JPH11230966A - 肺癌予後検査方法 - Google Patents

肺癌予後検査方法

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JPH11230966A JP3248998A JP3248998A JPH11230966A JP H11230966 A JPH11230966 A JP H11230966A JP 3248998 A JP3248998 A JP 3248998A JP 3248998 A JP3248998 A JP 3248998A JP H11230966 A JPH11230966 A JP H11230966A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 肺癌患者の予後を検査する方法及び検査試薬
の提供。 【解決手段】 固相化したMUC1ムチンと検体試料を反応
させた後、非反応物質を洗浄除去し、得られた反応物質
と標識した抗ヒトIgG 抗体とを反応させる。その後、結
合しない余分の標識抗ヒトIgG 抗体を洗浄除去し、結合
した標識抗ヒトIgG 抗体量を測定することにより検体試
料中の抗MUC1ムチン自己抗体量を定量して肺癌患者の予
後を検査する。患者の抗MUC1ムチン自己抗体量は正常者
と比較して有意に低下していた。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、血清等の検体試料
中の抗ムチンMUC1抗体を測定することにより肺癌患者の
予後を検査する方法及び検査試薬であって、医療の分野
で利用される。
【0002】
【従来の技術】ムチンは上皮細胞の産生する粘液の主成
分であり、セリン、スレオニンの含量が多く、O-グリコ
シド結合糖鎖、シアル酸、硫酸基に富むなどの生化学的
特徴を有している物質である。ムチンは最近、上皮由来
の腫瘍マーカーとして注目され、MUC1からMUC8まで知ら
れている。なかでもMUC1ムチンは膜貫通型糖蛋白として
存在し、腫瘍細胞とその微小循環を形成している宿主の
細胞との相互作用を規定する糖鎖表出分子である。乳癌
をはじめ大腸癌、膵臓癌などの各種の癌におけるムチン
分子の診断・治療への研究が報告されており、機能分子
としてその重要性が認識され始めている。
【0003】MUC1ムチンは種々の癌細胞に発現し、癌の
増殖、細胞接着さらに転移に関与することが知られてい
る。大腸癌においては、進行度とともにMUC1ムチンの発
現量が増加し、さらに原発巣より転移巣において発現量
が増加していることが報告されている。また、MUC1ムチ
ンの免疫原性の高いことも注目されており、潰瘍性大腸
炎患者の一部において抗MUC1抗体陽性者を検出したとの
報告(Hinode et al.,Immunol. Lett., 35, 163-168, 1
993)や乳癌あるいは卵巣癌患者の一部において、MUC1と
抗MUC1抗体の免疫複合体が検出されたと報告されている
(Gourevitch et al., Br.J.Cancer, 72, 934-938, 199
5)。しかし、ムチンと癌との関係は不明な点が多く、診
断への応用はいまだ確立されていない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ムチ
ンMUC1の血清中自己抗体を測定することにより、肺癌と
の関係を究明し、該抗体を肺癌予後検査に応用すること
にある。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、肺腺癌由
来の細胞株VMRC-LCRを免疫し、間質性肺炎患者の病体の
活動性を鋭敏に診断することができるモノクロナール抗
体、抗KL-6抗体を作製した(特公平7-31207)。さらに、
本抗体が認識する抗原KL-6が、IASLC 主催の肺細胞抗原
国際分類においてクラスター9であるMUC1に属するムチ
ンの一つであることを明らかにした(Stahl,R.A. et a
l., Int.J.Cancer, (Suppl.), 6-26, 1994) 。
【0006】本発明者らは、抗KL-6抗体と肺癌との関係
をさらに明らかにするために、抗KL-6抗体を用いるイム
ノアフィニティカラムを用いて抗原KL-6の精製を行っ
た。肺腺癌患者腹水を原料として、アフィニティクロマ
トグラフィ、次いでゲルろ過クロマトグラフィ操作によ
り抗原KL-6を精製し、その性状を解析したところ、ムチ
ンMUC1であることが確認された。そこで抗原KL-6を用い
てELIZA 法により、正常者および肺癌患者血清中に抗MU
C1抗体が存在するか否かを検査したところ、驚くべきこ
とに、肺癌患者および正常者の全例において抗MUC1抗体
が検出された。この事実は、抗MUC1自己抗体が存在する
ことを意味し、さらにその値は肺癌患者の方が低く、患
者の抗MUC1自己抗体価と生存期間との相関を見たとこ
ろ、有意な正の相関を有することを見出し本発明を完成
するに至った。
【0007】すなわち本発明は、 (a) 固相化したMUC1ムチンと検体試料を反応させた後、
非反応物質を洗浄除去する工程 (b) 上記工程で得られた反応物質と標識した抗ヒトIgG
抗体とを反応させた後、結合しない余分の標識抗ヒトIg
G 抗体を洗浄除去する工程 (c) 結合した標識抗ヒトIgG 抗体量を測定することによ
り検体試料中の抗MUC1ムチン自己抗体量を定量する工程 からなることを特徴とする肺癌患者の予後検査方法、及
びMUC1ムチンを含むことを特徴とする、上記検査に用い
られる検査試薬に関する。
【0008】MUC1ムチンとしては、好ましくは抗原KL-6
が挙げられ、これ以後の記載は抗原KL-6を代表例として
記載する。なお、KL-6の名称は、抗原名を意味し、それ
に対する抗体は抗KL-6抗体と記載する。
【0009】
【発明の実施の形態】本発明は、抗原KL-6の自己抗体が
正常者及び肺癌患者の血清中に存在することを見出し、
この抗原KL-6がMUC1ムチンと同一物質であることを確認
したことに基づくものである。自己抗体の測定法は、抗
原KL-6を用いて、通常の免疫学的手法を用いればよく、
凝集法、ELIZA 法、サンドイッチ法などいずれの手法も
可能である。通常、第2反応物質として、標識抗ヒトIg
G 抗体を使用するが、標識物質としては、酵素、色素、
発光物質、蛍光色素、電気化学発光物質など常用されて
いるものを含め特に限定されない。
【0010】抗原KL-6は、本発明者らの開発した抗KL-6
抗体と反応する物質を、たとえば肺腺癌患者腹水を原料
として精製することができる(Hirasawa,Y.et al., Am.
J.Respir.Cell Mol.Biol., 17, 501-507, 1997)。な
お、MUC1ムチンはMCF7,ZR75-1など乳癌細胞株培養上清
あるいはその他の癌細胞株培養上清を原料として常法に
より精製することができる。抗KL-6抗体は、特公平7-31
2207に記載されているごとく、肺腺癌由来の細胞株VMRC
-LCRを抗原としてマウスに免疫し、常法のモノクロナー
ル抗体の作製法に準じて作製することができる(Koehle
r G. Milstein C.,Eur.J.Immunol., , 511-519, 197
6)。
【0011】本発明の検査試薬の具体的態様は、ELIZA
法を1例として示せば次のようになる。抗原KL-6が固相
化されたものを必須の構成成分とし、自己抗体検出用試
薬として標識抗ヒトIgG 抗体を含有するものである。ま
た検査実施のための適当な抗原希釈液、反応希釈液、基
質溶解液、反応停止液などがセット中に添付されること
は自由であり、これらは本発明を限定するものではな
い。抗原KL-6の固相化体は、マイクロタイターウエル、
粒子、磁気粒子、合成樹脂など通常使用されているもの
が用いられ特に限定されない。
【0012】本発明の検査方法は、まず固相化抗原KL-6
に検体血清を反応させたのち非反応物質を洗浄除去した
後、標識抗ヒトIgG 抗体を反応させ、その後結合しない
余分の標識抗ヒトIgG 抗体を洗浄除去する。次いで、結
合した標識抗ヒトIgG 抗体量を標識物質の特性に応じて
測定することにより、検体血清中の抗KL-6自己抗体量を
定量し、コントロール値、標準サンプル値などと比較し
て解析することにより肺癌患者の予後を検査する。
【0013】
【実施例】以下に記載する実施例をもって、本発明を具
体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるもので
はない。
【0014】実施例1 抗原KL-6の精製 本発明者らの開発した抗KL-6抗体のアフィニティカラム
を作製し、肺腺癌患者腹水を原料として抗原KL-6を精製
した。まず、CNBr-Sepharose4Bと抗KL-6抗体とを常法に
より結合させアフィニティカラム(size:10x60mm)を作成
した。0.1M Tris-HCl buffer(pH 8.0)にてよく緩衝化
後、腹水390ml を負荷した後、同bufferにて洗浄。3M M
gCl2含有同bufferにて溶出した。溶出液をSuperose 6
ゲル濾過カラム(size:15x320mm, 溶媒0.1M Tris-HCl bu
ffer, pH8.0)にかけ、高分子溶出画分を凍結乾燥し、精
製KL-6抗原を得た。
【0015】上記の方法により精製された抗原KL-6をSD
S-PAGEにて電気泳動後Western blotting法により解析し
た。SDS-PAGEは4%ポリアクリルアミドゲルを使用し、
サンプル量35μl(10μg/ml) を負荷し、70V 27mA(定電
圧) で2時間泳動した。ニトロセルロース膜にブロッテ
ィング(100V,27mA,1.5hr) 後、解析した結果、抗原KL-6
はPAS 染色および抗KL-6抗体での免疫染色で200kD より
高分子量の領域にdisperse patternを示すバンドが確認
された。また、MUC1ムチン抗原のコア蛋白の繰り返し領
域を認識するDF-3抗体(Abe,M.et al., Cancer Res., 4
9, 2834-2839,1989, Tray-Fuji Bionics Inco., Tokyo,
Japan より供与されたもの) で免疫染色した場合も、
抗KL-6抗体の場合と同様な染色パターンを確認した。こ
のことから抗原KL-6はMUC1ムチンに属することが判明し
た。
【0016】実施例2 抗KL-6自己抗体の検出 ELIZA 法にて測定した。実施例1の方法により精製した
抗原KL-6を固相化したプレートに、対象患者血清 (20倍
および 100倍希釈したもの) またはコントロール血清
(288U/ml のものを 320倍および1280倍希釈したものを
使用) を添加し反応させた。洗浄後、ワサビペルオキシ
ダーゼを標識した抗ヒトIgG 抗体を添加反応させたのち
洗浄した。次いで酵素基質(o-フェニレンジアミン)と
反応させ、発色度を測定し、肺腺癌患者腹水の抗KL-6自
己抗体価を70U/mlとして、40倍希釈から 320倍希釈まで
の倍数希釈サンプルのODを基に作成した検量線を基準と
して、検体のOD値から抗体価をユニットとして表わし
た。結果を図1に示す。図1の結果から明らかなよう
に、肺癌患者、コントロールの全例において、抗KL-6自
己抗体を検出し、コントロール値は 108±26.2 U/ml 、
肺癌患者は32±13U/ml で、患者の抗KL-6自己抗体価は
有意に低下していた。
【0017】実施例3 抗KL-6自己抗体の確認 実施例2に記載のELIZA 法により検出された抗KL-6自己
抗体が、真に抗MUC1抗体であるかどうかを確認するため
に、ヒト血清を原料として抗KL-6自己抗体を精製した。
まず正常者のプール血清を、硫酸アンモニウムによって
塩析し、60%飽和硫安分画を分取した。次いで、マウス
抗KL-6抗体を結合させたイムノアフィニティカラム (si
ze:10x60mm、樹脂名:CNBr-Sepharose)に、実施例1に
より精製した抗原KL-6 (1mg,使用溶媒:0.1M Tris-HCl
buffer, pH 8.0)を負荷し、抗KL-6抗体と抗原KL-6の結
合した免疫複合体カラムを作製した。このカラムに60%
飽和硫安沈殿分画(500mg, 溶媒0.15M NaCl含有0.02M Tr
is-HCl buffer, pH8.0に溶解) を負荷し同溶媒で洗浄し
た後、50mlの2M MgCl2含有0.1M Tris-HCl buffer, pH8.
0 で溶出し、セントリコンプラス(限外濾過) にて2ml
に濃縮した。これを精製抗KL-6抗体とし、その蛋白濃度
は5μg/mlであった。
【0018】得られた溶出液を、12%ポリアクリルアミ
ドゲルを用いるSDS-PAGEにて分析した結果、2−メルカ
プトエタノール共存下、非共存下において、IgG の泳動
パターンと一致する領域、すなわちH鎖50kD、L鎖25kD
の位置にバンドを認めた。さらに、精製抗原KL-6をSDS-
PAGEで泳動した後、抗KL-6抗体、抗MUC1抗体Ma695(MUC1
のCarbohydrate epitopeを認識する抗体、Van Daken A.
et al., Anticancer Res., 16, 2339-1343, 1996, YLEM
社、Roma, Italy)およびHMFG2抗体(MUC1を認識する抗
体、Fisken J.et al., Br.J.Cancer, 67, 1065-1070, 1
993, YLEM 社、Roma, Italy)で免疫染色した結果、これ
ら3抗体により、同様の高分子量の領域にバンドを認め
た。この際、精製ヒトIgG による免疫染色ではなんのバ
ンドも認められなかった。これらのことからヒト血清中
には抗MUC1抗体が存在することが確認された。
【0019】実施例4 抗MUC1抗体価と生存期間との相
関 PS 0, 1, 2のStage III, IV 期の進行非小細胞肺癌患者
30例を対象として、血清中の抗MUC1抗体価を分析し、生
命予後との関連を検討した。コントロールとして対象患
者と年齢分布を合わせた非坦癌者60例を用いた。その結
果、図2に示すごとく、50%生存率は約12ヶ月、3年生
存率は17%であった。コントロールの抗MUC1抗体価の平
均値マイナス3SD値を計算し、32 U/mlをcut off 値と
して2つのグループに分けて解析した結果、図3に示す
ごとく、平均生存期間において32 U/ml 以上の群は26ヶ
月、32 U/ml 未満の群は7.7 ヶ月と32 U/ml 以上の群に
おいて有意な生存率の向上が認められた。その相関は図
4に示すようにきれいな相関が見られた。また、治療成
績と抗MUC1抗体価の間にも有意な相関を認めた。この事
より、患者血清中の抗MUC1抗体価を測定することは、予
後の検査法として有用な方法である。
【図面の簡単な説明】
【図1】 正常者及び肺癌患者血清中の抗MUC1抗体価を
示す図である。
【図2】 肺癌患者の生存率曲線である。
【図3】 抗MUC1抗体価32U/mlを境とした肺癌患者の生
存率曲線である。
【図4】 抗MUC1抗体価と肺癌患者の生存期間との相関
を示す図である。

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】(a) 固相化したMUC1ムチンと検体試料を反
    応させた後、非反応物質を洗浄除去する工程 (b) 上記工程で得られた反応物質と標識した抗ヒトIgG
    抗体とを反応させた後、結合しない余分の標識抗ヒトIg
    G 抗体を洗浄除去する工程 (c) 結合した標識抗ヒトIgG 抗体量を測定することによ
    り検体試料中の抗MUC1ムチン自己抗体量を定量する工程 からなることを特徴とする肺癌患者の予後検査方法。
  2. 【請求項2】 標識物質が、酵素または電気化学発光物
    質である請求項1記載の方法。
  3. 【請求項3】 検体試料が、血清である請求項1記載の
    方法。
  4. 【請求項4】 MUC1ムチンが、抗原KL-6である請求項1
    記載の方法。
  5. 【請求項5】 肺癌患者が、進行性非小細胞肺癌患者で
    ある請求項1記載の方法。
  6. 【請求項6】 MUC1ムチンを含むことを特徴とする、抗
    MUC1ムチン自己抗体量を測定することによる肺癌患者の
    予後を検査する検査試薬。
  7. 【請求項7】 肺癌患者が、進行性非小細胞肺癌患者で
    ある請求項6記載の検査試薬。
  8. 【請求項8】 MUC1ムチンが、抗原KL-6である請求項6
    記載の検査試薬。
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