JPH11181A - ｃｄｃ２５Ｂ遺伝子のプロモーター、その調製、およびその使用 - Google Patents
ｃｄｃ２５Ｂ遺伝子のプロモーター、その調製、およびその使用Info
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- JPH11181A JPH11181A JP10084995A JP8499598A JPH11181A JP H11181 A JPH11181 A JP H11181A JP 10084995 A JP10084995 A JP 10084995A JP 8499598 A JP8499598 A JP 8499598A JP H11181 A JPH11181 A JP H11181A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ｃｄｃ２５Ｂ遺伝子プロモーター配列および
遺伝子治療用核酸構築物の提供。 【解決手段】 配列番号：７に示される配列またはその
機能的部分とストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズする配列を含んでなるｃｄｃ２５Ｂ遺伝子のプロモー
ター。
遺伝子治療用核酸構築物の提供。 【解決手段】 配列番号：７に示される配列またはその
機能的部分とストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズする配列を含んでなるｃｄｃ２５Ｂ遺伝子のプロモー
ター。
Description
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、ｃｄｃ２５Ｂ遺伝子のプロモーター、ｃｄｃ
２５Ｂ遺伝子のプロモーターの検出法、および医薬品を
製造するためのｃｄｃ２５Ｂプロモーターの使用に関す
る。
２５Ｂ遺伝子のプロモーターの検出法、および医薬品を
製造するためのｃｄｃ２５Ｂプロモーターの使用に関す
る。
【０００２】背景技術 細胞分裂は、連続的相Ｇ０またはＧ１、Ｓ、Ｇ２および
Ｍに細分される。Ｓ相はＤＮＡ合成の相であり、これに
遷移相Ｇ２（Ｇ２相）が続き、更に有糸分裂相（Ｍ相）
が続いて、親細胞は２個の娘細胞に分裂する。静止相Ｇ
０（Ｇ０相）または遷移相Ｇ１（Ｇ１相）は、Ｍ相とＳ
相の間に位置している。
Ｍに細分される。Ｓ相はＤＮＡ合成の相であり、これに
遷移相Ｇ２（Ｇ２相）が続き、更に有糸分裂相（Ｍ相）
が続いて、親細胞は２個の娘細胞に分裂する。静止相Ｇ
０（Ｇ０相）または遷移相Ｇ１（Ｇ１相）は、Ｍ相とＳ
相の間に位置している。
【０００３】細胞分裂は、タンパク質キナーゼの１群、
すなわちサイクリン／ｃｄｋ複合体によって推進する。
これらは、触媒サブユニット［サイクリン依存性キナー
ゼ（ｃｄｋ、例えばｃｄｋ１、−２、−３、−４、−
５、−６、−７、または−８）および調節サブユニッ
ト、すなわちサイクリン（例えば、サイクリンＡ、−Ｂ
１−Ｂ３、−Ｄ１−Ｄ３、−Ｅ、−Ｈ、または−Ｃ］を
含んでなる。
すなわちサイクリン／ｃｄｋ複合体によって推進する。
これらは、触媒サブユニット［サイクリン依存性キナー
ゼ（ｃｄｋ、例えばｃｄｋ１、−２、−３、−４、−
５、−６、−７、または−８）および調節サブユニッ
ト、すなわちサイクリン（例えば、サイクリンＡ、−Ｂ
１−Ｂ３、−Ｄ１−Ｄ３、−Ｅ、−Ｈ、または−Ｃ］を
含んでなる。
【０００４】様々なｃｄｋ複合体は細胞サイクルの各相
で特に活性であり、例えばｃｄｋ複合体ｃｄｋ４／サイ
クリンＤ１−３およびｃｄｋ６／サイクリンＤ１−３は
中期Ｇ１相で、ｃｄｋ複合体ｃｄｋ２／サイクリンＥは
後期Ｇ１相で、ｃｄｋ複合体ｃｄｋ２／サイクリンＡは
Ｓ相で、およびｃｄｋ複合体ｃｄｋ１／サイクリンＢ１
−３およびｃｄｋ１／サイクリンＡはＧ２／Ｍ遷移相で
特に活性である。
で特に活性であり、例えばｃｄｋ複合体ｃｄｋ４／サイ
クリンＤ１−３およびｃｄｋ６／サイクリンＤ１−３は
中期Ｇ１相で、ｃｄｋ複合体ｃｄｋ２／サイクリンＥは
後期Ｇ１相で、ｃｄｋ複合体ｃｄｋ２／サイクリンＡは
Ｓ相で、およびｃｄｋ複合体ｃｄｋ１／サイクリンＢ１
−３およびｃｄｋ１／サイクリンＡはＧ２／Ｍ遷移相で
特に活性である。
【０００５】サイクリン／ｃｄｋ複合体の活性は、ＤＮ
Ａ合成および有糸分裂の調節に直接または間接的に関与
するタンパク質のリン酸化に続いて活性化または不活性
化とを含んでなる。
Ａ合成および有糸分裂の調節に直接または間接的に関与
するタンパク質のリン酸化に続いて活性化または不活性
化とを含んでなる。
【０００６】細胞サイクルにおけるそれらの機能と調和
して、幾つかのサイクリンおよびｃｄｋの遺伝子は、例
えばサイクリンの制御された分解によって、インヒビタ
ー（例えば、ｐ１６INK4A 、ｐ１５INK4B 、ｐ２
１Cip1、ｐ２７Kip1、ｐ１８INK4C、ｐ１９INK4D およ
びｐ５７）の細胞サイクル相特異的結合によって、また
は酵素の活性化（例えば、ｃｄｃ２５ホスファターゼ、
またはｃｄｋ７／サイクリンＨ）または阻害（例えば、
ｗｅｅ１キナーゼ）による修飾によって、定期的に転写
され、および／または定期的に活性化または阻害される
（Zwicker and Mueller, Progr. Cell Cycle Res., 1,
91 (1995); La Thangue, Curr. Opin. Cell Biol., 6,
443 (1994); MacLachlan et al., Crit. Rev. Eukaryot
ic Gene Expr.,5, 127 (1995)における総説）。
して、幾つかのサイクリンおよびｃｄｋの遺伝子は、例
えばサイクリンの制御された分解によって、インヒビタ
ー（例えば、ｐ１６INK4A 、ｐ１５INK4B 、ｐ２
１Cip1、ｐ２７Kip1、ｐ１８INK4C、ｐ１９INK4D およ
びｐ５７）の細胞サイクル相特異的結合によって、また
は酵素の活性化（例えば、ｃｄｃ２５ホスファターゼ、
またはｃｄｋ７／サイクリンＨ）または阻害（例えば、
ｗｅｅ１キナーゼ）による修飾によって、定期的に転写
され、および／または定期的に活性化または阻害される
（Zwicker and Mueller, Progr. Cell Cycle Res., 1,
91 (1995); La Thangue, Curr. Opin. Cell Biol., 6,
443 (1994); MacLachlan et al., Crit. Rev. Eukaryot
ic Gene Expr.,5, 127 (1995)における総説）。
【０００７】高等な真核生物は、少なくとも３種類のｃ
ｄｃ２５ホスファターゼ、すなわちｃｄｃ２５Ａ、ｃｄ
ｃ２５Ｂおよびｃｄｃ２５Ｃを有する。これらのホスフ
ァターゼに対する遺伝子のｃＤＮＡは、既にクローニン
グされて、分析されている(Okazaki et al., Gene 178,
111 (1996); Galaktionaw et al., Cell 67, 1181 (19
91))。３種類のホスファターゼ総ては、細胞サイクルに
定期的に現れる。しかしながら、これらのｃｄｃ２５ホ
スファターゼの活性化機能は、明らかに異なっている(J
inno et al., EMBO J. 13, 1549 (1994); Honda et a
l., FEBS Lett. 318, 331 (1993); Hoffmann et al., E
MBO J. 13, 4302 (1994)) 。
ｄｃ２５ホスファターゼ、すなわちｃｄｃ２５Ａ、ｃｄ
ｃ２５Ｂおよびｃｄｃ２５Ｃを有する。これらのホスフ
ァターゼに対する遺伝子のｃＤＮＡは、既にクローニン
グされて、分析されている(Okazaki et al., Gene 178,
111 (1996); Galaktionaw et al., Cell 67, 1181 (19
91))。３種類のホスファターゼ総ては、細胞サイクルに
定期的に現れる。しかしながら、これらのｃｄｃ２５ホ
スファターゼの活性化機能は、明らかに異なっている(J
inno et al., EMBO J. 13, 1549 (1994); Honda et a
l., FEBS Lett. 318, 331 (1993); Hoffmann et al., E
MBO J. 13, 4302 (1994)) 。
【０００８】ｃｄｃ２５Ａは主に後記Ｇ１相で発現し、
特にｃｄｋ／サイクリン複合体を活性化することによっ
てＧ１相からＳ相への遷移を調節し、これはそれ自身Ｍ
ｙｃ（転写）およびＲａｆ（活性）によって調節され
る。ｃｄｃ２５Ｂはｃｄｋ１のＡＴＰ結合ポケットにお
けるチロシン（チロシン１４およびチロシン１５）を脱
リン酸化することによってそれらを活性化し、更にこれ
はｃｄｋ１とは独立してサイクリンＢ（１−３）によっ
て刺激することができ、その発現はウイルス（ＳＶ４０
またはＨＰＶ）に感染した細胞で制限解除され、増加す
る。ｃｄｃ２５Ｃはｃｄｋ１のＡＴＰ結合ポケットにお
けるチロシン（チロシン１４およびチロシン１５）を脱
リン酸化することによってそれらを活性化し、これは特
にＧ２相で発現され、Ｍ相へのエントリーを調節する。
特にｃｄｋ／サイクリン複合体を活性化することによっ
てＧ１相からＳ相への遷移を調節し、これはそれ自身Ｍ
ｙｃ（転写）およびＲａｆ（活性）によって調節され
る。ｃｄｃ２５Ｂはｃｄｋ１のＡＴＰ結合ポケットにお
けるチロシン（チロシン１４およびチロシン１５）を脱
リン酸化することによってそれらを活性化し、更にこれ
はｃｄｋ１とは独立してサイクリンＢ（１−３）によっ
て刺激することができ、その発現はウイルス（ＳＶ４０
またはＨＰＶ）に感染した細胞で制限解除され、増加す
る。ｃｄｃ２５Ｃはｃｄｋ１のＡＴＰ結合ポケットにお
けるチロシン（チロシン１４およびチロシン１５）を脱
リン酸化することによってそれらを活性化し、これは特
にＧ２相で発現され、Ｍ相へのエントリーを調節する。
【０００９】細胞サイクルのＧ２相におけるｃｄｃ２５
Ｃの定期的発現は、本質的にｃｄｃ２５Ｃのプロモータ
ー領域の要素（ＣＤＥ−ＣＨＲ）によって調節され、こ
の要素はＧ０／Ｇ１相では抑制性タンパク質によって占
められ、Ｇ２相ではフリーである。このプロモーター要
素のヌクレオチド配列は同定されており、サイクリンＡ
およびｃｄｋ１についての遺伝子のプロモーターにも同
様に見出だされているが、幾分異なるヌクレオチド配列
（Ｅ２ＦＢＳ−ＣＨＲ）がＢｍｙｂに対するプロモータ
ーで検出されている。これらのプロモーター要素の機能
の細胞サイクル依存性モードの検討により、Ｇ０／Ｇ１
相においてそれらを阻害すると、関連遺伝子の転写のア
ップレギュレーションが生じ、このアップレギュレーシ
ョンはＢ−ｍｙｂ遺伝子の場合には特に早く（中期Ｇ１
相で）起こり、サイクリンＡの場合にはＧ１／Ｓ遷移相
で、ｃｄｋ１遺伝子の場合にはＳ相で、ｃｄｃ２５Ｃ遺
伝子の場合には後期Ｓ相だけで起こることが示された(Z
wicker and Mueller, Progress in Cell Cycle Res. 1,
91 (1995); Lucibello et al., EMBO J. 14, 132(199
5); Liu et al., Nucl. Acids Res. 24, 2905 (1995);
Zwicker et al., Nucl. Acids Res. 23, 3822 (1995);
EMBO J. 14, 4514 (1995))。
Ｃの定期的発現は、本質的にｃｄｃ２５Ｃのプロモータ
ー領域の要素（ＣＤＥ−ＣＨＲ）によって調節され、こ
の要素はＧ０／Ｇ１相では抑制性タンパク質によって占
められ、Ｇ２相ではフリーである。このプロモーター要
素のヌクレオチド配列は同定されており、サイクリンＡ
およびｃｄｋ１についての遺伝子のプロモーターにも同
様に見出だされているが、幾分異なるヌクレオチド配列
（Ｅ２ＦＢＳ−ＣＨＲ）がＢｍｙｂに対するプロモータ
ーで検出されている。これらのプロモーター要素の機能
の細胞サイクル依存性モードの検討により、Ｇ０／Ｇ１
相においてそれらを阻害すると、関連遺伝子の転写のア
ップレギュレーションが生じ、このアップレギュレーシ
ョンはＢ−ｍｙｂ遺伝子の場合には特に早く（中期Ｇ１
相で）起こり、サイクリンＡの場合にはＧ１／Ｓ遷移相
で、ｃｄｋ１遺伝子の場合にはＳ相で、ｃｄｃ２５Ｃ遺
伝子の場合には後期Ｓ相だけで起こることが示された(Z
wicker and Mueller, Progress in Cell Cycle Res. 1,
91 (1995); Lucibello et al., EMBO J. 14, 132(199
5); Liu et al., Nucl. Acids Res. 24, 2905 (1995);
Zwicker et al., Nucl. Acids Res. 23, 3822 (1995);
EMBO J. 14, 4514 (1995))。
【００１０】更に、サイクリン２５Ｃ、サイクリンＡ、
およびｃｄｋ１遺伝子に対するプロモーターの）ＣＤＥ
−ＣＨＲ要素、および（Ｂ−ｍｙｂ遺伝子に対するプロ
モーターの）Ｅ２ＦＢＳ−ＣＨＲ要素は、Ｇ０／Ｇ１相
における相同遺伝子の活性化および転写を阻害すること
ができるだけでなく、他の遺伝子の活性化および転写を
阻害することもできることが見出だされている（例え
ば、ＷＯ９６／０６９４３号、ＤＥ１９６０５２７４．
２号、ＤＥ１９６１７８５１．７号、ＷＯ９６／０６９
４０号、ＷＯ９６／０６９３８号、ＷＯ９６／０６９４
１号およびＷＯ９６／０６９３９号明細書を参照された
い）。
およびｃｄｋ１遺伝子に対するプロモーターの）ＣＤＥ
−ＣＨＲ要素、および（Ｂ−ｍｙｂ遺伝子に対するプロ
モーターの）Ｅ２ＦＢＳ−ＣＨＲ要素は、Ｇ０／Ｇ１相
における相同遺伝子の活性化および転写を阻害すること
ができるだけでなく、他の遺伝子の活性化および転写を
阻害することもできることが見出だされている（例え
ば、ＷＯ９６／０６９４３号、ＤＥ１９６０５２７４．
２号、ＤＥ１９６１７８５１．７号、ＷＯ９６／０６９
４０号、ＷＯ９６／０６９３８号、ＷＯ９６／０６９４
１号およびＷＯ９６／０６９３９号明細書を参照された
い）。
【００１１】これらの特許明細書には、細胞サイクル依
存性プロモーターと、非特異的、細胞特異的、ウイルス
特異的または代謝により活性化可能なプロモーターとを
組み合わせてエフェクター遺伝子の転写を活性し、この
遺伝子が疾患の予防および／または治療のためのタンパ
ク質を制御された方法でコードすることが開示されてい
る。これらの疾患は、例えば腫瘍疾患、白血病、自己免
疫疾患、関節炎、アレルギー、炎症、移植臓器の拒絶反
応、血液循環系または血液凝固系の疾患、または中枢神
経系の感染症または損傷であることがある。
存性プロモーターと、非特異的、細胞特異的、ウイルス
特異的または代謝により活性化可能なプロモーターとを
組み合わせてエフェクター遺伝子の転写を活性し、この
遺伝子が疾患の予防および／または治療のためのタンパ
ク質を制御された方法でコードすることが開示されてい
る。これらの疾患は、例えば腫瘍疾患、白血病、自己免
疫疾患、関節炎、アレルギー、炎症、移植臓器の拒絶反
応、血液循環系または血液凝固系の疾患、または中枢神
経系の感染症または損傷であることがある。
【００１２】いわゆるキメラプロモーターは、様々なプ
ロモーターを細胞サイクル特異的プロモーター要素と組
み合わせるこの可能性の具体例である。このキメラプロ
モーターでは、非特異的、細胞特異的、ウイルス特異
的、または代謝により活性化可能な活性化配列（または
プロモーター配列）は、その下流に直ぐ隣接しているＣ
ＤＥ−ＣＨＲまたはＥ２ＦＢＳ−ＣＨＲプロモーター要
素よって細胞サイクルのＳおよびＧ２相に大部分制限さ
れている。
ロモーターを細胞サイクル特異的プロモーター要素と組
み合わせるこの可能性の具体例である。このキメラプロ
モーターでは、非特異的、細胞特異的、ウイルス特異
的、または代謝により活性化可能な活性化配列（または
プロモーター配列）は、その下流に直ぐ隣接しているＣ
ＤＥ−ＣＨＲまたはＥ２ＦＢＳ−ＣＨＲプロモーター要
素よって細胞サイクルのＳおよびＧ２相に大部分制限さ
れている。
【００１３】ＣＤＥ−ＣＨＲプロモーター要素の機能の
様式について引き続いて検討を行なった結果、上流のア
クティベーター配列のＣＤＥ−ＣＨＲ要素による細胞サ
イクル依存性制御は、活性化配列がグルタミンリッチな
活性化ドメインを有する転写因子によって活性化される
かどうかに大部分依存していることが明らかになった(Z
wicker et al., Nucl. Acids Res. 23, 3822 (1995))。
様式について引き続いて検討を行なった結果、上流のア
クティベーター配列のＣＤＥ−ＣＨＲ要素による細胞サ
イクル依存性制御は、活性化配列がグルタミンリッチな
活性化ドメインを有する転写因子によって活性化される
かどうかに大部分依存していることが明らかになった(Z
wicker et al., Nucl. Acids Res. 23, 3822 (1995))。
【００１４】これらの転写因子の例は、Ｓｐ１およびＮ
Ｆ−Ｙである。
Ｆ−Ｙである。
【００１５】したがって、これはキメラプロモーターに
対するＣＤＥ−ＣＨＲプロモーター要素の使用を制限す
る。同じことは、Ｂ−ｍｙｂ遺伝子のＥ２Ｆ−ＢＳ−Ｃ
ＨＢプロモーター要素についても真実であると仮定しな
ければならない(Zwicker etal., Nucl. Acids Res. 23,
3822 (1995))。
対するＣＤＥ−ＣＨＲプロモーター要素の使用を制限す
る。同じことは、Ｂ−ｍｙｂ遺伝子のＥ２Ｆ−ＢＳ−Ｃ
ＨＢプロモーター要素についても真実であると仮定しな
ければならない(Zwicker etal., Nucl. Acids Res. 23,
3822 (1995))。
【００１６】
【発明の概要】したがって、本発明の目的は、Ｇ０特異
的およびＧ１特異的抑制がＣＤＥ−ＣＨＲプロモーター
要素を必要とする環境以外の他の環境に依存している細
胞サイクル特異的プロモーターおよびプロモーター要素
を見出だすことである。
的およびＧ１特異的抑制がＣＤＥ−ＣＨＲプロモーター
要素を必要とする環境以外の他の環境に依存している細
胞サイクル特異的プロモーターおよびプロモーター要素
を見出だすことである。
【００１７】ネズミｃｄｃ２５Ｂ遺伝子のプロモーター
のヌクレオチド配列、およびｃｄｃ２５Ｂ遺伝子の開始
（または出発）領域を含む直ぐ下流の５′−非コード領
域のヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列−９５０〜＋
１６７）を分析したとき、ｃｄｃ２５Ｂプロモーター配
列の機能領域は２個のＥボックス、２個の（推定的）Ｅ
２Ｆ結合部位、４個の（推定的）ＳＰ１結合部位、１個
の（推定的）ＮＦ−Ｙ結合部位、およびＴＡＴＡボック
スを含むことを見出だした。意外なことには、ＣＤＥ−
ＣＨＲまたはＥ２ＦＢＳ−ＣＨＲと相同性を有するヌク
レオチド配列はまったく見出だすことはできなかった。
したがって、ｃｄｃ２５Ｂプロモーター配列の機能領域
はｃｄｃ２５Ｃのプロモーター、サイクリンＡ、ｃｄｋ
１遺伝子およびＢ−ｍｙｂ遺伝子の機能領域とは明らか
に異なっている。また、意外なことには、機能的ＴＡＴ
Ａボックスを含む細胞サイクル遺伝子プロモーターの報
告は今日までまったくない。
のヌクレオチド配列、およびｃｄｃ２５Ｂ遺伝子の開始
（または出発）領域を含む直ぐ下流の５′−非コード領
域のヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列−９５０〜＋
１６７）を分析したとき、ｃｄｃ２５Ｂプロモーター配
列の機能領域は２個のＥボックス、２個の（推定的）Ｅ
２Ｆ結合部位、４個の（推定的）ＳＰ１結合部位、１個
の（推定的）ＮＦ−Ｙ結合部位、およびＴＡＴＡボック
スを含むことを見出だした。意外なことには、ＣＤＥ−
ＣＨＲまたはＥ２ＦＢＳ−ＣＨＲと相同性を有するヌク
レオチド配列はまったく見出だすことはできなかった。
したがって、ｃｄｃ２５Ｂプロモーター配列の機能領域
はｃｄｃ２５Ｃのプロモーター、サイクリンＡ、ｃｄｋ
１遺伝子およびＢ−ｍｙｂ遺伝子の機能領域とは明らか
に異なっている。また、意外なことには、機能的ＴＡＴ
Ａボックスを含む細胞サイクル遺伝子プロモーターの報
告は今日までまったくない。
【００１８】したがって、本発明は、ｃｄｃ２５Ｂ遺伝
子のプロモーターであって、ストリンジェントな条件下
で図７および８に示される配列（配列番号：７）または
その機能的部分とハイブリダイズする配列を含むプロモ
ーター、特に図７および８に示される配列（配列番号：
７）またはその機能的部分を有するプロモーターに関す
る。
子のプロモーターであって、ストリンジェントな条件下
で図７および８に示される配列（配列番号：７）または
その機能的部分とハイブリダイズする配列を含むプロモ
ーター、特に図７および８に示される配列（配列番号：
７）またはその機能的部分を有するプロモーターに関す
る。
【００１９】
【発明の具体的な説明】ｃｄｃ２５Ｂプロモーターの全
配列、または断片をルシフェラーゼ遺伝子の上流のプラ
スミドにクローニングし、これらのプラスミドをマウス
またはヒトの静止しているおよび増殖している線維芽腫
にトランスフェクションし、発現したルシフェラーゼの
量を測定した。
配列、または断片をルシフェラーゼ遺伝子の上流のプラ
スミドにクローニングし、これらのプラスミドをマウス
またはヒトの静止しているおよび増殖している線維芽腫
にトランスフェクションし、発現したルシフェラーゼの
量を測定した。
【００２０】（増殖細胞での状況とは対照的に）クロー
ニングしたｃｄｃ２５Ｂ配列（プロモーターおよび５′
−非コード領域：約−９５０〜約＋１６７）は、静止細
胞でのルシフェラーゼ遺伝子の発現が強力に抑制され、
この抑制はｃｄｃ２５Ｂプロモーターの５′末端におい
て欠失を作製することによって段階的に減少することが
判明した（約−９５０〜約＋１６７〜約−３０〜約＋１
６７）。
ニングしたｃｄｃ２５Ｂ配列（プロモーターおよび５′
−非コード領域：約−９５０〜約＋１６７）は、静止細
胞でのルシフェラーゼ遺伝子の発現が強力に抑制され、
この抑制はｃｄｃ２５Ｂプロモーターの５′末端におい
て欠失を作製することによって段階的に減少することが
判明した（約−９５０〜約＋１６７〜約−３０〜約＋１
６７）。
【００２１】約−１８０〜約＋１６７より小さな欠失断
片では、プロモーター活性は増殖細胞でも同様に減少し
た。
片では、プロモーター活性は増殖細胞でも同様に減少し
た。
【００２２】したがって、本発明の意味では、機能部分
は、特にそれらが全プロモーターの約５０％以上を包含
するときには、特に上記の転写因子結合部位であると理
解される。特に好ましいものは、ＴＡＴＡボックス、少
なくとも１個のＳＰ１結合部位、少なくとも１個のＮＦ
Ｙ結合部位、および適当ならば、少なくとも１個のＥ２
Ｆ結合部位、および適当ならば、少なくとも１個のＥボ
ックスを含む機能部分であって、エフェクター遺伝子の
細胞サイクル依存性発現を達成することができるような
ものである。これらのプロモーター配列としては、特に
ネズミｃｄｃ２５Ｂ遺伝子のプロモーター配列が挙げら
れるが、それらはヒトｃｄｃ２５Ｂ遺伝子のプロモータ
ー配列も包含している。
は、特にそれらが全プロモーターの約５０％以上を包含
するときには、特に上記の転写因子結合部位であると理
解される。特に好ましいものは、ＴＡＴＡボックス、少
なくとも１個のＳＰ１結合部位、少なくとも１個のＮＦ
Ｙ結合部位、および適当ならば、少なくとも１個のＥ２
Ｆ結合部位、および適当ならば、少なくとも１個のＥボ
ックスを含む機能部分であって、エフェクター遺伝子の
細胞サイクル依存性発現を達成することができるような
ものである。これらのプロモーター配列としては、特に
ネズミｃｄｃ２５Ｂ遺伝子のプロモーター配列が挙げら
れるが、それらはヒトｃｄｃ２５Ｂ遺伝子のプロモータ
ー配列も包含している。
【００２３】新規なプロモーターの他の好ましい部分
は、図７および８によれば、約−９５０〜約＋１６７、
約−９５０〜約＋３、約−９３０〜約＋３、約−７２０
〜約＋３、約−３４０〜約＋３、約−１８０〜約＋３、
約−１００〜約＋３、約−８０〜約＋３、約−６０〜約
＋３、または約−３０〜約＋３のヌクレオチド、および
それらの部分であって、図６による相当する機能的シス
調節要素、特に５′欠失および／または３′欠失を含む
ものである。
は、図７および８によれば、約−９５０〜約＋１６７、
約−９５０〜約＋３、約−９３０〜約＋３、約−７２０
〜約＋３、約−３４０〜約＋３、約−１８０〜約＋３、
約−１００〜約＋３、約−８０〜約＋３、約−６０〜約
＋３、または約−３０〜約＋３のヌクレオチド、および
それらの部分であって、図６による相当する機能的シス
調節要素、特に５′欠失および／または３′欠失を含む
ものである。
【００２４】本発明は、新規なプロモーターを有するｃ
ｄｃ２５Ｂタンパク質またはその部分であって、標識さ
れ、好ましくは放射能標識されたもの、およびゲノムＤ
ＮＡライブラリー、好ましくは哺乳動物細胞由来の、ス
トリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションによ
ってスクリーニングされるものを見出だす方法にも関す
る。当業者は、例えばSmabrook, J. et al. (1989)分子
クローニング、実験室便覧(Molecular Cloning. A labo
ratory manual)、Cold Spring Harbor Laboratory 、ニ
ューヨーク、から、ストリンジェントな条件下でのゲノ
ムＤＮＡライブラリーの調製およびハイブリダイゼーシ
ョンになれている。ハイブリダイゼーション条件は、例
えばSzostak, J.W. et al. (1979) 、合成オリゴヌクレ
オチドを用いるハイブリダイゼーション(Hybridization
with synthetic oligonucleotides), Method in Enzym
ol. 68, 419-482 に記載の方法で最適にすることができ
る。例えば、ネズミｃｄｃ２５Ｂプロモーターを単離す
るため、例えばマウス品種１２９ＦＶＪ(Stratagene)か
ら得たネズミゲノムファージライブラリーを図７および
８に示される配列（配列番号：７）の一部、好ましくは
配列番号：４の配列を含むプローブでスクリーニングす
ることができる。
ｄｃ２５Ｂタンパク質またはその部分であって、標識さ
れ、好ましくは放射能標識されたもの、およびゲノムＤ
ＮＡライブラリー、好ましくは哺乳動物細胞由来の、ス
トリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションによ
ってスクリーニングされるものを見出だす方法にも関す
る。当業者は、例えばSmabrook, J. et al. (1989)分子
クローニング、実験室便覧(Molecular Cloning. A labo
ratory manual)、Cold Spring Harbor Laboratory 、ニ
ューヨーク、から、ストリンジェントな条件下でのゲノ
ムＤＮＡライブラリーの調製およびハイブリダイゼーシ
ョンになれている。ハイブリダイゼーション条件は、例
えばSzostak, J.W. et al. (1979) 、合成オリゴヌクレ
オチドを用いるハイブリダイゼーション(Hybridization
with synthetic oligonucleotides), Method in Enzym
ol. 68, 419-482 に記載の方法で最適にすることができ
る。例えば、ネズミｃｄｃ２５Ｂプロモーターを単離す
るため、例えばマウス品種１２９ＦＶＪ(Stratagene)か
ら得たネズミゲノムファージライブラリーを図７および
８に示される配列（配列番号：７）の一部、好ましくは
配列番号：４の配列を含むプローブでスクリーニングす
ることができる。
【００２５】本発明は、少なくとも１個の新規なプロモ
ーターを含む核酸構築物にも関する。好ましくは、ｃｄ
ｃ２５Ｂ遺伝子の新規なプロモーター配列は構造遺伝
子、すなわち一般には活性化合物の形態のタンパク質ま
たはＲＮＡをコードする遺伝子と組み合わさせている。
最も単純な場合には、この組み合わせはｃｄｃ２５Ｂ遺
伝子に対する新規なプロモーターのヌクレオチド配列お
よび構造遺伝子を含む核酸構築物を構成することがで
き、プロモーターは構造遺伝子の転写を好ましくは細胞
サイクル依存的に活性化する。新規なプロモーターは、
好ましくは構造遺伝子の上流に配置されている。
ーターを含む核酸構築物にも関する。好ましくは、ｃｄ
ｃ２５Ｂ遺伝子の新規なプロモーター配列は構造遺伝
子、すなわち一般には活性化合物の形態のタンパク質ま
たはＲＮＡをコードする遺伝子と組み合わさせている。
最も単純な場合には、この組み合わせはｃｄｃ２５Ｂ遺
伝子に対する新規なプロモーターのヌクレオチド配列お
よび構造遺伝子を含む核酸構築物を構成することがで
き、プロモーターは構造遺伝子の転写を好ましくは細胞
サイクル依存的に活性化する。新規なプロモーターは、
好ましくは構造遺伝子の上流に配置されている。
【００２６】もう一つの好ましい態様では、ｃｄｃ２５
Ｂ遺伝子の５′−非コード領域（ヌクレオチド配列＋１
〜約＋１６７）は、新規プロモーターと構造遺伝子との
間に挿入される。
Ｂ遺伝子の５′−非コード領域（ヌクレオチド配列＋１
〜約＋１６７）は、新規プロモーターと構造遺伝子との
間に挿入される。
【００２７】もう一つの好ましい態様では、新規プロモ
ーターは、少なくとも１個の別の非特異的、ウイルス特
異的、代謝特異的、細胞特異的、細胞サイクル特異的お
よび／または細胞増殖依存性活性化配列と組み合わされ
て、構造遺伝子の発現を調節する。例えば、内皮細胞、
腹膜細胞、胸膜細胞、皮膚上皮細胞、肺細胞、消化管細
胞、腎臓および尿排泄通路細胞、筋肉細胞、結合組織細
胞、造血細胞、マクロファージ、リンパ球、白血病細
胞、腫瘍細胞またはグリア細胞で活性化されるプロモー
ター、低酸素症によって活性化されるプロモーターまた
はエンハンサー配列、ｃｄｃ２５Ｃ、サイクリンＡ、ｃ
ｄｃ２、Ｅ２Ｆ−１、Ｂ−ｍｙｂおよびＤＨＦＲをコー
ドする遺伝子の細胞サイクル特異的活性化配列、および
／または結合配列、例えば細胞増殖依存的に現れるまた
は活性化される転写因子についてのＭｙｃ Ｅボックス
のモノマーまたはマルチマーである。
ーターは、少なくとも１個の別の非特異的、ウイルス特
異的、代謝特異的、細胞特異的、細胞サイクル特異的お
よび／または細胞増殖依存性活性化配列と組み合わされ
て、構造遺伝子の発現を調節する。例えば、内皮細胞、
腹膜細胞、胸膜細胞、皮膚上皮細胞、肺細胞、消化管細
胞、腎臓および尿排泄通路細胞、筋肉細胞、結合組織細
胞、造血細胞、マクロファージ、リンパ球、白血病細
胞、腫瘍細胞またはグリア細胞で活性化されるプロモー
ター、低酸素症によって活性化されるプロモーターまた
はエンハンサー配列、ｃｄｃ２５Ｃ、サイクリンＡ、ｃ
ｄｃ２、Ｅ２Ｆ−１、Ｂ−ｍｙｂおよびＤＨＦＲをコー
ドする遺伝子の細胞サイクル特異的活性化配列、および
／または結合配列、例えば細胞増殖依存的に現れるまた
は活性化される転写因子についてのＭｙｃ Ｅボックス
のモノマーまたはマルチマーである。
【００２８】様々な手法を用いて、新規プロモーターを
少なくとも１個の別のプロモーターと組み合わせること
ができる。これらの手法は、例えばＤＥ１９６１７８５
１．７号明細書、ＤＥ１９６３９１０３．２号明細書、
およびＤＥ１９６５１４４３．６号明細書に記載されて
いる。
少なくとも１個の別のプロモーターと組み合わせること
ができる。これらの手法は、例えばＤＥ１９６１７８５
１．７号明細書、ＤＥ１９６３９１０３．２号明細書、
およびＤＥ１９６５１４４３．６号明細書に記載されて
いる。
【００２９】本発明のもう一つの態様では、新規プロモ
ーターと少なくとも１個の別のプロモーターまたはエン
ハンサーとの組み合わせについての核酸構築物であっ
て、転写因子についての少なくとも１個の結合部位が突
然変異している形態での新規プロモーターを含むものが
選択される。この突然変異は、構造遺伝子の転写の開始
をブロックする。核酸構築物の他の成分は、適当な場合
には、構造遺伝子、少なくとも１個の別のプロモーター
配列またはエンハンサー配列であって、非特異的、細胞
特異的またはウイルス特異的に、テトラサイクリンによ
って、および／または細胞サイクル特異的に活性化する
ことができ、かつ突然変異している少なくとも１個の転
写因子をコードする少なくとも１個の別の構造遺伝子の
転写を活性化して新規プロモーターの（複数の）突然変
異した結合部位に結合し、かつこのプロモーターを活性
化するもの、および／または転写因子をコードする構造
遺伝子である。
ーターと少なくとも１個の別のプロモーターまたはエン
ハンサーとの組み合わせについての核酸構築物であっ
て、転写因子についての少なくとも１個の結合部位が突
然変異している形態での新規プロモーターを含むものが
選択される。この突然変異は、構造遺伝子の転写の開始
をブロックする。核酸構築物の他の成分は、適当な場合
には、構造遺伝子、少なくとも１個の別のプロモーター
配列またはエンハンサー配列であって、非特異的、細胞
特異的またはウイルス特異的に、テトラサイクリンによ
って、および／または細胞サイクル特異的に活性化する
ことができ、かつ突然変異している少なくとも１個の転
写因子をコードする少なくとも１個の別の構造遺伝子の
転写を活性化して新規プロモーターの（複数の）突然変
異した結合部位に結合し、かつこのプロモーターを活性
化するもの、および／または転写因子をコードする構造
遺伝子である。
【００３０】個々の成分の配列は、例えば図１の略図に
示されている。
示されている。
【００３１】本発明の代表的態様では、突然変異は新規
なプロモーターのＴＡＴＡボックスの突然変異であるこ
とができる。ＴＡＴＡボックス（ＴＡＴＡＡＡまたはＴ
ＡＴＡＴＡＡ）は、細胞各に含まれるＲＮＡポリメラー
ゼIIおよびIII の開始複合体についての結合部位である
と認識される。ＴＡＴＡボックスの約３０塩基下流の転
写の開始は、細胞各に含まれる総てのＲＮＡポリメラー
ゼ（Ｉ、IIおよびIII）の転写反応に関与するＴＡＴＡ
ボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）に結合することによ
って行われる。厳密にＴＡＴＡボックス依存性のプロモ
ーターの一例は、Ｕ６遺伝子についてのプロモーターで
あり、これはＲＮＡポリメラーゼIII によって転写さ
れ、その遺伝子生成物はｍＲＮＡスプライシングに関与
している。
なプロモーターのＴＡＴＡボックスの突然変異であるこ
とができる。ＴＡＴＡボックス（ＴＡＴＡＡＡまたはＴ
ＡＴＡＴＡＡ）は、細胞各に含まれるＲＮＡポリメラー
ゼIIおよびIII の開始複合体についての結合部位である
と認識される。ＴＡＴＡボックスの約３０塩基下流の転
写の開始は、細胞各に含まれる総てのＲＮＡポリメラー
ゼ（Ｉ、IIおよびIII）の転写反応に関与するＴＡＴＡ
ボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）に結合することによ
って行われる。厳密にＴＡＴＡボックス依存性のプロモ
ーターの一例は、Ｕ６遺伝子についてのプロモーターで
あり、これはＲＮＡポリメラーゼIII によって転写さ
れ、その遺伝子生成物はｍＲＮＡスプライシングに関与
している。
【００３２】ＴＡＴＡボックス配列の突然変異の一例は
ＴＧＴＡＴＡＡであることができる。この突然変異の結
果として、正常なＴＢＰのＤＮＡ結合部位は最早認識さ
れず、コード遺伝子は最早効率的に転写されない。この
ような突然変異の場合には、転写因子をコードする遺伝
子は、同時突然変異ＴＢＰをコードする核酸配列であ
る。この同時突然変異（comutation）の結果、ＴＢＰは
突然変異したＴＡＴＡボックス（例えば、ＴＧＴＡＴＡ
Ａ）に結合し、これによって構造遺伝子が効率的に転写
される。ＴＢＰ遺伝子のこのような同時突然変異は、例
えばStrubin andStruhl (Cell, 68, 721 (1992)) およ
びHeard et al. (EMBO J., 12, 3519 (1993)) によって
記載されている。
ＴＧＴＡＴＡＡであることができる。この突然変異の結
果として、正常なＴＢＰのＤＮＡ結合部位は最早認識さ
れず、コード遺伝子は最早効率的に転写されない。この
ような突然変異の場合には、転写因子をコードする遺伝
子は、同時突然変異ＴＢＰをコードする核酸配列であ
る。この同時突然変異（comutation）の結果、ＴＢＰは
突然変異したＴＡＴＡボックス（例えば、ＴＧＴＡＴＡ
Ａ）に結合し、これによって構造遺伝子が効率的に転写
される。ＴＢＰ遺伝子のこのような同時突然変異は、例
えばStrubin andStruhl (Cell, 68, 721 (1992)) およ
びHeard et al. (EMBO J., 12, 3519 (1993)) によって
記載されている。
【００３３】特に好ましい態様は、(1) ＴＡＴＡボッ
クスを含むｃｄｃ２５Ｂ遺伝子の新規なプロモーターで
あって、ＴＡＴＡボックスの配列が突然変異してＴＧＴ
Ａとなっているもの、(2) 配列ＧＣＣＡＣＣ、(3)
免疫グロブリンシグナルペプチドについてのｃＤＮＡ
（ヌクレオチド配列＜６３〜＞１０７）、(4) β−グ
ルクロニダーゼのｃＤＮＡ（ヌクレオチド配列＜９３〜
＞１９８２）、(5) ｖＷＦ遺伝子のプロモーター（ヌ
クレオチド配列−４８７〜＋２４７）、および(6) Ｔ
ＡＴＡボックス結合タンパク質についてのｃＤＮＡ（核
酸配列１〜１００１であって、核酸位置８６２（ＡがＴ
で置換）、８８９および８９０（ＧＴがＡＣで置換）、
および８９５（ＣがＧで置換）で突然変異しているも
の）を含んでなる。
クスを含むｃｄｃ２５Ｂ遺伝子の新規なプロモーターで
あって、ＴＡＴＡボックスの配列が突然変異してＴＧＴ
Ａとなっているもの、(2) 配列ＧＣＣＡＣＣ、(3)
免疫グロブリンシグナルペプチドについてのｃＤＮＡ
（ヌクレオチド配列＜６３〜＞１０７）、(4) β−グ
ルクロニダーゼのｃＤＮＡ（ヌクレオチド配列＜９３〜
＞１９８２）、(5) ｖＷＦ遺伝子のプロモーター（ヌ
クレオチド配列−４８７〜＋２４７）、および(6) Ｔ
ＡＴＡボックス結合タンパク質についてのｃＤＮＡ（核
酸配列１〜１００１であって、核酸位置８６２（ＡがＴ
で置換）、８８９および８９０（ＧＴがＡＣで置換）、
および８９５（ＣがＧで置換）で突然変異しているも
の）を含んでなる。
【００３４】本発明のもう一つの好ましい態様では、新
規なプロモーターと少なくとも１個の別のプロモーター
との組み合わせについての核酸構築物であって、核保持
シグナルと輸出因子を有する多重プロモーターと呼ば
れ、下記の成分 a) 第一の非特異的、細胞特異的またはウイルス特異的
プロモーターまたはエンハンサー配列(I) であって、代
謝的および／または細胞サイクル特異的に活性化するこ
とができかつ構造遺伝子の基本転写を活性化するもの、 b) 構造遺伝子、 c) 核保持シグナル（ＮＲＳ）であって、そのｃＤＮＡ
が直接または間接的にその５′末端で構造遺伝子の３′
末端に結合し、核保持シグナルの転写生成物は核輸出因
子を結合するための構造を有するもの、 d) もう一つのプロモーターまたはエンハンサー配列(I
I)であって、核輸出因子（ＮＥＦ）の基本転写を活性化
するもの、および e) 核保持シグナルの転写生成物に結合し、これによっ
て細胞核からの構造遺伝子の転写生成物の輸送を仲介す
る核輸出因子（ＮＥＦ）をコードする核酸 を含んでなるものが選択される。
規なプロモーターと少なくとも１個の別のプロモーター
との組み合わせについての核酸構築物であって、核保持
シグナルと輸出因子を有する多重プロモーターと呼ば
れ、下記の成分 a) 第一の非特異的、細胞特異的またはウイルス特異的
プロモーターまたはエンハンサー配列(I) であって、代
謝的および／または細胞サイクル特異的に活性化するこ
とができかつ構造遺伝子の基本転写を活性化するもの、 b) 構造遺伝子、 c) 核保持シグナル（ＮＲＳ）であって、そのｃＤＮＡ
が直接または間接的にその５′末端で構造遺伝子の３′
末端に結合し、核保持シグナルの転写生成物は核輸出因
子を結合するための構造を有するもの、 d) もう一つのプロモーターまたはエンハンサー配列(I
I)であって、核輸出因子（ＮＥＦ）の基本転写を活性化
するもの、および e) 核保持シグナルの転写生成物に結合し、これによっ
て細胞核からの構造遺伝子の転写生成物の輸送を仲介す
る核輸出因子（ＮＥＦ）をコードする核酸 を含んでなるものが選択される。
【００３５】本発明の意味においては、プロモーター成
分の少なくとも１個は、新規なプロモーターを構成す
る。
分の少なくとも１個は、新規なプロモーターを構成す
る。
【００３６】第一の(I) プロモーターまたはエンハンサ
ー配列(a) および第二の(II)プロモーターまたはエンハ
ンサー配列(d) は同一でもまたは異なっていてもよく、
適当な場合には、非特異的、細胞特異的、ウイルス特異
的または代謝的に、特に低酸素症により活性化可能であ
り、または別の細胞サイクル特異的なプロモーターを構
成することができる。
ー配列(a) および第二の(II)プロモーターまたはエンハ
ンサー配列(d) は同一でもまたは異なっていてもよく、
適当な場合には、非特異的、細胞特異的、ウイルス特異
的または代謝的に、特に低酸素症により活性化可能であ
り、または別の細胞サイクル特異的なプロモーターを構
成することができる。
【００３７】個々の成分の配列は、例えば図２に示され
ている。
ている。
【００３８】新規な核酸構築物において、成分d)および
e)は成分a)、b)およびc)の上流または下流に配置するこ
ともできる（図２も同様に参照されたい）。
e)は成分a)、b)およびc)の上流または下流に配置するこ
ともできる（図２も同様に参照されたい）。
【００３９】好ましくは、核保持シグナル（ＮＲＳ）を
コードする遺伝子は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のｒ
ｅｖ応答性要素（ＲＲＥ）、レトロウイルスのＲＲＥ等
価保持シグナルまたはＨＢＶのＲＲＥ等価保持シグナル
から選択される。
コードする遺伝子は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のｒ
ｅｖ応答性要素（ＲＲＥ）、レトロウイルスのＲＲＥ等
価保持シグナルまたはＨＢＶのＲＲＥ等価保持シグナル
から選択される。
【００４０】核輸出因子（ＮＥＦ）をコードする遺伝子
は、好ましくはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２ウイルス、
ビスナ−マエディ（visna-maedi）ウイルス、ヤギ関節
炎脳炎ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ネコ免疫不
全症ウイルス、レトロウイルスまたはＨＴＬＶのｒｅｖ
遺伝子、ｈｎＲＮＰ−Ａ１タンパク質をコードする遺伝
子、または転写因子ＴＦIII −Ａをコードする遺伝子か
ら選択される。
は、好ましくはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２ウイルス、
ビスナ−マエディ（visna-maedi）ウイルス、ヤギ関節
炎脳炎ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ネコ免疫不
全症ウイルス、レトロウイルスまたはＨＴＬＶのｒｅｖ
遺伝子、ｈｎＲＮＰ−Ａ１タンパク質をコードする遺伝
子、または転写因子ＴＦIII −Ａをコードする遺伝子か
ら選択される。
【００４１】もう一つの好ましい態様では、新規な核酸
構築物における少なくとも１個のプロモーターまたはエ
ンハンサー配列（成分a)またはd)）は、アクティベータ
ー応答性プロモーター単位と呼ばれ、好ましくは下記の
成分
構築物における少なくとも１個のプロモーターまたはエ
ンハンサー配列（成分a)またはd)）は、アクティベータ
ー応答性プロモーター単位と呼ばれ、好ましくは下記の
成分
【００４２】f) 例えば、細胞サイクル特異的、細胞増
殖依存性、代謝的、細胞特異的またはウイルス特異的
に、または細胞サイクル特異的および代謝的、細胞特異
的またはウイルス特異的に（いわゆるキメラプロモータ
ー）活性化することができる１種類以上の同一または異
なるプロモーターまたはエンハンサー配列、
殖依存性、代謝的、細胞特異的またはウイルス特異的
に、または細胞サイクル特異的および代謝的、細胞特異
的またはウイルス特異的に（いわゆるキメラプロモータ
ー）活性化することができる１種類以上の同一または異
なるプロモーターまたはエンハンサー配列、
【００４３】g) それぞれの場合にプロモーターまたは
エンハンサー配列の下流に配置され、その基本転写がこ
れらの配列によって活性化される１種類以上の同一また
は異なるアクティベーターサブユニット、
エンハンサー配列の下流に配置され、その基本転写がこ
れらの配列によって活性化される１種類以上の同一また
は異なるアクティベーターサブユニット、
【００４４】h) １種類以上のアクティベーターサブユ
ニットの発現生成物によって活性化されるアクティベー
ター応答性プロモーター（activator-responsive promo
ter）を含んでなるものである。
ニットの発現生成物によって活性化されるアクティベー
ター応答性プロモーター（activator-responsive promo
ter）を含んでなるものである。
【００４５】好ましいアクティベーター応答性プロモー
ター単位の個々の成分の配置は、図３に示されている。
ター単位の個々の成分の配置は、図３に示されている。
【００４６】好ましいアクティベーター応答性プロモー
ター単位の新規な核酸構築物への挿入は、例えば図４に
示される。
ター単位の新規な核酸構築物への挿入は、例えば図４に
示される。
【００４７】図３）および４）に例として示されている
これらのアクティベーター応答性プロモーター単位で
は、少なくとも１個のプロモーター（Ｉ、II、III また
はIV）が新規なプロモーターを構成することができる。
これらのアクティベーター応答性プロモーター単位で
は、少なくとも１個のプロモーター（Ｉ、II、III また
はIV）が新規なプロモーターを構成することができる。
【００４８】好ましい態様では、アクティベーター応答
性プロモーター単位は、ＤＮＡ結合ドメイン、タンパク
質／タンパク質相互作用ドメイン、およびトランス活性
化ドメインからなるキメラ転写因子についての結合配列
を構成することができる。本発明で記載される総ての転
写因子結合部位は、１回だけ（モノマー）または数個の
コピー（マルチマー、例えば約１０コピーまで）に含ま
れることができる。
性プロモーター単位は、ＤＮＡ結合ドメイン、タンパク
質／タンパク質相互作用ドメイン、およびトランス活性
化ドメインからなるキメラ転写因子についての結合配列
を構成することができる。本発明で記載される総ての転
写因子結合部位は、１回だけ（モノマー）または数個の
コピー（マルチマー、例えば約１０コピーまで）に含ま
れることができる。
【００４９】ＳＶ４０プロモーターと組み合わせるＬｅ
ｘＡオペレーターは、２個のアクティベーターサブユニ
ット（ｇおよびｇ′）によって活性化されるアクティベ
ーター応答性プロモーター(h) の一例である。
ｘＡオペレーターは、２個のアクティベーターサブユニ
ット（ｇおよびｇ′）によって活性化されるアクティベ
ーター応答性プロモーター(h) の一例である。
【００５０】このプロモーターは、例えば下記のアクテ
ィベーターサブユニット、(1) 第一のアクティベータ
ーサブユニット(g) は、３′末端がＧａｌ８０タンパク
質（アミノ酸１〜４３５）をコードするｃＤＮＡの５′
末端に結合しているＬｅｘＡ ＤＮＡ結合タンパク質の
アミノ酸１〜８１または１〜２０２をコードするｃＤＮ
Ａを含み、および(2) 第二のアクティベーターサブユ
ニット(g')は、アミノ酸８５１〜８８１をコードするＧ
ａｌ４タンパク質のＧａｌ８０結合ドメインをコードす
るｃＤＮＡを含み、その３′末端はＳＶ４０ラージＴ抗
原のアミノ酸１２６〜１３２をコードするｃＤＮＡの
５′末端に連結し、その３′末端はＨＳＶ−１ ＶＰ１
６のトランス活性化ドメインのアミノ酸４０６〜４８８
をコードするｃＤＮＡの５′末端に連結しているものを
含む。
ィベーターサブユニット、(1) 第一のアクティベータ
ーサブユニット(g) は、３′末端がＧａｌ８０タンパク
質（アミノ酸１〜４３５）をコードするｃＤＮＡの５′
末端に結合しているＬｅｘＡ ＤＮＡ結合タンパク質の
アミノ酸１〜８１または１〜２０２をコードするｃＤＮ
Ａを含み、および(2) 第二のアクティベーターサブユ
ニット(g')は、アミノ酸８５１〜８８１をコードするＧ
ａｌ４タンパク質のＧａｌ８０結合ドメインをコードす
るｃＤＮＡを含み、その３′末端はＳＶ４０ラージＴ抗
原のアミノ酸１２６〜１３２をコードするｃＤＮＡの
５′末端に連結し、その３′末端はＨＳＶ−１ ＶＰ１
６のトランス活性化ドメインのアミノ酸４０６〜４８８
をコードするｃＤＮＡの５′末端に連結しているものを
含む。
【００５１】ＳＶ４０プロモーターと組み合わされるＧ
ａｌ４タンパク質についての結合配列は、２個のアクテ
ィベーターサブユニット（g およびg'）によって活性化
されるアクティベーター応答性プロモーターのもう一つ
の例である。
ａｌ４タンパク質についての結合配列は、２個のアクテ
ィベーターサブユニット（g およびg'）によって活性化
されるアクティベーター応答性プロモーターのもう一つ
の例である。
【００５２】このプロモーターは、例えば下記のアクテ
ィベーターサブユニットを含んでいる。 (1) 第一のアクティベーターサブユニット(g) は、Ｇ
ａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１〜
１４７）をコードするｃＤＮＡを含み、その３′末端は
Ｇａｌ８０タンパク質（アミノ酸１〜４３５）について
のｃＤＮＡの５′末端に連結しており、(2) 第二のア
クティベーターサブユニット(g')は、Ｇａｌ４のＧａｌ
８０結合ドメイン（アミノ酸８５１〜８８１）をコード
するｃＤＮＡを含み、その３′末端はＳＶ４０核局在化
シグナルＳＶ４０（ＳＶ４０ラージＴ、アミノ酸１２６
〜１３２）をコードするｃＤＮＡの５′末端に連結して
おり、その３′末端はＨＳＶ−１ ＶＰ１６のトランス
活性化ドメインのアミノ酸４０６〜４８８をコードする
ｃＤＮＡの５′末端に連結している。
ィベーターサブユニットを含んでいる。 (1) 第一のアクティベーターサブユニット(g) は、Ｇ
ａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１〜
１４７）をコードするｃＤＮＡを含み、その３′末端は
Ｇａｌ８０タンパク質（アミノ酸１〜４３５）について
のｃＤＮＡの５′末端に連結しており、(2) 第二のア
クティベーターサブユニット(g')は、Ｇａｌ４のＧａｌ
８０結合ドメイン（アミノ酸８５１〜８８１）をコード
するｃＤＮＡを含み、その３′末端はＳＶ４０核局在化
シグナルＳＶ４０（ＳＶ４０ラージＴ、アミノ酸１２６
〜１３２）をコードするｃＤＮＡの５′末端に連結して
おり、その３′末端はＨＳＶ−１ ＶＰ１６のトランス
活性化ドメインのアミノ酸４０６〜４８８をコードする
ｃＤＮＡの５′末端に連結している。
【００５３】Ｇａｌ４タンパク質とＳＶ４０プロモータ
ーを結合する配列を含むアクティベーター応答性プロモ
ーターを活性化する２個のアクティベーターサブユニッ
ト（g およびg'）のもう一つの例は、下記のものであ
る。 (1) ＣＤ４Ｔ細胞抗原の細胞質ドメインをコードする
ｃＤＮＡを含むものであって（アミノ酸３９７〜４３
５）、その５′末端がＨＳＶ−１ＶＰ１６のトランス活
性化ドメイン（アミノ酸４０６〜４８８）についてのｃ
ＤＮＡの３′末端に連結し、その５′末端は更にＳＶ４
０核局在化シグナル（ＳＶ４０ラージＴ、アミノ酸１６
〜１３２）についてのｃＤＮＡの３′末端に連結してい
るもの、および(2) ＳＶ４０核局在化シグナル（ＳＶ
４０ラージＴ、アミノ酸１２６〜１３２）をコードする
ｃＤＮＡとＧａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン
（アミノ酸１〜１４７）についてのｃＤＮＡを含む活性
化単位(g')であって、その３′末端がｐ５６ ｌｃｋタ
ンパク質のＣＤ４結合配列（アミノ酸１〜７１）につい
てのｃＤＮＡの５′末端に連結しているもの。
ーを結合する配列を含むアクティベーター応答性プロモ
ーターを活性化する２個のアクティベーターサブユニッ
ト（g およびg'）のもう一つの例は、下記のものであ
る。 (1) ＣＤ４Ｔ細胞抗原の細胞質ドメインをコードする
ｃＤＮＡを含むものであって（アミノ酸３９７〜４３
５）、その５′末端がＨＳＶ−１ＶＰ１６のトランス活
性化ドメイン（アミノ酸４０６〜４８８）についてのｃ
ＤＮＡの３′末端に連結し、その５′末端は更にＳＶ４
０核局在化シグナル（ＳＶ４０ラージＴ、アミノ酸１６
〜１３２）についてのｃＤＮＡの３′末端に連結してい
るもの、および(2) ＳＶ４０核局在化シグナル（ＳＶ
４０ラージＴ、アミノ酸１２６〜１３２）をコードする
ｃＤＮＡとＧａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン
（アミノ酸１〜１４７）についてのｃＤＮＡを含む活性
化単位(g')であって、その３′末端がｐ５６ ｌｃｋタ
ンパク質のＣＤ４結合配列（アミノ酸１〜７１）につい
てのｃＤＮＡの５′末端に連結しているもの。
【００５４】したがって、好ましい態様は、(1) 基本
転写がプロモーターまたはエンハンサーによって活性化
される１個以上の同一または異なるアクティベーターサ
ブユニット、および(2) 上記アクティベーターサブユ
ニットの発現生成物によって活性化されるアクティベー
ター応答性プロモーターを含み、特に好ましい態様は、
アクティベーターサブユニット(A) として(1) 新規な
プロモーター、(2) ＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬ
Ｓ）（ＳＶ４０ラージＴ、アミノ酸１２６〜１３２；Ｐ
ＫＫＫＲＫＶ）、(3) ＨＳＶ−１ ＶＰ１６酸トラン
ス活性化ドメイン（ＴＡＤ）（アミノ酸４０６〜４８
８）、および(4) ＣＤ４糖タンパク質の細胞質部分を
（アミノ酸３９７〜４３５）をコードするｃＤＮＡと、
もう一つのアクティベーターサブユニット(B) として
(1) ｃｄｃ２５Ｃ遺伝子のプロモーター（核酸−２９
０〜＋１２１）、(2) ＳＶ４０核局在化シグナル（Ｎ
ＬＳ）（ＳＶ４０ラージＴ；アミノ酸１２６〜１３２
ＰＫＫＫＲＫＶ）、(3) Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ
結合ドメインについてのｃＤＮＡ（アミノ酸１〜１４
７）、および(4) ｐ５６ ｌｃｋタンパク質のＣＤ４
結合配列についてのｃＤＮＡ（アミノ酸１〜７１）と、
ＧＡＬ４結合タンパク質についての結合配列の約１０コ
ピー間でを含み、ヌクレオチド配列５′−ＣＧＧＡＣＡ
ＡＴＧＴＴＧＡＣＣＧ−３′を有するアクティベーター
応答性プロモーター、と、基本ＳＶ４０プロモーター
（ヌクレオチド配列４８〜５１９１）と、適当な場合に
は、構造遺伝子、好ましくは完全なｃＤＮＡであって、
活性化合物、酵素、またはリガンドと活性化合物、また
はリガンドと酵素とを含んでなる融合タンパク質をコー
ドするものを含む核酸構築物である。
転写がプロモーターまたはエンハンサーによって活性化
される１個以上の同一または異なるアクティベーターサ
ブユニット、および(2) 上記アクティベーターサブユ
ニットの発現生成物によって活性化されるアクティベー
ター応答性プロモーターを含み、特に好ましい態様は、
アクティベーターサブユニット(A) として(1) 新規な
プロモーター、(2) ＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬ
Ｓ）（ＳＶ４０ラージＴ、アミノ酸１２６〜１３２；Ｐ
ＫＫＫＲＫＶ）、(3) ＨＳＶ−１ ＶＰ１６酸トラン
ス活性化ドメイン（ＴＡＤ）（アミノ酸４０６〜４８
８）、および(4) ＣＤ４糖タンパク質の細胞質部分を
（アミノ酸３９７〜４３５）をコードするｃＤＮＡと、
もう一つのアクティベーターサブユニット(B) として
(1) ｃｄｃ２５Ｃ遺伝子のプロモーター（核酸−２９
０〜＋１２１）、(2) ＳＶ４０核局在化シグナル（Ｎ
ＬＳ）（ＳＶ４０ラージＴ；アミノ酸１２６〜１３２
ＰＫＫＫＲＫＶ）、(3) Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ
結合ドメインについてのｃＤＮＡ（アミノ酸１〜１４
７）、および(4) ｐ５６ ｌｃｋタンパク質のＣＤ４
結合配列についてのｃＤＮＡ（アミノ酸１〜７１）と、
ＧＡＬ４結合タンパク質についての結合配列の約１０コ
ピー間でを含み、ヌクレオチド配列５′−ＣＧＧＡＣＡ
ＡＴＧＴＴＧＡＣＣＧ−３′を有するアクティベーター
応答性プロモーター、と、基本ＳＶ４０プロモーター
（ヌクレオチド配列４８〜５１９１）と、適当な場合に
は、構造遺伝子、好ましくは完全なｃＤＮＡであって、
活性化合物、酵素、またはリガンドと活性化合物、また
はリガンドと酵素とを含んでなる融合タンパク質をコー
ドするものを含む核酸構築物である。
【００５５】原則として、構造遺伝子は、酵素、融合タ
ンパク質、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、サイ
トカインのレセプター、ケモカインのレセプター、成長
因子のレセプター、増殖抑制または細胞増殖抑制または
アポプトーシス作用を有するペプチドまたはタンパク
質、抗体または抗体断片、血管新生インヒビター、ペプ
チドホルモン、凝固因子、凝固インヒビター、フィブリ
ン溶解ペプチドまたはタンパク質、血液循環に効果を有
するペプチドまたはタンパク質、血漿タンパク質、感染
性物質の抗原、例えば細菌性抗原および寄生生物抗原、
細胞の抗原または腫瘍の抗原から選択されるのが好まし
く、抗原は免疫反応、血栓誘発物質、補体活性化タンパ
ク質、ウイルスコートタンパク質および／またはリボザ
イムを生じる。
ンパク質、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、サイ
トカインのレセプター、ケモカインのレセプター、成長
因子のレセプター、増殖抑制または細胞増殖抑制または
アポプトーシス作用を有するペプチドまたはタンパク
質、抗体または抗体断片、血管新生インヒビター、ペプ
チドホルモン、凝固因子、凝固インヒビター、フィブリ
ン溶解ペプチドまたはタンパク質、血液循環に効果を有
するペプチドまたはタンパク質、血漿タンパク質、感染
性物質の抗原、例えば細菌性抗原および寄生生物抗原、
細胞の抗原または腫瘍の抗原から選択されるのが好まし
く、抗原は免疫反応、血栓誘発物質、補体活性化タンパ
ク質、ウイルスコートタンパク質および／またはリボザ
イムを生じる。
【００５６】リボザイムの場合には、構造遺伝子は、好
ましくは細胞サイクル制御タンパク質、特にサイクリン
Ａ、サイクリンＢ、サイクリンＤ１、サイクリンＥ、Ｅ
２Ｆ１−５、ｃｄｃ２、ｃｄｃ２５ＣまたはＤＰ１、ウ
イルスタンパク質、サイトカイン、成長因子、またはそ
れらのレセプターから選択されるタンパク質をコートす
るｍＲＮＡを不活性化するリボザイムをコートする遺伝
子である。
ましくは細胞サイクル制御タンパク質、特にサイクリン
Ａ、サイクリンＢ、サイクリンＤ１、サイクリンＥ、Ｅ
２Ｆ１−５、ｃｄｃ２、ｃｄｃ２５ＣまたはＤＰ１、ウ
イルスタンパク質、サイトカイン、成長因子、またはそ
れらのレセプターから選択されるタンパク質をコートす
るｍＲＮＡを不活性化するリボザイムをコートする遺伝
子である。
【００５７】もう一つの好ましい態様では、構造遺伝子
は、薬剤の前駆物質を開裂して薬剤とする酵素をコート
する遺伝子であることができる。もう一つの好ましい態
様では、構造遺伝子はリガンド／エフェクター融合タン
パク質をコートすることができ、リガンドは抗体、抗体
断片、サイトカイン、成長因子、接着分子またはペプチ
ドホルモンであることが可能であり、エフェクターは上
記のような薬理活性化合物、または酵素であることがで
きる。例えば、構造遺伝子はリガンド／酵素融合タンパ
ク質をコートすることができ、酵素は薬剤の前駆物質を
開裂して薬剤とし、リガンドは細胞表面、好ましくは内
皮細胞または腫瘍細胞に結合する。
は、薬剤の前駆物質を開裂して薬剤とする酵素をコート
する遺伝子であることができる。もう一つの好ましい態
様では、構造遺伝子はリガンド／エフェクター融合タン
パク質をコートすることができ、リガンドは抗体、抗体
断片、サイトカイン、成長因子、接着分子またはペプチ
ドホルモンであることが可能であり、エフェクターは上
記のような薬理活性化合物、または酵素であることがで
きる。例えば、構造遺伝子はリガンド／酵素融合タンパ
ク質をコートすることができ、酵素は薬剤の前駆物質を
開裂して薬剤とし、リガンドは細胞表面、好ましくは内
皮細胞または腫瘍細胞に結合する。
【００５８】核酸構築物は、好ましくはＤＮＡを含んで
なる。核酸構築物という用語は、一般には標的細胞に転
写することができる核酸を含んでなる人工構造と理解さ
れる。それらは、好ましくはベクター、特に好ましくは
プラスミドベクターまたはウイルスベクターに挿入され
る。
なる。核酸構築物という用語は、一般には標的細胞に転
写することができる核酸を含んでなる人工構造と理解さ
れる。それらは、好ましくはベクター、特に好ましくは
プラスミドベクターまたはウイルスベクターに挿入され
る。
【００５９】一般には、これらのベクターは、患者に、
外部または内部的に、局部的、経口、膀胱内、鼻内、気
管支内、筋肉内、皮下的に体腔に、器官に、血液循環
に、気管に、消化管に、および／または尿生殖器に投与
され、かつ疾患の予防または治療に用いられる。
外部または内部的に、局部的、経口、膀胱内、鼻内、気
管支内、筋肉内、皮下的に体腔に、器官に、血液循環
に、気管に、消化管に、および／または尿生殖器に投与
され、かつ疾患の予防または治療に用いられる。
【００６０】新規な核酸構築物を用いて、構造遺伝子を
細胞特異的に、ウイルス特異的に、所定の代謝条件下で
および／または細胞サイクル特異的に発現させることが
でき、構造遺伝子は好ましくは薬理活性化合物、または
薬剤の不活性な前駆物質を開裂して活性薬剤とする酵素
をコードする遺伝子である。構造遺伝子は、薬理活性化
合物または酵素が、融合タンパク質としてのリガンドと
共に発現されるように選択することができ、このリガン
ドは細胞、例えば増殖する内皮細胞または腫瘍細胞の表
面に結合する。
細胞特異的に、ウイルス特異的に、所定の代謝条件下で
および／または細胞サイクル特異的に発現させることが
でき、構造遺伝子は好ましくは薬理活性化合物、または
薬剤の不活性な前駆物質を開裂して活性薬剤とする酵素
をコードする遺伝子である。構造遺伝子は、薬理活性化
合物または酵素が、融合タンパク質としてのリガンドと
共に発現されるように選択することができ、このリガン
ドは細胞、例えば増殖する内皮細胞または腫瘍細胞の表
面に結合する。
【００６１】本発明は、新規な核酸構築物の製造法であ
って、核酸構築物の個々の成分が互いに接続しているこ
とを特徴とする方法にも関する。個々の成分の接続は、
一般に知られている方法を用いて、例えばリガーゼを用
いて酵素的に行なうことができる。
って、核酸構築物の個々の成分が互いに接続しているこ
とを特徴とする方法にも関する。個々の成分の接続は、
一般に知られている方法を用いて、例えばリガーゼを用
いて酵素的に行なうことができる。
【００６２】本発明は、細胞、特に酵母または哺乳動物
細胞であって、新規な核酸構築物を有するものにも関す
る。特に好ましい態様では、核酸構築物を細胞系に導入
し、次いでこれをトランスフェクションの後に、トラン
スジーンを発現するのに用いることができる。これらの
細胞は、続いて患者用の薬剤を提供するのに用いること
ができる。新規な核酸構築物の好ましい使用は、核酸構
築物を標的細胞に導入し、この構築物をウイルス特異的
または標的細胞特異的または代謝特異的または非特異的
に、かつ細胞サイクル特異的に発現することを含んでな
る薬剤の提供により疾患を治療することを特徴とする。
一般に、投与は、新規な核酸構築物の場合と精確に同様
に行われ、疾患の予防または治療にも同様に用いられ
る。
細胞であって、新規な核酸構築物を有するものにも関す
る。特に好ましい態様では、核酸構築物を細胞系に導入
し、次いでこれをトランスフェクションの後に、トラン
スジーンを発現するのに用いることができる。これらの
細胞は、続いて患者用の薬剤を提供するのに用いること
ができる。新規な核酸構築物の好ましい使用は、核酸構
築物を標的細胞に導入し、この構築物をウイルス特異的
または標的細胞特異的または代謝特異的または非特異的
に、かつ細胞サイクル特異的に発現することを含んでな
る薬剤の提供により疾患を治療することを特徴とする。
一般に、投与は、新規な核酸構築物の場合と精確に同様
に行われ、疾患の予防または治療にも同様に用いられ
る。
【００６３】薬剤を調製するには、例えば内皮細胞を血
液から単離して、イン・ビトロで新規な核酸構築物でト
ランスフェクションした後、それらを患者に、例えば静
脈内に再度注射することができる。
液から単離して、イン・ビトロで新規な核酸構築物でト
ランスフェクションした後、それらを患者に、例えば静
脈内に再度注射することができる。
【００６４】イン・ビトロでトランスフェクションした
細胞は、新規なベクターと組み合わせて患者に投与する
こともできる。この組み合わせは、細胞およびベクター
をそれぞれの場合に同時または異なる時間に、かつ同一
または異なる部位に糖よまたは注射することができると
いう利点を有する。
細胞は、新規なベクターと組み合わせて患者に投与する
こともできる。この組み合わせは、細胞およびベクター
をそれぞれの場合に同時または異なる時間に、かつ同一
または異なる部位に糖よまたは注射することができると
いう利点を有する。
【００６５】したがって、本発明は、新規な核酸構築物
または新規な細胞を使用して、腫瘍疾患、白血病、自己
免疫疾患、アレルギー、関節炎、炎症、臓器拒絶反応、
移植片対宿主の反応、血液凝固疾患、循環器疾患、貧
血、感染症、ホルモン疾患および／またはＣＮＳ損傷か
ら選択される疾患の治療のための薬剤を製造することに
も関する。内皮細胞を用いて、新規な薬剤を製造するの
が特に好ましい。
または新規な細胞を使用して、腫瘍疾患、白血病、自己
免疫疾患、アレルギー、関節炎、炎症、臓器拒絶反応、
移植片対宿主の反応、血液凝固疾患、循環器疾患、貧
血、感染症、ホルモン疾患および／またはＣＮＳ損傷か
ら選択される疾患の治療のための薬剤を製造することに
も関する。内皮細胞を用いて、新規な薬剤を製造するの
が特に好ましい。
【００６６】新規な核酸構築物は、天然ではこの形態で
存在せず、すなわち構造遺伝子は天然では新規なプロモ
ーターと結合しない。
存在せず、すなわち構造遺伝子は天然では新規なプロモ
ーターと結合しない。
【００６７】それぞれの場合の用途により、プロモータ
ーおよび構造遺伝子の選択が決定される。下記の例は、
これに関する指針として利用できる。
ーおよび構造遺伝子の選択が決定される。下記の例は、
これに関する指針として利用できる。
【００６８】ＷＯ９６／０６９４０号、ＷＯ９６／０６
９３８号、ＷＯ９６／０６９４１号、ＷＯ９６／０６９
３９号、ＤＥ１９６０５２７４．２号、ＤＥ１９６１７
８５１．７号、ＤＥ１９６３９１０３．２号およびＤＥ
１９６５１４４３．６号明細書には、個々の成分が詳細
に説明されている。
９３８号、ＷＯ９６／０６９４１号、ＷＯ９６／０６９
３９号、ＤＥ１９６０５２７４．２号、ＤＥ１９６１７
８５１．７号、ＤＥ１９６３９１０３．２号およびＤＥ
１９６５１４４３．６号明細書には、個々の成分が詳細
に説明されている。
【００６９】I) プロモーター配列 本発明の意味では、一般に転写因子を結合した後に、
３′末端に隣接する構造遺伝子の転写を活性化するヌク
レオチド配列はプロモーター配列として用いられるもの
である（成分a)、c)、f)またはf') ）。ｃｄｃ２５Ｂプ
ロモーターと結合する（複数の）プロモーター配列の選
択は、治療を行なう疾患および形質導入される標的細胞
によって変化する。したがって、追加のプロモーター配
列は、制限なしで、標的細胞特異的に、定義された代謝
条件下で、細胞サイクル特異的に、またはウイルス特異
的に活性化することが可能である。更に、同一または異
なるプロモーター配列を、成分a)、c)、f)および／また
はf') に用いることができる。選択されるプロモーター
配列の例は、制限なしで活性化することができるプロモ
ーターおよびアクティベーター配列、例えばＲＮＡポリ
メラーゼIII のプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼIIの
プロモーター、ＣＭＶプロモーター、およびＣＭＶエン
ハンサー、またはＳＶ４０プロモーター；ウイルスプロ
モーター配列およびアクティベーター配列、例えばＨＢ
Ｖ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶまたは
ＨＩＶのものである。ＨＩＶプロモーターを用いるとき
には、ウイルス特異的プロモーターとしてＴＡＲ配列
［位置−４５３〜−８０、Rosen etal., Cell 41, 813
(1985)]を含む全ＬＴＲ配列を用いることが好ましい。
３′末端に隣接する構造遺伝子の転写を活性化するヌク
レオチド配列はプロモーター配列として用いられるもの
である（成分a)、c)、f)またはf') ）。ｃｄｃ２５Ｂプ
ロモーターと結合する（複数の）プロモーター配列の選
択は、治療を行なう疾患および形質導入される標的細胞
によって変化する。したがって、追加のプロモーター配
列は、制限なしで、標的細胞特異的に、定義された代謝
条件下で、細胞サイクル特異的に、またはウイルス特異
的に活性化することが可能である。更に、同一または異
なるプロモーター配列を、成分a)、c)、f)および／また
はf') に用いることができる。選択されるプロモーター
配列の例は、制限なしで活性化することができるプロモ
ーターおよびアクティベーター配列、例えばＲＮＡポリ
メラーゼIII のプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼIIの
プロモーター、ＣＭＶプロモーター、およびＣＭＶエン
ハンサー、またはＳＶ４０プロモーター；ウイルスプロ
モーター配列およびアクティベーター配列、例えばＨＢ
Ｖ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶまたは
ＨＩＶのものである。ＨＩＶプロモーターを用いるとき
には、ウイルス特異的プロモーターとしてＴＡＲ配列
［位置−４５３〜−８０、Rosen etal., Cell 41, 813
(1985)]を含む全ＬＴＲ配列を用いることが好ましい。
【００７０】プロモーター配列としては、更に代謝によ
り活性化可能なプロモーターおよびエンハンサー配列、
例えば低酸素症によって誘導されるエンハンサー(Semen
za et al., PNAS 88, 5680 (1991); McBurney et al.,
Nucl. Acids Res. 19, 5755(1991));細胞サイクル特異
的に活性化可能なプロモーター、例えばｃｄｃ２５Ｃ遺
伝子、サイクリンＡ遺伝子、ｃｄｃ２遺伝子、Ｂ−ｍｙ
ｂ遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子またはＥ２Ｆ−１遺伝子のプ
ロモーター、または細胞増殖中に現れるまたは活性化さ
れる転写因子についての結合配列、例えばｃ−ｍｙｃタ
ンパク質についての結合配列であって、Ｍｙｃ Ｅボッ
クスと呼ばれるヌクレオチド配列のモノマーまたはマル
チマーを含む結合配列［５′−ＧＧＡＡＧＣＡＧＡＣＣ
ＡＣＧＴＧＧＴＣＴＧＣＴＴＣＣ−３′；Blackwood an
d Eisenmann, Science 251, 1211(1991) ］；テトラサ
イクリンにより活性化可能なプロモーター、例えば適当
なリプレッサーと組み合わせたテトラサイクリンオペレ
ーター；例えば、サプレッサータンパク質が結合するこ
とによって細胞サイクルのＧ０相およびＧ１相における
上流のアクティベーター配列の活性化を阻害することが
できるＣＤＥ−ＣＨＲまたはＥ２ＦＢＳ−ＣＨＲヌクレ
オチド配列を含む下流のプロモーターモジュールで細胞
特異的に、代謝的に、またはウイルス特異的に活性化す
ることができる上流のアクティベーター配列と組み合わ
せたテトラサイクリンオペレーター（ＷＯ９６／０６９
４３号明細書；Lucibello et al., EMBO J. 14, 12 (19
94));細胞特異的に活性化可能なプロモーター、例えば
選択された細胞で優先的に形成されるタンパク質をコー
ドする遺伝子のプロモーターまたはエンハンサーからの
プロモーターまたはアクティベーター配列が挙げられ
る。
り活性化可能なプロモーターおよびエンハンサー配列、
例えば低酸素症によって誘導されるエンハンサー(Semen
za et al., PNAS 88, 5680 (1991); McBurney et al.,
Nucl. Acids Res. 19, 5755(1991));細胞サイクル特異
的に活性化可能なプロモーター、例えばｃｄｃ２５Ｃ遺
伝子、サイクリンＡ遺伝子、ｃｄｃ２遺伝子、Ｂ−ｍｙ
ｂ遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子またはＥ２Ｆ−１遺伝子のプ
ロモーター、または細胞増殖中に現れるまたは活性化さ
れる転写因子についての結合配列、例えばｃ−ｍｙｃタ
ンパク質についての結合配列であって、Ｍｙｃ Ｅボッ
クスと呼ばれるヌクレオチド配列のモノマーまたはマル
チマーを含む結合配列［５′−ＧＧＡＡＧＣＡＧＡＣＣ
ＡＣＧＴＧＧＴＣＴＧＣＴＴＣＣ−３′；Blackwood an
d Eisenmann, Science 251, 1211(1991) ］；テトラサ
イクリンにより活性化可能なプロモーター、例えば適当
なリプレッサーと組み合わせたテトラサイクリンオペレ
ーター；例えば、サプレッサータンパク質が結合するこ
とによって細胞サイクルのＧ０相およびＧ１相における
上流のアクティベーター配列の活性化を阻害することが
できるＣＤＥ−ＣＨＲまたはＥ２ＦＢＳ−ＣＨＲヌクレ
オチド配列を含む下流のプロモーターモジュールで細胞
特異的に、代謝的に、またはウイルス特異的に活性化す
ることができる上流のアクティベーター配列と組み合わ
せたテトラサイクリンオペレーター（ＷＯ９６／０６９
４３号明細書；Lucibello et al., EMBO J. 14, 12 (19
94));細胞特異的に活性化可能なプロモーター、例えば
選択された細胞で優先的に形成されるタンパク質をコー
ドする遺伝子のプロモーターまたはエンハンサーからの
プロモーターまたはアクティベーター配列が挙げられ
る。
【００７１】細胞特異的に活性化可能なプロモーターの
例は、内皮細胞で活性化されるプロモーターおよびアク
ティベーター配列、例えば脳特異的な内皮グルコース−
１トランスポーター、エンドグリン、ＶＥＧＦレセプタ
ー１（ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦレセプター２（ｆｌｋ−
１またはＫＤＲ）、ｔｉｌ−１またはｔｉｌ−２、Ｂ６
１レセプター（Ｅｃｋレセプター）、Ｂ６１、エンドセ
リン、具体的にはエンドセリンＢまたはエンドセリン
１、エンドセリンレセプター、特にエンドセリンＢレセ
プター、マンノース６−ホスフェートレセプター、von
Willebrand因子、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１レ
セプター、血管細胞付着分子（ＶＣＡＭ−１）、または
例えば内皮細胞のような優先的または選択的に活性であ
る転写因子を結合するオリゴマー化した部位を含んでな
る合成アクティベーター配列である。一例は、転写因子
ＧＡＴＡ２であり、内皮１遺伝子における結合部位が
５′−ＴＴＡＴＣＴ−３′である(Lee et al., Biol. C
hem. 266, 16188 (1991), Dormann et al., J. Biol. C
hem. 267, 1279 (1992) およびWilson et al., Mol. Ce
ll Biol. 10, 4854 (1990)) 。他の細胞特異的に活性化
可能なプロモーターは、活性化した内皮細胞の近傍の細
胞で活性化されるプロモーターまたはアクティベーター
配列、例えばＶＥＧＦをコードする遺伝子のプロモータ
ーおよびアクティベーター配列であって、ＶＥＧＦ遺伝
子についての遺伝子調節配列は５′−隣接領域、３′−
隣接領域、ｃ−Ｓｒｃ遺伝子またはｖ−Ｓｒｃ遺伝子で
あるもの、またはステロイドホルモンレセプターおよび
それらのプロモーター要素(Truss and Beato, Endocr.
Rev. 14, 459 (1993))、特にマウス哺乳動物腫瘍ウイル
スプロモーターである。
例は、内皮細胞で活性化されるプロモーターおよびアク
ティベーター配列、例えば脳特異的な内皮グルコース−
１トランスポーター、エンドグリン、ＶＥＧＦレセプタ
ー１（ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦレセプター２（ｆｌｋ−
１またはＫＤＲ）、ｔｉｌ−１またはｔｉｌ−２、Ｂ６
１レセプター（Ｅｃｋレセプター）、Ｂ６１、エンドセ
リン、具体的にはエンドセリンＢまたはエンドセリン
１、エンドセリンレセプター、特にエンドセリンＢレセ
プター、マンノース６−ホスフェートレセプター、von
Willebrand因子、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１レ
セプター、血管細胞付着分子（ＶＣＡＭ−１）、または
例えば内皮細胞のような優先的または選択的に活性であ
る転写因子を結合するオリゴマー化した部位を含んでな
る合成アクティベーター配列である。一例は、転写因子
ＧＡＴＡ２であり、内皮１遺伝子における結合部位が
５′−ＴＴＡＴＣＴ−３′である(Lee et al., Biol. C
hem. 266, 16188 (1991), Dormann et al., J. Biol. C
hem. 267, 1279 (1992) およびWilson et al., Mol. Ce
ll Biol. 10, 4854 (1990)) 。他の細胞特異的に活性化
可能なプロモーターは、活性化した内皮細胞の近傍の細
胞で活性化されるプロモーターまたはアクティベーター
配列、例えばＶＥＧＦをコードする遺伝子のプロモータ
ーおよびアクティベーター配列であって、ＶＥＧＦ遺伝
子についての遺伝子調節配列は５′−隣接領域、３′−
隣接領域、ｃ−Ｓｒｃ遺伝子またはｖ−Ｓｒｃ遺伝子で
あるもの、またはステロイドホルモンレセプターおよび
それらのプロモーター要素(Truss and Beato, Endocr.
Rev. 14, 459 (1993))、特にマウス哺乳動物腫瘍ウイル
スプロモーターである。
【００７２】筋肉細胞、特に平滑筋細胞で活性化される
プロモーターまたはアクティベーター配列の例は、トロ
ポミオシン、α−アクチン、α−ミオシン、ＰＤＧＦレ
セプター、ＦＧＦレセプター、ＭＲＦ−４、ホスホフル
クトキナーゼＡ、ホスホグリセレートムターゼ、トロポ
ニンＣ、ミオゲニン、エンドセリンＡレセプター、デス
ミン、ＶＥＧＦをコードする遺伝子のプロモーターおよ
びアクティベーター配列であり、ＶＥＧＦ遺伝子につい
ての遺伝子調節配列は既に上記されており、または「人
工」プロモーターである。このような人工プロモーター
の例は、筋肉特異的なヘリックス−ループ−ヘリックス
（ＨＬＨ）タンパク質についての（ＤＮＡ）結合部位の
多重コピー、例えばＥボックス（ＭｙｏＤ）（例えば、
４×ＡＧＣＡＧＧＴＧＴＴＧＧＧＡＧＧＣ、配列番号：
１）、またはα−ミオシン重鎖遺伝子のＤＮＡジンクフ
ィンガーＧＡＴＡ４結合部位の多重コピー（例えば、
５′−ＧＧＣＣＧＡＴＧＧＧＣＡＧＡＴＡＧＡＧＧＧＧ
ＧＣＣＧＡＴＧＧＧＣＡＧＡＴＡＧＡＧＧ−３′、配列
番号：２）である。ＨＬＨタンパク質の例は、Ｍｙｏ
Ｄ、Ｍｙｆ−５、ミオゲニン、またはＭＲＦ４である。
ＨＬＨタンパク質およびＧＡＴＡ４も、筋肉特異的遺伝
子のプロモーターでだけでなくヘテロロガスな関連にお
いても、すなわち人工プロモーターでも同様に筋肉特異
的転写を示す。
プロモーターまたはアクティベーター配列の例は、トロ
ポミオシン、α−アクチン、α−ミオシン、ＰＤＧＦレ
セプター、ＦＧＦレセプター、ＭＲＦ−４、ホスホフル
クトキナーゼＡ、ホスホグリセレートムターゼ、トロポ
ニンＣ、ミオゲニン、エンドセリンＡレセプター、デス
ミン、ＶＥＧＦをコードする遺伝子のプロモーターおよ
びアクティベーター配列であり、ＶＥＧＦ遺伝子につい
ての遺伝子調節配列は既に上記されており、または「人
工」プロモーターである。このような人工プロモーター
の例は、筋肉特異的なヘリックス−ループ−ヘリックス
（ＨＬＨ）タンパク質についての（ＤＮＡ）結合部位の
多重コピー、例えばＥボックス（ＭｙｏＤ）（例えば、
４×ＡＧＣＡＧＧＴＧＴＴＧＧＧＡＧＧＣ、配列番号：
１）、またはα−ミオシン重鎖遺伝子のＤＮＡジンクフ
ィンガーＧＡＴＡ４結合部位の多重コピー（例えば、
５′−ＧＧＣＣＧＡＴＧＧＧＣＡＧＡＴＡＧＡＧＧＧＧ
ＧＣＣＧＡＴＧＧＧＣＡＧＡＴＡＧＡＧＧ−３′、配列
番号：２）である。ＨＬＨタンパク質の例は、Ｍｙｏ
Ｄ、Ｍｙｆ−５、ミオゲニン、またはＭＲＦ４である。
ＨＬＨタンパク質およびＧＡＴＡ４も、筋肉特異的遺伝
子のプロモーターでだけでなくヘテロロガスな関連にお
いても、すなわち人工プロモーターでも同様に筋肉特異
的転写を示す。
【００７３】グリア細胞で活性化されるプロモーターお
よびアクティベーター配列は特に、例えばSchwann 細胞
特異的タンパク質ペリアキシン、グルタミンシンセター
ゼ、グリア細胞特異的タンパク質（グリア繊維酸タンパ
ク質＝ＧＦＡＰ）、グリア細胞タンパク質Ｓ１００ｂ、
ＩＬ−６（ＣＮＴＦ）、５−ＨＴレセプター、ＴＮＦ
α、ＩＬ−１０、インシュリン様成長因子レセプターＩ
およびIIまたはＶＥＧＦのようなタンパク質をコードす
る遺伝子由来の遺伝子調節配列または要素であり、ＶＥ
ＧＦ遺伝子についての遺伝子調節配列は既に上記されて
いる。
よびアクティベーター配列は特に、例えばSchwann 細胞
特異的タンパク質ペリアキシン、グルタミンシンセター
ゼ、グリア細胞特異的タンパク質（グリア繊維酸タンパ
ク質＝ＧＦＡＰ）、グリア細胞タンパク質Ｓ１００ｂ、
ＩＬ−６（ＣＮＴＦ）、５−ＨＴレセプター、ＴＮＦ
α、ＩＬ−１０、インシュリン様成長因子レセプターＩ
およびIIまたはＶＥＧＦのようなタンパク質をコードす
る遺伝子由来の遺伝子調節配列または要素であり、ＶＥ
ＧＦ遺伝子についての遺伝子調節配列は既に上記されて
いる。
【００７４】造血細胞で活性化されるプロモーターおよ
びアクティベーター配列は、造血細胞または隣接細胞、
例えば支質で発現するサイトカインについての遺伝子の
プロモーター配列またはそのレセプターである。
びアクティベーター配列は、造血細胞または隣接細胞、
例えば支質で発現するサイトカインについての遺伝子の
プロモーター配列またはそのレセプターである。
【００７５】これらのプロモーター配列としては、例え
ば幹細胞因子レセプター、幹細胞因子、ＩＬ−１α、Ｉ
Ｌ−１レセプター、ＩＬ−３、ＩＬ−３レセプター（α
サブユニット）、ＩＬ−３レセプター（βサブユニッ
ト）、ＩＬ−６、ＩＬ−６レセプター、ＧＭ−ＣＳＦ、
ＧＭ−ＣＳＦレセプター（α鎖）、インターフェロン調
節因子１（ＩＲＦ−１）のようなサイトカインおよびそ
れらのレセプターのプロモーター配列が挙げられ、ＩＲ
Ｆ−１プロモーターはＩＬ−６によって、およびＩＦＮ
γまたはＩＦＮβ、エリスロポエチンまたはエリスロポ
エチンレセプターによって同程度まで活性化される。
ば幹細胞因子レセプター、幹細胞因子、ＩＬ−１α、Ｉ
Ｌ−１レセプター、ＩＬ−３、ＩＬ−３レセプター（α
サブユニット）、ＩＬ−３レセプター（βサブユニッ
ト）、ＩＬ−６、ＩＬ−６レセプター、ＧＭ−ＣＳＦ、
ＧＭ−ＣＳＦレセプター（α鎖）、インターフェロン調
節因子１（ＩＲＦ−１）のようなサイトカインおよびそ
れらのレセプターのプロモーター配列が挙げられ、ＩＲ
Ｆ−１プロモーターはＩＬ−６によって、およびＩＦＮ
γまたはＩＦＮβ、エリスロポエチンまたはエリスロポ
エチンレセプターによって同程度まで活性化される。
【００７６】リンパ球および／またはマクロファージで
活性化されるプロモーターおよびアクティベーター配列
の例は、サイトカイン、サイトカインレセプターおよび
付着分子および抗体のＦｃ断片についてのレセプターに
ついての遺伝子のプロモーターおよびアクティベーター
配列である。
活性化されるプロモーターおよびアクティベーター配列
の例は、サイトカイン、サイトカインレセプターおよび
付着分子および抗体のＦｃ断片についてのレセプターに
ついての遺伝子のプロモーターおよびアクティベーター
配列である。
【００７７】例えば、ＩＬ−１レセプター、ＩＬ−１
α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−２レセプター、ＩＬ
−３、ＩＬ−３レセプター（αサブユニット）、ＩＬ−
３レセプター（βサブユニット）、ＩＬ−４、ＩＬ−４
レセプター、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６レセプタ
ー、インターフェロン調節因子１（ＩＲＦ−１）のよう
なタンパク質のプロモーター配列であり、ＩＲＦ−１プ
ロモーターはＩＬ−６によって、ＩＦＮγまたはＩＦＮ
β、ＩＦＮγ応答性プロモーター、ＩＬ−７、ＩＬ−
８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳ
Ｆ、ＧＭ−ＣＳＦレセプター（α鎖）、ＩＬ−１３、Ｌ
ＩＦ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）
レセプター、、Ｉ型およびII型マクロファージスカベン
ジャーレセプター、ＭＡＣ−１（白血球機能抗原）、Ｌ
ＦＡ−１α（白血球機能抗原）またはｐ１５０，９５
（白血球機能抗原）によるのと同程度まで活性化され
る。
α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−２レセプター、ＩＬ
−３、ＩＬ−３レセプター（αサブユニット）、ＩＬ−
３レセプター（βサブユニット）、ＩＬ−４、ＩＬ−４
レセプター、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６レセプタ
ー、インターフェロン調節因子１（ＩＲＦ−１）のよう
なタンパク質のプロモーター配列であり、ＩＲＦ−１プ
ロモーターはＩＬ−６によって、ＩＦＮγまたはＩＦＮ
β、ＩＦＮγ応答性プロモーター、ＩＬ−７、ＩＬ−
８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳ
Ｆ、ＧＭ−ＣＳＦレセプター（α鎖）、ＩＬ−１３、Ｌ
ＩＦ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）
レセプター、、Ｉ型およびII型マクロファージスカベン
ジャーレセプター、ＭＡＣ−１（白血球機能抗原）、Ｌ
ＦＡ−１α（白血球機能抗原）またはｐ１５０，９５
（白血球機能抗原）によるのと同程度まで活性化され
る。
【００７８】滑膜細胞で活性化されるプロモーターおよ
びアクティベーター配列は、例えばマトリックスメタロ
プロテイナーゼ（ＭＭＰ）例えばＭＭＰ１（間コラーゲ
ナーゼ）またはＭＭＰ３（ストロメリシン／トランシ
ン）のプロモーター配列である。
びアクティベーター配列は、例えばマトリックスメタロ
プロテイナーゼ（ＭＭＰ）例えばＭＭＰ１（間コラーゲ
ナーゼ）またはＭＭＰ３（ストロメリシン／トランシ
ン）のプロモーター配列である。
【００７９】更に、それらには、メタロプロテイナーゼ
の組織インヒビター（ＴＩＭＰ）、例えばＩＴＭＰ−
１、ＴＩＭＰ−２またはＴＩＭＰ−３についてのプロモ
ーター配列が挙げられる。
の組織インヒビター（ＴＩＭＰ）、例えばＩＴＭＰ−
１、ＴＩＭＰ−２またはＴＩＭＰ−３についてのプロモ
ーター配列が挙げられる。
【００８０】白血病細胞で活性化されるプロモーターお
よびアクティベーター配列の例は、ｃ−ｍｙｃ、ＨＳＰ
７０、ｂｃｌ−１／サイクリンＤ１、ｂｃｌ−２、ＩＬ
−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＨＯＸ１１、
ＢＣＲ−Ａｂｌ、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１、ＰＭＬ−ＲＡＲＡ
（前骨髄性白血病レチノイン酸レセプター）またはｃ−
ｍｙｃのプロモーターであり、ｃ−ｍｙｃタンパク質は
ＭｙｃＥボックスと呼ばれるヌクレオチド配列（５′−
ＧＧＡＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＴＴＣ
Ｃ−３′、配列番号：３）のマルチマーに結合し、それ
らを活性化する。
よびアクティベーター配列の例は、ｃ−ｍｙｃ、ＨＳＰ
７０、ｂｃｌ−１／サイクリンＤ１、ｂｃｌ−２、ＩＬ
−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＨＯＸ１１、
ＢＣＲ−Ａｂｌ、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１、ＰＭＬ−ＲＡＲＡ
（前骨髄性白血病レチノイン酸レセプター）またはｃ−
ｍｙｃのプロモーターであり、ｃ−ｍｙｃタンパク質は
ＭｙｃＥボックスと呼ばれるヌクレオチド配列（５′−
ＧＧＡＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＴＴＣ
Ｃ−３′、配列番号：３）のマルチマーに結合し、それ
らを活性化する。
【００８１】腫瘍細胞で活性化されるプロモーターおよ
びアクティベーター配列の例は、遺伝子調節ヌクレオチ
ド配列であり、形成されるまたは腫瘍細胞で活性を有す
る転写因子がこれと相互作用する。
びアクティベーター配列の例は、遺伝子調節ヌクレオチ
ド配列であり、形成されるまたは腫瘍細胞で活性を有す
る転写因子がこれと相互作用する。
【００８２】本発明の意味では、好ましいプロモーター
またはアクティベーター配列としては、特に癌細胞また
は肉腫細胞で形成されるタンパク質をコードする遺伝子
由来の遺伝子調節配列または要素が挙げられる。したが
って、小細胞気管支癌の場合にはＮ−ＣＡＭタンパク質
のプロモーターを用い、卵巣癌の場合には、肝炎成長因
子レセプターまたはＬ−プラスチンのプロモーターを用
い、膵臓癌の場合にはＬ−プラスチンまたは多形上皮ム
チン（ＰＥＭ）のプロモーターを用いるのが好ましい。
またはアクティベーター配列としては、特に癌細胞また
は肉腫細胞で形成されるタンパク質をコードする遺伝子
由来の遺伝子調節配列または要素が挙げられる。したが
って、小細胞気管支癌の場合にはＮ−ＣＡＭタンパク質
のプロモーターを用い、卵巣癌の場合には、肝炎成長因
子レセプターまたはＬ−プラスチンのプロモーターを用
い、膵臓癌の場合にはＬ−プラスチンまたは多形上皮ム
チン（ＰＥＭ）のプロモーターを用いるのが好ましい。
【００８３】II) 核輸出シグナルおよび核輸出因子 好ましい態様では、核保持シグナル（ＮＲＳ）は、プレ
メッセンジャーＲＮＡの輸送を妨げ、核膜を介してこれ
に結合しているが、他方では輸出タンパク質を結合する
構造も構成しているヌクレオチド配列である。この輸出
タンパク質は、細胞核からのＮＲＳ含有プレメッセンジ
ャーまたはメッセンジャーＲＮＡの細胞質への輸送を仲
介する。ＮＲＳを含むプレメッセンジャーまたはメッセ
ンジャーＲＮＡは、続いて輸出タンパク質に結合するこ
とによって細胞核から分泌される(Fischer et al., Cel
l 82, 475 (1995)) 。
メッセンジャーＲＮＡの輸送を妨げ、核膜を介してこれ
に結合しているが、他方では輸出タンパク質を結合する
構造も構成しているヌクレオチド配列である。この輸出
タンパク質は、細胞核からのＮＲＳ含有プレメッセンジ
ャーまたはメッセンジャーＲＮＡの細胞質への輸送を仲
介する。ＮＲＳを含むプレメッセンジャーまたはメッセ
ンジャーＲＮＡは、続いて輸出タンパク質に結合するこ
とによって細胞核から分泌される(Fischer et al., Cel
l 82, 475 (1995)) 。
【００８４】核輸出シグナル（ＮＥＳ）は、好ましくは
レトロウイルスのｒｅｖ応答性要素（ＲＲＥ）配列であ
る。ＨＩＶ−１の場合には、このＲＲＥは２４３個のヌ
クレオチド（ヌクレオチド７３６２〜７５９５）を包含
するｅｎｖ遺伝子における配列である。しかしながら、
核輸出シグナル（ＮＥＳ）は、任意の相同製および機能
的に同様な（類似の）ヌクレオチド配列、例えばＨＢＶ
ウイルスのＲＲＥ等価要素であることもできる(Huang e
t al., Mol. Cell Biol. 13, 7476 (1993)) 。
レトロウイルスのｒｅｖ応答性要素（ＲＲＥ）配列であ
る。ＨＩＶ−１の場合には、このＲＲＥは２４３個のヌ
クレオチド（ヌクレオチド７３６２〜７５９５）を包含
するｅｎｖ遺伝子における配列である。しかしながら、
核輸出シグナル（ＮＥＳ）は、任意の相同製および機能
的に同様な（類似の）ヌクレオチド配列、例えばＨＢＶ
ウイルスのＲＲＥ等価要素であることもできる(Huang e
t al., Mol. Cell Biol. 13, 7476 (1993)) 。
【００８５】新規な核酸構築物では、核輸出因子（ＮＥ
Ｆ）は、ＮＲＳのｍＲＮＡに結合し、細胞核から細胞質
へ（または細胞質から細胞核へ）ＮＲＳ含有プレメッセ
ンジャーＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡの輸送を仲
介するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であ
る。レトロウイルス、具体的にはＨＩＶ−１またはＨＩ
Ｖ−２ウイルスからのｒｅｖ遺伝子が特に用いられる。
レトロウイルス性のｒｅｖ遺伝子からのｒｅｖタンパク
質はそのＮ末端ドメインによってプレ−ｍＲＮＡにおけ
るＲＲＥに結合する。ＲＲＥとｒｅｖタンパク質との間
の結合により、スプライシングしていないプレメッセン
ジャーＲＮＡおよびＲＲＥを含む任意の他のＲＮＡを細
胞核から細胞質へ輸送し、これによって実質的に翻訳を
増加することができる。
Ｆ）は、ＮＲＳのｍＲＮＡに結合し、細胞核から細胞質
へ（または細胞質から細胞核へ）ＮＲＳ含有プレメッセ
ンジャーＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡの輸送を仲
介するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であ
る。レトロウイルス、具体的にはＨＩＶ−１またはＨＩ
Ｖ−２ウイルスからのｒｅｖ遺伝子が特に用いられる。
レトロウイルス性のｒｅｖ遺伝子からのｒｅｖタンパク
質はそのＮ末端ドメインによってプレ−ｍＲＮＡにおけ
るＲＲＥに結合する。ＲＲＥとｒｅｖタンパク質との間
の結合により、スプライシングしていないプレメッセン
ジャーＲＮＡおよびＲＲＥを含む任意の他のＲＮＡを細
胞核から細胞質へ輸送し、これによって実質的に翻訳を
増加することができる。
【００８６】本発明の意味においては、ＨＩＶ−１ｒｅ
ｖタンパク質(Bogerd et al., Cell, 82, 485 (1995))
と相同および機能的に同様なタンパク質、例えばビスナ
−マエディウイルス（ＶＭＶ）ｒｅｖ遺伝子またはヤギ
関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）ｒｅｖ遺伝子をコード
するヌクレオチド配列も、ＮＥＦとして用いることがで
きる。しかしながら、ｒｅｖタンパク質との相同性が僅
かであるかまたは全くないが、ＨＩＶ−１ｒｅｖタンパ
ク質に機能的に類似しているタンパク質をコードする遺
伝子を用いることもできる。例は、ＨＴＬＶ−１ｒｅｖ
遺伝子およびウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）およ
びネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ｒｅｖ遺伝子であ
る。
ｖタンパク質(Bogerd et al., Cell, 82, 485 (1995))
と相同および機能的に同様なタンパク質、例えばビスナ
−マエディウイルス（ＶＭＶ）ｒｅｖ遺伝子またはヤギ
関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）ｒｅｖ遺伝子をコード
するヌクレオチド配列も、ＮＥＦとして用いることがで
きる。しかしながら、ｒｅｖタンパク質との相同性が僅
かであるかまたは全くないが、ＨＩＶ−１ｒｅｖタンパ
ク質に機能的に類似しているタンパク質をコードする遺
伝子を用いることもできる。例は、ＨＴＬＶ−１ｒｅｖ
遺伝子およびウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）およ
びネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ｒｅｖ遺伝子であ
る。
【００８７】もう一つの態様では、ＮＥＦは、核からＲ
ＮＡを分泌するタンパク質のヌクレオチド配列であり、
これなしではＲＮＡはＮＲＳによって核に保持されてい
る。これらのタンパク質の例は転写因子ＴＦIII Ａまた
は異種核リボ核タンパク質Ａ１（ｈｎＲＮＰＡ１タンパ
ク質）である。より広義には、核輸送タンパク質として
は、熱ショックタンパク質７０（ｈｓｃ７０）およびタ
ンパク質キナーゼインヒビターＣＰＫＩも挙げられる。
ＮＡを分泌するタンパク質のヌクレオチド配列であり、
これなしではＲＮＡはＮＲＳによって核に保持されてい
る。これらのタンパク質の例は転写因子ＴＦIII Ａまた
は異種核リボ核タンパク質Ａ１（ｈｎＲＮＰＡ１タンパ
ク質）である。より広義には、核輸送タンパク質として
は、熱ショックタンパク質７０（ｈｓｃ７０）およびタ
ンパク質キナーゼインヒビターＣＰＫＩも挙げられる。
【００８８】ＮＥＦおよびその相同および類似タンパク
質によって普通に共有されている特徴はドメインであ
り、アミノ末端付近に位置して、モノマータンパク質を
ＮＲＳのＲＮＡに結合しているもの、および通常はロイ
シンリッチであり（これに対する例外はｈｎＲＮＰＡ１
である）、ＮＥＦの輸送機能に必要なドメインである。
質によって普通に共有されている特徴はドメインであ
り、アミノ末端付近に位置して、モノマータンパク質を
ＮＲＳのＲＮＡに結合しているもの、および通常はロイ
シンリッチであり（これに対する例外はｈｎＲＮＰＡ１
である）、ＮＥＦの輸送機能に必要なドメインである。
【００８９】本発明の意味においては、ＮＥＦ遺伝子の
発現は、上記において既に詳細に記載されているＮＥＦ
遺伝子の５′末端上流に位置しているプロモーター配列
によって制御されている。
発現は、上記において既に詳細に記載されているＮＥＦ
遺伝子の５′末端上流に位置しているプロモーター配列
によって制御されている。
【００９０】III) 構造遺伝子 本発明の意味においては、構造遺伝子（成分b)）は、疾
患の予防および／または治療のための活性化合物をコー
ドする。構造遺伝子およびプロモーター配列は、疾患の
治療の性質に関してかつ形質導入される標的細胞を考慮
して選択すべきである。
患の予防および／または治療のための活性化合物をコー
ドする。構造遺伝子およびプロモーター配列は、疾患の
治療の性質に関してかつ形質導入される標的細胞を考慮
して選択すべきである。
【００９１】例えば、プロモーター配列および構造遺伝
子の下記の組み合わせは、下記の疾患に関して選択すべ
きである。詳細な説明は、既に特許出願ＷＯ９６／０６
９４０号、ＤＥ１９６０５２７４．２号、ＤＥ１９６１
７８５１．７号、ＤＥ１９６３９１０３．２号、および
ＤＥ１９６５１４４３．６号明細書でなされており、上
記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書
に引用される。
子の下記の組み合わせは、下記の疾患に関して選択すべ
きである。詳細な説明は、既に特許出願ＷＯ９６／０６
９４０号、ＤＥ１９６０５２７４．２号、ＤＥ１９６１
７８５１．７号、ＤＥ１９６３９１０３．２号、および
ＤＥ１９６５１４４３．６号明細書でなされており、上
記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書
に引用される。
【００９２】腫瘍の治療に選択される標的細胞の例は、
内皮細胞、または腫瘍細胞、または白血病細胞に隣接し
ている増殖する内皮細胞、間質細胞および筋肉細胞であ
る。これらのプロモーターは内皮細胞特異的、および細
胞サイクル特異的または細胞非特異的または筋肉細胞特
異的、および細胞サイクル特異的または腫瘍細胞特異的
（固体腫瘍および白血病）および細胞サイクル特異的で
ある。
内皮細胞、または腫瘍細胞、または白血病細胞に隣接し
ている増殖する内皮細胞、間質細胞および筋肉細胞であ
る。これらのプロモーターは内皮細胞特異的、および細
胞サイクル特異的または細胞非特異的または筋肉細胞特
異的、および細胞サイクル特異的または腫瘍細胞特異的
（固体腫瘍および白血病）および細胞サイクル特異的で
ある。
【００９３】細胞増殖のインヒビターについて、例えば
網膜芽腫タンパク質（ｐＲｂ＝ｐ１１０）または関連の
ｐ１０７およびｐ１３０タンパク質の構造遺伝子を選択
するときには、下記の方法を選択することができる。
網膜芽腫タンパク質（ｐＲｂ＝ｐ１１０）または関連の
ｐ１０７およびｐ１３０タンパク質の構造遺伝子を選択
するときには、下記の方法を選択することができる。
【００９４】網膜芽腫タンパク質（ｐＲｂ＝ｐ１１０）
または関連のｐ１０７およびｐ１３０タンパク質をリン
酸化によって不活性化する。これなしでは発現したタン
パク質の不活性化部位について突然変異を示し、したが
ってその機能を損なうこれらの細胞サイクルインヒビタ
ーの遺伝子を用いるのが好ましい。これらの突然変異の
例はｐ１１０について記載されている。ｐ１０７タンパ
ク質またはｐ１３０タンパク質についてのＤＮＡ配列も
同様にして突然変異することができる。
または関連のｐ１０７およびｐ１３０タンパク質をリン
酸化によって不活性化する。これなしでは発現したタン
パク質の不活性化部位について突然変異を示し、したが
ってその機能を損なうこれらの細胞サイクルインヒビタ
ーの遺伝子を用いるのが好ましい。これらの突然変異の
例はｐ１１０について記載されている。ｐ１０７タンパ
ク質またはｐ１３０タンパク質についてのＤＮＡ配列も
同様にして突然変異することができる。
【００９５】ｐ５３タンパク質は、細胞増殖のもう一つ
のインヒビターである。タンパク質ｐ５３はＭＤＭ２の
ような特殊タンパク質に結合することによって、または
脱リン酸化Ｃ末端セリンを介してｐ５３のオリゴマー化
によって細胞中で不活性化される。したがって、Ｃ末端
のセリン３９２の喪失により切断されているｐ５３タン
パク質についてのＤＮＡ配列を用いるのが好ましい。他
のインヒビターはｐ２１（ＷＡＦ−１）、ｐ１６タンパ
ク質、他のｃｄｋインヒビター、ＧＡＤＤ４５タンパク
質、またはｂａｋタンパク質である。
のインヒビターである。タンパク質ｐ５３はＭＤＭ２の
ような特殊タンパク質に結合することによって、または
脱リン酸化Ｃ末端セリンを介してｐ５３のオリゴマー化
によって細胞中で不活性化される。したがって、Ｃ末端
のセリン３９２の喪失により切断されているｐ５３タン
パク質についてのＤＮＡ配列を用いるのが好ましい。他
のインヒビターはｐ２１（ＷＡＦ−１）、ｐ１６タンパ
ク質、他のｃｄｋインヒビター、ＧＡＤＤ４５タンパク
質、またはｂａｋタンパク質である。
【００９６】凝固誘発因子および脈感形成インヒビター
の構造遺伝子は、例えばプラスミノーゲンアクティベー
ターインヒビター１（ＰＡＩ−１）、ＰＡＩ−２、ＰＡ
Ｉ−３、アンギオスタチン、インターフェロン（ＩＦＮ
α、ＩＦＮβまたはＩＦＮγ）、血小板因子４、ＩＬ−
１２、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、白
血病抑制因子（ＬＩＦ）、または組織因子（ＴＦ）およ
び凝固において活性なその断片をコードする。
の構造遺伝子は、例えばプラスミノーゲンアクティベー
ターインヒビター１（ＰＡＩ−１）、ＰＡＩ−２、ＰＡ
Ｉ−３、アンギオスタチン、インターフェロン（ＩＦＮ
α、ＩＦＮβまたはＩＦＮγ）、血小板因子４、ＩＬ−
１２、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、白
血病抑制因子（ＬＩＦ）、または組織因子（ＴＦ）およ
び凝固において活性なその断片をコードする。
【００９７】細胞増殖抑制および細胞毒性タンパク質の
構造遺伝子は、例えばパーフォリン、グランチーム、Ｉ
Ｌ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、インターフェロン、例
えばＩＦＮ−α、ＩＦＮβまたはＩＦＮγ、ＴＮＦ、例
えばＴＮＦαまたはＴＮＦβ、オンコスタチンＭ、スフ
ィンゴミエリナーゼまたはマガイニンおよびマガイニン
誘導体をコードする。
構造遺伝子は、例えばパーフォリン、グランチーム、Ｉ
Ｌ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、インターフェロン、例
えばＩＦＮ−α、ＩＦＮβまたはＩＦＮγ、ＴＮＦ、例
えばＴＮＦαまたはＴＮＦβ、オンコスタチンＭ、スフ
ィンゴミエリナーゼまたはマガイニンおよびマガイニン
誘導体をコードする。
【００９８】細胞増殖抑制および細胞毒性抗体、および
抗原結合抗体断片と細胞増殖抑制、細胞毒性または炎症
性タンパク質または酵素との融合タンパク質をコードす
る構造遺伝子は、下記の方法によって選択することがで
きる。
抗原結合抗体断片と細胞増殖抑制、細胞毒性または炎症
性タンパク質または酵素との融合タンパク質をコードす
る構造遺伝子は、下記の方法によって選択することがで
きる。
【００９９】細胞増殖抑制または細胞毒性抗体として
は、例えばBurrows et al. (Pharmac.Ther.,64,155 (19
94)) 、Hughes et al. (Cancer Res., 49, 6214 (198
9))、およびMaruyama et al., (PNAS USA, 87, 5744 (1
990))によって記載されているように、内皮細胞の膜構
造に向けられているものが挙げられる。これらの抗体と
しては、特にＶＥＧＦレセプターに対する抗体が挙げら
れる。更に、それらとしては、腫瘍細胞上の膜構造に向
けられている細胞増殖抑制または細胞毒性抗体が挙げら
れる。これらの抗体は、例えばSdlacek et al., Contri
b. to Oncol., 32,Karger Verlag,ミュンヘン (1988)
およびContrib. to Oncol., 43, Karger Verlag,ミュン
ヘン (1992) に総括されている。他の例は、シアリル・
ルイスに対する、Ｔ細胞によって認識される腫瘍上のペ
プチドに対する、癌遺伝子から発現するタンパク質に対
する、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＭ２、９−Ｏ−アセチルＧＤ
およびフコシルＧＭ１のようなガングリオシドに対す
る、血液群抗原およびそれらの前駆物質に対する、多形
上皮ムシン上の抗原に対する、および熱ショックタンパ
ク質上の抗原に対する抗体である。それらには、更に白
血病細胞の膜構造に対して向けられている抗体が挙げら
れる。多数のこのようなモノクローナル抗体は、診断お
よび治療法について既に記載されている（Kristensen,
Danish Medical Buttetin, 47,52 (1994); Schranz, he
rapia Hungarica, 38, 3 (1990); Drexler et al., Leu
k. Res., 10, 279 (1986); Naeim, Dis., Markers, 71
(1989); Stickney et al., Curr. Opin. Oncol., 4, 84
7 (1992); Drexler et al., Blut, 57, 327 (1988); Fr
eedman et al., Cancer Invest., 9, 69 (1991))。白血
病の型によっては、モノクローナル抗体またはそれらの
抗原結合抗体断片であって、下記の膜右舷に向けられて
いるものが、例えばリガンドとして用いるのに好適であ
る。細胞 膜抗原 ＡＭＬ ＣＤ１３ ＣＤ１５ ＣＤ３３ ＣＡＭＡＬ シアロシル−Ｌｅ Ｂ−ＣＬＬ ＣＤ５ ＣＤ１ｃ ＣＤ２３ 膜免疫グロブリンのイディオタイプおよびイソタイプ Ｔ−ＣＬＬ ＣＤ３３ Ｍ３８ ＩＬ−２レセプター Ｔ細胞レセプター ＡＬＬ ＣＡＬＬＡ ＣＤ１９ 非ホジキンリンパ腫
は、例えばBurrows et al. (Pharmac.Ther.,64,155 (19
94)) 、Hughes et al. (Cancer Res., 49, 6214 (198
9))、およびMaruyama et al., (PNAS USA, 87, 5744 (1
990))によって記載されているように、内皮細胞の膜構
造に向けられているものが挙げられる。これらの抗体と
しては、特にＶＥＧＦレセプターに対する抗体が挙げら
れる。更に、それらとしては、腫瘍細胞上の膜構造に向
けられている細胞増殖抑制または細胞毒性抗体が挙げら
れる。これらの抗体は、例えばSdlacek et al., Contri
b. to Oncol., 32,Karger Verlag,ミュンヘン (1988)
およびContrib. to Oncol., 43, Karger Verlag,ミュン
ヘン (1992) に総括されている。他の例は、シアリル・
ルイスに対する、Ｔ細胞によって認識される腫瘍上のペ
プチドに対する、癌遺伝子から発現するタンパク質に対
する、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＭ２、９−Ｏ−アセチルＧＤ
およびフコシルＧＭ１のようなガングリオシドに対す
る、血液群抗原およびそれらの前駆物質に対する、多形
上皮ムシン上の抗原に対する、および熱ショックタンパ
ク質上の抗原に対する抗体である。それらには、更に白
血病細胞の膜構造に対して向けられている抗体が挙げら
れる。多数のこのようなモノクローナル抗体は、診断お
よび治療法について既に記載されている（Kristensen,
Danish Medical Buttetin, 47,52 (1994); Schranz, he
rapia Hungarica, 38, 3 (1990); Drexler et al., Leu
k. Res., 10, 279 (1986); Naeim, Dis., Markers, 71
(1989); Stickney et al., Curr. Opin. Oncol., 4, 84
7 (1992); Drexler et al., Blut, 57, 327 (1988); Fr
eedman et al., Cancer Invest., 9, 69 (1991))。白血
病の型によっては、モノクローナル抗体またはそれらの
抗原結合抗体断片であって、下記の膜右舷に向けられて
いるものが、例えばリガンドとして用いるのに好適であ
る。細胞 膜抗原 ＡＭＬ ＣＤ１３ ＣＤ１５ ＣＤ３３ ＣＡＭＡＬ シアロシル−Ｌｅ Ｂ−ＣＬＬ ＣＤ５ ＣＤ１ｃ ＣＤ２３ 膜免疫グロブリンのイディオタイプおよびイソタイプ Ｔ−ＣＬＬ ＣＤ３３ Ｍ３８ ＩＬ−２レセプター Ｔ細胞レセプター ＡＬＬ ＣＡＬＬＡ ＣＤ１９ 非ホジキンリンパ腫
【０１００】ネズミ抗体のヒト化、およびＦａｂ組換え
Ｆｖ断片に対する遺伝子の調製および最適化は、総て当
業者に知られている手法によって行なった(Winter et a
l.,Nature, 349,293 (1991); Hoogenbooms et al., Re
v. Tr. Transfus. Hemobiol., 36, 19 (1993); Girol.
Mol. Immunol., 28, 1379 (1991)、またはHuston eta
l., Intern. Rev. Immunol., 10, 195 (1993)) 。組換
えＦｖ断片も、当業者に知られている技術の状態によっ
て細胞増殖抑制、細胞毒性または炎症性タンパク質また
は酵素についての遺伝子と融合する。
Ｆｖ断片に対する遺伝子の調製および最適化は、総て当
業者に知られている手法によって行なった(Winter et a
l.,Nature, 349,293 (1991); Hoogenbooms et al., Re
v. Tr. Transfus. Hemobiol., 36, 19 (1993); Girol.
Mol. Immunol., 28, 1379 (1991)、またはHuston eta
l., Intern. Rev. Immunol., 10, 195 (1993)) 。組換
えＦｖ断片も、当業者に知られている技術の状態によっ
て細胞増殖抑制、細胞毒性または炎症性タンパク質また
は酵素についての遺伝子と融合する。
【０１０１】標的細胞結合リガンドと細胞増殖抑制およ
び細胞毒性タンパク質との融合タンパク質をコードする
構造遺伝子は、下記の方法によって選択することができ
る。リガンドとしては、例えば内皮細胞上の膜構造また
は膜レセプターに結合する総ての物質が挙げられる。こ
れらの物質の例は、サイトカイン、例えばＩＬ−１、ま
たは成長因子、またはそれらの断片またはそれらの部分
配列であって、内皮細胞によって発現されるレセプター
に結合するもの、例えばＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧ
Ｆ、ＴＧＦである。
び細胞毒性タンパク質との融合タンパク質をコードする
構造遺伝子は、下記の方法によって選択することができ
る。リガンドとしては、例えば内皮細胞上の膜構造また
は膜レセプターに結合する総ての物質が挙げられる。こ
れらの物質の例は、サイトカイン、例えばＩＬ−１、ま
たは成長因子、またはそれらの断片またはそれらの部分
配列であって、内皮細胞によって発現されるレセプター
に結合するもの、例えばＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧ
Ｆ、ＴＧＦである。
【０１０２】それらには、更に活性化されおよび／また
は増殖している内皮細胞に結合する接着分子が挙げられ
る。これらの例は、ＳＬｅｘ、ＬＦＡ−１、ＭＡＣ−
１、ＬＥＣＡＭ−１、ＶＬＡ−４またはビトロネクチン
である。それらには、更に腫瘍または白血病細胞の膜構
造または膜レセプターに結合する物質が挙げられる。例
は成長因子、またはそれらの断片またはそれらの部分配
列であり、白血病細胞または腫瘍細胞によって発現され
るレセプターに結合している。このような成長因子は、
既に報告されている（Cross et al., Cell, 64, 271 (1
991), Aulitzky et al., Drugs, 48, 667 (1994), Moor
e, Clin. Cancer Res., 1, 3 (1995), VanKooten et a
l., Luek. Lymph., 27 (1993) の総説）。これらのリガ
ンドに対する遺伝子であって、標的細胞に結合している
ものは、当業者に知られている方法を用いて当該技術分
野の状態にしたがって細胞増殖抑制、細胞毒性または炎
症性タンパク質または酵素についての遺伝子と融合され
る。
は増殖している内皮細胞に結合する接着分子が挙げられ
る。これらの例は、ＳＬｅｘ、ＬＦＡ−１、ＭＡＣ−
１、ＬＥＣＡＭ−１、ＶＬＡ−４またはビトロネクチン
である。それらには、更に腫瘍または白血病細胞の膜構
造または膜レセプターに結合する物質が挙げられる。例
は成長因子、またはそれらの断片またはそれらの部分配
列であり、白血病細胞または腫瘍細胞によって発現され
るレセプターに結合している。このような成長因子は、
既に報告されている（Cross et al., Cell, 64, 271 (1
991), Aulitzky et al., Drugs, 48, 667 (1994), Moor
e, Clin. Cancer Res., 1, 3 (1995), VanKooten et a
l., Luek. Lymph., 27 (1993) の総説）。これらのリガ
ンドに対する遺伝子であって、標的細胞に結合している
ものは、当業者に知られている方法を用いて当該技術分
野の状態にしたがって細胞増殖抑制、細胞毒性または炎
症性タンパク質または酵素についての遺伝子と融合され
る。
【０１０３】炎症インデューサーの構造遺伝子は、例え
ばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＲＮＡＴＥＳ（ＭＣＰ−２）、
単球走化性および活性化因子（ＭＣＡＦ）、ＩＬ−８、
マクロファージ炎症タンパク質１（ＭＩＰ−１α、ＭＩ
Ｐ−１β）、好中球活性化タンパク質２（ＮＡＰ−
２）、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ヒト白血病抑制因子（ＬＩ
Ｆ）、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳ
Ｆ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、コブラ毒因子（ＣＶ
Ｆ）、またはヒト補体因子Ｃ３ｂに機能的に相当するＣ
ＶＦの部分配列、すなわち補体因子Ｂに結合することが
できかつ因子Ｄによる開裂の後、Ｃ３コンベルターゼ、
ヒト補体Ｃ３またはその部分配列Ｃ３ｂ、機能的および
構造的にＣＶＦに類似しているヒト補体因子Ｃ３の開裂
生成物を構成するもの、または補体を活性化しまたは炎
症を誘発する細菌タンパク質、例えばSalmonella typhi
murium porins 、Staphylococcus aureus 凝集因子、モ
ジュリン、特にグラム陰性菌由来のもの、Legionellas
またはHaemophilus influenzaeＢ型またはKlebsiellas
由来の主要外膜タンパク質、またはグループＧのStrept
ococci由来のＭ分子をコードする。
ばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＲＮＡＴＥＳ（ＭＣＰ−２）、
単球走化性および活性化因子（ＭＣＡＦ）、ＩＬ−８、
マクロファージ炎症タンパク質１（ＭＩＰ−１α、ＭＩ
Ｐ−１β）、好中球活性化タンパク質２（ＮＡＰ−
２）、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ヒト白血病抑制因子（ＬＩ
Ｆ）、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳ
Ｆ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、コブラ毒因子（ＣＶ
Ｆ）、またはヒト補体因子Ｃ３ｂに機能的に相当するＣ
ＶＦの部分配列、すなわち補体因子Ｂに結合することが
できかつ因子Ｄによる開裂の後、Ｃ３コンベルターゼ、
ヒト補体Ｃ３またはその部分配列Ｃ３ｂ、機能的および
構造的にＣＶＦに類似しているヒト補体因子Ｃ３の開裂
生成物を構成するもの、または補体を活性化しまたは炎
症を誘発する細菌タンパク質、例えばSalmonella typhi
murium porins 、Staphylococcus aureus 凝集因子、モ
ジュリン、特にグラム陰性菌由来のもの、Legionellas
またはHaemophilus influenzaeＢ型またはKlebsiellas
由来の主要外膜タンパク質、またはグループＧのStrept
ococci由来のＭ分子をコードする。
【０１０４】サイズ増殖抑制物質の前駆物質を活性化す
る酵素をコードする構造遺伝子、例えば不活性前駆物質
（プロドラッグ）を開裂して活性なサイズ増殖抑制物質
（薬剤）にする酵素をコードするもの、およびそれぞれ
場合の関連プロドラッグおよび薬剤は、既にDeonarain
et al.(British Journal Cancer, 70, 786 (1994))、Mu
llen, Pharmac. Ther., 63, 199 (1994)) およびHarris
et al. （Gene Ther., 1, 170 (1994))によりすでに総
括されている。例えば、下記の酵素の一つについてのＤ
ＮＡ配列を用いることができる。単純ヘルペスウイルス
チミジンキナーゼ、帯状疱疹ウイルスチミジンキナー
ゼ、細菌性ニトロレダクターゼ、細菌性β−グルクロニ
ダーゼ、Secale cereale由来の植物β−グルクロニダー
ゼ、ヒトβ−グルクロニダーゼ、ヒトカルボキシペプチ
ダーゼ（ＣＢ）、例えばマスト細胞ＣＢ−Ａ、ＣＢ−
Ｂ、膵臓または細菌性カルボキシペプチダーゼ、細菌性
β−ラクタマーゼ、細菌性シトシンデアミナーゼ、ヒト
カタラーゼまたはペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、
特にヒトアルカリホスファターゼ、ヒト酸性前立腺ホス
ファターゼ、または５型酸性ホスファターゼ、オキシダ
ーゼ、特にヒトリシルオキシダーゼ、またはヒト酸性Ｄ
−アミノオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、特にヒトグ
ルタチオンペルオキシダーゼ、ヒト好酸球ペルオキシダ
ーゼ、またはヒト甲状腺ペルオキシダーゼ、またはガラ
クトシダーゼ。
る酵素をコードする構造遺伝子、例えば不活性前駆物質
（プロドラッグ）を開裂して活性なサイズ増殖抑制物質
（薬剤）にする酵素をコードするもの、およびそれぞれ
場合の関連プロドラッグおよび薬剤は、既にDeonarain
et al.(British Journal Cancer, 70, 786 (1994))、Mu
llen, Pharmac. Ther., 63, 199 (1994)) およびHarris
et al. （Gene Ther., 1, 170 (1994))によりすでに総
括されている。例えば、下記の酵素の一つについてのＤ
ＮＡ配列を用いることができる。単純ヘルペスウイルス
チミジンキナーゼ、帯状疱疹ウイルスチミジンキナー
ゼ、細菌性ニトロレダクターゼ、細菌性β−グルクロニ
ダーゼ、Secale cereale由来の植物β−グルクロニダー
ゼ、ヒトβ−グルクロニダーゼ、ヒトカルボキシペプチ
ダーゼ（ＣＢ）、例えばマスト細胞ＣＢ−Ａ、ＣＢ−
Ｂ、膵臓または細菌性カルボキシペプチダーゼ、細菌性
β−ラクタマーゼ、細菌性シトシンデアミナーゼ、ヒト
カタラーゼまたはペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、
特にヒトアルカリホスファターゼ、ヒト酸性前立腺ホス
ファターゼ、または５型酸性ホスファターゼ、オキシダ
ーゼ、特にヒトリシルオキシダーゼ、またはヒト酸性Ｄ
−アミノオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、特にヒトグ
ルタチオンペルオキシダーゼ、ヒト好酸球ペルオキシダ
ーゼ、またはヒト甲状腺ペルオキシダーゼ、またはガラ
クトシダーゼ。
【０１０５】更に、自己免疫疾患および炎症の治療は、
ＷＯ／０６９４１号明細書およびＤＥ１９６５１４４
３．６号明細書に記載されており、上記特許明細書の内
容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
ＷＯ／０６９４１号明細書およびＤＥ１９６５１４４
３．６号明細書に記載されており、上記特許明細書の内
容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【０１０６】好適な標的細胞の例は、増職制内皮細胞、
マクロファージおよび／またはリンパ球または滑膜細胞
である。このプロモーターは、例えば内皮細胞特異的、
および細胞サイクル特異的、またはマクロファージ特異
的および／またはリンパ球特異的および／または細胞サ
イクル特異的または滑膜細胞特異的および／または細胞
サイクル特異的である。
マクロファージおよび／またはリンパ球または滑膜細胞
である。このプロモーターは、例えば内皮細胞特異的、
および細胞サイクル特異的、またはマクロファージ特異
的および／またはリンパ球特異的および／または細胞サ
イクル特異的または滑膜細胞特異的および／または細胞
サイクル特異的である。
【０１０７】アレルギーの治療の構造遺伝子は、例えば
ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−４に対する抗
体または抗体断片、可溶性ＩＬ−４レセプター、ＩＬ−
１２またはＴＧＦβをコードする。
ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−４に対する抗
体または抗体断片、可溶性ＩＬ−４レセプター、ＩＬ−
１２またはＴＧＦβをコードする。
【０１０８】移植臓器の拒絶反応を防止する構造遺伝子
は、例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、可溶性ＩＬ−１レ
セプター、可溶性ＩＬ−２レセプター、ＩＬ−１レセプ
ター拮抗薬、可溶性ＩＬ−６レセプターまたは免疫抑制
抗体またはそれらのＶＨ含有およびＶＬ含有断片または
それらのＶＨおよびＶＬ断片であってリンカーを介して
接続されているものをコードする。免疫抑制抗体の例
は、Ｔ細胞レセプターまたはそのＣＤ３複合体に特異的
な抗体、またはＣＤ４またはＣＤ８に向けられている、
および特にＩＬ−２レセプター、ＩＬ−１レセプターま
たはＩＬ−４レセプターまたは付着分子ＣＤ２、ＬＦＡ
−１、ＣＤ２８またはＣＤ４０に向けられている抗体で
ある。
は、例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、可溶性ＩＬ−１レ
セプター、可溶性ＩＬ−２レセプター、ＩＬ−１レセプ
ター拮抗薬、可溶性ＩＬ−６レセプターまたは免疫抑制
抗体またはそれらのＶＨ含有およびＶＬ含有断片または
それらのＶＨおよびＶＬ断片であってリンカーを介して
接続されているものをコードする。免疫抑制抗体の例
は、Ｔ細胞レセプターまたはそのＣＤ３複合体に特異的
な抗体、またはＣＤ４またはＣＤ８に向けられている、
および特にＩＬ−２レセプター、ＩＬ−１レセプターま
たはＩＬ−４レセプターまたは付着分子ＣＤ２、ＬＦＡ
−１、ＣＤ２８またはＣＤ４０に向けられている抗体で
ある。
【０１０９】抗体介在自己免疫疾患の治療の構造遺伝子
は、例えばＴＧＦβ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、
ＩＬ−１２、可溶性ＩＬ−４レセプター、可溶性ＩＬ−
６レセプター、または免疫抑制抗体またはそれらのＶＨ
含有およびＶＬ含有断片をコードする。
は、例えばＴＧＦβ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、
ＩＬ−１２、可溶性ＩＬ−４レセプター、可溶性ＩＬ−
６レセプター、または免疫抑制抗体またはそれらのＶＨ
含有およびＶＬ含有断片をコードする。
【０１１０】細胞介在自己免疫疾患の治療のための構造
遺伝子は、例えばＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、Ｉ
Ｌ−１３、ＴＮＦαまたはＴＮＦβ、ＩＬ−１３または
免疫抑制抗体またはそのＶＨ含有およびＶＬ含有断片を
コードする。
遺伝子は、例えばＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、Ｉ
Ｌ−１３、ＴＮＦαまたはＴＮＦβ、ＩＬ−１３または
免疫抑制抗体またはそのＶＨ含有およびＶＬ含有断片を
コードする。
【０１１１】細胞増殖、細胞増殖抑制または細胞毒性タ
ンパク質のインヒビターおよび細胞増殖抑制物質の活性
化の酵素の構造遺伝子は、主要の治療に関して既に上記
した。
ンパク質のインヒビターおよび細胞増殖抑制物質の活性
化の酵素の構造遺伝子は、主要の治療に関して既に上記
した。
【０１１２】その点に関して既述したのと同じ形態で
は、本発明の意味において、抗体またはこれらの抗体の
Ｆａｂまたは組換えＦｖ断片、または標的細胞に特異的
な他のリガンド、および上記サイトカイン、成長因子、
レセプター細胞増殖抑制または細胞毒性タンパク質およ
び酵素を含んでなる融合タンパク質をコードする構造遺
伝子を用いることができる。
は、本発明の意味において、抗体またはこれらの抗体の
Ｆａｂまたは組換えＦｖ断片、または標的細胞に特異的
な他のリガンド、および上記サイトカイン、成長因子、
レセプター細胞増殖抑制または細胞毒性タンパク質およ
び酵素を含んでなる融合タンパク質をコードする構造遺
伝子を用いることができる。
【０１１３】本発明の意味においては、発現した構造遺
伝子が、直接または間接的に関節などの炎症を抑制し、
および／または関節における細胞外マトリックスの再構
成を促進するタンパク質が、関節炎の治療の目的で選択
される。
伝子が、直接または間接的に関節などの炎症を抑制し、
および／または関節における細胞外マトリックスの再構
成を促進するタンパク質が、関節炎の治療の目的で選択
される。
【０１１４】これらのタンパク質の例は、ＩＬ−１−Ｒ
ＡがＩＬ−１αおよびＩＬ−１レセプターの結合を阻害
するのでＩＬ−１レセプター拮抗薬（ＩＬ−１−Ｒ
Ａ）、可溶性Ｌ−１レセプターがＩＬ−１に結合して不
活性化するので可溶性ＩＬ−１レセプター、ＩＬ−６が
ＴＩＭＰ及びスーパーオキシドの分泌を増加し、滑膜細
胞および軟骨細胞によるＩＬ−１およびＴＮＦαの分泌
を減少するので、ＩＬ−６、可溶性ＴＮＦレセプターが
ＴＮＦに結合して不活性化するので可溶性ＴＮＦレセプ
ター、ＩＬ−４がＩＬ−１、ＴＮＦαおよびＭＭＰの形
成および分泌を阻害するのでＩＬ−４、ＩＬ−１０がＩ
Ｌ−１、ＴＮＦαおよびＭＭＰの形成および分泌を阻害
し、ＴＩＭＰの分泌を増加するのでＩＬ−１０、インシ
ュリン様成長因子（ＩＧＦ−１）が細胞外マトリックス
の合成を促進するので、ＩＧＦ−１、ＴＧＦβが細胞外
マトリックスの合成を刺激するのでＴＧＦβ、具体的に
はＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２、およびスーパージスム
ターゼまたはＴＩＭＰ、具体的ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ
−２またはＴＩＭＰ−３である。
ＡがＩＬ−１αおよびＩＬ−１レセプターの結合を阻害
するのでＩＬ−１レセプター拮抗薬（ＩＬ−１−Ｒ
Ａ）、可溶性Ｌ−１レセプターがＩＬ−１に結合して不
活性化するので可溶性ＩＬ−１レセプター、ＩＬ−６が
ＴＩＭＰ及びスーパーオキシドの分泌を増加し、滑膜細
胞および軟骨細胞によるＩＬ−１およびＴＮＦαの分泌
を減少するので、ＩＬ−６、可溶性ＴＮＦレセプターが
ＴＮＦに結合して不活性化するので可溶性ＴＮＦレセプ
ター、ＩＬ−４がＩＬ−１、ＴＮＦαおよびＭＭＰの形
成および分泌を阻害するのでＩＬ−４、ＩＬ−１０がＩ
Ｌ−１、ＴＮＦαおよびＭＭＰの形成および分泌を阻害
し、ＴＩＭＰの分泌を増加するのでＩＬ−１０、インシ
ュリン様成長因子（ＩＧＦ−１）が細胞外マトリックス
の合成を促進するので、ＩＧＦ−１、ＴＧＦβが細胞外
マトリックスの合成を刺激するのでＴＧＦβ、具体的に
はＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２、およびスーパージスム
ターゼまたはＴＩＭＰ、具体的ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ
−２またはＴＩＭＰ−３である。
【０１１５】血液細胞の形成不全の治療は、既にＷＯ９
６／０６９４１号明細書に詳細に記載されており、上記
特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に
引用される。
６／０６９４１号明細書に詳細に記載されており、上記
特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に
引用される。
【０１１６】好適な標的細胞の例は、造血系の増殖性の
未成熟細胞、または造血系に隣接する支質（stroma）細
胞である。プロモーターは、例えば造血細胞に特異的で
あり、および／または細胞サイクル特異的または細胞非
特異的および細胞サイクル特異的である。
未成熟細胞、または造血系に隣接する支質（stroma）細
胞である。プロモーターは、例えば造血細胞に特異的で
あり、および／または細胞サイクル特異的または細胞非
特異的および細胞サイクル特異的である。
【０１１７】貧血の治療のための構造遺伝子は、例えば
エリスロポエチンをコードする。白血球減少症の治療の
ための構造遺伝子は、例えばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ
またはＭ−ＣＳＦをコードする。血小板減少症の治療の
ための構造遺伝子は、例えばＩＬ−３、白血病阻害因子
（ＬＩＦ）、ＩＬ−１１またはトロンボポエチンをコー
ドする。
エリスロポエチンをコードする。白血球減少症の治療の
ための構造遺伝子は、例えばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ
またはＭ−ＣＳＦをコードする。血小板減少症の治療の
ための構造遺伝子は、例えばＩＬ−３、白血病阻害因子
（ＬＩＦ）、ＩＬ−１１またはトロンボポエチンをコー
ドする。
【０１１８】神経系の損傷の治療に好適な標的細胞は、
グリア細胞または増殖性内皮細胞である。この場合に
は、プロモーターはグリア細胞特異的および細胞サイク
ル特異的、または内皮細胞特異的および細胞サイクル特
異的、または非特異的および細胞サイクル特異的であ
る。
グリア細胞または増殖性内皮細胞である。この場合に
は、プロモーターはグリア細胞特異的および細胞サイク
ル特異的、または内皮細胞特異的および細胞サイクル特
異的、または非特異的および細胞サイクル特異的であ
る。
【０１１９】ニューロン成長因子の構造遺伝子は、例え
ばＦＧＦ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来の神経栄養
因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−
３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４）、または毛様
体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）もしくはグリア細胞由来成
長因子（ＧＤＮＦ）をコードする。酵素の構造遺伝子
は、例えばチロシンヒドロキシラーゼまたはドーパーデ
カルボキシラーゼをコードする。サイトカイン、および
ＴＮＦαの神経毒性作用を阻害または中和するそのイン
ヒビターの構造遺伝子は、例えばＴＧＦβ、可溶性ＴＮ
Ｆレセプター、ＴＮＦレセプターをコードし、ＴＮＦレ
セプターはＴＮＦαを中和し、ＩＬ−１０はＩＦＮγ、
ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−４の形成を阻害するの
でＩＬ−１０、可溶性ＩＬ−１レセプターはＩＬ−１、
ＩＬ−１レセプター拮抗薬または可溶性ＩＬ−６レセプ
ターの活性を中和するので、可溶性ＩＬ−１レセプタ
ー、ＩＬ−１レセプターＩ、ＩＬ−１レセプターIIをコ
ードする。
ばＦＧＦ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来の神経栄養
因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−
３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４）、または毛様
体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）もしくはグリア細胞由来成
長因子（ＧＤＮＦ）をコードする。酵素の構造遺伝子
は、例えばチロシンヒドロキシラーゼまたはドーパーデ
カルボキシラーゼをコードする。サイトカイン、および
ＴＮＦαの神経毒性作用を阻害または中和するそのイン
ヒビターの構造遺伝子は、例えばＴＧＦβ、可溶性ＴＮ
Ｆレセプター、ＴＮＦレセプターをコードし、ＴＮＦレ
セプターはＴＮＦαを中和し、ＩＬ−１０はＩＦＮγ、
ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−４の形成を阻害するの
でＩＬ−１０、可溶性ＩＬ−１レセプターはＩＬ−１、
ＩＬ−１レセプター拮抗薬または可溶性ＩＬ−６レセプ
ターの活性を中和するので、可溶性ＩＬ−１レセプタ
ー、ＩＬ−１レセプターＩ、ＩＬ−１レセプターIIをコ
ードする。
【０１２０】血液凝固系および血液循環系の障害の治療
は、既に特許出願明細書ＷＯ９６／０６９３８号、ＤＥ
１９６１７８５１．７号およびＤＥ１９６３９１０３．
２号明細書に詳細に記載されており、上記特許明細書の
内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
好適な標的細胞の例は、内皮細胞、増殖性内皮細胞、内
皮細胞の近傍の体細胞、および平滑筋細胞またはマクロ
ファージである。
は、既に特許出願明細書ＷＯ９６／０６９３８号、ＤＥ
１９６１７８５１．７号およびＤＥ１９６３９１０３．
２号明細書に詳細に記載されており、上記特許明細書の
内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
好適な標的細胞の例は、内皮細胞、増殖性内皮細胞、内
皮細胞の近傍の体細胞、および平滑筋細胞またはマクロ
ファージである。
【０１２１】プロモーターは、例えば細胞非特異的およ
び細胞サイクル特異的または内皮細胞、平滑筋細胞また
はマクロファージに特異的、および細胞サイクル特異的
である。
び細胞サイクル特異的または内皮細胞、平滑筋細胞また
はマクロファージに特異的、および細胞サイクル特異的
である。
【０１２２】凝固の阻害またはフィブリン溶解を促進す
るための構造遺伝子は、例えば組織プラスミノーゲンア
クティベーター（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ型プラスミノ
ーゲンアクティベーター（ｕＰＡ）、ｔＰＡとｕＰＡと
のハイブリッド、タンパク質Ｃ、ヒルジン、セリンプロ
テイナーゼインヒビター（セルピン）、例えばＣ−１Ｓ
インヒビター、α１−抗トリプシンまたは抗トロンビン
III または組織因子通路インヒビター（ＴＦＰＩ）をコ
ードする。凝固を促進するための構造遺伝子は、例えば
ＦVIII、フォン・ビレブランド因子、ＦXIII、ＰＡＩ−
１、ＰＡＩ−２または組織因子およびその断片をコード
する。脈感形成因子の構造遺伝子は、例えばＶＥＧＦま
たはＦＧＦをコードする。血圧を低下するための構造遺
伝子は、例えばカリクレインまたは内皮細胞酸化窒素シ
ンタ−ゼをコードする。内皮層の損傷の後の平滑筋細胞
の増殖を阻害する構造遺伝子は、例えば増殖抑制、細胞
増殖抑制または細胞毒性タンパク質、または主要の治療
で既に上記したように細胞増殖抑制物質の前駆物質を開
裂して細胞増殖抑制物質にする酵素、またはこれらの活
性化合物の一つとリガンド、例えば筋肉細胞に特異的な
抗体または抗体断片との融合タンパク質をコードする。
他の血漿タンパク質の構造遺伝子は、例えばアルブミ
ン、Ｃ１不活性化剤、血清コリンエステラーゼ、トラン
スフェリンまたは１−アンチトリプシンをコードする。
るための構造遺伝子は、例えば組織プラスミノーゲンア
クティベーター（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ型プラスミノ
ーゲンアクティベーター（ｕＰＡ）、ｔＰＡとｕＰＡと
のハイブリッド、タンパク質Ｃ、ヒルジン、セリンプロ
テイナーゼインヒビター（セルピン）、例えばＣ−１Ｓ
インヒビター、α１−抗トリプシンまたは抗トロンビン
III または組織因子通路インヒビター（ＴＦＰＩ）をコ
ードする。凝固を促進するための構造遺伝子は、例えば
ＦVIII、フォン・ビレブランド因子、ＦXIII、ＰＡＩ−
１、ＰＡＩ−２または組織因子およびその断片をコード
する。脈感形成因子の構造遺伝子は、例えばＶＥＧＦま
たはＦＧＦをコードする。血圧を低下するための構造遺
伝子は、例えばカリクレインまたは内皮細胞酸化窒素シ
ンタ−ゼをコードする。内皮層の損傷の後の平滑筋細胞
の増殖を阻害する構造遺伝子は、例えば増殖抑制、細胞
増殖抑制または細胞毒性タンパク質、または主要の治療
で既に上記したように細胞増殖抑制物質の前駆物質を開
裂して細胞増殖抑制物質にする酵素、またはこれらの活
性化合物の一つとリガンド、例えば筋肉細胞に特異的な
抗体または抗体断片との融合タンパク質をコードする。
他の血漿タンパク質の構造遺伝子は、例えばアルブミ
ン、Ｃ１不活性化剤、血清コリンエステラーゼ、トラン
スフェリンまたは１−アンチトリプシンをコードする。
【０１２３】ワクチン化のための核酸構築物の使用は、
既に特許出願明細書ＷＯ９６／０６９４１号、ＤＥ１９
６１７８５１．７号、ＤＥ１９６３９１０３．２号およ
びＤＥ１９６５１４４３．６号明細書に記載されてお
り、上記特許明細書の内容は、その開示の一部として本
明細書に引用される。好適な標的細胞の例は、筋細胞、
マクロファージおよび／またはリンパ球、または内皮細
胞である。プロモーターは、例えば非特異的および細胞
サイクル特異的または標的細胞特異的および細胞サイク
ル特異的である。
既に特許出願明細書ＷＯ９６／０６９４１号、ＤＥ１９
６１７８５１．７号、ＤＥ１９６３９１０３．２号およ
びＤＥ１９６５１４４３．６号明細書に記載されてお
り、上記特許明細書の内容は、その開示の一部として本
明細書に引用される。好適な標的細胞の例は、筋細胞、
マクロファージおよび／またはリンパ球、または内皮細
胞である。プロモーターは、例えば非特異的および細胞
サイクル特異的または標的細胞特異的および細胞サイク
ル特異的である。
【０１２４】感染性物質によって形成され、免疫反応を
誘発することによって、すなわち交替結合および／また
は細胞毒性Ｔリンパ球によって薬剤を中和しおよび／ま
たは破壊するタンパク質のＤＮＡが、例えば感染症の予
防の構造遺伝子として用いられる。このようないわゆる
中和抗原は、ワクチン化抗原として既に用いられている
（Ellis, Adv. Exp. Med. Biol., 327, 263 (1992)の総
説を参照されたい）。しかしながら、有効なワクチンを
作製する可能性は、通常は限定されている。更に、ＤＮ
Ａワクチンには、効力に関して問題がある(Fynan et a
l., Int. J. Immunopharm., 17, 79 (1995); Donnelly
et al., Immunol., 2, 20 (1994))。本発明の利点は、
効力が大きくなることを期待できることである。
誘発することによって、すなわち交替結合および／また
は細胞毒性Ｔリンパ球によって薬剤を中和しおよび／ま
たは破壊するタンパク質のＤＮＡが、例えば感染症の予
防の構造遺伝子として用いられる。このようないわゆる
中和抗原は、ワクチン化抗原として既に用いられている
（Ellis, Adv. Exp. Med. Biol., 327, 263 (1992)の総
説を参照されたい）。しかしながら、有効なワクチンを
作製する可能性は、通常は限定されている。更に、ＤＮ
Ａワクチンには、効力に関して問題がある(Fynan et a
l., Int. J. Immunopharm., 17, 79 (1995); Donnelly
et al., Immunol., 2, 20 (1994))。本発明の利点は、
効力が大きくなることを期待できることである。
【０１２５】したがって、本発明の意味では、下記の病
原性物質由来の中和抗原をコードするＤＮＡが好まし
い。インフルエンザＡウイルス、ＨＩＶ、狂犬病ウイル
ス、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＲＳＶ（呼吸器
多核体ウイルス）、パラインフルエンザウイルス、ロタ
ウイルス、ＶＺＶ（水痘−帯状疱疹ウイルス）、ＣＭＶ
（サイトメガロウイルス）、麻疹ウイルス、ＨＰＶ（ヒ
トパピローマウイルス）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイル
ス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、ＨＤＶ（Ｄ型肝炎
ウイルス）、ＨＥＶ（Ｅ型肝炎ウイルス）、ＨＡＶ（Ａ
型肝炎ウイルス）、コレラ菌抗原、Borrelia burgdorfe
i またはHelicobacter pylori またはマラリア抗原。
原性物質由来の中和抗原をコードするＤＮＡが好まし
い。インフルエンザＡウイルス、ＨＩＶ、狂犬病ウイル
ス、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＲＳＶ（呼吸器
多核体ウイルス）、パラインフルエンザウイルス、ロタ
ウイルス、ＶＺＶ（水痘−帯状疱疹ウイルス）、ＣＭＶ
（サイトメガロウイルス）、麻疹ウイルス、ＨＰＶ（ヒ
トパピローマウイルス）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイル
ス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、ＨＤＶ（Ｄ型肝炎
ウイルス）、ＨＥＶ（Ｅ型肝炎ウイルス）、ＨＡＶ（Ａ
型肝炎ウイルス）、コレラ菌抗原、Borrelia burgdorfe
i またはHelicobacter pylori またはマラリア抗原。
【０１２６】しかしながら、この種の活性物質として
は、抗イディオタイプ抗体のＤＮＡ、またはその抗原結
合断片であって、その抗原結合構造（相補性決定領域）
が、感染性物質の中和抗原のタンパク質構造または炭水
化物構造のコピーを構成するものも挙げられる。抗イデ
ィオタイプ抗体は、特に細菌性の感染性物質の場合に
は、炭水化物抗原を置換することができる。抗イディオ
タイプ抗体およびその開裂生成物はHawkins et al. (J.
Immunother., 14, 273 (1993)) およびWesterinkand A
picella (Springer Seminars in Immunopathol., 15, 2
27 (1993)) に総括されている。
は、抗イディオタイプ抗体のＤＮＡ、またはその抗原結
合断片であって、その抗原結合構造（相補性決定領域）
が、感染性物質の中和抗原のタンパク質構造または炭水
化物構造のコピーを構成するものも挙げられる。抗イデ
ィオタイプ抗体は、特に細菌性の感染性物質の場合に
は、炭水化物抗原を置換することができる。抗イディオ
タイプ抗体およびその開裂生成物はHawkins et al. (J.
Immunother., 14, 273 (1993)) およびWesterinkand A
picella (Springer Seminars in Immunopathol., 15, 2
27 (1993)) に総括されている。
【０１２７】「腫瘍ワクチン」の構造イディオタイプの
例は、腫瘍細胞上の抗原をコードする遺伝子である。こ
れらの抗原は、例えばSedlacek et al., Contrib. to O
ncol., 32, Karger Verlag, ミュンヘン(1988)およびCo
ntrib. to Oncol., 43, Karger Verlag, ミュンヘン(1
992)によって総括されている。
例は、腫瘍細胞上の抗原をコードする遺伝子である。こ
れらの抗原は、例えばSedlacek et al., Contrib. to O
ncol., 32, Karger Verlag, ミュンヘン(1988)およびCo
ntrib. to Oncol., 43, Karger Verlag, ミュンヘン(1
992)によって総括されている。
【０１２８】他の例は、下記の抗原または下記の抗イデ
ィオタイプ抗体をコードする遺伝子である。シアリル・
ルイス、Ｔ細胞によって認識される腫瘍上のペプチド、
癌遺伝子から発現されるタンパク質、血液群抗原および
その前駆物質、多形上皮ムチン上の抗原、または熱ショ
ックタンパク質上の抗原。
ィオタイプ抗体をコードする遺伝子である。シアリル・
ルイス、Ｔ細胞によって認識される腫瘍上のペプチド、
癌遺伝子から発現されるタンパク質、血液群抗原および
その前駆物質、多形上皮ムチン上の抗原、または熱ショ
ックタンパク質上の抗原。
【０１２９】慢性感染症の治療は、特許出願明細書ＷＯ
９６／０６９４１号、ＤＥ１９６１７８５１．７号、Ｄ
Ｅ１９６３９１０３．２号およびＤＥ１９６５１４４
３．６号明細書に詳細に記載されており、上記特許明細
書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用され
る。好適な標的細胞は、肝細胞、リンパ球および／また
はマクロファージ、上皮細胞または内皮細胞である。プ
ロモーター、例えばウイルス特異的または細胞特異的お
よび細胞サイクル特異的である。
９６／０６９４１号、ＤＥ１９６１７８５１．７号、Ｄ
Ｅ１９６３９１０３．２号およびＤＥ１９６５１４４
３．６号明細書に詳細に記載されており、上記特許明細
書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用され
る。好適な標的細胞は、肝細胞、リンパ球および／また
はマクロファージ、上皮細胞または内皮細胞である。プ
ロモーター、例えばウイルス特異的または細胞特異的お
よび細胞サイクル特異的である。
【０１３０】構造遺伝子は、例えば、細胞増殖抑制、ア
ポプトーシスまたは細胞毒性作用を示すタンパク質、ま
たは抗ウイルス性または上記の細胞毒性物質の前駆物質
を開裂して活性物質とする酵素をコードする。抗ウイル
スタンパク質をコードする構造遺伝子の例は、サイトカ
インおよび抗ウイルス作用を有する成長因子、例えばＩ
ＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＴＮＦβ、ＴＮＦα、Ｉ
Ｌ−１、またはＴＧＦβ、または既に記載されているよ
うにリンカーによって結合されている関連ウイルスを不
活性化する特異性を有する抗体またはそれらのＶＨ含有
およびＶＬ含有断片、またはそれらのＶＨおよびＶＬ断
片の遺伝子である。ウイルス抗原に対する抗体の例は、
抗−ＨＢＶ、抗−ＨＣＶ、抗−ＨＳＶ、抗−ＨＰＶ、抗
−ＨＩＶ抗−ＥＢＶ、抗ＨＴＬＶ、抗−コクサッキー
（coxsakie）ウイルスまたは抗−ハンターンウイルスで
ある。
ポプトーシスまたは細胞毒性作用を示すタンパク質、ま
たは抗ウイルス性または上記の細胞毒性物質の前駆物質
を開裂して活性物質とする酵素をコードする。抗ウイル
スタンパク質をコードする構造遺伝子の例は、サイトカ
インおよび抗ウイルス作用を有する成長因子、例えばＩ
ＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＴＮＦβ、ＴＮＦα、Ｉ
Ｌ−１、またはＴＧＦβ、または既に記載されているよ
うにリンカーによって結合されている関連ウイルスを不
活性化する特異性を有する抗体またはそれらのＶＨ含有
およびＶＬ含有断片、またはそれらのＶＨおよびＶＬ断
片の遺伝子である。ウイルス抗原に対する抗体の例は、
抗−ＨＢＶ、抗−ＨＣＶ、抗−ＨＳＶ、抗−ＨＰＶ、抗
−ＨＩＶ抗−ＥＢＶ、抗ＨＴＬＶ、抗−コクサッキー
（coxsakie）ウイルスまたは抗−ハンターンウイルスで
ある。
【０１３１】抗ウイルスタンパク質のもう一つの例は、
ｒｅｖ結合タンパク質である。このタンパク質はｒｅｖ
−ＲＮＡに結合して、レトロウイルス遺伝子発現におけ
るｒｅｖ依存性転写後段階を阻害する。ｒｅｖ結合タン
パク質の例は、ＲＢＰ９−２７、ＲＢＰ１−８Ｕ、ＲＢ
Ｐ１−８ＤまたはＲＢＰ１−８の偽遺伝子である。
ｒｅｖ結合タンパク質である。このタンパク質はｒｅｖ
−ＲＮＡに結合して、レトロウイルス遺伝子発現におけ
るｒｅｖ依存性転写後段階を阻害する。ｒｅｖ結合タン
パク質の例は、ＲＢＰ９−２７、ＲＢＰ１−８Ｕ、ＲＢ
Ｐ１−８ＤまたはＲＢＰ１−８の偽遺伝子である。
【０１３２】もう一つのウイルス性構造遺伝子は、細胞
サイクル制御タンパク質の遺伝子のｍＲＮＡまたはウイ
ルスのｍＲＮＡを消化するリボザイムをコードする。Ｈ
ＩＶに触媒作用を有するリボザイムは、例えばChristof
fersen et al., J. Med. Chem., 38, 2033 (1995) によ
って総括されている。
サイクル制御タンパク質の遺伝子のｍＲＮＡまたはウイ
ルスのｍＲＮＡを消化するリボザイムをコードする。Ｈ
ＩＶに触媒作用を有するリボザイムは、例えばChristof
fersen et al., J. Med. Chem., 38, 2033 (1995) によ
って総括されている。
【０１３３】抗菌性タンパク質をコードする構造遺伝子
の例は、細菌毒素を中和し、細菌をオプソニン化する抗
体の遺伝子である。これらの抗体の例は、ＣまたはＢ M
eningcocci、E. coli 、Borrelia、PseudomonasHelicob
acter pyloriまたはStaphylococcus aureus に対する抗
体である。
の例は、細菌毒素を中和し、細菌をオプソニン化する抗
体の遺伝子である。これらの抗体の例は、ＣまたはＢ M
eningcocci、E. coli 、Borrelia、PseudomonasHelicob
acter pyloriまたはStaphylococcus aureus に対する抗
体である。
【０１３４】IV) 同一または異なる構造遺伝子の組み
合わせ 特許出願明細書ＷＯ９６／０６９４１号、ＷＯ９６／０
６９３９号、ＷＯ９６／０６９４０号、ＷＯ９６／０６
９３８号、ＤＥ１９６３９１０３．２号およびＤＥ１９
６５１４４３．６号明細書に詳細に記載されており、上
記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書
に引用される。構造遺伝子の組み合わせの一例は、自己
増強性で、適当な場合には、薬理学的に制御可能な発現
系であって、２個の同一または２個の異なる構造遺伝子
［成分c)およびc') ］のＤＮＡ配列の組み合わせがある
ものである。別のプロモーター配列、または好ましくは
内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）に対するｃ
ＤＮＡが、２個のＤＮＡ配列を発現する目的で２個の構
造遺伝子の間に調節要素として挿入されている。ＩＲＥ
Ｓにより、ＩＲＥＳによって互いに結合されている２個
のＤＮＡ配列を発現することができる。このようなＩＲ
ＥＳは、例えばMontford and Smith, TIG, 11, 179 (19
95); Kaufman et al., Nucl. Acids Res., 19, 4485 (1
991); Morganet al., Nucl. Acids Res., 20, 1293 (19
92); Dirks et al., Gene, 128, 247, (1993); Pelleti
er and Sonenberg, Nature, 334, 320 (1988), およびS
ugimoto et al., BioTechn., 12, 694 (1994)) によっ
て記載されている。したがって、ポリオウイルスＩＲＥ
Ｓ配列（位置、５′ＵＴＲの＜１４０〜＞６３０）など
を用いることができる。
合わせ 特許出願明細書ＷＯ９６／０６９４１号、ＷＯ９６／０
６９３９号、ＷＯ９６／０６９４０号、ＷＯ９６／０６
９３８号、ＤＥ１９６３９１０３．２号およびＤＥ１９
６５１４４３．６号明細書に詳細に記載されており、上
記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書
に引用される。構造遺伝子の組み合わせの一例は、自己
増強性で、適当な場合には、薬理学的に制御可能な発現
系であって、２個の同一または２個の異なる構造遺伝子
［成分c)およびc') ］のＤＮＡ配列の組み合わせがある
ものである。別のプロモーター配列、または好ましくは
内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）に対するｃ
ＤＮＡが、２個のＤＮＡ配列を発現する目的で２個の構
造遺伝子の間に調節要素として挿入されている。ＩＲＥ
Ｓにより、ＩＲＥＳによって互いに結合されている２個
のＤＮＡ配列を発現することができる。このようなＩＲ
ＥＳは、例えばMontford and Smith, TIG, 11, 179 (19
95); Kaufman et al., Nucl. Acids Res., 19, 4485 (1
991); Morganet al., Nucl. Acids Res., 20, 1293 (19
92); Dirks et al., Gene, 128, 247, (1993); Pelleti
er and Sonenberg, Nature, 334, 320 (1988), およびS
ugimoto et al., BioTechn., 12, 694 (1994)) によっ
て記載されている。したがって、ポリオウイルスＩＲＥ
Ｓ配列（位置、５′ＵＴＲの＜１４０〜＞６３０）など
を用いることができる。
【０１３５】追加の効果を示し、別のプロモーター配列
またはＩＲＥＳ配列によって連結された構造遺伝子が好
ましい。腫瘍の治療の構造遺伝子の好ましい組み合わせ
は、例えば同一または異なる、細胞増殖抑制、アポトー
シス、細胞毒性または炎症タンパク質、および／または
細胞増殖抑制物質の前駆物質を開裂する同一または異な
る酵素をコードする。自己免疫疾患の治療に好ましい組
み合わせは、細胞性および／または体液性免疫反応を阻
害するための相乗作用を有する異なるサイトカインまた
はレセプター、または異なるまたは同一のＴＩＭＰをコ
ードする。血液細胞の形成不全の治療の好ましい組み合
わせは、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６またはＧＭ−Ｃ
ＳＦおよびエリスロポエチンのような異なる階層的に連
続したサイトカイン、Ｇ−ＣＳＦまたはトロンボポエチ
ンをコードする。神経細胞損傷の治療のための好ましい
組み合わせは、ニューロン成長因子およびサイトカイン
またはサイトカインのインヒビターをコードする。血液
凝固系および血液循環系の障害の治療に好ましい組み合
わせは血栓抑制物質およびフィブリン溶解物質（例え
ば、ｔＰＡまたはｕＰＡ）、または細胞増殖抑制、アポ
プトーシスまたは細胞毒性タンパク質、および血栓抑制
物質またはフィブリン溶解物質、または数種類の異なる
層状的に作用する血液凝固因子、例えばＦVIIIおよびｖ
ＷＦまたはＦVIIIおよびＦIXをコードする。ワクチンに
ついての好ましい組み合わせは抗原と免疫刺激性サイト
カイン、例えばＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−３またはＩＬ−４レセプター、１つ
の感染性物質のまたは異なる感染性物質の異なる抗原、
または一つの腫瘍型または異なる腫瘍型の異なる抗原を
コードする。ウイルス感染症の治療についての好ましい
組み合わせは、抗ウイルスタンパク質と細胞増殖抑制、
アポトーシスまたは細胞毒性タンパク質、または１種類
のウイルスまたは数種類のウイルスの異なる表面抗原に
対する抗体をコードする。細菌性感染性疾患の治療につ
いて好ましい組み合わせは、異なる表面抗原および／ま
たは原因生物の毒素に対する抗体をコードする。
またはＩＲＥＳ配列によって連結された構造遺伝子が好
ましい。腫瘍の治療の構造遺伝子の好ましい組み合わせ
は、例えば同一または異なる、細胞増殖抑制、アポトー
シス、細胞毒性または炎症タンパク質、および／または
細胞増殖抑制物質の前駆物質を開裂する同一または異な
る酵素をコードする。自己免疫疾患の治療に好ましい組
み合わせは、細胞性および／または体液性免疫反応を阻
害するための相乗作用を有する異なるサイトカインまた
はレセプター、または異なるまたは同一のＴＩＭＰをコ
ードする。血液細胞の形成不全の治療の好ましい組み合
わせは、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６またはＧＭ−Ｃ
ＳＦおよびエリスロポエチンのような異なる階層的に連
続したサイトカイン、Ｇ−ＣＳＦまたはトロンボポエチ
ンをコードする。神経細胞損傷の治療のための好ましい
組み合わせは、ニューロン成長因子およびサイトカイン
またはサイトカインのインヒビターをコードする。血液
凝固系および血液循環系の障害の治療に好ましい組み合
わせは血栓抑制物質およびフィブリン溶解物質（例え
ば、ｔＰＡまたはｕＰＡ）、または細胞増殖抑制、アポ
プトーシスまたは細胞毒性タンパク質、および血栓抑制
物質またはフィブリン溶解物質、または数種類の異なる
層状的に作用する血液凝固因子、例えばＦVIIIおよびｖ
ＷＦまたはＦVIIIおよびＦIXをコードする。ワクチンに
ついての好ましい組み合わせは抗原と免疫刺激性サイト
カイン、例えばＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−３またはＩＬ−４レセプター、１つ
の感染性物質のまたは異なる感染性物質の異なる抗原、
または一つの腫瘍型または異なる腫瘍型の異なる抗原を
コードする。ウイルス感染症の治療についての好ましい
組み合わせは、抗ウイルスタンパク質と細胞増殖抑制、
アポトーシスまたは細胞毒性タンパク質、または１種類
のウイルスまたは数種類のウイルスの異なる表面抗原に
対する抗体をコードする。細菌性感染性疾患の治療につ
いて好ましい組み合わせは、異なる表面抗原および／ま
たは原因生物の毒素に対する抗体をコードする。
【０１３６】Ｖ) シグナル配列と膜貫通ドメインの挿
入 詳細な説明は、特許出願明細書ＤＥ１９３９１０３．２
号およびＤＥ１９６５１４４３．６号に既に示されてお
り、上記特許明細書の内容は、その開示の一部として本
明細書に引用される。
入 詳細な説明は、特許出願明細書ＤＥ１９３９１０３．２
号およびＤＥ１９６５１４４３．６号に既に示されてお
り、上記特許明細書の内容は、その開示の一部として本
明細書に引用される。
【０１３７】翻訳を高めるため、ヌクレオチド配列ＧＣ
ＣＡＣＣまたはＧＣＣＧＣＣ(Kozak, J. Cell Biol., 1
08, 299 (1989)) をプロモーター配列の３′末端、およ
びシグナルまたは膜貫通配列の開始シグナル（ＡＴＧ）
５′末端に直接挿入することができる。
ＣＡＣＣまたはＧＣＣＧＣＣ(Kozak, J. Cell Biol., 1
08, 299 (1989)) をプロモーター配列の３′末端、およ
びシグナルまたは膜貫通配列の開始シグナル（ＡＴＧ）
５′末端に直接挿入することができる。
【０１３８】構造遺伝子の発現生成物の分泌を促進する
ため、構造遺伝子のＤＮＡ配列に含まれることがある相
同性シグナル配列を細胞外分泌を向上させる異種シグナ
ル配列で置換することができる。したがって、免疫グロ
ブリンについてのシグナル配列（ＤＮＡ位置６３〜１０
７；Riechmann et al., Nature, 332, 323 (1988))また
はＣＥＡについてのシグナル配列（ＤＮＡ位置３３〜１
３４；Schrewe et al., Mol. Cell Biol., 10, 2738 (1
990); Berling et al., Cancer Res., 50, 6534 (199
0)) またはヒト呼吸器多核体ウイルス糖タンパク質のシ
グナル配列（アミノ酸３８〜５０または４８〜６５につ
いてのｃＤＮＡ；Lichtenstein et al., J. Gen. Viro
l., 77, 109 (1996))などを挿入することができる。
ため、構造遺伝子のＤＮＡ配列に含まれることがある相
同性シグナル配列を細胞外分泌を向上させる異種シグナ
ル配列で置換することができる。したがって、免疫グロ
ブリンについてのシグナル配列（ＤＮＡ位置６３〜１０
７；Riechmann et al., Nature, 332, 323 (1988))また
はＣＥＡについてのシグナル配列（ＤＮＡ位置３３〜１
３４；Schrewe et al., Mol. Cell Biol., 10, 2738 (1
990); Berling et al., Cancer Res., 50, 6534 (199
0)) またはヒト呼吸器多核体ウイルス糖タンパク質のシ
グナル配列（アミノ酸３８〜５０または４８〜６５につ
いてのｃＤＮＡ；Lichtenstein et al., J. Gen. Viro
l., 77, 109 (1996))などを挿入することができる。
【０１３９】膜貫通ドメインの配列は、活性化合物を形
成している形質導入細胞の細胞膜に活性化合物を固定す
るため、代替物としてまたは追加としてシグナル配列に
挿入することができる。例えば、ヒトマクロファージコ
ロニー刺激因子の膜貫通配列（ＤＮＡ位置１４８５〜１
５５４；Cosman et al., Behring Inst. Mitt., 77,15
(1988))またはヒト呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）糖
タンパク質Ｇのシグナルおよび膜貫通領域のＤＮＡ配列
（アミノ酸１〜６３またはそれらの部分配列、アミノ酸
３８〜６３；Vijaya et al., Mol. Cell Biol., 8, 170
9 (1988); Lichtenstein et al., J. Gen. Virol., 77,
109 (1996))、またはインフルエンザウイルスノイラミ
ニダーゼのシグナルおよび膜貫通領域のＤＮＡ配列（ア
ミノ酸７〜３５または部分配列アミノ酸７〜２７；Brow
n et al., J. Virol., 62, 3824(1988)) を、例えばプ
ロモーター配列と構造遺伝子の配列との間に挿入するこ
とができる。
成している形質導入細胞の細胞膜に活性化合物を固定す
るため、代替物としてまたは追加としてシグナル配列に
挿入することができる。例えば、ヒトマクロファージコ
ロニー刺激因子の膜貫通配列（ＤＮＡ位置１４８５〜１
５５４；Cosman et al., Behring Inst. Mitt., 77,15
(1988))またはヒト呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）糖
タンパク質Ｇのシグナルおよび膜貫通領域のＤＮＡ配列
（アミノ酸１〜６３またはそれらの部分配列、アミノ酸
３８〜６３；Vijaya et al., Mol. Cell Biol., 8, 170
9 (1988); Lichtenstein et al., J. Gen. Virol., 77,
109 (1996))、またはインフルエンザウイルスノイラミ
ニダーゼのシグナルおよび膜貫通領域のＤＮＡ配列（ア
ミノ酸７〜３５または部分配列アミノ酸７〜２７；Brow
n et al., J. Virol., 62, 3824(1988)) を、例えばプ
ロモーター配列と構造遺伝子の配列との間に挿入するこ
とができる。
【０１４０】しかしながら、糖リン脂質アンカーのヌク
レオチド配列を挿入して、活性化合物を形成している形
質導入細胞の細胞膜に活性化合物を固定することもでき
る。糖リン脂質アンカーは構造遺伝子のヌクレオチド配
列の３′末端に挿入され、この挿入はシグナル配列の挿
入に加えて行なうこともできる。糖リン脂質アンカー
は、例えばＣＥＡについて、Ｎ−ＣＡＭについて、およ
び他の膜タンパク質、例えばＴｈｙ−１について記載さ
れている（Ferguson et al., Ann. Rev. Biochem., 57,
285 (1988) の総説を参照されたい）。
レオチド配列を挿入して、活性化合物を形成している形
質導入細胞の細胞膜に活性化合物を固定することもでき
る。糖リン脂質アンカーは構造遺伝子のヌクレオチド配
列の３′末端に挿入され、この挿入はシグナル配列の挿
入に加えて行なうこともできる。糖リン脂質アンカー
は、例えばＣＥＡについて、Ｎ−ＣＡＭについて、およ
び他の膜タンパク質、例えばＴｈｙ−１について記載さ
れている（Ferguson et al., Ann. Rev. Biochem., 57,
285 (1988) の総説を参照されたい）。
【０１４１】本発明により細胞膜に活性化合物を固定す
るためのもう一つの方法は、リガンド／活性化合物融合
タンパク質についてのＤＮＡ配列を用いる方法である。
この融合タンパク質のリガンドの特異性は、選択された
標的細胞の細胞膜上の膜構造に対して向けられている。
るためのもう一つの方法は、リガンド／活性化合物融合
タンパク質についてのＤＮＡ配列を用いる方法である。
この融合タンパク質のリガンドの特異性は、選択された
標的細胞の細胞膜上の膜構造に対して向けられている。
【０１４２】細胞の表面に結合しているリガンドとして
は、例えば内皮細胞の表面上の構造に対して向けられて
いる抗体または抗体断片が挙げられる。これらの抗体ま
たは抗体断片としては、特にＶＥＧＦに対するまたはキ
ニンレセプターに対する抗体が挙げられる。それらは筋
細胞に対して向けられることもでき、例えばアクチンに
対する抗体またはアンギオテンシンIIレセプターに対す
る抗体、または成長因子のレセプターに対する抗体、例
えばＥＧＦレセプターに対する、またはＰＤＧＦレセプ
ターに対する、またはＦＧＦレセプターに対するもの、
または内皮Ａレセプターに対する抗体であることができ
る。
は、例えば内皮細胞の表面上の構造に対して向けられて
いる抗体または抗体断片が挙げられる。これらの抗体ま
たは抗体断片としては、特にＶＥＧＦに対するまたはキ
ニンレセプターに対する抗体が挙げられる。それらは筋
細胞に対して向けられることもでき、例えばアクチンに
対する抗体またはアンギオテンシンIIレセプターに対す
る抗体、または成長因子のレセプターに対する抗体、例
えばＥＧＦレセプターに対する、またはＰＤＧＦレセプ
ターに対する、またはＦＧＦレセプターに対するもの、
または内皮Ａレセプターに対する抗体であることができ
る。
【０１４３】リガンドとしては、腫瘍細胞膜上の腫瘍特
異的または腫瘍関連抗原に対して向けられている抗体ま
たはその断片が挙げられる。この種の抗体は、既に記載
されている。ネズミモノクローナル抗体は、ヒト化形態
で用いるのが好ましい。Ｆａｂおよび組換えＦｖ断片、
およびそれらの融合生成物は、既述のように当業者に知
られている方法を用いて作成される。
異的または腫瘍関連抗原に対して向けられている抗体ま
たはその断片が挙げられる。この種の抗体は、既に記載
されている。ネズミモノクローナル抗体は、ヒト化形態
で用いるのが好ましい。Ｆａｂおよび組換えＦｖ断片、
およびそれらの融合生成物は、既述のように当業者に知
られている方法を用いて作成される。
【０１４４】リガンドとしては、更に総ての活性化合
物、例えばサイトカインまたは付着分子、成長因子また
はそれらの断片またはその部分配列、メディエイター、
または頁関連の選択された細胞上の膜構造または膜レセ
プターに結合しているペプチドホルモンが挙げられる。
例は、内皮細胞についてのリガンド、例えばＩＬ−１、
ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＧβ（Pusztain e
t al., J. Pathol., 169, 191 (1993)) またはキニンお
よびキニンの誘導体または類似体である。これらのリガ
ンドは、付着分子も含む。この種の付着分子、例えばＳ
Ｌｅｘ、ＬＦＡ−１、ＭＡＣ−１、ＬｅＣＡＭ−１、Ｖ
ＬＡ−４、またはビトロネクチンおよびビトロネクチン
の誘導体または類似体は、内皮細胞について既に記載さ
れている（Augustin-Voss et al., J. Cell Biol., 11
9, 483 (1992); Pauli et al., Cancer Metast. Rev.,
9, 175 (1990); Honn et al., Cancer Metast. Rev., 1
1, 353 (1992); Varner et al., Cell Adh. Commun.,
3, 367 (1995))。
物、例えばサイトカインまたは付着分子、成長因子また
はそれらの断片またはその部分配列、メディエイター、
または頁関連の選択された細胞上の膜構造または膜レセ
プターに結合しているペプチドホルモンが挙げられる。
例は、内皮細胞についてのリガンド、例えばＩＬ−１、
ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＧβ（Pusztain e
t al., J. Pathol., 169, 191 (1993)) またはキニンお
よびキニンの誘導体または類似体である。これらのリガ
ンドは、付着分子も含む。この種の付着分子、例えばＳ
Ｌｅｘ、ＬＦＡ−１、ＭＡＣ−１、ＬｅＣＡＭ−１、Ｖ
ＬＡ−４、またはビトロネクチンおよびビトロネクチン
の誘導体または類似体は、内皮細胞について既に記載さ
れている（Augustin-Voss et al., J. Cell Biol., 11
9, 483 (1992); Pauli et al., Cancer Metast. Rev.,
9, 175 (1990); Honn et al., Cancer Metast. Rev., 1
1, 353 (1992); Varner et al., Cell Adh. Commun.,
3, 367 (1995))。
【０１４５】
【実施例】本発明を下記の図、表および例を用いて説明
するが、これらに限定されるものではない。
するが、これらに限定されるものではない。
【０１４６】断片は、Q1Aquick（商品名）スピンカラム
(Qiagen)により精製し、ｐＧＬ３ベクター(Promega) に
クローニングした。
(Qiagen)により精製し、ｐＧＬ３ベクター(Promega) に
クローニングした。
【０１４７】例 １． ネズミｃｄｃ２５Ｂプロモーターのクローニング
および分析 ネズミｃｄｃ２５Ｂプロモーターをクローニングするた
め、ネズミゲノムファージライブラリー（マウス品種１
２９ＦＶＪ、Stratagene）からの約１０６個のファージ
プラークを、Λ−Ｆｉｘ(Stratagene)でスクリーニング
した。このスクリーニングで用いたプローブは、ネズミ
ｃｄｃ２５Ｂ ｃＤＮＡ(Kakizuka et al., Genes De
v., 6, 587 (1992))の外側５′領域に向けられた８０ｂ
ｐのオリゴヌクレオチドであった。配列は、下記の通り
である。
および分析 ネズミｃｄｃ２５Ｂプロモーターをクローニングするた
め、ネズミゲノムファージライブラリー（マウス品種１
２９ＦＶＪ、Stratagene）からの約１０６個のファージ
プラークを、Λ−Ｆｉｘ(Stratagene)でスクリーニング
した。このスクリーニングで用いたプローブは、ネズミ
ｃｄｃ２５Ｂ ｃＤＮＡ(Kakizuka et al., Genes De
v., 6, 587 (1992))の外側５′領域に向けられた８０ｂ
ｐのオリゴヌクレオチドであった。配列は、下記の通り
である。
【０１４８】プローブ１： ５′ＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣ
ＣＴＴＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＣＡＣＧＡＴＧＧＡＧ
ＧＴＡＣＣＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣＧＣＣＧＧ
ＧＴＴＣＡＧＣＴＣＴＣＡＧＴＣＣＴＧＣＣ−３′（配
列番号：４） 生成する６個のファージクローンの３個を単離し、増幅
して、制限消化（Gibco 製酵素）によりおよびネズミｃ
ｄｃ２５Ｂ ｃＤＮＡの他の３′に配置した配列に対し
て向けられている２個の追加のプローブを用いてマッピ
ングした（図５）。
ＣＴＴＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＣＡＣＧＡＴＧＧＡＧ
ＧＴＡＣＣＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣＧＣＣＧＧ
ＧＴＴＣＡＧＣＴＣＴＣＡＧＴＣＣＴＧＣＣ−３′（配
列番号：４） 生成する６個のファージクローンの３個を単離し、増幅
して、制限消化（Gibco 製酵素）によりおよびネズミｃ
ｄｃ２５Ｂ ｃＤＮＡの他の３′に配置した配列に対し
て向けられている２個の追加のプローブを用いてマッピ
ングした（図５）。
【０１４９】プローブ２： ５′ＧＧＴＣＡＴＴＣＡＡ
ＡＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＣＣＡＴＡＡＡＡＣＧＣＴＴ
ＣＣＧＡＴＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＧＧＣＴＴＧＣＴ
ＧＧＡＡＣＡＣＡＧＴＣＣＧＧＴＧＣＴＧ−３′（配列
番号：５）
ＡＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＣＣＡＴＡＡＡＡＣＧＣＴＴ
ＣＣＧＡＴＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＧＧＣＴＴＧＣＴ
ＧＧＡＡＣＡＣＡＧＴＣＣＧＧＴＧＣＴＧ−３′（配列
番号：５）
【０１５０】プローブ３： ５′ＧＴＴＡＡＡＧＡＡＧ
ＣＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＧ
ＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＡＴ
ＡＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＣＣＡＡＴＧＡ−３′（配
列番号：６）
ＣＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＧ
ＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＡＴ
ＡＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＣＣＡＡＴＧＡ−３′（配
列番号：６）
【０１５１】最後に、公表されたｃＤＮＡ（Kakizuka e
t al.,上記文献参照）と隣接している基端部エンハンサ
ー領域からの４．６ｋｂ断片を、アガロースゲル電気泳
動によって精製した酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ(Gib
co) を用い、Q1Aquick（商品名）スピンカラム(Qiagen)
を用いて、ファージVIから切り取り、Bluescript SKII
ベクター(Stratagene)に挿入した（図５）。クローニン
グした４．６ｋｂの３′領域の１．５ｋｂを、配列をｃ
ｄｃ２５Ｂ遺伝子のネズミホモローグと同様に、各種種
からのｃｄｃ２５Ｂ ｃＤＮＡ配列と比較することによ
って配列決定して同定した。
t al.,上記文献参照）と隣接している基端部エンハンサ
ー領域からの４．６ｋｂ断片を、アガロースゲル電気泳
動によって精製した酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ(Gib
co) を用い、Q1Aquick（商品名）スピンカラム(Qiagen)
を用いて、ファージVIから切り取り、Bluescript SKII
ベクター(Stratagene)に挿入した（図５）。クローニン
グした４．６ｋｂの３′領域の１．５ｋｂを、配列をｃ
ｄｃ２５Ｂ遺伝子のネズミホモローグと同様に、各種種
からのｃｄｃ２５Ｂ ｃＤＮＡ配列と比較することによ
って配列決定して同定した。
【０１５２】各種の断片をこの配列決定した領域から切
り取り、ｐＧＬ３ルシフェラーゼリポーターベクター(P
romega) にクローニングし、ＮＩＨ−３Ｔ３マウス繊維
芽腫（ＡＴＣＣ）におけるプロモーター活性を試験し
た。（一過性）トランスフェクションを、ＤＥＡＥ／デ
キストラン法（Sompayrac et al., PNAS, 78, 7575 (19
81) の改良法）を用いて行なった。この実験で用いたコ
ントラストはｐＧＬ３ベクター(Promega) 中のＳＶ４０
基本プロモーターであり、このプロモーターは有意な細
胞サイクル調節を受けにくく、陽性コントロールして、
ヒトｃｄｃ２５Ｃプロモーター（Ｃ２９０，Lucibello
et al., EMBO J., 14, 132 (1995))の断片をｐＧＬ３ベ
クターにクローニングした。ルシフェラーゼ活性を、上
記の方法(Herber et al., Oncogene, 9, 1295 (1994))
で測定した。
り取り、ｐＧＬ３ルシフェラーゼリポーターベクター(P
romega) にクローニングし、ＮＩＨ−３Ｔ３マウス繊維
芽腫（ＡＴＣＣ）におけるプロモーター活性を試験し
た。（一過性）トランスフェクションを、ＤＥＡＥ／デ
キストラン法（Sompayrac et al., PNAS, 78, 7575 (19
81) の改良法）を用いて行なった。この実験で用いたコ
ントラストはｐＧＬ３ベクター(Promega) 中のＳＶ４０
基本プロモーターであり、このプロモーターは有意な細
胞サイクル調節を受けにくく、陽性コントロールして、
ヒトｃｄｃ２５Ｃプロモーター（Ｃ２９０，Lucibello
et al., EMBO J., 14, 132 (1995))の断片をｐＧＬ３ベ
クターにクローニングした。ルシフェラーゼ活性を、上
記の方法(Herber et al., Oncogene, 9, 1295 (1994))
で測定した。
【０１５３】ヌクレオチド配列−９５０〜＋１６７は、
ネズミｃ２５Ｂ遺伝子のプロモーターであることが分か
った（配列番号：７、図７および８を参照されたい）。
ネズミｃ２５Ｂ遺伝子のプロモーターであることが分か
った（配列番号：７、図７および８を参照されたい）。
【０１５４】各種の欠失断片をネズミｃｄｃ２５Ｂ遺伝
子（図６）のプロモーターから切り取り、ｐＧＬ３ルシ
フェラーゼリポーターベクター(Promega) にクローニン
グし、ＮＩＨ−３Ｔ３マウス繊維芽腫で記載した方法で
プロモーター活性について試験した。
子（図６）のプロモーターから切り取り、ｐＧＬ３ルシ
フェラーゼリポーターベクター(Promega) にクローニン
グし、ＮＩＨ−３Ｔ３マウス繊維芽腫で記載した方法で
プロモーター活性について試験した。
【０１５５】異なる欠失構築物の細胞サイクル反応を分
析するため、正常に成長している一過性のトランスフェ
クションした細胞をそれぞれの場合に、文献記載の方法
でトランスフェクションの後に血清を除去した同様な細
胞と比較した(Lucibello etal., EMBO J., 14, 132 (19
95)) 。結果を表１および２にまとめている。表１およ
び２： 異なる欠失構築物のプロモーター活性。この表
は、図６に示された構築物の成長しておりかつ無血清Ｎ
ＩＨ−３Ｔ３細胞における相対的ルシフェラーゼ活性を
示している。成長対飢餓細胞についての値の商から決定
されるプロモーターの細胞サイクル誘導は、最後の欄に
示す。これに関して、成長細胞における最長の構築物に
ついての値を１００として、残りの値をこの対照値と比
較する。
析するため、正常に成長している一過性のトランスフェ
クションした細胞をそれぞれの場合に、文献記載の方法
でトランスフェクションの後に血清を除去した同様な細
胞と比較した(Lucibello etal., EMBO J., 14, 132 (19
95)) 。結果を表１および２にまとめている。表１およ
び２： 異なる欠失構築物のプロモーター活性。この表
は、図６に示された構築物の成長しておりかつ無血清Ｎ
ＩＨ−３Ｔ３細胞における相対的ルシフェラーゼ活性を
示している。成長対飢餓細胞についての値の商から決定
されるプロモーターの細胞サイクル誘導は、最後の欄に
示す。これに関して、成長細胞における最長の構築物に
ついての値を１００として、残りの値をこの対照値と比
較する。
【表１】 表１： プロモーターの機能領域を決定するための比較
的大きなサイズの欠失、およびＴＡＴＡボックスの点突
然変異。
的大きなサイズの欠失、およびＴＡＴＡボックスの点突
然変異。
【０１５６】
【表２】 表２： 基部Ｓｐ１結合部位およびＮＦ−Ｙ−結合部位
の逐次欠失、およびＮＦ−Ｙ−結合部位の点突然変異。
この場合には、総てのこれらのアクティベーター結合部
位を含む構築物の成長細胞の活性を再度、簡単にするた
めに、１００とする（実際の活性は、構築物Ｂ−９５０
の活性に対応しない）。 a) 試験した欠失構築物（図６参照） b) 成長細胞のプロモーター活性 c) 静止細胞（無血清）のプロモーター活性 d) 細胞サイクル誘導（成長細胞のプロモーター活性を
静止細胞の活性と比較した商） これに関して、最長構築物、すなわちＢ−９５０（ヌク
レオチド配列−９５０〜＋１６７）は１０．１の細胞サ
イクル調節を示し、これはヒトｃｄｃ２５Ｃ構築物の値
に匹敵した（表１および２には示していない）。３′領
域の＋３までの欠失（図６を参照されたい）では、プロ
モーターの活性または細胞サイクル調節はまったく損失
せず、したがってプロモーター調節に関与する領域の範
囲を設定することができた。プロモーターの５′領域の
欠失は、２種類の異なる効果を生じ、一方では、最長構
築物、すなわちＢ−９５０のＢ−３４０間での欠失によ
りＧ０／Ｇ１細胞における活性が増加し、調節解除に相
当した。更に、欠失は、最後の欠失までプロモーター活
性を低下させ、次いで再度調節解除した（表１）。
の逐次欠失、およびＮＦ−Ｙ−結合部位の点突然変異。
この場合には、総てのこれらのアクティベーター結合部
位を含む構築物の成長細胞の活性を再度、簡単にするた
めに、１００とする（実際の活性は、構築物Ｂ−９５０
の活性に対応しない）。 a) 試験した欠失構築物（図６参照） b) 成長細胞のプロモーター活性 c) 静止細胞（無血清）のプロモーター活性 d) 細胞サイクル誘導（成長細胞のプロモーター活性を
静止細胞の活性と比較した商） これに関して、最長構築物、すなわちＢ−９５０（ヌク
レオチド配列−９５０〜＋１６７）は１０．１の細胞サ
イクル調節を示し、これはヒトｃｄｃ２５Ｃ構築物の値
に匹敵した（表１および２には示していない）。３′領
域の＋３までの欠失（図６を参照されたい）では、プロ
モーターの活性または細胞サイクル調節はまったく損失
せず、したがってプロモーター調節に関与する領域の範
囲を設定することができた。プロモーターの５′領域の
欠失は、２種類の異なる効果を生じ、一方では、最長構
築物、すなわちＢ−９５０のＢ−３４０間での欠失によ
りＧ０／Ｇ１細胞における活性が増加し、調節解除に相
当した。更に、欠失は、最後の欠失までプロモーター活
性を低下させ、次いで再度調節解除した（表１）。
【０１５７】出発部位は、プライマー伸張によって決定
した。このために、ＲＮＡを正常に成長しているＮＩＨ
−３Ｔ３マウス繊維芽腫から単離し、様々なプライマー
およびＭＭＬＶ逆転写酵素(Gibco) を用いて反応を行な
った。マッピングした出発部位をイニシエーター様配列
要素であるＴＡＴＡボックスの２４塩基対の３′に配置
する（配列番号：７、図７および８を参照されたい）。
した。このために、ＲＮＡを正常に成長しているＮＩＨ
−３Ｔ３マウス繊維芽腫から単離し、様々なプライマー
およびＭＭＬＶ逆転写酵素(Gibco) を用いて反応を行な
った。マッピングした出発部位をイニシエーター様配列
要素であるＴＡＴＡボックスの２４塩基対の３′に配置
する（配列番号：７、図７および８を参照されたい）。
【０１５８】欠失構築物のプロモーター活性が図７およ
び８に示した推定的転写因子結合部位の背景に対して考
察すると、この効果は特異的結合部位の欠失によって仲
介され、５′領域に位置したＥボックスの欠失はＴＡＴ
Ａボックスの近傍に配置した推定的Ｅ２Ｆ結合部位の欠
失と同様に、プロモーターを抑制解除することが明らか
である。他方、推定的アクティベーター結合部位（主と
してＳＰ１結合部位）とＮＦ−Ｙ−結合部位の欠失はプ
ロモーター活性を減少させる（表２参照）。これに関し
て、推定的ＮＦ−Ｙ部位の点突然変異は、野生型構築物
と比較して７４％異常の活性が損失した（表２参照）。
Ｓｐ１／Ｓｐ３およびＮＦ−Ｙ(Santa Cruz)に対する特
異抗体を用いる電気泳動移動度シフト分析法（ＥＭＳ
Ａ、Zwicker et al., Nucleic Acids Res., 23, No.19,
S.3822 ff, 1995に記載の方法）、および真のＳｐ１−
またはＮＦ−Ｙ−結合部位を用いる交差競争実験の結
果、Ｓｐ１／Ｓｐ３およびＮＦ−Ｙのそれぞれの推定的
結合部位への特異的結合を示した。
び８に示した推定的転写因子結合部位の背景に対して考
察すると、この効果は特異的結合部位の欠失によって仲
介され、５′領域に位置したＥボックスの欠失はＴＡＴ
Ａボックスの近傍に配置した推定的Ｅ２Ｆ結合部位の欠
失と同様に、プロモーターを抑制解除することが明らか
である。他方、推定的アクティベーター結合部位（主と
してＳＰ１結合部位）とＮＦ−Ｙ−結合部位の欠失はプ
ロモーター活性を減少させる（表２参照）。これに関し
て、推定的ＮＦ−Ｙ部位の点突然変異は、野生型構築物
と比較して７４％異常の活性が損失した（表２参照）。
Ｓｐ１／Ｓｐ３およびＮＦ−Ｙ(Santa Cruz)に対する特
異抗体を用いる電気泳動移動度シフト分析法（ＥＭＳ
Ａ、Zwicker et al., Nucleic Acids Res., 23, No.19,
S.3822 ff, 1995に記載の方法）、および真のＳｐ１−
またはＮＦ−Ｙ−結合部位を用いる交差競争実験の結
果、Ｓｐ１／Ｓｐ３およびＮＦ−Ｙのそれぞれの推定的
結合部位への特異的結合を示した。
【０１５９】ＴＡＴＡボックスおよびマッピングした出
発部位を含む最短構築物（Ｂ−３０）はかなりの程度ま
で調節解除されるが、これはｐＧＬ３ベクターのバック
グラウンド活性の２００倍を上回る活性を示す。更に、
ＴＡＴＡボックスの点突然変異の結果、プロモーター活
性の２５％以上が損失し（表１参照）、これによりプロ
モーター活性の調節におけるその機能的役割が確かめら
れた。
発部位を含む最短構築物（Ｂ−３０）はかなりの程度ま
で調節解除されるが、これはｐＧＬ３ベクターのバック
グラウンド活性の２００倍を上回る活性を示す。更に、
ＴＡＴＡボックスの点突然変異の結果、プロモーター活
性の２５％以上が損失し（表１参照）、これによりプロ
モーター活性の調節におけるその機能的役割が確かめら
れた。
【０１６０】転写因子結合部位（主として、ＳＰ１およ
びＮＦ−Ｙ）は、抑制または活性化によって細胞サイク
ル特異的に調節される多くの記載された遺伝子のものに
相当するが（総説については、Zwicker and Mueller, T
iGS 14, 3 (1997)を参照されたい）、機能的ＴＡＴＡボ
ックスを含む細胞サイクル遺伝子プロモーターはこれま
で報告されていない。
びＮＦ−Ｙ）は、抑制または活性化によって細胞サイク
ル特異的に調節される多くの記載された遺伝子のものに
相当するが（総説については、Zwicker and Mueller, T
iGS 14, 3 (1997)を参照されたい）、機能的ＴＡＴＡボ
ックスを含む細胞サイクル遺伝子プロモーターはこれま
で報告されていない。
【０１６１】したがって、ネズミｃｄｃ２５Ｂ遺伝子の
プロモーターは、ヌクレオチド＜−９５０〜＞＋１６
７、またはこれらのヌクレオチド配列の部分配列、例え
ば＜−９５０〜＞＋１、−９３０〜＋１６７、−７２０
〜＋１６７、−３４０〜＋１６７、−１８０〜１６７、
−１００〜＋１６７、−８０〜＋１６７、−６０〜＋１
６７、または−３０〜＋１６７、および／または＋３ま
たは＋１までの相当する部分配列を包含する。
プロモーターは、ヌクレオチド＜−９５０〜＞＋１６
７、またはこれらのヌクレオチド配列の部分配列、例え
ば＜−９５０〜＞＋１、−９３０〜＋１６７、−７２０
〜＋１６７、−３４０〜＋１６７、−１８０〜１６７、
−１００〜＋１６７、−８０〜＋１６７、−６０〜＋１
６７、または−３０〜＋１６７、および／または＋３ま
たは＋１までの相当する部分配列を包含する。
【０１６２】見出だされたネズミプロモーター配列から
続ければ、ネズミプロモーターを標識し、好ましくは放
射能標識し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ゼーションによって哺乳動物細胞から得たゲノムＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングすることによって、ネズ
ミｃｄｃ２５Ｂプロモーターに相同性の非ネズミｃｄｃ
２５Ｂプロモーターを見出だすことは当業者にとって簡
単なことである。
続ければ、ネズミプロモーターを標識し、好ましくは放
射能標識し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ゼーションによって哺乳動物細胞から得たゲノムＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングすることによって、ネズ
ミｃｄｃ２５Ｂプロモーターに相同性の非ネズミｃｄｃ
２５Ｂプロモーターを見出だすことは当業者にとって簡
単なことである。
【０１６３】２． 多重プロモーター法を用いる遺伝子
構築物の調製 a) アクティベーター応答性プロモーター単位の調製 新規なアクティベーター応答性プロモーター単位は、下
流芳香で互いに連続している下記の異なるヌクレオチド
配列を含んでなる。
構築物の調製 a) アクティベーター応答性プロモーター単位の調製 新規なアクティベーター応答性プロモーター単位は、下
流芳香で互いに連続している下記の異なるヌクレオチド
配列を含んでなる。
【０１６４】アクティベーターサブユニットＡ ｃｄｃ２５Ｂ遺伝子のプロモーター（核酸−９５０〜＋
１６７） ＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）（ＳＶ４０ラージ
Ｔ、アミノ酸１２６〜１３２；ＰＫＫＫＲＫＶ、Dingwa
ll et al., TIBS, 16, 478 (1991))、ＨＳＶ−１ ＶＰ
１６の酸性トランス活性化ドメイン（アミノ酸４０６〜
４８８；Triezenberg et al., Genes Developm., 2, 71
8 (1988)); Triezenberg, Curr.Opin. Gen. Developm.,
5, 190 (1995)) ＣＤ４糖タンパク質の細胞質部分についてのｃＤＮＡ
（アミノ酸３９７〜４３５; Simpson et al., Oncogen
e, 4, 1141 (1988); Mddon et al., Cell, 93 (1985))
１６７） ＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）（ＳＶ４０ラージ
Ｔ、アミノ酸１２６〜１３２；ＰＫＫＫＲＫＶ、Dingwa
ll et al., TIBS, 16, 478 (1991))、ＨＳＶ−１ ＶＰ
１６の酸性トランス活性化ドメイン（アミノ酸４０６〜
４８８；Triezenberg et al., Genes Developm., 2, 71
8 (1988)); Triezenberg, Curr.Opin. Gen. Developm.,
5, 190 (1995)) ＣＤ４糖タンパク質の細胞質部分についてのｃＤＮＡ
（アミノ酸３９７〜４３５; Simpson et al., Oncogen
e, 4, 1141 (1988); Mddon et al., Cell, 93 (1985))
【０１６５】アクティベーターサブユニットＢ ｃｄｃ２５Ｃ遺伝子のプロモーター（核酸−２９０〜＋
１２１；Zwicker et al., EMBO J., 14, 4514 (1995);
Zwicker et al., Nucl. Acids Res., 23, 3822(1995)) ＳＶ４０核局在シグナル（ＮＬＳ）（ＳＶ４０ラージ
Ｔ; アミノ酸１２６〜１３２ＰＫＫＫＲＫＶ；Dinwall
et al., TIBS, 16, 478 (1991)) Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインのｃＤＮＡ
（アミノ酸１〜１４７、Chasman and Kornberg, Mol. C
ell Biol., 10, 2916 (1990)) ｐ５１ Ｋｃｋタンパク質のＣＤ４結合配列のｃＤＮＡ
（アミノ酸１〜７１；Shaw et al., Cell, 59, 627 (19
89); Tumer et al., Cell, 60, 755 (1990); Perimutte
r et al., J. Cell. Biochem., 38, 117 (1988))。
１２１；Zwicker et al., EMBO J., 14, 4514 (1995);
Zwicker et al., Nucl. Acids Res., 23, 3822(1995)) ＳＶ４０核局在シグナル（ＮＬＳ）（ＳＶ４０ラージ
Ｔ; アミノ酸１２６〜１３２ＰＫＫＫＲＫＶ；Dinwall
et al., TIBS, 16, 478 (1991)) Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインのｃＤＮＡ
（アミノ酸１〜１４７、Chasman and Kornberg, Mol. C
ell Biol., 10, 2916 (1990)) ｐ５１ Ｋｃｋタンパク質のＣＤ４結合配列のｃＤＮＡ
（アミノ酸１〜７１；Shaw et al., Cell, 59, 627 (19
89); Tumer et al., Cell, 60, 755 (1990); Perimutte
r et al., J. Cell. Biochem., 38, 117 (1988))。
【０１６６】アクティベーター応答性プロモーター ヌクレオチド配列５′−ＣＧＧＡＣＡＡＴＧＴＴＧＡＣ
ＣＧ−３′を有するＧａｌ４結合タンパク質の結合配列
×１０(Chasman and kornberg, Mol. Cell. Biol., 10,
2916 (1989)) 基本ＳＶ４０プロモーター（核酸４８〜５１９１；Tooz
e （監修）ＤＮＡ腫瘍ウイルス(DNA Tumor Viruses (コ
ールドスプリングハーバー、ニューヨーク、ニューヨー
ク、Cold Spring Harbor Laboratory)エフェクター遺伝
子ルシフェラーゼのｃＤＮＡ(Nordeen Bio Techniques,
6, 454 (1988)) 。
ＣＧ−３′を有するＧａｌ４結合タンパク質の結合配列
×１０(Chasman and kornberg, Mol. Cell. Biol., 10,
2916 (1989)) 基本ＳＶ４０プロモーター（核酸４８〜５１９１；Tooz
e （監修）ＤＮＡ腫瘍ウイルス(DNA Tumor Viruses (コ
ールドスプリングハーバー、ニューヨーク、ニューヨー
ク、Cold Spring Harbor Laboratory)エフェクター遺伝
子ルシフェラーゼのｃＤＮＡ(Nordeen Bio Techniques,
6, 454 (1988)) 。
【０１６７】記載されたアクティベーター配列は、下記
の機能を有する。
の機能を有する。
【０１６８】ｃｄｃ２５Ｂプロモーターは、ＶＰ１６活
性化ドメインとＣＤ４の細胞質部分（活性化サブユニッ
トＡ）についての組み合わせたｃＤＮＡの転写を細胞サ
イクル特異的に調節する。ｃｄｃ２５Ｃプロモーターは
Ｇａｌ４のＤＮＡ結合タンパク質およびｐ５６ ｌｃｋ
タンパク質のＣＤ４結合部分についての組み合わせたｃ
ＤＮＡの転写を細胞サイクル特異的に調節する。アクテ
ィベーターサブユニットＡおよびＢの発現生成物は、ｐ
５６ ｋｃｋドメインに結合しているＣＤ４ドメインに
よって二量体化する。二量体タンパク質は、エフェクタ
ー遺伝子（＝ルシフェラーゼ遺伝子）の転写のためのア
クティベーター応答性プロモーター（Ｇａｌ４結合ドメ
イン／ＳＶ４０プロモーターについてのＤＮＡ配列）の
キメラ転写因子を構成する。
性化ドメインとＣＤ４の細胞質部分（活性化サブユニッ
トＡ）についての組み合わせたｃＤＮＡの転写を細胞サ
イクル特異的に調節する。ｃｄｃ２５Ｃプロモーターは
Ｇａｌ４のＤＮＡ結合タンパク質およびｐ５６ ｌｃｋ
タンパク質のＣＤ４結合部分についての組み合わせたｃ
ＤＮＡの転写を細胞サイクル特異的に調節する。アクテ
ィベーターサブユニットＡおよびＢの発現生成物は、ｐ
５６ ｋｃｋドメインに結合しているＣＤ４ドメインに
よって二量体化する。二量体タンパク質は、エフェクタ
ー遺伝子（＝ルシフェラーゼ遺伝子）の転写のためのア
クティベーター応答性プロモーター（Ｇａｌ４結合ドメ
イン／ＳＶ４０プロモーターについてのＤＮＡ配列）の
キメラ転写因子を構成する。
【０１６９】構築物の個々の成分はＰＣＲ増幅の際に異
なる要素の末端に加えられる好適な制限部位を介して互
いに連結している。連結は、当業者に知られておりかつ
制限部位に特異的な酵素およびＤＮＡリガーゼを用いて
行なう。これらの酵素は、市販されている。
なる要素の末端に加えられる好適な制限部位を介して互
いに連結している。連結は、当業者に知られておりかつ
制限部位に特異的な酵素およびＤＮＡリガーゼを用いて
行なう。これらの酵素は、市販されている。
【０１７０】この方法で調製したヌクレオチド構築物を
ｐＸＰ２プラスミノーゲンベクター(Nordeen， Bio Tec
hniques, 6, 454 (1988)) にクローニングした後、これ
を直接、またはコロイド分散液経でイン・ビボ適用の目
的で用いる。培養物中に保持されている３Ｔ３繊維芽細
胞を、当業者に知られている方法(Lucibello et al.,EM
BO J., 14, 132 (1995)) を用いて記載のプラスミノー
ゲンでトランスフェクションし、繊維芽細胞によって産
生されるルシフェラーゼの量をHerber et al.(Oncogen
e, 9, 1295 (1994))およびLucibello et al. (EMBO J.,
14, 132 (1995))によって報告された方法で測定する。
ｐＸＰ２プラスミノーゲンベクター(Nordeen， Bio Tec
hniques, 6, 454 (1988)) にクローニングした後、これ
を直接、またはコロイド分散液経でイン・ビボ適用の目
的で用いる。培養物中に保持されている３Ｔ３繊維芽細
胞を、当業者に知られている方法(Lucibello et al.,EM
BO J., 14, 132 (1995)) を用いて記載のプラスミノー
ゲンでトランスフェクションし、繊維芽細胞によって産
生されるルシフェラーゼの量をHerber et al.(Oncogen
e, 9, 1295 (1994))およびLucibello et al. (EMBO J.,
14, 132 (1995))によって報告された方法で測定する。
【０１７１】下記の結果が得られる。トランスフェクシ
ョンしていない繊維芽細胞(fibroblasts)と比較して、
トランスフェクションした繊維芽細胞では、ルシフェラ
ーゼが著しく増加することが確認される。増殖している
繊維芽細胞（ＤＮＡ＞２Ｓ）は、Ｇ０／Ｇ１で同期した
繊維芽細胞よりも実質的に多量のルシフェラーゼを形成
する。したがって、記載したアクティベーター応答性プ
ロモーター単位は、リポーター遺伝子ルシフェラーゼを
細胞サイクル依存的に発現する。
ョンしていない繊維芽細胞(fibroblasts)と比較して、
トランスフェクションした繊維芽細胞では、ルシフェラ
ーゼが著しく増加することが確認される。増殖している
繊維芽細胞（ＤＮＡ＞２Ｓ）は、Ｇ０／Ｇ１で同期した
繊維芽細胞よりも実質的に多量のルシフェラーゼを形成
する。したがって、記載したアクティベーター応答性プ
ロモーター単位は、リポーター遺伝子ルシフェラーゼを
細胞サイクル依存的に発現する。
【０１７２】ｂ）ハイブリッドプロモーターの調製 新規ハイブリッドプロモーターは下流の方向に各々連続
する下記の異なるヌクレオチド配列を含む：ｃｄｃ２５
Ｂ遺伝子のプロモーター（ヌクレオチド配列−９５０〜
＋１６７；ＴＡＴＡボックス（−３０〜−２３位の核酸
ＴＡＴＡＴＡＡをＴＧＴＡＴＡＡに変異させる））、配
列ＧＣＣＡＣＣ（Kodak, J. Cell Biol., 108, 229(198
9)）、免疫グロブリンシグナルペプチド（ヌクレオチド
配列＜６３〜＞１０７；Riechmann et al., Nature, 33
2, 323(1988)）、β−グルクロニダーゼをコードするｃ
ＤＮＡ（ヌクレオチド配列＜９３〜＞１９８２）（Oshi
ma et al., PNAS USA, 84, 685(1987)）、von Wilebran
d factor （ｖＷＦ）遺伝子のプロモーター（核酸−４
８７〜＋２４７；Jahroudi and Lynch, Mol. Cell Bio
l., 14 999(1994)）、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質
をコードする遺伝子（核酸配列＋１〜＋１００１；８６
２番のＡがＴに、８８９および８９０番のＧＴがＡＣ
に、８９５番のＣがＧにそれぞれ置換されている。Stru
bin and Struhl, Cell, 68, 721(1992);Heard et al.,
EMBO J. 12, 3519(1993)）。
する下記の異なるヌクレオチド配列を含む：ｃｄｃ２５
Ｂ遺伝子のプロモーター（ヌクレオチド配列−９５０〜
＋１６７；ＴＡＴＡボックス（−３０〜−２３位の核酸
ＴＡＴＡＴＡＡをＴＧＴＡＴＡＡに変異させる））、配
列ＧＣＣＡＣＣ（Kodak, J. Cell Biol., 108, 229(198
9)）、免疫グロブリンシグナルペプチド（ヌクレオチド
配列＜６３〜＞１０７；Riechmann et al., Nature, 33
2, 323(1988)）、β−グルクロニダーゼをコードするｃ
ＤＮＡ（ヌクレオチド配列＜９３〜＞１９８２）（Oshi
ma et al., PNAS USA, 84, 685(1987)）、von Wilebran
d factor （ｖＷＦ）遺伝子のプロモーター（核酸−４
８７〜＋２４７；Jahroudi and Lynch, Mol. Cell Bio
l., 14 999(1994)）、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質
をコードする遺伝子（核酸配列＋１〜＋１００１；８６
２番のＡがＴに、８８９および８９０番のＧＴがＡＣ
に、８９５番のＣがＧにそれぞれ置換されている。Stru
bin and Struhl, Cell, 68, 721(1992);Heard et al.,
EMBO J. 12, 3519(1993)）。
【０１７３】この構築物の個々の成分は、ＰＣＲ増幅中
にそれぞれの成分の末端に導入されている適当な制限部
位により連結される。連結は当業者に周知であり、制限
部位に特異的な酵素、並びにＤＮＡリガーゼを用いて実
施する。この方法に従って調製したヌクレオチド構築物
は、ｐＵＣ１８／１９プラスミドベクターにクローン化
される。ｐＵＣ１８／１９プラスミドベクターはインビ
ボにおける適用のために直接またはコロイド分散系にお
いて使用される。培地で維持されているヒト臍帯内皮細
胞および繊維芽細胞（Ｗｉ−３８）は当業者に慣用の方
法を用いて上記プラスミドとともにトランスフェクトす
る（Lucibello etal., EMBO J., 14, 132(1995)）。内
皮細胞により生産されたβグルクロニダーゼの量は４−
メチルウンベリフェリル−β−グルクロニダーゼを基質
として測定する。細胞サイクル特異性を確認するため
に、４８時間以上メチオニンを除くことによって内皮細
胞をＧ０／Ｇ１に同調させる。細胞のＤＮＡ含量はHoec
hst33258で染色した後蛍光活性化細胞選別器（Lucibell
o et al., EMBO J., 14, 132(1995)）により決定した。
にそれぞれの成分の末端に導入されている適当な制限部
位により連結される。連結は当業者に周知であり、制限
部位に特異的な酵素、並びにＤＮＡリガーゼを用いて実
施する。この方法に従って調製したヌクレオチド構築物
は、ｐＵＣ１８／１９プラスミドベクターにクローン化
される。ｐＵＣ１８／１９プラスミドベクターはインビ
ボにおける適用のために直接またはコロイド分散系にお
いて使用される。培地で維持されているヒト臍帯内皮細
胞および繊維芽細胞（Ｗｉ−３８）は当業者に慣用の方
法を用いて上記プラスミドとともにトランスフェクトす
る（Lucibello etal., EMBO J., 14, 132(1995)）。内
皮細胞により生産されたβグルクロニダーゼの量は４−
メチルウンベリフェリル−β−グルクロニダーゼを基質
として測定する。細胞サイクル特異性を確認するため
に、４８時間以上メチオニンを除くことによって内皮細
胞をＧ０／Ｇ１に同調させる。細胞のＤＮＡ含量はHoec
hst33258で染色した後蛍光活性化細胞選別器（Lucibell
o et al., EMBO J., 14, 132(1995)）により決定した。
【０１７４】下記の結果が得られた：β−グルクロニダ
ーゼの増加は、非感染繊維芽細胞とは対処的に、感染繊
維芽細胞において確認できない。感染内皮細胞は非感染
内皮細胞よりも実質的に多くのβ−グルクロニダーゼを
発現する。増殖内皮細胞（ＤＮＡ＞２Ｓ；Ｓ＝染色体１
セット）は、Ｇ０／Ｇ１（ＤＮＡ＝２Ｓ）に同調させた
内皮細胞よりも実質的に多くのβ−グルクロニダーゼを
分泌する。このように、上記の多重プロモーター単位に
よって、構造遺伝子β−グルクロニダーゼが細胞特異
的、細胞サイクル依存的に発現される。 ｃ）核保持シグナル（ＮＲＳ）および核輸出因子（ＮＥ
Ｆ）を有する多重プロモーターの調製 新規多重プロモーターは下流の方向に各々連続する下記
の異なるヌクレオチド配列を含む：ｃｄｃ２５Ｂ遺伝子
のプロモーター（ヌクレオチド配列−９５０〜＋１６
７）、配列ＧＣＣＡＣＣ（配列番号１）（kodak, J. Ce
ll Biol., 108, 229(1989)）、免疫グロブリンシグナル
ペプチド（ヌクレオチド配列＜６３〜＞１０７；Riechm
ann et al., Nature, 332, 323(1988)）、β−グルクロ
ニダーゼをコードするｃＤＮＡ（ヌクレオチド配列＜９
３〜＞１９８２）（Oshima et al., PNA USA, 84, 685
(1987)）、核保持シグナル（ＮＲＳ）としてのＨＩＶウ
イルスＲＥＲをコードするｃＤＮＡ（ヌクレオチド配列
７３５７〜７６０２；Rantner et al., Nature, 313, 2
77(1985); Malim et al., Nature, 338, 254(1989)）、
von Wilebrand factor （ｖＷＦ）遺伝子のプロモータ
ー（核酸−４８７〜＋２４７；Jahroudi and Lynch, Mo
l. Cell Biol., 14 999(1994)）、核輸出因子（ＮＥ
Ｆ）としてのＨＩＶ−１ウイルスＲＥＶをコードするｃ
ＤＮＡ（アミノ酸配列１〜１１７；Rantner et al., Na
ture, 313, 277(1985)）。細胞サイクル特異性を確認す
るために、４８時間以上メチオニンを除くことによって
内皮細胞をＧ０／Ｇ１に同調させる。細胞のＤＮＡ含量
はHoechst33258で染色した後蛍光活性化細胞選別器（Lu
cibello et al., EMBO J., 14, 132(1995)）により決定
した。
ーゼの増加は、非感染繊維芽細胞とは対処的に、感染繊
維芽細胞において確認できない。感染内皮細胞は非感染
内皮細胞よりも実質的に多くのβ−グルクロニダーゼを
発現する。増殖内皮細胞（ＤＮＡ＞２Ｓ；Ｓ＝染色体１
セット）は、Ｇ０／Ｇ１（ＤＮＡ＝２Ｓ）に同調させた
内皮細胞よりも実質的に多くのβ−グルクロニダーゼを
分泌する。このように、上記の多重プロモーター単位に
よって、構造遺伝子β−グルクロニダーゼが細胞特異
的、細胞サイクル依存的に発現される。 ｃ）核保持シグナル（ＮＲＳ）および核輸出因子（ＮＥ
Ｆ）を有する多重プロモーターの調製 新規多重プロモーターは下流の方向に各々連続する下記
の異なるヌクレオチド配列を含む：ｃｄｃ２５Ｂ遺伝子
のプロモーター（ヌクレオチド配列−９５０〜＋１６
７）、配列ＧＣＣＡＣＣ（配列番号１）（kodak, J. Ce
ll Biol., 108, 229(1989)）、免疫グロブリンシグナル
ペプチド（ヌクレオチド配列＜６３〜＞１０７；Riechm
ann et al., Nature, 332, 323(1988)）、β−グルクロ
ニダーゼをコードするｃＤＮＡ（ヌクレオチド配列＜９
３〜＞１９８２）（Oshima et al., PNA USA, 84, 685
(1987)）、核保持シグナル（ＮＲＳ）としてのＨＩＶウ
イルスＲＥＲをコードするｃＤＮＡ（ヌクレオチド配列
７３５７〜７６０２；Rantner et al., Nature, 313, 2
77(1985); Malim et al., Nature, 338, 254(1989)）、
von Wilebrand factor （ｖＷＦ）遺伝子のプロモータ
ー（核酸−４８７〜＋２４７；Jahroudi and Lynch, Mo
l. Cell Biol., 14 999(1994)）、核輸出因子（ＮＥ
Ｆ）としてのＨＩＶ−１ウイルスＲＥＶをコードするｃ
ＤＮＡ（アミノ酸配列１〜１１７；Rantner et al., Na
ture, 313, 277(1985)）。細胞サイクル特異性を確認す
るために、４８時間以上メチオニンを除くことによって
内皮細胞をＧ０／Ｇ１に同調させる。細胞のＤＮＡ含量
はHoechst33258で染色した後蛍光活性化細胞選別器（Lu
cibello et al., EMBO J., 14, 132(1995)）により決定
した。
【０１７５】下記の結果が得られた：β−グルクロニダ
ーゼの増加は、非感染繊維芽細胞とは対処的に、感染繊
維芽細胞において確認できない。感染内皮細胞は非感染
内皮細胞よりも実質的に多くのβ−グルクロニダーゼを
発現する。増殖内皮細胞（ＤＮＡ＞２Ｓ；Ｓ＝染色体１
セット）は、Ｇ０／Ｇ１（ＤＮＡ＝２Ｓ）に同調させた
内皮細胞よりも実質的に多くのβ−グルクロニダーゼを
分泌する。このように、上記の多重プロモーター単位に
よって、構造遺伝子β−グルクロニダーゼが細胞特異
的、細胞サイクル依存的に発現される。
ーゼの増加は、非感染繊維芽細胞とは対処的に、感染繊
維芽細胞において確認できない。感染内皮細胞は非感染
内皮細胞よりも実質的に多くのβ−グルクロニダーゼを
発現する。増殖内皮細胞（ＤＮＡ＞２Ｓ；Ｓ＝染色体１
セット）は、Ｇ０／Ｇ１（ＤＮＡ＝２Ｓ）に同調させた
内皮細胞よりも実質的に多くのβ−グルクロニダーゼを
分泌する。このように、上記の多重プロモーター単位に
よって、構造遺伝子β−グルクロニダーゼが細胞特異
的、細胞サイクル依存的に発現される。
【０１７６】３．適用 上記例による活性化合物は、局所投与、例えば腫瘍部位
への投与、の後、あるいは頭蓋内もしくは蜘蛛膜下投
与、または全身、好ましくは、静脈または動脈投与の
後、細胞サイクルの特異性および多重プロモーター単位
の内皮細胞特異性の結果、β−グルクロニダーゼを分泌
する増殖内皮細胞に主に、あるいはのみに存在する。こ
のβ−グルクロニダーゼは注入された耐性であるドキソ
ルビシン−β−グルクロニダーゼ（Jacquesy et al., E
PO0511917A1）を細胞増殖抑制活性を有するドキソルビ
シンに開裂する。ドキソルビシンは内皮細胞の増殖を阻
害し、細胞増殖抑制効果をこれらの細胞のみならず近接
する腫瘍細胞にも及ぼす。
への投与、の後、あるいは頭蓋内もしくは蜘蛛膜下投
与、または全身、好ましくは、静脈または動脈投与の
後、細胞サイクルの特異性および多重プロモーター単位
の内皮細胞特異性の結果、β−グルクロニダーゼを分泌
する増殖内皮細胞に主に、あるいはのみに存在する。こ
のβ−グルクロニダーゼは注入された耐性であるドキソ
ルビシン−β−グルクロニダーゼ（Jacquesy et al., E
PO0511917A1）を細胞増殖抑制活性を有するドキソルビ
シンに開裂する。ドキソルビシンは内皮細胞の増殖を阻
害し、細胞増殖抑制効果をこれらの細胞のみならず近接
する腫瘍細胞にも及ぼす。
【０１７７】
配列番号：１ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．１７ 配列 AGCAGGTGTT GGGAGGC 17
【０１７８】配列番号：２ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．４１ 配列 GGCCGATGGG CAGATAGAGG GGGCCGATGG GCAGATAGAG G 41
【０１７９】配列番号：３ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．２６ 配列 GGAAGCAGAC CAGCTGGTCT GCTTCC 26
【０１８０】配列番号：４ 配列の長さ：８０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．８０ 配列 TCTAGCTAGC CTTTGCCCGC CCCGCCACGA TGGAGGTACC CCTGCAGAAG TCTGCGCCGG 60 GTTCAGCTCT CAGTCCTGCC 80
【０１８１】配列番号：５ 配列の長さ：７９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．７９ 配列 GGTCATTCAA AATGAGCAGT TACCATAAAA CGCTTCCGAT CCTTACCAGT GAGGCTTGCT 60 GGAACACAGT CCGGTGCTG 79
【０１８２】配列番号：６ 配列の長さ：８０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．８０ 配列 GTTAAAGAAG CATTGTTATT ATGGGGAGGG GGGAGCAACC TCTGGGTTCA GAATCTACAT 60 ATGCTGGAAG GCCCCAATGA 80
【０１８３】配列番号：７ 配列の長さ：１１２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．１１２２ 配列 AGTTCTCAAC TGCCCACTAG GTCCTTCCCA GCTCATTCCA GGAAAACAGA CTCAGCTGCA 60 AGGTGATTAG GTCATTAGAA AACGCTCATT GTAAACTAAT AGCAAATTCA GCCTCTTTCA 120 CCTTCAAAGA AACACTAAAT ATGGTGCTAT TAACCCCAAA TTAGCCAAGT GGGTGTGAGA 180 TTTTTTTCCC CCTAGTTGGG TTCTCTGGTG GCATGTCCCA ACTGTGTGTT GCAGAAATCA 240 TTGCCTAAAT CTAAGCGTCT AATTCTCAGG AGAATAGGCT CAGTGGGGTC ACATCTAAAC 300 TCTGGTGCCC CAGAACCCAG CAGTTCCACT GTGCCTCGCA AAGGGCTGCC AGCAAACGAC 360 TGCAGCTGCT CTGTGAGGTC CAGGGGCGAT GACAGGAGGC TGCACCATCA GCGGAGTCCC 420 TGAGGGAGCT TCTATGTCTC TGCCACTCAA CCGAACCTGT GACCTTAAAC GAGTTAAAGA 480 GCTTTTCAAC GCTGGGGTCT GTGAACTGGA CAGGGAACGC AGTGCTCACA GCATACTTGG 540 CAAACGTCCT GGGCTCAAGC AGAGCGTCGC ACCGTCCCTT ACTGATGAAC GTGCATGATG 600 GTAAACGTTG AGGGCTCCTT ATGAGGCCAC CTTAGGGGAT GACTACTCCC TCTGAGGGTA 660 GAGGGCTGCT CCCACCTCCA AACCCTGTTC CAGGAGGCAA TATCCTGGAG GCCCAGGATT 720 CTCGCGTCAA TGGGAGCGGG CGGGGCCGGG GCGGTACGTG TGGGGCAGGG GGTTAACCCA 780 ACTCCCCGAG TCACCCTAAG AAGCCAGGCG AGCAGAAGTA GCTGGTCCAG CCTCAGCCTC 840 AGCCCCGCCC TTGGTCCCGC CCTCCCGGAA CCGGCGCCCC CATTGGTGGC GTCTGGCGGC 900 GCTGCCGCTG TTATTTTTCG AATATATAAG GAGGTGGAGG TGGCAGCTGC CCAGCTCGGC 960 GTCCTCCCCT CCCTTCCTCC CCACATCCCT CTCCTCACTC CCAGGCCCAT TGCTCTTCCT 1020 CCCTCCCTTC CCTCCCTCCT TCCCCTCACC CCAGGCTCAC TCTCGGAGCT GAGCCAGCTG 1080 GGTCGGCGTC TGCTGGCCGC TGTACTGTGG CCCTCTAGCT AG 1122
【図１】成分a)〜d)を含んでなる新規な核酸構築物を模
式的に表した図である。
式的に表した図である。
【図２】成分a)〜e)を含んでなる新規な核酸構築物を模
式的に表した図である。
式的に表した図である。
【図３】アクティベーター応答性プロモーター単位を模
式的に表した図である。
式的に表した図である。
【図４】アクティベーター応答性プロモーター単位を含
んでなる新規な核酸構築物を模式的に表した図である。
んでなる新規な核酸構築物を模式的に表した図である。
【図５】ネズミｃｄｃ２５Ｂプロモーター／エンハンサ
ー領域のゲノム構造を表した図である。様々な酵素で制
限消化を行なうことによって、ゲノム遺伝子座のマップ
を単離した３個のファージクローンから調製した。ｃＤ
ＮＡの５′領域に直接隣接している４．６ｋｂ断片をフ
ァージVIから切り取り、Bluescript SKII ベクター(Str
atagene)にサブクローニングした。a)＝ファージクロー
ンb)＝サブクローニングした断片。
ー領域のゲノム構造を表した図である。様々な酵素で制
限消化を行なうことによって、ゲノム遺伝子座のマップ
を単離した３個のファージクローンから調製した。ｃＤ
ＮＡの５′領域に直接隣接している４．６ｋｂ断片をフ
ァージVIから切り取り、Bluescript SKII ベクター(Str
atagene)にサブクローニングした。a)＝ファージクロー
ンb)＝サブクローニングした断片。
【図６】ネズミｃｄｃ２５Ｂプロモーターの欠失突然変
異体を表した図である。図は、プロモーターの様々な
５′欠失および１個の３′欠失、およびプロモーターの
この領域に配置されている推定的転写因子結合部位を表
している。個々の欠失構築物の名称は、配列における
５′末端の位置に基づいている。
異体を表した図である。図は、プロモーターの様々な
５′欠失および１個の３′欠失、およびプロモーターの
この領域に配置されている推定的転写因子結合部位を表
している。個々の欠失構築物の名称は、配列における
５′末端の位置に基づいている。
【図７】ネズミｃｄｃ２５Ｂプロモーターの配列決定領
域を示す。公表されたｃＤＮＡ配列(Kakizuka et al.,
Genes Dev., 6, 587 (1992))の５′末端に直接隣接して
いる領域を配列決定した。図は、推定的結合部位および
転写開始の配置を示す。推定的結合部位は、一方では、
発現によって調節される多くの細胞サイクル特異的プロ
モーターに見られるようなアクティベーターである。ま
た、推定的Ｅ２Ｆ結合部位と、５′領域には、リプレッ
サー活性が付着している２個のＥボックスがある。示さ
れているＴＡＴＡボックスは、細胞サイクル特異的に調
節される遺伝子ついては異常であり、転写開始の位置を
特定するので、このプロモーターでは機能的に明らかに
重要な配列要素である。
域を示す。公表されたｃＤＮＡ配列(Kakizuka et al.,
Genes Dev., 6, 587 (1992))の５′末端に直接隣接して
いる領域を配列決定した。図は、推定的結合部位および
転写開始の配置を示す。推定的結合部位は、一方では、
発現によって調節される多くの細胞サイクル特異的プロ
モーターに見られるようなアクティベーターである。ま
た、推定的Ｅ２Ｆ結合部位と、５′領域には、リプレッ
サー活性が付着している２個のＥボックスがある。示さ
れているＴＡＴＡボックスは、細胞サイクル特異的に調
節される遺伝子ついては異常であり、転写開始の位置を
特定するので、このプロモーターでは機能的に明らかに
重要な配列要素である。
【図８】ネズミｃｄｃ２５Ｂプロモーターの配列決定領
域を示す。図７の続きである。
域を示す。図７の続きである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (39)
- 【請求項１】配列番号：７に示される配列またはその機
能的部分とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
する配列を含んでなるｃｄｃ２５Ｂ遺伝子のプロモータ
ー。 - 【請求項２】プロモーターが配列番号：７に示される配
列またはその機能的部分を含んでなる、請求項１に記載
のプロモーター。 - 【請求項３】機能的部分がＴＡＴＡボックスと、少なく
とも１個のＳｐ１結合部位と、少なくとも１個のＮＦＹ
結合部位と、適当ならば、少なくとも１個のＥ２Ｆ結合
部位と、適当ならば、少なくとも１個のＥボックスとを
含んでなる、請求項１または２に記載のプロモーター。 - 【請求項４】図７および８の約−９５０〜約＋１６７の
ヌクレオチドを包含する配列、または図６に示される約
−９５０〜約＋１６７のヌクレオチドのプロモーター配
列の総ての機能的シス−調節要素を含むその断片を含ん
でなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロモー
ター。 - 【請求項５】図７および８の約−９５０〜約＋１６７の
ヌクレオチドを包含する配列、または図６に示される約
−９５０〜約＋３のヌクレオチドのプロモーター配列の
総ての機能的シス−調節要素を含むその断片を含んでな
る、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロモータ
ー。 - 【請求項６】図７および８の約−９３０〜約＋３のヌク
レオチドを包含する配列、または図６に示される約−９
５０〜約＋３のヌクレオチドのプロモーター配列の総て
の機能的シス−調節要素を含むその断片を含んでなる、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロモーター。 - 【請求項７】図７および８の約−７２０〜約＋３のヌク
レオチドを包含する配列、または図６に示される約−７
２０〜約＋３のヌクレオチドのプロモーター配列の総て
の機能的シス−調節要素を含むその断片を含んでなる、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロモーター。 - 【請求項８】図７および８の約−３４０〜約＋３のヌク
レオチドを包含する配列、または図６に示される約−３
４０〜約＋３のヌクレオチドのプロモーター配列の総て
の機能的シス−調節要素を含むその断片を含んでなる、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロモーター。 - 【請求項９】図７および８の約−１８０〜約＋３のヌク
レオチドを包含する配列、または図６に示される約−１
８０〜約＋３のヌクレオチドのプロモーター配列の総て
の機能的シス−調節要素を含むその断片を含んでなる、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロモーター。 - 【請求項１０】図７および８の約−１００〜約＋３のヌ
クレオチドを包含する配列、または図６に示される約−
１００〜約＋３のヌクレオチドのプロモーター配列の総
ての機能的シス−調節要素を含むその断片を含んでな
る、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロモータ
ー。 - 【請求項１１】図７および８の約−８０〜約＋３のヌク
レオチドを包含する配列、または図６に示される約−８
０〜約＋３のヌクレオチドのプロモーター配列の総ての
機能的シス−調節要素を含むその断片を含んでなる、請
求項１〜３のいずれか一項に記載のプロモーター。 - 【請求項１２】図７および８の約−６０〜約＋３のヌク
レオチドを包含する配列、または図６に示される約−６
０〜約＋３のヌクレオチドのプロモーター配列の総ての
機能的シス−調節要素を含むその断片を含んでなる、請
求項１〜３のいずれか一項に記載のプロモーター。 - 【請求項１３】図７および８の約−３０〜約＋３のヌク
レオチドを包含する配列、または図６に示される約−３
０〜約＋３のヌクレオチドのプロモーター配列の総ての
機能的シス−調節要素を含むその断片を含んでなる、請
求項１〜３のいずれか一項に記載のプロモーター。 - 【請求項１４】請求項１〜１３のいずれか一項に記載の
プロモーターを標識、好ましくは放射能標識し、ストリ
ンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションによっ
て好ましくは哺乳動物細胞からのゲノムＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングすることを含んでなる、ｃｄｃ２
５Ｂプロモーターの検出法。 - 【請求項１５】図７および８に示される配列の一部を含
み、好ましくは配列番号：４の配列を含むプローブでマ
ウス系統１２９ＦＶＪから得られるネズミゲノムファー
ジライブラリーをスクリーニングすることを含んでな
る、ネズミｃｄｃ２５Ｂプロモーターの単離法。 - 【請求項１６】請求項１〜１３のいずれか一項に記載の
少なくとも１個のプロモーターを含んでなる核酸構築
物。 - 【請求項１７】構造遺伝子を更に含んでなる、請求項１
６に記載の核酸構築物。 - 【請求項１８】上記プロモーターが構造遺伝子の上流に
配置されている、請求項１６に記載の核酸構築物。 - 【請求項１９】＋１〜約＋１６７のヌクレオチド配列を
有するｃｄｃ２５Ｂ遺伝子の５′非コード領域が上記プ
ロモーターと構造遺伝子との間に挿入されている、請求
項１７または１８に記載の核酸構築物。 - 【請求項２０】請求項１〜１３のいずれか一項に記載の
プロモーターを少なくとも１個の追加の活性化配列と組
み合わせ、この追加の活性化配列は非特異的、ウイルス
特異的、代謝特異的、細胞特異的、細胞サイクル特異
的、および／または細胞増殖依存性活性化配列から選択
される、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の核酸
構築物。 - 【請求項２１】追加の活性化配列が、内皮細胞、腹膜細
胞、胸膜細胞、皮膚上皮細胞、肺細胞、消化管細胞、腎
臓および尿排泄通路細胞、筋肉細胞、結合組織細胞、造
血細胞、マクロファージ、リンパ球、白血病細胞、腫瘍
細胞またはグリア細胞で活性化されるプロモーター、Ｈ
ＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶ、Ｃ
ＭＶまたはＨＩＶのようなウイルスのプロモーター配
列、低酸素症によって活性化されるプロモーターまたは
エンハンサー配列、ｃｄｃ２５Ｃ、サイクリンＡ、ｃｄ
ｃ２、Ｅ２Ｆ−１、Ｂ−ｍｙｂおよびＤＨＦＲをコード
する遺伝子の細胞サイクル特異的活性化配列、および／
または細胞増殖依存的に現れるまたは活性化される転写
因子についてのＭｙｃＥボックスのモノマーまたはマル
チマーのような結合配列から選択される、請求項２０に
記載の核酸構築物。 - 【請求項２２】請求項１〜１３のいずれか一項に記載の
プロモーターが、転写因子の少なくとも１個の結合部位
が突然変異している形態で存在する、請求項１６〜２１
のいずれか一項に記載の核酸構築物。 - 【請求項２３】ＴＡＴＡボックスが突然変異する、請求
項２２に記載の核酸構築物。 - 【請求項２４】構造遺伝子の他に、非特異的、細胞特異
的またはウイルス特異的に、テトラサイクリンによっ
て、および／または細胞サイクル特異的に活性化するこ
とができ、請求項２２または２３に記載のプロモーター
の（複数の）突然変異した結合部位に結合してこのプロ
モーターを活性化するように突然変異された少なくとも
１個の転写因子をコードする少なくとももう一つの構造
遺伝子の転写を活性化するもう一つのプロモーターまた
はエンハンサー配列、および／または転写因子をコード
する構造遺伝子が存在する、請求項２２または２３に記
載の核酸構築物。 - 【請求項２５】転写因子が突然変異したＴＡＴＡボック
スに結合するタンパク質（ＴＢＰ）である、請求項２２
〜２４のいずれか一項に記載の核酸構築物。 - 【請求項２６】(1) ＴＡＴＡボックスを含み、ＴＡＴ
Ａボックスの配列がＴＧＴＡに突然変位している請求項
１〜１３のいずれか一項に記載のプロモーター、 (2) 配列ＧＣＣＡＣＣ、 (3) 免疫グロブリンシグナルペプチドのｃＤＮＡ、 （ヌクレオチド配列＜６３〜＞１０７） (4) β−グルクロニダーゼのｃＤＮＡ（ヌクレオチド
配列＜９３〜＞１９８２）、 (5) ｖＷＦ遺伝子のプロモーター（ヌクレオチド配列
−４８７〜＋２４７）、および (6) ＴＡＴＡボックス結合タンパク質のｃＤＮＡ（核
酸配列１〜１００１） であって、核酸８６２位（ＡがＴに置換）、８８９位お
よび８９０位（ＧＴがＡＣに置換）および８９５位（Ｃ
がＧに置換）が突然変異しているものを含んでなる、請
求項２５に記載の核酸構築物。 - 【請求項２７】プロモーターと、構造遺伝子であってそ
の３′末端に核保持シグナルが加えられているものと、
核輸出因子（ＮＥＦ）をコードする遺伝子の転写を活性
化するもう一つのプロモーターであってＮＥＦがＮＲＳ
のｍＲＮＡに結合するものとを含んでなり、上記プロモ
ーターの少なくとも１個が請求項１〜１３のいずれか一
項に記載のプロモーターである、核酸構築物。 - 【請求項２８】少なくとも１個のプロモーターまたはエ
ンハンサーがアクティベーター応答性プロモーター単位
である、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の核酸
構築物。 - 【請求項２９】アクティベーター応答性プロモーター単
位が少なくとも下記の単位 (1) 基本転写がプロモーターまたはエンハンサーによ
って活性化される１個以上の同一または異なるアクティ
ベーターサブユニット、および(2) 上記アクティベー
ターサブユニットの発現生成物によって活性化されるア
クティベーター応答性プロモーター を含んでなる、請求項２８に記載の核酸構築物。 - 【請求項３０】アクティベーターサブユニット(A) とし
て、 (1) 請求項１〜１３のいずれか一項に記載のプロモー
ター、 (2) ＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）（ＳＶ４０
ラージＴ、アミノ酸１２６〜１３２；ＰＫＫＫＲＫ
Ｖ）、 (3) ＨＳＶ−１ ＶＰ１６酸トランス活性化ドメイン
（ＴＡＤ）（アミノ酸４０６〜４８８）、および (4) ＣＤ４糖タンパク質の細胞質部分をコードするｃ
ＤＮＡおよび、 第二のアクティベーターサブユニット(B) として、 (1) ｃｄｃ２５Ｃ遺伝子のプロモーター（核酸−２９
０〜＋１２１）、 (2) ＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）（ＳＶ４０
ラージＴ；アミノ酸１２６〜１３２ ＰＫＫＫＲＫ
Ｖ）、 (3) Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインのｃＤ
ＮＡ（アミノ酸１〜１４７）、および (4) ｐ５６ ｌｃｋタンパク質のＣＤ４結合配列のｃ
ＤＮＡ（アミノ酸１〜７１）、 およびヌクレオチド配列５′−ＣＧＧＡＣＡＡＴＧＴＴ
ＧＡＣＣＧ−３′を有するＧａｌ４結合タンパク質に対
する結合配列の約１０コピーまでを含むアクティベータ
ー応答性プロモーター、および基本ＳＶ４０プロモータ
ー（ヌクレオチド配列４８〜５１９１）、および適当な
らば、構造遺伝子、好ましくは活性化合物、酵素、また
はリガンドと活性化合物またはリガンドと酵素とからな
る融合タンパク質をコードする完全ｃＤＮＡを含んでな
る、請求項２８または２９に記載の核酸構築物。 - 【請求項３１】構造遺伝子が、酵素、融合タンパク質、
サイトカイン、ケモカイン、成長因子、サイトカインの
レセプター、ケモカインのレセプター、成長因子のレセ
プター、増殖抑制または細胞増殖抑制またはアポトーシ
ス効果を有するペプチドまたはタンパク質、抗体、抗体
断片、脈管形成インヒビター、ペプチドホルモン、凝固
因子、凝固インヒビター、フィブリン溶解タンパク質、
血液循環に効果を有するペプチドまたはタンパク質、血
漿タンパク質、感染性物質の抗原、細胞の抗原、腫瘍の
抗原、血栓症誘発物質、補体活性化タンパク質、ウイル
スコートタンパク質、および／またはリゾチームから選
択される活性化合物コードする遺伝子である、請求項１
７〜３０のいずれか一項に記載の核酸構築物。 - 【請求項３２】構造遺伝子が、薬剤の前駆物質を開裂し
て薬剤とする酵素をコードする遺伝子である、請求項３
１に記載の核酸構築物。 - 【請求項３３】構造遺伝子が、リガンド／活性化合物融
合タンパク質またはリガンド／酵素融合タンパク質をコ
ードする遺伝子であり、リガンドがサイトカイン、成長
因子、抗体、抗体断片、ペプチドホルモン、メディエイ
ターおよび／または細胞接着タンパク質から選択され
る、請求項３１または３２に記載の核酸構築物。 - 【請求項３４】核酸がＤＮＡである、請求項１６〜３３
のいずれか一項に記載の核酸構築物。 - 【請求項３５】核酸構築物がベクター、好ましくはプラ
スミドベクターまたはウイルスベクターに挿入される、
請求項１６〜３４のいずれか一項に記載の核酸構築物。 - 【請求項３６】個々の成分を互いに結合することを含ん
でなる、１６〜３５のいずれか一項に記載の核酸構築物
の製造法。 - 【請求項３７】請求項１６〜３５のいずれか一項に記載
の核酸構築物を有する、細胞。 - 【請求項３８】腫瘍疾患、白血病、自己免疫疾患、アレ
ルギー、関節炎、炎症、臓器移植拒絶反応、移植片体宿
主反応、血液凝固疾患、循環疾患、貧血、感染症、ホル
モン疾患、および／またはＣＮＳ障害から選択される疾
患の治療用薬剤を製造するための、請求項１６〜３５の
いずれか一項に記載の核酸構築物または請求項３７に記
載の細胞の使用。 - 【請求項３９】細胞が内皮細胞である、請求項３８に記
載の細胞の使用。
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|---|---|---|---|
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| DE19710643.9 | 1997-03-14 |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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