JPH11209389A - オリゴ糖の単離精製方法 - Google Patents
オリゴ糖の単離精製方法Info
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- JPH11209389A JPH11209389A JP2516798A JP2516798A JPH11209389A JP H11209389 A JPH11209389 A JP H11209389A JP 2516798 A JP2516798 A JP 2516798A JP 2516798 A JP2516798 A JP 2516798A JP H11209389 A JPH11209389 A JP H11209389A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 効率よく容易にかつ短時間で、他の不純物、
特にセルロース由来の不純物を混入させることなく、目
的のオリゴ糖のみを単離精製する方法を提供する。 【解決手段】 オリゴ糖試料からオリゴ糖を単離精製す
る方法において、アルコールと水の混合液を溶離液とし
て、セルロースカラムクロマトグラフィーを行い、目的
のオリゴ糖のみを単離精製するオリゴ糖の単離精製方
法。アルコールと水の混合液のアルコール濃度が１０〜
９０％、そしてアルコールが、メタノール又はエタノー
ルであることが好ましい。
特にセルロース由来の不純物を混入させることなく、目
的のオリゴ糖のみを単離精製する方法を提供する。 【解決手段】 オリゴ糖試料からオリゴ糖を単離精製す
る方法において、アルコールと水の混合液を溶離液とし
て、セルロースカラムクロマトグラフィーを行い、目的
のオリゴ糖のみを単離精製するオリゴ糖の単離精製方
法。アルコールと水の混合液のアルコール濃度が１０〜
９０％、そしてアルコールが、メタノール又はエタノー
ルであることが好ましい。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、セルロースカラム
クロマトグラフィーを用いたオリゴ糖の単離精製方法に
関する。
クロマトグラフィーを用いたオリゴ糖の単離精製方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】オリゴ糖や多糖といった糖質の分離精製
には、従来、ゲルろ過法や、逆相系、順相系の高速液体
クロマトグラフィー（HPLC）等の各種クロマトグラフィ
ー技術が用いられてきている。しかしながら、これらの
方法は、いずれも分離に長時間を要したり、あるいは分
離能が良すぎるために試料のオリゴ糖や多糖の分子サイ
ズや時には構造の違いによって分離してしまうことがあ
り、糖質画分の精製という目的には不十分であった。従
来、糖質画分の単離という目的には、ろ紙クロマトグラ
フィーが広く用いられてきているが、操作に長時間を要
することや大量調製には不向きであるなどの理由からこ
れに代わる方法の確立が望まれていた。特公平 5-79079
号公報には、ヒドラジン分解によって糖タンパク質より
得られたＮ−結合型非還元オリゴ糖から、セルロースカ
ラムクロマトグラフィーにおいて、ブタノール：エタノ
ール：水系の溶媒を用い、洗浄を行い、汚染物を除去
し、蒸留水で目的とするオリゴ糖画分を回収する非還元
オリゴサッカライドの単離方法を開示している。しかし
ながら、本発明者らが、上記特公平 5-79079号公報に開
示されている方法で行ったところ、セルロースカラムク
ロマトグラフィー後のオリゴ糖画分に、他の不純物、特
にカラムに用いたセルロース由来の不純物が混入してい
ることがわかり、オリゴ糖を単離精製するにはかなり不
十分なものであることがわかった。
には、従来、ゲルろ過法や、逆相系、順相系の高速液体
クロマトグラフィー（HPLC）等の各種クロマトグラフィ
ー技術が用いられてきている。しかしながら、これらの
方法は、いずれも分離に長時間を要したり、あるいは分
離能が良すぎるために試料のオリゴ糖や多糖の分子サイ
ズや時には構造の違いによって分離してしまうことがあ
り、糖質画分の精製という目的には不十分であった。従
来、糖質画分の単離という目的には、ろ紙クロマトグラ
フィーが広く用いられてきているが、操作に長時間を要
することや大量調製には不向きであるなどの理由からこ
れに代わる方法の確立が望まれていた。特公平 5-79079
号公報には、ヒドラジン分解によって糖タンパク質より
得られたＮ−結合型非還元オリゴ糖から、セルロースカ
ラムクロマトグラフィーにおいて、ブタノール：エタノ
ール：水系の溶媒を用い、洗浄を行い、汚染物を除去
し、蒸留水で目的とするオリゴ糖画分を回収する非還元
オリゴサッカライドの単離方法を開示している。しかし
ながら、本発明者らが、上記特公平 5-79079号公報に開
示されている方法で行ったところ、セルロースカラムク
ロマトグラフィー後のオリゴ糖画分に、他の不純物、特
にカラムに用いたセルロース由来の不純物が混入してい
ることがわかり、オリゴ糖を単離精製するにはかなり不
十分なものであることがわかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上述したように、オリ
ゴ糖や多糖といった糖質を短時間で、大量に単離・精製
することが可能な方法、更に不純物が混入しない方法は
なく、そのような方法が得られれば、糖質工学にとっ
て、工業的にも非常に有用である。したがって、本発明
の目的は、効率よく容易にかつ短時間で、他の不純物、
特にセルロース由来の不純物を混入させることなく、目
的のオリゴ糖のみを単離精製する方法を提供することに
ある。
ゴ糖や多糖といった糖質を短時間で、大量に単離・精製
することが可能な方法、更に不純物が混入しない方法は
なく、そのような方法が得られれば、糖質工学にとっ
て、工業的にも非常に有用である。したがって、本発明
の目的は、効率よく容易にかつ短時間で、他の不純物、
特にセルロース由来の不純物を混入させることなく、目
的のオリゴ糖のみを単離精製する方法を提供することに
ある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明はオリゴ糖の単離精製方法に関する発明であって、
オリゴ糖試料からオリゴ糖を単離精製する方法におい
て、アルコールと水の混合液を溶離液として、セルロー
スカラムクロマトグラフィーを行い、目的のオリゴ糖の
みを単離精製することを特徴とする。
発明はオリゴ糖の単離精製方法に関する発明であって、
オリゴ糖試料からオリゴ糖を単離精製する方法におい
て、アルコールと水の混合液を溶離液として、セルロー
スカラムクロマトグラフィーを行い、目的のオリゴ糖の
みを単離精製することを特徴とする。
【０００５】本発明者は、セルロースカラムクロマトグ
ラフィーを用いて、目的とするオリゴ糖以外の不純物、
特にセルロース由来の不純物を混入させることなく、オ
リゴ糖を単離することができないかと、種々の条件につ
いて検討を行った結果、特定の組成の溶出液（溶離液）
を用いて、オリゴ糖試料を溶出することにより、目的と
するオリゴ糖以外の不純物を混入させることなく、目的
とするオリゴ糖のみを単離することができることを見出
し、本発明を完成するに至った。
ラフィーを用いて、目的とするオリゴ糖以外の不純物、
特にセルロース由来の不純物を混入させることなく、オ
リゴ糖を単離することができないかと、種々の条件につ
いて検討を行った結果、特定の組成の溶出液（溶離液）
を用いて、オリゴ糖試料を溶出することにより、目的と
するオリゴ糖以外の不純物を混入させることなく、目的
とするオリゴ糖のみを単離することができることを見出
し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下、本発明について具体的に説
明する。本発明に使用されるセルロースカラムに用いる
セルロースとしては、例えば微結晶質セルロース、又は
微粒子状セルロース、微粉状セルロース、繊維状セルロ
ース等が挙げられる。微結晶質セルロースは、例えば、
市販されているアビセルを用いることができる。微粉状
セルロース、繊維状セルロースとしては、例えば、セル
ロースパウダー ＣＦ−１１〔ワットマン（Whatman ）
社製〕を用いることができる。これらセルロースの好ま
しい粒径は、約１〜１００ミクロン以下である。
明する。本発明に使用されるセルロースカラムに用いる
セルロースとしては、例えば微結晶質セルロース、又は
微粒子状セルロース、微粉状セルロース、繊維状セルロ
ース等が挙げられる。微結晶質セルロースは、例えば、
市販されているアビセルを用いることができる。微粉状
セルロース、繊維状セルロースとしては、例えば、セル
ロースパウダー ＣＦ−１１〔ワットマン（Whatman ）
社製〕を用いることができる。これらセルロースの好ま
しい粒径は、約１〜１００ミクロン以下である。
【０００７】セルロースカラムのカラムハウスとしては
市販のガラス製カラム、ポリプロピレン製カラム、ある
いは同じくポリプロピレン製のシリンジ等を用いること
ができるが、これらに限定されるものではなく、セルロ
ースカラムのカラムハウスとして使用できれば、特に限
定されるものではない。
市販のガラス製カラム、ポリプロピレン製カラム、ある
いは同じくポリプロピレン製のシリンジ等を用いること
ができるが、これらに限定されるものではなく、セルロ
ースカラムのカラムハウスとして使用できれば、特に限
定されるものではない。
【０００８】本発明で言う「オリゴ糖試料」とは、２糖
以上のオリゴ糖を含むものであれば良く、例えば、糖タ
ンパク質からヒドラジン分解、Ｎ−アセチル化によって
得られたＮ−グリカン、あるいは同じくヒドラジン分
解、Ｎ−アセチル化やアルカリ分解によって得られたＯ
−グリカン、あるいはグリコサミノグリカン、デキスト
ラン、フコイダン、デンプン等のような多糖及び該多糖
の部分分解物などを含むものが挙げられるが、これらに
限定される物ではない。また更に、ピリジル−２−アミ
ノ化やパラアミノ安息香酸エチルエステル（以下、ＡＢ
ＥＥと略す）で標識されたオリゴ糖などのように、標識
オリゴ糖やオリゴ糖誘導体を含むものも、本発明で言
う、オリゴ糖試料に含まれる。
以上のオリゴ糖を含むものであれば良く、例えば、糖タ
ンパク質からヒドラジン分解、Ｎ−アセチル化によって
得られたＮ−グリカン、あるいは同じくヒドラジン分
解、Ｎ−アセチル化やアルカリ分解によって得られたＯ
−グリカン、あるいはグリコサミノグリカン、デキスト
ラン、フコイダン、デンプン等のような多糖及び該多糖
の部分分解物などを含むものが挙げられるが、これらに
限定される物ではない。また更に、ピリジル−２−アミ
ノ化やパラアミノ安息香酸エチルエステル（以下、ＡＢ
ＥＥと略す）で標識されたオリゴ糖などのように、標識
オリゴ糖やオリゴ糖誘導体を含むものも、本発明で言
う、オリゴ糖試料に含まれる。
【０００９】本発明で言う「アルコール」とは、オリゴ
糖を溶出することが可能なアルコールであればよく、例
えば、メタノールやエタノールが挙げられるが、これら
に限定されるものではない。また、本発明の溶離液とし
て使用する際には、１種類のアルコールと水の混合液と
して使用し、該混合液中のアルコール濃度は、１０〜９
０％の範囲で使用することが好ましい。例えば５０％の
アルコール溶液を用いることができる。
糖を溶出することが可能なアルコールであればよく、例
えば、メタノールやエタノールが挙げられるが、これら
に限定されるものではない。また、本発明の溶離液とし
て使用する際には、１種類のアルコールと水の混合液と
して使用し、該混合液中のアルコール濃度は、１０〜９
０％の範囲で使用することが好ましい。例えば５０％の
アルコール溶液を用いることができる。
【００１０】本発明のセルロースカラムクロマトグラフ
ィーは、例えば、次のように行うことができる。まず、
セルロースを蒸留水に懸濁し、デカンテーションを繰り
返して良く洗浄する。洗浄したセルロースを適量、例え
ば１ｍｌをカラムハウスにつめ、カラム容量の１０倍量
の蒸留水を流す。次に、溶離液であるアルコールと水の
混合液（以下、Ａ／Ｗと略す）を同じくカラム容量の１
０倍量流す。このＡ／Ｗ中のアルコールの濃度は１０〜
９０％の範囲の中から適当に選べばよいが、例えば、５
０％のエタノール溶液を用いることができる。更に、１
−ブタノール／エタノール／水の混合液（以下、Ｂ／Ｅ
／Ｗと略す）をカラム容量の１０倍量流してカラムを平
衡化する。Ｂ／Ｅ／Ｗ比は、例えば、４：１：１（ｖ／
ｖ／ｖ）を用いることができる。平衡化が終了したカラ
ムにオリゴ糖試料を添加する。このオリゴ糖試料はカラ
ムの平衡化に用いた溶液、例えば、Ｂ／Ｅ／Ｗ＝４：
１：１（ｖ／ｖ／ｖ）混合液に溶解されていることが望
ましい。オリゴ糖試料添加後、カラム容量の１０〜３０
倍のＢ／Ｅ／Ｗでカラムを洗浄する。このとき用いるＢ
／Ｅ／Ｗは、カラムの平衡化に用いたものと同じ組成の
溶液を用いるのが好ましい。洗浄後、上記記載の溶離液
Ａ／Ｗをカラム容量の１０倍量流し、オリゴ糖を溶出す
る。Ａ／Ｗで溶出されないようなオリゴ糖が、もしカラ
ム内に残っている場合は、従来の通り、蒸留水を用いて
カラムを洗浄すればそのようなオリゴ糖は回収すること
ができるが、その際の蒸留水を用いて回収した画分には
セルロース由来の不純物が含まれている。Ａ／Ｗで溶出
された画分から、通常のエバポレーターや凍結乾燥機に
よって溶媒を除去することによって、目的とする精製オ
リゴ糖のみを得ることができる。
ィーは、例えば、次のように行うことができる。まず、
セルロースを蒸留水に懸濁し、デカンテーションを繰り
返して良く洗浄する。洗浄したセルロースを適量、例え
ば１ｍｌをカラムハウスにつめ、カラム容量の１０倍量
の蒸留水を流す。次に、溶離液であるアルコールと水の
混合液（以下、Ａ／Ｗと略す）を同じくカラム容量の１
０倍量流す。このＡ／Ｗ中のアルコールの濃度は１０〜
９０％の範囲の中から適当に選べばよいが、例えば、５
０％のエタノール溶液を用いることができる。更に、１
−ブタノール／エタノール／水の混合液（以下、Ｂ／Ｅ
／Ｗと略す）をカラム容量の１０倍量流してカラムを平
衡化する。Ｂ／Ｅ／Ｗ比は、例えば、４：１：１（ｖ／
ｖ／ｖ）を用いることができる。平衡化が終了したカラ
ムにオリゴ糖試料を添加する。このオリゴ糖試料はカラ
ムの平衡化に用いた溶液、例えば、Ｂ／Ｅ／Ｗ＝４：
１：１（ｖ／ｖ／ｖ）混合液に溶解されていることが望
ましい。オリゴ糖試料添加後、カラム容量の１０〜３０
倍のＢ／Ｅ／Ｗでカラムを洗浄する。このとき用いるＢ
／Ｅ／Ｗは、カラムの平衡化に用いたものと同じ組成の
溶液を用いるのが好ましい。洗浄後、上記記載の溶離液
Ａ／Ｗをカラム容量の１０倍量流し、オリゴ糖を溶出す
る。Ａ／Ｗで溶出されないようなオリゴ糖が、もしカラ
ム内に残っている場合は、従来の通り、蒸留水を用いて
カラムを洗浄すればそのようなオリゴ糖は回収すること
ができるが、その際の蒸留水を用いて回収した画分には
セルロース由来の不純物が含まれている。Ａ／Ｗで溶出
された画分から、通常のエバポレーターや凍結乾燥機に
よって溶媒を除去することによって、目的とする精製オ
リゴ糖のみを得ることができる。
【００１１】このようにして得られたオリゴ糖は、例え
ば、ゲルろ過クロマトグラフィーで分析可能であり、ま
た、還元アミノ化反応によって、２−アミノピリジン、
２−アミノベンゼン、ＡＢＥＥ等で標識した後、ＨＰＬ
Ｃ等を用いて、構造分析することも可能である。
ば、ゲルろ過クロマトグラフィーで分析可能であり、ま
た、還元アミノ化反応によって、２−アミノピリジン、
２−アミノベンゼン、ＡＢＥＥ等で標識した後、ＨＰＬ
Ｃ等を用いて、構造分析することも可能である。
【００１２】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではな
い。
示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではな
い。
【００１３】実施例１ アビセル〔メルク（Merck ）社製〕を蒸留水で膨潤洗浄
後、０．７×２．６ｃｍ、容量１ｍｌのカラムを作製し
た。このセルロースカラムを、１０ｍｌの蒸留水で洗浄
した後、Ｂ／Ｅ／Ｗ＝４：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）混合液
でカラムを平衡化した。オリゴ糖試料として、５０μｇ
のマルトペンタオースをセルロースカラムに添加した。
また、対照実験として、何もカラムに添加せずに同様の
操作を行った。３０ｍｌのＢ／Ｅ／Ｗ＝４：１：１（ｖ
／ｖ／ｖ）で洗浄した後、２０ｍｌの蒸留水を溶離液と
して、オリゴ糖を溶出させた。溶出液は１ｍｌずつ、Ｂ
／Ｅ／Ｗの洗浄時から分画し、各フラクションに含まれ
るオリゴ糖をフェノール硫酸法によって検出した。その
結果を図１示す。すなわち図１は、セルロースカラムに
マルトペンタオースを添加し、蒸留水で溶出したときの
オリゴ糖の溶出パターンを示す図（上段）と、何も添加
せずに蒸留水で溶出したときのオリゴ糖の溶出パターン
を示す図（下段）である。図中、横軸は溶出容量（ｍ
ｌ）を、縦軸は４９０ｎｍにおける吸光度（Ａ490 ）を
示す。図１から明らかなように、マルトペンタオースは
カラムに吸着し、蒸留水で溶出されてきたが、対照とし
てカラムに何も添加せずに同様の操作を行った場合で
も、フェノール硫酸法で呈色する物質が溶出されてくる
ことが判明した。
後、０．７×２．６ｃｍ、容量１ｍｌのカラムを作製し
た。このセルロースカラムを、１０ｍｌの蒸留水で洗浄
した後、Ｂ／Ｅ／Ｗ＝４：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）混合液
でカラムを平衡化した。オリゴ糖試料として、５０μｇ
のマルトペンタオースをセルロースカラムに添加した。
また、対照実験として、何もカラムに添加せずに同様の
操作を行った。３０ｍｌのＢ／Ｅ／Ｗ＝４：１：１（ｖ
／ｖ／ｖ）で洗浄した後、２０ｍｌの蒸留水を溶離液と
して、オリゴ糖を溶出させた。溶出液は１ｍｌずつ、Ｂ
／Ｅ／Ｗの洗浄時から分画し、各フラクションに含まれ
るオリゴ糖をフェノール硫酸法によって検出した。その
結果を図１示す。すなわち図１は、セルロースカラムに
マルトペンタオースを添加し、蒸留水で溶出したときの
オリゴ糖の溶出パターンを示す図（上段）と、何も添加
せずに蒸留水で溶出したときのオリゴ糖の溶出パターン
を示す図（下段）である。図中、横軸は溶出容量（ｍ
ｌ）を、縦軸は４９０ｎｍにおける吸光度（Ａ490 ）を
示す。図１から明らかなように、マルトペンタオースは
カラムに吸着し、蒸留水で溶出されてきたが、対照とし
てカラムに何も添加せずに同様の操作を行った場合で
も、フェノール硫酸法で呈色する物質が溶出されてくる
ことが判明した。
【００１４】次に、この何も添加していないセルロース
カラムから溶離液として蒸留水を用いた場合に溶出され
てきた画分を集めて濃縮乾固したものを、グライココン
ジュゲート ジャーナル（Glycoconjugate Journal）、
第８巻、第４００〜４１３頁（１９９１）に記載の方法
に従い還元アミノ化反応によってＡＢＥＥで標識した。
その後、BIO-GEL （登録商標）P-4 〔バイオラッド（BI
ORAD）社製〕カラムを用いて、ＡＢＥＥ化オリゴ糖を精
製した。このＡＢＥＥ化オリゴ糖を、ワコーパック（登
録商標）ワコーシルWS 5C18-200 〔Wakopak （登録商
標） Wakosil WS5C18-200（４．６×２５０ｍｍ）、和
光純薬社製〕を用いた逆相ＨＰＬＣで分析した。溶出
は、Ａ液及びＢ液を用いたグラジエントにより行った。
Ａ液は５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ酢酸溶液、Ｂ
液は１５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ酢酸溶液を用
いた。まず、カラムを４０％Ｂ液で平衡化した後、上記
調製したＡＢＥＥ化オリゴ糖試料を添加し、その後６０
分間で、Ｂ液の割合を４０％から７０％まで上昇させて
溶出させた。その結果を図２に示す。すなわち図２は、
セルロースカラムに何も添加せずに蒸留水で溶出した画
分を集めてＡＢＥＥ化したものを、逆相ＨＰＬＣで分析
した時の溶出パターンを示す図である。図中、横軸は相
対保持時間（分）を、縦軸は３０４ｎｍにおける吸光度
を示し、矢印は、一連の二本鎖複合型糖鎖、高マンノー
ス型糖鎖、三本鎖／四本鎖複合型糖鎖の溶出位置をそれ
ぞれ示している。図２から、何も添加していないセルロ
ースカラムから蒸留水で溶出される物質のＡＢＥＥ化物
は、大きな複数のピークとして溶出され、しかもその溶
出位置は二本鎖複合型糖鎖の一部や高マンノース型糖
鎖、三本鎖、四本鎖複合型糖鎖の溶出位置と重なること
が明らかとなった。すなわち、従来、溶離液として用い
られている蒸留水を用いるセルロースカラムクロマトグ
ラフィーでは、オリゴ糖画分に目的以外の不純物、特に
セルロースカラム由来の不純物が混入してしまうことが
明らかとなり、このため、蒸留水により得られたオリゴ
糖は、正確な糖鎖の構造解析を行う過程で使用するに
は、極めて不十分であることが明らかとなった。また、
上記のセルロースカラムのセルロースを、セルロースパ
ウダー ＣＦ−１１（ワットマン社製）に置き換えて、
実験を行ったところ、上記と同様の結果が得られた。
カラムから溶離液として蒸留水を用いた場合に溶出され
てきた画分を集めて濃縮乾固したものを、グライココン
ジュゲート ジャーナル（Glycoconjugate Journal）、
第８巻、第４００〜４１３頁（１９９１）に記載の方法
に従い還元アミノ化反応によってＡＢＥＥで標識した。
その後、BIO-GEL （登録商標）P-4 〔バイオラッド（BI
ORAD）社製〕カラムを用いて、ＡＢＥＥ化オリゴ糖を精
製した。このＡＢＥＥ化オリゴ糖を、ワコーパック（登
録商標）ワコーシルWS 5C18-200 〔Wakopak （登録商
標） Wakosil WS5C18-200（４．６×２５０ｍｍ）、和
光純薬社製〕を用いた逆相ＨＰＬＣで分析した。溶出
は、Ａ液及びＢ液を用いたグラジエントにより行った。
Ａ液は５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ酢酸溶液、Ｂ
液は１５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ酢酸溶液を用
いた。まず、カラムを４０％Ｂ液で平衡化した後、上記
調製したＡＢＥＥ化オリゴ糖試料を添加し、その後６０
分間で、Ｂ液の割合を４０％から７０％まで上昇させて
溶出させた。その結果を図２に示す。すなわち図２は、
セルロースカラムに何も添加せずに蒸留水で溶出した画
分を集めてＡＢＥＥ化したものを、逆相ＨＰＬＣで分析
した時の溶出パターンを示す図である。図中、横軸は相
対保持時間（分）を、縦軸は３０４ｎｍにおける吸光度
を示し、矢印は、一連の二本鎖複合型糖鎖、高マンノー
ス型糖鎖、三本鎖／四本鎖複合型糖鎖の溶出位置をそれ
ぞれ示している。図２から、何も添加していないセルロ
ースカラムから蒸留水で溶出される物質のＡＢＥＥ化物
は、大きな複数のピークとして溶出され、しかもその溶
出位置は二本鎖複合型糖鎖の一部や高マンノース型糖
鎖、三本鎖、四本鎖複合型糖鎖の溶出位置と重なること
が明らかとなった。すなわち、従来、溶離液として用い
られている蒸留水を用いるセルロースカラムクロマトグ
ラフィーでは、オリゴ糖画分に目的以外の不純物、特に
セルロースカラム由来の不純物が混入してしまうことが
明らかとなり、このため、蒸留水により得られたオリゴ
糖は、正確な糖鎖の構造解析を行う過程で使用するに
は、極めて不十分であることが明らかとなった。また、
上記のセルロースカラムのセルロースを、セルロースパ
ウダー ＣＦ−１１（ワットマン社製）に置き換えて、
実験を行ったところ、上記と同様の結果が得られた。
【００１５】実施例２ 実施例１と同様にして、アビセル（メルク社製）を用い
て、セルロースカラムを作成し、１０ｍｌの蒸留水で洗
浄した後、Ｂ／Ｅ／Ｗ＝４：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）でカ
ラムを平衡化した。次に、カラムにオリゴ糖試料を添加
せずに、１０ｍｌずつのＢ／Ｅ／Ｗ＝４：１：１、３：
１：１、２：１：１、１：１：１、０：１：１、及び蒸
留水を順次カラムに流し、それぞれの画分を濃縮後、得
られた濃縮画分中のオリゴ糖量をフェノール硫酸法によ
って検出した。その結果を図３に示す。すなわち図３
は、各溶出画分に含まれるオリゴ糖量をフェノール硫酸
法によって定量した結果を示す図であり、横軸にＢ／Ｅ
／Ｗの組成を、縦軸に４９０ｎｍにおける吸光度を示
す。その結果、フェノール硫酸法で呈色する物質は、種
々の混合比のＢ／Ｅ／Ｗでは溶出されず、蒸留水の画分
に溶出された。また、上記のセルロースカラムのセルロ
ースを、セルロースパウダー ＣＦ−１１（ワットマン
社製）に置き換えて、実験を行ったところ、上記と同様
の結果が得られた。
て、セルロースカラムを作成し、１０ｍｌの蒸留水で洗
浄した後、Ｂ／Ｅ／Ｗ＝４：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）でカ
ラムを平衡化した。次に、カラムにオリゴ糖試料を添加
せずに、１０ｍｌずつのＢ／Ｅ／Ｗ＝４：１：１、３：
１：１、２：１：１、１：１：１、０：１：１、及び蒸
留水を順次カラムに流し、それぞれの画分を濃縮後、得
られた濃縮画分中のオリゴ糖量をフェノール硫酸法によ
って検出した。その結果を図３に示す。すなわち図３
は、各溶出画分に含まれるオリゴ糖量をフェノール硫酸
法によって定量した結果を示す図であり、横軸にＢ／Ｅ
／Ｗの組成を、縦軸に４９０ｎｍにおける吸光度を示
す。その結果、フェノール硫酸法で呈色する物質は、種
々の混合比のＢ／Ｅ／Ｗでは溶出されず、蒸留水の画分
に溶出された。また、上記のセルロースカラムのセルロ
ースを、セルロースパウダー ＣＦ−１１（ワットマン
社製）に置き換えて、実験を行ったところ、上記と同様
の結果が得られた。
【００１６】実施例３ 実施例１と同様にして、アビセル（メルク社製）を用い
て、セルロースカラムを作成し、１０ｍｌの蒸留水で洗
浄した後、Ｂ／Ｅ／Ｗ＝４：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）でカ
ラムを平衡化した。次に、オリゴ糖試料として５０μｇ
のマルトペンタオースをセルロースカラムに添加して、
Ｂ／Ｅ／Ｗ＝４：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）３０ｍｌで洗浄
後、溶離液として、エタノール／水の混合液（Ｅ／Ｗ）
＝１：１（ｖ／ｖ）２０ｍｌを用い、溶出を行った。そ
の結果を図４に示す。すなわち図４は、各フラクション
中の中性糖含量をフェノール硫酸法によって定量した、
マルトペンタオースの溶出パターンを示す図であり、横
軸に溶出容量（ｍｌ）、縦軸に４９０ｎｍにおける吸光
度を示す。カラムに吸着した糖鎖は、Ｅ／Ｗ＝１：１
（ｖ／ｖ）で速やかに溶出され、フェノール硫酸法によ
る測定の結果、その回収率は１００％であった。更に、
２５ｍｇのマルトペンタオースを同じカラムに添加した
場合も、同様の結果が得られた。また、上記のセルロー
スカラムのセルロースを、セルロースパウダー ＣＦ−
１１（ワットマン社製）に置き換えて、実験を行ったと
ころ、上記と同様の結果が得られた。
て、セルロースカラムを作成し、１０ｍｌの蒸留水で洗
浄した後、Ｂ／Ｅ／Ｗ＝４：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）でカ
ラムを平衡化した。次に、オリゴ糖試料として５０μｇ
のマルトペンタオースをセルロースカラムに添加して、
Ｂ／Ｅ／Ｗ＝４：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）３０ｍｌで洗浄
後、溶離液として、エタノール／水の混合液（Ｅ／Ｗ）
＝１：１（ｖ／ｖ）２０ｍｌを用い、溶出を行った。そ
の結果を図４に示す。すなわち図４は、各フラクション
中の中性糖含量をフェノール硫酸法によって定量した、
マルトペンタオースの溶出パターンを示す図であり、横
軸に溶出容量（ｍｌ）、縦軸に４９０ｎｍにおける吸光
度を示す。カラムに吸着した糖鎖は、Ｅ／Ｗ＝１：１
（ｖ／ｖ）で速やかに溶出され、フェノール硫酸法によ
る測定の結果、その回収率は１００％であった。更に、
２５ｍｇのマルトペンタオースを同じカラムに添加した
場合も、同様の結果が得られた。また、上記のセルロー
スカラムのセルロースを、セルロースパウダー ＣＦ−
１１（ワットマン社製）に置き換えて、実験を行ったと
ころ、上記と同様の結果が得られた。
【００１７】実施例４ ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を、メソッズ イン
モレキュラー バイオロジー（Methods in Molecular B
iology）、第１４巻、第５５〜６８頁〔Ｅ．ハウンセル
（E. Hounsell ）ら編集、ヒューマナ プレス（Humana
Press）１９９３年発行〕記載の方法に従って、ヒドラ
ジン分解、Ｎ−アセチル化した物を、実施例１と同様に
して、アビセル（メルク社製）を用いて作成したセルロ
ースカラムに供して、一連の二本鎖複合型糖鎖を精製し
た。溶出は、実施例３に記載の方法と同様に行い、最後
に蒸留水１０ｍｌによる溶出も行った。その結果を図５
に示す。すなわち図５は、ＩｇＧのヒドラジン分解産物
をセルロースカラムクロマトグラフィーに供した際の溶
出パターンを示す図であり、ポリペプチド鎖由来のヒド
ラジン分解物の溶出位置を２１５ｎｍにおける吸光度で
測定（図中、黒三角印で示す）し、同時にＩｇＧ由来糖
鎖の溶出位置をフェノール硫酸法による呈色を４９０ｎ
ｍにおける吸光度で測定（図中、黒丸印で示す）した図
である。横軸に溶出容量（ｍｌ）、右縦軸に２１５ｎｍ
における吸光度、左縦軸に４９０ｎｍにおける吸光度を
示す。図中、矢印はＥ／Ｗ＝１：１（ｖ／ｖ）で溶出を
開始した箇所及び蒸留水で溶出を開始した箇所を示す。
図５から明らかなように、ポリペプチド鎖由来のヒドラ
ジン分解物はカラムに吸着せず、Ｂ／Ｅ／Ｗ＝４：１：
１（ｖ／ｖ／ｖ）で速やかに洗い流された。一方、Ｉｇ
Ｇ由来糖鎖は、Ｅ／Ｗ＝１：１（ｖ／ｖ）で溶出を行っ
た画分にピークが認められ、また最後に蒸留水を流した
画分にもピークが認められた。
モレキュラー バイオロジー（Methods in Molecular B
iology）、第１４巻、第５５〜６８頁〔Ｅ．ハウンセル
（E. Hounsell ）ら編集、ヒューマナ プレス（Humana
Press）１９９３年発行〕記載の方法に従って、ヒドラ
ジン分解、Ｎ−アセチル化した物を、実施例１と同様に
して、アビセル（メルク社製）を用いて作成したセルロ
ースカラムに供して、一連の二本鎖複合型糖鎖を精製し
た。溶出は、実施例３に記載の方法と同様に行い、最後
に蒸留水１０ｍｌによる溶出も行った。その結果を図５
に示す。すなわち図５は、ＩｇＧのヒドラジン分解産物
をセルロースカラムクロマトグラフィーに供した際の溶
出パターンを示す図であり、ポリペプチド鎖由来のヒド
ラジン分解物の溶出位置を２１５ｎｍにおける吸光度で
測定（図中、黒三角印で示す）し、同時にＩｇＧ由来糖
鎖の溶出位置をフェノール硫酸法による呈色を４９０ｎ
ｍにおける吸光度で測定（図中、黒丸印で示す）した図
である。横軸に溶出容量（ｍｌ）、右縦軸に２１５ｎｍ
における吸光度、左縦軸に４９０ｎｍにおける吸光度を
示す。図中、矢印はＥ／Ｗ＝１：１（ｖ／ｖ）で溶出を
開始した箇所及び蒸留水で溶出を開始した箇所を示す。
図５から明らかなように、ポリペプチド鎖由来のヒドラ
ジン分解物はカラムに吸着せず、Ｂ／Ｅ／Ｗ＝４：１：
１（ｖ／ｖ／ｖ）で速やかに洗い流された。一方、Ｉｇ
Ｇ由来糖鎖は、Ｅ／Ｗ＝１：１（ｖ／ｖ）で溶出を行っ
た画分にピークが認められ、また最後に蒸留水を流した
画分にもピークが認められた。
【００１８】次に、Ｅ／Ｗ＝１：１（ｖ／ｖ）で溶出を
行った画分と、蒸留水で溶出した画分をそれぞれ集め、
実施例１と同様の方法で、ＡＢＥＥ化した後、逆相ＨＰ
ＬＣ分析を行った。その結果を図６に示す。すなわち図
６は、上記溶出した画分をＡＢＥＥ化した後、逆相ＨＰ
ＬＣ分析に供した際の溶出パターンを示す図である。図
中、Ｉは対照としてＩｇＧ由来糖鎖をメソッズ イン
モレキュラー バイオロジー、第１４巻、第５５〜６８
頁（Ｅ．ハウンセルら編集、ヒューマナ プレス、１９
９３年発行）に従って、ろ紙クロマトグラフィーにより
精製した物を、ＡＢＥＥ化した後、逆相ＨＰＬＣ分析に
供した際の溶出パターンを示し、IIはＥ／Ｗ＝１：１
（ｖ／ｖ）で溶出を行った画分の逆相ＨＰＬＣの溶出パ
ターンを示し、III は蒸留水で溶出した画分の逆相ＨＰ
ＬＣの溶出パターンを示し、更にIVは対照としてセルロ
ースカラムに何も添加せずにＥ／Ｗ＝１：１（ｖ／ｖ）
で溶出を行った画分の逆相ＨＰＬＣの溶出パターンを示
す。横軸は相対保持時間（分）を、縦軸は３０４ｎｍに
おける吸光度を示す。図６から明らかなように、Ｅ／Ｗ
＝１：１（ｖ／ｖ）で溶出を行った画分IIには、ａから
ｌまでの１２種類の糖鎖に相当するピークが溶出し、ろ
紙クロマトグラフィーにより精製したＩｇＧ糖鎖の溶出
パターンと完全に一致した。一方、蒸留水で溶出した画
分には、不純物又はセルロースカラム由来と考えられる
ピークは認められるが、ＩｇＧの糖鎖に相当するピーク
は全く検出されなかった。更に、何も添加せずにＥ／Ｗ
＝１：１（ｖ／ｖ）で溶出を行った画分にも全くピーク
は検出されなかった。また、上記のセルロースカラムの
セルロースを、セルロースパウダー ＣＦ−１１（ワッ
トマン社製）に置き換えて、実験を行ったところ、上記
と同様の結果が得られた。したがって、これらの結果か
ら、蒸留水を溶離液としたセルロースカラムクロマトグ
ラフィーにより得られるオリゴ糖は、不純物を含み、極
めて不十分なものであるのに対して、上記で示したよう
な、アルコールと水の混合液を溶離液とする、本発明の
セルロースカラムクロマトグラフィーは、微量糖タンパ
ク質糖鎖構造解析のためのオリゴ糖画分を、迅速かつ簡
便に、しかも高純度に精製するのに、非常に有効な手段
であることが証明された。
行った画分と、蒸留水で溶出した画分をそれぞれ集め、
実施例１と同様の方法で、ＡＢＥＥ化した後、逆相ＨＰ
ＬＣ分析を行った。その結果を図６に示す。すなわち図
６は、上記溶出した画分をＡＢＥＥ化した後、逆相ＨＰ
ＬＣ分析に供した際の溶出パターンを示す図である。図
中、Ｉは対照としてＩｇＧ由来糖鎖をメソッズ イン
モレキュラー バイオロジー、第１４巻、第５５〜６８
頁（Ｅ．ハウンセルら編集、ヒューマナ プレス、１９
９３年発行）に従って、ろ紙クロマトグラフィーにより
精製した物を、ＡＢＥＥ化した後、逆相ＨＰＬＣ分析に
供した際の溶出パターンを示し、IIはＥ／Ｗ＝１：１
（ｖ／ｖ）で溶出を行った画分の逆相ＨＰＬＣの溶出パ
ターンを示し、III は蒸留水で溶出した画分の逆相ＨＰ
ＬＣの溶出パターンを示し、更にIVは対照としてセルロ
ースカラムに何も添加せずにＥ／Ｗ＝１：１（ｖ／ｖ）
で溶出を行った画分の逆相ＨＰＬＣの溶出パターンを示
す。横軸は相対保持時間（分）を、縦軸は３０４ｎｍに
おける吸光度を示す。図６から明らかなように、Ｅ／Ｗ
＝１：１（ｖ／ｖ）で溶出を行った画分IIには、ａから
ｌまでの１２種類の糖鎖に相当するピークが溶出し、ろ
紙クロマトグラフィーにより精製したＩｇＧ糖鎖の溶出
パターンと完全に一致した。一方、蒸留水で溶出した画
分には、不純物又はセルロースカラム由来と考えられる
ピークは認められるが、ＩｇＧの糖鎖に相当するピーク
は全く検出されなかった。更に、何も添加せずにＥ／Ｗ
＝１：１（ｖ／ｖ）で溶出を行った画分にも全くピーク
は検出されなかった。また、上記のセルロースカラムの
セルロースを、セルロースパウダー ＣＦ−１１（ワッ
トマン社製）に置き換えて、実験を行ったところ、上記
と同様の結果が得られた。したがって、これらの結果か
ら、蒸留水を溶離液としたセルロースカラムクロマトグ
ラフィーにより得られるオリゴ糖は、不純物を含み、極
めて不十分なものであるのに対して、上記で示したよう
な、アルコールと水の混合液を溶離液とする、本発明の
セルロースカラムクロマトグラフィーは、微量糖タンパ
ク質糖鎖構造解析のためのオリゴ糖画分を、迅速かつ簡
便に、しかも高純度に精製するのに、非常に有効な手段
であることが証明された。
【００１９】実施例５ 一連の高マンノース型糖鎖を持つリボヌクレアーゼＢ
（RNase B ）１００ｍｇを実施例４と同様にヒドラジン
分解後、セルロースカラムによる精製を行い、ＡＢＥＥ
化した後、アミド８０カラム（東ソー社製）を用いた順
相ＨＰＬＣにて分析を行った。その結果を図７に示す。
すなわち図７は、上記Ｅ／Ｗ＝１：１（ｖ／ｖ）で溶出
した画分を、ＡＢＥＥ化した後、順相ＨＰＬＣ分析に供
した際の溶出パターンを示す図である。図中、Ｉは、対
照としてRNase B 由来糖鎖をメソッズ インモレキュラ
ー バイオロジー、第１４巻、第５５〜６８頁（Ｅ．ハ
ウンセルら編集、ヒューマナ プレス、１９９３年発
行）に従って、ろ紙クロマトグラフィーにより精製した
物を、同じようにＡＢＥＥ化した後、順相ＨＰＬＣ分析
に供した際の溶出パターンであり、IIはセルロースカラ
ムからＥ／Ｗ＝１：１（ｖ／ｖ）で溶出を行った画分の
順相ＨＰＬＣ溶出パターンを示す。横軸は相対保持時間
（分）を、縦軸は３０４ｎｍにおける吸光度を示す。図
７から明らかなように、セルロースカラムからＥ／Ｗ＝
１：１（ｖ／ｖ）で溶出を行った画分には、Ｍ５からＭ
９までの５種類の糖鎖に相当するピークが認められ（図
中、矢印で示す）、ろ紙クロマトグラフィーにより精製
したRNase B糖鎖の溶出パターンと完全に一致した。更
に、この糖鎖混合物をα１，２−マンノシダーゼで消化
すると、すべてＭ５に相当するピークに変換された。ま
た、それぞれの糖鎖に相当するピークを分取して、ＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによるによる質量分析を行ったと
ころ、それぞれ理論値に相当するマススペクトルを与え
ることを確認した。
（RNase B ）１００ｍｇを実施例４と同様にヒドラジン
分解後、セルロースカラムによる精製を行い、ＡＢＥＥ
化した後、アミド８０カラム（東ソー社製）を用いた順
相ＨＰＬＣにて分析を行った。その結果を図７に示す。
すなわち図７は、上記Ｅ／Ｗ＝１：１（ｖ／ｖ）で溶出
した画分を、ＡＢＥＥ化した後、順相ＨＰＬＣ分析に供
した際の溶出パターンを示す図である。図中、Ｉは、対
照としてRNase B 由来糖鎖をメソッズ インモレキュラ
ー バイオロジー、第１４巻、第５５〜６８頁（Ｅ．ハ
ウンセルら編集、ヒューマナ プレス、１９９３年発
行）に従って、ろ紙クロマトグラフィーにより精製した
物を、同じようにＡＢＥＥ化した後、順相ＨＰＬＣ分析
に供した際の溶出パターンであり、IIはセルロースカラ
ムからＥ／Ｗ＝１：１（ｖ／ｖ）で溶出を行った画分の
順相ＨＰＬＣ溶出パターンを示す。横軸は相対保持時間
（分）を、縦軸は３０４ｎｍにおける吸光度を示す。図
７から明らかなように、セルロースカラムからＥ／Ｗ＝
１：１（ｖ／ｖ）で溶出を行った画分には、Ｍ５からＭ
９までの５種類の糖鎖に相当するピークが認められ（図
中、矢印で示す）、ろ紙クロマトグラフィーにより精製
したRNase B糖鎖の溶出パターンと完全に一致した。更
に、この糖鎖混合物をα１，２−マンノシダーゼで消化
すると、すべてＭ５に相当するピークに変換された。ま
た、それぞれの糖鎖に相当するピークを分取して、ＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによるによる質量分析を行ったと
ころ、それぞれ理論値に相当するマススペクトルを与え
ることを確認した。
【００２０】
【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明によ
り、迅速かつ簡便にオリゴ糖を単離精製する方法が提供
され、目的とするオリゴ糖以外の不純物、特に使用した
セルロース由来の不純物を含むことなく、目的とするオ
リゴ糖のみを微量に、あるいは大量に、かつ、高純度で
精製することが可能となった。
り、迅速かつ簡便にオリゴ糖を単離精製する方法が提供
され、目的とするオリゴ糖以外の不純物、特に使用した
セルロース由来の不純物を含むことなく、目的とするオ
リゴ糖のみを微量に、あるいは大量に、かつ、高純度で
精製することが可能となった。
【図１】セルロースカラムの溶出パターンを示す図であ
る。
る。
【図２】セルロースカラムから蒸留水で得られた溶出し
た画分のＡＢＥＥ化物の逆相ＨＰＬＣ溶出パターンを示
す図である。
た画分のＡＢＥＥ化物の逆相ＨＰＬＣ溶出パターンを示
す図である。
【図３】各溶出画分に含まれるオリゴ糖量をフェノール
硫酸法によって定量した結果を示す図である。
硫酸法によって定量した結果を示す図である。
【図４】各フラクション中のマルトペンタオースの溶出
パターンを示す図である。
パターンを示す図である。
【図５】ＩｇＧのヒドラジン分解産物をセルロースカラ
ムクロマトグラフィーに供した際の溶出パターンを示す
図である。
ムクロマトグラフィーに供した際の溶出パターンを示す
図である。
【図６】溶出した画分のＡＢＥＥ化物の逆相ＨＰＬＣ溶
出パターンを示す図である。
出パターンを示す図である。
【図７】溶出した画分のＡＢＥＥ化物の順相ＨＰＬＣ溶
出パターンを示す図である。
出パターンを示す図である。
Claims (4)
- 【請求項１】 オリゴ糖試料からオリゴ糖を単離精製す
る方法において、アルコールと水の混合液を溶離液とし
て、セルロースカラムクロマトグラフィーを行い、目的
のオリゴ糖のみを単離精製することを特徴とするオリゴ
糖の単離精製方法。 - 【請求項２】 アルコールと水の混合液のアルコール濃
度が１０〜９０％である請求項１記載のオリゴ糖の単離
精製方法。 - 【請求項３】 アルコールと水の混合液のアルコール濃
度が５０％である請求項１記載のオリゴ糖の単離精製方
法。 - 【請求項４】 アルコールが、メタノール又はエタノー
ルである請求項１記載のオリゴ糖の単離精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02516798A JP3885912B2 (ja) | 1998-01-23 | 1998-01-23 | オリゴ糖の単離精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02516798A JP3885912B2 (ja) | 1998-01-23 | 1998-01-23 | オリゴ糖の単離精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11209389A true JPH11209389A (ja) | 1999-08-03 |
| JP3885912B2 JP3885912B2 (ja) | 2007-02-28 |
Family
ID=12158458
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02516798A Expired - Fee Related JP3885912B2 (ja) | 1998-01-23 | 1998-01-23 | オリゴ糖の単離精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3885912B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100450619B1 (ko) * | 2002-04-22 | 2004-09-30 | 학교법인 인제학원 | 세포자살을 이용한 천연물질유래의 면역기능성 올리고당의검색 방법 |
| JP2008542690A (ja) * | 2005-05-06 | 2008-11-27 | エクソンモービル リサーチ アンド エンジニアリング カンパニー | ２次元（多次元）分離概念が例として適用された２次元（多次元）分離ガスクロマトグラフィーｘ質量分析（ＧＣｘＭＳ）技術のための新規のデータ処理／視覚化の方法 |
| JP2010046666A (ja) * | 2002-12-26 | 2010-03-04 | Shionogi & Co Ltd | 糖鎖捕捉分子を用いた糖鎖精製濃縮法および糖鎖構造解析法 |
| WO2012169648A1 (ja) * | 2011-06-09 | 2012-12-13 | 日本ケミカルリサーチ株式会社 | 糖蛋白質の分析法 |
-
1998
- 1998-01-23 JP JP02516798A patent/JP3885912B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100450619B1 (ko) * | 2002-04-22 | 2004-09-30 | 학교법인 인제학원 | 세포자살을 이용한 천연물질유래의 면역기능성 올리고당의검색 방법 |
| JP2010046666A (ja) * | 2002-12-26 | 2010-03-04 | Shionogi & Co Ltd | 糖鎖捕捉分子を用いた糖鎖精製濃縮法および糖鎖構造解析法 |
| US9139607B2 (en) | 2002-12-26 | 2015-09-22 | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | Method of purifying/concentrating sugar chain with sugar chain-trapping molecule and method of analyzing sugar chain structure |
| US9683006B2 (en) | 2002-12-26 | 2017-06-20 | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | Method of purifying/concentrating sugar chains with a sugar chain-trapping molecule and method of analyzing sugar chain structure |
| JP2008542690A (ja) * | 2005-05-06 | 2008-11-27 | エクソンモービル リサーチ アンド エンジニアリング カンパニー | ２次元（多次元）分離概念が例として適用された２次元（多次元）分離ガスクロマトグラフィーｘ質量分析（ＧＣｘＭＳ）技術のための新規のデータ処理／視覚化の方法 |
| WO2012169648A1 (ja) * | 2011-06-09 | 2012-12-13 | 日本ケミカルリサーチ株式会社 | 糖蛋白質の分析法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3885912B2 (ja) | 2007-02-28 |
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