JPH11308997A - サイクリン依存性キナ―ゼ阻害剤によって活性が影響を受ける遺伝子治療用核酸構築体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 サイクリン依存性キナーゼ阻害剤によって活
性が影響を受ける遺伝子治療用核酸構築体の提供。 【解決手段】 細胞内p27を阻害し、それによりp27によ
って引き起こされる細胞増殖の阻害を軽減するタンパク
質（優性妨害形質を有するそれらの突然変異体を含む）
をコードする核酸を含んでなる遺伝子治療用核酸構築
体、並びに疾患の予防および治療のためのこれら核酸の
使用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野 本出願は、細胞内タンパク質p27を阻害し、それによりp
27によって引き起こされる細胞増殖の抑制を軽減するタ
ンパク質、そのいくつかが優性妨害形質（dominant int
erfering character）であるそれらの突然変異体、これ
らタンパク質をコードする核酸、および疾病の予防およ
び治療のためのタンパク質および核酸の使用に関する。

【０００２】背景技術 真核細胞の細胞周期はサイクリン依存性キナーゼ(cdks)
によって制御される。これらは活性型となるためにレギ
ュレーターサブユニット（「サイクリン」）を必要とす
るキナーゼである。細胞周期における異なるプロセス
（複製や有糸分裂への導入など）は、異なるcdksによっ
て制御される(Morgan, Nature 374, 131 (1995))。これ
との会合（association）において、サイクリン依存性
キナーゼ活性は高度の調節を受ける。これに関連して、
例えば、ＤＮＡがその複製を完了するまで有糸分裂への
導入を妨げる分子内制御機構が存在する。成長因子など
の外部因子による制御はＤＮＡ複製の開始前のみに起こ
り、複製は活性型サイクリンE/cdk2複合体によって開始
される。

【０００３】キナーゼサブユニットにおけるサイクリン
の量に加えて、サイクリン依存性キナーゼの活性もまた
小さな阻害タンパク質によって調節される(Sherr and R
oberts, Gene Dev.9, 1149(1995))。例えば、それらの
大きさに従ってp21およびp27と呼ばれる２種の阻害剤は
サイクリンE/cdk2にとって極めて重要である。サイクリ
ンE/cdk2キナーゼは通常、多量のp27を発現する細胞中
では不活性であり、ＤＮＡ複製への導入は遮断されてい
る。

【０００４】多くのヒト細胞では、正の細胞周期レギュ
レーターが過剰に発現するか、または少なくとも構成的
に発現するが(Sherr, Science 274, 1672(1996))、負の
レギュレーターは変異しているか、または弱く発現する
だけである(Fero et al., Cell 85, 733(1996))。特異
的な相関が存在し、例えば、多くの頸部腫瘍において、
サイクリンD1遺伝子が過剰に発現することが判ってい
る。従って、増殖抑制効果を有する新規な選択性物質の
検索の際、サイクリン依存性キナーゼおよびそれらの機
能が標的構造となるかも知れないという期待がある。

【０００５】p27タンパク質に対する遺伝子は数年のう
ちに知られてきており(K. Polyak etal. Cell 78, 59-6
6(1994))、ジーンバンクで入手可能である[受託番号K 0
9968；ヒトp27：K 10906]。集中的な探索にもかかわら
ず、p27遺伝子における突然変異はヒト腫瘍においては
これまでには発見されていない。p27の遺伝子が不活性
化されたマウスは、多発性形成異常を伴う表現型や腫瘍
発生の増加を示すため、これは驚くべきことである(Fer
o et al., Cell 85, 733(1996),Kiyokawa et al.Cell 8
5, 721(1996))。にもかかわらず、p27の機能は主な転写
後調節においては明らかである。

【０００６】このように、p27はタンパク質分解によっ
て変性され、また、これが正常細胞でＤＮＡ複製の開始
を引き起こす。正常細胞に比べて腫瘍細胞では、p27を
タンパク質分解により変性させる能力は格段に増大し、
このことは好ましくない予後と直接関係しているようで
ある(Loba et al. Nature Med. 3, 231,(1997))。しか
しながら、p27の不活性化をもたらし得る他の機構も存
在するはずである。例えば、Mycガン遺伝子で細胞を形
質転換した後、まず第一にp27が機能的に不活性化され
（すなわち、もはやサイクリン／cdk複合体に結合しな
い）、かなり後の段階で変性されるに過ぎない。多くの
胸部腫瘍でなぜ多量のp27タンパク質が発現するのか、
例えば、また、にもかかわらずなぜこれら腫瘍が極めて
急速に増殖するのか、これまでは理解できなかった。こ
れら腫瘍においてp27を不活性化する機構は、これまで
には知られていない(Fredersdorf et al., Proc. Natl,
Acad, Sci. USA 94, 6380(1997))。

【０００７】結果として、専門家の間では、腫瘍におけ
るp27の不活性化にあずかる機構または物質の発見に多
大な関心がある。本発明はこの問題を解決した。本出願
に記載されるタンパク質p163はp27の機能を阻害するこ
とができ、しかも、p27に細胞質内でタンパク質分解を
もたらすことができる。

【０００８】

【発明の概要】1)タンパク質p163およびその核酸配列 本発明は、p27と結合し、それによりその機能を阻害
し、細胞質内でそれにタンパク質分解をもたらす、p63
と呼ばれる新規なタンパク質に関する。このタンパク質
のアミノ酸配列が決定された。タンパク質p63はp27に特
異的に結合するが、Myc、Max、Bcl-6またはプロチモシ
ン-αなどの他のタンパク質には結合しない。本発明は
さらに、タンパク質p163をコードする核酸配列に関す
る。このヌクレオチド配列はマウスp163タンパク質の場
合において、配列比較により、ヒトp163タンパク質の場
合においてもまた決定された。

【０００９】2)ドミナントネガティブp163類似体 本発明はさらに、p163の構成ペプチドをコードするかつ
／またはp163の類似体であり、ドミナントネガティブ効
果を発揮する、すなわち、p27タンパク質のサイクリンE
/cdk2に対する結合およびそれによって引き起こされる
サイクリンE/cdk2の阻害を実質的に損なわずに、天然p1
63タンパク質のタンパク質p27への結合を阻害するヌク
レオチド配列に関する。本発明はさらに、p163タンパク
質のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸配
列、またはその構成配列の使用であって、これらヌクレ
オチド配列を標的細胞へ導入し、次いで、標的細胞特異
的p163タンパク質と標的細胞特異的p27タンパク質間の
結合を阻害し、その結果、それにより遊離する標的細胞
特異的p27タンパク質によって標的細胞の増殖が阻害さ
れることを特徴とする使用に関する。

【００１０】3)p163を阻害するペプチド しかしながら、本発明はまた、p163の機能を阻害するタ
ンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列
に関する。これらには、p27タンパク質が結合するp163
内の部位に結合するか、またはRanが結合するp163内の
部位に結合するタンパク質またはペプチドが含まれ(Loe
b et al. Mol. Cell. Biol. 4, 209-222(1993))、それ
により細胞に対して内側にあるp163タンパク質を阻害す
る。これらのタンパク質には、p163タンパク質が結合す
るp27タンパク質内の部位またはRanタンパク質内の部位
に相当するペプチドが含まれる。これらのタンパク質に
はさらに、F(ab)₂、Fab、FvおよびscFVなど、タンパク
質p163に対して、特にp27タンパク質が結合するその部
位に対して特異性を有する抗体または抗体切断産物が含
まれる。本発明はさらに、かかる阻害タンパク質または
ペプチドをコードする核酸配列の使用であって、これら
ヌクレオチド配列を標的細胞に導入し、次いで、標的細
胞特異的p163タンパク質と標的細胞特異的p27タンパク
質または標的細胞特異的Ranタンパク質間の結合を阻害
し、その結果、それにより遊離する標的細胞特異的p27
タンパク質によって標的細胞の増殖が阻害されることを
特徴とする使用に関する。

【００１１】4)細胞分裂を刺激するp163の使用 本発明はさらに、細胞に対して内側にあるp27タンパク
質を阻害するための、また、このように標的細胞の細胞
分裂を刺激するための、p163タンパク質をコードするヌ
クレオチド配列、またはp163タンパク質自身の使用に関
する。

【００１２】5)p163の転写および翻訳の阻害 しかしながら、本発明はまた、p163タンパク質をコード
する標的細胞特異的核酸の転写および／または翻訳を阻
害し、それによりp27タンパク質を遊離させ、その結
果、標的細胞の増殖を阻害する核酸配列に関する。本発
明のかかる核酸配列は、例えば、アンチセンス（三重ら
せん）ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよび／またはリボ
ザイムであってよい。

【００１３】6)p163阻害剤を見出す試験系 本発明はさらに、p163タンパク質とp27タンパク質また
はRanタンパク質との間の結合の阻害剤を検索する（ス
クリーニングする）試験系のための、p163タンパク質を
コードする核酸配列の、またはp163タンパク質の、また
はその構成配列の使用に関し、標的細胞の増殖を阻害す
るされら試験系で見出されるp163タンパク質の阻害剤の
使用にも関する。

【００１４】7)疾病の診断のためのp163の検出 本発明はさらに、細胞のまたは組織の増殖状況を確認す
る、もしくは病状を診断することを目的として、p163を
コードする核酸を検出するための、もしくは細胞または
組織または体液中でp163タンパク質を検出するための、
p163タンパク質をコードするか、もしくはp163タンパク
質の構成配列をコードする核酸構築体、p163タンパク質
の核酸配列に結合する核酸配列あるいはタンパク質配
列、またはp163タンパク質に結合するタンパク質の使用
に関する。

【００１５】8)p27またはp163/p27が結合する配列を含
んでなる発現系 さらに本発明は、発現がp27タンパク質によって制御さ
れ、また最も単純な場合では以下の構成要素：

【００１６】構成要素a) 少なくとも１つの活性化配列（プロモーターNo.1）

【００１７】 構成要素b) 構成要素b₁) 少なくとも１つの転写因子の活性化ドメイン 構成要素b₂) 1)p27タンパク質に結合する、p163の少なくとも１つの配列また は少なくとも１つの構成配列、または 2)Fab、FvまたはscFvなどの少なくとも１つの抗体、もしくは少 なくとも１つの抗体断片、または 3)p27タンパク質が結合するp167タンパク質内の部位に結合する Fab、FvまたはscFvなどの少なくとも１つの抗体、もしくは抗 体断片、または 4)p163とp27を含んでなる複合体に結合するFab、FvまたはscFv などの少なくとも１つの抗体、もしくは抗体断片 構成要素b₃) 少なくとも１つの転写因子のＤＮＡ結合ドメイン を含む融合タンパク質を含んでなる少なくとも１つの転写因子の遺伝子

【００１８】構成要素c) 構成要素b)によってコードされる転写因子の結合によっ
て活性化される、少なくとも１つの活性化配列（プロモ
ーターNo.11）

【００１９】構成要素d) 少なくとも１つのエフェクター遺伝子を含む発現系に関
する。

【００２０】

【発明の具体的説明】発現系 個々の構成要素の配置は、図１に示される。この発現系
の本発明の作用に関する必要条件は、構成要素b₂1)、ｂ
₂2)またはb₂3)を構成要素b₁)とb₃)の間、またはこれに
付加して配置して、p27タンパク質またはp163タンパク
質の構成要素b₂)の発現生成物への結合が活性化ドメイ
ン[構成要素b₁)]および／またはＤＮＡ結合ドメイン[構
成要素b₃)]の作用を阻害することである。遊離したp27
または遊離したp163が存在する細胞では、この阻害がエ
フェクター遺伝子の阻害をもたらす。p27タンパク質お
よび／またはp163タンパク質が複合体を形成しており、
もはや構成要素b₂)とは相互作用できなくなっている
か、もしくは存在していないか、少量でしか存在してい
ない細胞では、この阻害はなく、このことは転写因子
[構成要素b)]が妨害を受けないような様式で活性化配列
[構成要素c)]を活性化することができ、それによりエフ
ェクター遺伝子の転写が開始されることを意味してい
る。構成要素b₂4)は独特な特色をなす。分裂細胞でのp1
63/p27複合体の構成要素b₂4)への結合は転写因子[構成
要素b)]を阻害し、これに対して、転写因子[構成要素
b)]は遊離し、休止細胞で十分な機能する（すなわち、p
27が遊離状態で存在する場合）。エフェクター遺伝子の
転写は活性化配列[構成要素a)]の活性化によって開始さ
れ、この結果、転写因子構成要素b)の遺伝子が発現す
る。転写因子[構成要素b)]が順々に活性化配列[構成要
素c)]に結合し、これがエフェクター遺伝子[構成要素
d)]の発現を誘導する。

【００２１】本発明の１つの特定の具体例では、構成要
素a)は構成要素c)と同じものである。この特定の具体例
では、活性化配列[プロモーターI、構成要素a)]のわず
かな活性化が転写因子[構成要素b)]の発現をもたらし、
これが活性化配列[プロモーターI、構成要素a)]と活性
化配列[プロモーターII、構成要素c)]の双方を活性化
し、それにより順々にエフェクター遺伝子[構成要素d)]
の発現が増強される。この発現系は、いくつかの同一の
または異なるエフェクター遺伝子[構成要素d)、d')、
d")]の配列を共に配列することにより（これは同一のま
たは異なるIRES配列により、もしくは活性化配列[構成
要素c')およびc")]によって互いに連結されている場合
である）、いくつかの同一のまたは異なる転写因子[構
成要素b)]を共に配列することにより（これは同一のま
たは異なるIRES配列により、もしくは活性化配列[構成
要素a)または構成要素c)]によって互いに連結されてい
る場合である）、拡張することができる。

【００２２】異なる転写因子の遺伝子が共に配列されて
いる場合、活性化配列はそれらが転写因子[構成要素b)]
が結合可能なヌクレオチド配列を含むよう選択すべきで
ある。活性化配列[構成要素a)またはc)]の選択により、
本発明の核酸構築体を用いて非特異的、細胞特異的、ま
たはウイルス特異的に、もしくは特定の代謝条件下で、
その他細胞周期特異的にエフェクター遺伝子[構成要素
d)]を発現させることができる。エフェクター遺伝子は
薬理活性のある化合物またはその他、不活性な薬剤前駆
体を活性薬剤に分割するその他の酵素をその部分に関し
てコードする遺伝子である。例えば、エフェクター遺伝
子はこの活性化合物、またはこの酵素が融合タンパク質
としてリガンドとともに発現し、しかもこのリガンドが
細胞、例えば内皮細胞または腫瘍細胞または白血球の表
面に結合するように選択することができる。

【００２３】引用された本発明の核酸構築体はＤＮＡを
含んでなることが好ましい。「核酸構築体」とは、標的
細胞で転写され得る人工核酸構造を意味するものとして
理解される。それらは好ましくは、プラスミドベクター
またはウイルスベクターが特に好ましいベクターに挿入
される。核酸構築体はベクターに適切に挿入され、疾病
の予防または治療のために患者に投与される。この投与
は経口、局所、もしくは注射または点滴により達成でき
る。

【００２４】本発明はまた、本発明の核酸構築体を担持
する哺乳類細胞に関する。特に好ましい具体例では、核
酸構築体を細胞サインに導入し、次いで転写後にそれを
エフェクター遺伝子を発現させる本発明の発現系の担体
として用いることができる。かかる細胞は患者に薬剤を
与えるために用いることができる。別法として、本発明
の核酸構築体を導入した腫瘍細胞、免疫細胞または内皮
細胞などの細胞または細胞ラインを患者に局所投与、ま
たは非経口的、例えば静脈内、動脈内、体腔内、器官
内、皮下に注射することができる。

【００２５】本発明の核酸構築体の好ましい使用は、結
局、疾病の予防または治療にあり、本発明はin vitroで
の核酸構築体の標的細胞への導入、該標的細胞での薬剤
の非特異的、ウイルス特異的または標的細胞特異的、代
謝特異的および／または細胞周期特異的発現、および該
標的細胞の患者への局所または非経口投与、またはinvi
vtoでの核酸構築体の該標的細胞への導入のための患者
への核酸構築体の局所または非経口投与からなる。

【００２６】本発明の核酸構築体は、自然界ではこの形
態では生じない。すなわち、活性化合物の、または酵素
の、またはリガンド-活性化合物もしくはリガンド-酵素
融合体融合タンパク質のエフェクター遺伝子は、本発明
の核酸構築体に含まれるようには、核酸配列と自然には
結びつかない。

【００２７】本発明の発現系に組み込まれる好ましいエ
フェクター遺伝子[構成要素d)]は、薬理活性化合物をコ
ードする。かかる薬理活性化合物には、サイトカイン、
成長因子、サイトカインまたは成長因子の受容体、抗体
または抗体断片、増殖阻害作用または細胞分裂阻害作用
を有するタンパク質、アポトーシス作用または抗アポト
ーシス作用を有するタンパク質、腫瘍抗原、脈管形成阻
害剤、血栓症誘導性タンパク質、凝固阻害剤、繊維素溶
解作用を有するタンパク質、血漿タンパク質、相補的活
性化タンパク質、ウイルスおよび細菌のエンベロープ物
質、循環系に作用するペプチド、神経ペプチド、酵素、
メディエーター、自然に生じる変異していない調節タン
パク質およびリボザイム、または遺伝子発現に阻害的作
用を有する（アンチセンス）ヌクレオチド配列からなる
群より選択されるタンパク質および糖タンパク質があ
る。

【００２８】好ましくは、導入遺伝子は、細胞周期制御
タンパク質、特にサイクリンA、サイクリンB、サイクリ
ンD1、サイクリンE、E2F1-5、cdc2、cdc25c、p163また
はDP1、もしくはウイルスタンパク質またはサイトカイ
ンまたは成長因子またはそれらの受容体からなる群より
選択されるタンパク質をコードするｍＲＮＡを不活性化
するリボザイムをコードするエフェクター遺伝子であ
る。

【００２９】もう１つの具体例では、該エフェクター遺
伝子はリガンド-活性化合物融合タンパク質をコードす
ることができ、このリガンドは抗体、抗体断片、サイト
カイン、成長因子、接着分子またはペプチドホルモンで
あり得、また、この活性化合物は前記したような薬理活
性化合物または酵素であり得る。例えば、該エフェクタ
ー遺伝子はリガンド-酵素融合タンパク質をコードする
ことができ、この酵素が前駆薬剤を薬剤へと分割し、こ
のリガンドが細胞表面に、好ましくは内皮細胞または腫
瘍細胞に結合する。

【００３０】具体例 1)p163タンパク質およびp163タンパク質をコードする核
酸配列の同定 「ツーハイブリッド技術（two-hybrid）」(Fields and
Song, Nature 340, 245(1989))を用いてp27の新たなパ
ートナータンパク質としてのp163タンパク質を発見し
た。このためにPCRを用いて、ネズミp27タンパク質の全
コーディング配列をフレーム内に転写因子GAL4のＤＮＡ
結合ドメインを有する酵母ベクターpGBT10(Clontech)に
クローン化した。酵母菌株Hf7c（Clontech Heidelberg,
Matchmaker Two Hybrid, K 1605-1製）をこのベクター
で形質転換し、その後、トリプトファン栄養要求性コロ
ニーを単離し、GAL4およびp27に対して特異的な抗体を
用いるウエスタンブロットで正確な融合タンパク質の発
現を検出した。この菌株を、第二の形質転換で、マウス
胎児由来のVP16タグ付きｃＤＮＡライブラリーで形質転
換した(Vojtek et al., Cell 74,205(1993))。15nMアミ
ノトリアゾールの存在下でヒスチジン栄養要求性であっ
た400のコロニーをさらなる解析にかけた。これらのコ
ロニーのうち70を配列決定し、それらは総て異なるD型
サイクリンをコードしており、これらはp27の相互作用
パートナーであることが知られている。サザンブロッテ
ィングを用いて、400の耐性コロニーのうち390がDサイ
クリンをコードしていることを示した。残りのコロニー
のうち２つは（「163番」）は同一のタンパク質をコー
ドし、それらは完全に配列決定された。Balb/c-3T3細胞
から作製したλZAP ｃＤＮＡライブラリー由来のいくつ
かのコロニーはp163と相同であることが確認された。配
列解析によりオープンリーディングフレームが示され、
これはまたｃＤＮＡライブラリー由来VP16キメラでも用
いられている。２種のオリジナルクローンはこのリーデ
ィングフレームのアミノ酸121〜252をコードしている。
クローンp163はレポーター遺伝子としてβ-ガラクトシ
ダーゼを用いる酵母でさらに詳細に同定された。

【００３１】表1に示したように、コードされたタンパ
ク質は酵母内でp27と特異的に相互作用するが、Myc、Ma
x、Bcl-6またはプロチモシン-αなどの他のタンパク質
とは相互作用しない。また表1は、p163との相互作用が
起こるp27のドメインの第一の範囲設定を示す。これら
のデータは、p163がサイクリン依存性キナーゼがそうで
あるようにp27内の同一のドメインに結合することを示
している (Russo et al. Nature 382, 325(1996))。こ
のことは、p163とサイクリン依存性キナーゼがp27との
結合に関して競合することを示すものである。第二に、
アミノ酸121〜252でp27と相互作用するp163ドメインの
範囲を定めることができた。

【００３２】この酵母試験系からのこれらの結果を確認
するために、組換えにより発現した163[融合タンパク質
として、グルタチオントランスフェラーゼ(GST)ととも
に発現]をカラムに結合させ、次いで、このカラムでの
アフィニティークロマトグラフィーにより、³⁵Sで標識
したp27タンパク質の精製を試みた。グルタチオントラ
ンスフェラーゼとともにp163を含んでなる融合タンパク
質の使用により、これらの実験のための均一なマトリッ
クスを使用できるようになる（いわゆるGSTプルダウン
ズ(pulldowns); Hateboer et al., Proc. Natl. Sci. U
SA 90, 8489(1993)）。

【００３３】これら検討のため、大腸菌(E. coli)のIPT
G誘導性TACプロモーターの制御下で、酵母クローンから
のリーディングフレームを、グルタチオン-S-トランス
フェラーゼ(GST)とのキメラタンパク質をコードするpGE
Xベクター(Pharmacia, Freiburg pGEX-2T; Cat. No. 27
-4801-01)へ導入した(Smith and Johnson, Gene 67:31,
1988)。キメラタンパク質は、グルタチオン-アガロー
スでのアフィニティークロマトグラフィーにより、誘導
した大腸菌培養物から精製し(Smityh and Johnson, 198
8)、次いで、100mMトリス-HCl、pH 7.5、100mM KCl、20
mM EDTA、10%グリセロール、0.1mM PMSFに対して透析し
た。対照として、同様のプロトコールに従ってグルタチ
オン-S-トランスフェラーゼを精製し、次いで透析し、
精製したタンパク質は-80℃で保存した。

【００３４】次いで２種のタンパク質10μgをそれぞ
れ、4℃にて2時間、10μgのBSAおよび20mgの膨潤GSTア
ガロースとともにインキュベートし、その後、アガロー
スを遠心分離で回収し、透析緩衝液で２回洗浄した。タ
ンパク質の結合に関する対照として、このアガロースの
アリコートをサンプル緩衝液中で直接煮沸し、次いで、
SDSゲル電気泳動の後に結合したタンパク質を検出し
た。（製造業者の指示に従って;Promega, Mannheim; TN
T couoled retc. lys. system; L 4610）³⁵S-メチオニ
ンで標識したp27をin vitro転写によって作製し、4℃に
て2時間、0.1% NP-40を含有する透析緩衝液中200μlの
総容量で添加したアガロースとともにインキュベートし
た。このアガロースを透析緩衝液／0.1% NP-40で４回洗
浄し、次いで、SDSサンプル緩衝液中で煮沸した。結合
したタンパク質は、SDSゲル電気泳動および蛍光間接撮
影法により検出した。

【００３５】これらの実験の結果は表2に示されてい
る。それらは組換え体、in vitroで合成された³⁵Sで標
識したp27が同量のGSTが充填されているカラムに特異的
に結合することを示している。表2はまた、細胞抽出物
由来のp27がGST-p163には有効には結合せず、この抽出
物ではp27がサイクリン依存性キナーゼの複合体に結合
することを示している。短時間の加熱処理がこれらの複
合体からp27を遊離させ、次いで、それをp163と結合さ
せる。このことはp163とサイクリン依存性キナーゼがp2
7との結合に関して競合することを示している。ネズミp
163タンパク質をコードする本発明の核酸配列は表3に示
されている。この配列はデータベースにおいて相同性を
有し、これは酵母核タンパク質(Nup)2遺伝子である。Nu
p2は核タンパク質の形成に、また核内および核外のタン
パク質輸送に関与する核膜のタンパク質である。酵母で
は、Nup2はおそらくは特に輸出に関与している。

【００３６】いくつかの機能性ドメインが保存されてい
るが、全体として見ると相同性は高くはない（表4）。
例えば、核の輸送を調節する調節タンパク質と結合する
部位（Ran, GTP結合タンパク質）は、Ran結合タンパク
質(RPB-1)、NuP-2およびp163間で保存されており（表
5）、構造的機能が帰するところの短いペンタペプチド
配列も同様である（表6）。疑う余地なくp163がヌクレ
オポリン(nucleoporin)であることを証明するために、
該タンパク質に対してポリクローナル抗血清を作製し
[ヒスチジン-p163(aa121〜252)]、次いでアフィニティ
ー精製した。免疫蛍光法の下での典型的な核膜孔染色
（核の表面上のドットおよび周縁部が染色される）から
認められるように、この抗血清は疑いなくヌクレオポリ
ンを認識する。p163またはNup2およびp27が細胞内で会
合していることを証明するために、CNV発現ベクターを
用いてＨｅＬａ細胞でこの２種のタンパク質を一時的に
発現させ、48時間後に細胞を溶解させ、免疫沈降／ウエ
スタンブロッティングにより、この２種のタンパク質の
相互作用に関して調べた(Peukert et al., EMBO J. 16,
5672(1997))。p27とNup2の間の会合は、それぞれの場
合においてNup2に対するポリクローナル抗体およびネズ
ミp27に対するポリクローナル抗体を用いて証明した。p
27タンパク質はp163が発現した場合にのみ首尾よく沈降
した（表7参照）。このことはNup2およびp27がin vivo
におけるＨｅＬａ細胞内で互いに会合可能なことを証明
するものである。

【００３７】ヒトp163タンパク質の核酸配列は配列比較
を行うによって同定し、ヒトESTを用いて検索した。Ran
結合ドメインの場合には、それらは配列AA161285中の17
3≧575位に位置し、p27結合ドメインの場合には、それ
らは配列R62321中の318≧486位に位置し、またp163の他
の構成配列の場合には、それらは配列THC199124中の348
≧489位に位置している。Nup2-p163が相互作用するp27
アミノ酸をさらに正確に定義するために、酵母でp163と
はもはや相互作用しない突然変異体に関しての検索を行
った。このために、p27をコードするｃＤＮＡをエラー
誘導PCR反応（"PCR-technology, Principles and Appli
cations for DNA amplifications", H.A. Erlich, Stoc
kton press,NY 1989)に記載したようなPCR条件）にか
け、その結果得られたランダムエラーを含むクローンを
Nup2との相互作用に関して、また対照としてD1との相互
作用に関して試験した。このPCRの条件は（標準条件と
は異なり）、1UのGIBCO Taqポリメラーゼおよび0.1mM M
nCl₂の存在下で40サイクルであった。

【００３８】得られたｃＤＮＡ断片を、BamHIおよびEco
RIで線状化し次いで精製したGBT10ベクターとともに、
酵母菌株HF7c-p163/Nup2pへ同時形質転換した。形質転
換コロニーを-Leu-Trp欠損培地からの選択によって選択
した。960の個々のコロニーを単離し、選択培地(-Leu-H
is-Trp)上で平板培養した。第二の相互作用試験とし
て、この選択培地で増殖しなかったクローンについてβ
-ガラクトシド試験を行った。

【００３９】陰性クローンを単離し、次いでそれらから
pGBT10-p27プラスミドを単離した。得られたプラスミド
は、まず、トランス活性化ドメインを含有するキメラと
してp163/Nup2を発現する酵母発現プラスミドで、次に
対照として、トランス活性化ドメインを含有するキメラ
としてサイクリンD1を発現するプラスミドで形質転換し
た。この結果、Nup2とはもはや相互作用しないが、サイ
クリンD1とは相互作用する３種のクローンが生じた。こ
れらのプラスミドをいくつかの対照とともに配列決定し
た。

【００４０】得られた表現型の範囲は表13に要約されて
いる。これらの実験では、相互作用はヒスチジン（-Trp
-Leu-His、「選択性」）存在下での増殖としてそれ自身
一目瞭然であるが、対照（-Trp-Leu、「非選択性」）
は、両タンパク質が酵母で発現されたことを示してい
る。1000のうちから３クローンがp163-Nup2とはもはや
特異的には相互作用しないが、サイクリンD1とは相互作
用することが判明した。この配列は表14に示されてい
る。３クローンは総て、一連の対照とは異なり、アミノ
酸アルギニン90（グリシンに対する変異）に同一の突然
変異を有する。またこの配列は、それらが付加的な、異
なる突然変異を有するので、独立に形成されたことを示
している。このことはアルギニン90がp27のNup2との相
互作用における中心アミノ酸であることを明確に示して
いる。この相互作用の生物学的関連をバリデートするた
めにはこの突然変異体を利用できる。

【００４１】2)p163タンパク質のドミナントネガティブ
類似体のヌクレオチド配列 前記の機能解析によって、その機能に関して決定的であ
るp163タンパク質の２つのドメインが明らかになる。

【００４２】これらドメインの一方は、p27と結合する
ドメイン（アミノ酸121-252）である。他方は、輸送機
能を調節するGTP結合タンパク質であるRanと結合するド
メイン（アミノ酸307-467）である。結果として、本発
明はタンパク質p163の、またはこのタンパク質の一部の
核酸配列に関するものであって、これらの核酸配列はp2
7結合ドメインおよび／またはRan結合ドメインにおいて
突然変異を示し、その結果発現した突然変異タンパク質
のp27かまたはRanかのいずれかとの結合が劇的に減少す
る。細胞中に導入した場合には、これらp163の類似体は
機能的細胞特異的p163を阻害する。この結果、遊離のp2
7を生じ、細胞分裂の抑制をもたらす。かかるp163のド
ミナントネガティブ突然変異体の例を表8および9に示
す。表8はp27結合ドメインが欠失しているp163を示し、
一方、表9はRan結合ドメインを欠失しているp163を示
す。結果として、本発明は、細胞の増殖の阻害を目的と
する、ドミナントネガティブp163類似体をコードする核
酸構築体の細胞への導入に関する。この細胞への導入は
in vitroまたはin vivoのいずれかで行うことができ
る。本発明の核酸構築体の発現が最良の可能性であり、
かつ／または制御を受けるということを保証するために
は、この構築体が活性化配列に連結されていることが好
ましい。かかる活性化配列の例は8.3.に挙げられてい
る。p163をコードする核酸配列が核内に位置していると
いうことを保証するためには、核局在化シグナル(NLS)
をそれに付加しなければならない。かかるNLSは当業者
には公知である。

【００４３】該核酸構築体は、当業者に公知である方法
を用いて、裸のＤＮＡとして、もしくは非ウイルスベク
ターにより、またはウイルスベクターにより挿入して、
細胞に導入する。

【００４４】3)p163結合ドメインと結合するタンパク質
またはペプチドのヌクレオチド配列 これまでに発表されてきた研究から、p163タンパク質の
p27結合ドメインはアミノ酸121-252であり、Ran結合ド
メインはアミノ酸307-467であるということを確定する
ことが可能となった。結果として、本発明は、p27が結
合するp163ドメインに結合して、それによりp163のp27
への結合を阻害するか、またはRanが結合するp163ドメ
インに結合して、それによりp163のRanへの結合を阻害
するかのいずれかであるペプチドをコードする核酸構築
体に関する。この阻害の結果、例えばサイクリンE/cdk2
への結合により細胞増殖を阻害する遊離p27が形成され
る。かかる阻害ペプチドの例には、p27タンパク質（ア
ミノ酸69-178）またはRanのp163結合ドメインに相当す
るアミノ酸配列がある。p163と、特にp163のp27結合ド
メインまたはRan結合部位と結合するF(ab)₂、Fab、Fvま
たはs.c.Fvのような抗体または抗体断片は、もう１つの
例を構成する。例えば、動物をp163またはp163のp27結
合ドメインもしくはRan結合ドメインを用いて免疫化す
ることによって、かかる抗体を製造することができる。
これらのドメインを、表5（Ran結合ドメイン）および表
10（p27結合ドメイン）に示す。結果として、本発明
は、細胞増殖を阻害する目的で、p163に結合するタンパ
ク質をコードする核酸構築体の細胞への導入に関する。
細胞へのこの導入はin vitroまたはin vivoのいずれか
で行うことができる。

【００４５】本発明の核酸構築体の発現が最良の可能性
であり、かつ／または制御を受けるということを保証す
るためには、この構築体が活性化配列に連結されている
ことが好ましい。かかる活性化配列の例は8.3.に挙げら
れている。本発明の核酸構築体をコードする核酸配列が
核内に位置しているということを保証するためには、核
局在化シグナル(NLS)をそれに付加しなければならな
い。かかるNLSは当業者には公知である。該核酸構築体
は、当業者に公知である方法を用いて、裸のＤＮＡとし
て、もしくは非ウイルスベクターにより、またはウイル
スベクターにより挿入して、細胞に導入する。

【００４６】4)細胞分裂を刺激するp163のヌクレオチド
配列 p163またはp163タンパク質のヌクレオチド配列の細胞中
への導入は、細胞内p27の阻害をもたらす。これは（p27
によって抑制されている）サイクリンE/cdk2複合体を遊
離し、この複合体が細胞分裂を開始させる。結果とし
て、本発明は、細胞増殖の促進を目的とする、p163をコ
ードする核酸構築体の細胞への導入に関する。この細胞
への導入はin vitroまたはin vivoのいずれかで行うこ
とができる。

【００４７】本発明の核酸構築体の発現が最良の可能性
であり、かつ／または制御を受けるということを保証す
るためには、この構築体が活性化配列に連結されている
ことが好ましい。かかる活性化配列の例は8.3.に挙げら
れている。p163をコードする核酸配列が核内に位置して
いるということを保証するためには、核局在化シグナル
(NLS)をそれに付加しなければならない。かかるNLSは当
業者には公知である。該核酸構築体は、当業者に公知で
ある方法を用いて、裸のＤＮＡとして、もしくは非ウイ
ルスベクターにより、またはウイルスベクターにより挿
入して、細胞に導入する。p163をコードする核酸構築体
の導入は、例えば、細胞培養中の細胞、または例えば細
胞増殖が欠損している場合のin vivoの細胞の増殖を刺
激することができる。

【００４８】5)p163タンパク質の転写および／または翻
訳を阻害するヌクレオチド配列 p163タンパク質の核酸配列に関する知見は、p163の転写
または翻訳を特異的に阻害するために用いることのでき
るオリゴヌクレオチドを作製できる可能性をもたらす。
これらのアンチセンス核酸には、オリゴヌクレオチド、
アンチセンス(三重らせん)ＤＮＡ、リボザイムおよびア
ンチセンスＲＮＡが含まれる。三重らせんＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドを作製する方法は、Frank-Kamenetskii an
d Mirkin, Ann. Rev. Biochem. 64, 65 (1995)に詳細に
記載されており、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチ
ドを作製する方法は、Neckers et al., Crit. Rev. Onc
ogen. 3, 175 (1992); Carter and Limoine, Br. J. Ca
ncer 67, 869 (1993); Mukhdopadhyay and Roth, Crit.
Rev. Oncogen. 7, 151 (1996)およびMercola and Cohe
n, Cancer Gene Ther. 2, 47 (1995) に詳細に記載され
ている。

【００４９】本発明の意味の範囲内では、p27タンパク
質と結合するドメインの構成領域（全領域、アミノ酸12
1-252）、またはRanタンパク質と結合するドメインの構
成領域（全領域、アミノ酸307-467）をコードするp163
ヌクレオチド配列とハイブリダイズする三重らせんＤＮ
ＡまたはアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを用い
ることが好ましい。p163の転写および／または翻訳を阻
害するヌクレオチド配列にはさらに、p163タンパク質の
ヌクレオチド配列領域に対して特異的なリボザイムが含
まれる。

【００５０】リボザイムを作製する方法は、Burke, Nuc
l. Acids Mol. Biol. 8, 105 (1994), Christoffersen
and Marr, J. Med. Chem. 38, 2023 (1995) およびScot
t etal., Science 274, 2065 (1996) に詳細に記載され
ている。本発明の意味の範囲内では、p27タンパク質と
結合するドメイン（アミノ酸121-252）に対する、また
はRanタンパク質と結合するドメイン（アミノ酸307-46
7）に対するヌクレオチド配列の領域内に位置しているp
163ヌクレオチド配列とハイブリダイズするリボザイム
が好ましい。リボザイムによって切断され得るp163タン
パク質のヌクレオチド配列の例は表11に挙げられてい
る。三重らせんＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはリボ
ザイムは、in vitroにおいて細胞をターゲッティングす
るために添加されるか、またはin vivoにおいて［当業
者にとっては公知の方法（先に引用した文献を参照）を
用いて製造し、DNアーゼまたはRNアーゼによる分解から
保護した］オリゴヌクレオチドとして、注射もしくは局
所貼布により投与されるかのいずれかである。しかしな
がら、本発明はまた、この細胞の増殖を阻害するために
本発明のオリゴヌクレオチドに対応するアンチセンスＲ
ＮＡまたはリボザイムを転写により細胞内で形成する目
的で、細胞に核酸構築体を導入することに関する。細胞
への導入は、in vitroまたはin vivoのいずれかで行う
ことができる。

【００５１】本発明の核酸構築体の発現が最良の可能性
であり、かつ／または制御を受けるということを保証す
るためには、この構築体が活性化配列に連結されている
ことが好ましい。かかる活性化配列の例は8.3.に挙げら
れている。該核酸構築体は、当業者に公知である方法を
用いて、裸のＤＮＡとして、もしくは非ウイルスベクタ
ーにより、ウイルスベクターにより挿入して、細胞に導
入する。

【００５２】6)p163機能の阻害剤を発見する試験系 p163タンパク質およびそれとp27タンパク質との相互作
用の発見により、この相互作用の阻害剤を検索すること
が可能となる。このことは、p27タンパク質とp163タン
パク質との間の結合が阻害され、かつ、この抑制の発生
が指示薬によって示されるという試験系を必要とする。
数多くの方法が知られている。この方法の１つの例は、
ツーハイブリッドスクリーンアッセイである（この点に
ついては、7)節および表1を参照）。しかしながら、別
法として、例えばアフィニティー系をスクリーニングに
用いることも可能であり、この系では、p163[好ましく
はp27結合ドメイン（アミノ酸121-252）]を固相に結合
させ、試験物質とともにインキュベートし、p163タンパ
ク質のp27結合ドメインに対する標識した結合パートナ
ーの結合を阻害することによって試験物質の結合が確認
される。この標識した結合パートナーは、p27かまたはp
163タンパク質のp27結合ドメインと特異的に結合する抗
体であってよい。p163とRanとの間の結合の阻害剤に対
する試験系を構築することが可能であり、p163とp27と
の間の結合の阻害剤に対する場合と同じ方法でスクリー
ニングに用いられる。結果として、本発明は、p163もし
くはp163の構成タンパク質をコードする核酸配列の使用
に、またはp163の阻害剤を検索するためのp163タンパク
質もしくはその構成タンパク質の使用に関する。

【００５３】7)細胞増殖の段階または病状を診断するた
めのp163またはタンパク質配列p163の核酸配列の使用 背景技術において説明したように、多くの腫瘍がp27の
細胞内濃度の増加によって特徴づけられている。これら
の腫瘍は増殖するので、この増加したp27の機能が抑制
されるものと仮定される。本発明によれば、p163はp27
の特異的な阻害剤である。細胞内でのこの阻害剤の検出
によって、細胞の増殖状態についての結論を引き出すこ
とが可能となる。この結果は、例えば腫瘍細胞または腫
瘍組織の悪性性を評価するためには極めて重要なもので
あると考えられる。p163タンパク質は細胞の死滅によっ
て放出される。体液中でのp163の検出は、その結果とし
て体内の増殖プロセスおよび／または細胞の死滅、例え
ば炎症プロセスに伴うプロセスに関する結果を引き出す
ことを可能にする。p163タンパク質を、標識した物質と
の特異的結合によって検出することができる。これらの
特異的結合物質には、p27タンパク質、Ranタンパク質お
よび例えば動物をp163タンパク質またはこのタンパク質
の構成配列を用いて免疫化することによって製造した体
が含まれる。しかしながら、p163 ｍＲＮＡもまた、タ
ンパク質p163をコードする核酸配列を対応するｍＲＮＡ
とハイブリダイズさせることによって、細胞または組織
において検出される。当業者にとってよく知られ、検出
すべき核酸配列のいくつかのコピーをその検出の感度を
増すために、いわゆるプライマー対を用いて増幅させ得
るポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術を用いることができ
る。p163をコードする核酸配列を増幅および検出するた
めのプライマー対の例は、表12a、bおよびcに示されて
いる。しかしながら、また、例えばGussoni et al., Na
ture Biotechnol. 14, 1012(1996)によって公表された
蛍光in situハイブリダイゼーションを用いて、p163を
コードするＲＮＡを検出することも可能である。結果と
して、本発明は、生きた哺乳動物において、細胞もしく
は組織の増殖状態を確認するための、または増殖の変化
もしくは細胞の死滅を伴う変化を検出するためのp163を
コードする核酸配列またはp163タンパク質の検出に関す
る。

【００５４】8)p163、p27またはp163/p27複合体によっ
て制御される発現系特有の特徴 8.1.構成要素b) 8.1.1.p163、p27またはp163/p27タンパク質複合体の結
合配列[構成要素b₂)] 本発明の好ましい具体例では、発現系はその構成要素
b₂)として、p27タンパク質と結合するp163タンパク質ま
たはp163タンパク質のその部分に対する少なくとも１つ
の核酸配列を含む。もう１つの好ましい具体例では、発
現系はその構成要素b₂)として、p163タンパク質と結合
するp27タンパク質内の部位に対する、またはp27タンパ
ク質と結合するp163タンパク質内の部位に対する、結合
配列(VHおよびVL)を含む抗体または抗体の一部に対する
少なくとも１つの核酸配列を含む。これらの具体例で
は、細胞中に存在する遊離p27タンパク質または遊離p16
3タンパク質は、例えば構成要素b₂)の発現生成物と結合
し、それにより構成要素b)によってコードされた転写因
子を阻害し、その結果として発現系をブロックする。し
かしながら、p27タンパク質が例えば細胞中のp163タン
パク質と複合体を形成する場合には、構成要素b₂)の発
現生成物、およびその結果生じた転写因子[構成要素b)]
は遊離したままであり、発現系が機能できる。

【００５５】本発明のこれらの発現系は、その結果とし
て（p163/p27複合体の存在下）分裂細胞では機能でき、
休止細胞（遊離p27）では阻害される。もう１つの特定
の具体例では、発現系はその構成要素b₂)として、p27と
p163を含んでなる複合体に対する結合配列(VHおよびVL)
を含む抗体または抗体の一部に対する少なくとも１つの
核酸配列を含む。この具体例では、p27とp163との複合
体は構成要素b₂)の発現生成物と結合し、それにより発
現系をブロックするが、遊離p27またはp163は構成要素b
₂)の発現生成物とは結合しない。

【００５６】本発明の発現系は、その結果として（p163
/p27複合体の存在下）分裂細胞ではブロックされ、休止
細胞（遊離p27）では機能できる。 構成要素b₂)に対する抗体を選択する際に、その抗体が
ネズミ起源のものであればヒト化された型である抗体、
すなわちFV_LおよびFV_Hのエピトープ結合部分を使用する
ことが好ましい。このヒト化は、Winter et al.(Nature
349, 293 (1991)およびHoogenbooms et al.(Rev. Tr.
Transfus. Hemobiol. 36. 19.(1993)によって記載され
た方法で達成される。抗体断片は、技術の状態に従っ
て、例えばWinter et al., Nature 349, 293 (1991)、H
oogenbooms et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 3
6.19.(1993)、Girol. Mol. Immunol. 28, 1379 (1991)
またはHuston et al., Int. Rev. Immunol. 10, 195 (1
993)によって記載された方法で製造される。抗体、抗体
断片および組換え抗体断片の製造は、特許出願DE196 49
645.4に詳細に記載されていた。

【００５７】組換え抗体断片は、既存のハイブリドーマ
から直接製造されるか、またはファージディスプレイ技
術(Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433 (199
4))を用いてネズミまたはヒト抗体断片のライブラリー
から単離されるかのいずれかである。次いでこれらの抗
体断片は、構成要素b₁)およびb₃)とのカップリングのた
めに遺伝レベルで直接使用される。ハイブリドーマから
組換え抗体断片を製造するために、ｍＲＮＡを単離し、
そのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次いで可変断片のそ
れぞれ5'および3'末端に相補的であるオリゴヌクレオチ
ドを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅すること
によって、抗体の抗原結合ドメイン(V_H、V_L)をコードす
る遺伝情報を得る。得られたV_HおよびV_LをコードするＤ
ＮＡ断片を、次いでバクテリア発現ベクター中にクロー
ン化する。Fv断片、一本鎖Fv断片(scFv)またはFab断片
は例えばこのようにして発現させることができる。

【００５８】新しい抗体断片もまた、ファージディスプ
レイ技術を用いてネズミまたはヒト起源の抗体ライブラ
リー（免疫ライブラリーまたは天然ライブラリー）から
直接単離することができる。抗体断片のファージディス
プレイにおいて、抗原結合ドメインは、繊維状バクテリ
オファージのg3Pコートタンパク質に対する遺伝子との
融合タンパク質として、scFv断片遺伝子の形態で、また
はFab断片遺伝子としてファージゲノム中か、またはフ
ァージミドベクター中のいずれかへクローン化される。
抗原結合ファージは、抗原を充填したプラスチック容器
（パンニング）上で、抗原を結合させた常磁性ビーズ上
でまたは細胞表面へ結合させることによって選択する。

【００５９】免疫ライブラリーは、免疫化した動物また
は患者のBリンパ球由来の可変抗体断片に対する遺伝子
のPCR増幅により製造する。ネズミまたはヒト免疫グロ
ブリンに特異的な、あるいはヒト免疫グロブリン遺伝子
ファミリーに特異的なオリゴヌクレオチドの組み合わせ
がこの目的で使用される。天然ライブラリーは、免疫グ
ロブリン遺伝子の供給源として非免疫化ドナーを用いる
ことによって製造することができる。別法として、免疫
グロブリン生殖系遺伝子を、その可変領域の相補性決定
領域3が縮重プライマーを用いるPCRによって増幅され
る、半合成抗体レパートリーを作製するために使用する
ことができる。これらのいわゆる単一ポットライブラリ
ーは、免疫ライブラリーに比べて、多数の抗原に対する
抗体断片を１つの単一ライブラリーから単離することが
できるという利点を有する。

【００６０】未処理のレパートリー由来の断片を有する
個々のドメインの鎖をシャッフルすることによる、また
はバクテリアミューテーター系統、およびストリンジェ
ント条件下で再選択することによって単離される改良特
性を有する抗体断片を用いることによる、ランダム突然
変異誘発、コドンに基づいた突然変異誘発、または位置
指定突然変異誘発の手段によって既存の抗体断片から製
造された新しいライブラリーを用いたファージディスプ
レイ技術により、抗体断片の親和性をさらに増強するこ
とができる。さらに、ネズミ抗体断片を、可変ドメイン
の１つをヒトレパートリーで段階的に置換し、続いても
との抗原を用いた選択（ガイドセレクション）によって
ヒト化することができる。別法として、意図したヒト抗
体の超可変領域の元のネズミ抗体の対応領域での置換に
よって、ネズミ抗体のヒト化が達成される。

【００６１】8.1.2.活性化ドメイン[構成要素b₁)]およ
びＤＮＡ結合ドメイン[構成要素b₃)] 本発明の意味の範囲内で、転写因子の活性化ドメインお
よびＤＮＡ結合ドメインとして入手可能なすべての遺伝
子を、構成要素b)に用いることができる。これらのドメ
インの例の記載は、本発明を制限することを意図したも
のではない。 活性化ドメイン[構成要素b₁)] HSV1-VP16の酸性トランス活性化ドメイン(TAD)に対する
ｃＤＮＡ（アミノ酸406〜488; Triezenberg et al., Ge
nes Developm. 2: 718 (1988);Triezenberg,Curr. Opi
n. Gen. Developm. 5: 190 (1995)またはアミノ酸413〜
490;Regier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,
883 (1993)）の、またはOct 2の活性化ドメイン（アミ
ノ酸438〜479; Tanaka et al., Mol. Cell. Biol. 14:
6046 (1994)またはアミノ酸3〜154; Das et al., Natu
re 374: 657 (1995)）の、またはSP1の活性化ドメイン
（アミノ酸340〜485; Courey and Tijan, Cell 55, 887
(1988)）の、またはNFYの活性化ドメイン（アミノ酸1〜
233; Li et al., J. Biol. Chem. 267, 8984(1992); va
n Hujisduijnen et al., EMBO J. 9, 3119 (1990); Sin
ha et al.,J. Biol.Chem. 92, 1624 (1995); Coustry e
t al., J. Biol. Chem. 270, 468(1995)）の、またはIT
F2の活性化ドメイン（アミノ酸2〜452; Seipei et al.,
EMBO J. 13, 4961,1992)）の、またはC-Mycの活性化ド
メイン（アミノ酸1〜262; Eilera et al.）の、またはC
TFの活性化ドメイン（アミノ酸399〜499; Mermod et a
l., Cell 58, 741(1989); Das and Herr, Nature 374,
657 (1995))の少なくとも１つの配列。 ＤＮＡ結合ドメイン[構成要素b₃)] Gal4タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸1〜14
7; Chasman and Komberg, Mol. Cell. Biol. 10:2916
(1990))の、またはLexAタンパク質(アミノ酸1〜81; Kim
et al., Science 255: 203 (1992)または全LexAタンパ
ク質(アミノ酸1〜202; Brent et al., Cell 43: 729 (1
985))の、またはlacリプレッサー(lac I)タンパク質(Br
own et al., Cell 49: 603 (1987); Fuerst et al., PN
AS USA 86: 2549 (1989))の、またはテトラサイクリン
リプレッサー(tet R)タンパク質(Gossen et al., PNAS
USA89:5547(1992); Dingermann et al., EMBO J. 11: 1
487 (1992))の、またはZFHD1タンパク質(Pomerantz et
al., Science 267: 93 (1995))の少なくとも１つの配
列。

【００６２】本発明の意味の範囲内で、ＤＮＡ結合ドメ
インの3'末端に核局在化シグナル(NLS)を付加すること
が有利である。 8.2.構成要素b)によって活性化され得るプロモーターユ
ニットII[構成要素c)]活性化配列 この活性化配列の選択は、転写因子[構成要素b)]に対す
る遺伝子におけるＤＮＡ結合ドメイン[構成要素b₃)]の
選択に依存する。一例に、8.1.2で挙げたＤＮＡ結合ド
メインの例として以下の可能性が順に存在する。

【００６３】8.2.1.可能性A) Gal4タンパク質(Chasman and Kornberg, Mol. Cell. Bi
ol. 10, 2916 (1990))が結合する少なくとも１つの配列
[ヌクレオチド配列：5'-CGGACAACTGTTGACCG-3'、配列番
号1]を含み、さらに（その3'末端へ） SV40の基本プロモーター （ヌクレオチド48〜5191; Tooze（編）,DNA Tumor Viru
ses (Cold Spring Harbor New York, New York; Cold S
pring Harbor Laboratory) 、またはc-fosのプロモータ
ー(Das et al., Nature 374, 657 (1995))、またはU2 s
n ＲＮＡプロモーター、またはHSV TKのプロモーター(P
apavassiliou et al., J. Biol. Chem. 265, 9402 (199
0); Park et al., Molec. Endocrinol. 7, 319 (1993))
が付加される活性化配列

【００６４】8.2.2.可能性B) LexAタンパク質[LexAオペレーター; Brent et al., Nat
ure 612, 312 (1984)]が結合する少なくとも１つの配列
[ヌクレオチド配列5'-TACTGTATGTACATACAGTA-3'配列番
号2]を含み、さらに（その3'末端へ） SV40の基本プロモーター（核酸48〜5191; Tooze（編）,
DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, Ne
w York; Cold Spring Harbor Laboratory）または別の
プロモーター（可能性A参照）が付加される活性化配列

【００６５】8.2.3.可能性C) lac I受容体タンパク質(Fuerst et al., PNAS USA 86,
2549 (1989); Simonset al., PNAS USA 81, 1624 (198
4))が結合する少なくとも１つのLacオペレーター配列
（ヌクレオチド配列：5'-GAATTGTGAGCGCTCACAATTC-3',
配列番号3）を含み、さらに（その3'末端へ） SV40の基本プロモーター（核酸48〜5191; Tooze（編）,
DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, N.
Y.; Cold Spring Harbor Laboratory）または別のプロ
モーター（可能性A参照）が付加される活性化配列

【００６６】8.2.4.可能性D) テトラサイクリン受容体(tet R)タンパク質が結合する
少なくとも１つのテトラサイクリンオペレーター(tet
O)配列（ヌクレオチド配列：5'-TCGAGTTTACCACTCCCTATC
AGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3'、配列番号4）を含み、さら
に（その3'末端へ） SV40の基本プロモーター（核酸48〜5191; Tooze（編）,
DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, N.
Y.; Cold Spring Harbor Laboratory）または別のプロ
モーター（可能性A参照）が付加される活性化配列

【００６７】8.2.5.可能性E) ZFHD-1タンパク質(Pomerantz et al., Science 267, 93
(1995))が結合する少なくとも１つの配列[ヌクレオチ
ド配列：5'-TAATGATGGCG-3'、配列番号5]を含み、さら
に（その3'末端へ） SV40の基本プロモーター（核酸48〜5191; Tooze（編）,
DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, Ne
w York; Cold Spring Harbor Laboratory）または別の
プロモーター（可能性A参照）が付加される活性化配列

【００６８】8.3.活性化配列[構成要素a)] 本発明の意味の範囲内で、転写因子に結合した後に3'末
端に隣接して位置する遺伝子の転写を活性化するヌクレ
オチド配列は、活性化配列として用いられる。該活性化
配列の選択は治療される疾病に、さらには導入される標
的細胞に依存する。このように、該活性化配列[構成要
素a)]を制限されない様式で標的細胞特異的に、特定の
代謝条件の下で、細胞周期特異的に、あるいはウイルス
特異的に活性化させればよい。これらプロモーター配列
は既に、特許出願EP95930524.4、EP95931933.6、EP9593
1204.2、EP95931205.9、EP97101507.8、EP97102547.3、
DE19639103.2、およびDE19651443.6に詳細に記載されて
いる。選択されるべきプロモーター配列の例は以下の通
りである。

【００６９】8.3.1.制限されないの様式で活性化され得
るアクチベーター配列およびプロモーター ＲＮＡポリメラーゼIIIのプロモーター ＲＮＡポリメラーゼIIのプロモーター CMVプロモーターおよびエンハンサー SV40プロモーター など

【００７０】8.3.2.ウイルスプロモーターおよびアクチ
ベーター配列 HBV HCV HSV HPV EBV HTLV HIV などHIVプロモーターが用いられる場合、TAR配列[-453
〜-80位,Rosen et al., Cell 41, 813 (1985)]を含む全
LTR配列がウイルス特異的プロモーターとして使用され
る。

【００７１】8.3.3.低酸素症によって引き起こされ得る
エンハンサーなどの、代謝的に活性化可能なプロモータ
ーおよびエンハンサー配列

【００７２】8.3.4.細胞周期特異的に活性化可能なプロ
モーター これらのプロモーターの例としては、cdc25C遺伝子の、
サイクリンA遺伝子の、cdc2遺伝子の、B-myb遺伝子の、
DHFR遺伝子の、E2F-1遺伝子の、またはcdc25B遺伝子の
プロモーター、もしくは細胞増殖中に出現するか、また
は活性化させる転写因子が結合する他の配列がある。こ
れら結合配列には、例えば、c-mycタンパク質が結合す
る配列が含まれる。またこれら結合配列には、Myc Eボ
ックスと呼ばれるヌクレオチド配列[5'-GGAAGCAGACCACG
TGGTCTGCTTCC-3'、配列番号6]; Blackwood and Eisenma
nn, Science 251:1211 (1991)]の単量体または多量体も
含まれる。

【００７３】8.3.5.相当するリプレッサーと組み合わせ
たテトラサイクリンオペレーターなどのテトラサイクリ
ンによって活性化され得るプロモーター

【００７４】8.3.6.キメラプロモーター キメラプロモーターとは、細胞特異的に、代謝的に、ま
たはウイルス特異的に活性化され得る上流アクチベータ
ー配列と、抑制タンパク質が結合し、それにより細胞周
期のＧ₀およびＧ₁期において上流アクチベーター配列の
活性化を阻害することができる、ヌクレオチド配列CDE-
CHRまたはE2FBS-CHRを含む下流プロモーターモジュール
との組み合わせである(PCT/GB94/17366; Lucibello et
al., EMBO J. 14, 12 (1994))。

【００７５】8.3.7.細胞特異的に活性化可能なプロモー
ター これらには好ましくは、選択細胞で優先的に形成される
タンパク質をコードするそれら遺伝子に由来するプロモ
ーターまたはエンハンサーを含んでなるプロモーター配
列またはアクチベーター配列が含まれる。例えば、本発
明の意味の範囲内で、以下のタンパク質に対するプロモ
ーターが以下の細胞に使用されることが好ましい。

【００７６】8.3.7.1.内皮細胞で活性化されるプロモー
ターおよびアクチベーター配列 脳特異的内皮グルコース-1輸送体 エンドグリン VEGF受容体1(fit-1) VEGF受容体2(fit-1,KDR) tie-1またはtie-2 B61受容体（Eck受容体） B61 エンドセリン、特にエンドセリンBまたはエンドセリン1 エンドセリン受容体、特にはエンドセリンB受容体 マンノース6-リン酸受容体 フォンビルブラント因子 IL-1αおよびIL-1β IL-1受容体 血管細胞接着分子(VCAM-1) 合成アクチベーター配列 天然の内皮細胞特異的プロモーターの代替物として、内
皮細胞で優先的に、または選択的に活性を有する転写因
子が結合するオリゴマー化部位を含んでなる合成アクチ
ベーター配列を作製して使用することもできる。例とし
ては、そのエンドセリン1遺伝子内の結合部位が5'-TTAT
CT-3'である、転写因子GATA-2が挙げられる[Lee et a
l., Bio. Chem. 266, 16188 (1991); Dormann et al.,
J. Biol.Chem. 267, 1279 (1992)およびWilson et al.,
Mol. Cell Biol.10, 4854 (1990)]。

【００７７】8.3.7.2.活性化内皮細胞近傍の細胞で活性
化されるプロモーターまたはアクチベーター配列 VEGF VEGF遺伝子に対する遺伝子調節配列は5'フランキング領
域、3'フランキング領域、c-Src遺伝子またはv-Src遺伝
子である。マウス乳ガンウイルスプロモーターのステロ
イドホルモン受容体およびそれらのプロモーターエレメ
ント(Truss and Beato, Endocr. Rev.14, 459 (1993))

【００７８】8.3.7.3.特定の平滑筋細胞における筋肉細
胞で活性化されるプロモーターまたはアクチベーター配
列 トロポミオシン α-アクチン α-ミオシン PDGFに対する受容体 FGFに対する受容体 MRF-4 ホスホフルクトキナーゼA ホスホグリセレートムターゼ トロポニンC ミオゲニン エンドセリンAに対する受容体 デスミン VEGF 該VEGFに対する遺伝子調節配列はすでに「活性化内皮細
胞近傍の細胞で活性化されるプロモーター」の節で挙げ
られている（前記参照） 「人工」プロモーター ヘリックス−ループ−ヘリックス(HLH)ファミリーの因
子（MyoD、 Myf-5、ミオゲニン、MRF4）は、筋肉特異的
転写因子であると報告されている。筋肉特異的転写因子
にはまた、ジンクフィンガータンパク質GATA-4が含まれ
る。HLHタンパク質およびGATA-4は筋肉特異的遺伝子の
プロモーターを用いた場合のみならず、異なる情況で人
工プロモーターを用いてもまた筋肉特異的な転写を示
す。この特性を有する人工プロモーターの例としては、
Eボックス(Myo D)などの筋肉特異的HLHタンパク質が結
合する多重コピーの（ＤＮＡ）部位（例えば4xAGCAGGTG
TTGGGAGGC、配列番号7）、またはα-ミオシン重鎖遺伝
子のGATA-4が結合する多重コピーのＤＮＡ部位（例えば
5'-GGCCGATGGGCA GATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG-3'、
配列番号8）がある。

【００７９】8.3.7.4.グリア細胞で活性化されるプロモ
ーターおよびアクチベーター配列 これらには特に以下のタンパク質、 シュワン細胞特異的タンパク質ペリアキシン グルタミンシンターゼ グリア細胞特異的タンパク質（グリア繊維酸性タンパク
質＝GFAP） グリア細胞タンパク質S100b IL-6(CNTF) 5-HT受容体 TNFα IL-10 インスリン様成長因子 VEGF VEGF遺伝子に対する遺伝子調節配列はすでに上に挙げら
れている。をコードする遺伝子に由来する遺伝子調節配
列またはエレメントが含まれる。

【００８０】8.3.7.5.造血細胞で活性化されるプロモー
ターおよびアクチベーター配列 この性質の遺伝子調節配列には、造血細胞で、またはス
トロマなどの隣接細胞で発現されるサイトカインに関す
る遺伝子に対するプロモーター配列、もしくはその受容
体が含まれる。これらには以下のサイトカインおよびそ
れらの受容体、例えば、 幹細胞因子受容体 幹細胞因子 IL-1α IL-1受容体 IL-3 IL-3受容体(α-サブユニット) IL-3受容体(β-サブユニット) IL-6 IL-6受容体 GM-CSF GM-CSF受容体(α-鎖) インターフェロン調節因子1(IRF-1) IRF-1のプロモーターはIL-6により、IFNγまたはIFNβ
によるのと同様に十分に活 性化される エリトロポエチン エリトロポエチン受容体 に対するプロモーター配列が含まれる。

【００８１】8.3.7.6.リンパ球および／またはマクロフ
ァージで活性化されるプロモーターおよびアクチベータ
ー配列 これらには、例えば、サイトカイン、サイトカイン受容
体および接着分子、並びに抗体のFc断片に対する受容体
に対する遺伝子のプロモーターおよびアクチベーター配
列が含まれる。例としては： IL-1受容体 IL-1α IL-1β IL-2 IL-2受容体 IL-3 IL-3受容体(α-サブユニット) IL-3受容体(β-サブユニット) IL-4 IL-4受容体 IL-5 IL-6 IL-6受容体 インターフェロン調節因子1(IRF-1) IRF-1のプロモーターはIL-6により、IFNγまたはIFNβ
によるのと同様に十分に活性化される IFNγ-応答プロモーター IL-7 IL-8 IL-10 IL-11 IFNγ GM-CSF GM-CFS受容体(α-鎖) IL-13 LIF マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)受容体 マクロファージスカベンジャー受容体IおよびII型 MAC-1（白血球作用抗原） LFA-1α（白血球作用抗原） p150,95（白血球作用抗原） が挙げられる。

【００８２】8.3.7.7.滑膜細胞で活性化されるプロモー
ターおよびアクチベーター配列 これらには、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、
例えば MMP-1（介在性コラゲナーゼ） MMP-3（ストロメライシン／トランシン） に対するプロモーター配列が含まれる。それらにはさら
に組織阻害剤メタロプロテアーゼ(TIMP)、例えば TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 に対するプロモーター配列が含まれる。

【００８３】8.3.7.8.白血病細胞で活性化されるプロモ
ーターおよびアクチベーター配列 これらには例えば、 c-myc HSP-70 bcl-1/サイクリンD-1 bcl-2 IL-6 IL-10 TNFα,TNFβ HOX-11 BCR-Abl E2A-PBX-1 PML-RARA（前骨髄細胞性白血病-レチノイン酸受容体） c-myc c-mycタンパク質はMyc Eボックスと呼ばれるヌクレオチ
ド配列(5'-GGAAGCAGACCAGCTGGTCT GCTTCC-3'、配列番号
6）の多量体に結合してそれを活性化させるに対するプ
ロモーターが挙げられる。

【００８４】8.3.7.9.腫瘍細胞で活性化されるプロモー
ターまたはアクチベーター配列 腫瘍細胞で形成する、または活性化される転写因子がそ
れと相互作用する遺伝子調節ヌクレオチド配列が、プロ
モーターまたはアクチベーター配列であると認識されて
いる。本発明の意味の範囲内で、好ましいプロモーター
またはアクチベーター配列には、特にガン細胞または肉
腫細胞で形成されるタンパク質をコードする遺伝子由来
の遺伝子調節配列またはエレメントが含まれる。かくし
て、小細胞気管支ガンの場合にはN-CAMタンパク質のプ
ロモーターを、卵巣ガンの場合には「肝炎成長因子」受
容体のまたはL-プラスチンのプロモーターを、および膵
臓ガンの場合にはL-プラスチンのまたは多型性上皮ムチ
ン(PEM)のプロモーターを使用することが好ましい。

【００８５】8.4.エフェクター遺伝子[構成要素d)] 本発明の意味の範囲内で、エフェクター遺伝子[構成要
素d)]は、疾病の予防および／または治療のための活性
化合物をコードする。エフェクター遺伝子およびプロモ
ーター配列は、疾病の治療の性質に関して、また導入さ
れるべき標的細胞を考慮して選択される。例えば、以下
の組み合わせのプロモーター配列およびエフェクター遺
伝子は、以下の疾病の場合に選択される（詳しい記載
は、特許出願EP95930524.4、EP95931933.6、EP9593120
4.2、EP95931205.9、EP97101507.5、DE19617851.7、DE1
9639103.2号およびDE19651443.6にすでに与えられてお
り、これらは本明細書の一部とみなす）。

【００８６】8.4.1.腫瘍の治療 1.1.標的細胞： 増殖内皮細胞または内皮細胞に隣接しているストロマ細
胞および筋細胞、または腫瘍細胞または白血病細胞。 1.2.プロモーター：内皮細胞特異的かつ細胞周期特異
的、または細胞非特異的または筋細胞特異的かつ細胞周
期特異的、または腫瘍細胞特異的（固体腫瘍、白血病）
かつ細胞周期特異的

【００８７】1.3)細胞増殖の阻害剤用のエフェクター遺
伝子、例えば網膜芽細胞腫タンパク質(pRb=p110)または
それに関連するp107およびp130タンパク質 網膜芽細胞腫タンパク質(pRb/p110)およびそれに関連す
るp107およびp130タンパク質は、リン酸化によって不活
化されている。それによって損なわれた後者が機能する
ことなく発現したタンパク質の不活化部位に対する突然
変異を示すこれら細胞周期阻害剤のそれら遺伝子の使用
が優先的に与えられる。これらの突然変異の例はp110と
記載されている。p107タンパク質またはp130タンパク質
に対するＤＮＡ配列は、類似の方法で突然変異誘発され
る。 p53タンパク質 p53タンパク質は、MDM2などの特殊なタンパク質と結合
することによるか、または脱リン酸化したC末端セリン
によるp53のオリゴマー化によるかのいずれかで、細胞
内で不活性化される。結果として、セリン392によってC
末端で切断されているp53タンパク質に対するＤＮＡ配
列を用いることが優先される。 p21(WAF-1) p16タンパク質 他のcdk阻害剤 GADD45タンパク質 bakタンパク質 調節タンパク質に対する結合タンパク質(II.1.を参照)

【００８８】1.4.凝固誘導因子および血管形成インヒビ
ターに対するエフェクター遺伝子、例えば： プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター(PAL-1) PAI-2 PAI-3 アンギオスタチン インターフェロン(IFNα，IFNβ，またはIFNγ） 血小板因子4 TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 白血病阻害因子(LIF) 組織因子(TF)およびその凝固活性断片

【００８９】1.5)例えば パーフォリン グランザイム IL-2 IL-4 IL-12 IFNα，IFNβ，またはIFNγなどのインターフェロン TNFαまたはTNFβなどのTNF オンコスタチンM スフィンゴミエリナーゼ マガイニンおよびマガイニン誘導体 に対する細胞増殖抑制タンパク質および細胞障害性タン
パク質に対するエフェクター遺伝子

【００９０】1.6.細胞増殖抑制抗体または細胞障害性抗
体に対する、並びに抗原結合抗体断片と細胞増殖抑制タ
ンパク質、細胞障害性タンパク質または炎症性タンパク
質、もしくは酵素との間で形成される融合タンパク質に
対するエフェクター遺伝子。細胞増殖抑制抗体または細
胞障害性抗体には、例えば、Burrows et al. (Pharmac.
Ther. 64, 155 (1994))、Hughes et al., (Cancer Re
s. 49, 6214 (1989))およびMaruyama et al., (PNAS US
A 87, 5744 (1990))により記載されているように、内皮
細胞の膜構造に向けられるものが含まれ、それらには特
に、VEGF受容体に対する抗体が含まれる。さらにそれら
には、腫瘍細胞上の膜構造に向けられる細胞増殖抑制抗
体または細胞障害性抗体が含まれる。この性質を有する
抗体は、例えば、Sedlacek et al., Contrib. to Onco
l. 32, Karger Verlag, Munich (1988)およびContrib.
toOncol. 43, Karger Verlag, Munich (1992)によって
概説されている。他の例としては、Sialyl Lewisに対す
る、Ｔ細胞によって認識される腫瘍上のペプチドに対す
る、ガン遺伝子によって発現されるタンパク質に対す
る、GD3、GD2、GM2、9-0-アセチルGD3およびフコシルGM
1などのガングリオシド類に対する、血液型抗原および
それらの前駆体に対する、多型性上皮ムチン上の抗原に
対する、並びに熱ショックタンパク質上の抗原に対する
抗体がある。さらにそれらには、白血病細胞の膜構造に
向けられる抗体が含まれる。この性質を有する多数のモ
ノクローナル抗体はすでに、診断および治療法として記
載されている（Kristensen, Danish Medical Bulletin
41, 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 38, 3
(1990); Drexler et al.,Leuk. Res. 10, 279 (1986);N
aeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al., C
urr. Opin. Oncol. 4,847 (1992); Drexler et al., Bl
ut 57, 327 (1988); Freedman et al., Cancer Invest.
9, 69 (1991)で概説）。白血病のタイプに依存して、
以下の膜抗原に向けられるモノクローナル抗体、または
それらの抗原結合抗体断片が、例えばリガンドとして使
用するのに適している。

【００９１】 細胞 膜抗原 AML CD13 CD15 CD33 CAMAL シアロシル-Le B-CLL CD5 CD1c CD23 膜のイディオタイプおよびアイソタイプ 免疫グロブリン T-CLL CD33 M38 IL-2受容体 Ｔ細胞受容体 ALL CALLA CD19 非ホジキンリンパ球

【００９２】ネズミ抗体のヒト化、並びにFabおよびre
c. Fv断片に対する遺伝子の作製および至適化は、当業
者に公知の技術に従って行われる(Winter et al., Natu
re 349, 293(1991); Hoogenbooms et al., Rev. Tr. Tr
ansfus. Hemobiol. 36, 19(1993); Girol. Mol. Immuno
l. 28, 1379(1991)またはHuston et al., Intern. Rev.
Immunol. 10, 195(1993))。rec. Fv断片の細胞増殖抑制
タンパク質、細胞障害性タンパク質または炎症性タンパ
ク質または酵素との融合も同様に、当業者に公知の技術
の状態に従って行われる。

【００９３】1.7.標的細胞結合リガンドと細胞増殖抑制
タンパク質と細胞障害性タンパク質から形成される融合
タンパク質に対するエフェクター遺伝子。該リガンドに
は、内皮細胞上の膜構造または膜受容体と結合するすべ
ての物質が含まれる。例としては、IL-1などのサイトカ
イン類、もしくは、PDGF、bFGF、VEGFおよびTGFなどの
内皮細胞によって発現される受容体と結合する成長因
子、またはそれらの断片、またはそれらの構成配列さら
にそれらには、活性化および／または増殖内皮細胞と結
合する接着分子が含まれる。これらの例としては、SLe
x、LFA-1、MAC-1、LECAM-1、VLA-4またはビトロネクチ
ンがある。さらにそれらには、腫瘍または白血病細胞の
膜構造または膜受容体と結合する物質が含まれる。これ
らの例としては、ホルモン、もしくは白血病細胞または
腫瘍細胞によって発現される受容体と結合する成長因
子、またはそれらの断片、またはそれらの構成配列があ
る。

【００９４】この性質を有する成長因子はすでに記載さ
れている（Cross et al., Cell 64,271 (1991)、Aulitz
ky et al., Drugs 48, 667 （1994）、Moore, Clin. Ca
ncer Res. 1, 3 (1995), Van Kooten et al., Leuk. Ly
mph. 12, 27 (1993)で概説）。標的細胞と結合するこれ
らのリガンドの遺伝子の細胞増殖抑制タンパク質、細胞
障害性タンパク質または炎症性タンパク質または酵素と
の融合は、当業者に公知な方法を用いて技術の水準に従
って達成される。

【００９５】1.8.例えば、 IL-1 IL-2 RANTES(MCP-2) 単球走化性因子および活性化因子(MCAF) IL-8 マクロファージ炎症タンパク質-1(MIP-1α、-β) 好中球活性化タンパク質-2(NAP-2) IL-3 IL-5 ヒト白血病阻害因子(LIF) IL-7 IL-11 IL-13 GM-CSF G-CSF M-CSF の炎症性インデューサーに対するエフェクター遺伝子 機能的にヒト補体因子C3bに相当するコブラ毒因子(CVF)
またはCVFの構成配列、すなわち補体因子Bと結合するこ
とができ、D因子による分割の後にC3変換酵素を構成す
る。 ヒト補体因子C3またはその構成配列C3b CVFと機能的にも構造的にも類似したヒト補体因子C3の
分割産物 サルモネラ・チフィムリウム・ポリンス(Salmonella ty
phimurium porins)、スタフィロコッカス・オーレウス
(Staphylococcus aureus)凝集因子、モジュリン、特に
グラム陰性菌由来のモジュリン、レジュネラ菌またはB
型インフルエンザ菌またはクレブシエラ菌の主要外部膜
タンパク質、またはG群連鎖球菌のM分子などの補体を活
性化する、または炎症を誘引する細菌タンパク質

【００９６】1.9.細胞分裂抑制剤の前駆体を活性化する
酵素に対する、例えば、不活性な前駆体を（前駆薬剤）
を活性細胞分裂抑制剤（薬）へと変換するまたは分割す
る酵素に対するエフェクター遺伝子。この性質を有する
物質、並びにそれらと密接に関連している場合の前駆薬
剤および薬剤がすでにDeonarain et al., (Br. J. Canc
er 70, 786 (1994)、Mullen,Pharmac.Ther. 63, 199 (1
994)およびHarris et al.(Gene Ther. 1, 170 (1994))
によって概説されている。例えば、以下の酵素： 単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ 水痘ウイルスチミジンキナーゼ 細菌ニトロレダクターゼ 細菌β-グルクロニダーゼ セカル・セレアレ(Secale cereale)由来の植物β-グル
クロニダーゼ ヒトβ-グルクロニダーゼ ヒトカルボキシペプチダーゼ(CB)、例えばマスト細胞CB
-A、膵臓CB-B、細菌カルボキシペプチダーゼ 細菌β-ラクタマーゼ 細菌シトシンデアミナーゼ ヒトカタラーゼまたはペルオキシダーゼ ホスファターゼ、特にヒトアルカリ性ホスファターゼ、
ヒト酸性前立腺ホスファターゼ、または５型酸性ホスフ
ァターゼ オキシダーゼ、特にヒトリシルオキシダーゼ、またはヒ
ト酸性D-アミノオキシダーゼ ペルオキシダーゼ、特にヒトグルタチオンペルオキシダ
ーゼ、ヒト好酸球ペルオキシダーゼ、またはヒト甲状腺
ペルオキシダーゼ ガラクトシダーゼ の一つに対するＤＮＡ配列が使用される。

【００９７】8.4.2.自己免疫疾患および炎症の治療 2.1.標的細胞： 増殖内皮細胞 マクロファージおよび／またはリンパ球、または滑膜細
胞 2.2.プロモーター：内皮細胞特異的または細胞周期特異
的、もしくはマクロファージ特異的および／またはリン
パ球特異的および／または細胞周期特異的、もしくは滑
膜細胞特異的および／または細胞周期特異的 2.3.例えば、 IFNβ INFγ IL-10 IL-4に対する抗体または抗体断片 可溶性IL-4受容体 IL-2 TGfβ のアレルギーの治療に関するエフェクター遺伝子

【００９８】2.4.例えば、 IL-10 TGFβ 可溶性IL-1受容体 可溶性IL-2受容体 IL-1受容体アンタゴニスト 可溶性IL-6受容体 リンカーによって結合される免疫抑制抗体またはそれら
のV_HおよびV_L含有断片、もしくはそれらのV_HおよびV_L断
片。免疫抑制抗体の例としては、Ｔ細胞受容体またはそ
のCD3複合体に特異的であるか、もしくはCD4またはCD8
に対する抗体、およびIL-2受容体、IL-1受容体またはIL
-4受容体に対する抗体、もしくは接着分子CD2、LFA-1,C
D28またはCD40に対する抗体があるに対する移植器官の
拒絶を防ぐためのエフェクター遺伝子

【００９９】2.5.例えば、 TGFβ IFNα IFNβ INFγ IL-12 可溶性IL-4受容体 可溶性IL-6受容体 免疫抑制抗体またはそれらのV_HおよびV_L含有断片に関す
る抗体介在自己免疫疾患の治療のためのエフェクター遺
伝子

【０１００】2.6.例えば、 IL-6 IL-9 IL-10 IL-13 TNFαまたはTNFβ 免疫抑制抗体またはそのV_HおよびV_L含有断片に関する細
胞介在自己免疫疾患の治療のためのエフェクター遺伝子

【０１０１】2.7.細胞増殖、細胞分裂抑制タンパク質ま
たは細胞障害性タンパク質および細胞分裂抑制剤の前駆
体を活性化する酵素の阻害剤に対するエフェクター遺伝
子 この性質を有するタンパク質をコードする遺伝子の例
は、すでに「腫瘍治療のためのエフェクター遺伝子」で
挙げられている。その節においてすでに記載されたもの
と同様の形態で、本発明の意味の範囲内で、抗体または
これら抗体のFabまたはrec. Fv断片もしくは標的細胞に
特異的な他のリガンド、および前記したサイトカイン、
成長因子、受容体、細胞分裂抑制タンパク質または細胞
障害性タンパク質、および酵素から形成される融合タン
パク質をコードするエフェクター遺伝子を使用すること
ができる。

【０１０２】2.8.関節炎の治療のためのエフェクター遺
伝子 本発明の意味の範囲内で、その発現タンパク質が直接的
もしくは間接的に例えば関節の炎症を阻害する、および
／または関節内における細胞外マトリックス（軟骨、結
合組織）の再構成を促進するエフェクター遺伝子が選択
される。例としては、 IL-1受容体アンタゴニスト(IL-1 RA);IL-1 RAはIL-1
α、βの結合を阻害する 可溶性IL-1受容体；可溶性IL-1受容体はIL-1に結合して
これを不活化する IL-6 IL-6は滑膜細胞および軟骨細胞によってTIMPおよびスパ
ーオキシドの分泌を増加させ、かつIL-1およびTNFαを
減少させる 可溶性TNF受容体 可溶性TNF受容体はTNFに結合してこれを不活化する IL-4 IL-4はLI-1、TNFαおよびMMPの形成、並びに分泌を阻害
する IL-10 IL-10はIL-1、TNFαおよびMMPの形成並びに分泌を阻害
し、かつTIMPの分泌を増加させる インスリン様成長因子(IGF-1) IGF-1は細胞外マトリックスの合成を刺激する TGFβ、特にTGFβ1およびTGFβ2TGFβは細胞外マトリッ
クスの合成を刺激するスーパーオキシドジスムターゼTI
MP、特にTIMP-1、TIMP-2またはTIMP-3がある。

【０１０３】8.4.3.血球形成不全の治療 3.1.標的細胞：造血系の増殖未熟細胞、または造血細胞
に隣接するストロマ細胞 3.2.プロモーター：造血細胞に特異的かつ／または細胞
周期特異的細胞非特異的かつ細胞周期特異的 3.3.例えば エリトロポエチンに関する貧血症の治療のためのエフェ
クター遺伝子 3.4.例えば G-CSF GM-CSF M-CSF に関する白血球減少症の治療のためのエフェクター遺伝
子 3.5.例えば IL-3 白血病阻害因子(LIF) IL-11 トロンボポエチン に関する血小板減少症の治療のためのエフェクター遺伝
子

【０１０４】8.4.4.神経系に対する損傷の治療 4.1.標的細胞： グリア細胞または増殖内皮細胞 4.2.プロモーター：グリア細胞特異的かつ細胞周期特異
的、または内皮細胞特異的かつ細胞周期特異的、または
非特異的かつ細胞周期特異的 4.3.神経成長因子に対するエフェクター遺伝子、例えば FGF 神経成長因子(NGF) 脳由来神経栄養因子(BDNF) ニューロトロフィン3(NT-3) ニューロトロフィン4(NT-4) 毛様体神経栄養因子(CNTF) 4.4.例えば チロシンヒドロキシラーゼ ドーパデカルボキシラーゼ に関する酵素に対するエフェクター遺伝子 4.5.サイトカイン類および、例えば TGFβ 可溶性TNF受容体 TNF受容体はTNFαを無効にする IL-10 IL-10はIFNγ、TNFα、IL-2およびIL-4の形成を阻害す
る 可溶性IL-1受容体 IL-1受容体I IL-1受容体II 可溶性IL-1受容体はIL-1の活性を無効にする IL-1受容体アンタゴニスト 可溶性IL-6受容体 に対するTNFαの神経毒作用を阻害する、または無効に
するそれらのインヒビターに対するエフェクター遺伝子

【０１０５】8.4.5.血液凝固および血液循環系障害の治
療 5.1.標的細胞：内皮細胞、または増殖内皮細胞、または
内皮細胞および平滑筋細胞近傍の体細胞、またはマクロ
ファージ 5.2.プロモーター：細胞非特異的かつ細胞周期特異的、
または内皮細胞、平滑筋細胞またはマクロファージ特異
的、かつ細胞周期特異的 5.3.例えば 組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA) ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター(uPA) tPAおよびuPAのハイブリッド Cタンパク質 ヒルジン C-1Sインヒビター、α1-アンチ抗トリプシン、またはア
ンチトロンビンIIIなどのセリンプロテナーゼインヒビ
ター（セルピン類） 組織因子経路インヒビター(TFPI) に対する凝固阻害、または繊維素溶解を促進する構造遺
伝子 5.4.例えば F VIII F IX フォンビルブラント因子 F XIII PAI-1 PAI-2 組織因子およびその断片に関する凝固を誘導するエフェ
クター遺伝子 5.5.例えば VEGF FGF の血管形成因子に対するエフェクター遺伝子

【０１０６】5.6.例えば カリクレイン 内皮細胞ＮＯシンターゼに関する血圧低下のためのエフ
ェクター遺伝子 5.7.例えば抗増殖タンパク質、細胞分裂抑制タンパク
質、または細胞障害性タンパク質、もしくはすでに上に
挙げたような細胞分裂抑制剤前駆体の細胞分裂抑制剤へ
の分割のための酵素（腫瘍下）もしくはこれらの活性化
合物の１つとリガンド、例えば、筋細胞に特異的な抗体
または抗体断片とを含んでなる融合タンパク質に関する
内皮層の損傷に続く、平滑筋細胞の増殖を阻害するエフ
ェクター遺伝子 5.8.例えば アルブミン C1インアクチベーター 血清コリンエステラーゼ トランスフェリン 1-アンチトリプシン に関する他の血漿タンパク質に対するエフェクター遺伝
子

【０１０７】8.4.6.予防接種 6.1.標的細胞：筋細胞またはマクロファージおよび／ま
たはリンパ球内皮細胞 6.2.プロモーター：非特異的かつ細胞周期特異的、もし
くは標的細胞特異的かつ細胞周期特異的 6.3.感染症の予防のためのエフェクター遺伝子 従来、有効なワクチンの製造の可能性は制限されてき
た。結果として、ＤＮＡワクチンの技術が開発された。
しかしながら、これらＤＮＡワクチンは効力の点で問題
が生じる(Finan et al.,Int. J. Immunopharm. 17,79(1
995); Donnelly et al., Immunol. 2, 20(1994))。本発
明によれば、ＤＮＡワクチンはの効力は大いに期待でき
る。選択されるべき活性物質とは、感染性病原体によっ
て形成され、免疫反応を誘引することによって、すなわ
ち抗体結合によって、および／または細胞障害性Ｔリン
パ球によって、その病原体の無力化および／または妨害
をもたらすタンパク質に対するＤＮＡである。この性質
を有するいわゆる無力化抗原は、予防接種抗原としてす
でに応用されている（Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 32
7, 263 (1992)の概説を参照）。

【０１０８】本発明の意味の範囲内で、以下の病原体： Ａ型インフルエンザウイルス HIV 狂犬病ウイルス HSV（単純ヘルペスウイルス） RSV（RSウイルス） パラインフルエンザウイルス ロタウイルス VZV（水痘帯状ヘルペスウイルス） CMV（サイトメガロウイルス） はしかウイルス HPV（ヒトパピローマウイルス） HBV（Ｂ型肝炎ウイルス） HCV（Ｃ型肝炎ウイルス） HDV（Ｄ型肝炎ウイルス） HEV（Ｅ型肝炎ウイルス） HAV（Ａ型肝炎ウイルス） コレラ菌抗原 ボレリア・ブルグドレエフィリ(Borrelia burgdorferi) ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori) マラリア抗原 由来の抗原の無力化をコードするＤＮＡが好ましい。し
かしながら、本発明の意味の範囲内で、この性質を有す
る活性物質にはまた、その抗原結合構造（相補性決定領
域）が感染性病原体の無力化抗原のタンパク質構造また
は炭水化物構造のコピーからなる抗イディオタイプ抗体
またはその抗原結合断片が含まれる。

【０１０９】この性質を有する抗イディオタイプ抗体
は、特に細菌性の感染性病原体の場合には、炭水化物抗
原に置き換わる。この性質を有する抗イディオタイプ抗
体およびそれらの切断産物は、Hawkis et al., (J. Imm
unother. 14, 273 (1993))およびWesterinkおよびApice
lla(Springer Seminars in Immunopathol. 15, 227 (19
93))によって概説されている。 6.4.「腫瘍ワクチン」のエフェクター遺伝子 これらには腫瘍細胞上の抗原が含まれる。この性質を有
する抗原は、例えば、Sedlacek et al., Contrib. to O
ncol.32, Karger Verlag, Munich (1988)およびContri
b. to Oncol 43, Karger Verlag, Munich (1992)により
概説されている。他の例は、以下のタンパク質抗原また
は以下の非タンパク質抗原： ガングリオシド シアリル・ルイス Ｔ細胞により認識される腫瘍上のペプチド ガン遺伝子により発現されるタンパク質 血液型抗原およびそれらの前駆体 腫瘍会合ムチン上の抗原 に相当するアンチイディオタイプ抗体の可変領域(V_L,
V_H)の遺伝子により構成される。

【０１１０】8.7.4.慢性感染症の治療 7.1.標的細胞： 肝細胞 リンパ球および／またはマクロファージ 上皮細胞 内皮細胞 7.2.プロモーター：ウイルス特異的、または細胞特異
的、かつ細胞周期特異的 7.3.例えば細胞分裂抑制作用、アポトーシス作用、また
は細胞障害作用を示すタンパク質抗ウイルス性物質また
は細胞障害性物質の前駆体をその活性物質へと分割する
酵素 7.4.抗ウイルスタンパク質に対するエフェクター遺伝子 抗ウイルス作用を有するサイトカイン類および成長因子 これらには、例えば、IFNα、INFβ、INFγ、TNFβ、TN
Fα、IL-1、またはTGFβがある。各ウイルスを不活化す
る特異性を有する抗体、またはそれらのV_HおよびV_L含有
断片、またはそれらのVHおよびVL断片、それらはリンカ
ーによって結合され、すでに記載されたように製造され
る。

【０１１１】ウイルス抗原に対する抗体の例は： 抗HBV 抗HCV 抗HSV 抗HPV 抗HIV 抗EBV 抗HTLV 抗コキサッキーウイルス 抗ハンタンウイルス Rev結合タンパク質。これらタンパク質はRevＲＮＡに結
合して、レトロウイルス遺伝子発現におけるRev依存転
写後段階を阻害する。 RBP9-27 RBP1-8U RBP1-8D RBP1-8の偽遺伝子 細胞周期制御タンパク質に関する遺伝子のｍＲＮＡ、ま
たはウイルスのｍＲＮＡを消化するリボザイム。HIVに
対して触媒効果を有するリボザイムは、例えば、Christ
offersen et al.,J. Med. Chem. 38, 2033 (1995)によ
り概説されている。である。

【０１１２】7.5.抗菌タンパク質に対するエフェクター
遺伝子 抗菌タンパク質には、例えば、細菌毒性を中和するか、
または細菌にオプソニンを作用させる抗体が含まれる。
これら抗体には例えば、 髄膜炎菌(Meningococci)CおよびB 大腸菌(E.coli) ボレリア(Borrelia) シュードモナス(Pseudomonas) ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori) スタフィロコッカス（ブドウ球菌）・オーレウス(Staph
ylococcus aureus) に対する抗体が含まれる。

【０１１３】8.5.同一のまたは異なるエフェクター遺伝
子の組み合わせ さらに本発明は、２つの同一または２つの異なるエフェ
クター遺伝子ｃ[構成要素d)およびd')]のＤＮＡ配列の
組み合わせを含んでなる、自己増強および、適切な薬理
学的制御が可能である発現系に関する。２つのＤＮＡ配
列を確実に発現させるためには、その２つのエフェクタ
ー遺伝子の間に、調節要素として、さらなるプロモータ
ー配列、または好ましくは「インターナル・リボゾーム
・エントリー・サイト(internal ribosome entry site
(IRES)」に対するｃＤＮＡが挿入される。IRESはIRESに
よって互いに連結される２つのＤＮＡ配列を発現するこ
とが可能にする。この性質を有するIRESは、例えば、Mo
ntford and Smith(TIG 11, 179 (1995);Kaufman et a
l., Nucl. Acids Res. 20, 1293 (1992); Dirks et a
l., Gene 128, 247 (1993); Pelletier and Sonenberg,
Nature 334, 320 (1988)およびSugitomo et al., BioT
echn. 12, 694 (1994))により記載されている。例えば
ポリオウイルスのIRES配列（5'UTRの140〜630位）に対
するｃＤＮＡを用いることができる。

【０１１４】本発明の意味の範囲内で、付加的な効果を
示すエフェクター遺伝子は付加的プロモーター配列また
はIRES配列により連結されることが好ましい。本発明の
意味の範囲内では、例えば以下の組み合わせのエフェク
ター遺伝子が好ましい。

【０１１５】8.5.1.腫瘍の治療 同一または異なる、細胞分裂抑制、アポトーシス、細胞
障害性または炎症性タンパク質、もしくは細胞分裂抑制
剤の前駆体を分割する同一または異なる酵素 8.5.2.自己免疫疾患の治療 異なるサイトカイン類または細胞性および／またはホル
モン性免疫反応の阻害に相乗効果を有する受容体異なる
または同一のTIMP 8.5.3.血球形成不全の治療 IL-1、IL-3、IL-6、またはGM-CSFなどの異なる階層分類
上連続したサイトカイン類、およびエリトロポエチン、
G-CSFまたはトロンボポエチン 8.5.4.神経細胞損傷の治療 神経成長因子およびサイトカイン、またはサイトカイン
のインヒビター 8.5.5.血液凝固および血液循環系障害の治療 抗血栓剤および繊維素溶解剤（例えばtPAまたはuPA）ま
たは細胞分裂抑制、アポトーシスまたは細胞障害性タン
パク質および抗血栓剤または繊維素溶解剤 相乗的に作用するいくつかの異なる血液凝固因子、例え
ばF VIIIおよびvWFまたはF VIIIおよびF IX

【０１１６】8.5.6.予防接種 抗原およびIL-1α、IL-1β、IL-2、GM-CSF、IL-3または
IL-4受容体などの免疫刺激性サイトカイン ある感染性病原体の、または異なる感染性病原体の異な
る抗原、もしくはある腫瘍種の、または異なる腫瘍種の
異なる抗原に関するエフェクター遺伝子の好ましい組み
合わせの例である。 8.5.7.ウイルス感染症の治療 抗ウイルスタンパク質および細胞分裂抑制、アポトーシ
スまたは細胞障害性タンパク質 あるウイルスまたはいくつかのウイルスの異なる表面抗
原に対する抗体 8.5.8.細菌感染症の治療 微生物の異なる表面抗原および／または毒素に対する抗
体

【０１１７】8.6.シグナル配列の挿入およびトランスメ
ンブランドメイン 8.6.1.翻訳の増強 翻訳を増強するために、該ヌクレオチド配列GCCACCもし
くはGCCGCCを、プロモーター配列の3'末端、および直接
的にそのシグナルの開始シグナル(ATG)の5'末端、もし
くはトランスメンブラン配列(Kozak,, J. Cell Biol. 1
08, 299 (1989))に挿入することができる。 8.6.2.分泌の促進 エフェクター遺伝子の発現産物の分泌を促進するため
に、そのエフェクター遺伝子のＤＮＡ配列に存在すると
考えられる相同シグナル配列を、細胞外放出を増進する
異種シグナル配列に置換することができる。このよう
に、免疫グロブリンシグナル配列（ＤＮＡ63〜107位; R
iechmann etal., Nature 332, 323 (1988)）またはCEA
シグナル配列（ＤＮＡ33〜134位, Schrewe et al., Mo
l. Cell Biol. 10, 2738 (1990); Berling et al., Can
cer Res. 50, 6534 (1990))またはヒト・レスピレータ
ー・シンシシャル・ウイルス糖タンパク質のシグナル配
列（アミノ酸のｃＤＮＡ38〜50、または48〜65位; Lich
tenstein et al., J. Gen. Virol. 77, 109 (1996))を
挿入することができる。

【０１１８】8.6.3.活性化合物の固定 3.1)別法として、またはシグナル配列に加えて、該活性
化合物を生成する形質導入細胞の細胞膜に該活性化合物
を固定化することを目的として、トランスメンブランド
メインのに対する配列を挿入することができる。このよ
うに、例えば、ヒトマクロファージコロニー刺激因子の
トランスメンブラン配列（ＤＮＡ1485〜1554位; Cosman
et al., Behring Inst. Mitt. 83, 15(1988))、または
ヒトレスピレーター・シンシシャル・ウイルス(RSV)糖
タンパク質Gのシグナルおよびトランスメンブラン領域
に対するＤＮＡ配列（アミノ酸1〜63、もしくはその構
成配列アミノ酸38〜63; Vijaya et al., Mol. Cell Bio
l. 8, 1709 (1988); Lichtenstein et al., J. Gen. Vi
rol. 77, 109 (1996))、またはインフルエンザウイルス
・ノイラミニダーゼのシグナルおよびトランスメンブラ
ン領域に対するＤＮＡ配列（アミノ酸7〜35、もしくは
その構成配列アミノ酸7〜27; Brown et al., J. Virol.
62, 3824 (1988)）をプロモーター配列とエフェクター
遺伝子配列の間に挿入することができる。

【０１１９】3.2)しかしながら、活性化合物を形成する
形質導入細胞の細胞膜に活性化合物を固定化する目的
で、また、糖リン脂質アンカーに対するヌクレオチド配
列を挿入することもできる。糖リン脂質アンカーの挿入
は、エフェクター遺伝子のヌクレオチド配列の3'末端で
なされ、この挿入はシグナル配列の挿入に加えて行うこ
とができる。糖リン脂質アンカーは、例えばCEAに関し
て、N-CAMおよびThy-1などの他の膜タンパク質に関して
記載されている（Ferguson et al., Ann. Rev. Bioche
m. 57, 285 (1988)の総説を参照）。

【０１２０】3.3)本発明によれば、細胞膜に活性化合物
をつなぎ止めるさらなる可能性は、リガンド-活性化合
物融合タンパク質のＤＮＡ配列の使用にある。この融合
タンパク質のリガンドの特異性は、選択された標的細胞
の細胞膜の膜構造に向けられる。細胞表面に結合するリ
ガンドには、表面構造に対して向けられる抗体もしくは
抗体断片が含まれる。例えば内皮細胞。これらには、特
にVEGF受容体に対する、およびキニン受容体に対する抗
体が含まれる。アクチンに対する抗体、もしくはアンギ
オテンシンII受容体に対する抗体、もしくはEGF受容体
やPDGF受容体やFGF受容体などの成長因子受容体に対す
る抗体、もしくはエンドセリンA受容体に対する抗体な
どの筋肉細胞に関するものリガンドはまた、腫瘍細胞膜
上の腫瘍特異的もしくは腫瘍会合抗原に対して向けられ
る抗体もしくはその断片も含む。この性質を有する抗体
は、すでに記載されている。ネズミモノクローナル抗体
は、ヒト化された形態で用いるのが好ましい。当業者に
よく知られている技術を用いて、すでに記載されている
ように、Fabおよびrec.Fv断片およびそれらの融合産物
が製造される。

【０１２１】さらに、該リガンドには選択された各々の
細胞上の膜構造または膜受容体に結合するサイトカイン
類、接着分子、成長因子またはそれらの断片、またはそ
の構成配列、もしくはメディエーターもしくはペプチド
ホルモンなど、すべての活性化合物が含まれる。例とし
ては、IL-1、PDGF、bFGF、VEGF、TGGβもしくはキニン
およびキニンの誘導体または類似体など、内皮細胞のリ
ガンドそれらにはさらに、該リガンドは接着分子が含ま
れる。SLex、LFA-1、MAC-1、LeCAM-1、VLA-4もしくはビ
トロネクチンおよびビトロネクチンの誘導体または類似
体など、この性質を有する接着分子は、すでに内皮細胞
に関して記載されている（Augustin-Voss et al., J. C
ell Biol. 119, 483 (1992); Pauli et al., Cancer Me
tast. Rev. 9, 175 (1990); Honn et al., Cancer Meta
st. Rev. 11, 353 (1992); Varner et al., Cell Adh.
Commun. 3, 367(1995)に概説）。

【０１２２】

【表１】

【０１２３】

【表２】

【０１２４】

【表３】

【０１２５】

【表４】

【０１２６】

【表５】

【０１２７】

【表６】

【０１２８】

【表７】

【０１２９】

【表８】

【０１３０】

【表９】

【０１３１】

【表１０】

【０１３２】

【表１１】

【０１３３】

【表１２】

【０１３４】

【表１３】

【０１３５】

【表１４】

【０１３６】

【表１５】

【０１３７】

【表１６】

【０１３８】

【表１７】

【０１３９】

【表１８】

【０１４０】

【表１９】

【０１４１】

【表２０】

【０１４２】

【表２１】

【０１４３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH <120> Nucleic acid constructions for gene therapy whose activity is affected by inhibitors of cyclin-dependent kinases <130> 118418 <140> <141> <160> 57 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <400> 1 cggacaactg ttgaccg 17 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 tactgtatgt acatacagta 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 gaattgtgag cgctcacaat tc 22 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 4 tcgagtttac cactccctat cagtgataga gaaaagtgaa ag 42 <210> 5 <211> 12 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 5 taatgatggg cg 12 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Avian leukemia virus <400> 6 ggaagcagac cacgtggtct gcttcc 26 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 agcaggtgtt gggaggc 17 <210> 8 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ggccgatggg cagatagagg gggccgatgg gcagatagag g 41 <210> 9 <211> 1958 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 9 tcgaattggg taccgggccc cccctcgagg tcgacggtat cgataagctt gatatcgaat 60 tcgcggccgc tcgagttaca agatggcggc cccgggcgct ctcttcaccg ttctgtagca 120 gcttcgggct gagcggatgt ctcttcttgt cctcagtgtc ggactcagag acacacggct 180 cccgagttct gctgatcacg aagttcccgg aggcgctcga cgcaccggaa tctcccagcg 240 gccgcgaccg ccgcctcggc cctgctcgcc gcggcgccgg gactccagcg tgatcggcgg 300 cggcagtcaa ggttcacaaa aatggcgaag agagttgcgg agaaggagtt gactgacagg 360 aactgggatg aggaagacga agttgaagag atgggaacat tctcagtggc cagtgaggaa 420 gtcatgaaga acagagccgt aaagaaggca aagcgcagaa acgttggatt tgaatctgat 480 agcggaggag cctttaaagg tttcaaaggt ttggttgtgc cttctggagg aggagggttt 540 tctggatttg gtggctctgg aggaaagcct ctggaaggac tgacaaatgg aaacagcaca 600 gacaatgcca cgcccttctc caatgtaaag acagcagcag agcccaaggc agcctttggt 660 tcttttgctg tgaatggccc tactaccttg gtggataaag tttcaaatcc aaaaactaat 720 ggggacagca atcagccgcc ctcctccggc cctgcttcca gtaccgcctg ccctgggaat 780 gcctatcaca agcagctggc tggcttgaac tgctccgtcc gcgattggat agtgaagcac 840 gtgaacacaa acccgctttg tgacctgact cccattttta aagactatga gagatacttg 900 gcgacgatcg agaagcagct tgagaatgga ggcggcagca gttctgagag ccagacagac 960 agggcgacgg ctggaatgga gcctccttcc ctttttggtt caacaaaact acagcaagag 1020 tcaccatttt catttcatgg caacaaagcg gaggacacat ctgaaaaggt ggagtttaca 1080 gcagaaaaga aatcggacgc agcacaagga gcaacaagtg cctcgtttag tttcggcaag 1140 aaaattgaga gctcggcttt gggctcgtta agctctggct ccctaactgg gttttcattc 1200 tctgctggaa gctccagctt gtttggtaaa gatgctgccc agagtaaagc agcctcttcg 1260 ctgttctctg ctaaagcatc cgagagtccg gcaggaggcg gcagcagcga gtgcagagat 1320 ggtgaagaag aggagaatga cgagccaccc aaggtagtgg tgaccgaagt aaaggaagag 1380 gatgctttct actccaaaaa atgtaaacta ttttacaaga aagacaacga atttaaagag 1440 aagggtgtgg ggaccctgca tttaaaaccc acagcaactc agaagaccca gctcttggtg 1500 cgggcagaca ccaacctagg caacatactg ctgaatgttc tgatcgcccc caacatgccg 1560 tgcacccgga caggaaagaa caacgtcctt atcgtctgtg tccccaaccc cccactcgat 1620 gagaagcagc ccactctccc ggccaccatg ctgatccggg tgaagacgag cgaggatgcc 1680 gatgaattgc acaagatttt actggagaaa aaggatgcct gagcactgag gctgaccaag 1740 gcatgttgcc acgttgctgc ttcccctccg tccctaactt agtcacattc tttcctcttc 1800 tactgtgaca ttctgagaac ttctaggtaa cttgaacttt tgtgaggaag attaaggcca 1860 ataaatcctt tcagtggcgg ccgcgaattc ctgcagcccg ggggatccac tagttctaga 1920 gcggccgcca ccgcggtgga gctccagctt ttgggaga 1958 <210> 10 <211> 24 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 10 Met Ala Lys Arg Val Ala Glu Lys Glu Leu Thr Asp Arg Asn Trp Asp 1 5 10 15 Glu Glu Asp Glu Val Glu Glu Met 20 <210> 11 <211> 24 <212> PRT <213> Saccharomyces sp. <400> 11 Met Ala Lys Arg Val Ala Asp Ala Gln Ile Gln Arg Glu Thr Tyr Asp 1 5 10 15 Ser Asn Glu Ser Asp Asp Asp Val 20 <210> 12 <211> 60 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 12 Asn Gln Pro Pro Ser Ser Gly Pro Ala Ser Ser Thr Ala Cys Pro Gly 1 5 10 15 Asn Ala Tyr His Lys Gln Leu Ala Gly Leu Asn Cys Ser Val Arg Asp 20 25 30 Trp Ile Val Lys His Val Asn Thr Asn Pro Leu Cys Asp Leu Thr Pro 35 40 45 Ile Phe Lys Asp Tyr Glu Arg Tyr Leu Ala Thr Ile 50 55 60 <210> 13 <211> 60 <212> PRT <213> Saccharomyces sp. <400> 13 Asn Arg Ala Asp Gly Thr Gly Glu Ala Gln Val Asp Asn Ser Pro Thr 1 5 10 15 Thr Glu Ser Asn Ser Arg Leu Lys Ala Leu Asn Leu Gln Phe Lys Ala 20 25 30 Lys Val Asp Asp Leu Val Leu Gly Lys Pro Leu Ala Asp Leu Arg Pro 35 40 45 Leu Phe Thr Arg Tyr Glu Leu Tyr Ile Lys Asn Ile 50 55 60 <210> 14 <211> 51 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 14 Ala Thr Ala Gly Met Glu Pro Pro Ser Leu Phe Gly Ser Thr Lys Leu 1 5 10 15 Gln Gln Glu Ser Pro Phe Ser Phe His Gly Asn Lys Ala Glu Asp Thr 20 25 30 Ser Glu Lys Val Glu Phe Thr Ala Glu Lys Lys Ser Asp Ala Ala Gln 35 40 45 Gly Ala Thr 50 <210> 15 <211> 51 <212> PRT <213> Saccharomyces sp. <400> 15 Ala Asn Ser Ser Thr Ser Pro Ala Pro Ser Ile Pro Ser Thr Gly Phe 1 5 10 15 Lys Phe Ser Leu Pro Phe Glu Gln Lys Gly Ser Gln Thr Thr Thr Asn 20 25 30 Asp Ser Lys Glu Glu Ser Thr Thr Glu Ala Thr Gly Asn Glu Ser Gln 35 40 45 Asp Ala Thr 50 <210> 16 <211> 34 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 16 His Gly Asn Lys Ala Glu Asp Thr Ser 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Lys Val Ser Asn Pro Lys Thr Asn Gly Asp Ser 1 5 10 15 Asn Gln Pro Pro Ser Ser Gly Pro Ala Ser Ser Thr Ala Cys Pro Gly 20 25 30 Asn Ala Tyr His Lys Gln Leu Ala Gly Leu Asn Cys Ser Val Arg Asp 35 40 45 Trp Ile Val Lys His Val Asn Thr Asn Pro Leu Cys Asp Leu Thr Pro 50 55 60 Ile Phe Lys Asp Tyr Glu Arg Tyr Leu Ala Thr Ile Glu Lys Gln Leu 65 70 75 80 Glu Asn Gly Gly Gly Ser Ser Ser Glu Ser Gln Thr Asp Arg Ala Thr 85 90 95 Ala Gly Met Glu Pro Pro Ser Leu Phe Gly Ser Thr Lys Leu Gln Gln 100 105 110 Glu Ser Pro Phe Ser Phe His Gly Asn Lys Ala Glu Asp Thr Ser Glu 115 120 125 Lys Val Glu Phe 130 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 29 agaaagcaaa gcgcagaaat gt 22 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 30 caaatccaga aaagcgtcct c 21 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 31 tgaagaatag agccataaag aaag 24 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 32 agaaaagcgt cctcctccag a 21 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 33 tgaagaatag agccataaag aaag 24 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 34 agcgccacta accaaatcca ga 22 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 35 agaaagcaaa gcgcagaaat gt 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 36 gaaaagcgtc ctcctccaga ag 22 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 37 gaaagcaaag cgcagaaatg tt 22 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 38 ctccagcgcc actaccaaat c 21 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 39 cccgcacgga gcagttcaag 20 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 40 gcagcggcag atcccaaggt ag 22 <210> 41 <211> 17 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 41 ggcatccttt ttctcca 17 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 42 cgttcttatc gtctctgtgt tc 22 <210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 43 gcatcctttt tctccagta 19 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 44 tgttccaaat ccaccaat 18 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 45 gtctgcatcc tcgctggtt 19 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 46 cgttcttatc gtctgtgttc c 21 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 47 ttttacccga atcaacat 18 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 48 gtacgcgaac agggaagaat a 21 <210> 49 <211> 212 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 49 Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met Asp Ala Arg Gln 1 5 10 15 Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro Val 20 25 30 Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp Met 35 40 45 Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Arg Gly Ser Leu 65 70 75 80 Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro Lys Ser Ala Cys Lys 85 90 95 Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser Arg Gln Ala Val 100 105 110 Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg His Leu Val Asp 115 120 125 Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu Ala Glu Gln Cys 130 135 140 Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Ser Gln Ile 145 150 155 160 Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro Asn 165 170 175 Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Leu Arg Arg Gln 180 185 190 Thr Arg Val Asp Leu Gln Pro Ser Phe Arg Ala Asn Phe Leu Phe Met 195 200 205 Ile Phe Ile Lys 210 <210> 50 <211> 183 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 50 Met Asp Ala Arg Gln Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn 1 5 10 15 Leu Phe Gly Pro Val Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys 20 25 30 His Cys Arg Asp Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp 35 40 45 Phe Gln Asn His Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val 50 55 60 Glu Arg Gly Ser Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Cys Pro Pro 65 70 75 80 Lys Ser Ala Cys Lys Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly 85 90 95 Ser Arg Gln Ala Val Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp 100 105 110 Arg His Leu Val Asp Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly 115 120 125 Leu Ala Glu Gln Cys Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp 130 135 140 Ser Ser Ser Gln Ile Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser 145 150 155 160 Asp Gly Ser Pro Asn Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro 165 170 175 Gly Leu Arg Arg Gln Thr Arg 180 <210> 51 <211> 199 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 51 Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Pro Glu Arg Met Asp Ala Arg Gln 1 5 10 15 Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro Val 20 25 30 Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp Met 35 40 45 Glu Glu Ala Ser Gln His Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His Arg 50 55 60 Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Arg Gly Ser Leu 65 70 75 80 Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro Lys Ser Ala Cys Lys 85 90 95 Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser Arg Gln Ala Val 100 105 110 Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg His Leu Val Asp 115 120 125 Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu Ala Glu Gln Cys 130 135 140 Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Ser Gln Ile 145 150 155 160 Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro Asn 165 170 175 Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Pro Arg Arg Gln 180 185 190 Thr Arg Val Asp Leu Gln Pro 195 <210> 52 <211> 199 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 52 Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met Asp Ala Arg Gln 1 5 10 15 Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro Val 20 25 30 Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp Met 35 40 45 Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Arg Gly Ser Leu 65 70 75 80 Pro Glu Phe Tyr Tyr Gly Pro Pro Arg Pro Pro Lys Ser Ala Cys Lys 85 90 95 Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Gly Gly Ser Arg Gln Ala Val 100 105 110 Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg His Leu Val Asp 115 120 125 Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu Ala Glu Gln Cys 130 135 140 Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Ser Gln Ile 145 150 155 160 Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro Asn 165 170 175 Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Leu Arg Arg Gln 180 185 190 Thr Arg Val Asp Leu Gln Pro 195 <210> 53 <211> 199 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 53 Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met Asp Ala Arg Gln Ala 1 5 10 15 Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro Val Asn 20 25 30 His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp Met Glu 35 40 45 Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His Lys Pro 50 55 60 Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Arg Gly Ser Leu Pro 65 70 75 80 Glu Phe Tyr Tyr Gly Pro Pro Arg Pro Pro Lys Ser Ala Cys Lys Val 85 90 95 Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser Arg Gln Ala Val Pro 100 105 110 Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg His Leu Val Asp Gln 115 120 125 Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu Ala Glu Gln Cys Pro 130 135 140 Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Ser Gln Ile Lys 145 150 155 160 Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro Asn Ala 165 170 175 Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Leu Arg Arg Gln Thr 180 185 190 Arg Val Asp Leu Gln Pro Ser 195 <210> 54 <211> 220 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 54 Asn Val Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met Asp Ala 1 5 10 15 Arg Gln Ala Asp His Pro Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro 20 25 30 Val Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp 35 40 45 Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His 50 55 60 Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Arg Gly Ser 65 70 75 80 Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro Lys Ser Ala Cys 85 90 95 Lys Val Pro Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser Arg Gln Ala 100 105 110 Val Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg His Leu Val 115 120 125 Asp Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu Ala Glu Gln 130 135 140 Cys Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Ser Gln 145 150 155 160 Ile Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro 165 170 175 Asn Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Leu Arg Arg 180 185 190 Gln Thr Arg Val Asp Leu Gln Pro Ser Phe Arg Ala Asn Phe Leu Phe 195 200 205 Met Ile Phe Ile Ile Lys Val Ile Lys Lys Ile Ser 210 215 220 <210> 55 <211> 183 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 55 Met Asp Ala Arg Gln Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn 1 5 10 15 Leu Phe Gly Pro Val Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys 20 25 30 His Cys Gln Asp Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp 35 40 45 Phe Gln Asn His Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val 50 55 60 Glu Arg Gly Ser Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro 65 70 75 80 Lys Ser Ala Cys Lys Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly 85 90 95 Ser Arg Gln Ala Val Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp 100 105 110 Arg His Leu Val Asp Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly 115 120 125 Leu Ala Glu Gln Cys Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp 130 135 140 Ser Ser Ser Gln Ile Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser 145 150 155 160 Asp Gly Ser Pro Asn Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro 165 170 175 Gly Leu Arg Arg Gln Thr Arg 180 <210> 56 <211> 138 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 56 Met Asp Ala Arg Gln Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn 1 5 10 15 Leu Phe Gly Pro Val Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys 20 25 30 His Cys Arg Asp Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp 35 40 45 Phe Gln Asn His Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val 50 55 60 Glu Arg Gly Ser Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Gly Pro Pro Arg Pro Pro 65 70 75 80 Lys Ser Ala Cys Lys Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly 85 90 95 Ser Arg Gln Ala Val Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp 100 105 110 Arg His Leu Val Asp Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Ser Gln Ala Gly 115 120 125 Leu Ala Glu Gln Cys Pro Gly Met Arg Lys 130 135 <210> 57 <211> 197 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 57 Met Ser Asn Val Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met 1 5 10 15 Asp Ala Arg Gln Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu 20 25 30 Phe Gly Pro Val Asn His Glu Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His 35 40 45 Cys Arg Asp Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe 50 55 60 Gln Asn His Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu 65 70 75 80 Arg Gly Ser Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro Lys 85 90 95 Ser Ala Cys Lys Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser 100 105 110 Arg Gln Ala Val Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg 115 120 125 His Leu Val Asp Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu 130 135 140 Ala Glu Gln Cys Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser 145 150 155 160 Ser Ser Gln Asn Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Pro Asn Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly 180 185 190 Leu Arg Arg Gln Thr 195

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の核酸構築体を示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/00 ６２５ Ａ６１Ｋ 31/00 ６２５Ｂ ６２９ ６２９ ６３５ ６３５ ６３５Ａ ６３７ ６３７Ａ ６３７Ｅ 38/00 39/395 Ｖ 38/22 48/00 38/43 37/02 39/395 37/24 48/00 37/465 (72)発明者 アンドレア、ブアーギン ドイツ連邦共和国マールブルク、シュール シュトラーセ、16 (72)発明者 ハンス‐ハラルド、ゼトラツェック ドイツ連邦共和国マールブルク、ゾネンハ ンク、３

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の構成要素： 構成要素a)：構成要素b)の転写のための活性化配列 構成要素c)：構成要素b)の発現生成物の結合により活性
   化され、かつ、構成要素d)の転写を誘導する活性化配列 構成要素d)：エフェクター遺伝子 を含んでなる核酸構築体。
2. 【請求項２】構成要素a)が構成要素c)と同一である、請
   求項１記載の核酸構築体。
3. 【請求項３】構成要素a)が非特異的に、細胞特異的に、
   代謝特異的に、ウイルス特異的に、および／または細胞
   周期特異的に活性化され得る、請求項１または２記載の
   核酸構築体。
4. 【請求項４】構成要素a)が、 内皮細胞、腹膜細胞、胸膜細胞、皮膚、肺、胃腸管、腎
   臓、および尿道の上皮細胞、筋細胞、結合細胞、造血細
   胞、マクロファージ、リンパ球、白血病細胞、腫瘍細胞
   またはグリア細胞で活性化されるプロモーター、 HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV、CMVまたはHIVなどの
   ウイルスのプロモーター配列、 低酸素症によって活性化されるプロモーターまたはエン
   ハンサー配列、またはcdc25c、サイクリンA、cdcE、E2F
   -1、B-myb、DHFRの遺伝子の細胞周期特異的活性化配列
   および単量体または多量体MycEボックスなどの、細胞増
   殖に依存して出現する、または活性化される転写因子が
   結合する配列からなる群より選択される、請求項３記載
   の核酸構築体。
5. 【請求項５】活性化ドメイン[構成要素b)の構成要素
   b₁)]が、Oct-2、Sp1、NFY、ITF-2、VP-16、c-Mycおよび
   CTFを含んでなる転写因子の活性化ドメインより選択さ
   れる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸構築
   体。
6. 【請求項６】阻害剤(b₂)が結合する配列が、タンパク質
   p27を阻害し、p27によって引き起こされる細胞増殖の阻
   害を中和にすることができるタンパク質からなる群より
   選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸
   構築体。
7. 【請求項７】阻害剤(b₂)が結合する配列が、表6に示し
   た配列番号24のp163のアミノ酸配列、またはその一部を
   含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸
   構築体。
8. 【請求項８】p163のアミノ酸配列の一部が、配列番号10
   の1〜24位、配列番号12の137〜196位、配列番号14の215
   〜265位、配列番号16の239〜272位、配列番号18の399〜
   438位、および配列番号20の307〜469位のアミノ酸配列
   （表6のナンバリングに基づく）を有するペプチドから
   なる群より選択される、請求項７記載の核酸構築体。
9. 【請求項９】阻害剤(b₂)が結合する配列が、機能性ドメ
   インの欠失により、請求項７記載のタンパク質から誘導
   され、p27結合ドメインまたはRan結合ドメインが表6
   （配列番号24）から欠失している、請求項１〜５のいず
   れか１項に記載の核酸構築体。
10. 【請求項１０】p27結合ドメインの欠失後に表8に示され
    た配列番号26のアミノ酸配列のタンパク質が得られ、か
    つRan結合ドメインの欠失の際に表９で示された配列番
    号27のアミノ酸配列のタンパク質が得られる、請求項９
    記載の核酸構築体。
11. 【請求項１１】阻害剤(b₂)が結合する配列が、p27結合
    ドメイン領域を除く総てのアミノ酸配列を欠失させるこ
    とにより、請求項２記載のタンパク質から誘導すること
    ができる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸構
    築体。
12. 【請求項１２】阻害剤に結合する配列が表10に示された
    配列番号28のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１１記
    載の核酸構築体。
13. 【請求項１３】阻害剤(b₂)が結合する配列が、請求項６
    〜１２に記載される別の哺乳類種の、またはヒトの阻害
    剤の相同タンパク質、相当するその一部からなる群より
    選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸
    構築体。
14. 【請求項１４】阻害剤のアミノ酸配列がp163のヒト相同
    体である、請求項１３記載の核酸構築体。
15. 【請求項１５】構成要素c)が、構成要素b)が結合する少
    なくとも１つのＤＮＡ（結合）配列を含んでなり、この
    結合によって活性化される、請求項１〜１４のいずれか
    １項に記載の核酸構築体。
16. 【請求項１６】ＤＮＡ結合配列が、Gal4タンパク質が結
    合する配列(5'-CGGACAACTGTTGACCCG-3',配列番号1)、Le
    xAタンパク質が結合する配列(5'-TACTGTATGTACATACAGTA
    -3',配列番号2)、Lac I受容体タンパク質が結合する配
    列(5'-GAATTGTGAGCGCGCACAATTC-3',配列番号3)、テトラ
    サイクリン受容体タンパク質が結合する配列(5'-TCGAGT
    TTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3',配列番号
    4)、およびZFHD-1タンパク質が結合する配列(5'-TAATGA
    TGGGCG-3',配列番号5)からなる群より選択される、請求
    項１５に記載の核酸構築体。
17. 【請求項１７】エフェクター遺伝子（構成要素d）が、
    サイトカイン；ケモカイン；成長因子；サイトカイン、
    ケモカインまたは成長因子に対する受容体；抗増殖作
    用、または細胞分裂抑制作用、またはアポトーシス作用
    を有するタンパク質；抗体；抗体断片；脈管形成阻害
    剤；ペプチドホルモン；凝固因子；凝固阻害剤；繊維素
    溶解タンパク質；血液循環に作用を有するペプチドまた
    はタンパク質；血漿タンパク質；および免疫反応を引き
    起こす選択抗原を有する感染性病原体の、または細胞
    の、または腫瘍の抗原からなる群より選択される活性化
    合物をコードする遺伝子である、請求項１〜１６のいず
    れか１項に記載の核酸構築体。
18. 【請求項１８】エフェクター遺伝子が薬剤前駆体を薬剤
    へと変換する酵素をコードする遺伝子である、請求項１
    〜１４のいずれか１項に記載の核酸構築体。
19. 【請求項１９】エフェクター遺伝子が、そのリガンドが
    サイトカイン、成長因子、抗体、抗体断片、ペプチドホ
    ルモン、メディエーター、および細胞接着分子からなる
    群より選択される、リガンド−活性化合物融合タンパク
    質またはリガンド−酵素融合タンパク質をコードする遺
    伝子である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核
    酸構築体。
20. 【請求項２０】核酸がＤＮＡである、請求項１〜１９の
    いずれか１項に記載の核酸構築体。
21. 【請求項２１】核酸構築体がベクターに挿入されてい
    る、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の核酸構築
    体。
22. 【請求項２２】ベクターがプラスミドベクターである、
    請求項２１記載の核酸構築体。
23. 【請求項２３】ベクターがウイルスベクターである、請
    求項２１記載の核酸構築体。
24. 【請求項２４】疾病の予防または治療のために、外用、
    経口、膀胱内、鼻腔内、気管支内または胃腸管内に投与
    されるか、もしくは器官、体腔、筋肉組織、皮下または
    血液循環系に注射される、請求項１〜２３のいずれか１
    項に記載の核酸構築体。
25. 【請求項２５】請求項１〜２４のいずれか１項に記載の
    核酸構築体を含有する単離細胞。
26. 【請求項２６】感染症、腫瘍、白血病、自己免疫疾患、
    アレルギー、関節炎、炎症、器官拒絶、移植片に対する
    宿主の反応、血液凝固疾患、循環疾患、貧血症、ホルモ
    ン障害およびCNS損傷からなる群より選択される疾病の
    治療用薬剤を製造するための、請求項１〜２４いずれか
    １項に記載の核酸構築体、または請求項２５記載の細胞
    の使用。
27. 【請求項２７】個々の要素を段階的に連結する、請求項
    １〜２４のいずれか１項に記載の核酸構築体の製造法。
28. 【請求項２８】疾病の予防または治療のために、少なく
    とも１つの細胞が外用、膀胱内、鼻腔内、気管支内、経
    口または胃腸管内に投与されるか、あるいは器官、体
    腔、筋肉組織、皮下または血液循環系に注射される請求
    項２４の疾病治療用薬剤を製造するための、請求項２５
    記載の細胞の使用。