JPH11281618A

JPH11281618A - 核酸試料混合物中の核酸の種類の比率の測定方法

Info

Publication number: JPH11281618A
Application number: JP10101989A
Authority: JP
Inventors: Toshihiro Tsuneyoshi; 俊宏常吉; Masatoshi Kaji; 眞壽梶; Ryuji Kawaguchi; 竜二川口
Original assignee: SHIZUOKA INST OF SCIENCE AND T; SRL Inc; Shizuoka Institute of Science and Technology
Current assignee: SHIZUOKA INST OF SCIENCE AND T; SRL Inc; Shizuoka Institute of Science and Technology
Priority date: 1998-03-30
Filing date: 1998-03-30
Publication date: 1999-10-15
Anticipated expiration: 2018-03-30
Also published as: JP3950546B2

Abstract

(57)【要約】【課題】一括した処理により、核酸試料混合物中の核
酸の種類の比率を測定することができる方法を提供する
こと。【解決手段】核酸試料群中の各核酸の混合物を遺伝子
増幅法で増幅する工程と、増幅産物を制限酵素で消化す
る工程と、消化物を電気泳動にかける工程と、泳動バン
ドの濃さを測定する工程と、測定された各バンドの濃さ
に基づいて前記核酸試料群中の、核酸の種類の比率を測
定する工程とを含む、核酸試料群中の、核酸の種類の比
率の測定方法を提供した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸試料混合物中
の核酸の種類の比率の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】日本産のウナギは、学名がAnguilla jap
onica であり、我が国の消費者の間では最も人気が高
く、価格も高い。一方、外国産のウナギとしては、フラ
ンス産のA. anguilla 、オーストラリア産で斑点のある
A. reinhardti 、オーストラリア産で斑点の無いA. aus
tralis、インドネシア産のA. celebesensis 、フィリピ
ン産のA. marmorata、アメリカ産のA. rostrata 等があ
る。

【０００３】養鰻業は、ウナギの稚魚（シラス）を養殖
することにより行われている。シラスは市販のものを購
入する場合が多い。日本産のウナギのシラスと称して販
売されているものの中に外国産ウナギのシラスが混入し
ている場合がある。日本産ウナギのシラスの中に外国産
ウナギのシラスが混入していると、経費をかけて養殖し
ても、外国産ウナギは成長が著しく悪いので、全てが日
本産ウナギの場合に比べ、同じ経費をかけても売上は少
なくなってしまい、養鰻業者が被害を被ることになる。
しかしながら、ウナギのシラスは、日本産も外国産も外
見上、区別がつかない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記のウナギのシラス
の場合のように、外見上区別できない生物の種類を識別
する方法として、遺伝子検査による方法が考えられる。
しかしながら、遺伝子検査による方法では、各生物個体
について、それぞれ分析する必要があり、日本産ウナギ
シラスの中に外国産ウナギシラスが混入することが予想
される場合等では、かなりの数のシラスを無作為抽出し
て１個体ずつ分析する必要があるので、効率が悪くコス
トがかかる。もし、複数の生物個体を一括で処理し、そ
の生物個体群中の生物の種類の混合比率（例えば、一群
のウナギシラスにおける日本産と外国産の比率）がわか
れば手間とコストを大きく削減することができ有利であ
る。

【０００５】従って、本発明の目的は、一括した処理に
より、核酸試料混合物中の核酸の種類の比率を測定する
ことができる方法を提供することである。

【０００６】本願発明者らは、鋭意研究の結果、核酸試
料混合物についてＰＣＲ−ＲＦＬＰを行い、電気泳動に
より現れる泳動バンドの濃さに基づいて核酸試料混合物
中のの核酸の種類の比率を測定することができることを
見出し、本発明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明は、核酸試料群中の各核
酸の混合物を遺伝子増幅法で増幅する工程と、増幅産物
を制限酵素で消化する工程と、消化物を電気泳動にかけ
る工程と、泳動バンドの濃さを測定する工程と、測定さ
れた各バンドの濃さに基づいて前記核酸試料群中の、核
酸の種類の比率を測定する工程とを含む、核酸試料群中
の、核酸の種類の比率の測定方法を提供する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明の方法は、複数の核酸試料
を含む核酸試料混合物中の核酸の種類の比率を測定する
ものである。核酸試料が由来する生物としては、何ら限
定されるものではなく、例えば、従来技術の項で述べた
ウナギの他に、マグロ、サケ等の魚、ウマ、ウシ、ヒツ
ジ等の哺乳動物、ニワトリ、ウズラ等の鳥類、綿花、ダ
イズ、イネ、ムギ、各種野菜等の植物、カイコ等の昆虫
等を例示することができるが、もちろんこれらに限定さ
れるものではない。また、核酸試料は、生物由来の各種
加工品、例えば、各種生鮮食品や加工食品、羊毛、綿、
繊維製品等に由来するものであってもよい。また、本明
細書において、「核酸の種類」とは、次のことを意味す
る。すなわち、後述の核酸増幅領域中に、問題とする塩
基が相違する塩基配列が２種類以上存在する場合に、各
種類の塩基配列を有する核酸が、それぞれ「核酸の種
類」を構成する。例えば、後述の実施例では、日本産の
ウナギであるAuguilla japonica と、フランス産のウナ
ギであるAnguilla anguilla とを含む生物個体群につい
て試験を行っているが、この場合、増幅領域中に問題と
する塩基が異なる塩基配列が２種類存在するので、「核
酸の種類」は２種類である。この実施例の個体群にさら
にオーストラリア産のウナギであるAnguilla australis
を加え、これら３種のウナギの混合比率を求める場合に
は、「核酸の種類」は３種類である。しかしながら、試
料が３種のウナギ由来の核酸混合物である場合であって
も、日本産と外国産（この例ではanguillaとaustralis
の合計）の混合比率を求めることを目的とする場合に
は、日本産ウナギの塩基配列のみがその他の外国産ウナ
ギと異なる塩基に注目するので、問題とする塩基配列が
異なる塩基配列が２種類存在することになり（つまり、
ある特定の部位の塩基が特定の塩基かそれ以外の塩基か
ということで２種類に分けられる）、従って、「核酸の
種類」は２種類になる。このように、「核酸の種類」
は、同じ核酸試料混合物であっても、検査の目的に応じ
て変化する概念である。さらに、増幅が起きない場合も
１種類の核酸として扱われる。従って、例えば、核酸試
料混合物中に、増幅操作により増幅が起きる核酸と起き
ない核酸が含まれており、増幅が起きる核酸試料の比率
を求める場合も本発明の範囲に含まれる。

【０００９】核酸試料混合物中の核酸試料の数は、特に
限定されないが、あまりに多くなると分析の精度が低下
するので、通常、２〜６程度が好ましい。試料の数が２
〜６程度であれば、測定された混合比率から、混合物中
の各核酸の種類に該当する試料の数を特定することが可
能である。もっとも、混合比率から各種類の試料の数ま
でを特定する必要はなく、おおまかな混合比率さえわか
ればよい場合には、試料の数の上限は特にない。また、
存在する可能性のある核酸の種類の数も特に限定されな
いが、あまりに多くなると分析の精度が低下するので、
通常、２〜６種類程度が好ましい。

【００１０】核酸試料の調製は、常法により行うことが
できる。なお、核酸試料混合物は、各核酸試料の供給源
からそれぞれ核酸を抽出した後に混合してもよいが、先
に供給源を混合し、それから一括して核酸を抽出する方
が手間が省けるので好ましい。

【００１１】次に、核酸試料混合物中に含まれる特定の
核酸領域を遺伝子増幅法により増幅する。なお、増幅さ
れる核酸領域は、上記した核酸の種類が複数存在し得る
領域である。例えば、ウナギの個体群中のウナギの種の
混合比率を求める場合には、後でさらに詳しく述べるよ
うに、ウナギのミトコンドリアのチトクロムｂ遺伝子中
の領域を増幅領域とすることができる。

【００１２】遺伝子増幅法自体は、いくつかの方法がこ
の分野において周知であり、それらのいずれをも用いる
ことが可能である。代表的な方法としてポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）を挙げることができるが、これに限定
されるものではない。遺伝子増幅法用の試薬キット及び
装置は市販されているので、それらを用いて遺伝子増幅
法自体は容易に行うことができる。なお、下記実施例に
も、ＰＣＲによる増幅の例が具体的に記載されている。

【００１３】次に、増幅産物を制限酵素で消化する。消
化に用いる制限酵素は、核酸の種類に応じて異なる長さ
の制限断片を生じさせるものを選んで用いる。すなわ
ち、この工程は、この分野において周知の制限断片長多
型（ＲＦＬＰ）法の工程であり、常法により行うことが
できる。

【００１４】次いで、消化物を電気泳動にかける。電気
泳動としては、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲ
ル等のゲルを用いたゲル電気泳動が好ましい。核酸増幅
産物の制限酵素消化物の電気泳動法自体はこの分野にお
いて周知であり、従来のＲＦＬＰと同様に行うことがで
きる。

【００１５】次いで、電気泳動により得られる泳動バン
ドの濃さを測定する。バンドの濃さは相対的なものであ
ってよく、各バンドの濃さの比率がとれればよい。バン
ドの濃さの測定は、例えば、電気泳動ゲル上の核酸バン
ドを紫外線吸収又は蛍光法により可視化し、可視化した
泳動バンドパターンを写真に撮り、該電気泳動写真をス
キャナーでスキャンするか、若しくはデジタルカメラで
撮影するか、又は電気泳動写真のネガをフィルムスキャ
ナーでスキャンしてコンピューターに取込み、コンピュ
ーター内で画像解析ソフトを用いて各バンドの濃度を測
定することにより行うことができる。スキャナー、デジ
タルカメラ、フィルムスキャナーは、通常の市販のもの
を用いることができ、解像度は３００ｄｐｉ以上のもの
が好ましい。また、画像処理ソフトとしては、米国ＮＩ
Ｈ（National Institutes of Health)から「Image 」と
いう名称のソフトが入手可能であり、このソフトを好ま
しく用いることができる。なお、電気泳動バンドの濃度
の測定方法自体は公知であり、例えば小島清嗣著、「ス
キャナを利用した電気泳動ゲルの画像取込みと画像処理
（Image ）。医学、分子生物学研究のためのMacintosh
ハンドブック」pp.112-121；「遺伝子解析、データ解析
から論文発表まで」法橋尚宏、丸山和夫編、羊土社（１
９９２）；及びNIH Image 1.44マニュアル：Wayne Rasb
and (1992)に記載されている。また、バンドの濃さを測
定するためには、必ずしもバンドを可視化する必要はな
く、発光強度やフォトン強度を測定機器を用いて測定し
たり、あるいは、核酸増幅に用いるヌクレオチドとして
放射標識したものを用い、バンドの放射能を測定するこ
とによりバンドの濃さを測定することもできる。

【００１６】次に、測定された各バンドの濃さに基づい
て、核酸試料群中の核酸の種類の比率を測定する。これ
は、混合物中の各核酸の種類の混合比率が公知である各
対照混合物について試料と同じ操作を行い、そのバンド
の濃さの相対比率と被検試料混合物について得られたバ
ンドの濃さの相対比率とを比較することにより行うこと
ができる。なお、下記実施例に具体的に記載するよう
に、核酸の種類が２種類である場合には、注目する核酸
の比率を横軸にとり、該泳動バンドの濃さの比率を縦軸
にとる検量線を作成すると、この検量線がほぼ直線にな
るので、この検量線を利用して被検核酸試料混合物中の
核酸の種類の比率を求めることができる。

【００１７】次に、本発明の方法を、ウナギ個体群中の
ウナギ種の混合比率の測定に用いる場合について説明す
る。

【００１８】ウナギの核酸試料の供給源としては、生き
たシラスであってもよいし、成鰻や蒲焼き等、どのよう
な成育段階のものや加工された食品であっても構わな
い。先ず、混合された供給源から、核酸を抽出する。シ
ラス等の供給源から、遺伝子増幅法の鋳型として用いる
ＤＮＡを調製する方法としては、特に限定されず、公知
のいずれの方法をも採用することができる。好ましい方
法として次の２通りの方法を挙げることができる。第１
法では、先ず、シラス等を液体窒素で凍結し、すりつぶ
し、ＳＤＳ含有バッファー中Proteinase Kで例えば５６
℃で一夜消化する。得られた消化物を、常法に従いフェ
ノールクロロホルム抽出し、エタノール沈殿したものを
ＤＮＡ試料として遺伝子増幅法に供する。第２法では、
シラスを１〜２ｃｍに細かく切断するか又は液体窒素で
凍結してすりつぶし、ＳＤＳ含有バッファー中Proteina
se Kで例えば５６℃で１５分間〜２時間消化する。得ら
れた消化物を遠心分離（例えば1000 rpm、１０分間）
し、上清の一部を取り、例えば９８℃で１０分間加熱し
て酵素を失活させたものをＤＮＡ試料として遺伝子増幅
法に供する。

【００１９】遺伝子増幅法は、鋳型として被検核酸試料
混合物を用い、さらに目的とする核酸領域を増幅するた
めに選択された第１及び第２の核酸プライマーを用い
る。ウナギ種の検査のためには、ウナギのミトコンドリ
アのチトクロムｂ遺伝子中の特定領域を用いることが好
ましい。なぜなら、この領域は、ウナギの種毎に塩基配
列が異なっているからである。

【００２０】第１の核酸プライマーは、配列表の配列番
号１、好ましくは配列番号２に示される塩基配列若しく
は該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５
塩基以上から成る塩基配列又は該配列のうち１０％以下
の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基
配列を有する核酸から成ることが好ましい。なお、核酸
はＤＮＡでもＲＮＡでもよく、従って、配列中のＴはＵ
であってもよい。核酸プライマーのサイズは、１５塩基
〜５０塩基程度が好ましい。核酸プライマーの配列は、
配列番号１に示される配列を有する核酸又はその相補鎖
のいずれと同じ配列であってもよい。また、１０％以下
の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された配列であ
っても、鋳型核酸とハイブリダイズ可能であるので使用
することができる。このことを利用して意図的に特定の
塩基を置換したものを用いることにより、意図的に特定
の制限酵素部位を導入することも可能である。

【００２１】第２の核酸プライマーは、配列表の配列番
号４、好ましくは配列番号５に示される塩基配列若しく
は該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５
塩基以上から成る塩基配列又は該配列のうち１０％以下
の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基
配列を有する核酸から成ることが好ましい。なお、核酸
はＤＮＡでもＲＮＡでもよく、従って、配列中のＴはＵ
であってもよい。核酸プライマーのサイズは、１５塩基
〜５０塩基程度が好ましい。核酸プライマーの配列は、
配列番号４に示される配列を有する核酸又はその相補鎖
のいずれと同じ配列であってもよい。また、１０％以下
の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された配列であ
っても、鋳型核酸とハイブリダイズ可能であるので使用
することができる。このことを利用して意図的に特定の
塩基を置換したものを用いることにより、意図的に特定
の制限酵素部位を導入することも可能である。例えば、
下記実施例で具体的に記載される第２の核酸プライマー
であるＴＷ１１は、５’末端から２７番目のアデニンを
意図的にシトシンに置換することによりＰｓｔＩ部位を
導入している。

【００２２】なお、第１の核酸プライマー及び第２の核
酸プライマーのいずれか一方をフォワード側プライマ
ー、他方をリバース側プライマーとして用いる必要があ
る。従って、第１のプライマーとして、配列番号１に示
される配列と同一又は相同な配列を有するプライマーを
用いる場合には、第２のプライマーとしては、配列番号
４に示される塩基配列と同一又は相同な配列を有する核
酸の相補鎖を用いる。逆に、第１のプライマーとして配
列番号１に示される配列と同一又は相同な配列を有する
核酸の相補鎖を用いる場合には、第２のプライマーとし
ては配列番号４に示される配列と同一又は相同な配列を
有するプライマーを用いる。なお、周知のように、核酸
鎖とその相補鎖は、バックボーンの５’→３’方向が逆
になっており、一方、明細書における塩基配列は５’側
を左側（上流側）に記載するように決められているか
ら、ある核酸鎖の相補鎖の塩基配列を明細書に記載する
場合、元の核酸鎖の下流側（３’側）と相補的な領域が
上流側（５’側）に記載される。

【００２３】この方法では、上記第１及び第２のプライ
マーを用い、ウナギＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いて遺
伝子増幅法により、ウナギＤＮＡの一領域を増幅する。
増幅される領域は、ウナギのミトコンドリアのチトクロ
ムｂ遺伝子内の領域である。この方法により増幅可能
な、Anguilla japonica のミトコンドリアのチトクロム
ｂ遺伝子領域の塩基配列を配列番号７に示す。また、各
種ウナギの当該領域の塩基配列と、制限酵素部位を図１
及び図２に示す。なお、図１及び図２中、A. japonica
以外のウナギの配列は、A. japonica と異なる部位のみ
記載してある。また、制限酵素の切断部位が矢印で示さ
れていないものは、japonica以外の種において制限酵素
部位が存在するものである。図２は図１の続きである。

【００２４】配列番号１に示される配列は、図１に示さ
れる第１番目の塩基（以下、「１ｎｔ」のように表示）
〜１４２ｎｔの領域の塩基配列であり、ウナギ種により
塩基が異なる部位を一般化して一般式として示したもの
である。また、配列番号４に示される配列は、図２に示
される２７９ｎｔ〜４１０ｎｔの領域の塩基配列であ
り、ウナギ種により塩基が異なる部位を一般化して一般
式として示したものである。第１及び第２のプライマー
を用いて遺伝子増幅を行うと、両方のプライマーによっ
て挟まれた領域が増幅される。

【００２５】次いで、遺伝子増幅法により得られた増幅
産物を制限酵素で消化する。図１及び図２に示されるよ
うに、増幅領域には、ＨｉｎｆＩ、ＭｂｏII及びＲｓａ
Ｉの制限酵素部位が含まれるので、これらの制限酵素を
用いてＲＦＬＰを行うことにより種の鑑定を行うことが
できる。また、下記実施例で用いられるプライマーＴＷ
１１は、japonicaの場合にのみＰｓｔＩ部位が生じるよ
うに、上記の通り人為的に塩基を置換している。これら
のうち、ＨｉｎｆＩ及びＴＷ１１を用いた場合のＰｓｔ
Ｉは、japonicaの切断部位のみが外国産ウナギの切断部
位と異なっているので、ＨｉｎｆＩとＰｓｔＩのいずれ
か一方を用いることにより、日本産と外国産との識別が
可能である。また、(1) ＨｉｎｆＩと、(2) ＭｂｏIIと
ＲｓａＩとをそれぞれ別個に用い、それぞれにおいて得
られる消化断片の大きさから種を同定することも可能で
ある。例えば、下記実施例において用いられる、配列番
号３で示される塩基配列を有する第１プライマー（ＴＷ
６、配列番号７の１１ｎｔ〜３２ｎｔとハイブリダイ
ズ）と、配列番号６で示される第２プライマー（ＴＷ１
１、配列番号７の３７９ｎｔ〜４０８ｎｔの相補鎖とハ
イブリダイズ）とを用いて増幅を行った場合には、下記
表１に示されるサイズの断片を指標として種の同定を行
うことができる。

【００２６】

【表１】

【００２７】表１からわかるように、ＨｉｎｆＩで消化
した場合に２２０ｂｐ及び１１８ｂｐの断片が現れるの
は日本産（japonica）のみであるから、日本産か否かを
鑑定するだけが目的であれば、ＨｉｎｆＩのみを用いる
ことができる。あるいは、先ず、日本産か否かをＨｉｎ
ｆＩのみ、又はＨｉｎｆＩと確認のためにＰｓｔＩを用
いて調べ、外国産であることが判明した試料についての
みＭｂｏIIとＲｓａＩを用いて消化を行い、種を同定す
ることもできる。

【００２８】本発明の方法は、生物個体群中の特定の種
類の生物個体の混合比率の測定の他、特定の感染症にか
かった生物個体の混合比率、食品又は食料の群中の、特
定の感染症にかかったり又は遺伝子操作を受けた生物由
来の食品又は食料の混合比率、生物由来の繊維製品や糸
等の群における特定の種類の生物個体由来のものの混合
比率等、種々のものの測定に適用することができる。

【００２９】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。

【００３０】実施例１１．ＤＮＡ試料の調製日本産ウナギAnguilla japonica （以下、単に「Ｊ」と
表記することがある）及びフランス産ウナギAnguilla a
nguilla （以下、単に「Ａ」と表記することがある）の
シラスを核酸の供給源として用いた。１群５匹とし、第
１群は５匹ともＪ、第２群は４匹がＪ、１匹がＡ、第３
群は３匹がＪ、２匹がＡ、第４群は２匹がＪ、３匹が
Ａ、第５群は１匹がＪ、４匹がＡ、第６群は５匹ともＡ
とした。

【００３１】各群のシラスをそれぞれ群毎に混合し、液
体窒素で凍結後、乳鉢を用いて細かくすりつぶし、エッ
ペンドルフチューブに投入した。洗浄用バッファー（1M
Tris-HCl (pH8.0) 2.5 ml、0.5M EDTA (pH8.0) 、5M N
aCl 1.0 ml、蒸留水45.5 mlを混合して調製）０．５ｍ
ｌを加え、すりつぶし、５分間遠心分離した。上澄み液
をデカンテーションで捨て、ＳＴＥバッファー（1M Tri
s-HCl (pH8.0) 2.5 ml、0.5M EDTA (pH8.0) 1.0 ml、5M
NaCl 1.0 ml、10% SDS 0.5 ml、蒸留水45.0 ml を混合
して調製）０．５ｍｌとProteinase K溶液（10 mg/ml)
４０μｌを加え、５６℃で３０分間消化した。消化物を
ボルテックスミキサーで撹拌後、５分間遠心分離し、１
００μｌの上清を取り、９８℃、１０分間加熱処理して
酵素を失活させた。このうち１μｌを取って、ＰＣＲに
供した。

【００３２】２．ＰＣＲ市販のＰＣＲキット及び装置
を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ混合物の組成は次の通
りであった。なお、プライマーとしては、上記したＴＷ
６及びＴＷ１１を用いた。

【００３３】蒸留水 14.8μｌ 10xGA バッファー（Mg²⁺ 1.5 mM) 2.0μｌ 2.5 mM dNTP 1.6μｌ 25μＭ各プライマー 0.4μｌ Taq ポリメラーゼ（5U/ μｌ） 0.2μｌＤＮＡ 1.0μｌ

【００３４】ＰＣＲは、９５℃３０秒の変性工程、６０
℃３０秒のアニーリング工程及び７２℃３０秒の伸長工
程を３５サイクル行った。

【００３５】３．ＲＦＬＰ各ＰＣＲ産物６μｌ、１０ｘバッファー１．５μｌ、Ｈ
ｉｎｆＩ（濃度１０U／μｌ）０．７５μｌ及び蒸留水
６．７５μｌから成る混合物を３７℃で３０分間インキ
ュベートすることにより消化を行った。次いで、常法に
より、各消化物を３％アガロースゲル電気泳動にかけ
た。

【００３６】４．泳動バンドの濃さの測定及び混合比
率の測定泳動バンドをエチジウムブロミドで染色し、紫外線を照
射し、アガロースゲルからのトランスイルミネーター蛍
光をポラロイド６６７（商品名）白黒フィルムで撮影し
た。この電気泳動写真をマッキントッシュPerforma 522
0 （商品名）とエプソンGT-5000 スキャナ（商品名）で
３００ｄｐｉで取込み、画像を反転後、NIH Image 1.6
のゲル解析ソフトで処理した。各バンドの積分濃度を泳
動方向にプロットし、ベースラインを手で引いた後、各
ピークの面積を計算し、表計算によりＡ特有の上の方の
バンド（Ｈ）（サイズ３９８ｂｐ）とＪ特有の下の方の
バンド（Ｌ）（サイズ２２０ｂｐ）の強度比［I(H)/I
(L)]を縦軸にとり、ＡとＪの数の比率を横軸にとって検
量線を作成した。この検量線を図３に示す。

【００３７】図３に示すように、検量線はほぼ直線とな
った。従って、混合比率が未知の被検個体群も上記と同
様に処理し、図３に示す検量線を用いることにより、未
知の被検個体群中のＪとＡの混合比率を測定することが
できる。

【００３８】

【発明の効果】本発明によれば、一括した処理により、
核酸試料混合物中の核酸の種類の比率を測定することが
できる方法が初めて提供された。本発明の方法によれ
ば、各試料についてそれぞれ遺伝子検査を行う場合に比
べ、遥かに簡便かつ迅速に遺伝子検査を行うことができ
る。

【００３９】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：１４２配列の型：核酸配列 ATGGCAARCC TACGAAAAAC CCACCCACTY CTAAAAATTG CTAAYGATGC CCTAGTGGAT 60 CTACCAACCC CMTCCAAYAT TTCAGCATGA TGAAATTTTG GCTCTCTYCT AGGAYTATGY 120 CTHATYTCDC AAATCVTYAC AG 142

【００４０】配列番号：２配列の長さ：４２配列の型：核酸配列 ATGGCAARCC TACGAAAAAC CCACCCACTY CTAAAAATTG CT 42

【００４１】配列番号：３配列の長さ：２２配列の型：核酸配列 TACGAAAAAC CCACCCACTT CT 22

【００４２】配列番号：４配列の長さ：１３２配列の型：核酸配列 YCTMTACCTN CACATTGCCC GAGGACTTTA CTACGGYTMA TAYCTTTACA AAGARACATG 60 AAACATYGGA GTYGTAYTAT TYCTATTAGT AATAATAACW GCATTCGTRG GRTAYGTRCT 120 YCCATGAGGA CA 132

【００４３】配列番号：５配列の長さ：４２配列の型：核酸配列 AATAATAACW GCATTCGTRG GRTAYGTRCT YCCATGAGGA CA 42

【００４４】配列番号：６配列の長さ：３０配列の型：核酸配列 TCCTCATGGA AGTACATATC CTACGACTGC 30

【００４５】配列番号：７配列の長さ：配列の型：核酸配列 ATGGCAAACC TACGAAAAAC CCACCCACTT CTAAAAATTG CTAACGATGC CCTAGTGGAT 60 CTACCAACCC CATCCAACAT TTCAGCATGA TGAAATTTTG GCTCTCTCCT AGGACTATGC 120 CTTATTTCGC AAATCCTTAC AGGATTATTC CTAGCAATAC ACTACACATC AGACATTTCA 180 ACTGCCTTTT CCTCAGTAGC CCACATCTGC CGAGACGTTA ATTATGGATG ATTCATCCGA 240 AATTTACATG CAAACGGGGC CTCCTTCTTC TTTATCTGCC TCTACCTACA CATTGCCCGA 300 GGACTTTACT ACGGCTCATA CCTTTACAAA GAAACATGAA ACATCGGAGT CGTACTATTC 360 CTATTAGTAA TAATAACTGC ATTCGTAGGA TATGTACTCC CATGAGGACA 410

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法により増幅される、各種ウナギの
ミトコンドリアＤＮＡの増幅領域の塩基配列及び制限酵
素部位を示す図である。

【図２】図１の続きである。

【図３】本発明の実施例において作成された、日本産ウ
ナギとフランス産ウナギから成る個体群中の、日本産ウ
ナギとフランス産ウナギの比率を求めるための検量線を
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者川口竜二東京都八王子市小宮町51 株式会社エスアールエル八王子ラボラトリー内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸試料群中の各核酸の混合物を遺伝子
増幅法で増幅する工程と、増幅産物を制限酵素で消化す
る工程と、消化物を電気泳動にかける工程と、泳動バン
ドの濃さを測定する工程と、測定された各バンドの濃さ
に基づいて前記核酸試料群中の、核酸の種類の比率を測
定する工程とを含む、核酸試料群中の、核酸の種類の比
率の測定方法。
【請求項２】可視化された泳動バンドの濃さを測定す
る工程は、電気泳動ゲル上の核酸バンドの濃度を紫外線
吸収又は蛍光法による可視像を光学的手法で読み取り、
濃度値をコンピューターに取込み、データ処理すること
により行われる請求項１記載の方法。
【請求項３】前記核酸試料群中の核酸試料の数は２〜
６である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】前記核酸試料群中には、２種類の核酸が
含まれる請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項５】前記それぞれの核酸試料は、それぞれ生
物個体に由来し、生物個体群中の生物の種類の比率が測
定される請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項６】前記生物はウナギである請求項５記載の
方法。
【請求項７】前記遺伝子増幅法は、配列表の配列番号
１に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩
基配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列
（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該配列のうち１
０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加さ
れた塩基配列を有する核酸から成る第１の核酸プライマ
ーと、配列表の配列番号４に示される塩基配列若しくは
該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩
基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよ
い）又は該配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加された塩基配列を有する核酸から
成る第２の核酸プライマーを用いて行われる請求項６記
載の方法。
【請求項８】前記第１の核酸プライマーとして、配列
表の配列番号２に示される塩基配列若しくは該塩基配列
に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩基以上から
成る塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該
配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若
しくは付加された塩基配列を有する核酸から成るプライ
マーを用い、前記第２の核酸プライマーとして、配列表
の配列番号５に示される塩基配列若しくは該塩基配列に
相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩基以上から成
る塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該配
列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若し
くは付加された塩基配列を有する核酸から成るプライマ
ーを用いる請求項７記載の方法。
【請求項９】前記第１の核酸プライマーとして、配列
表の配列番号３に示される塩基配列（ただし、ＴはＵで
あってもよい）を有する核酸から成るプライマーを用
い、前記第２の核酸プライマーとして、配列表の配列番
号６に示される塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよ
い）を有する核酸から成るプライマーを用いる請求項８
記載の方法。
【請求項１０】前記制限酵素は、ＨｉｎｆＩ、Ｐｓｔ
Ｉ、ＭｂｏII及びＲｓａＩから成る群より選ばれる１又
は２以上の制限酵素である請求項７ないし９のいずれか
１項に記載の方法。
【請求項１１】前記制限酵素はＨｉｎｆＩである請求
項１０記載の方法。