JPH11127857A

JPH11127857A - 多種のリボザイム分子またはアンチセンスｒｎａ分子を生成するポリリボヌクレオチド

Info

Publication number: JPH11127857A
Application number: JP9295183A
Authority: JP
Inventors: Makoto Koizumi; 誠小泉; Yuji Ozawa; 雄次小沢
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1997-10-28
Filing date: 1997-10-28
Publication date: 1999-05-18

Abstract

(57)【要約】【課題】特定のヌクレオチド配列を有するポリリボヌ
クレオチドが存在する条件でのみ、該ポリリボヌクレオ
チドを利用して、遺伝子発現阻害機能を有するリボザイ
ムやアンチセンスＲＮＡ等の機能性単位ポリリボヌクレ
オチドが一本鎖上に複数連結したポリリボヌクレオチド
を切り分け、それぞれの機能性単位ポリリボヌクレオチ
ドを生成せしめる方法を提供する。【解決手段】特定のヌクレオチド配列を有するポリリ
ボヌクレオチドの存在下でリボザイム活性により分断さ
れ、遺伝子機能阻害活性を有する断片を生成するポリリ
ボヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、特定のヌクレオ
チド配列を有するＲＮＡを用い、リボザイムやアンチセ
ンスＲＮＡ分子などの有用な多種類の分子が１本鎖上に
あるポリリボヌクレオチドを複数の分子に分断する方
法、該ポリリボヌクレオチド、該ポリリボヌクレオチド
を含む組換えベクタ−、該ポリリボヌクレオチドをコー
ドするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクタ−、該組換
えベクタ−を保持する細胞に関する。

【０００２】

【従来の技術】タバコリングスポットウイルスのサテ
ライトＲＮＡのプラス鎖や、アボガドサンブロッチウイ
ロイドのプラス鎖ＲＮＡやマイナス鎖ＲＮＡは、Ｍｇ²⁺
の存在下で自己の触媒活性により切断されることが見出
されている［Prody, G. A., et al. (1986) Science 2
31, 1577-1580 および Hutchins, C. J., et al. (198
6) Nucleic Acids Res. 14, 3627-3640参照］。これら
のＲＮＡの切断部位周辺のヌクレオチド配列は共通性を
有しており、この共通性よりこれらＲＮＡの二次構造が
予想された。ウーレンベックは、これらの共通配列を基
に１９ｍｅｒの短鎖ＲＮＡフラグメントを設計し、該フ
ラグメントが２４ｍｅｒのＲＮＡを触媒的に切断するこ
とを示した［Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature 328,596
-600,参照］。

【０００３】また、ウイロイドやウイルスのサテライト
ＲＮＡだけでなく、イモリのサテライトＤＮＡの転写物
もこのリボザイムのヌクレオチド配列を有することが報
告されている［Epstein, L. M. and Gall, J. G. (198
7) Cell, 48, 535-543 参照］。このイモリのサテライ
トＤＮＡの転写物の切断部位周辺のヌクレオチド配列を
有する２種類の２１ｍｅｒＲＮＡを化学合成し、この一
方のＲＮＡに他方を加えると、天然と同一の部位で切断
反応が起こることが見出されている［Koizumi, M., et
al. (1988) FEBS Lett. 228, 228-230参照］。さらに、
この結果を基に、リボザイムを用いて他のＲＮＡまたは
ポリリボヌクレオチド分子を切断する方法が開発されて
いる［Koizumi, M., et al. (1989) Nucleic Acids Re
s. 17, 7059-7071 参照］。

【０００４】一方、タバコリングスポットウイルスのサ
テライトＲＮＡのマイナス鎖も切断反応を起こし、特定
部位において切断を引き起こすことが明らかにされた
［Buzayan, J. M., et al. (1986) Nature 323, 349-35
3 参照］。また、この切断に必要なＲＮＡの最小領域が
明らかにされた［Hampel, A. and Tritz, R. (1989) Bi
ochemistry, 28, 4929-4933 参照］。この触媒活性を持
つＲＮＡは５０ヌクレオチドからなり、このＲＮＡ内に
ヘアピンループ構造を有するモデルが提唱され、ヘアピ
ン型リボザイムと名付けられた。このヘアピン型リボザ
イムのヌクレオチドを他のヌクレオチドに変換すること
によって、切断反応に重要ないくつかのヌクレオチドが
明らかにされている［Chowrira, B. M., et al. (1991)
Nature 354, 320-322 および Sekiguchi, A., et al.
(1991) Nucleic Acids Res. 19, 6833-6838参照］。ま
た、バークらのグループは、ランダムなヌクレオチド配
列をもつＤＮＡとＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を
用いたインビトロ選択（in vitro selection）法によっ
てヘアピン型リボザイムの切断反応と連結反応に重要な
ヌクレオチド配列を明らかにしている［Berzal-Herran
z, A., et al. (1992)Gene & Development 6, 129-134
参照］。また、ヘアピンループ部分を欠失したＲＮＡで
も触媒反応が進行することも明らかにされている［Seki
guchi, A., etal. (1991) Nucleic Acids Res. 19, 683
3-6838 参照］。

【０００５】一方、リボザイムを細胞内で人工的に発現
させることにより、疾患に関与するＲＮＡを切断する試
みがなされている［例えば Bratty, J., et al. (1993)
Biochim. Biophy. Acta 1216, 345-359参照] 。その場
合、リボザイムをコードするＤＮＡとして投与したり、
レトロウイルスベクターを用いる方法がとられる。いず
れの方法においても、リボザイムの遺伝子を哺乳動物ま
たは、ウイルス由来のプロモーターの支配下で発現させ
るシステムが用いられる。また、疾患に関与するＲＮＡ
を切断するリボザイムの両端に、自らを切断することに
より末端を整える（以下「自己トリミング」という）た
めの別のリボザイムを配置した遺伝子を用いる方法が報
告されている［大川淳、多比良和誠 (1995) 蛋白質
・核酸・酵素 40, 1421-1429 参照］。さらに、疾患に
関与するＲＮＡを切断するリボザイムと自己トリミング
型リボザイムを交互に連結したものは、疾患に関与する
ＲＮＡを切断するリボザイムだけを単純に連結したもの
に比べ、疾患に関与するＲＮＡを切断する活性が向上す
ることがわかっている［大川淳、多比良和誠 (199
5) 蛋白質・核酸・酵素 40, 1421-1429 参照］。この
ことは、自己トリミング型リボザイムにより、１分子の
ＲＮＡが、疾患に関与するＲＮＡを切断する多種のリボ
ザイム分子に切断され、それぞれのリボザイム分子が疾
患に関与するＲＮＡを切断するように作用したことを示
唆している。しかしながら、強力なレトロウイルスプロ
モーターの支配下に自己トリミング型リボザイムを有す
るＲＮＡをレトロウイルスベクターに導入しようした場
合、ウイルス内でＲＮＡの自己切断が起こるので、理論
的には、レトロウイルスベクターに完全鎖長の自己切断
型ＲＮＡをパッケージングすることは困難である。

【０００６】また、Nuc. Acids Res. 17, 1371-1377(19
89) およびNuc. Acids Res. 23, 4092-4096 (1995)に
は、本発明のポリリボヌクレオチドを切断するリボザイ
ムと類似の構造を有するリボザイムが開示されている
が、このような構造のリボザイムの基質となるポリリボ
ヌクレオチドに、さらに別のリボザイムやアンチセンス
ＲＮＡ等を連結することに関する示唆はない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、特
定のヌクレオチド配列を有するポリリボヌクレオチドが
存在する条件でのみ、該ポリリボヌクレオチドを利用し
て、遺伝子発現阻害機能を有するリボザイムやアンチセ
ンスＲＮＡ等の機能性単位ポリリボヌクレオチドが一本
鎖上に複数連結したポリリボヌクレオチドを切り分け、
それぞれの機能性単位ポリリボヌクレオチドを生成せし
める方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、（１）式
（Ｉ）乃至（ＩＶ）：５’− α₁ β₁ α₂ β₂ ・・・α_n β_n −３’ （Ｉ）；５’− α₁ β₁ α₂ β₂ ・・・α_n-1 β_n-1 α_n −３’ （ＩＩ）；５’− β₁ α₁ β₂ α₂ ・・・β_n α_n −３’ （ＩＩＩ）；５’− β₁ α₁ β₂ α₂ ・・・β_n-1 α_n-1 β_n −３’ （ＩＶ）（式中、α₁ 〜α_n またはα₁ 〜α_n-1 は、同一または
異なるポリリボヌクレオチドであって、細胞内の特定の
ポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n またはγ₁ 〜γ _n-1 と
複合体を形成する能力を有し、β₁ 〜β_n またはβ₁ 〜
β_n-1 は、同一または異なるポリリボヌクレオチドであ
り、式（Ｉ）または（ＩＩＩ）においては、ｎは１以上
の整数を表し、式（ＩＩ）または（ＩＶ）においては、
ｎは２以上の整数を表す）のいずれか一つで表わされる
構造を有し、下記の１）乃至３）の全ての特徴を有する
ポリリボヌクレオチド：１）細胞内のポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n または
γ₁ 〜γ_n-1 と、α₁ 〜α_n またはα₁ 〜α_n-1 とは、
同一または異なって、リボザイム活性を有する複合体を
それぞれ形成することができ；２）細胞内で、式（Ｉ）乃至（ＩＶ）のいずれか一つ
で表わされるポリリボヌクレオチドは、１）記載の複合
体の有するリボザイム活性により、α₁ 〜α_n またはα
₁ 〜α_n-1 の特定の位置でそれぞれ切断され；３）２）における切断後の、β₁ 〜β_n またはβ₁ 〜
β_n-1 を含む各断片は、それぞれ同一または異なって、
単独または協同して細胞内のポリリボヌクレオチドδ₁
〜δ_n またはδ₁ 〜δ_n-1 の機能を特異的に阻害する活
性を有する、（２）ポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n
またはγ₁ 〜γ_n-1 とポリリボヌクレオチドδ₁ 〜δ_n
またはδ₁ 〜δ_n-1 が同一の細胞集団に特異的に存在す
るポリリボヌクレオチドであることを特徴とする、
（１）記載のポリリボヌクレオチド、（３）ポリリ
ボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n またはγ₁ 〜γ_n-1 とポリリ
ボヌクレオチドδ₁ 〜δ_n またはδ₁ 〜δ_n-1 とが同一
のＲＮＡ中に存在することを特徴とする、（１）または
（２）記載のポリリボヌクレオチド、（４）ポリリボ
ヌクレオチドγ₁ 〜γ_n またはγ₁ 〜γ_n-1 、および／
またはポリリボヌクレオチドδ₁ 〜δ_n またはδ₁ 〜δ
_n-1 が病因遺伝子の転写物もしくはレトロウイルスＲＮ
Ａ中に存在することを特徴とする、（１）乃至（３）の
いずれか一つに記載のポリリボヌクレオチド、（５）
ポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n またはγ₁ 〜γ_n-1 、
および／またはポリリボヌクレオチドδ₁ 〜δ_n または
δ₁ 〜δ_n-1 がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来の
ＲＮＡ中に存在することを特徴とする、（１）乃至
（４）のいずれか一つに記載のポリリボヌクレオチド、
（６）ポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n またはγ₁ 〜
γ_n-1 が配列表の配列番号１９乃至２２のいずれか一つ
に示されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、
（１）乃至（５）のいずれか一つに記載のポリリボヌク
レオチド、（７）ポリリボヌクレオチドδ₁ 〜δ_n ま
たはδ₁ 〜δ_n-1 が配列表の配列番号２３乃至２５のい
ずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含むことを特
徴とする、（１）乃至（６）のいずれか一つに記載のポ
リリボヌクレオチド、（８）ｎが２０以下であること
を特徴とする、（１）乃至（７）のいずれか一つに記載
のポリリボヌクレオチド、（９）ｎが６以下であるこ
とを特徴とする、（１）乃至（７）のいずれか一つに記
載のポリリボヌクレオチド、（１０）ｎが５以下であ
ることを特徴とする、（１）乃至（７）のいずれか一つ
に記載のポリリボヌクレオチド、（１１） α₁ 〜α_n
またはα₁ 〜α_n-1 の構造が、それぞれ式（Ｖ）乃至
（ＶＩＩ）：

【０００９】

【化８】

【００１０】（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃは
シトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇ
はグアニンヌクレオチドを表し、Ｄ₁ 〜Ｄ_e は同一また
は異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチ
ド、シトシンヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチド
のいずれかを表し、Ｑ₁ 〜Ｑ_a は同一または異なってウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、Ｒ₁ 〜Ｒ_a はＱ₁ 〜Ｑ_a にそれぞれ相補的なヌク
レオチドを表し、Ｗ₁ 〜Ｗ_k は同一または異なってウラ
シルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌ
クレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを表
し、Ｚ₁ 〜Ｚ_q は同一または異なってウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｐはウラ
シルヌクレオチド、アデニンヌクレオチドまたはシトシ
ンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｓは、ウラシルヌク
レオチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチ
ドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、ｑ、
ｋは同一または異なって１乃至２０の整数を表し、ｅ、
ａは同一または異なって１乃至１０の整数を表す。）；

【００１１】

【化９】

【００１２】（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃは
シトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇ
はグアニンヌクレオチドを表し、Ｂ₁ 〜Ｂ_h は同一また
は異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチ
ド、シトシンヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチド
のいずれかを表し、Ｄ₁ 〜Ｄ_e は同一または異なってウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、Ｑ₁ 〜Ｑ_a は同一または異なってウラシルヌクレ
オチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド
またはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｒ₁ 〜
Ｒ_a はＱ₁ 〜Ｑ_a にそれぞれ相補的なヌクレオチドを表
し、Ｗ₁ 〜Ｗ_k は同一または異なってウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｚ₁ 〜Ｚ
_q は同一または異なってウラシルヌクレオチド、アデニ
ンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドまたはグアニン
ヌクレオチドのいずれかを表し、Ｐはウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｌは、ウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチドまたはシト
シンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｖは、ウラシルヌ
クレオチド、アデニンヌクレオチドまたはシトシンヌク
レオチドのいずれかを表し、ｈは１乃至５０の整数を表
し、ｑ、ｋは同一または異なって１乃至２０の整数を表
し、ｅ、ａは同一または異なって１乃至１０の整数を表
す。）；

【００１３】

【化１０】

【００１４】（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃは
シトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇ
はグアニンヌクレオチドを表し、Ｂ₁ 〜Ｂ_h は同一また
は異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチ
ド、シトシンヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチド
のいずれかを表し、Ｄ₁ 〜Ｄ_e は同一または異なってウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、Ｅ₁ 〜Ｅ_j は同一または異なってウラシルヌクレ
オチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド
またはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｆ₁ 〜
Ｆ_j はＥ₁ 〜Ｅ_j にそれぞれ相補的なヌクレオチドを表
し、Ｑ₁ 〜Ｑ_a は同一または異なってウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｒ₁ 〜Ｒ
_a はＱ₁ 〜Ｑ_a にそれぞれ相補的なヌクレオチドを表
し、Ｗ₁ 〜Ｗ_k は同一または異なってウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｚ₁ 〜Ｚ
_q は同一または異なってウラシルヌクレオチド、アデニ
ンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドまたはグアニン
ヌクレオチドのいずれかを表し、Ｐはウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｌは、ウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチドまたはシト
シンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｖは、ウラシルヌ
クレオチド、アデニンヌクレオチドまたはシトシンヌク
レオチドのいずれかを表し、ｈは１乃至５０の整数を表
し、ｑ、ｋは同一または異なって１乃至２０の整数を表
し、ｊ、ｅ、ａは同一または異なって１乃至１０の整数
を表す。）からなる群より選択されることを特徴とす
る、（１）乃至（１０）のいずれか一つに記載のポリリ
ボヌクレオチド、（１２） α₁ 〜α_n またはα₁ 〜α
_n-1 の構造が、式（Ｖ）：

【００１５】

【化１１】

【００１６】（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃは
シトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇ
はグアニンヌクレオチドを表し、Ｄ₁ 〜Ｄ_e は同一また
は異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチ
ド、シトシンヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチド
のいずれかを表し、Ｑ₁ 〜Ｑ_a は同一または異なってウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、Ｒ₁ 〜Ｒ_a はＱ₁ 〜Ｑ_a にそれぞれ相補的なヌク
レオチドを表し、Ｗ₁ 〜Ｗ_k は同一または異なってウラ
シルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌ
クレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを表
し、Ｚ₁ 〜Ｚ_q は同一または異なってウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｐはウラ
シルヌクレオチド、アデニンヌクレオチドまたは、シト
シンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｓは、ウラシルヌ
クレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオ
チドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、
ｑ、ｋは同一または異なって１乃至２０の整数を表し、
ｅ、ａは同一または異なって１乃至１０の整数を表
す。）で表わされることを特徴とする、（１）乃至（１
１）のいずれか一つに記載のポリリボヌクレオチド、
（１３）式（Ｖ）において、ｋが８であって、Ｗ₈ か
らＷ₁ からなるヌクレオチド配列が配列表の配列番号５
２に示される配列であり、ｑが８であって、Ｚ₈ からＺ
₁ からなるヌクレオチド配列が配列表の配列番号５３に
示される配列であることを特徴とする、（１２）記載の
ポリリボヌクレオチド、（１４） α₁ 〜α_n またはα
₁ 〜α_n-1 のヌクレオチド配列が、それぞれ配列表の配
列番号４９乃至５１からなる群より選択されるヌクレオ
チド配列であることを特徴とする、（１２）または（１
３）記載のポリリボヌクレオチド、（１５）ポリリボ
ヌクレオチドδ₁ 〜δ_n またはδ₁ 〜δ_n-1 の機能を阻
害する手段が、リボザイムによるポリリボヌクレオチド
δ₁ 〜δ_n またはδ₁ 〜δ_n-1 の切断またはアンチセン
スＲＮＡによるポリリボヌクレオチドδ₁ 〜δ_n または
δ₁ 〜δ_n-1 の発現阻止であることを特徴とする、
（１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のポリリボヌ
クレオチド、（１６）ポリリボヌクレオチドδ₁ 〜δ
_n またはδ₁ 〜δ_n-1 の機能を阻害する手段が、リボザ
イムによるポリリボヌクレオチドδ₁ 〜δ_n またはδ₁
〜δ_n-1 の切断であることを特徴とする、（１）乃至
（１４）のいずれか一つに記載のポリリボヌクレオチ
ド、（１７）ポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n または
γ₁ 〜γ_n-1 の存在下で切断された後のβ₁ 〜β_n もし
くはβ₁ 〜β_n-1 を含む各断片が形成するリボザイムの
構造が、式（ＶＩＩＩ）または（ＩＸ）：

【００１７】

【化１２】

【００１８】（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃは
シトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇ
はグアニンヌクレオチドを表し、Ｄ₁ 〜Ｄ_e は同一また
は異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチ
ド、シトシンヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチド
のいずれかを表し、Ｑ₁ 〜Ｑ_a は同一または異なってウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、Ｒ₁ 〜Ｒ_a はＱ₁ 〜Ｑ_a にそれぞれ相補的なヌク
レオチドを表し、Ｗ₁ 〜Ｗ_k は同一または異なってウラ
シルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌ
クレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを表
し、Ｚ₁ 〜Ｚ_q は同一または異なってウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｓは、ウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、ｑ、ｋは同一または異なって１乃至２０の整数を
表し、ｅ、ａは同一または異なって１乃至１０の整数を
表す。）；

【００１９】

【化１３】

【００２０】（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃは
シトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇ
はグアニンヌクレオチドを表し、Ｄ₁ 〜Ｄ_e は同一また
は異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチ
ド、シトシンヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチド
のいずれかを表し、Ｑ₁ 〜Ｑ_a は同一または異なってウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、Ｒ₁ 〜Ｒ_a はＱ₁ 〜Ｑ_a にそれぞれ相補的なヌク
レオチドを表し、Ｗ₁ 〜Ｗ₄ は同一または異なってウラ
シルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌ
クレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを表
し、Ｚ₁ 〜Ｚ_q は同一または異なってウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｓは、ア
デニンヌクレオチドまたはシトシンヌクレオチドのいず
れかを表し、ｑは同一または異なって１乃至２０の整数
を表し、ｅ、ａは同一または異なって１乃至１０の整数
を表す。）からなる群より選択されることを特徴とす
る、（１５）または（１６）記載のポリリボヌクレオチ
ド、（１８）ポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n または
γ₁ 〜γ_n-1 の存在下で切断された後のβ₁ 〜β_n もし
くはβ₁ 〜β_n-1 を含む各断片が形成するリボザイムの
構造が、式（ＶＩＩＩ）：

【００２１】

【化１４】

【００２２】（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃは
シトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇ
はグアニンヌクレオチドを表し、Ｄ₁ 〜Ｄ_e は同一また
は異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチ
ド、シトシンヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチド
のいずれかを表し、Ｑ₁ 〜Ｑ_a は同一または異なってウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、Ｒ₁ 〜Ｒ_a はＱ₁ 〜Ｑ_a にそれぞれ相補的なヌク
レオチドを表し、Ｗ₁ 〜Ｗ_k は同一または異なってウラ
シルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌ
クレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを表
し、Ｚ₁ 〜Ｚ_q は同一または異なってウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｓは、ウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、ｑ、ｋは同一または異なって１乃至２０の整数を
表し、ｅ、ａは同一または異なって１乃至１０の整数を
表す。）で表わされることを特徴とする、（１６）記載
のポリリボヌクレオチド、（１９）ポリリボヌクレオ
チドγ₁ 〜γ_n またはγ₁ 〜γ_n-1 の存在下で切断され
た後のβ₁ 〜β_n もしくはβ₁ 〜β_n-1 を含む各断片の
ヌクレオチド配列が、それぞれ配列表の配列番号５３乃
至５６のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列であ
ることを特徴とする、（１６）乃至（１８）のいずれか
一つに記載のポリリボヌクレオチド、（２０）配列表
の配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有すること
を特徴とする、（１）乃至（１９）のいずれか一つに記
載のポリリボヌクレオチド、（２１）配列表の配列番
号９に示されるヌクレオチド配列を有することを特徴と
する、（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載のポリ
リボヌクレオチド、（２２）配列表の配列番号１０に
示されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする、
（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載のポリリボヌ
クレオチド、（２３）配列表の配列番号２６に示され
るヌクレオチド配列を有することを特徴とする、（１）
乃至（１９）のいずれか一つに記載のポリリボヌクレオ
チド、（２４）配列表の配列番号２７に示されるヌク
レオチド配列を有することを特徴とする、（１）乃至
（１９）のいずれか一つに記載のポリリボヌクレオチ
ド、（２５）配列表の配列番号２８に示されるヌクレ
オチド配列を有することを特徴とする、（１）乃至（１
９）のいずれか一つに記載のポリリボヌクレオチド、
（２６）配列表の配列番号２９に示されるヌクレオチ
ド配列を有することを特徴とする、（１）乃至（１９）
のいずれか一つに記載のポリリボヌクレオチド、（２
７）（１）乃至（２６）のいずれか一つに記載のポリ
リボヌクレオチドに転写されるヌクレオチド配列を含む
ＤＮＡ、（２８）（２７）記載のＤＮＡを含む組換え
ベクター；（２９）レトロウイルスベクターである、
（２８）記載のベクター、（３０）プラスミドｐＴ７
−Ｒ２Ｔである、（２８）記載のベクター、（３１）
プラスミドｐＴ７−Ｒ２Ｇである、（２８）記載のベク
ター、（３２）プラスミドｐＴ７−Ｒ３である、（２
８）記載のベクター、（３３）プラスミドｐＴ７−Ｒ
４である、（２８）記載のベクター、（３４）プラス
ミドｐＴ７−Ｒ５である、（２８）記載のベクター、
（３５）プラスミドｐＴ７−Ｒ６である、（２８）記
載のベクター、（３６）プラスミドｐＴ７−Ｒ７であ
る、（２８）記載のベクター、（３７）式（Ｉ）乃至
（ＩＶ）：５’− α₁ β₁ α₂ β₂ ・・・α_n β_n −３’ （Ｉ）；５’− α₁ β₁ α₂ β₂ ・・・α_n-1 β_n-1 α_n −３’ （ＩＩ）；５’− β₁ α₁ β₂ α₂ ・・・β_n α_n −３’ （ＩＩＩ）；５’− β₁ α₁ β₂ α₂ ・・・β_n-1 α_n-1 β_n −３’ （ＩＶ）（式中、α₁ 〜α_n またはα₁ 〜α_n-1 は、同一または
異なるポリリボヌクレオチドであって、細胞内の特定の
ポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n またはγ₁ 〜γ_n-1 と
複合体を形成する能力を有し、β₁ 〜β_n またはβ₁ 〜
β_n-1 は、同一または異なるポリリボヌクレオチドであ
り、式（Ｉ）または（ＩＩＩ）においては、ｎは１以上
の整数を表し、式（ＩＩ）または（ＩＶ）においては、
ｎは２以上の整数を表す）のいずれか一つで表わされる
構造を有する（１）乃至（２６）のいずれか一つに記載
のポリリボヌクレオチドを用い、下記の工程１）から
３）を経て細胞内の特定のポリリボヌクレオチドδ₁ 〜
δ_n またはδ₁ 〜δ_n-1 の機能を阻害する方法：１）細胞内の特定のポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n
またはγ₁ 〜γ_n-1 とα₁ 〜α_n またはα₁ 〜α_n-1 と
は、同一または異なって、リボザイム活性を有する複合
体をそれぞれ形成し；２）細胞内で、式（Ｉ）乃至（ＩＶ）のいずれか一つ
で表わされるポリリボヌクレオチドが、１）記載の複合
体の有するリボザイム活性により、α₁ 〜α_n またはα
₁ 〜α_n-1 の特定の位置でそれぞれ切断され；３）２）における切断後の、β₁ 〜β_n もしくはβ₁
〜β_n-1 を含む各断片が、それぞれ同一または異なっ
て、単独または協同して細胞内のポリリボヌクレオチド
δ₁ 〜δ_n またはδ₁ 〜δ_n-1 の機能を特異的に阻害す
る、（３８）（１）乃至（２６）のいずれか一つに記
載のポリリボヌクレオチド、（２７）記載のＤＮＡ、
または（２８）乃至（３６）のいずれか一つに記載のベ
クターを有効成分として含有する医薬組成物、（３９）
抗ＨＩＶ剤である、（３８）記載の医薬組成物、（４
０）抗腫瘍剤である、（３８）記載の医薬組成物、
（４１）抗炎症剤である、（３８）記載の医薬組成
物、に関する。

【００２３】本発明者らは、ＨＩＶＲＮＡの特定のヌ
クレオチド配列を有するＲＮＡの存在下で、ＨＩＶＲ
ＮＡに特異的なリボザイムやアンチセンスＲＮＡ等の機
能性単位ポリリボヌクレオチドが一本鎖上に複数連結し
たポリリボヌクレオチドが切り分けられられることによ
り、それぞれの機能性単位ポリリボヌクレオチドを生成
するようなポリリボヌクレオチドを作製した。さらに、
このポリリボヌクレオチドが実際にＨＩＶＲＮＡの存
在下で切り分けられること、および切り分けられた後の
断片がＨＩＶＲＮＡの機能を特異的に阻害することを
見出し、本発明を完成した。

【００２４】本発明のポリリボヌクレオチドまたは該ポ
リリボヌクレオチドに転写されるＤＮＡを含む組換えベ
クターを細胞内に取り込ませると、取り込まれた該ポリ
リボヌクレオチドまたは該ＤＮＡから転写されたポリリ
ボヌクレオチドは、細胞内で特定のヌクレオチド配列を
有するポリリボヌクレオチドγにより切り分けられ、そ
れぞれの機能性単位ポリリボヌクレオチドを生成する。
対象とする細胞は、植物、動物または人体を問わない。

【００２５】本発明において、ポリリボヌクレオチドγ
₁ 〜γ_n またはγ₁ 〜γ_n-1 （以下これらを総称して
「γ」という）は、細胞内に存在し得る９ヌクレオチド
以上の鎖長のポリリボヌクレオチドであればよく、細胞
が正常であるか異常であるかを問わないが、好適には、
病的状態の細胞において特異的に存在するポリリボヌク
レオチドである（ここで「病的状態」とは、個体、臓
器、組織等において疾病の原因となり得る状態を指し、
例えば癌細胞、ウイルス感染細胞、炎症局所に浸潤する
白血球等が該当する）。より好適には、ポリリボヌクレ
オチドγは、単純ヘルペスウイルス、ヒトハピローマウ
イルス、ヒト免疫不全ウイルス（以下「ＨＩＶ」とい
う）、アデノウイルス、エプスタインバールウイルス、
肝炎Ｂ型ウイルス、肝炎Ｃ型ウイルス、インフルエンザ
ウイルスおよびヒトサイトメガロウイルス等のウイルス
由来のＲＮＡ；Ha-ras、Ki-ras、src 、c-myc 、c-myb
、c-raf等の癌遺伝子の転写産物；またはＣ−キナー
ゼ、ｐ５３、表皮成長因子（以下「ＥＧＦ」という）、
腫瘍成長因子−β（以下「ＴＧＦ−β」という）、細胞
間接着分子−Ｉ（以下「ＩＣＡＭ−１」という）等の癌
や炎症に関与するタンパク質をコードするＲＮＡであ
り、さらに好適には肝炎Ｃ型ウイルスまたはＨＩＶのＲ
ＮＡであり、最も好適にはＨＩＶのＲＮＡである。

【００２６】α₁ 〜α_n またはα₁ 〜α_n-1 （以下これ
らを総称して「α」という）のそれぞれの構造は、それ
らとポリリボヌクレオチドγとで形成するリボザイム活
性を有する複合体の構造、および、該複合体を構成する
ポリリボヌクレオチドγのヌクレオチド配列に依存す
る。該複合体の構造は、基本的にはαの特定の位置を切
断するリボザイム活性を有していれば、既知のリボザイ
ムの構造をいずれも利用することができ、例えばハンマ
ーヘッド型［Jeffries, A. C. and Symons, R. H. (198
9) Nucleic Acids Res. 17, 1371-1377, Chartrand, P.
et al., (1995)Nucleic Acids Res. 23, 4092-4096.
参照］、ヘアピン型［Komatsu, Y. et al., (1995) EMB
O J. 252, 292-304 参照］、ドメイン変換ヘアピン型
［Komatsu, Y. et al., (1995) EMBO J. 252, 292-304
参照］等を挙げることができる。好適にはハンマーヘッ
ド型およびヘアピン型であり、より好適には、αとγと
が構成する構造が下記式（Ｘ）乃至（ＸＩＩ）のいずれ
か一つで表わされるようなリボザイムである：

【００２７】

【化１５】

【００２８】（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃは
シトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇ
はグアニンヌクレオチドを表し、Ｄ₁ 〜Ｄ_e は同一また
は異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチ
ド、シトシンヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチド
のいずれかを表し、Ｑ₁ 〜Ｑ_a は同一または異なってウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、Ｒ₁ 〜Ｒ_a はＱ₁ 〜Ｑ_a にそれぞれ相補的なヌク
レオチドを表し、Ｗ₁ 〜Ｗ_k は同一または異なってウラ
シルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌ
クレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを表
し、Ｚ₁ 〜Ｚ_q は同一または異なってウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｍ₁ 〜Ｍ
_m はＷ₁ 〜Ｗ_k にハイブリダイズするヌクレオチドを表
し、Ｎ₁ 〜Ｎ_p はＺ₁ 〜Ｚ_q にハイブリダイズするヌク
レオチドを表し、Ｐはウラシルヌクレオチド、アデニン
ヌクレオチドまたは、シトシンヌクレオチドのいずれか
を表し、Ｓは、ウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレ
オチド、シトシンヌクレオチドまたはグアニンヌクレオ
チドのいずれかを表し、ｑ、ｋは同一または異なって１
乃至２０の整数を表し、ｅ、ｍ、ａ、ｐは同一または異
なって１乃至１０の整数を表す。）；

【００２９】

【化１６】

【００３０】（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃは
シトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇ
はグアニンヌクレオチドを表し、Ｂ₁ 〜Ｂ_h は同一また
は異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチ
ド、シトシンヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチド
のいずれかを表し、Ｄ₁ 〜Ｄ_e は同一または異なってウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、Ｑ₁ 〜Ｑ_a は同一または異なってウラシルヌクレ
オチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド
またはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｒ₁ 〜
Ｒ_a はＱ₁ 〜Ｑ_a にそれぞれ相補的なヌクレオチドを表
し、Ｗ₁ 〜Ｗ_k は同一または異なってウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｚ₁ 〜Ｚ
_q は同一または異なってウラシルヌクレオチド、アデニ
ンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドまたはグアニン
ヌクレオチドのいずれかを表し、Ｍ₁ 〜Ｍ_m はＷ₁ 〜Ｗ
_k にハイブリダイズするヌクレオチドを表し、Ｎ₁ 〜Ｎ
_p はＺ₁ 〜Ｚ_q にハイブリダイズするヌクレオチドを表
し、Ｐはウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチ
ド、シトシンヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチド
のいずれかを表し、Ｌは、ウラシルヌクレオチド、アデ
ニンヌクレオチドまたはシトシンヌクレオチドのいずれ
かを表し、Ｓは、アデニンヌクレオチドまたはシトシン
ヌクレオチドのいずれかを表し、Ｖは、Ｓがシトシンヌ
クレオチドの場合には、アデニンヌクレオチドを表し、
Ｓがアデニンヌクレオチドの場合には、ウラシルヌクレ
オチドまたはシトシンヌクレオチドのいずれかを表し、
ｈは１乃至５０の整数を表し、ｑ、ｋは同一または異な
って１乃至２０の整数を表し、ｅ、ｍ、ａ、ｐは同一ま
たは異なって１乃至１０の整数を表す。）；

【００３１】

【化１７】

【００３２】（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃは
シトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇ
はグアニンヌクレオチドを表し、Ｂ₁ 〜Ｂ_h は同一また
は異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチ
ド、シトシンヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチド
のいずれかを表し、Ｄ₁ 〜Ｄ_e は同一または異なってウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、Ｅ₁ 〜Ｅ_j は同一または異なってウラシルヌクレ
オチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド
またはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｆ₁ 〜
Ｆ_j はＥ₁ 〜Ｅ_j にそれぞれ相補的なヌクレオチドを表
し、Ｑ₁ 〜Ｑ_a は同一または異なってウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｒ₁ 〜Ｒ
_a はＱ₁ 〜Ｑ_a にそれぞれ相補的なヌクレオチドを表
し、Ｗ₁ 〜Ｗ_k は同一または異なってウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｚ₁ 〜Ｚ
_q は同一または異なってウラシルヌクレオチド、アデニ
ンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドまたはグアニン
ヌクレオチドのいずれかを表し、Ｍ₁ 〜Ｍ_m はＷ₁ 〜Ｗ
_k にハイブリダイズするヌクレオチドを表し、Ｎ₁ 〜Ｎ
_p はＺ₁ 〜Ｚ_q にハイブリダイズするヌクレオチドを表
し、Ｐはウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチ
ド、シトシンヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチド
のいずれかを表し、Ｌは、ウラシルヌクレオチド、アデ
ニンヌクレオチドまたはシトシンヌクレオチドのいずれ
かを表し、Ｓは、アデニンヌクレオチドまたはシトシン
ヌクレオチドのいずれかを表し、Ｖは、Ｓがシトシンヌ
クレオチドの場合には、アデニンヌクレオチドを表し、
Ｓがアデニンヌクレオチドの場合には、ウラシルヌクレ
オチド、またはシトシンヌクレオチドのいずれかを表
し、ｈは１乃至５０の整数を表し、ｑ、ｋは同一または
異なって１乃至２０の整数を表し、ｅ、ｊ、ｍ、ａ、ｐ
は同一または異なって１乃至１０の整数を表す。）。式
中の矢印は、リボザイム活性により切断される部位を表
す。なお、いずれの場合も、ポリリボヌクレオチドγは
それぞれの式中で特定された４ヌクレオチドの配列（す
なわち、式（Ｘ）の場合は5'- GAAA -3'；式（ＸＩ）ま
たは（ＸＩＩ）の場合は5'- SGAA -3'）を含んでいなけ
ればならない。また例えば「Ｗ₁ 〜Ｗ_kにハイブリダイ
ズするヌクレオチド」とは、Ｗ₁ 〜Ｗ_k に完全に相補的
なヌクレオチド、または、ミスマッチが存在しても生理
的条件下であればＷ₁ 〜Ｗ_k と二本鎖を形成するような
ヌクレオチドを指す。

【００３３】さらに、式（Ｘ）において、ｋが８であっ
て、Ｗ₈ からＷ₁ からなるヌクレオチド配列が配列表の
配列番号５２に示される配列であり；ｑが８であって、
Ｚ₈からＺ₁ からなるヌクレオチド配列が配列表の配列
番号５３に示される配列であり；ｐが８であって、Ｎ₁
からＮ₈ からなるヌクレオチド配列が配列表の配列番号
５４に示される配列であり；ｍが８であって、Ｍ₁ から
Ｍ₈ からなるヌクレオチド配列が配列表の配列番号５５
に示される配列であるようなハンマーヘッド型リボザイ
ムが好適である。

【００３４】ポリリボヌクレオチドγをＨＩＶのＲＮＡ
とした場合、αとして最も好適なヌクレオチド配列は、
配列表の配列番号４９乃至５１からなる群より選択され
る。

【００３５】ポリリボヌクレオチドδ₁ 〜δ_n またはδ
₁ 〜δ_n-1 （以下これらを総称して「δ」という）は、
ポリリボヌクレオチドγと同様、細胞内に存在し得る９
ヌクレオチド以上の鎖長のポリリボヌクレオチドであれ
ばよいが、病的状態の細胞に特異的に存在し、かつ直接
的または間接的に、病的状態の発生、維持または増悪に
関与しているポリリボヌクレオチドであることが好まし
い。そのようなポリリボヌクレオチドとしては、単純ヘ
ルペスウイルス、ヒトハピローマウイルス、ＨＩＶ、ア
デノウイルス、エプスタインバールウイルス、肝炎Ｂ型
ウイルス、肝炎Ｃ型ウイルス、インフルエンザウイルス
およびヒトサイトメガロウイルス等のウイルス由来のＲ
ＮＡ；Ha-ras、Ki-ras、c-src 、c-myc 、c-myb 、c-ra
f 等の癌遺伝子の転写産物；Ｃ−キナーゼ、ｐ５３、Ｅ
ＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＣＡＭ−１等の癌や炎症に関与す
るタンパク質をコードするＲＮＡ等を挙げることができ
るが、より好適には、肝炎Ｃ型ウイルスまたはＨＩＶ由
来のＲＮＡ；Ha-ras、Ki-ras、c-src 、c-myc 、c-myb
またはc-raf の転写産物；もしくはＣ−キナーゼをコー
ドするＲＮＡであり、最も好適には、肝炎Ｃ型ウイルス
またはＨＩＶのＲＮＡである。

【００３６】特に、ポリリボヌクレオチドγとポリリボ
ヌクレオチドδを同一のＲＮＡ中に含まれるヌクレオチ
ド配列とした場合、本発明のポリリボヌクレオチドは、
ポリリボヌクレオチドγ／δを含むＲＮＡが存在する細
胞でのみその機能を発揮する。例えば、ポリリボヌクレ
オチドγ／δを含むＲＮＡを病原性のレトロウイルスＲ
ＮＡとした場合、本発明のポリリボヌクレオチドは該ウ
イルスに感染した細胞でのみ切断を起こし、該ウイルス
ＲＮＡの機能を効率的に阻害する。同様に、ポリリボヌ
クレオチドγ／δを含むＲＮＡを活性化癌遺伝子の転写
物とした場合、本発明のポリリボヌクレオチドは癌細胞
でのみ切断を起こして、該活性化癌遺伝子の発現を効率
的に阻害することができる。

【００３７】また、ポリリボヌクレオチドγとポリリボ
ヌクレオチドδが同一のＲＮＡ中に存在するものでなく
ても、例えば両者が同一の細胞集団に特異的に存在する
ポリリボヌクレオチドであれば、ポリリボヌクレオチド
γとポリリボヌクレオチドδを同一にした場合と同等の
効果を得ることができる。

【００３８】本発明のポリリボヌクレオチドがポリリボ
ヌクレオチドγの存在下で切断された後の、β₁ 〜β_n
もしくはβ₁ 〜β_n-1 （以下これらを総称して「β」と
いう）を含む各断片の構造は、それらがポリリボヌクレ
オチドδに対して行う機能阻害の手段、ならびに、ポリ
リボヌクレオチドδのヌクレオチド配列またはポリリボ
ヌクレオチドδの発現を支配する因子の構造的特徴に依
存する。具体的には例えば、ポリリボヌクレオチドδの
発現阻害の手段としてハンマーヘッド型リボザイムを選
択した場合、βを含む断片の構造は、ポリリボヌクレオ
チドδのヌクレオチド配列に依存する。

【００３９】ポリリボヌクレオチドδの機能を阻害する
手段は、ポリリボヌクレオチド分子が行ない得るもので
あればいずれでもよく、例えばリボザイムによるポリリ
ボヌクレオチドδの切断、ポリリボヌクレオチドδに対
するアンチセンスＲＮＡによる翻訳阻止、ポリリボヌク
レオチドδに転写される遺伝子の特異的転写因子の阻害
等を挙げることができる。この手段の選択に際しては、
ポリリボヌクレオチドδのヌクレオチド配列がそれぞれ
の手段に適しているか否かが考慮される。リボザイムに
よるポリリボヌクレオチドδの切断またはポリリボヌク
レオチドδに対するアンチセンスＲＮＡによる翻訳阻止
が、本発明における好適な機能阻害の手段である。この
うち、リボザイムの構造は、ポリリボヌクレオチドδを
特異的に切断する活性を有していればいずれのものでも
よいが、好適にはハンマーヘッド型、ヘアピン型、また
はドメイン変換ヘアピン型であり、より好適には、βを
含む断片とδが構成する構造が下記式（ＸＩＩＩ）また
は（ＸＩＶ）で表わされるようなハンマーヘッド型リボ
ザイムまたはヘアピン型リボザイムである：

【００４０】

【化１８】

【００４１】（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃは
シトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇ
はグアニンヌクレオチドを表し、Ｄ₁ 〜Ｄ_e は同一また
は異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチ
ド、シトシンヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチド
のいずれかを表し、Ｑ₁ 〜Ｑ_a は同一または異なってウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、Ｒ₁ 〜Ｒ_a はＱ₁ 〜Ｑ_a にそれぞれ相補的なヌク
レオチドを表し、Ｗ₁ 〜Ｗ_k は同一または異なってウラ
シルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌ
クレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを表
し、Ｚ₁ 〜Ｚ_q は同一または異なってウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｓは、ウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、Ｍ₁ 〜Ｍ_m はＷ₁ 〜Ｗ_k にハイブリダイズするヌ
クレオチドを表し、Ｎ₁ 〜Ｎ_p はＺ₁ 〜Ｚ_q にハイブリ
ダイズするヌクレオチドを表し、Ｐはウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチドまたはシトシンヌクレオチ
ドのいずれかを表し、ｐ、ｑ、ｋ、ｍは同一または異な
って１乃至２０の整数を表し、ｅ、ａは同一または異な
って１乃至１０の整数を表す。）；

【００４２】

【化１９】

【００４３】（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃは
シトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇ
はグアニンヌクレオチドを表し、Ｄ₁ 〜Ｄ_e は同一また
は異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチ
ド、シトシンヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチド
のいずれかを表し、Ｑ₁ 〜Ｑ_a は同一または異なってウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、Ｒ₁ 〜Ｒ_a はＱ₁ 〜Ｑ_a にそれぞれ相補的なヌク
レオチドを表し、Ｗ₁ 〜Ｗ４は同一または異なってウラ
シルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌ
クレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを表
し、Ｚ₁ 〜Ｚ_q は同一または異なってウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｓは、ア
デニンヌクレオチドまたはシトシンヌクレオチドのいず
れかを表し、Ｍ₁ 〜Ｍ₄ はＷ₁ 〜Ｗ₄ にハイブリダイズ
するヌクレオチドを表し、Ｎ₁ 〜Ｎ_p はＺ₁ 〜Ｚ_q にハ
イブリダイズするヌクレオチドを表し、Ｐはウラシルヌ
クレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオ
チドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、
ｐ、ｑは同一または異なって１乃至２０の整数を表し、
ｅ、ａは同一または異なって１乃至１０の整数を表
す。）。

【００４４】ポリリボヌクレオチドδをＨＩＶのＲＮＡ
とした場合、βとして最も好適なヌクレオチド配列は、
配列表の配列番号５６乃至５９からなる群より選択され
る。

【００４５】βを含む断片は、それぞれ単独で、あるい
は複数の断片が協同してポリリボヌクレオチドδの発現
を特異的に阻害するが、この「協同して」とは、例えば
β₁を含む断片とβ₂ を含む断片が一つのハンマーヘッ
ド型リボザイム複合体の部分構造を構成するような状態
等をいう。

【００４６】本発明のポリリボヌクレオチドのヌクレオ
チド配列は、以上の事項を考慮した上で、その目的に無
関係の非特異的な高次構造を形成する可能性を最小限に
とどめるように設計されることが好ましい。そのよう
な、本発明のポリリボヌクレオチドとして好適な例は、
配列表の配列番号８乃至１０、または２６乃至２９のい
ずれか一つに示されるヌクレオチド配列を有するポリリ
ボヌクレオチドである。さらに好適な例は、配列表の配
列番号２６乃至２９のいずれか一つに示されるヌクレオ
チド配列を有するポリリボヌクレオチドである。

【００４７】図１は、ポリリボヌクレオチドαとポリリ
ボヌクレオチドγがハンマーヘッド型リボザイムを構成
し、βがリボザイムであるような場合における、本発明
のポリリボヌクレオチドの細胞内での挙動について説明
したものである。

【００４８】

【発明の実施の形態】本発明のポリリボヌクレオチド
に転写されるＤＮＡは、例えば、両端の配列がオーバー
ラップするように、センスおよびアンチセンスの部分オ
リゴデオキシリボヌクレオチドを合成してから、ＤＮＡ
リガーゼによる連結反応や、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）［Saiki, R. K., et al (1988) Science 239, 48
7-491 参照］等のＤＮＡポリメラーゼ反応を利用して、
それら部分オリゴデオキシリボヌクレオチドを連結する
ことにより作製することができる。オリゴデオキシリボ
ヌクレオチドは、５’−水酸基をジメトキシトリチル
基、塩基部のアミノ基をアシル基で保護した、ヌクレオ
シド３’−Ｏ−ホスホロアミダイト体（パーキンエルマ
ー社、ファルマシア社、グレンリサーチ社、パーセプテ
ィブ社等）を原料として、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機
（例えば（株）パーキンエルマージャパン・アプライド
バイオシステムズ事業部製）を用いることにより所望の
配列のものを合成することができる［Koster, et al.
(1984) Nucleic Acids Res. 12, 4539 参照］。

【００４９】合成終了後、リン酸基の保護基のβ−シア
ノエチル基の除去、ポリヌクレオチド鎖の担体からの切
り出しおよび塩基部のアシル基の除去をアルカリ処理に
より行い、次いで酸処理を行って５’−水酸基の保護基
を除去する。これに続く逆相およびイオン交換クロマト
グラフィー（高速液体クロマトグラフィーを含む）等の
各種クロマトグラフィー等、通常の核酸精製に用いられ
る精製操作で精製することにより、ＤＮＡ鎖を得ること
ができる。得られたＤＮＡのヌクレオチド配列の確認
は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法［Maxam,
A. M. and Gilbert, W. (1980) Methods in Enzymolog
y 65, 499-559 参照］やＭ１３ファージを用いるジデオ
キシヌクレオチド鎖終結法［Messing, J. and Vieira,
J. (1982)Gene 19, 269-276参照］により行うことがで
きる。

【００５０】かくして得られたオリゴデオキシリボヌク
レオチドのセンス鎖とアンチセンス鎖とをアニーリング
させて二本鎖とし、ＤＮＡリガーゼを用いて細胞内で作
用するプロモーターの支配下に該二本鎖ＤＮＡを連結す
ることにより、本発明のポリリボヌクレオチドに転写さ
れるＤＮＡを構築することができる。

【００５１】本発明のポリリボヌクレオチドは、例えば
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列の下流に、
上記のごとくして得られた本発明のポリリボヌクレオチ
ドに転写されるＤＮＡを連結したものに、ＡＴＰ、ＣＴ
Ｐ、ＧＴＰおよびＵＴＰの存在下でＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼを作用させることにより得ることができる［Millig
an, J. F., et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15, 87
83-8798 参照］。その他、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼやＳ
Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼ等、他の既知のＲＮＡポリメ
ラーゼおよびプロモーター配列の組み合わせを利用する
こともできる。

【００５２】さらに、本発明のポリリボヌクレオチドに
転写されるＤＮＡを含む発現ベクターを宿主細胞へ導入
することにより、本発明の宿主細胞を得ることができ、
また同時に本発明の発現ベクターを量産することもでき
る。

【００５３】本発明のポリリボヌクレオチドを切断させ
るためには、ポリリボヌクレオチドγが必要であるが、
本発明の組換えベクターを保持する宿主細胞は、γを有
する細胞に限定されない。以下、本発明の組換えベクタ
ーによる宿主細胞の形質転換の好適な態様について説明
する。

【００５４】ポリリボヌクレオチドに転写される発現ベ
クター用いる方法：本発明のポリリボヌクレオチドに転
写されるＤＮＡを含む発現ベクターを作製し、該発現ベ
クターでポリリボヌクレオチドγを有する細胞を形質転
換させる。また、単に該発現ベクターを増幅する目的で
あれば、ポリリボヌクレオチドγを含まない宿主細胞を
使用することもできる。

【００５５】ポリリボヌクレオチドに転写される発現ベ
クターとγに転写される発現ベクターの二種類のベクタ
ーを用いる方法：本発明のポリリボヌクレオチドに転写
されるＤＮＡを含む発現ベクターと、γに転写されるＤ
ＮＡを含む発現ベクターをそれぞれ別個に作製し、それ
ら発現ベクターで宿主細胞にコ・トランスフェクション
または、順次トランスフェクションする。ベクター系は
必要に応じて同一のもの、または異なるものをいずれも
使用することができる。

【００５６】本発明のポリリボヌクレオチドに転写され
る遺伝子とγに転写される遺伝子が反対の向きに挿入さ
れた発現ベクターを用いる方法：本発明のポリリボヌク
レオチドに転写されるＤＮＡと、γに転写されるＤＮＡ
を、プロモーターの支配下、反対の向きに連結した発現
ベクターを調製し、宿主細胞を形質転換させる。プロモ
ーターは必要に応じて同一のもの、または異なるものを
いずれも使用することができる。

【００５７】宿主細胞およびベクターとしては以下のも
のが例示される。

【００５８】原核細胞の宿主細胞としては、例えば大腸
菌（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtilis
）等が挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞
内で形質発現させるには、宿主細胞と適合し得る種由来
のレプリコン、すなわち複製起点および調節配列を含ん
でいるプラスミドベクターで宿主細胞をトランスフェク
トさせればよい。また、ベクターはトランスフェクトさ
れた細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与すること
ができる配列を持つものが好ましい。

【００５９】例えば、大腸菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては一般にｐ
ＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドがよく用いられる
が、本発明ではこれらに限定されず、公知の各種の菌株
およびベクターがいずれも利用できる。プロモーターと
しては、大腸菌においてはトリプトファン（ｔｒｐ）プ
ロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリ
プトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポ
プロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、バクテリオファー
ジ由来のラムダ（λ）ＰＬプロモーター、ポリペプチド
鎖伸長因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター等が挙げら
れ、いずれのプロモーターも本発明のポリリボヌクレオ
チドの産生に使用することができる。

【００６０】また、枯草菌としては、例えば、２０７−
２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２８［Oh
mura, K., et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93 参
照］等が用いられるが、本発明はこれらに限定されな
い。プロモーターとしては、枯草菌のα−アミラーゼ遺
伝子の調節配列がよく用いられる。

【００６１】真核生物の宿主細胞としては、脊椎動物、
昆虫、酵母等の細胞が利用可能であり、脊椎動物細胞と
しては、例えば、マウスの細胞であるＮＩＨ−３Ｔ３細
胞［(1969) J. Viol. 4, 549-553参照］、サルの細胞で
あるＣＯＳ細胞［Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-18
2 参照］やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨ
Ｏ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株［Urlaub, G. a
nd Chasin, L. A., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 77, 4216-4220 参照］等がよく用いられているが、本
発明は、これらに限定されない。脊椎動物細胞の発現ベ
クターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に
位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライシング部位、
ポリアデニル化部位および転写終結配列等を有するもの
を使用でき、これらはさらに必要に応じて複製起点を有
してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０初
期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ［Subramani,
S.,et al. (1981) Mol. Cell, Biol. 1, 854-864参
照］やＳＶ４０初期プロモーターにＨＴＬＶ−ＩＬＴ
ＲのＲ−Ｕ５連結したＳＲαプロモーターを有するｐｃ
ＤＬ−ＳＲα［Takebe, Y., et al. (1988) Mol. Cell,
Biol. 8, 466-472 参照］等を例示できるが、本発明は
これらに限定されない。また、真核微生物としては酵母
も使用し得る。該酵母等の真核微生物の発現ベクターと
しては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモ
ーター［Bennetzen, J. and Hall, B. D.(1982) J. Bio
l. Chem. 257, 3018-3025参照］や酸性ホスファターゼ
遺伝子のプロモーター［Miyanohara, A., et al. (198
3) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80,1-5参照］等を使用
できる。

【００６２】このようにして得られたベクターを導入す
ることにより、他の原核生物または真核生物の宿主細胞
を形質転換させることができる。さらに、これらのベク
ターに適当なプロモーターおよび形質発現にかかわる配
列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において
遺伝子を発現させることが可能である。

【００６３】宿主細胞として大腸菌を用いる場合を例に
挙げると、発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２複製起
点を有し、大腸菌において自律増殖が可能であり、さら
に転写プロモーター、翻訳開始シグナルを備えたものを
用いることができる。該発現ベクターは塩化カルシウム
法［Mandel, M. and Higa, A. (1970) J. Mol. Biol.5
3, 154参照］、ハナハンの方法［Hanahan, D. and Mese
lson, M. (1980) Gene10, 63 参照］および電気穿孔法
［Neumann, E., et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845 参
照］等により大腸菌に取り込ませることができ、かくし
て所望のベクターがトランスフェクトされた細胞を得る
ことができる。

【００６４】また、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げ
ると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有
し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、さらに
転写プロモーター、転写終結シグナルおよびＲＮＡスプ
ライス部位を備えたものを用いることができる。該発現
ベクターはＤＥＡＥ−デキストラン法［Luthman, H. an
d Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 1295
-1308 参照］、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈澱法［Gr
aham, F. L. and van der Ed, A. J. (1973) Virology
52, 456-457 参照］および電気穿孔法［Neumann, E., e
t al. (1982) EMBO J. 1, 841-845 参照］等によりＣＯ
Ｓ細胞に取り込ませることができ、かくして所望のベク
ターがトランスフェクトされた細胞を得ることができ
る。

【００６５】また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる
場合には、発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカー
として機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例
えばｐＲＳＶｎｅｏ［Sambrook, J., et al. (1989) "M
olecular Cloning: A Laboratory Manual" Cold Spring
Harbor Laboratory, NY参照］やｐＳＶ２−ｎｅｏ［So
uthern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Ge
net. 1, 327-341 参照］等によって共形質転換し、Ｇ４
１８耐性のコロニーを選択することにより本発明のリボ
ザイムを安定に産生する形質転換細胞を得ることができ
る。

【００６６】上記のごとくして得られた形質転換細胞
は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞
内に本発明のポリリボヌクレオチドが産生される。該培
養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じ
て慣用される各種のものが適宜選択でき、例えば、大腸
菌であればトリプトン−イースト培地（バクトトリプト
ン１．６％、イーストエキストラクト１．０％、塩化ナ
トリウム０．５％（ｐＨ７．０））やペプトン培地
（ディフコ社）等を使用できる。

【００６７】また、例えばＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地やダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭ
ＥＭ）等の培地に、必要に応じウシ胎児血清（ＦＢＳ）
等の血清成分を添加したものを使用することができる。

【００６８】本発明のポリリボヌクレオチドは、塩の形
で使用することができる。そのような塩としては、例え
ばナトリウム、カリウムのようなアルカリ金属；カルシ
ウムのようなアルカリ土類金属；アンモニア；リジン、
アルギニンのような塩基性アミノ酸；トリエチルアミン
のようなアルキルアミン類；などの無機塩または有機塩
を挙げることができる。

【００６９】本発明のポリリボヌクレオチドがポリリボ
ヌクレオチドγの存在下で切断されることは、例えば以
下に記載する実験によって確認することができる。

【００７０】まず、ポリリボヌクレオチドγを、二価の
金属イオンを含有する緩衝液中にて本発明のポリリボヌ
クレオチドを加えて加温する。二価の金属イオンとして
は、好適にはＭｇ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｐｂ²⁺等が用い
られる。緩衝液としては、中性からアルカリ性で使用さ
れる緩衝液であれば制限はないが、トリス−塩酸緩衝
液、グリシル−グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等が
使用され得る。

【００７１】反応温度は、０〜１００℃が好適であり、
さらに３０〜５０℃が好適である。

【００７２】一定時間後、反応液中にエチレンジアミン
四酢酸（以下「ＥＤＴＡ」という）を加えることにより
反応を停止させる。

【００７３】ポリリボヌクレオチドγの存在下での本発
明のポリリボヌクレオチドの切断反応の定量には、本発
明のポリリボヌクレオチドの５’末端をラジオアイソト
ープ等で標識し切断反応生成物をイメージアナライザー
等で定量する方法、切断反応生成物を逆相高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）で定量する方法、切断反応
生成物を色素（エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲＧＲ
ＥＥＮＩＩＲＮＡゲルステイン（モレキュラープロ
ーブ社製）等）で染色し、コンピュータを用いた画像処
理により定量する方法などが用いられる。

【００７４】また、本発明のポリリボヌクレオチド中の
βを含む断片がポリリボヌクレオチドδを特異的に切断
するリボザイムである場合のリボザイム反応について
も、上記と同様の実験を行なうことにより確認すること
ができる。

【００７５】さらに、本発明のポリリボヌクレオチド中
のβを含む断片がポリリボヌクレオチドδのアンチセン
スＲＮＡである場合、例えばδがタンパク質をコードす
るポリリボヌクレオチドであれば、δから該タンパク質
への翻訳が可能な条件下でポリリボヌクレオチドβを含
む断片を共存させる反応系を調製し、一定時間経過後の
該反応系中の該タンパク質の量や活性を定量する方法等
を用いてポリリボヌクレオチドβを含む断片の効果を検
証することができる。

【００７６】本発明のポリリボヌクレオチドは、動物や
植物、または人体に薬理上使用できる担体と共に直接投
与することが可能である。それらの投与形態としては、
錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による
経口投与、または、注射剤、点滴剤、坐薬等による非経
口投与を挙げることができる。

【００７７】また、本発明のポリリボヌクレオチドに転
写されるＤＮＡを含む発現ベクターはリポソーム等の運
搬体中に封入し投与することも可能である。そのような
リポソームとして、N-[1-(2,3-ジオレイロキシ) プロピ
ル]-N,N,N-トリメチルアンモニウム・クロリド（N-[1-
(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium ch
loride ；ＤＯＴＭＡ）とジオレオイルホスファチジル
・エタノールアミン（dioleoylphosphatidyl ethanolam
ine ；ＤＯＰＥ）からなる「リポフェクチン（ギブコ・
ビーアールエル社製）」やリポポリアミン［Behr, J.
P., et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6
982-6986参照］等が例示できるが、これらに限定されな
い。

【００７８】その投与量は、症状、年令、体重等によっ
て異なるが、通常、経口投与では、成人に対して、１日
約０．１ｍｇないし１０００ｍｇであり、これらを１
回、または数回に分けて投与することができる。また、
非経口投与では、１回０．１ｍｇないし１０００ｍｇを
皮下注射、筋肉注射、または静脈注射によって投与する
ことができる。

【００７９】また、本発明のＤＮＡを好適なベクターに
組み込み、該ベクター自体を生体に投与することによ
り、細胞内でポリリボヌクレオチドを発現せしめ、本発
明の効果を得ることも可能である。そのようなベクター
として、レトロウイルス（Moloney murine leukemic vi
rus ［Eglitis, N. A. and Anderson, W. F. (1988) Bi
otechniques 6, 608-614参照］等）、アデノウイルス
［鐘ケ江裕美ら、実験医学(1994) 12, 316-322 参
照］、アデノアソシエトウイルス［平井幸彦、島田隆、
実験医学 (1994) 12, 323-327 参照］やワクシニアウイ
ルス等が例示できるが、これらに限定されない。

【００８０】さらに、植物・動物やヒトの生体より細胞
を摘出し、該細胞に本発明の発現ベクターをトランスフ
ェクトして培養し、細胞内にて本発明のポリリボヌクレ
オチドを産生する能力を付与した後に、このトランスフ
ェクトされた細胞を元の生体に移植して、ポリリボヌク
レオチド内に有するリボザイムまたは、アンチセンスＲ
ＮＡを該生体に発現させることも可能である。触媒活性
をもつリボザイムとしては、ハンマーヘッド型リボザイ
ム、ヘアピン型リボザイムまたは、その変形型であるド
メイン変換ヘアピンリボザイム、ＨＤＶリボザイム[Bre
aker, R. R. (1997) Chem. Rev. 97, 371-390 参照] 等
が例示できるが、これらに限定されない。アンチセンス
ＲＮＡは、標的とするＲＮＡのヌクレオチド配列が解明
されていれば、その相補配列を用いることで調製可能で
ある[Uhlman,E. and Payman,A. (1990) Chem Rev. 90,
544-584.] 。

【００８１】本発明のポリリボヌクレオチドは、特定の
ヌクレオチド配列を有するポリリボヌクレオチドγの存
在下で、複数の分子のリボザイムまたはアンチセンスＲ
ＮＡ等に切り分けられるので、効率良く標的ポリリボヌ
クレオチドδの機能を阻害することが可能となる。この
方法を利用することにより、例えばヒト生体内で、エイ
ズに関連するポリリボヌクレオチドや、癌遺伝子に関連
するポリリボヌクレオチドを、本発明のポリリボヌクレ
オチドから生成するリボザイムまたはアンチセンスＲＮ
Ａ等にその機能を阻害させることにより、上記病因遺伝
子に起因する疾患の発病阻止や症状の軽減が可能であ
る。

【００８２】

【実施例】以下、実施例および参考例により、本発明
をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定され
ない。

【００８３】実施例１．ポリリボヌクレオチド
（１）、（２）および（３）の調製ＨＩＶ−１ＲＮＡのヌクレオチド配列を有する基質ポ
リリボヌクレオチドを切断するリボザイム配列を有し、
かつＨＩＶＲＮＡの特定のヌクレオチド配列を有する
ＲＮＡにより、トリミング反応を生じるポリリボヌクレ
オチド（１）（配列表の配列番号８）、同（２）（配列
表の配列番号９）および同（３）（配列表の配列番号１
０）を、ＤＮＡからの転写反応によって得るため、以下
に記載する方法に従って、鋳型ＤＮＡ１（配列表の配列
番号１）、鋳型ＤＮＡ２（配列表の配列番号２）および
鋳型ＤＮＡ３（配列表の配列番号３）を調製した後、こ
れらを保持するプラスミドベクターｐＴ７−Ｒ２Ｔ、ｐ
Ｔ７−Ｒ２ＧおよびｐＴ７−Ｒ３を調製した。

【００８４】１）オリゴデオキシリボヌクレオチドの合
成まず、以下に記載するオリゴデオキシリボヌクレオチ
ド： 5'- GCACAACAAG AAGGCAACCA GAGAAACACT CAGACTTTTA AT
CTGAGGTA TATTACCTGG TAGGTAC -3' （１１２ＡＣ：配
列表の配列番号１１）； 5'- CTACCAGGTA ATATACCTCA GATTAAAAGT CTGAGTGTTT CT
CTGGTTGC CTTCTTGTTG TGCTGCA -3' （１１２ＡＣ
（−）：配列表の配列番号１２）； 5'- TTCTGTCAGT CGTAGCGCGA AAGCGCTACC TGATGATTAA CA
CTGGTAC -3'（Ｓ１：配列表の配列番号１３）； 5'- CAGTGTTAAT CATCAGGTAG CGCTTTCGCG CTACGACTGA CA
GAAGTAC -3'（Ｓ１（−）：配列表の配列番号１４）； 5'- TTCTGTCAGT CGTAGCGCGA AAGCGCTACC TGATGAGTAA CA
CTGGTAC -3'（Ｓ１Ｇ：配列表の配列番号１５）； 5'- CAGTGTTACT CATCAGGTAG CGCTTTCGCG CTACGACTGA CA
GAAGTAC -3'（Ｓ１Ｇ（−）：配列表の配列番号１
６）； 5'- TTCTTTCAGT CGTAGCGCGA AAGCGCTACC TGATGAGTAA CA
CTGGTAC -3'（Ｓ２：配列表の配列番号１７）； 5'- CAGTGTTACT CATCAGGTAG CGCTTTCGCG CTACGACTGA AA
GAAGTAC -3'（Ｓ２（−）：配列表の配列番号１８）を合成した。

【００８５】上記の各オリゴデオキシリボヌクレオチド
は、デオキシヌクレオシド３’−ホスホロアミダイト
（（株）パーキンエルマージャパン・アプライドバイオ
システムズ事業部より購入）を原料として、ＤＮＡ自動
合成機（モデル３９２：（株）パーキンエルマージャパ
ン・アプライドバイオシステムズ事業部製）で、１μｍ
ｏｌスケールで合成した。

【００８６】合成終了後、濃アンモニア水でＣＰＧ（Co
ntrolled Pore Glass ）よりオリゴデオキシリボヌクレ
オチドを切り出し、６０℃で５時間加温した。溶媒を留
去し、脱イオン水に溶解した後、逆相ＨＰＬＣで精製し
てから、１ｍｌの８０％酢酸水溶液を加え、２０分間放
置した。酢酸を減圧下留去し、水層を酢酸エチルで洗浄
した。溶媒を留去後、滅菌水１ｍｌに溶解した。この画
分中のポリリボヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣで分取後、
さらにイオン交換ＨＰＬＣで分取し、精製した。ジメト
キシトリチル基が５’末端に結合したオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドの逆相ＨＰＬＣの条件は以下の通りであ
った：カラム：イナートシルプレップＯＤＳカラム（φ１０×２５０ｍｍ：ジーエルサイエンス社製）；溶媒：Ａ溶液５％アセトニトリル／０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（以下「ＴＥＡＡ」という）（ｐＨ７．０）；Ｂ溶液アセトニトリル；流速：２ｍｌ／分。

【００８７】ジメトキシトリチル基が５’末端に結合し
たオリゴデオキシリボヌクレオチドについての逆相ＨＰ
ＬＣにおける直線濃度勾配の条件および保持時間を表１
に示す。

【００８８】

【表１】逆相ＨＰＬＣ ─────────────────────────────── ヌクレＢ％直線濃度勾配保持時間オチドの全時間 ─────────────────────────────── １１２ＡＣ１０→５０％２０分 14.4分１１２ＡＣ（−）１０→５０％２０分 14.8分Ｓ１１０→５０％２０分 16.8分Ｓ１（−）１０→５０％２０分 15.2分Ｓ１Ｇ分取は行わなかった。Ｓ１Ｇ（−）分取は行わなかった。Ｓ２分取は行わなかった。Ｓ２（−）分取は行わなかった。 ─────────────────────────────── ジメトキシトリチル基を脱保護後のオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドの逆相ＨＰＬＣの条件は以下の通りであっ
た：カラムおよび流速：（ａ）イナートシルＯＤＳ−２（φ６×１５０ｍｍ：ジーエルサイエンス社製）、１ｍｌ／分；（ｂ）ワコーパックＷＳ−ＤＮＡ（φ１０×２５０ｍｍ：和光純薬工業（株）製）、２ｍｌ／分；（ｃ）ワコーパックＷＳ−ＤＮＡ（φ４．６×１５０ｍｍ：和光純薬工業（株）製）、１ｍｌ／分溶媒：Ａ溶液５％アセトニトリル／０．１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）；Ｂ溶液２５％アセトニトリル／０．１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）；Ｂ％：１０→５０％；カラム温度：６０℃；直線濃度勾配の全時間：２０分。」脱保護後のオリゴデオキシリボヌクレオチドについての
逆相ＨＰＬＣにおけるカラム名および保持時間を表２に
示す。

【００８９】

【表２】逆相ＨＰＬＣ ─────────────────────── ヌクレオチドカラム保持時間 ─────────────────────── １１２ＡＣ（ｃ） 15.3分１１２ＡＣ（−）（ｃ） 15.7分Ｓ１（ｃ） 22.9分Ｓ１（−）（ｃ） 21.7分Ｓ１Ｇ（ｂ） 23.9分Ｓ１Ｇ（−）（ｂ） 25.5分Ｓ２（ａ） 21.6分Ｓ２（−）（ａ） 20.2分 ─────────────────────── イオン交換ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。

【００９０】カラム：ＴＳＫゲルＤＥＡＥ２ＳＷ（φ４．６×２５０ｍｍ：東ソー（株）社製）；溶媒：Ａ溶液２０％アセトニトリル／水；Ｂ溶液２０％アセトニトリルを含む２Ｍ酢酸アンモニウム水溶液；流速：１ｍｌ／分；Ｂ％：１０→５０％；カラム温度：６０℃；直線濃度勾配の全時間：２０分。

【００９１】各オリゴデオキシリボヌクレオチドについ
てのＨＰＬＣにおける直線濃度勾配の条件および保持時
間を表３に示す。

【００９２】

【表３】イオン交換ＨＰＬＣ ──────────────────────────── ヌクレオチド保持時間 ──────────────────────────── １１２ＡＣ 19.4 分１１２ＡＣ（−）イオン交換による分取は行わなかった。Ｓ１同上Ｓ１（−）同上Ｓ１Ｇ同上Ｓ１Ｇ（−）同上Ｓ２ 17.3 分Ｓ２（−） 17.5 分 ──────────────────────────── ２）プラスミドｐＴ７−Ｒ２Ｔ、ｐＴ７−Ｒ２Ｇおよび
ｐＴ７−Ｒ３の構築図２に示すように、プラスミドｐＴ７Ｔ３１９Ｕより、
二本鎖とした１１２ＡＣを導入し、ｐＴ７−Ｒ１を得た
後、二本鎖としたオリゴデオキシリボヌクレオチドＳ
１、Ｓ１ＧおよびＳ２を導入することにより、それぞれ
プラスミドｐＴ７−Ｒ２Ｔ、ｐＴ７−Ｒ２ＧおよびｐＴ
７−Ｒ３を構築した。

【００９３】まず上記１）で調製したオリゴデオキシリ
ボヌクレオチド１１２ＡＣおよび１１２ＡＣ（−）（各
１０ｐｍｏｌ）を１０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭト
リス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解
し、７０℃で５分間加温した後、室温まで徐冷した。

【００９４】一方、プラスミドベクターｐＴ７Ｔ３Ｕ１
９（ファルマシア社製）１．８８μｇ（１８．７５μ
ｌ）を、制限酵素ＫｐｎＩで消化した後、エタノール沈
澱を行なってＤＮＡを回収した。さらにこのＤＮＡを制
限酵素ＰｓｔＩで消化した後、エタノール沈澱を行なっ
て回収したＤＮＡを６．４μｌの滅菌水に溶解した。

【００９５】このｐＴ７Ｔ３Ｕ１９／ＫｐｎＩ−Ｐｓｔ
Ｉ消化物（０．５ｐｍｏｌ）３．２μｌに、５倍濃度リ
ガーゼ反応用緩衝液（３３０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
７．６）、３３ｍＭ塩化マグネシウム）４μｌ、１１
２ＡＣおよび１１２ＡＣ（−）からなるニ本鎖オリゴデ
オキシリボヌクレオチド３μｌ、２．５ｍＭＡＴＰ
４．８μｌ、０．２Ｍ２−メルカプトエタノール
１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３５０単位／μｌ；宝酒
造（株）社製）１μｌを加え、２０℃で３．５時間保温
した。この反応液にエタノール沈澱操作を行なってＤＮ
Ａを回収し、ＴＥ緩衝液２０μｌに溶解した。

【００９６】このＤＮＡ溶液１０μｌ（約０．９μｇ相
当）を大腸菌ＮＭ５２２株のコンピテント細胞（１００
μｌ）に加えて混合後、０℃で１０分間冷却し、４２℃
で１分間加温した後、室温まで戻した。この大腸菌に１
ｍｌのＬＢ培地（日本製薬（株）製）を加え、１時間培
養した。この培地を遠心し、沈澱を回収して、２０μｇ
／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（日本製薬
（株）製）上に塗布して３７℃で１晩培養した。成育し
たコロニーの中から８コロニーを選択し、それぞれを２
０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地のシャ
−レの１／４区画に１つのコロニ−を植え、３７℃で一
晩培養した。そのうちの半分（シャ−レの１／８区画
分）の菌体をかきとり、これらの大腸菌をプレートから
をエッペンドルフチューブに回収し、文献［Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (second edition), Col
d Spring Harbor Laboratory（1989) 1.29-1.30 参照］
に記載された手順で少量のプラスミドを回収した。

【００９７】得られたプラスミドを制限酵素ＮａｅＩお
よびＰｓｔＩで消化した後、１０ｍｇ／ｍｌリボヌク
レアーゼＡ０．２μｌを加え、３７℃で３０分間保温
した。この反応液をフェノール抽出、クロロホルム抽出
し、エタノール沈澱を行った。得られたプラスミドを４
μｌの滅菌水に溶解し、４μｌのＤＮＡローディング溶
液（３０％グリセロール、０．２５％ブロモフェノ
ールブルー、０．２５％キシレンシアノール）を加
え、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１５０Ｖ、
１．５時間）を行った。泳動後のゲルを臭化エチジウム
で染色して、目的の鎖長である４０１塩基対のバンドを
確認した。８個のコロニーのうち３つに１１２ＡＣの遺
伝子を含むプラスミドｐＴ７−Ｒ１を保持していること
を確認した。３個のコロニーのうち１個を選択して２０
μｇ／ｍｌアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地中で培
養し、ＤＮＡ精製キット（ウィザード・プラスミニプレ
ップ・ＤＮＡピュリフィケーションシステム：プロメガ
社製）によりプラスミドｐＴ７−Ｒ１を回収精製した。

【００９８】次に、上記１）で調製したオリゴデオキシ
リボヌクレオチド、Ｓ１とＳ１（−）、Ｓ１ＧとＳ１Ｇ
（−）または、Ｓ２とＳ２（−）（各１０ｐｍｏｌ）を
１０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解し、７０℃で５分
間加温した後、室温まで徐冷することにより二本鎖ＤＮ
Ａ（Ｓ１／Ｓ１（−）、Ｓ１Ｇ／Ｓ１Ｇ（−）またはＳ
２／Ｓ２（−））を調製した。

【００９９】一方、上記で得られたプラスミドベクター
ｐＴ７−Ｒ１１．８８μｇ（４０μｌ）を制限酵素
ＫｐｎＩで消化した後、エタノール沈澱操作を行なって
沈澱を回収した。

【０１００】ｐＴ７−Ｒ１／ＫｐｎＩ消化物（０．５ｐ
ｍｏｌ）３．２μｌ、５倍濃度リガーゼ反応用緩衝液
（３３０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、３３ｍＭ
塩化マグネシウム）４μｌ、二本鎖ＤＮＡ（Ｓ１／Ｓ
１（−）、Ｓ１Ｇ／Ｓ１Ｇ（−）またはＳ２／Ｓ２
（−））各３μｌ、２．５ｍＭＡＴＰ４．８μｌ、
０．２Ｍ２−メルカプトエタノール１μｌ、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（３５０単位／μｌ：宝酒造（株）社製）
１μｌを加え２０℃で３．５時間保温した。この反応液
にエタノール沈澱操作を行なってそれぞれプラスミドを
含む沈澱を回収し、ＴＥ緩衝液２０μｌに溶解した。

【０１０１】これらの溶液それぞれ１０μｌ（約０．９
μｇ相当）を大腸菌ＮＭ５２２株のコンピテント細胞
（１００μｌ）に混合後、０℃で１０分間冷却し、４２
℃で１分間加温した後、室温まで戻した。この大腸菌に
１ｍｌのＬＢ培地（日本製薬（株）製）を加え、１時間
培養した。遠心し、大腸菌を回収して、２０μｇ／ｍｌ
アンピシリンを含むＬＢ寒天培地（日本製薬（株）製）
上で３７℃で一晩培養し、成育したコロニーの中から８
コロニーを選択し、それぞれを２０μｇ／ｍｌアンピシ
リンを含むＬＢ寒天培地（日本製薬（株）製）のシャー
レの１／４区画に1 つのコロニーを植え、３７℃で一晩
培養した。そのうちの半分（シャーレの１／８区画分）
の菌体をかきとり、これらの大腸菌をプレートからをエ
ッペンドルフチューブに回収し、少量のプラスミドを回
収した。

【０１０２】得られたプラスミドを滅菌水２５μｌに
溶解し、制限酵素ＮａｅＩおよびＰｓｔＩで消化してか
ら、１０ｍｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡ（０．２μ
ｌ）を加えて３７℃で３０分間保温した。フェノール抽
出、クロロホルム抽出し、エタノール沈澱を行った。得
られたプラスミドを４μｌの滅菌水に溶解し、４μｌの
ＤＮＡローディング溶液を加え、５％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（１５０Ｖ、１．５時間）を行った。泳
動後のゲルを臭化エチジウムで染色して、目的の鎖長で
ある約４５０ｂｐのバンドを確認した。Ｓ１では３０個
のコロニーのうち１３個が、Ｓ１Ｇでは１６個のコロニ
ーのうち２つが、そしてＳ２では１６個のコロニーのう
ち７つが、それぞれ目的の鎖長の遺伝子を保持してい
た。

【０１０３】それらのプラスミドについて、目的のヌク
レオチド配列を有する遺伝子が挿入されていることを確
認する目的で、市販のプライマーオリゴヌクレオチド
（Ｔ７プライマーまたは−２１Ｍ１３プライマー；
（株）パーキンエルマージャパン・アプライドバイオシ
ステムズ事業部製）をプライマーとして用い、ＤＮＡシ
ークエンサー（CATALYST800 および310 Genetic Analyz
er；（株）パーキンエルマージャパン・アプライドバイ
オシステムズ事業部製）でヌクレオチド配列を解析し
た。その結果、Ｓ１、Ｓ１Ｇ、Ｓ２でそれぞれ２個のコ
ロニーについて目的のヌクレオチド配列を保持している
ことが確認された。そこで、それぞれ１つのコロニーを
選択して、大量培養を行なった。すなわち、目的のプラ
スミドを有する大腸菌を１００μｇ／ｍｌアンピシリ
ンを含むＬＢ培地２５０ｍｌに接種し、３７℃で培養
した。培養液を遠心分離して菌体を回収し、プラスミド
精製キットフレキシプレップ（ファルマシア社製）を用
いて、キットに添付された説明書に従って使用すること
により、プラスミドを精製した。得られたプラスミドを
１０００μｌの滅菌水に溶解して、プラスミドｐＴ７−
Ｒ２Ｔ（Ｓ１：約６９０μｇ）、ｐＴ７−Ｒ２Ｇ（Ｓ１
Ｇ：約４１０μｇ）およびｐＴ７−Ｒ３（Ｓ２：約８０
μｇ）試料を得た。

【０１０４】３）ポリリボヌクレオチド（１）、（２）
および（３）への転写反応上記２）で調製したプラスミドおよび転写反応試薬キッ
ト（メガスクリプトＴ７キット：アムビオン社製）を用
いて、以下に記載する方法に従ってポリリボヌクレオチ
ド（１）、（２）および（３）を調製した。

【０１０５】プラスミドｐＴ７−Ｒ２Ｔを制限酵素Ｎａ
ｅＩで消化したもの（９．５μｇ相当、１９μｌ）に、
１０倍濃度Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ反応用緩衝液１９
μｌ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ溶液各１
９μｌ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ１９μｌ（試薬はい
ずれも上記キット中のものを使用）、滅菌水５７μｌを
加えて（合計１９０μｌ）、３７℃で保温した。この反
応液に反応停止液（キット添付）を加えた後、フェノー
ル抽出、クロロホルム抽出し、エタノール沈澱を行っ
た。

【０１０６】一方、核酸精製用カラム（キアゲン−チッ
プ１００：キアゲン社製）に６ｍｌの平衡化溶液（５０
ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１５％エタノー
ル、０．１５％トリトンＸ−１００）をカラムに流し
た後、転写反応停止後に回収された沈澱を３．２ｍｌの
５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）に溶解して、カ
ラムに流した。０．４、０．６、０．８、１．０および
１．２Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩
酸（ｐＨ７．５）、１５％エタノール溶液各１０ｍｌ
を順にカラムに流し、それぞれの塩濃度別に、溶出液を
集めた。各溶出液をブタノールで抽出し、約７ｍｌと
し、同量のイソプロパノールを加え、−２０℃で３０分
放置し、遠心後、沈澱を回収した。これらを１ｍｌの滅
菌水に溶解し、その一部を採取して、等量のＲＮＡロー
ディング緩衝液（８９ｍＭトリス−ほう酸−ＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０）、６Ｍ尿素、２０％ショ糖、０．０
２％ブロモフェノールブルー、０．０２％キシレン
シアノール）を加えてから５％変性ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（３５０Ｖ定電圧、４０分）を行ったとこ
ろ、０．８および１．０Ｍ塩化ナトリウム濃度のフラ
クションに目的物が溶出されたことを確認した。

【０１０７】同様にして、プラスミドｐＴ７−Ｒ２Ｇを
用いてポリリボヌクレオチド（２）を、ｐＴ７−Ｒ３を
用いてポリリボヌクレオチド（３）を、それぞれ調製し
た。

【０１０８】参考例１．ＨＩＶｖｉｆ配列を有する
ポリリボヌクレオチド（４）、（５）、（６）および
（７）の合成ＨＩＶＲＮＡのｖｉｆ領域の部分ヌクレオチド配列を
有するポリリボヌクレオチド（４）（Muesing,M.A., et
al. (1995) Nature 313, 450-458 記載のヌクレオチド
番号５１１４から５１３３までの２０量体）、ポリリボ
ヌクレオチド（５）（ヌクレオチド番号５１２１のC を
A に置換した以外は（４）と同じ）、ポリリボヌクレオ
チド（６）（ヌクレオチド番号５１２１のC をG に置換
した以外は（４）と同じ）およびポリリボヌクレオチド
（７）（ヌクレオチド番号５１２１のC をA に、ヌクレ
オチド番号５１２８のG をA にそれぞれ置換した以外は
（４）と同じ）を、以下に記載する方法で調製した：（４） 5'- AGUGUUACGA AACUGACAGA -3' （配列表の配
列番号１９）；（５） 5'- AGUGUUAAGA AACUGACAGA -3' （配列表の配
列番号２０）；（６） 5'- AGUGUUAGGA AACUGACAGA -3' （配列表の配
列番号２１）；（７） 5'- AGUGUUAAGA AACUAACAGA -3' （配列表の配
列番号２２）。

【０１０９】塩基部のアミノ基がアシル基で、５’−水
酸基がジメトキシトリチル基で、２’−水酸基がtert−
ブチルジメチルシリル基でそれぞれ保護された、４種の
リボヌクレオシド３’−ホスホロアミダイト（パーキン
エルマー社製）を原料として、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成
機（モデル３９２；（株）パーキンエルマージャパン社
アプライド・バイオシステムズ事業部製）で上記のヌク
レオチド配列を有するオリゴリボヌクレオチドを１μｍ
ｏｌスケールで合成した。合成終了後、オリゴヌクレオ
チドが結合したＣＰＧ（Controlled Pore Glass ）に濃
アンモニア水：エタノール（３：１（ｖ／ｖ））混液を
加えて５６℃で１５時間加温した。ＣＰＧをろ過して除
き、ろ液の溶媒を留去し、残渣に１ｍｌの１Ｍテトラ
ブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）／テトラヒ
ドロフラン（ＴＨＦ）溶液（アルドリッチ社製）を加え
溶解し、室温で１晩放置した。これに４ｍｌの０．１Ｍ
ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）を加えた後、Ｃ１８シリカゲル
カラムクロマトグラフィーを行なった（カラムサイズφ
１．５×１６ｃｍ（ウォーターズ社製）：１０−４０％
アセトニトリル、５０ｍＭトリエチルアンモニウム
・バイカーボネート水溶液の溶媒を用いた濃度勾配によ
り溶出）。約３０％濃度のアセトニトリルで溶出される
ジメトキシトリチルの発色を有するフラクションを集
め、２ｍｌの０．０１Ｎ塩酸を加え、１５分間攪拌し
た。０．１Ｎアンモニア水を加えて中和後、水層を酢
酸エチルで洗浄し、溶媒留去後滅菌水１. ５ｍｌに溶解
した。この画分中のポリリボヌクレオチドを逆相ＨＰＬ
Ｃで分取後、さらにイオン交換ＨＰＬＣで分取・精製し
た。

【０１１０】逆相ＨＰＬＣはワコーパックＷＳ−ＤＮ
Ａカラム（φ１０×２５０ｍｍ：和光純薬工業（株）
製）を用い、Ａ溶液として５％アセトニトリルを含む
０．１ＭＴＥＡＡ、ｐＨ７．０）、Ｂ溶液として２５
％アセトニトリルを含む０．１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ
７．０）を用い、カラム温度：６０℃、流速：２ｍｌ／
分、直線濃度勾配法により行なった。イオン交換ＨＰＬ
Ｃは、ＴＳＫゲルＤＥＡＥ２ＳＷ（φ４．６×２５
０ｍｍ、東ソー（株）社製）カラムを用い、Ａ溶液とし
て２０％アセトニトリル／水、Ｂ溶液として２０％
アセトニトリルを含む２Ｍ酢酸アンモニウム水溶液を
用い、カラム温度：６０℃、流速：１ｍｌ／分で直線濃
度勾配法により行なった（Ｂ％：２０→６０％（２０
分））。

【０１１１】各オリゴリボヌクレオチドについての逆相
ＨＰＬＣにおける直線濃度勾配の条件および保持時間を
表４に示す。

【０１１２】

【表４】逆相ＨＰＬＣ ────────────────────────────── ヌクレオチド直線濃度勾配（Ｂ％および時間）保持時間 ────────────────────────────── （４）１５→５５％（２０分） 19.9分（５）１０→５０％（２０分） 22.0分（６）１０→５５％（２０分） 17.7分（７）１５→５５％（２０分） 19.7分 ────────────────────────────── 各オリゴリボヌクレオチドについてのイオン交換ＨＰＬ
Ｃにおける保持時間を表５に示す。

【０１１３】

【表５】イオン交換ＨＰＬＣ ───────────────── ヌクレオチド保持時間 ───────────────── （４） 16.4 分（５） 16.7 分（６） 18.8 分（７） 18.9 分 ───────────────── このようにして得られた各オリゴリボヌクレオチドは後
述の実験に供した。

【０１１４】参考例２. 基質ポリリボヌクレオチドの
合成ＨＩＶＲＮＡの部分ヌクレオチド配列を有する基質ポ
リリボヌクレオチド（８）（Muesing, M. A., et al.
(1995) Nature 313, 450-458 記載のヌクレオチド番号
１０３から１２７までの２５量体）、基質ポリリボヌク
レオチド（９）（前出Muesing, M. A., et al.記載のヌ
クレオチド番号７３８６から７４１３までの２８量体）
および、基質ポリリボヌクレオチド（１０）（前出Mues
ing, M. A., et al.記載のヌクレオチド番号８４６７か
ら８４８５までの１９量体）を、特開平９−２２００９
４号公報に記載された方法で調製した：（８）5'- UGUGUGCCCG UCUGUUGUGU GACUC -3' （配列表
の配列番号２３）；（９）5'- CACUAUGGGC GCAGCGUCAA UGACGCUG -3'（配列
表の配列番号２４）；（１０）5'- AGCAGCAUCU CGAGACCUA -3' （配列表の配
列番号２５）。

【０１１５】実施例２．ＨＩＶｖｉｆ配列を有するポ
リリボヌクレオチド（４）、（５）、（６）または
（７）を利用したポリリボヌクレチド（１）、（２）ま
たは（３）の切断参考例１で調製したＨＩＶｖｉｆ配列を有するポリリ
ボヌクレオチド（４）、（５）、（６）または（７）
を、それぞれ１．８μＭとなるように切断反応用緩衝液
（４０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ
塩化マグネシウム、２０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ
ジチオスレイトール、０．６単位／μｌリボヌクレア
ーゼインヒビター（宝酒造（株）社製））に溶解し、６
５℃で３分間加熱後氷冷してから、３７℃で５分間保温
した。一方、ポリリボヌクレオチド（１）、（２）また
は（３）（６ｐｍｏｌ）をそれぞれ１試料あたり５μｌ
の切断反応用緩衝液に溶解し、上記ＨＩＶｖｉｆ配列
を有するポリリボヌクレオチド溶液（１試料あたり５μ
ｌ）に加え反応を開始させた。ポリリボヌクレオチド
（４）、（５）、（６）または（７）とポリリボヌクレ
オチド（１）、（２）または（３）との反応様式を以下
に示す。

【０１１６】

【化２０】

【０１１７】

【化２１】

【０１１８】

【化２２】

【０１１９】

【化２３】

【０１２０】

【化２４】

【０１２１】

【化２５】

【０１２２】

【化２６】

【０１２３】

【化２７】

【０１２４】

【化２８】

【０１２５】

【化２９】

【０１２６】

【化３０】

【０１２７】

【化３１】

【０１２８】これらの反応液を３７℃で３０分または１
時間保温した後、各３μｌの反応液を採取し、５０ｍＭ
ＥＤＴＡ溶液（３μｌ）に加え反応を停止させた。得
られた各試料を、等量のＲＮＡローディング緩衝液を加
えてから、７Ｍ尿素を含む５％ポリアクリルアミドゲ
ルで電気泳動（４００Ｖ、５０分）することにより、
反応生成物と未反応物を分離した。電気泳動後のゲル
を、ステンレス製のバットに移し、核酸用染色剤（ＳＹ
ＢＲＧＲＥＥＮＩＩ：モレキュラープローブ社
製）を用いて染色した。ゲルに３６６ｎｍの紫外線を照
射することによりポリリボヌクレオチドのバンドを可視
化し、ポラロイドフィルムで撮影した。その結果を図３
および４に示した。図３のレーン１は反応前のポリリボ
ヌクレオチド（１）を、図３のレーン６は反応前のポリ
リボヌクレオチド（２）を、図４のレーン１は、反応前
のポリリボヌクレオチド（３）を、図３および４のＭは
分子量マーカー（ＲＮＡ分子量マーカーＩＩＩ：ベーリ
ンガーマンハイム社製）を泳動した。ポリリボヌクレオ
チド（１）とＨＩＶｖｉｆ配列を有するポリリボヌク
レオチド（４）、（５）または（６）との反応（図３の
レーン２、３および４）では、切断反応生成物のバンド
が観察された。また、ポリリボヌクレオチド（２）とＨ
ＩＶｖｉｆ配列を有するポリリボヌクレオチド
（４）、（５）または（６）との反応（図３のレーン
７、８および９）でも、切断反応生成物のバンドが観察
された。しかしながら、ポリリボヌクレオチド（１）ま
たは（２）とＨＩＶｖｉｆ配列を有するポリリボヌクレ
オチド（７）との反応（図３のレーン５、１０）では、
切断反応生成物のバンドは検出されなかった。ポリリボ
ヌクレオチド（３）とＨＩＶｖｉｆ配列を有するポリ
リボヌクレオチド（４）、（５）または（７）との反応
（図４のレーン２、３および５）では、切断反応生成物
のバンドが観察されたが、ポリリボヌクレオチド（３）
とＨＩＶｖｉｆ配列を有するポリリボヌクレオチド
（６）の反応（図４のレーン４）では、切断反応生成物
のバンドはほとんど観察されなかった。この写真をデン
シトグラフ（ＡＥ−６９００Ｍ型：アトー社製）を用い
て画像処理し、非切断ポリリボヌクレオチドと２つの切
断生成物のバンドを数値として表し、その値から切断反
応生成物の割合を求めた結果を表６に示した。

【０１２９】

【表６】 ─────────────────────────────────── ポリリボヌクレオチド（１）（２）（３） ─────────────────────────────────── （４）＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋（＋＋＋＋）（＋＋）（５）＋＋＋＋＋＋＋＋（６）＋＋＋＋ ± （７） − − ＋＋＋ ─────────────────────────────────── （括弧内は反応時間３０分での値。「＋＋＋＋」：７０％以上の切断、「＋＋＋」：５０−７０％の切断、「＋＋」：３０−５０％の切断、「＋」：０−３０％の切断、「±」：トレース量の切断、「−」：切断反応生成物が検出されない。）実施例３．ポリリボヌクレチド（２）由来の切断反応生
成物による基質ポリリボヌクレオチド（８）の切断参考例１で調製したＨＩＶｖｉｆ配列を有するポリリ
ボヌクレオチド（４）を１．８μＭになるように切断反
応用緩衝液（４０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、
２５ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭ塩化ナトリウ
ム、１ｍＭジチオスレイトール、０．６単位／μｌ
リボヌクレアーゼインヒビター（宝酒造（株）社製）に
溶解し、６５℃で３分間加熱後氷冷した後、３７℃で５
分間保温した。一方、ポリリボヌクレオチド（２）（１
８ｐｍｏｌ）を１５μｌの切断反応用緩衝液に溶解し、
上記オリゴリボヌクレオチド（４）溶液（１５μｌ）に
加え反応を開始させた。その反応様式を以下に示す。

【０１３０】

【化３２】

【０１３１】この反応液を３７℃で１時間保温した。こ
の反応液１６．６７μｌに２０ｍＭジチオスレイトール
１２μｌ、１０８単位／μｌリボヌクレアーゼ
インヒビター（宝酒造（株）社製）２μｌ、ヘアピン型
リボザイム反応用２倍緩衝液（８０ｍＭトリス−塩酸
（ｐＨ７．５）、２４ｍＭ塩化マグネシウム、８ｍＭ
スペルミジン３塩酸塩）１０８．３３μｌ、滅菌水１
１１μｌを加えた。一方、基質ポリリボヌクレオチド
（８）（３０ｐｍｏｌ）を２５０μｌのヘアピン型リボ
ザイム反応用緩衝液（４０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
７．５）、１２ｍＭ塩化マグネシウム、４ｍＭスペ
ルミジン３塩酸塩）に溶解した。両溶液を、６５℃で３
分間加熱後氷冷した後、３７℃で５分間保温してから、
両者を混合し、反応を開始させた。その反応様式を以下
に示す。

【０１３２】

【化３３】

【０１３３】１５、３０および６０分後に５０ｍＭＥ
ＤＴＡ８０μｌ中に反応液１６０μｌづつを加え、反
応を停止させた。各試料をエーテルで２回洗浄し、以下
に記載する条件で逆相ＨＰＬＣで分析した：カラム：ワコーパックＷＳ−ＤＮＡカラム（φ４．６×１５０ｍｍ）；溶媒：Ａ溶液０．１ＭＴＥＡＡ、ｐＨ７．０）；Ｂ溶液２５％アセトニトリルを含む０．１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）；カラム温度：６０℃；流速：１ｍｌ／分；直線濃度勾配：Ｂ％５→４０％（２０分）。

【０１３４】得られた溶出ピーク分布を、特開平９−２
２００９４において分析された同じ基質ポリリボヌクレ
オチドの切断反応液のものと比較した結果、基質が目的
の位置で切断されたことが確かめられた。また、基質ポ
リリボヌクレオチド（８）のピーク面積および切断反応
生成物のピーク面積より切断率を求め、基質の半減期を
算出した結果、半減期は７２分であった。

【０１３５】実施例４．ポリリボヌクレオチド（１
１）、（１２）、（１３）および（１４）の調製ＨＩＶ−１ＲＮＡのヌクレオチド配列を有する基質ポ
リリボヌクレオチドを切断する３種類のリボザイム配列
を有し、かつＨＩＶＲＮＡの特定のヌクレオチド配列
を有するＲＮＡにより、トリミング反応を生じるポリリ
ボヌクレオチド（１１）（配列表の配列番号２６）、同
（１２）（配列表の配列番号２７）、同（１３）（配列
表の配列番号２８）および同（１４）（配列表の配列番
号２９）をＤＮＡからの転写反応によって得るため、鋳
型ＤＮＡ４（配列表の配列番号４）、鋳型ＤＮＡ５（配
列表の配列番号５）、鋳型ＤＮＡ６（配列表の配列番号
６）および鋳型ＤＮＡ７（配列表の配列番号７）を調製
し、それぞれの鋳型ＤＮＡを保持するプラスミドベクタ
ーｐＴ７−Ｒ４、ｐＴ７−Ｒ５、ｐＴ７−Ｒ６およびｐ
Ｔ７−Ｒ７を調製した。

【０１３６】１）オリゴデオキシリボヌクレオチドの合
成まず、以下に記載するオリゴデオキシリボヌクレオチ
ド： 5'- CTACCAGGTA ATATACCACC CGAAGGTG -3'（Ｌ１：配列
表の配列番号３０）； 5'- TGTTTCTCTG GTTGCCTTCT TGTTGTGCGT ACCAGTGTTA CT
C -3'（Ｌ２：配列表の配列番号３１）； 5'- ATCAGGTAGC GCTTTCGCGC TACGACTGAC AGAAGTACCG CA
GCG -3'（Ｌ３：配列表の配列番号３２）； 5'- TTTCGTCAGA TTAAAAGTCT GACTCATCAG AATGACGCGT AC
CAGTGTTA CTC -3'（Ｌ４：配列表の配列番号３３）； 5'- ATCAGGTAGC GCTTTCGCGC TACGACTGAC AGAAGTACCG CA
GCATC -3'（Ｌ５：配列表の配列番号３４）； 5'- TTTCGTCAGA TTAAAAGTCT GACTCATCAG GAGACCTCTG CA
-3'（Ｌ６：配列表の配列番号３５）； 5'- CTACCAGGTA ATATACCTCA GATTAAAAGT CTGAG -3'（Ｌ
７：配列表の配列番号３６）； 5'- CGTCTGTTTC GCCGCCGAAG CGGCTCATCA GGTGTGACGT AC
CAGTGTTA CTC -3'（Ｌ８：配列表の配列番号３７）； 5'- CGTCTGTTTC GTCAGATTAA AAGTCTGACT CATCAGGTGT GA
CGTACCAG TGTTACTC -3'（Ｌ９：配列表の配列番号３
８）； 5'- GCGTCATTCT GATGAGTCAG ACTTTTAATC TGACGAAACG CT
GCGGTAC -3'（ＡＣ７８６７：配列表の配列番号３
９）； 5'- GAGGTCTCCT GATGAGTCAG ACTTTTAATC TGACGAAAGA TG
CTGCGGTA C -3'（ＡＣ８４７８：配列表の配列番号４
０）； 5'- GCACAACAAG AAGGCAACCA GAGAAACACA CCTTCGGGTG GT
ATATTACC TGGTAGGTAC -3' （ＨＲ１１２：配列表の配
列番号４１）； 5'- GTCACACCTG ATGAGCCGCT TCGGCGGCGA AACAGACGGT AC
-3'（ＲＺ１１９：配列表の配列番号４２）； 5'- GTCACACCTG ATGAGTCAGA CTTTTAATCT GACGAAACAG AC
GGTAC -3'（ＡＣ１１９：配列表の配列番号４３）を合成した。

【０１３７】上記の各オリゴデオキシリボヌクレオチド
は、デオキシヌクレオシド３’−ホスホロアミダイト
（（株）パーキンエルマージャパン・アプライドバイオ
システムズ事業部より購入）を原料として、ＤＮＡ自動
合成機（モデル３９２；（株）パーキンエルマージャパ
ン・アプライドバイオシステムズ事業部製）で、１μｍ
ｏｌスケールで合成した。

【０１３８】合成終了後、濃アンモニア水でＣＰＧ（Co
ntrolled Pore Glass ）よりオリゴデオキシリボヌクレ
オチドを切り出し、６０℃で５時間加温した。溶媒を留
去し、脱イオン水に溶解した後、逆相ＨＰＬＣで精製し
たのち、ＯＰＣカラム（（株）パーキンエルマージャパ
ン・アプライドバイオシステムズ事業部製）を用いて、
ジメトキシトリチル基を脱保護し、溶媒を留去後、滅菌
水１ｍｌに溶解した。この画分中のポリリボヌクレオチ
ドを逆相ＨＰＬＣで分取し、精製した。

【０１３９】ジメトキシトリチル基が５’末端に結合し
たオリゴデオキシリボヌクレオチドの逆相ＨＰＬＣの条
件は以下の通りであった：カラム：（ａ）イナートシルプレップＯＤＳカラム（φ１０×２５０ｍｍ：ジーエルサイエンス社製）、または（ｂ）ワコーパックＷＳ−ＤＮＡカラム（ φ１０×２５０ｍｍ：和光純薬工業（株）製）；溶媒：Ａ溶液５％アセトニトリル／０．１ＭＴＥＡＡｐＨ７．０）；Ｂ溶液アセトニトリル；流速：２ｍｌ／分；カラム温度：６０℃；直線濃度勾配の全時間：２０分。

【０１４０】ジメトキシトリチル基が５’末端に結合し
たオリゴデオキシリボヌクレオチドについての逆相ＨＰ
ＬＣにおけるカラム、Ｂ％および保持時間を表７に示
す。

【０１４１】

【表７】逆相ＨＰＬＣ ──────────────────────────── ヌクレオチドカラムＢ％保持時間 ──────────────────────────── Ｌ１（ａ）１０→６０％ 17.9分Ｌ２（ａ）１０→６０％ 17.3分Ｌ３（ａ）１０→６０％ 16.6分Ｌ４（ａ）１０→６０％ 17.2分Ｌ５（ｂ）１０→６０％ 16.5分Ｌ６（ａ）１０→６０％ 17.8分Ｌ７（ａ）１０→６０％ 17.1分Ｌ８（ａ）１０→６０％ 15.7分Ｌ９（ａ）１０→６０％ 13.9分ＡＣ７８６７（ａ）１０→６０％ 14.7分ＡＣ８４７８（ａ）１０→５０％ 14.9分ＨＲ１１２（ａ）１０→５０％ 15.1分ＲＺ１１９（ａ）１０→５０％ 16.5分ＡＣ１１９（ａ）１０→５０％ 16.6分 ──────────────────────────── ジメトキシトリチル基を脱保護後のオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドの逆相ＨＰＬＣの条件は以下の通りであっ
た：カラム：（ａ）イナートシルプレップＯＤＳカラム（φ１０×２５０ｍｍ：ジーエルサイエンス社製）、または（ｂ）ワコーパックＷＳ−ＤＮＡカラム（ φ１０×２５０ｍｍ：和光純薬工業（株）製）；溶媒：Ａ溶液５％アセトニトリル／０．１ＭＴＥＡＡｐＨ７．０）；Ｂ溶液２５％アセトニトリル／０．１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）；流速：２ｍｌ／分；カラム温度：６０℃；直線濃度勾配の全時間：２０分。

【０１４２】脱保護後のオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドについての逆相ＨＰＬＣにおけるカラム、Ｂ％および
保持時間を表８に示す。

【０１４３】

【表８】逆相ＨＰＬＣ ─────────────────────────── ヌクレオチドカラムＢ％保持時間 ─────────────────────────── Ｌ１（ｂ）２０→６０％ 14.9 分Ｌ２（ｂ）２０→６０％ 17.5 分Ｌ３（ｂ）２０→６０％ 17.0 分Ｌ４（ｂ）２０→６０％ 18.2 分Ｌ５（ｂ）２０→６０％ 17.2 分Ｌ６（ｂ）２０→６０％ 18.0 分Ｌ７（ｂ）２０→６０％ 18.4 分Ｌ８（ｂ）２０→６０％ 18.7 分Ｌ９（ｂ）２０→６０％ 19.2 分ＡＣ７８６７（ｂ）２０→６０％ 18.9 分ＡＣ８４７８（ａ）１０→５０％ 20.9 分ＨＲ１１２（ａ）２０→６０％ 17.9 分ＲＺ１１９（ａ）２０→６０％ 17.4 分ＡＣ１１９（ａ）２０→６０％ 19.9 分 ─────────────────────────── ２）プラスミドｐＴ７−Ｒ４、ｐＴ７−Ｒ５、ｐＴ７−
Ｒ６およびｐＴ７−Ｒ７の構築以下に記載する方法に従って、上記１）または実施例１
の１）で合成したオリゴデオキシリボヌクレオチドから
鋳型ＤＮＡ４、５、６および７を調製し、これらをプラ
スミドｐＴ７−Ｒ１に導入することにより、プラスミド
ｐＴ７−Ｒ４、ｐＴ７−Ｒ５、ｐＴ７−Ｒ６およびｐＴ
７−Ｒ７を構築した（図５、６および７）。

【０１４４】鋳型ＤＮＡ４（配列表の配列番号４）を構
築するため、まず実施例１の１）で調製したオリゴデオ
キシリボヌクレオチドＳ１Ｇの５’末端をリン酸化し
た。Ｓ１Ｇ（０．５ｎｍｏｌ）に、４μｌの５倍濃度キ
ナーゼ反応用緩衝液（２５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
７．６）、５０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ２
−メルカプトエタノール）、１５μｌの１ｍＭＡＴＰ
および１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１単
位；宝酒造（株）社製）を混合し、溶液を３７℃で１時
間保温することにより、５’末端をリン酸化した。以
後、例えばリン酸化されたＳ１Ｇを「ｐＳ１Ｇ」と表記
する。同様にしてＡＣ７８６７、ＨＲ１１２、Ｌ２、Ｌ
３、Ｌ４およびＬ６の５’末端をリン酸化することによ
り、ｐＡＣ７８６７、ｐＨＲ１１２、ｐＬ２、ｐＬ３、
ｐＬ４およびｐＬ６を調製した。

【０１４５】ＡＣ８４７８、ｐＳ１Ｇ、Ｌ５およびｐＬ
６の混合物を「ブロック１」、ＨＲ１１２、ｐＳ１Ｇ、
Ｌ１、ｐＬ２およびｐＬ３の混合物を「ブロック２」と
し、それぞれのブロック（オリゴデオキシリボヌクレオ
チド各０．５ｎｍｏｌ）に５倍濃度リガーゼ反応用緩衝
液（３３０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、３３ｍ
Ｍ塩化マグネシウム）４０μｌ、２．５ｍＭＡＴＰ
溶液４８μｌ、滅菌水を加えて全量を１８８μｌとし、
７０℃で１０分間加温した後室温まで徐冷した。このも
のに、０．２Ｍ２−メルカプトエタノール１０μ
ｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３５０単位／μｌ：宝酒造
（株）社製）２μｌを加え１５℃で一晩保温した。この
反応液にエタノール沈澱操作を行なって沈澱を回収し、
４．５％低融点アガロースゲル電気泳動により分画した
（ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧアガロース（エフエムシー
バイオプロダクツ社製）を使用、７５Ｖ定電圧、３．
５時間）。電気泳動終了後、ゲルを臭化エチジウムで染
色し、トランスイルミネーター（３６６ｎｍ）上で各反
応生成物（ブロック１：８５ｂｐ、ブロック２：１０５
ｂｐ）のバンドに相当する部分を切り出した。次いで、
文献［Molecular Cloning: A Laboratory Manual (seco
nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory（1989)
6.30-6.31 参照］記載の方法に従い、ゲル片より目的の
ＤＮＡ断片を回収した。その後抽出液についてエタノー
ル沈澱操作を行なって、沈澱した反応生成物を回収し
た。

【０１４６】一方、ｐＡＣ７８６７とｐＬ４のリン酸化
反応液を混合し、滅菌水６０μｌを加えて全量１００μ
ｌとし、７０℃で５分間加温した後、室温まで徐冷した
ものを「ブロック３」とした。

【０１４７】ブロック１およびブロック２の各反応生成
物ならびにブロック３（各１２０pｍｏｌ）に、５倍濃
度リガーゼ反応用緩衝液（３３０ｍＭトリス−塩酸
（ｐＨ７．６）、３３ｍＭ塩化マグネシウム）４０μ
ｌ、２．５ｍＭＡＴＰ溶液４８μｌ、０．２Ｍ２−
メルカプトエタノール１０μｌを加え、さらに滅菌水
を加えて全量を１９８μｌとし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（３５０単位／μｌ；宝酒造（株）社製）２μｌを加
え、１５℃で一晩保温した。この反応液にエタノール沈
澱操作を行なって沈澱を回収し、３％低融点アガロース
ゲル電気泳動により分画した（６０Ｖ定電圧、４時
間）。電気泳動終了後、ゲルを臭化エチジウムで染色
し、トランスイルミネーター（３６６ｎｍ）上で反応生
成物（２６１ｂｐ）のバンドに相当する部分を切り出
し、目的のＤＮＡ断片を回収した。さらにエタノール沈
澱操作を行って沈澱を回収し、このものを鋳型ＤＮＡ４
とした。

【０１４８】実施例１の２）で調製したプラスミドｐＴ
７−Ｒ１７．５２μｇを制限酵素ＫｐｎＩで消化した
後、エタノール沈澱操作を行なってＤＮＡを回収した。
このＤＮＡをさらに制限酵素ＰｓｔＩで消化し、エタノ
ール沈澱操作を行なって回収したＤＮＡを２５．６μｌ
の滅菌水に溶解した。

【０１４９】このようにして得られたｐＴ７−Ｒ１／Ｋ
ｐｎＩ−ＰｓｔＩ消化物０．５ｐｍｏｌ（３．２μ
ｌ）に、５倍濃度リガーゼ反応用緩衝液（３３０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７．６）、３３ｍＭ塩化マグネシ
ウム）４μｌ、鋳型ＤＮＡ４（６ｐｍｏｌ）６μｌ、
２．５ｍＭＡＴＰ４．８μｌ、０．２Ｍ２−メル
カプトエタノール１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３５
０単位／μｌ；宝酒造（株）社製）１μｌを加え、２０
℃で３時間保温した。この反応液にエタノール沈澱操作
を行なってｐＴ７−Ｒ４を含む沈澱を回収し、ＴＥ緩衝
液２０μｌに溶解した。この溶液１０μｌ（約０．５μ
ｇ相当）を大腸菌ＮＭ５２２株のコンピテント細胞（１
００μｌ）に混合後、０℃で１０分間冷却し、４２℃で
１分間加温した後、室温まで戻した。この大腸菌に１ｍ
ｌのＬＢ培地（日本製薬（株）製）を加え、１時間培養
した。遠心し、大腸菌を回収して、２０μｇ／ｍｌア
ンピシリンを含むＬＢ寒天培地（日本製薬（株）製）上
で３７℃で１晩培養し、成育したコロニーの中から２コ
ロニーを選択し、それぞれを２０μｇ／ｍｌアンピシ
リンを含むＬＢ寒天培地（日本製薬（株）製）のシャ−
レの１／４区画に１つのコロニーを植え、３７℃で一晩
培養した。そのうちの半分（シャ−レの１／８区画分）
の菌体をかきとり、これらの大腸菌をプレートからエッ
ペンドルフチューブに回収し、少量のプラスミドを回収
した［Molecular Cloning: A LaboratoryManual (secon
d edition), Cold Spring Harbor Laboratory（1989)
1.29-1.30参照］。

【０１５０】得られたプラスミドを滅菌水２５μｌに
溶解し、制限酵素ＫｐｎＩで消化し、さらに制限酵素Ｐ
ｓｔＩで消化してから、１０ｍｇ／ｍｌリボヌクレア
ーゼＡ０．２μｌを加え、３７℃で３０分間保温し
た。この反応液についてフェノール抽出およびクロロホ
ルム抽出を行い、さらにエタノ−ル沈澱を行ってＤＮＡ
を回収した。得られたＤＮＡを４μｌの滅菌水に溶解
し、４μｌのＤＮＡローディング溶液を加え、５％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（１５０Ｖ、１．５時間）
を行い、臭化エチジウムで染色してバンドを確認した。
２個のコロニーともに鋳型ＤＮＡ４を含むプラスミドを
保持していることを確認した。そのうちの１つのコロニ
ーを選択して、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ
Ｂ培地２５０ｍｌに接種し、３７℃で一晩培養した。
培養液を遠心分離して菌体を回収し、プラスミド精製キ
ット（フレキシプレップ：ファルマシア社製）を用い
て、プラスミドを精製した。得られたプラスミド（約１
０００μｇ）を１０００μｌの滅菌水に溶解したものを
プラスミドｐＴ７−Ｒ４試料とした。

【０１５１】このプラスミドについて、目的のヌクレオ
チド配列をもつ遺伝子が挿入されていることを確認する
目的で、市販のプライマーオリゴヌクレオチド（Ｔ７プ
ライマーおよび−２１Ｍ１３プライマー：（株）パーキ
ンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ事業
部製）をプライマーとして用い、ＤＮＡシークエンサー
（CATALYST800 および310 Genetic Analyzer；（株）パ
ーキンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ
事業部製）でヌクレオチド配列を解析した。その結果、
ｐＴ７−Ｒ４は目的のヌクレオチド配列を有する鋳型Ｄ
ＮＡ４を保持していることを確認した。

【０１５２】上記の一連の操作において、ＨＲ１１２お
よびＬ１の代わりにＨＲ１１２ＡＣおよびＬ７を用いる
ことにより鋳型ＤＮＡ５を調製し、プラスミドｐＴ７−
Ｒ５を構築した。また同様に、ＨＲ１１２、Ｌ１および
Ｌ２の代わりにＲＺ１１９およびＬ８を用いて鋳型ＤＮ
Ａ６を調製し、プラスミドｐＴ７−Ｒ６を構築した。さ
らにＨＲ１１２、Ｌ１およびＬ２の代わりにＡＣ１１９
およびＬ９を用いて、鋳型ＤＮＡ７を調製し、プラスミ
ドｐＴ７−Ｒ７を構築した。

【０１５３】３）プラスミドからポリリボヌクレオチド
への転写反応上記２）で調製したプラスミドｐＴ７−Ｒ４および転写
反応試薬キット（メガスクリプトＴ７キット：アムビ
オン社製）を用いて、以下に記載する方法に従って目的
のポリリボヌクレオチド（１１）を得た。

【０１５４】プラスミドｐＴ７−Ｒ４を制限酵素Ｎａｅ
Ｉで消化したもの（９μｇ相当、３６μｌ）に、１０倍
濃度Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ反応用緩衝液１９μｌ、
ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ溶液各１９μ
ｌ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ１９μｌ（試薬はいずれも
キットのものを使用）、滅菌水４０μｌを加えて合計１
９０μｌとし、これを３７℃で保温した。この反応液に
反応停止液（キットに添付）を加えた後、フェノール抽
出、クロロホルム抽出し、エタノール沈澱を行った。

【０１５５】一方、核酸精製用カラム（キアゲン−チッ
プ１００：キアゲン社製）に６ｍｌの平衡化溶液（５０
ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１５％エタノー
ル、０．１５％トリトンＸ−１００）をカラムに流し
た後、転写反応停止後に回収された沈澱を３．２ｍｌの
５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）に溶解して、カ
ラムに流した。０．４、０．６、０．８、１．０および
１．２Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩
酸（ｐＨ７．５）、１５％エタノール溶液各１０ｍｌ
を順にカラムに流し、それぞれの塩濃度別に、溶出液を
集めた。溶出液をブタノールで抽出し、約７ｍｌとして
から、同量のイソプロパノールを加え、−２０℃で３０
分放置した後、遠心して沈澱を回収した。この沈澱を１
ｍｌの滅菌水に溶解し、その一部を採取して、等量のＲ
ＮＡローディング緩衝液を加えてから５％変性ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（４５０Ｖ定電圧、６０分）を
行ったところ、０．８および１．０Ｍ塩化ナトリウム
濃度のフラクションに目的のポリリボヌクレオチドが溶
出されたことを確認した。

【０１５６】上記の一連の操作において、プラスミドｐ
Ｔ７−Ｒ４の代わりにプラスミドｐＴ７−Ｒ５、同ｐＴ
７−Ｒ６または同ｐＴ７−Ｒ７を使用することによリ、
ポリリボヌクレオチド（１２）、（１３）または（１
４）を調製する。

【０１５７】参考例３．ポリリボヌクレオチド（１
５）の調製ＨＩＶ−１ＲＮＡのヌクレオチド配列を有する基質ポ
リリボヌクレオチドを切断する３種のリボザイム配列が
連結されているが、ＨＩＶＲＮＡの特定のヌクレオチ
ド配列を有するＲＮＡの存在下で切り分けられないポリ
リボヌクレオチド（１５）（配列表の配列番号４４）を
ＤＮＡからの転写反応によって得るため、鋳型ＤＮＡ８
（配列表の配列番号４５）を調製した。

【０１５８】まず、実施例２の１）のオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドの他に、以下に記載するオリゴデオキシ
リボヌクレオチド： 5'- ATCAGGTAGC GCTTTCGCGC TACGTCTGAC AGAAGTACCG CA
GCG -3'（Ｌ１０：配列表の配列番号４６）； 5'- ATCAGGTAGC GCTTTCGCGC TACGTCTGAC AGAAGTACCG CA
GCATC -3'（Ｌ１１：配列表の配列番号４７）； 5'- TTCTGTCAGA CGTAGCGCGA AAGCGCTACC TGATGAGTAA CA
CTGGTAC -3'（Ｓ１ＧＭ：配列表の配列番号４８）を実施例２の１）と同様に合成した。ジメトキシトリチ
ル基が５’末端に結合したオリゴデオキシリボヌクレオ
チドの逆相ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった：カラム：ワコーパックＷＳ−ＤＮＡカラム（φ１０×２５０ｍｍ）；溶媒：Ａ溶液５％アセトニトリル／０．１ＭＴＥＡＡｐＨ７．０）；Ｂ溶液アセトニトリル；流速：２ｍｌ／分；カラム温度：６０℃；Ｂ％：１０→６０％直線濃度勾配の全時間：２０分。

【０１５９】ジメトキシトリチル基が５’末端に結合し
たオリゴデオキシリボヌクレオチドについての逆相ＨＰ
ＬＣにおける保持時間を表９に示す。

【０１６０】

【表９】逆相ＨＰＬＣ ────────────── ヌクレオチド保持時間 ────────────── Ｌ１０ 16.7 分Ｌ１１ 16.5 分Ｓ１ＧＭ 17.5 分 ────────────── ジメトキシトリチル基を脱保護後のオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドの逆相ＨＰＬＣの条件は以下の通りであっ
た：カラム：ワコーパックＷＳ−ＤＮＡカラム（φ１０×２５０ｍｍ：和光純薬工業（株）製）；溶媒：Ａ溶液５％アセトニトリル／０．１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）；Ｂ溶液２５％アセトニトリル／０．１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）；流速：２ｍｌ／分；カラム温度：６０℃；Ｂ％：１０→６０％；直線濃度勾配の全時間：２０分。

【０１６１】脱保護後のオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドについての逆相ＨＰＬＣにおける保持時間を表１０に
示す。

【０１６２】

【表１０】逆相ＨＰＬＣ ────────────── ヌクレオチド保持時間 ────────────── Ｌ１０ 19.0分Ｌ１１ 19.2分Ｓ１ＧＭ 18.7分 ────────────── Ｌ１０については、さらに以下の条件でイオン交換ＨＰ
ＬＣに供した：カラム：ＴＳＫゲルＤＥＡＥ２ＳＷ φ４．６×２５０ｍｍ（東ソー（株）社製）；溶媒：Ａ溶液２０％アセトニトリル／水；Ｂ溶液２０％アセトニトリルを含む２Ｍ酢酸アンモニウム水溶液；流速：１ｍｌ／分；Ｂ％：２０→６０％；直線濃度勾配の全時間：２０分；カラム温度：６０℃。

【０１６３】その保持時間は１７．０分であった。

【０１６４】次いで、図６に示したように、オリゴデオ
キシリボヌクレオチドから鋳型ＤＮＡ８を調製し、プラ
スミドｐＴ７−Ｒ８を得た。さらに、実施例４の３）と
同様にして、プラスミドｐＴ７−Ｒ８を用いてポリリボ
ヌクレオチド（１５）を調製した。

【０１６５】実施例５．ＨＩＶｖｉｆ配列を有する
ポリリボヌクレオチド（４）を用いたポリリボヌクレチ
ド（１１）または（１５）の切断参考例１で調製したＨＩＶｖｉｆ配列を有するポリリ
ボヌクレオチド（４）を、６μＭとなるように切断反応
用緩衝液（４０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、２
５ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭ塩化ナトリウ
ム）に溶解し、７０℃で３分間加熱後氷冷した後、３７
℃で５分間保温した。一方、ポリリボヌクレオチド（１
１）または（１５）（各１０ｐｍｏｌ）をそれぞれ５μ
ｌの切断反応用緩衝液に溶解し、上記ポリリボヌクレオ
チド（４）溶液（１試料あたり５μｌ）に加え反応を開
始させた。それぞれの反応様式を以下に示す。

【０１６６】

【化３４】

【０１６７】

【化３５】

【０１６８】この反応液を３７℃で１５分または３０分
保温した後、４．５μｌの反応液を採取して、５０ｍＭ
ＥＤＴＡ溶液（４μｌ）に加え、反応を停止させた。
得られた各試料を、等量のＲＮＡローディング緩衝液を
加えてから、７Ｍ尿素を含む５％ポリアクリルアミド
ゲルで電気泳動（４００Ｖ、４０分）することにより、
反応生成物と未反応物を分離した。電気泳動後のゲル
を、ステンレス製のバットに移し、核酸用染色剤（ＳＹ
ＢＲＧＲＥＥＮＩＩ：モレキュラープローブ社
製）を用いて染色した。ゲルに３６６ｎｍの紫外線を照
射することによりポリリボヌクレオチドのバンドを可視
化し、ポラロイドフィルムで撮影した（図８）。図８の
レーン１は反応前のポリリボヌクレオチド（１１）を、
レーン４は反応前のポリリボヌクレオチド（１５）を、
Ｍは分子量マーカー（ＲＮＡ分子量マーカーＩＩＩ：ベ
ーリンガーマンハイム製）を表す。ポリリボヌクレオチ
ド（１１）とＨＩＶｖｉｆ配列を有するポリリボヌク
レオチド（４）との１５分または３０分間の反応（図６
のレーン２、３）では切断反応生成物のバンドが観察さ
れた。しかしながら、ポリリボヌクレオチド（１５）と
ＨＩＶｖｉｆ配列を有するポリリボヌクレオチド
（４）（図６のレーン５、６）では切断反応生成物のバ
ンドが検出されなかった。

【０１６９】実施例６．ポリリボヌクレチド（１１）
由来の切断反応生成物による基質ポリリボヌクレオチド
（８）、（９）および（１０）の切断参考例１で調製したＨＩＶｖｉｆ配列を有するポリリ
ボヌクレオチド（４）を、６μＭとなるように切断反応
用緩衝液に溶解し、７０℃で３分間加熱後、氷冷してか
ら、３７℃で５分間保温した。一方、ポリリボヌクレオ
チド（１１）（２０ｐｍｏｌ）を１０μｌの切断反応用
緩衝液に溶解し、上記ポリリボヌクレオチド（４）溶液
（１０μｌ）に加え反応を開始させた。その反応様式を
以下に示す。

【０１７０】

【化３６】

【０１７１】この反応液を３７℃で１５分間保温した。
反応液２０μｌにヘアピン型リボザイム反応用２倍濃度
緩衝液（８０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、２４
ｍＭ塩化マグネシウム、８ｍＭスペルミジン３塩酸
塩）４０μｌ、滅菌水４０μｌを加え、リボザイム溶液
とした。一方、基質ポリリボヌクレオチド（８）、
（９）または（１０）（各２０ｐｍｏｌ）を１００μｌ
のヘアピン型リボザイム反応用緩衝液（４０ｍＭトリ
ス−塩酸（ｐＨ７．５）、１２ｍＭ塩化マグネシウ
ム、４ｍＭスペルミジン３塩酸塩）に溶解したものを
基質溶液とした。リボザイム溶液および基質溶液を、そ
れぞれ６５℃で３分間加熱後、氷冷してから、３７℃で
５分間保温した。この両溶液を混合することにより、反
応を開始させた。各反応様式を以下に示す。

【０１７２】

【化３７】

【０１７３】

【化３８】

【０１７４】

【化３９】

【０１７５】反応開始６０分後に、それぞれの試料につ
いて以下に記載する方法で反応を停止させた：（８）：反応液２００μｌを採取し、５００ｍＭＥＤ
ＴＡ１０μｌ中に加えた；（９）および（１０）：反応液４０μｌを採取し、５０
ｍＭＥＤＴＡ３０μｌ中に加えた。

【０１７６】これらの試料をエーテルで２回洗浄してか
ら、以下に記載する条件で逆相ＨＰＬＣによる分析を行
なった：カラム：ワコーパックＷＳ−ＤＮＡカラム（φ４．６×１５０ｍｍ：和光純薬工業（株）製）；溶媒：Ａ溶液０．１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）；Ｂ溶液２５％アセトニトリルを含む０．１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）；流速：１ｍｌ／分；溶出条件：直線濃度勾配（Ｂ％：０→４０％（２０分））；カラム温度：６０℃。

【０１７７】それぞれの試料の溶出ピーク分布を、特開
平９−２２００９４において分析された同じ基質ポリリ
ボヌクレオチドの切断反応液のものと比較した結果、い
ずれの試料においても基質が目的の位置で切断されたこ
とが確かめられた。また、各基質ポリリボヌクレオチド
のピーク面積および切断反応生成物のピーク面積より切
断率を算出した結果、その切断率はそれぞれ９８％（ポ
リリボヌクレオチド（８））、１４％（ポリリボヌクレ
オチド（９））および６０％（ポリリボヌクレオチド
（１０））であった。

【０１７８】実施例７．実施例５および６記載の方法に
おいて、ポリリボヌクレオチド（１１）の代わりにポリ
リボヌクレオチド（１２）、（１３）または（１４）を
用いることにより、これらがいずれもポリリボヌクレオ
チド（４）の存在下で切断され、さらにその切断反応生
成物が基質ポリリボヌクレオチド（８）、（９）および
（１０）を切断する活性を有することが確認される。

【０１７９】

【発明の効果】上記のごとく、本発明のポリリボヌク
レオチドは、特定のヌクレオチド配列を有するポリリボ
ヌクレオチドの存在下で、リボザイムやアンチセンスＲ
ＮＡ分子などの有用な多種類の分子が一本鎖上から複数
の分子に分断されること、および該切断後の断片が別の
特定のポリリボヌクレオチドの機能を阻害できることが
確認された。本発明のポリリボヌクレオチドや、それを
コードするＤＮＡを好適なベクタ−に組込んだものを生
体内に投与することにより、生体に悪影響をもたらす天
然のポリリボヌクレオチドまたはＲＮＡの機能を特異的
かつ効率的に阻害することが可能である。本発明の医薬
組成物は、エイズ、腫瘍、炎症等の疾患に対して、従来
型のリボザイムよりも高い治療および／または予防効果
が期待される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のポリリボヌクレオチドの標的細胞内
での挙動を示した模式図。

【図２】ポリリボヌクレオチド（１）をコードするＤ
ＮＡをもつプラスミドｐＴ７−Ｒ２Ｔの構築図。

【図３】ポリリボヌクレオチド（１）または（２）
の、ポリリボヌクレオチド（４）、（５）、（６）また
は（７）存在下における切断反応のゲル電気泳動による
分析。

【図４】ポリリボヌクレオチド（３）の、ポリリボヌ
クレオチド（４）、（５）、（６）または（７）存在下
における切断反応のゲル電気泳動による分析。

【図５】鋳型ＤＮＡ４の構築図。

【図６】鋳型ＤＮＡ５、６、７及び８の構築図。

【図７】鋳型ＤＮＡ４を有するするＤＮＡをもつプラ
スミドｐＴ７−Ｒ４の構築図。

【図８】ポリリボヌクレオチド（１１）および（１
５）のポリリボヌクレオチド（４）存在下における切断
反応のゲル電気泳動による分析。

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１１６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GCACAACAAG AAGGCAACCA GAGAAACACT CAGACTTTTA ATCTGAGGTA TATTACCTGG 60 TAGGTACTTC TGTCAGTCGT AGCGCGAAAG CGCTACCTGA TGATTAACAC TGGTAC 116 配列番号：２配列の長さ：116 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GCACAACAAG AAGGCAACCA GAGAAACACT CAGACTTTTA ATCTGAGGTA TATTACCTGG 60 TAGGTACTTC TGTCAGTCGT AGCGCGAAAG CGCTACCTGA TGAGTAACAC TGGTAC 116 配列番号：３配列の長さ：116 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GCACAACAAG AAGGCAACCA GAGAAACACT CAGACTTTTA ATCTGAGGTA TATTACCTGG 60 TAGGTACTTC TTTCAGTCGT AGCGCGAAAG CGCTACCTGA TGAGTAACAC TGGTAC 116 配列番号：４配列の長さ：258 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GAGGTCTCCT GATGAGTCAG ACTTTTAATC TGACGAAAGA TGCTGCGGTA CTTCTGTCAG 60 TCGTAGCGCG AAAGCGCTAC CTGATGAGTA ACACTGGTAC GCGTCATTCT GATGAGTCAG 120 ACTTTTAATC TGACGAAACG CTGCGGTACT TCTGTCAGTC GTAGCGCGAA AGCGCTACCT 180 GATGAGTAAC ACTGGTACGC ACAACAAGAA GGCAACCAGA GAAACACACC TTCGGGTGGT 240 ATATTACCTG GTAGGTAC 258 配列番号：５配列の長さ：265 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列 GAGGTCTCCT GATGAGTCAG ACTTTTAATC TGACGAAAGA TGCTGCGGTA CTTCTGTCAG 60 TCGTAGCGCG AAAGCGCTAC CTGATGAGTA ACACTGGTAC GCGTCATTCT GATGAGTCAG 120 ACTTTTAATC TGACGAAACG CTGCGGTACT TCTGTCAGTC GTAGCGCGAA AGCGCTACCT 180 GATGAGTAAC ACTGGTACGC ACAACAAGAA GGCAACCAGA GAAACACTCA GACTTTTAAT 240 CTGAGGTATA TTACCTGGTA GGTAC 265 配列番号：６配列の長さ：240 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GAGGTCTCCT GATGAGTCAG ACTTTTAATC TGACGAAAGA TGCTGCGGTA CTTCTGTCAG 60 TCGTAGCGCG AAAGCGCTAC CTGATGAGTA ACACTGGTAC GCGTCATTCT GATGAGTCAG 120 ACTTTTAATC TGACGAAACG CTGCGGTACT TCTGTCAGTC GTAGCGCGAA AGCGCTACCT 180 GATGAGTAAC ACTGGTACGT CACACCTGAT GAGCCGCTTC GGCGGCGAAA CAGACGGTAC 240 配列番号：７配列の長さ：246 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GAGGTCTCCT GATGAGTCAG ACTTTTAATC TGACGAAAGA TGCTGCGGTA CTTCTGTCAG 60 TCGTAGCGCG AAAGCGCTAC CTGATGAGTA ACACTGGTAC GCGTCATTCT GATGAGTCAG 120 ACTTTTAATC TGACGAAACG CTGCGGTACT TCTGTCAGTC GTAGCGCGAA AGCGCTACCT 180 GATGAGTAAC ACTGGTACGT CACACCTGAT GAGTCAGACT TTTAATCTGA CGAAACAGAC 240 GGTAC 245 配列番号：８配列の長さ：475 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成RNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGGAAAGCUU GCAUGCCUGC AGCACAACAA GAAGGCAACC AGAGAAACAC UCAGACUUUU 60 AAUCUGAGGU AUAUUACCUG GUAGGUACUU CUGUCAGUCG UAGCGCGAAA GCGCUACCUG 120 AUGAUUAACA CUGGUACCGA GCUCGAAUUC GUCUCUCCCU UUAGUGAGGG UUAAUUUAAU 180 CGAUAAUUCA CUGGCCGUCG UUUUACAACG UCGUGACUGG GAAAACCCUG GCGUUACCCA 240 ACUUAAUCGC CUUGCAGCAC AUCCCCCUUU CGCCAGCUGG CGUAAUAGCG AAGAGGCCCG 300 CACCGAUCGC CCUUCCCAAC AGUUGCGCAG CCUGAAUGGC GAAUGGGACG CGCCCAGUAG 360 CGGCGCAUUA AGCGCGGCGG GUGUGGUGGU UACGCGCAGC GUGACCGCUA CACUUGCCAG 420 CGCCCUAGCG CCCGCUCCUU UCGCUUUCUU CCCUUCCUUU CUCGCCACGU UCGCC 475 配列番号：９配列の長さ：４７５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＲＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス： No 配列 GGGAAAGCUU GCAUGCCUGC AGCACAACAA GAAGGCAACC AGAGAAACAC UCAGACUUUU 60 AAUCUGAGGU AUAUUACCUG GUAGGUACUU CUGUCAGUCG UAGCGCGAAA GCGCUACCUG 120 AUGAGUAACA CUGGUACCGA GCUCGAAUUC GUCUCUCCCU UUAGUGAGGG UUAAUUUAAU 180 CGAUAAUUCA CUGGCCGUCG UUUUACAACG UCGUGACUGG GAAAACCCUG GCGUUACCCA 240 ACUUAAUCGC CUUGCAGCAC AUCCCCCUUU CGCCAGCUGG CGUAAUAGCG AAGAGGCCCG 300 CACCGAUCGC CCUUCCCAAC AGUUGCGCAG CCUGAAUGGC GAAUGGGACG CGCCCAGUAG 360 CGGCGCAUUA AGCGCGGCGG GUGUGGUGGU UACGCGCAGC GUGACCGCUA CACUUGCCAG 420 CGCCCUAGCG CCCGCUCCUU UCGCUUUCUU CCCUUCCUUU CUCGCCACGU UCGCC 475 配列番号：１０配列の長さ：475 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成RNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス： No 配列 GGGAAAGCUU GCAUGCCUGC AGCACAACAA GAAGGCAACC AGAGAAACAC UCAGACUUUU 60 AAUCUGAGGU AUAUUACCUG GUAGGUACUU CUUUCAGUCG UAGCGCGAAA GCGCUACCUG 120 AUGAGUAACA CUGGUACCGA GCUCGAAUUC GUCUCUCCCU UUAGUGAGGG UUAAUUUAAU 180 CGAUAAUUCA CUGGCCGUCG UUUUACAACG UCGUGACUGG GAAAACCCUG GCGUUACCCA 240 ACUUAAUCGC CUUGCAGCAC AUCCCCCUUU CGCCAGCUGG CGUAAUAGCG AAGAGGCCCG 300 CACCGAUCGC CCUUCCCAAC AGUUGCGCAG CCUGAAUGGC GAAUGGGACG CGCCCAGUAG 360 CGGCGCAUUA AGCGCGGCGG GUGUGGUGGU UACGCGCAGC GUGACCGCUA CACUUGCCAG 420 CGCCCUAGCG CCCGCUCCUU UCGCUUUCUU CCCUUCCUUU CUCGCCACGU UCGCC 475 配列番号：１１配列の長さ：67 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス： No 配列 GCACAACAAG AAGGCAACCA GAGAAACACT CAGACTTTTA ATCTGAGGTA TATTACCTGG 60 TAGGTAC 67 配列番号：１２配列の長さ：67 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列 CTACCAGGTA ATATACCTCA GATTAAAAGT CTGAGTGTTT CTCTGGTTGC CTTCTTGTTG 60 TGCTGCA 67 配列番号：１３配列の長さ：49 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TTCTGTCAGT CGTAGCGCGA AAGCGCTACC TGATGATTAA CACTGGTAC 49 配列番号：１４配列の長さ：49 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列 CAGTGTTAAT CATCAGGTAG CGCTTTCGCG CTACGACTGA CAGAAGTAC 49 配列番号：１５配列の長さ：49 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：Noアンチセンス :No 配列 TTCTGTCAGT CGTAGCGCGA AAGCGCTACC TGATGAGTAA CACTGGTAC 48 配列番号：１６配列の長さ：49 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列 CAGTGTTACT CATCAGGTAG CGCTTTCGCG CTACGACTGA CAGAAGTAC 49 配列番号：１７配列の長さ：49 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TTCTTTCAGT CGTAGCGCGA AAGCGCTACC TGATGAGTAA CACTGGTAC 49 配列番号：１８配列の長さ：49 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列 CAGTGTTACT CATCAGGTAG CGCTTTCGCG CTACGACTGA AAGAAGTAC 49 配列番号：１９配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＲＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AGUGUUACGA AACUGACAGA 20 配列番号：２０配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＲＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列ＡＧＵＧＵＵＡＡＧＡＡＡＣＵＧＡＣＡＧＡ
２０配列番号：２１配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＲＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AGUGUUAGGA AACUGACAGA 20 配列番号：２２配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＲＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AGUGUUAAGA AACUAACAGA 20 配列番号：２３配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＲＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 UGUGUGCCCG UCUGUUGUGU GACUC 25 配列番号：２４配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＲＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CACUAUGGGC GCAGCGUCAA UGACGCUG 28 配列番号：２５配列の長さ：19 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＲＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AGCAGCAUCU CGAGACCUA 19 配列番号：２６配列の長さ：６１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＲＮＡ）ハイポセティカル：Ｎｏアンチセンス：No 配列 GGGAAAGCUU GCAUGCCUGC AGAGGUCUCC UGAUGAGUCA GACUUUUAAU CUGACGAAAG 60 AUGCUGCGGU ACUUCUGUCA GUCGUAGCGC GAAAGCGCUA CCUGAUGAGU AACACUGGUA 120 CGCGUCAUUC UGAUGAGUCA GACUUUUAAU CUGACGAAAC GCUGCGGUAC UUCUGUCAGU 180 CGUAGCGCGA AAGCGCUACC UGAUGAGUAA CACUGGUACG CACAACAAGA AGGCAACCAG 240 AGAAACACAC CUUCGGGUGG UAUAUUACCU GGUAGGUACC GAGCUCGAAU UCGUCUCUCC 300 CUUUAGUGAG GGUUAAUUUA AUCGAUAAUU CACUGGCCGU CGUUUUACAA CGUCGUGACU 360 GGGAAAACCC UGGCGUUACC CAACUUAAUC GCCUUGCAGC ACAUCCCCCU UUCGCCAGCU 420 GGCGUAAUAG CGAAGAGGCC CGCACCGAUC GCCCUUCCCA ACAGUUGCGC AGCCUGAAUG 480 GCGAAUGGGA CGCGCCCAGU AGCGGCGCAU UAAGCGCGGC GGGUGUGGUG GUUACGCGCA 540 GCGUGACCGC UACACUUGCC AGCGCCCUAG CGCCCGCUCC UUUCGCUUUC UUCCCUUCCU 600 UUCUCGCCAC GUUCGCC 617 配列番号：２７配列の長さ：624 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＲＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGGAAAGCUU GCAUGCCUGC AGAGGUCUCC UGAUGAGUCA GACUUUUAAU CUGACGAAAG 60 AUGCUGCGGU ACUUCUGUCA GUCGUAGCGC GAAAGCGCUA CCUGAUGAGU AACACUGGUA 120 CGCGUCAUUC UGAUGAGUCA GACUUUUAAU CUGACGAAAC GCUGCGGUAC UUCUGUCAGU 180 CGUAGCGCGA AAGCGCUACC UGAUGAGUAA CACUGGUACG CACAACAAGA AGGCAACCAG 240 AGAAACACUC AGACUUUUAA UCUGAGGUAU AUUACCUGGU AGGUACCGAG CUCGAAUUCG 300 UCUCUCCCUU UAGUGAGGGU UAAUUUAAUC GAUAAUUCAC UGGCCGUCGU UUUACAACGU 360 CGUGACUGGG AAAACCCUGG CGUUACCCAA CUUAAUCGCC UUGCAGCACA UCCCCCUUUC 420 GCCAGCUGGC GUAAUAGCGA AGAGGCCCGC ACCGAUCGCC CUUCCCAACA GUUGCGCAGC 480 CUGAAUGGCG AAUGGGACGC GCCCAGUAGC GGCGCAUUAA GCGCGGCGGG UGUGGUGGUU 540 ACGCGCAGCG UGACCGCUAC ACUUGCCAGC GCCCUAGCGC CCGCUCCUUU CGCUUUCUUC 600 CCUUCCUUUC UCGCCACGUU CGCC 624 配列番号：２８配列の長さ：599 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＲＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGGAAAGCUU GCAUGCCUGC AGAGGUCUCC UGAUGAGUCA GACUUUUAAU CUGACGAAAG 60 AUGCUGCGGU ACUUCUGUCA GUCGUAGCGC GAAAGCGCUA CCUGAUGAGU AACACUGGUA 120 CGCGUCAUUC UGAUGAGUCA GACUUUUAAU CUGACGAAAC GCUGCGGUAC UUCUGUCAGU 180 CGUAGCGCGA AAGCGCUACC UGAUGAGUAA CACUGGUACG UCACACCUGA UGAGCCGCUU 240 CGGCGGCGAA ACAGACGGUA CCGAGCUCGA AUUCGUCUCU CCCUUUAGUG AGGGUUAAUU 300 UAAUCGAUAA UUCACUGGCC GUCGUUUUAC AACGUCGUGA CUGGGAAAAC CCUGGCGUUA 360 CCCAACUUAA UCGCCUUGCA GCACAUCCCC CUUUCGCCAG CUGGCGUAAU AGCGAAGAGG 420 CCCGCACCGA UCGCCCUUCC CAACAGUUGC GCAGCCUGAA UGGCGAAUGG GACGCGCCCA 480 GUAGCGGCGC AUUAAGCGCG GCGGGUGUGG UGGUUACGCG CAGCGUGACC GCUACACUUG 540 CCAGCGCCCU AGCGCCCGCU CCUUUCGCUU UCUUCCCUUC CUUUCUCGCC ACGUUCGCC 599 配列番号：２９配列の長さ：604 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＲＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGGAAAGCUU GCAUGCCUGC AGAGGUCUCC UGAUGAGUCA GACUUUUAAU CUGACGAAAG 60 AUGCUGCGGU ACUUCUGUCA GUCGUAGCGC GAAAGCGCUA CCUGAUGAGU AACACUGGUA 120 CGCGUCAUUC UGAUGAGUCA GACUUUUAAU CUGACGAAAC GCUGCGGUAC UUCUGUCAGU 180 CGUAGCGCGA AAGCGCUACC UGAUGAGUAA CACUGGUACG UCACACCUGA UGAGUCAGAC 240 UUUUAAUCUG ACGAAACAGA CGGUACCGAG CUCGAAUUCG UCUCUCCCUU UAGUGAGGGU 300 UAAUUUAAUC GAUAAUUCAC UGGCCGUCGU UUUACAACGU CGUGACUGGG AAAACCCUGG 360 CGUUACCCAA CUUAAUCGCC UUGCAGCACA UCCCCCUUUC GCCAGCUGGC GUAAUAGCGA 420 AGAGGCCCGC ACCGAUCGCC CUUCCCAACA GUUGCGCAGC CUGAAUGGCG AAUGGGACGC 480 GCCCAGUAGC GGCGCAUUAA GCGCGGCGGG UGUGGUGGUU ACGCGCAGCG UGACCGCUAC 540 ACUUGCCAGC GCCCUAGCGC CCGCUCCUUU CGCUUUCUUC CCUUCCUUUC UCGCCACGUU 600 CGCC 604 配列番号：３０配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列 CTACCAGGTA ATATACCACC CGAAGGTG 28 配列番号：３１配列の長さ：43 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス： Yes 配列 TGTTTCTCTG GTTGCCTTCT TGTTGTGCGT ACCAGTGTTA CTC 43 配列番号：３２配列の長さ：45 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス： Yes 配列 ATCAGGTAGC GCTTTCGCGC TACGACTGAC AGAAGTACCG CAGCG 45 配列番号：３３配列の長さ：５３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：Ｎｏアンチセンス： Yes 配列 TTTCGTCAGA TTAAAAGTCT GACTCATCAG AATGACGCGT ACCAGTGTTA CTC 53 配列番号：３４配列の長さ：47 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス： Yes 配列 ATCAGGTAGC GCTTTCGCGC TACGACTGAC AGAAGTACCG CAGCATC 47 配列番号：３５配列の長さ：42 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス： Yes 配列 TTTCGTCAGA TTAAAAGTCT GACTCATCAG GAGACCTCTG CA 42 配列番号：３６配列の長さ：35 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス： Yes 配列 CTACCAGGTA ATATACCTCA GATTAAAAGT CTGAG 35 配列番号：３７配列の長さ：53 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス： Yes 配列 CGTCTGTTTC GCCGCCGAAG CGGCTCATCA GGTGTGACGT ACCAGTGTTA CTC 53 配列番号：３８配列の長さ：58 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス： Yes 配列 CGTCTGTTTC GTCAGATTAA AAGTCTGACT CATCAGGTGT GACGTACCAG TGTTACTC 58 配列番号：３９配列の長さ：49 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス： No 配列 GCGTCATTCT GATGAGTCAG ACTTTTAATC TGACGAAACG CTGCGGTAC 49 配列番号：４０配列の長さ：51 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス： No 配列 GAGGTCTCCT GATGAGTCAG ACTTTTAATC TGACGAAAGA TGCTGCGGTA C 51 配列番号：４１配列の長さ：60 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス： No 配列 GCACAACAAG AAGGCAACCA GAGAAACACA CCTTCGGGTG GTATATTACC TGGTAGGTAC 60 配列番号：４２配列の長さ：42 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス： No 配列 GTCACACCTG ATGAGCCGCT TCGGCGGCGA AACAGACGGT AC 42 配列番号：４３配列の長さ：47 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：Ｎｏ配列ＧＴＣＡＣＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＡＧＡＣＴＴＴＴＡＡＴＣＴＧＡＣ
ＧＡＡＡＣＡＧＡＣＧＧＴＡＣ４７配列番号：４４配列の長さ：617 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成RNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGGAAAGCUU GCAUGCCUGC AGAGGUCUCC UGAUGAGUCA GACUUUUAAU CUGACGAAAG 60 AUGCUGCGGU ACUUCUGUCA GACGUAGCGC GAAAGCGCUA CCUGAUGAGU AACACUGGUA 120 CGCGUCAUUC UGAUGAGUCA GACUUUUAAU CUGACGAAAC GCUGCGGUAC UUCUGUCAGA 180 CGUAGCGCGA AAGCGCUACC UGAUGAGUAA CACUGGUACG CACAACAAGA AGGCAACCAG 240 AGAAACACAC CUUCGGGUGG UAUAUUACCU GGUAGGUACC GAGCUCGAAU UCGUCUCUCC 300 CUUUAGUGAG GGUUAAUUUA AUCGAUAAUU CACUGGCCGU CGUUUUACAA CGUCGUGACU 360 GGGAAAACCC UGGCGUUACC CAACUUAAUC GCCUUGCAGC ACAUCCCCCU UUCGCCAGCU 420 GGCGUAAUAG CGAAGAGGCC CGCACCGAUC GCCCUUCCCA ACAGUUGCGC AGCCUGAAUG 480 GCGAAUGGGA CGCGCCCAGU AGCGGCGCAU UAAGCGCGGC GGGUGUGGUG GUUACGCGCA 540 GCGUGACCGC UACACUUGCC AGCGCCCUAG CGCCCGCUCC UUUCGCUUUC UUCCCUUCCU 600 UUCUCGCCAC GUUCGCC 617 配列番号：４５配列の長さ：258 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GAGGTCTCCT GATGAGTCAG ACTTTTAATC TGACGAAAGA TGCTGCGGTA CTTCTGTCAG 60 ACGTAGCGCG AAAGCGCTAC CTGATGAGTA ACACTGGTAC GCGTCATTCT GATGAGTCAG 120 ACTTTTAATC TGACGAAACG CTGCGGTACT TCTGTCAGAC GTAGCGCGAA AGCGCTACCT 180 GATGAGTAAC ACTGGTACGC ACAACAAGAA GGCAACCAGA GAAACACACC TTCGGGTGGT 240 ATATTACCTG GTAGGTAC 258 配列番号：４６配列の長さ：43 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス： No 配列 ATCAGGTAGC GCTTTCGCGC TACGTCTGAC AGAAGTACCG CAGCG 45 配列番号：４７配列の長さ：47 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：Ｎｏ配列ＡＴＣＡＧＧＴＡＧＣＧＣＴＴＴＣＧＣＧＣＴＡＣＧＴＣＴＧＡＣＡＧＡ
ＡＧＴＡＣＣＧＣＡＧＣＡＴＣ４７配列番号：４８配列の長さ：49 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス： No 配列 TTCTGTCAGA CGTAGCGCGA AAGCGCTACC TGATGAGTAA CACTGGTAC 49 配列番号：４９配列の長さ：43 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成RNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 UCUGUCAGUC GUAGCGCGAA AGCGCUACCU GAUGAUUAAC ACU 43 配列番号：５０配列の長さ：43 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成RNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 UCUGUCAGUC GUAGCGCGAA AGCGCUACCU GAUGAGUAAC ACU 43 配列番号：５１配列の長さ：43 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成RNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 UCUGUUAGUC GUAGCGCGAA AGCGCUACCU GAUGAGUAAC ACU 43 配列番号：５２配列の長さ：8 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成RNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 UCUGUYAG 8 配列番号：５３配列の長さ：8 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成RNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 KUAACACU 8 配列番号：５４配列の長さ：8 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成RNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AGUGUUAV 8 配列番号：５５配列の長さ：8 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成RNA ）ハイポセティカル：Noアンチセンス :No 配列 CURACAGA 8 配列番号：５６配列の長さ：61 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成RNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CACAACAAGA AGGCAACCAG AGAAACACUC AGACUUUUAA UCUGAGGUAU AUUACCUGGU 60 A 61 配列番号：５７配列の長さ：54 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成RNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CACAACAAGA AGGCAACCAG AGAAACACAC CUUCGGGUGG UAUAUUACCU GGUA 54 配列番号：５８配列の長さ：４３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＲＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CGUCAUUCUG AUGAGUCAGA CUUUUAAUCU GACGAAACGC UGC 43 配列番号：５９配列の長さ：45 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成RNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AGGUCUCCUG AUGAGUCAGA CUUUUAAUCU GACGAAAGAU GCUGC 45

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 ＡＤＵＡ６１Ｋ 48/00 ＡＤＵＡＤＹＡＤＹＣ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 9/00 //(Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式（Ｉ）乃至（ＩＶ）：５’− α₁ β₁ α₂ β₂ ・・・α_n β_n −３’ （Ｉ）；５’− α₁ β₁ α₂ β₂ ・・・α_n-1 β_n-1 α_n −３’ （ＩＩ）；５’− β₁ α₁ β₂ α₂ ・・・β_n α_n −３’ （ＩＩＩ）；５’− β₁ α₁ β₂ α₂ ・・・β_n-1 α_n-1 β_n −３’ （ＩＶ）（式中、α₁ 〜α_n またはα₁ 〜α_n-1 は、同一または
異なるポリリボヌクレオチドであって、細胞内の特定の
ポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n またはγ₁ 〜γ_n-1 と
複合体を形成する能力を有し、β₁ 〜β_n またはβ₁ 〜
β_n-1 は、同一または異なるポリリボヌクレオチドであ
り、式（Ｉ）または（ＩＩＩ）においては、ｎは１以上
の整数を表し、式（ＩＩ）または（ＩＶ）においては、
ｎは２以上の整数を表す）のいずれか一つで表わされる
構造を有し、下記の１）乃至３）の全ての特徴を有する
ポリリボヌクレオチド：１）細胞内の特定のポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n
またはγ₁ 〜γ_n-1 と、α₁ 〜α_n またはα₁ 〜α_n-1
とは、同一または異なって、リボザイム活性を有する複
合体をそれぞれ形成することができ；２）細胞内で、式（Ｉ）乃至（ＩＶ）のいずれか一つ
で表わされるポリリボヌクレオチドは、１）記載の複合
体の有するリボザイム活性により、α₁ 〜α_n またはα
₁ 〜α_n-1 の特定の位置でそれぞれ切断され；３）２）における切断後の、β₁ 〜β_n またはβ₁ 〜
β_n-1 を含む各断片は、それぞれ同一または異なって、
単独または協同して細胞内のポリリボヌクレオチドδ₁
〜δ_n またはδ₁ 〜δ_n-1 の機能を特異的に阻害する活
性を有する。
【請求項２】ポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n または
γ₁ 〜γ_n-1 とポリリボヌクレオチドδ₁ 〜δ_n または
δ₁ 〜δ_n-1 が同一の細胞集団に特異的に存在するポリ
リボヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１記
載のポリリボヌクレオチド。
【請求項３】ポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n または
γ₁ 〜γ_n-1 とポリリボヌクレオチドδ₁ 〜δ_n または
δ₁ 〜δ_n-1 とが同一のＲＮＡ中に存在することを特徴
とする、請求項１または２記載のポリリボヌクレオチ
ド。
【請求項４】ポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n または
γ₁ 〜γ_n-1 、および／または、ポリリボヌクレオチド
δ₁ 〜δ_n またはδ₁ 〜δ_n-1 が、病因遺伝子の転写物
もしくはレトロウイルスＲＮＡ中に存在することを特徴
とする、請求項１乃至３のいずれか一つに記載のポリリ
ボヌクレオチド。
【請求項５】ポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n または
γ₁ 〜γ_n-1 、および／または、ポリリボヌクレオチド
δ₁ 〜δ_n またはδ₁ 〜δ_n-1 がヒト免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ）由来のＲＮＡ中に存在することを特徴とす
る、請求項１乃至４のいずれか一つに記載のポリリボヌ
クレオチド。
【請求項６】ポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n または
γ₁ 〜γ_n-1 が配列表の配列番号１９乃至２２のいずれ
か一つに示されるヌクレオチド配列を含むことを特徴と
する、請求項１乃至５のいずれか一つに記載のポリリボ
ヌクレオチド。
【請求項７】ポリリボヌクレオチドδ₁ 〜δ_n または
δ₁ 〜δ_n-1 が配列表の配列番号２３乃至２５のいずれ
か一つに示されるヌクレオチド配列を含むことを特徴と
する、請求項１乃至６のいずれか一つに記載のポリリボ
ヌクレオチド。
【請求項８】ｎが２０以下であることを特徴とする、
請求項１乃至７のいずれか一つに記載のポリリボヌクレ
オチド。
【請求項９】ｎが６以下であることを特徴とする、請
求項１乃至７のいずれか一つに記載のポリリボヌクレオ
チド。
【請求項１０】ｎが５以下であることを特徴とする、
請求項１乃至７のいずれか一つに記載のポリリボヌクレ
オチド。
【請求項１１】 α₁ 〜α_n またはα₁ 〜α_n-1 の構造
が、それぞれ式（Ｖ）乃至（ＶＩＩ）：【化１】（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃはシトシンヌク
レオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇはグアニンヌ
クレオチドを表し、Ｄ₁ 〜Ｄ_e は同一または異なってウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、Ｑ₁ 〜Ｑ_a は同一または異なってウラシルヌクレ
オチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド
またはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｒ₁ 〜
Ｒ_a はＱ₁ 〜Ｑ_a にそれぞれ相補的なヌクレオチドを表
し、Ｗ₁ 〜Ｗ_k は同一または異なってウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｚ₁ 〜Ｚ
_q は同一または異なってウラシルヌクレオチド、アデニ
ンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドまたはグアニン
ヌクレオチドのいずれかを表し、Ｐはウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチドまたは、シトシンヌクレオ
チドのいずれかを表し、Ｓは、ウラシルヌクレオチド、
アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドまたはグ
アニンヌクレオチドのいずれかを表し、ｑ、ｋは同一ま
たは異なって１乃至２０の整数を表し、ｅ、ａは同一ま
たは異なって１乃至１０の整数を表す。）；【化２】（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃはシトシンヌク
レオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇはグアニンヌ
クレオチドを表し、Ｂ₁ 〜Ｂ_h は同一または異なってウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、Ｄ₁ 〜Ｄ_e は同一または異なってウラシルヌクレ
オチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド
またはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｑ₁ 〜
Ｑ_a は同一または異なってウラシルヌクレオチド、アデ
ニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドまたはグアニ
ンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｒ₁ 〜Ｒ_a はＱ₁ 〜
Ｑ_a にそれぞれ相補的なヌクレオチドを表し、Ｗ₁ 〜Ｗ
_k は同一または異なってウラシルヌクレオチド、アデニ
ンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドまたはグアニン
ヌクレオチドのいずれかを表し、Ｚ₁ 〜Ｚ_q は同一また
は異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチ
ド、シトシンヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチド
のいずれかを表し、Ｐはウラシルヌクレオチド、アデニ
ンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドまたはグアニン
ヌクレオチドのいずれかを表し、Ｌは、ウラシルヌクレ
オチド、アデニンヌクレオチド、またはシトシンヌクレ
オチドのいずれかを表し、Ｖは、ウラシルヌクレオチ
ド、アデニンヌクレオチド、またはシトシンヌクレオチ
ドのいずれかを表し、ｈは１乃至５０の整数を表し、
ｑ、ｋは同一または異なって１乃至２０の整数を表し、
ｅ、ａは同一または異なって１乃至１０の整数を表
す。）；【化３】（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃはシトシンヌク
レオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇはグアニンヌ
クレオチドを表し、Ｂ₁ 〜Ｂ_h は同一または異なってウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、Ｄ₁ 〜Ｄ_e は同一または異なってウラシルヌクレ
オチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド
またはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｅ₁ 〜
Ｅ_j は同一または異なってウラシルヌクレオチド、アデ
ニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドまたはグアニ
ンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｆ₁ 〜Ｆ_j はＥ₁ 〜
Ｅ_j にそれぞれ相補的なヌクレオチドを表し、Ｑ₁ 〜Ｑ
_a は同一または異なってウラシルヌクレオチド、アデニ
ンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドまたはグアニン
ヌクレオチドのいずれかを表し、Ｒ₁ 〜Ｒ_a はＱ₁ 〜Ｑ
_a にそれぞれ相補的なヌクレオチドを表し、Ｗ₁ 〜Ｗ_k
は同一または異なってウラシルヌクレオチド、アデニン
ヌクレオチド、シトシンヌクレオチドまたはグアニンヌ
クレオチドのいずれかを表し、Ｚ₁ 〜Ｚ_q は同一または
異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチ
ド、シトシンヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチド
のいずれかを表し、Ｐはウラシルヌクレオチド、アデニ
ンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドまたはグアニン
ヌクレオチドのいずれかを表し、Ｌは、ウラシルヌクレ
オチド、アデニンヌクレオチド、またはシトシンヌクレ
オチドのいずれかを表し、Ｖは、ウラシルヌクレオチ
ド、アデニンヌクレオチド、またはシトシンヌクレオチ
ドのいずれかを表し、ｈは１乃至５０の整数を表し、
ｑ、ｋは同一または異なって１乃至２０の整数を表し、
ｊ、ｅ、ａは同一または異なって１乃至１０の整数を表
す。）からなる群より選択されることを特徴とする、請
求項１乃至１０のいずれか一つに記載のポリリボヌクレ
オチド。
【請求項１２】 α₁ 〜α_n またはα₁ 〜α_n-1 の構造
が、式（Ｖ）：【化４】（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃはシトシンヌク
レオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇはグアニンヌ
クレオチドを表し、Ｄ₁ 〜Ｄ_e は同一または異なってウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、Ｑ₁ 〜Ｑ_a は同一または異なってウラシルヌクレ
オチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド
またはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｒ₁ 〜
Ｒ_a はＱ₁ 〜Ｑ_a にそれぞれ相補的なヌクレオチドを表
し、Ｗ₁ 〜Ｗ_k は同一または異なってウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｚ₁ 〜Ｚ
_q は同一または異なってウラシルヌクレオチド、アデニ
ンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドまたはグアニン
ヌクレオチドのいずれかを表し、Ｐはウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチドまたは、シトシンヌクレオ
チドのいずれかを表し、Ｓは、ウラシルヌクレオチド、
アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドまたはグ
アニンヌクレオチドのいずれかを表し、ｑ、ｋは同一ま
たは異なって１乃至２０の整数を表し、ｅ、ａは同一ま
たは異なって１乃至１０の整数を表す。）で表わされる
ことを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか一つに
記載のポリリボヌクレオチド。
【請求項１３】式（Ｖ）において、ｋが８であって、
Ｗ₈ からＷ₁ からなるヌクレオチド配列が配列表の配列
番号５２に示される配列であり、ｑが８であって、Ｚ₈
からＺ₁ からなるヌクレオチド配列が配列表の配列番号
５３に示される配列であることを特徴とする、請求項１
２記載のポリリボヌクレオチド。
【請求項１４】 α₁ 〜α_n またはα₁ 〜α_n-1 のヌク
レオチド配列が、それぞれ配列表の配列番号４９乃至５
１からなる群より選択されるヌクレオチド配列であるこ
とを特徴とする、請求項１２または１３記載のポリリボ
ヌクレオチド。
【請求項１５】ポリリボヌクレオチドδ₁ 〜δ_n また
はδ₁ 〜δ_n-1 の機能を阻害する手段が、リボザイムに
よるポリリボヌクレオチドδ₁ 〜δ_n またはδ₁ 〜δ
_n-1 の切断またはアンチセンスＲＮＡによるポリリボヌ
クレオチドδ₁ 〜δ_n またはδ₁ 〜δ_n-1 の発現阻止で
あることを特徴とする、請求項１乃至１４のいずれか一
つに記載のポリリボヌクレオチド。
【請求項１６】ポリリボヌクレオチドδ₁ 〜δ_n また
はδ₁ 〜δ_n-1 の機能を阻害する手段が、リボザイムに
よるポリリボヌクレオチドδ₁ 〜δ_n またはδ₁ 〜δ
_n-1 の切断であることを特徴とする、請求項１乃至１４
のいずれか一つに記載のポリリボヌクレオチド。
【請求項１７】ポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n また
はγ₁ 〜γ_n-1 の存在下で切断された後のβ₁ 〜β_n も
しくはβ₁ 〜β_n-1 を含む各断片が形成するリボザイム
の構造が、式（ＶＩＩＩ）または（ＩＸ）：【化５】（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃはシトシンヌク
レオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇはグアニンヌ
クレオチドを表し、Ｄ₁ 〜Ｄ_e は同一または異なってウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、Ｑ₁ 〜Ｑ_a は同一または異なってウラシルヌクレ
オチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド
またはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｒ₁ 〜
Ｒ_a はＱ₁ 〜Ｑ_a にそれぞれ相補的なヌクレオチドを表
し、Ｗ₁ 〜Ｗ_k は同一または異なってウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｚ₁ 〜Ｚ
_q は同一または異なってウラシルヌクレオチド、アデニ
ンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドまたはグアニン
ヌクレオチドのいずれかを表し、Ｓは、ウラシルヌクレ
オチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド
またはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、ｑ、ｋ
は同一または異なって１乃至２０の整数を表し、ｅ、ａ
は同一または異なって１乃至１０の整数を表す。）；【化６】（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃはシトシンヌク
レオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇはグアニンヌ
クレオチドを表し、Ｄ₁ 〜Ｄ_e は同一または異なってウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、Ｑ₁ 〜Ｑ_a は同一または異なってウラシルヌクレ
オチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド
またはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｒ₁ 〜
Ｒ_a はＱ₁ 〜Ｑ_a にそれぞれ相補的なヌクレオチドを表
し、Ｗ₁ 〜Ｗ₄ は同一または異なってウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｚ₁ 〜Ｚ
_q は同一または異なってウラシルヌクレオチド、アデニ
ンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドまたはグアニン
ヌクレオチドのいずれかを表し、Ｓは、アデニンヌクレ
オチド、またはシトシンヌクレオチドのいずれかを表
し、ｑは同一または異なって１乃至２０の整数を表し、
ｅ、ａは同一または異なって１乃至１０の整数を表
す。）からなる群より選択されることを特徴とする、請
求項１５または１６記載のポリリボヌクレオチド。
【請求項１８】ポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n また
はγ₁ 〜γ_n-1 の存在下で切断された後のβ₁ 〜β_n も
しくはβ₁ 〜β_n-1 を含む各断片が形成するリボザイム
の構造が、式（ＶＩＩＩ）：【化７】（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃはシトシンヌク
レオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇはグアニンヌ
クレオチドを表し、Ｄ₁ 〜Ｄ_e は同一または異なってウ
ラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシン
ヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかを
表し、Ｑ₁ 〜Ｑ_a は同一または異なってウラシルヌクレ
オチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド
またはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｒ₁ 〜
Ｒ_a はＱ₁ 〜Ｑ_a にそれぞれ相補的なヌクレオチドを表
し、Ｗ₁ 〜Ｗ_k は同一または異なってウラシルヌクレオ
チド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドま
たはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｚ₁ 〜Ｚ
_q は同一または異なってウラシルヌクレオチド、アデニ
ンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドまたはグアニン
ヌクレオチドのいずれかを表し、Ｓは、ウラシルヌクレ
オチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド
またはグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、ｑ、ｋ
は同一または異なって１乃至２０の整数を表し、ｅ、ａ
は同一または異なって１乃至１０の整数を表す。）で表
わされることを特徴とする、請求項１６記載のポリリボ
ヌクレオチド。
【請求項１９】ポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n また
はγ₁ 〜γ_n-1 の存在下で切断された後のβ₁ 〜β_n も
しくはβ₁ 〜β_n-1 を含む各断片のヌクレオチド配列
が、それぞれ配列表の配列番号５６乃至５９のいずれか
一つに示されるヌクレオチド配列であることを特徴とす
る、請求項１６乃至１８のいずれか一つに記載のポリリ
ボヌクレオチド。
【請求項２０】配列表の配列番号８に示されるヌクレ
オチド配列を有することを特徴とする、請求項１乃至１
９のいずれか一つに記載のポリリボヌクレオチド。
【請求項２１】配列表の配列番号９に示されるヌクレ
オチド配列を有することを特徴とする、請求項１乃至１
９のいずれか一つに記載のポリリボヌクレオチド。
【請求項２２】配列表の配列番号１０に示されるヌク
レオチド配列を有することを特徴とする、請求項１乃至
１９のいずれか一つに記載のポリリボヌクレオチド。
【請求項２３】配列表の配列番号２６に示されるヌク
レオチド配列を有することを特徴とする、請求項１乃至
１９のいずれか一つに記載のポリリボヌクレオチド。
【請求項２４】配列表の配列番号２７に示されるヌク
レオチド配列を有することを特徴とする、請求項１乃至
１９のいずれか一つに記載のポリリボヌクレオチド。
【請求項２５】配列表の配列番号２８に示されるヌク
レオチド配列を有することを特徴とする、請求項１乃至
１９のいずれか一つに記載のポリリボヌクレオチド。
【請求項２６】配列表の配列番号２９に示されるヌク
レオチド配列を有することを特徴とする、請求項１乃至
１９のいずれか一つに記載のポリリボヌクレオチド。
【請求項２７】請求項１乃至２６のいずれか一つに記
載のポリリボヌクレオチドに転写されるヌクレオチド配
列を含むＤＮＡ。
【請求項２８】請求項２７記載のＤＮＡを含む組換え
ベクター；
【請求項２９】レトロウイルスベクターである、請求
項２８記載のベクター。
【請求項３０】プラスミドｐＴ７−Ｒ２Ｔである、請
求項２８記載のベクター。
【請求項３１】プラスミドｐＴ７−Ｒ２Ｇである、請
求項２８記載のベクター。
【請求項３２】プラスミドｐＴ７−Ｒ３である、請求
項２８記載のベクター。
【請求項３３】プラスミドｐＴ７−Ｒ４である、請求
項２８記載のベクター。
【請求項３４】プラスミドｐＴ７−Ｒ５である、請求
項２８記載のベクター。
【請求項３５】プラスミドｐＴ７−Ｒ６である、請求
項２８記載のベクター。
【請求項３６】プラスミドｐＴ７−Ｒ７である、請求
項２８記載のベクター。
【請求項３７】式（Ｉ）乃至（ＩＶ）：５’− α₁ β₁ α₂ β₂ ・・・α_n β_n −３’ （Ｉ）；５’− α₁ β₁ α₂ β₂ ・・・α_n-1 β_n-1 α_n −３’ （ＩＩ）；５’− β₁ α₁ β₂ α₂ ・・・β_n α_n −３’ （ＩＩＩ）；５’− β₁ α₁ β₂ α₂ ・・・β_n-1 α_n-1 β_n −３’ （ＩＶ）（式中、α₁ 〜α_n またはα₁ 〜α_n-1 は、同一または
異なるポリリボヌクレオチドであって、細胞内の特定の
ポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n またはγ₁ 〜γ _n-1 と
複合体を形成する能力を有し、β₁ 〜β_n またはβ₁ 〜
β_n-1 は、同一または異なるポリリボヌクレオチドであ
り、式（Ｉ）または（ＩＩＩ）においては、ｎは１以上
の整数を表し、式（ＩＩ）または（ＩＶ）においては、
ｎは２以上の整数を表す）のいずれか一つで表わされる
構造を有する請求項１乃至２６のいずれか一つに記載の
ポリリボヌクレオチドを用い、下記の工程１）から３）
を経て細胞内の特定のポリリボヌクレオチドδ₁ 〜δ_n
またはδ₁ 〜δ_n-1 の機能を特異的に阻害する方法：１）細胞内のポリリボヌクレオチドγ₁ 〜γ_n または
γ₁ 〜γ_n-1 とα₁ 〜α_n またはα₁ 〜α_n-1 とは、同
一または異なって、リボザイム活性を有する複合体をそ
れぞれ形成し；２）細胞内で、式（Ｉ）乃至（ＩＶ）のいずれか一つ
で表わされるポリリボヌクレオチドが、１）記載の複合
体の有するリボザイム活性により、α₁ 〜α_n またはα
₁ 〜α_n-1 の特定の位置でそれぞれ切断され；３）２）における切断後の、β₁ 〜β_n もしくはβ₁
〜β_n-1 を含む各断片が、それぞれ同一または異なっ
て、単独または協同して細胞内のポリリボヌクレオチド
δ₁ 〜δ_n またはδ₁ 〜δ_n-1 の機能を特異的に阻害す
る。
【請求項３８】請求項１乃至２６のいずれか一つに記
載のポリリボヌクレオチド、請求項２７記載のＤＮＡ、
または請求項２８乃至３６のいずれか一つに記載のベク
ターを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項３９】抗ＨＩＶ剤である、請求項３８記載の
医薬組成物。
【請求項４０】抗腫瘍剤である、請求項３８記載の医
薬組成物。
【請求項４１】抗炎症剤である、請求項３８記載の医
薬組成物。