KR19990063284A

KR19990063284A - 사이클린-의존성 키나제의 억제인자에 대한 결합 파트너 및억제인자 검출 및 질병의 진단 또는 치료를 위한 이의 용도

Info

Publication number: KR19990063284A
Application number: KR1019980056992A
Authority: KR
Inventors: 마르틴 아일레르즈; 안드레아 부에르긴; 한스-하랄트 세들라첵
Original assignee: 로버트 흐라이탁, 미쉘 베스트; 훽스트 마리온 뤼쎌 도이치란드 게엠베하
Priority date: 1997-12-20
Filing date: 1998-12-19
Publication date: 1999-07-26
Also published as: CN1225367A; CA2255141A1; KR19990063285A; AU9720498A; ID21582A; TR199802649A2; HUP9802961A2; TR199802648A3; BR9805151A; HUP9802961A3; EP0926236A1; BR9805152A; US6265562B1; AR016436A1; EP0926237A3; CN1227871A; TR199802648A2; PL330452A1; AU747246B2; JPH11313686A

Abstract

본원은 세포 단백질 p27을 억제하여 p27에 의해 야기되는 세포 증식 억제를 완화시키는 단백질, 일부가 우성 간섭 특징을 갖는 이의 돌연변이체, 단백질을 암호화하는 상응하는 핵산, 및 질병의 예방 및 치료를 위한 단백질 및 핵산의 용도에 관한 것이다. 또한 본원은 상기 핵산을 포함하는, 질병의 유전자 치료를 위한 핵산 작제물에 관한 것이다.

Description

사이클린-의존성 키나제의 억제인자에 대한 결합 파트너 및 억제인자 검출 및 질병의 진단 또는 치료를 위한 이의 용도

본원은 세포 단백질 p27을 억제하여 p27에 의해 야기되는 세포 증식 억제를 완화시키는 단백질, 일부가 우성 간섭 특징을 갖는 이의 돌연변이체, 이러한 단백질을 암호화하는 상응하는 핵산, 및 질병의 예방 및 치료를 위한 단백질 및 핵산의 용도에 관한 것이다.

A) 서론

진핵 세포의 세포 주기는 사이클린-의존성 키나제(cdks)에 의해 조절되는데; 이러한 키나제는 활성을 띠기 위해서 조절 서브유닛(사이클린)을 필요로 한다. 세포 주기에서의 상이한 과정(예: 복제 및 유사분열로의 진입)은 상이한 cdks[참조 문헌: Morgan, Nature374, 131(1995)]에 의해 조절된다. 이와 관련하여, 사이클린-의존성 키나제의 활성은 고도로 조절된다. 이에 대해, 예를 들어, DNA가 완전히 복제될 때까지 유사분열로 진입하는 것을 방지하는 내부 조절 메카니즘이 존재한다. 생장 인자와 같은 외부 인자에 의한 조절은 단지 DNA 복제가 시작되기 전에 발생하는데; 복제는 활성 사이클린 E/cdk2 복합체에 의해 개시된다.

키나제 서브유닛내 사이클린의 양 이외에, 사이클린-의존성 키나제의 활성은 작은 억제인자 단백질에 의해 조절될 수 있다[참조 문헌: Sherr and Roberts, Gene Dev.9, 1149(1995)]. 예를 들어, 크기에 따라 p21 및 p27로 지정되는 두 가지 억제인자는 사이클린 E/cdk2에 결정적이다. 사이클린 E/cdk2 키나제는 다량의 p27을 발현시키는 세포에서는 일반적으로 불활성이며, DNA 복제로의 진입을 차단시킨다.

다수의 사람 종양에서 양성 세포 주기 조절인자가 과다발현되거나 구성요소적으로 발현되는 반면[참조 문헌: Sherr, Science274, 1672 (1996)], 네가티브 조절인자는 빈번하게 돌연변이되거나 매우 약하게 발현된다[참조 문헌: Fero et al., Cell85, 733(1996)]. 예를 들어, 다수의 목 종양에서 사이클린 D1 유전자가 과다발현되는 등 특이적 상관 관계가 존재한다. 따라서, 증식억제 효과가 있는 신규 물질을 찾는데 있어서, 사이클린-의존성 키나제 및 이의 작용을 밝히는 것을 목표로 해야되는 것으로 여겨진다.

p27 단백질 유전자가 최근 들어 알려져 있는데[참조 문헌: K. Polyak et al. Cell78, 59-66(1994)], 이는 진뱅크(Genbank)[뮤린 p27; 수탁번호 K 09968; 사람 p27; K 10906]에서 구할 수 있다. 광범위한 연구에도 불구하고, p27 유전자에서의 돌연변이는 사람 종양에서 아직 발견되지 않았다. p27에 대한 유전자가 불활성인 쥐가 다발성 형성장애를 지닌 표현형을 나타내고 종양 발병율이 증가되므로, 이는 더욱 놀라운 것이다[참조 문헌: Fero et al., Cell85, 733(1996), Kiyokawa et al., Cell85, 721(1996)). 대신, p27의 작용은 주로 전사 후에 조절되는 것이 분명하다.

따라서, p27은 단백질분해에 의해 분해되고, 또한 정상 세포내 DNA 복제 초기에 발생한다. 정상 조직과 비교시, 전사 후에 p27을 분해하는 능력은 다수의 종양에서 눈에 띄게 증가하고, 이는 바람직하지 않은 증상과 직접적으로 관련되는 것으로 여겨진다[참조 문헌: Loda et al., Nature Med.3, 231(1997)].

그러나, p27 불활성화를 유도할 수 있는 기타 메카니즘이 또한 존재할 수 있다. 예를 들어, 세포가 Myc 종양 유전자로 형질전환된 후에, p27이 가장 먼저 작용적으로 불활성화되고(즉, p27은 더 이상 사이클린/cdk 복합체에 결합하지 않는다), 휠씬 후의 단계에서 분해되기만 한다. 현재까지 다량의 p27 단백질이 상당수의 유방 종양에서 발현되고 있으나, 그럼에도 불구하고 예를 들어, 이들 종양이 매우 빠르게 생장하는 원인에 대해서는 밝혀내지 못하고 있다. 이들 종양에서 p27을 불활성화시키는 메커니즘에 대해서 알려진 바가 없다[참조 문헌: Fredersdorf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA94, 6380(1997)].

결과적으로 종양에서 p27을 불활성화시키는 메카니즘 또는 물질을 발견하는 것이 전문가들 사이에서 상당한 관심거리이다. 이러한 문제는 본 발명에 이르러 해결되었다. 본원에 기술되어 있는 단백질 p163은 p27에 결합할 수 있고, p27의 작용을 억제할 수 있으며, 세포질에서 p27의 단백질분해를 유도할 수 있다.

B) 본 발명의 개략적인 설명

1) 단백질 p163 및 이의 핵산 서열

본 발명은 p27에 결합하여 이의 작용을 억제하고 세포질에서 p27의 단백질분해를 유도하는 p163라 불리는 신규 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 단백질의 아미노산 서열을 측정하였다.

단백질 p163은 p27에 특이적으로 결합하나, Myc, Max, Bcl-6 또는 프로티모신-α와 같은 기타 단백질에는 결합하지 않는다.

본 발명은 또한 단백질 p163을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 이러한 뉴클레오티드 서열을 쥐 p163 단백질의 경우와 사람 p163 단백질의 경우에 서열 비교에 의해 측정하였다.

2) 우성 네가티브 p163 유사체

본 발명은 또한 p163 구성 펩타이드를 암호화하고/거나 p163의 유사체이고 우성 네가티브 효과를 갖는, 즉, 실질적으로 p27 단백질의 사이클린 E/cdk2로의 결합 및 이로 인한 사이클린 E/cdk2의 억제에 손상을 주지 않으면서 천연 단백질 p163의 단백질 p27로의 결합을 억제하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.

본 발명은 또한 핵산 서열을 표적 세포로 도입시키고 표적 세포-특이적 p163 단백질과 표적 세포-특이적 p27 단백질간의 결합을 억제하여, 이로 인해 방출된 표적 세포-특이적 p27 단백질에 의해 표적 세포의 증식을 억제함을 포함하는, p163 단백질의 우성 네가티브 돌연변이체를 암호화하는 핵산 서열 또는 이의 구성 서열의 용도에 관한 것이다.

3) p163을 억제하는 펩타이드

본 발명은 또한 p163의 작용을 억제하는 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 이는 p27 단백질에 결합하기 위해 p163 단백질내 부위에 결합하거나 Ran에 결합하기 위해 p163 단백질내 부위에 결합하여[참조 문헌: Loeb et al. Mol. Cell. Biol. 4, 209-222(1993)], 세포의 내부에서 p163 단백질을 억제하는 단백질 또는 펩타이드를 포함한다.

이들 단백질은 p27 단백질내 부위 또는 p163 단백질에 결합하기 위한 Ran 단백질내 부위에 상응하는 펩타이드를 포함한다. 이들 단백질은 또한 단백질 p163, 특히 p27 단백질에 결합하기 위해 이의 부위에 대해 특이성을 가지는 항체 또는 F(ab)₂, Fab, Fv, scFv와 같은 항체 분해 산물을 포함한다.

본 발명은 또한 핵산 서열을 표적 세포로 도입시키고 표적 세포-특이적 p163 단백질과 표적 세포-특이적 p27 단백질 또는 표적 세포-특이적 Ran 단백질간의 결합을 억제하여, 이로 인해 방출되는 표적 세포-특이적 p27 단백질에 의해 표적 세포의 증식을 억제함을 포함하는, 억제성 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열의 용도에 관한 것이다.

4) 세포 분열을 자극하는 p163의 용도

본 발명은 또한 세포 내부로 p27 단백질을 억제하여 표적 세포의 세포 분열을 자극하기 위한, 163 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 p163 단백질 자체의 용도에 관한 것이다.

5) p163의 전사 및 해독의 억제

본 발명은 또한 p163 단백질을 암호화하는 표적 세포-특이적 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 억제하여 p27 단백질을 방출시켜 결과적으로 표적 세포의 증식을 억제하는 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명에 따른 이러한 핵산 서열은 예를 들어, 안티센스(3중) DNA, 안티센스 RNA 및/또는 리보자임일 수 있다.

6) p163 억제인자를 발견하기 위한 테스트 시스템

본 발명은 또한 p163 단백질과 p27 단백질 또는 Ran 단백질간의 결합 억제인자에 대해 조사하는 테스트 시스템에 대해서 p163 단백질을 암호화하는 핵산 서열 또는 p163 단백질 또는 이의 구성 서열의 용도, 및 상기 테스트 시스템에서 발견되는, 표적 세포의 증식을 억제하기 위한 p163 단백질 억제인자의 용도에 관한 것이다.

7) 질병 진단을 위한 p163의 검출

본 발명은 또한 p163 단백질을 암호화하거나, p163 단백질의 구성 서열을 암호화하는 핵산 작제물, 또는 p163 단백질에 대한 이러한 핵산 서열에 결합하는 핵산 서열 또는 단백질 서열, 또는 p163 단백질에 결합하는 단백질의 핵산 작제물 용도에 관한 것으로, 이는 세포 또는 조직의 증식 상태를 확인하거나 질병을 진단할 목적으로 세포 또는 조직 또는 체액에서 p163 단백질 또는 p163 단백질을 암호화하는 핵산을 검출하기 위한 것이다.

C) 발명의 보다 상세한 설명

1) p163 단백질 및 p163 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 특징화

2-하이브리드 기술[참조 문헌: Fields and Song, Nature340, 245(1989)]을 사용하여, p27의 새로운 파트너 단백질로서 p163 단백질을 발견한다. 이를 위해, PCR을 사용하여 뮤린 p27 단백질에 대한 전체 코딩 서열을 전사 인자 GAL4의 DNA-결합 도메인으로 구성된 효모 벡터 pGBT10(Clontech)에 클로닝시킨다. 효모 균주 Hf7c[제조원: Clontech Heidelberg, Matchmaker Two Hybrid, K 1605-1]를 상기 벡터로 형질전환시킨 후, 트립토판-요구성 콜로니를 분리하고 정확한 융합 단백질의 발현을 GAL4와 p27에 대한 특정 항체를 사용하여 웨스턴 블롯(Western blot)에서 검출한다.

이러한 균주를 쥐 배아로부터의 VP16-표지 cDNA 라이브러리로 2차 형질전환에서 형질전환시킨다[참조 문헌: Vojtek et al., Cell74, 205(1993)). 15nM 아미노트리아졸의 존재하에 히스티딘-요구성인 400개의 콜로니를 추가 분석한다. 이들 콜로니 중 70개를 서열화하고; 이들 모두는 상이한 D-타입 사이클린을 암호화하며, p27의 상호작용 파트너인 것으로 알려져 있다. 서던 블롯팅(Southern blotting)을 사용하여 400개의 저항성 클론 중 390개가 D 사이클린을 암호화하는 것을 알 수 있다. 나머지 클론 중 2개(번호 163)는 동일한 단백질을 암호화하고, 이를 완전하게 서열화한다.

Balb/c-3T3 세포로부터 제조된 λZAP cDNA 라이브러리에서 몇몇 클론은 p163에 상동인 것으로 확인되었다. 서열 분석을 통해 개방 판독 프레임이 나타나고, 이는 또한 cDNA 라이브러리로부터의 VP16 키메라에 사용된다. 고유 클론은 둘다 상기 판독 프레임의 아미노산 121 내지 252를 암호화한다. 클론 p163을 리포터 유전자로서 β-갈락토시다제를 사용하여 효모에서 보다 상세하게 특징지운다.

표 1에서 제시된 바와 같이, 암호화된 단백질은 구체적으로 효모에서 p27과 상호작용하고, Myc, Max, Bcl-6 또는 프로티모신-α와 같은 기타 단백질과는 상호작용하지 않는다. 또한 표 1을 통해, p163과의 상호작용이 일어나는 p27의 도메인의 일차 범위가 나타난다. 이러한 데이터를 통해 p163이 사이클린-의존성 키나제와 마찬가지로 p27에서 동일한 도메인에 결합함을 알 수 있다[참조 문헌: Russo et al., Nature382, 325(1996)]. 이는 p163과 사이클린-의존성 키나제가 p27에 결합하기 위해 경쟁함을 나타낸다. 또한, p27과 상호작용하는 p163 도메인을 아미노산 121 내지 252로 제한할 수 있다.

이러한 효모 테스트 시스템으로부터의 상기 결과를 확인하기 위해, 재조합 발현 p163[작용 단백질로써 글루타티온 전이효소(GST)와 함께 발현된다]을 칼럼에 결합시킨 후, 이 칼럼에서 친화성 크로마토그래피에 의해³⁵S-표지된 p27 단백질을 분리시킨다. 글루타티온 전이효소(GST)와 함께 p163을 포함하는 융합 단백질을 사용함으로써 이와 같은 실험을 위해 균일한 매트릭스를 사용할 수 있다[소위 GST pulldowns라 불린다, 참조 문헌: GST pulldowns; Hateboer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA90, 8489(1993)].

이러한 연구를 위해, 효모 클론으로부터의 판독 프레임을 대장균(E. coli)내 IPTG-유도성 TAC 프로모터의 조절 하에 글루타티온-S-전이효소(GST)로 키메라 단백질을 암호화하는 pGEX 벡터(Pharmacia, Freiburg pGEX-2T; Cat. No. 27-4801-01)로 전이시킨다[참조 문헌: Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988]. 글루타티온-아가로즈(Smith and Johnson, 1988)상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 유도 대장균(E. coli) 배지로부터 키메라 단백질을 정제한 후, 100mM Tris-HCI, pH 7.5, 100mM KCI, 20mM EDTA, 10% 글리세롤, 0.1mM PMSF에 대해 투석한다. 대조군으로서, 글루타티온-S-전이효소도 동일한 과정에 따라 정제한 후에 투석시키고, 정제된 단백질을 -80℃에서 저장한다.

이어서 두 가지 단백질 10㎍을 각 경우에 BSA 10㎍와 팽창된 GST-아가로즈 20㎎으로 4℃에서 2시간동안 배양한 후, 아가로즈를 원심분리시키고 투석 완충액으로 2회 세척한다. 소적의 아가로즈를 단백질 결합에 대한 대조군으로 삼아, 샘플 완충액에서 직접 가열하고, 결합 단백질을 SDS 겔 전기영동 후에 검출한다.³⁵S-메티오닌-표지된 p27을 시험관내 해독으로 제조하고(제법에 따름; Promega, Mannheim; TNT coupled retc. lys. systems; L 4610), 4℃에서 2시간동안, 0.1% NP-40을 함유하는 총 용적 200㎕의 투석 완충액에서 로딩 아가로즈로 배양한다. 아가로즈를 투석 완충액/0.1% NP-40으로 4회 세척한 후에 SDS 샘플 완충액에서 비등시킨다. 결합된 단백질을 SDS-겔 전기영동 및 형광 그래프로 검출한다.

실험 결과를 표 2에 나타내었다. 표 2를 통해 시험관내에서 합성된 재조합³⁵S-표지된 p27이 키메라 GST-p163 융합 단백질로 로딩된 칼럼에만 선택적으로 결합하고 동량의 GST가 로딩된 칼럼에는 결합하지 않음을 알 수 있다. 표 2를 통해 또한 세포 추출물에서 얻은 p27은 GST-p163에 비효율적으로 결합하는 것을 알 수 있는데, 이 추출물에서 p27은 사이클린-의존성 키나제의 복합체에 결합한다. 간단한 열 처리로 이들 복합체에서 p27을 분리킨 후, p163에 결합시킨다. 이를 통해 p163과 사이클린-의존성 키나제가 p27에 결합하기 위해 경쟁함을 알 수 있다.

뮤린 p163 단백질을 암호화하는 본 발명에 따른 핵산 서열을 표 3에 나타내었다. 이 서열은 데이터베이스에 동족체를 가지는데 이는 효모의 핵단백질(Nup)2 유전자이다. Nup2는 핵 단백질의 형성 및 핵의 안팍으로의 단백질 운반에 관련되는 핵 막 단백질이다. 효모에서, Nup2는 특히 방출에 관련되는 것으로 여겨진다.

대체로 상동성은 적지만, 일부 작용성 도메인은 보존된다(표 4). 예를 들어, 핵 운반을 조절하는 조절 단백질(Ran, GTP-결합 단백질)의 결합 부위는 Ran-결합 단백질(RBP-1), NuP-2 및 p163 사이에 보존되고(표 5), 이는 구조적 작용을 초래하는 짧은 펜타펩타이드 서열이다(표 6).

p163이 뉴클레오포린이라는 것을 의심할 여지없이 입증하기 위해서, 단백질[히스티딘-p163(아미노산 121-252)]에 대해 다클론성 항혈청을 만든 후, 친화성-정제시키고, 이 항혈청은 뉴클레오포린을 인지하며, 이는 면역형광하에서 전형적인 핵공 염색(핵의 표면과 주변의 점을 염색시킴)으로 볼 수 있다.

p163 또는 Nup2 및 p27가 세포 내에서 연합하는 지를 입증하기 위해서, CMV 발현 벡터를 사용하여 HeLa 세포에서 일시적으로 두 가지 단백질을 발현시키고, 48시간 후에 세포를 용해시키고 두 단백질간의 가능한 상호작용을 면역침강/웨스턴 블롯팅에 의해 검사한다[참조 문헌: Peukert et al., EMBO J.16, 5672(1997)]. 지영 각 경우에 Nup2에 대한 다클론성 항체와 뮤린 p27에 대한 다클론성 항체를 사용하여 p27와 Nup2 사이에 연합을 설명할 수 있다. p27 단백질은 p163이 발현되었을 경우에만 만족할 정도로 침전한다(표 7 참고). 이는 Nup2와 p27이 생체내에서 HeLa 세포내에서 서로 연합할 수 있다는 증거가 되는 것이다.

사람의 ESTs를 사용하여, 서열 비교 및 데이터 연구를 하면, 사람의 p163 단백질에 대한 핵산 서열을 확인할 수 있다. Ran-결합 도메인의 경우에, 서열 AA161285에서 173 ≥575에 위치하고, p27-결합 도메인의 경우에, 서열 R62312에서 318 ≥486에 위치하고, p163의 다른 구성 단편의 경우에는 서열 THC199124에서 348 ≥489에 위치한다.

Nup2-p163와 상호작용을 하는 p27 아미노산을 좀더 정확하게 정의하기 위해서, p163과는 더 이상 상호작용을 하지 않는 돌연변이에 대해 효모에서 연구를 하였다. 이를 위해, p27를 암호화하는 cDNA는 에러를 유도하는 PCR 반응(PCR-기술, 원리 및 DNA 증폭 시에 사용에서 기술하는 PCR 조건; H.A. Erlich, Stockton press, NY 1989)을 하고, 무작위 에러를 포함하는 생성된 클론으로 Nup2과의 상호작용을 테스트를 하고, 기준은 사이클린 D1과의 상호작용에 대해 테스트를 한다. PCR 조건은 다음과 같다; 1U GIBCO Taq 중합효소와 0.1nM MnCl₂존재 하에 40회를 한다.

생성된 cDNA 단편을 BamHI와 EcoRI로 처리하여 선형인 pGBT10 벡터와 함께 HF7c-p163/Nup2 효모 균주에 공형질전환시킨 후, 정제시킨다. 형질전환된 콜로니는 -Leu-Trp 결실 배지에서 선별하고, 960개 콜로니는 분리하여, 선택 배지(-Leu-His-Trp)에서 도말한다. 두 번째 상호작용 테스트로써 β-갈락토시다제 테스트는 이와 같은 선택성 배지에서 생장을 하지 않는 콜로니에서 실행한다. 네가티브 클론을 확인하고, 여기에서 pGBT10-p27 플라스미드를 분리한다. 수득된 플라스미드를 먼저 p163/Nup2를 전이활성화 도메인을 함유하는 키메라로서 발현시키는 효모 발현 플라스미드와 함께 재형질전환시키고, 두 번째로, 대조군으로서, 사이클린 D1을 전이활성 도메인을 함유하는 키메라로서 발현하는 플라스미드와 함께 재형질도입시킨다. 이로써 Nup2과는 더 이상 선택성으로 결합을 하지 않으나 사이클린 D1과는 선택적으로 결합하는 세 개의 클론을 수득한다. 이들 플라스미드는 일부 대조군과 함께 서열화한다.

수득된 표현형의 범위를 표 13에 요약한다. 이들 실험에서, 상호작용은 히스티딘(-Trp-Leu-His, 선택성)이 없을 경우 생장으로서 명백해지는 반면, 대조군(-Trp-Leu; 비-선택성)에서는 효모에서 두 가지 단백질이 모두 발현되었음을 나타내는 것이다. 1000개의 클론 중 3개의 클론은 더 이상 p163-Nup2와는 특이적으로 상호작용을 하지 않으나, 사이클린 D1과는 특이적으로 반응을 하는 것으로 나타났다. 서열을 표 14에 나타내었다. 기준 클론과는 일련의 것은 아니나 세 개 클론 모두 90번째 아미노산인 아르기닌에 동일한 돌연변이(글리신으로 돌연변이됨)를 가진다. 서열에서는 또한 클론이 다른 추가적인 돌연변이를 가지기 때문에 독립적으로 형성된다는 것을 보여준다. 이는 p27와 Nup2의 상호작용에서 중심 아미노산이 아르기닌 90이라는 것을 분명하게 확인할 수 있게 된다. 이와 같은 상호작용의 생물학적 관련성을 증명하는데 돌연변이를 사용할 수 있다.

2) p163 단백질의 우성 네가티브 유사체에 대한 뉴클레오티드 서열

상기 설명한 작용 검사에서 p163의 작용에 중요한 p163 단백질의 두 가지 도메인을 발견하였다.

이들 도메인 중 하나는 p27에 결합하는 도메인(아미노산 121-252)이다. 다른 도메인은 운반 작용을 조절하는 GTP-결합 단백질인 Ran에 결합을 하는 도메인(아미노산 307-467)이다.

본 발명은 결과적으로 단백질 p163 또는 이 단백질의 일부분에 대한 핵산 서열과 p27-결합 도메인 또는 Ran-결합 도메인에 돌연변이를 가지는 이들 핵산 서열에 관한 것인데, 이때 돌연변이로 인하여 발현된 돌연변이화 단백질의 p27 또는 Ran으로의 결합이 급격히 감소된다. 세포로 도입하였을 경우에, p163의 유사체는 작용적으로 세포-특이적 p163을 억제하여, p27를 자유롭게 하여, 세포 분열을 억제하게 된다. 이와 같은 우성 네가티브 돌연변이 p163의 예는 표 8과 9에 나타내었다. 표 8은 p27-결합 도메인이 결여된 p163을 나타내고, 표 9는 Ran-결합 도메인이 결핍된 p163을 나타낸다.

본 발명은 결과적으로 세포 증식을 억제할 목적으로 세포에서 우성 네가티브적인 간섭을 하는 p163 유사체의 용도에 관한 것이다.

3) p163 결합 도메인에 결합을 하는 단백질 또는 펩타이드의 뉴클레오티드 서열

본 발명자들은 p163의 p27 결합 도메인은 아미노산 121-252이고, Ran-결합 도메인은 아미노산 307-467이라는 것을 밝혀내었다.

p163에 결합을 하는, 특히 p27-결합 도메인 또는 p163의 Ran 결합 도메인에 결합을 하는 것은 항체 또는 F(ab)₂, Fab, Fv, s.c. Fv와 같은 항체 분해 산물이다. p163 또는 p163의 p27 결합 도메인 또는 Ran 결합 도메인을 동물에 면역시킴으로써 이와 같은 항체를 만들 수 있다. 이들 도메인은 표 4(Ran-결합 도메인)와 표 10(p27-결합 도메인)에 나타내었다.

4) 세포 분열을 자극시키는 p163의 핵산 서열

세포로 p163 또는 p163 단백질의 핵산 서열을 도입시키면 세포내 p27의 억제를 유도한다. 이로써 사이클린 E/cdk2 복합체(p27에 의해 억제를 받는)를 자유롭게 하고, 복합체는 세포 분열을 시작한다.

5) p163 단백질의 전사 및 해독을 억제하는 핵산 서열

p163의 핵산 서열에 대해서 알면 p163의 전사 및 해독을 특이적으로 억제를 하는데 사용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 만들 수 있는 가능성이 있다. 이와 같은 안티센스 핵산에는 올리고뉴클레오티드, 안티센스(3중) DNA, 리보자임 및 안티센스 RNA를 포함한다. 삼중 DNA 올리고뉴클레오티드를 준비하는 방법은 Frank-Kamenetskii and Mirkin, Ann. Rev, Biochem. 64, 65(1995)에서 상술하고 있고, 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 준비하는 방법은 문헌[참조: Neckers et al., Crit. Rev. Oncogen. 3, 175(1992); Carter and Lemoine, Br. J. Cancer 67, 869(1993); Mukhdopadhyay and Roth, Crit. Rev. Oncogen. 7, 151(1996)and Mercola and Cohen, Cancer Gene Ther. 2, 47(1995)]에 상술하고 있다.

본 발명의 범위 내에서 적절한 것은 p27 단백질에 결합을 하는 도메인(전체 부분 아미노산 121-252) 또는 Ran 단백질에 결합을 하는 도메인(전체 부분 아미노산 307-467)을 암호화하는 p163 뉴클레오티드 서열에 하이브리드할 수 있는 삼중 DNA 또는 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이다.

p163의 전사 및 해독을 억제하는 뉴클레오티드 서열에는 p163 단백질의 뉴클레오티드 부분에 특이적인 리보자임을 포함한다.

리보자임을 준비하는 방법은 Burke, Nucl. Acids Mol. Biol. 8, 105(1994), Christoffersen and Marr, J. Med. Chem. 38, 2023(1995) and Scott et al., Science 274, 2065(1996)에 상술되어 있고, 본 발명의 범위내에서, p27 단백질에 결합을 하는 도메인(전체 부분 아미노산 121-252) 또는 Ran 단백질에 결합을 하는 도메인(전체 부분 아미노산 307-467) 부분을 암호화하는 p163 뉴클레오티드 서열에 하이브리드할 수 있는 리보자임를 사용하는 것이다.

리보자임에 의해 절단될 수 있는 p163 단백질의 뉴클레오티드 서열의 예를 표 11에 나열하였다.

삼중 DNA, 안티센스 RNA 또는 리보자임을 올리고뉴클레오티드[당분야에 공지된 방법을 사용하여 준비된 그리고 DNases 또는 RNases에 의한 분해에 대해 보호를 받은]를 시험관내에서 표적 세포에 첨가하거나 또는 주사 또는 국소적으로 생체내 상태에서 투여한다.

그러나, 본 발명은 또한 세포의 증식을 억제하기 위해 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드에 상응하는 안티센스 RNA 또는 리보자임을 전사에 의해 세포에서 만들기 위해 세포에 핵산 구조를 유도하는 것에 관한 것이다. 세포로 생체내 또는 시험관내에서 이와 같은 유도를 할 수 있다.

핵산 구조는 DNA만을 세포 내로 도입시키거나 또는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여, 바이러스유도성이 아닌 벡터 또는 바이러스성 벡터의 도움으로 도입시킬 수 있다.

6) p163 작용을 억제하는 억제인자를 발견하기 위한 테스트 시스템

p163 단백질 및 p27 단백질과의 상호작용을 발견하여, 이와 같은 상호작용에 대한 억제인자에 대한 연구를 할 수 있다. 이는 p27 단백질과 p163 단백질간에 결합을 억제하는 테스트 시스템을 필요로 하고, 이와 같은 억제가 있다는 것은 지시물질을 사용하면 알 수 있다.

많은 방법이 공지되어 있다. 이들 방법 중 한 가지는 2-하이브리드 스크린 검사이다(이에 대해서는 단락 C.1과 표 1을 참고로 한다).

또는 스크리닝에 친화성 검사를 사용할 수 있으나, 이 시스템에서 p163[바람직하게는 p27-결합 도메인(아미노산 121-252)]을 고형 지지체에 결합을 시키고, 테스트 물질과 배양을 하고, p163 단백질의 p27 결합 도메인에 대해 표지된 결합 파트너의 결합을 억제하는 것으로 테스트 물질의 결합을 확인한다. 이와 같은 표지된 결합 파트너은 p27이거나 p163 단백질의 p27-결합 도메인에 특이적으로 결합을 하는 항체가 될 수 있다.

p163과 p27간에 결합 억제인자과 동일한 방식으로 p163과 Ran사이에 결합 억제인자에 대한 테스트 시스템을 만들고, 이를 스크리닝에 사용을 할 수 있다. 궁극적으로 본 발명은 p163의 억제인자을 조사하는데 있어서, p163을 암호화하는 핵산 서열 또는 p163의 구성 단백질을 암호화하는 핵산 서열 또는 p163 단백질 또는 이의 구성 단백질을 사용하는 것에 관한 것이다.

7) 세포 증식 단계의 진단 또는 질병 상태의 진단을 위한 p163의 핵산 서열 또는 p163의 단백질 서열의 용도

서론부 A)에서 설명을 한 것과 같이, 상당수의 종양에는 세포내 p27의 농도가 증가되는 것을 특징으로 한다. 이들 종양은 증식을 하기 때문에, 이와 같이 증가된 p27의 작용이 억제되는 것으로 가정을 한다. 본 발명에 따르면, p163은 p27에 특이적 억제인자이다. 세포에서 이와 같은 억제인자을 발견하면 세포의 증식 상태에 대한 결론을 끌어낼 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 결론은 종양 세포 또는 종양 조직의 악성을 판단하는데 상당히 중요하다. 세포가 죽으면 p163 단백질은 유리된다. 체액에서 p163의 존재를 검출하면 신체에서 염증 과정과 같은 세포 죽음을 수반하는 증식성 공정에 대한 결론을 유추할 수 있다. 표지된 물질에 특이적으로 결합된 p163 단백질을 검출될 수 있다. 이와 같은 특이적 결합 물질에는 p27 단백질, Ran 단백질 및 p163 단백질 또는 이의 구성 서열로 동물에 면역반응을 일으켜 생산하는 항체 등을 포함한다.

그러나, 단백질 p163-암호화하는 핵산서열과 이에 상응하는 mRNA에 하이브리드시켜, 세포 또는 조직에서 p163 mRNA를 검출할 수 있다. 당업자에게 친숙한 폴리메라제 연쇄 반응(PCR)을 사용할 수 있고, 이와 같은 검출 방법에 감응성을 증가시키기 위해서, 소위 프라이머 쌍을 사용하여 검출해야할 핵산 복사체의 수를 증가시킬 수 있다.

p163-암호화 핵산 서열을 증폭시키고 검출하기 위해 프라이머 쌍의 예는 표 12a, b, c에 나타내었다.

그러나, 문헌[참조 문헌: Gussoni et al., Nature Biotechnol. 14, 1012(1996)]에 언급된 바와 같이 동일계 형광성 하이브리드화로 p163-암호화 RNA를 검출하는 것도 가능하다.

본 발명은 궁극적으로 p163-암호화 핵산 서열 또는 p163 단백질을 검출하여, 살아있는 포유류에서 세포 또는 조직에서 증식 상태를 확인하고 또는 증식에 변화 또는 세포의 죽음을 수반하는 변화를 확인할 수 있다.

본 발명의 내용을 하기와 같이 요약할 수 있다:

1) p27을 억제하여 p27 단백질에 의해 야기되는 세포 증식 억제를 완화시키는 단백질.

2) 제1항에 있어서, 표 6에 제시된 p163의 아미노산 서열(서열 16) 또는 이의 일부를 포함하는 단백질.

3) 제2항에 있어서, p163의 아미노산 서열의 일부가, 표 6에 따라 매겨진 번호를 기본으로 하여, 1 내지 24 위치(서열 2), 137 내지 196 위치(서열 4), 215 내지 265 위치(서열 6), 239 내지 272 위치(서열 8), 399 내지 438 위치(서열 10) 및 307 내지 469 위치(서열 12)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단백질.

4) p27-결합 도메인 또는 Ran-결합 도메인이 표 6의 서열 16으로부터 결실되어진, 작용성 도메인의 결실에 의해 제2항에 따른 단백질로부터 유도될 수 있는 단백질.

5) 제4항에 있어서, 표 8에 제시된 아미노산 서열(서열 18)을 갖는 단백질이 p27-결합 도메인을 결실시켜 수득되고, 표 9에 제시된 아미노산 서열(서열 19)을 갖는 단백질이 Ran-결합 도메인을 결실시켜 수득되는 단백질.

6) 제2항에 따른 단백질로부터 p27-결합 도메인 영역 외의 모든 아미노산 서열을 결실시킴으로써 유도될 수 있는 단백질.

7) 제6항에 있어서, 표 10에 제시된 아미노산 서열(서열 20)을 포함하는 단백질.

8) 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 사람 또는 기타 포유류 종으로부터 유래된 상응하는 상동 단백질 또는 이의 상응하는 부분인 단백질.

9) 제8항에 있어서, p163의 사람 동족체 아미노산 서열을 포함하는 단백질.

10) 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 단백질을 암호화하는 DNA.

11) 제10항에 있어서,

(a) 표 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(서열 1) 또는 이의 일부를 포함하고,

(b) (a)에 언급된 서열과 스트린전트(stringent) 조건하에 하이브리드되거나

(c) (a)에 언급된 서열과 비교하여 유전자 암호의 축퇴성에 따라 변형되지만동일한 아미노산 서열을 암호화하는 DNA.

12) 제11항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 표 12a의 서열 21 내지 서열 30, 표 12b의 서열 31 및 서열 32, 및 표 12c의 서열 33 내지 서열 40으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, PCR 프라이머로서 사용하기 위한 DNA.

13) 세포 및/또는 조직내 p163 mRNA를 검출 및/또는 정량화하기 위한 제10항 또는 제11항에 따른 DNA의 용도.

14) 제13항에 있어서, 검출 및/또는 정량화가 노던 블롯팅에 의해 수행되는 용도.

15) 제13항에 있어서, 검출 및/또는 정량화가 PCR에 의해 수행되는 용도.

16) 제15항에 있어서, 제12항에 따른 PCR 프라이머를 사용하는 용도.

17) 제13항에 있어서, 검출 및/또는 정량화가 동일계 형광성 하이브리드화로 수행되는 용도.

18) 단백질에 결합하는 항체를 제조하기 위한 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 단백질의 용도.

19) 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 단백질의 p27 단백질의 결합 도메인에 결합하는 항체 및 이의 분해 산물.

20) 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 단백질의 Ran 단백질의 결합 도메인에 결합하는 항체 및 이의 분해 산물.

21) 세포, 조직 또는 체액에서 제1항 또는 제2항에 따른 단백질을 검출하기 위한 제19항 또는 제20항에 따른 항체의 용도.

22) 아미노산 121 내지 467을 암호화하는 뉴클레오티드의 영역에 위치한 제10항 또는 제11항에 따른 DNA의 구조적 영역에 대해 상보적인 안티센스 핵산.

23) 제22항에 있어서, 삼중 DNA, 합성 올리고뉴클레오티드, 안티센스 RNA 및 리보자임으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 안티센스 핵산.

24) 시험관내 또는 생체내에서 안티센스 핵산과 접촉시켜 세포의 증식을 억제하기 위한 제22항 또는 제23항에 따른 안티센스 핵산의 용도.

25) 안티센스 핵산 서열을 암호화하는 DNA가 하나 이상의 활성화 서열에 연결되고 네이키드(naked) DNA로서 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터에 삽입되어 표적 세포내로 도입된, 세포의 증식을 억제하기 위한 제22항 또는 제23항에 따른 안티센스 핵산을 암호화하는 핵산 작제물.

26) 단백질과 세포 결합 파트너들간의 상호작용 억제인자를 검출하기 위한 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 단백질의 용도.

27) 제26항에 있어서, 2-하이브리드 시스템을 사용하는 용도.

28) 제26항에 있어서, p163 또는 이의 p27-결합 도메인을 고체상에 결합시킨 후, 이 고체상을 시험 물질과 함께 배양하고, 최종적으로 단백질에 대한 결합 파트너의 결합 억제를 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 단백질의 표지된 결합 파트너를 통해 측정하는 친화성 시스템을 사용하는 용도.

29) 제28항에 있어서, 결합 파트너가 p27 및 Ran으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 용도.

30) 제1항, 제2항, 제8항 및 제9항 중의 어느 한 항에 따른 단백질의 작용 억제인자로서 제3항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 단백질의 용도.

31) 제1항, 제2항, 제8항 및 제9항 중의 어느 한 항에 따른 단백질의 작용 억제인자로서 제19항 또는 제20항에 따른 항체의 용도.

32) 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 단백질이 세포에서 발현될 수 있도록 하는 활성화 서열에 작동적으로 연결된 제10항 또는 제11항에 따른 DNA를 포함하는 핵산 작제물.

33) 세포 증식을 자극하기 위한 제32항에 따른 핵산 작제물의 용도.

DNA-결합도메인(Gal4)	파트너 분자 I	파트너 분자 II	활성화도메인(VP16)	갈락토시다제활성
++++-+++++++++	p27(1-198)p27(1-198)p27(1-198)--Myc 262-439Max프로티모신LAZ3/Bcl6p27(1-178)p27(1-94)p27(69-198)p27(69-94)p27(1-198)	--p163-p163p163p163p163p163p163p163p163p163p163(121-252)	-++-++++++++++	--+++------+++++++n.d.+++

칼럼 로딩	다음의 것으로 피복된 친화성 크로마토그래피에결합하는 정도
	글루타티온전이효소-p163융합 단백질	글루타티온 전이효소
재조합(³⁵S-표지된)p27	+++	+
p27을 포함하는 세포추출물(RAT1-Myc ER)	(+)	-
p27을 포함하는 세포추출물(RAT1-Myc ER)(95℃에서 2분간 가열함)	+++	-
cdk-2(세포 추출물)	-	-
cdk-4(세포 추출물)	-	-

서열 1

p163(쥐) 서열 16

NUP2(효모) 서열 17

HeLa 세포에서 p27와 p163간에 연합을 검출

	다음의 것으로 형질감염된 HeLa 세포의 총 단백질 침전
다음의 것으로침전	CMV-p27	CMV-p27+CMV-Nap	-CMV-Nap	--
Nap2-특이적항체	-	+	+	-
p27-특이적 항체	+	++	-	-

서열 18

서열 19

서열 20

p163에서 GUC 서열

뉴클레오티드 위치	서열
422-424	GGAA	GTC	ATGA
818-820	CTCC	GTC	CGCG
1021-1023	AAGA	GTC	ACCA
1287-1289	GAGA	GTC	CGGC
1586-1588	CAAC	GTC	CTTA
1595-1597	TATC	GTC	TGTG
1601-1603	CTGT	GTC	CCCA
EST 62312(사람)뉴클레오티드위치의 서열아미노산
212-214	GACT	GTC	GAAT	87
358-360	GACA	GTC	AGCA	136
402-404	TTGT	GTC	GGCC	150

상호작용 도메인은 쥐의 아미노산 서열 121-252로 구성된다. 이는 쥐의 뉴클레오티드 서열 685-1078에 상응한다.

5개의 선택한 프라이머 쌍

한 개의 선택한 프라이머 쌍

생장 실험의 요약

	사이클린 D1	Nup2
	비-선택성	선택성	비-선택성	선택성
wt p27	+++	+++	+++	+++
Mut 106	+++	+++	+++	+++
Mut 152	+++	+	+++	+
Mut 294	+++	+++	+++	-
Mut 660	+++	+++	+++	-
Mut 687	+++	-	+++	-
Mut 826	+++	+++	+++	+++
Mut 850	+++	+++	+++	-

야생형과 비교를 하였을 때 돌연변이된 p27의 서열

서열	서열 번호
Majority	41
클론 # 106	42
클론 # 152	43
클론 # 294	44
클론 # 660	45
클론 # 687	46
클론 # 826	47
클론 # 850	48
p27(쥐)	49

본 발명을 통해 핵산 서열을 표적 세포로 도입시키고 표적 세포-특이적 p163 단백질과 표적 세포-특이적 p27 단백질간의 결합을 억제하여, 이로 인해 방출된 표적 세포-특이적 p27 단백질에 의해 표적 세포의 증식을 억제할 수 있다.

서열 목록

(1) 일반 정보

(i) 출원인;

(A) 이름; 훽스트 마리온 러쎌 도이칠란트 게엠베하

(B) 거리; -

(C) 도시; 프랑크푸르트

(D) 주; -

(E) 나라; 독일

(F) 우편번호; 65926

(G) 전화번호; 069-305-3005

(H) 팩스번호; 069-35-7175

(I) 텔렉스;

(ii) 발명의 명칭; 사이클린-의존성 키나제의 억제인자에 대한 결합 파트너 및 억제인자 검출 및 질병의 진단 또는 치료를 위한 이의 용도

(iii) 서열의 수; 49

(iv) 컴퓨터 판독 형태

(A) 매체 형태; 플로피 디스크

(B) 컴퓨터; IBM PC 호환성

(C) 작동시스템; PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어; PatentIn Release #1.0, Version #1.30(EPO)

(2) 서열 1에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 1958bp

(B) 형태; 핵산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..1958

(xi) 서열 1

(2) 서열 2에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 24 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..24

(xi) 서열 2

(2) 서열 3에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 24 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..24

(xi) 서열 3

(2) 서열 4에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 60 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..60

(xi) 서열 4

(2) 서열 5에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 60 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..60

(xi) 서열 5

(2) 서열 6에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 51 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..51

(xi) 서열 6

(2) 서열 7에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 51 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..51

(xi) 서열 7

(2) 서열 8에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 34 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..34

(xi) 서열 8

(2) 서열 9에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 34 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..34

(xi) 서열 9

(2) 서열 10에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 40 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..40

(xi) 서열 10

(2) 서열 11에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 40 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..40

(xi) 서열 11

(2) 서열 12에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 157 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..157

(xi) 서열 12

(2) 서열 13에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 157 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..157

(xi) 서열 13

(2) 서열 14에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이: 158 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..158

(xi) 서열 14

(2) 서열 15에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 160 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..160

(xi) 서열 15

(2) 서열 16에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 466 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..466

(xi) 서열 16

(2) 서열 17에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 715 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..715

(xi) 서열 17

(2) 서열 18에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 335 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..335

(xi) 서열 18

(2) 서열 19에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 310 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..310

(xi) 서열 19

(2) 서열 20에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 132 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..132

(xi) 서열 20

(2) 서열 21에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 22bp

(B) 형태; 핵산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..22

(xi) 서열 21

AGAAAGCAAA GCGCAGAAAT GT 22

(2) 서열 22에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 21bp

(B) 형태; 핵산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..21

(xi) 서열 22

CAAATCCAGA AAAGCGTCCT C 21

(2) 서열 23에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 24bp

(B) 형태; 핵산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..24

(xi) 서열 23

TGAAGAATAG AGCCATAAAG AAAG 24

(2) 서열 24에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 21bp

(B) 형태; 핵산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..21

(xi) 서열 24

AGAAAAGCGT CCTCCTCCAG A 21

(2) 서열 25에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 24bp

(B) 형태; 핵산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..24

(xi) 서열 25

TGAAGAATAG AGCCATAAAG AAAG 24

(2) 서열 26에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 22bp

(B) 형태; 핵산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..22

(xi) 서열 26

AGCGCCACTA ACCAAATCCA GA 22

(2) 서열 27에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 22bp

(B) 형태; 핵산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..22

(xi)서열 27

AGAAAGCAAA GCGCAGAAAT GT 22

(2) 서열 28에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 22bp

(B) 형태; 핵산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..22

(xi) 서열 28

GAAAAGCGTC CTCCTCCAGA AG 22

(2) 서열 29에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 22bp

(B) 형태; 핵산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지;선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..22

(xi) 서열 29

GAAAGCAAAG CGCAGAAATG TT 22

(2) 서열 30에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 21bp

(B) 형태; 핵산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..21

(xi) 서열 30

CTCCAGCGCC ACTACCAAAT C 21

(2) 서열 31에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 20bp

(B) 형태; 핵산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..20

(xi) 서열 31

CCCGCACGGA GCAGTTCAAG 20

(2) 서열 32에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 22bp

(B) 형태; 핵산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..22

(xi) 서열 32

GCAGCGGCAG ATCCCAAGGT AG 22

(2) 서열 33에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 17bp

(B) 형태; 핵산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..17

(xi) 서열 33

GGCATCCTTT TTCTCCA 17

(2) 서열 34에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 22bp

(B) 형태; 핵산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..34

(xi) 서열 34

CGTTCTTATC GTCTCTGTGT TC 22

(2) 서열 35에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 19bp

(B) 형태; 핵산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..19

(xi) 서열 35

GCATCCTTTT TCTCCAGTA 19

(2) 서열 36에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 18bp

(B) 형태; 핵산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..18

(xi) 서열 36

TGTTCCAAAT CCACCAAT 18

(2) 서열 37에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 19bp

(B) 형태; 핵산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..19

(xi) 서열 37

GTCTGCATCC TCGCTGGTT 19

(2) 서열 38에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 21bp

(B) 형태;핵산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..21

(xi) 서열 38

CGTTCTTATC GTCTGTGTTC C 21

(2) 서열 39에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 18bp

(B) 형태; 헥산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..18

(xi) 서열 39

TTTTACCCGA ATCAACAT 18

(2) 서열 40에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 21bp

(B) 형태; 핵산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 이름/키; 엑손

(B) 위치; 1..40

(xi) 서열 40

GTACGCGAAC AGGGAAGAAT A 21

(2) 서열 41에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 212 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..212

(xi) 서열 41

(2) 서열 42에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 183 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..183

(xi) 서열 42

(2) 서열 43에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 199 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..199

(xi) 서열 43

(2) 서열 44에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 199 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..199

(xi) 서열 44

(2) 서열 45에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 199 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..199

(xi) 서열 45

(2) 서열 46에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 220 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..220

(xi) 서열 46

(2) 서열 47에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 183 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..183

(xi) 서열 47

(2) 서열 48에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 138 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..138

(xi) 서열 48

(2) 서열 49에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이; 197 아미노산

(B) 형태; 아미노산

(C) 쇄의 수; 일본쇄

(D) 토폴로지; 선형

(ii) 분자형; 단백질

(ix) 특징

(A) 이름/키; 단백질

(B) 위치; 1..197

(xi) 서열 49

Claims

p27을 억제하여 p27 단백질에 의해 야기되는 세포 증식 억제를 완화시키는 단백질.
제1항에 있어서, 표 6에 제시된 p163의 아미노산 서열(서열 16) 또는 이의 일부를 포함하는 단백질.
제2항에 있어서, p163의 아미노산 서열의 일부가, 표 6에 따라 매겨진 번호를 기본으로 하여, 1 내지 24 위치(서열 2), 137 내지 196 위치(서열 4), 215 내지 265 위치(서열 6), 239 내지 272 위치(서열 8), 399 내지 438 위치(서열 10) 및 307 내지 469 위치(서열 12)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단백질.
p27-결합 도메인 또는 Ran-결합 도메인이 표 6의 서열 16으로부터 결실되어진, 작용성 도메인의 결실에 의해 제2항에 따른 단백질로부터 유도될 수 있는 단백질.
제4항에 있어서, 표 8에 제시된 아미노산 서열(서열 18)을 갖는 단백질이 p27-결합 도메인을 결실시켜 수득되고, 표 9에 제시된 아미노산 서열(서열 19)을 갖는 단백질이 Ran-결합 도메인을 결실시켜 수득되는 단백질.
제2항에 따른 단백질로부터 p27-결합 도메인 영역 외의 모든 아미노산 서열을 결실시킴으로써 유도될 수 있는 단백질.
제6항에 있어서, 표 10에 제시된 아미노산 서열(서열 20)을 포함하는 단백질.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 사람 또는 기타 포유류 종으로부터 유래된 상응하는 상동 단백질 또는 이의 상응하는 부분인 단백질.
제8항에 있어서, p163의 사람 동족체 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 단백질을 암호화하는 DNA.
제10항에 있어서,

(a) 표 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(서열 1) 또는 이의 일부를 포함하고,

(b) (a)에 언급된 서열과 스트린전트(stringent) 조건하에 하이브리드되거나

(c) (a)에 언급된 서열과 비교하여 유전자 암호의 축퇴성에 따라 변형되지만동일한 아미노산 서열을 암호화하는 DNA.
제11항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 표 12a의 서열 21 내지 서열 30, 표 12b의 서열 31 및 서열 32, 및 표 12c의 서열 33 내지 서열 40으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, PCR 프라이머로서 사용하기 위한 DNA.
세포 및/또는 조직내 p163 mRNA를 검출 및/또는 정량화하기 위한 제10항 또는 제11항에 따른 DNA의 용도.
제13항에 있어서, 검출 및/또는 정량화가 노던 블롯팅에 의해 수행되는 용도.
제13항에 있어서, 검출 및/또는 정량화가 PCR에 의해 수행되는 용도.
제15항에 있어서, 제12항에 따른 PCR 프라이머를 사용하는 용도.
제13항에 있어서, 검출 및/또는 정량화가 동일계 형광성 하이브리드화로 수행되는 용도.
단백질에 결합하는 항체를 제조하기 위한 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 단백질의 용도.
제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 단백질의 p27 단백질의 결합 도메인에 결합하는 항체 및 이의 분해 산물.
제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 단백질의 Ran 단백질의 결합 도메인에 결합하는 항체 및 이의 분해 산물.
세포, 조직 또는 체액에서 제1항 또는 제2항에 따른 단백질을 검출하기 위한 제19항 또는 제20항에 따른 항체의 용도.
아미노산 121 내지 467을 암호화하는 뉴클레오티드의 영역에 위치한 제10항 또는 제11항에 따른 DNA의 구조적 영역에 대해 상보적인 안티센스 핵산.
제22항에 있어서, 삼중 DNA, 합성 올리고뉴클레오티드, 안티센스 RNA 및 리보자임으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 안티센스 핵산.
시험관내 또는 생체내에서 안티센스 핵산과 접촉시켜 세포의 증식을 억제하기 위한 제22항 또는 제23항에 따른 안티센스 핵산의 용도.
안티센스 핵산 서열을 암호화하는 DNA가 하나 이상의 활성화 서열에 연결되고 네이키드(naked) DNA로서 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터에 삽입되어 표적 세포내로 도입된, 세포의 증식을 억제하기 위한 제22항 또는 제23항에 따른 안티센스 핵산을 암호화하는 핵산 작제물.
단백질과 세포 결합 파트너들간의 상호작용 억제인자를 검출하기 위한 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 단백질의 용도.
제26항에 있어서, 2-하이브리드 시스템을 사용하는 용도.
제26항에 있어서, p163 또는 이의 p27-결합 도메인을 고체상에 결합시킨 후, 이 고체상을 시험 물질과 함께 배양하고, 최종적으로 단백질에 대한 결합 파트너의 결합 억제를 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 단백질의 표지된 결합 파트너를 통해 측정하는 친화성 시스템을 사용하는 용도.
제28항에 있어서, 결합 파트너가 p27 및 Ran으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 용도.
제1항, 제2항, 제8항 및 제9항 중의 어느 한 항에 따른 단백질의 작용 억제인자로서 제3항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 단백질의 용도.
제1항, 제2항, 제8항 및 제9항 중의 어느 한 항에 따른 단백질의 작용 억제인자로서 제19항 또는 제20항에 따른 항체의 용도.
제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 단백질이 세포에서 발현될 수 있도록 하는 활성화 서열에 작동적으로 연결된 제10항 또는 제11항에 따른 DNA를 포함하는 핵산 작제물.
세포 증식을 자극하기 위한 제32항에 따른 핵산 작제물의 용도.