JPH11123100A - テロメラーゼ活性調節剤のスクリーニング方法 - Google Patents

テロメラーゼ活性調節剤のスクリーニング方法

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JPH11123100A
JPH11123100A JP10226268A JP22626898A JPH11123100A JP H11123100 A JPH11123100 A JP H11123100A JP 10226268 A JP10226268 A JP 10226268A JP 22626898 A JP22626898 A JP 22626898A JP H11123100 A JPH11123100 A JP H11123100A
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cell
telomerase
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ウエスト，マイケル・ディ
Jerry Shay
シェイ，ジェリー
Woodring Wright
ライト，ウッドリング
Elisabeth H Blackburn
ブラックバーン，エリザベス・エイチ
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University of Texas System
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University of California
University of Texas System
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 テロメラーゼ活性調節剤のスクリーニング方
法を提供すること。 【解決手段】 試験化合物がテロメラーゼ活性を調節す
るか否かを決定するためにスクリーニングする方法であ
って、反応混合物中で、テロメラーゼ活性を含む調製
物、テロメラーゼ活性により伸長されることができる基
質オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド三リン酸、および
試験化合物を合わせ；反応混合物を、テロメラーゼ活性
の調節剤の不在下で、基質オリゴヌクレオチドがテロメ
ラーゼ活性により伸長されて１つまたはそれ以上のヌク
レオシド三リン酸を取り込む条件下でインキュベート
し；基質オリゴヌクレオチドが伸長されるか否かを決定
し；そして基質オリゴヌクレオチドの促進された伸長ま
たは伸長の阻害をテロメラーゼ活性の調節と相関させ
る、の各工程を含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞老化の治療お
よび診断方法ならびに不死化に関する。
【０００２】
【従来の技術】以下の記載は、発明関連分野についての
一般的記載である。本発明の先行技術は認められない。
一般的には、この技術は、細胞老化、およびかかる加齢
ならびに細胞が老化を免れる機構、そして不死化を説明
する理論または仮説に関する。
【０００３】正常なヒト・体細胞（例えば、繊維芽細
胞、内皮細胞、および上皮細胞）は、豊富な増殖因子の
存在にかかわらず、５０〜１００回の集団倍加という限
定された複製能を示す。このインビトロでの増殖の休止
は、細胞老化または細胞の加齢によると言われることが
多い。ゴールドステイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ），サイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２４９巻，１１２９頁（１
９９０年）；ヘイフリック（Ｈａｙｆｌｉｃｋ）および
ムーアヘッド（Ｍｏｏｒｅｈｅａｄ）イクスペ・セル・
リサ（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．）第２５巻，５８５
頁（１９６１年），ヘイフリック、同，第３７巻；６１
４頁（１９８５年）；オーノ（Ｏｈｎｏ）メカ・エイジ
ング・ディベ（Ｍｅｃｈ．Ａｇｉｎｇ Ｄｅｖ．）第１
１巻，１７９頁（１９７９年）；ニューヨークのアカデ
ミック・プレスのメソッズ・イン・エンザイモロジー
（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）（ダ
ブリュ・ビー・ジャコビー（Ｗ．Ｂ．Ｊａｃｏｂｙ）お
よびアイ・エム・パスタン（Ｉ．Ｍ．Ｐａｓｔａｎ）
編）第５８巻；４４〜９３頁，ハム（Ｈａｍ）およびメ
キーハン（ＭｃＫｅｅｈａｎ），（１９７９年）「メデ
ィア・アンド・グロウス・リクワイアメンツ（Ｍｅｄｉ
ｅ ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ
ｓ）」参照。細胞の複製的寿命は、ドナーのインビボに
おける年齢に反比例する（マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）
ら、ラボ・インベスティ（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．）第
２３巻，８６頁（１９７９年）；ゴールドステインら、
プロ・ナショ・アカデ・サイ・ユーエスエイ（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第６４巻，
１５５頁，（１９６９年）；およびシュナイザー（Ｓｃ
ｈｎｅｉｄｅｒ）およびミツイ（Ｍｉｔｓｕｉ），同，
第７巻；３５８４頁（１９７６年））。それゆえ、細胞
老化は、インビボにおける加齢において重要な役割を果
していることが示唆される。
【０００４】細胞の不死化（無限の複製能の獲得）は、
細胞老化からの正常でない回避であると考えられる（シ
ェイ（Ｓｈａｙ）ら、イクス・セル・リサ、第１９６
巻；３３頁（１９９１年））。正常なヒト・体細胞は、
死ぬべきものと考えられる。すなわち、限定された複製
能を有すると考えられている。対照的に、悪性腫瘍細胞
系列は無限の増殖能を有する。インビトロで培養された
ヒト・細胞は、不死化し、ついで、１０-6ないし１０-7
の不死化頻度となるためには形質転換性ウィルスの腫瘍
蛋白の助けが必要である（シェイおよびライト（Ｗｒｉ
ｇｈｔ），イクスペ・セル・リサ，第１８４巻，１０９
頁（１９８９年）。数年来、細胞老化の原因を説明する
ために、種々の仮説がたてられた。かかる仮説の例を以
下に記載するが、コンセンサスは得られておらず、ある
いは一般的に受け入れられているものでもない。
【０００５】例えば、ＤＮＡおよび他の巨大分子に対す
るフリーラジカルにより媒介されるダメージは、細胞機
能の重大な損失により引き起こされるという加齢につい
てのフリーラジカル説がある（ハーモン（Ｈａｒｍｏ
ｎ）ジャーナル・ジェロントロ（Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏ
ｌ．）第１巻，２９８頁（１９５６年）；ハーモン，ジ
ャーナル・ジェロントロ，第１６巻，２４７頁（１９６
１年））。ハーマン（Ｈａｒｍａｎ）は、「加齢はフリ
ーラジカル反応によるダメージによるところが大き
い．．．．．．．．」と言っている（ハーマン，プロ・
ナショ・アカデ・サイ・ユーエスエイ，第７８巻，７１
２４頁（１９８１年）。
【０００６】老廃物蓄積説は、加齢している細胞におけ
る色素抱合体（しばしばリポフクシンと呼ばれる）の進
行しつつある蓄積は、徐々に正常な細胞機能を阻害する
ということを提唱する（ストレーラー（Ｓｔｒｅｈｌｅ
ｒ），アド・ジェロント・リサ（Ａｄｖ．Ｇｅｒｏｎ
ｔ．Ｒｅｓ．）第１巻，３４３頁（１９６４年）；ボー
ン（Ｂｏｕｒｎｅ），プログ・ブレイン・リサ（Ｐｒｏ
ｇ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）第４０巻，１８７頁（１９
７３年）；ヘイフリック，イクス・ジェロントロ，第２
０巻，１４５頁（１９８５年））。
【０００７】徐々に体細胞が変異するという説は、放射
線および他の手段による体細胞に対する遺伝的ダメージ
の進行性蓄積が細胞機能に影響し、遺伝的組み換えなし
に変異が起こる（例えば、系列細胞の減数分裂中に、体
細胞が不明確に増殖する能力を失う）ということを提唱
する（バーネット（Ｂｕｒｎｅｔｔ），「イントリンシ
ック・ミュタジェネシス−ア．ジェネティック・アプロ
ーチ・トゥ・エイジング（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｍｕｔ
ａｇｅｎｅｓｉｓ−Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｐｐｒｏａ
ｃｈ ｔｏ Ａｇｉｎｇ）」，ニューヨークのワイル
（Ｗｙｌｅ），１９７６年；ヘイフリック，イクス・ジ
ェロントロ，第２７巻，３６３頁，１９９２年）。遺伝
的にプログラムされた老化に関する理論は、老化特異的
遺伝子の発現が、実際に、細胞増殖を阻害することを示
唆している（マーティンら、アメ・ジャーナル・パソロ
（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ）第７４巻，１３７頁（１９
７４年）；ゴールドステイン，サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）第２４９巻，１１２９頁（１９９０年））。
【０００８】スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびホイットニー
（Ｗｈｉｔｎｅｙ），サイエンス第２０７巻，８２頁
（１９８０年）には、細胞加齢に関する機構が議論され
ており、そのデータには、「遺伝的にコントロールされ
た末端分化の過程と両立して．．．．．．．増殖能が徐
々に減少することも、ダメージやエラーの継続的な発生
と矛盾しない。これは理論づけられた過程である。しか
しながら、特に有糸分裂のペアーにおけるさまざまな倍
加能は、分裂におけるダメージまたはエラーの等分でな
い分配を示唆する。」とある。
【０００９】シェイら、イクスペリメンタル・ジェロン
トロジー第２７巻、４７７頁（１９９２年）、およびイ
クスペ・セル・リサ第１９６巻，３３頁（１９９１年）
には、ヒト・細胞を不死化させるシミアン（Ｓｉｍｉａ
ｎ）ウイルス４０ Ｔ−抗原の能力を説明するためのヒ
ト・細胞死滅に関する２段階モデルが記載されている。
死滅段階１の機構（Ｍ１）は、ある種の腫瘍ウイルス蛋
白の標的であり、独立した死滅段階２の機構（Ｍ２）は
危機的状況を作り出し、これらの腫瘍ウイルスが直接ヒ
ト・細胞を死滅させることを妨げる。該著者らは、マウ
ス・腫瘍ウイルスプロモーターにより駆動されるＴ−抗
原を用いて可逆的な細胞の不死化を引き起こした。シミ
アンウイルス４０ Ｔ−抗原は、ヒト・繊維芽細胞の複
製的寿命をさらに４０〜６０％延長させると言われてい
る。その著者らは、Ｍ１機構は、種々の細胞蛋白に結合
しているか、またはＭ１死滅機構を抑制する新たな活性
を誘導するＴ−抗原により打破されると考えている。次
に、Ｍ１機構が遮断されたとしても、Ｍ２機構は増殖の
休止を引き起こす。Ｍ２死滅機構までも妨げられた場合
に不死化が達成される。
【００１０】細胞の限定された複製能は、染色体のテロ
メア（ｔｅｌｏｍｅｒｅ）（末端部分）におけるＤＮＡ
合成と同様の「時計」の作用を反映しているかも知れな
いとも提案されている。オロフニコフ（Ｏｌｏｖｎｉｋ
ｏｖ），ジャーナル・オブ・セオレティカル・バイオロ
ジー（Ｊ．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）
第４１巻，１８１頁（１９７３年）には、体細胞におけ
る細胞倍加能の制限を説明するために、辺縁系切開（ｍ
ａｒｇｉｎｏｔｏｍｙ）の理論が記載されている。該著
者は、「テロメア遺伝子に続いてＤＮＡ中に構築され、
分化のリプレッサーの合成を抑制する情報を有するオリ
ゴヌクレオチドは、形態形成の仮定において行われる有
糸分裂を継続させるための手段として役立つ。かかるヌ
クレオチドの辺縁系切開的除去は、さらなる分化の開始
の適当な信号を提供するであろう。テロメア遺伝子の延
長は、分化における可能な有糸分裂の回数を増加させる
であろう。」と述べている。
【００１１】ハーリー（Ｈａｒｉｅｙ）ら、ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）第３４５巻，４５８頁（１９９０年）
には、インビトロ（そしておそらくインビボにおいて
も）における加齢の間の一連の継代に対する機能とし
て、ヒト・繊維芽細胞中のテロメアＤＮＡの量および長
さが減少するが、このＤＮＡの損失が老化の原因として
の役割を有するかどうかは不明であると述べられてい
る。該著者らは、さらに、「腫瘍細胞は、短縮されたテ
ロメアおよび増加し異数体になる頻度（テロメアの会合
を含む）によっても特徴づけられる。テロメアＤＮＡが
究極的に正常細胞における細胞周期の停止を引き起こす
ならば、この過程の最終段階は不死細胞中に固定されう
る。比較的長いテロメアおよび老化の表現形を有する正
常細胞は、テロメア活性が殆ど無いかまたは有していな
い可能性があるが、短いテロメアを有する腫瘍細胞は、
有意なテロメア活性を有しうる。それゆえ、テロメラー
ゼは抗癌剤にとって有効な標的でありう
る。．．．．．．．不完全な複製、末端の分解（特異的
または非特異的）、および短いテロメアを伴う細胞の選
択に関連した不平等な組換えをはじめとする加齢の間の
テロメアＤＮＡの損失についての多くの可能な機構があ
る。我々のデータの２つの特徴はこの問題に関連してい
る。まず、平均テロメア長の減少は平均集団倍加あたり
約５０ｂｐであり、次に、その分散は増殖状態または細
胞活動停止に関連しては実質的に変化しない。その３’
末端の鋳型鎖の不完全なコピーにより、これらのデータ
は最も簡単に説明される。しかし、テロメアにおける複
製様式または組換の程度についての詳細なデータがない
ことにより、これらの機構をいずれも除外できないこと
が意味される。さらなる研究を行って、ヒト・繊維芽細
胞におけるテロメア短縮の機構およびその細胞老化に対
する意義を調べる必要がある。」〔引用省略〕と述べて
いる。
【００１２】結腸腫瘍細胞について議論しているハステ
ィ（Ｈａｓｔｉｅ）ら、ネイチャー第３４６巻，８６６
頁（１９９０年）には、「同じ患者の正常な結腸粘膜に
対してテロメア繰り返し配列の長さの減少があ
る。．．．．．．確証は得られていないが、成長した胎
児の組織は２０〜５０回の細胞分裂により生じるが、６
０才のヒト・結腸粘膜および血液細胞は数百または数千
回の細胞分裂により生成される。よって、テロメア減少
の程度は、多かれ少なかれ細胞分裂回数に比例している
可能性がある。正常なテロメアのないドロソフィア（Ｄ
ｒｏｓｏｐｈｉａ）の染色体の末端のサイズが１回の細
胞分裂で４ｂｐずつ小さくなること、および酵母染色体
末端は、テロメア機能を欠くと見られる変異株において
同程度に減少することが示されている。ヒト・組織にお
いて体細胞分裂の間に同じ割合で減少していると考える
ならば、ＴＲＡにおける１４ｋｂの減少は、３５００回
の母細胞の分裂により６０才のヒトの血中細胞が生産さ
れることを意味するのである。これとは別に、精子のテ
ロメア長の評価を用いて、我々は、１０００〜２０００
回という値を得た。これらの値は、マウス・血液細胞に
ついて仮定される値とうまく比較される。よって、我々
はテロメラーゼが体組織において実際には欠乏している
と提案する。この点において、トウモロコシの破壊され
た染色体は、胞子体組織（接合組織）においてのみ治癒
されるが、胚乳（末端が分化している）においては治癒
されないことは注目すべきことであり、分化した組織に
おいてテロメラーゼ活性が欠乏していることを示唆する
ものである。」〔引用省略〕と述べられている。
【００１３】該著者らは、ある種の腫瘍においては、テ
ロメラーゼ活性を有することが知られている培養中のＨ
ｅＬａ細胞について提案されたように、テロメラーゼが
再活性化されると提案している。しかし、該著者らは、
「われわれの知見に関する１つの別の説明は、腫瘍にお
いては、短いテロメアを有する細胞は、長いテロメアを
有する細胞よりも増殖において有利な面を有するという
ことである。テトラヒメナの増殖性細胞について記載さ
れた状況」〔引用省略〕と述べている。
【００１４】ハーリー，ミューティション・リサーチ
（Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）第２５６巻，
２７１頁（１９９１年）には、ヒト・体細胞のテロメア
は、複製に依存したやり方でインビトロおよびインビボ
両方における加齢を短縮する有糸分裂の時計として作用
することを示すという伝聞した観察結果が議論されてい
る。該著者は、「テロメラーゼの活性化は遅く、不死化
における出来事に従属するものであるかも知れない。な
ぜならば、多くの形質転換細胞および腫瘍組織は、非常
に短いテロメアを有するからである。よって、テロメア
長およびテロメラーゼ活性は、細胞の複製履歴および増
殖能のマーカーであるように思われる。テロメアの損失
は遺伝的な時限爆弾であり、それゆえ、時々、細胞の老
化および不死化に必要とされるという興味深い可能性が
残っている。．．．．．．．種々の腫瘍組織または形質
転換細胞系においてテロメア長は明らかに安定であるに
もかかわらず、通常、この長さはもとの組織のテロメア
長よりも短いように思われた。これらのデータは、テロ
メラーゼは、細胞の形質転換の最終段階で活性化され、
細胞は、テロメラーゼにより安定に維持された短いテロ
メアを有しながら生きることができたことを示唆するも
のである（遺伝的には不安定であるにもかかわらず）。
もし、テロメラーゼが正常細胞の小断片中に構成的に存
在しており、これらが生存の危機に瀕するか、または形
質転換されたものならば、我々は長いテロメアを有する
形質転換細胞をずっと頻繁に見いだすことができると考
えられる。」〔引用省略〕と述べている。
【００１５】該著者は、ヒト・細胞の加齢および形質転
換についての半定量的モデルにおいて、テロメアおよび
テロメラーゼは、細胞老化および癌において偶発的な役
割を果たしているという仮説を提案し、そして、この仮
説に関するモデルを提案している。
【００１６】ド・ランゲ（Ｄｅ Ｌａｎｇｅ）ら、モレ
キュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ）第１０巻，５１８頁（１９９０年）において、ヒト
・染色体末端またはテロメアについて一般的に議論され
ている。該著者らは、「テロメアの減少が細胞増殖と厳
密に関連しているかどうかを我々は知らない。もし、減
少がテロメアの不完全な複製により起こるのであれば、
かかる関連がありうると考えられる。しかしながら、遺
伝子の末端からの分解のごとき他の機構が細胞分裂とは
独立して作用しているかも知れない。いかなる場合にお
いても、テロメアの維持は体細胞において損なわれてい
ることは明らかである。はっきりと減少し、損失してい
く活性がテロメラーゼである。Ｇに富むプライマーにＴ
ＴＡＧＧＧの反復を付加することのできるヒト・テロメ
ラーゼ活性が最近になって同定された（ジー・モリン
（Ｇ．Ｍｏｒｉｎ），個人的情報）。興味深いことに、
該活性はＨｅＬａ細胞の抽出液中に示され、我々は、該
細胞が例外的に長いテロメアを有することを見いだし
た。他の細胞についてはまだ試験していないが、テロメ
ラーゼ活性が（部分的に）ヒト・染色体末端の変動の原
因であるかどうかについて、かかる実験を行って明らか
にできるだろう。」と述べている。
【００１７】スターリング（Ｓｔａｒｌｉｎｇ）ら、ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）第１８巻，６８８１頁
（１９９０年）には、マウスが長いテロメアを有するこ
とが示されており、ヒト・テロメアとの関連においてこ
の長さについて議論されている。該著者らは、「最近、
インビボにおけるヒト・繊維芽細胞の継代数にともない
ＴＲＡ長さが減少すること、および、老化細胞は、ある
種の末端においてテロメアを全く欠いていることが示さ
れた。よって、インビトロにおけるテロメア損失は、老
化において役割を果たしている。エス・セレビシェ
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびテトラヒメナ（Ｔ
ｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）においてそのシナリオは明らか
である。我々が研究したある種のマウスは老齢（１年
半）であるが、研究した組織すべてにおいてまだ３０ｋ
ｂ以上のＴＲＡを有している。ヒトにおいては、年齢と
ともに１年に１００ｂｐの割合でテロメアが短縮されて
いる。それゆえ、同じことがマウスに起こっていると考
えられるが、その生涯における末端ＤＮＡの数百ｂｐの
除去が検出されなかったのである。」〔引用省略〕と述
べている。
【００１８】ド・メロ（Ｄ’Ｍｅｌｌｏ）およびジャズ
ウィンスキ（Ｊａｚｗｉｎｓｋｉ），ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）
第１７３巻，６７０９頁には、「我々は、生物が生きて
いる間には、テロメアの短縮は正常な加齢過程において
は役割を果たさないと提案する。しかしながら、他のす
べての遺伝的変化のような、テロメラーゼ活性に影響す
る変異または外部からの遺伝的変化により、それぞれの
寿命が影響されるのかもしれない。．．．．．．要約す
ると、ヒト・２倍体繊維芽細胞における加齢に伴うテロ
メアの短縮は、一般的現象とは言えないかも知れない。
さらなる研究を行って、異なる種類の老化細胞のみなら
ず、異なる寿命の異なる生物における同じ細胞型におい
てもテロメア長およびテロメラーゼ活性を調べる必要が
ある。これにより、テロメア短縮が、特別な細胞型また
は生物の老化に、偶発的に役割を果たしているかどうか
が示されるであろう。」と述べられている。
【００１９】ヒヤマ（Ｈｉｙａｍａ）ら、ジャパニーズ
・ジャーナル・オブ・キャンサー・リサーチ（Ｊｐｎ．
Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）第８３巻、１５９頁（１
９９２年）には、「テロメアの反復の減少は神経芽細胞
の増殖能に関連しており、神経芽細胞の攻撃性の有用な
指標と考えられる。．．．．．神経芽細胞におけるテロ
メアの反復の減少または延長の機構については不明であ
るが、少なくとも、テロメアの反復の長さが神経芽細胞
の進化および／または退化に関連している可能性がある
ことはわかっている。」と述べられている。
【００２０】カウンター（Ｃｏｕｎｔｅｒ）ら、ＥＭＢ
Ｏ．Ｊ．第１１巻，１９２１頁（１９９２年）には、
「細胞増殖の間のテロメアＤＮＡの損失は、加齢および
癌化において役割をはたしている可能性がある。」と述
べられている。該著者らは、テロメラーゼの発現は、細
胞が不死性を獲得するために必要な１つの出来事である
と提案しており、「このモデルは、インビボにおける癌
発生と直接関連がありうる。例えば、部分的に形質転換
された（不死化の前の）テロメラーゼを欠いている細胞
の限定された寿命により、インビボにおける限定された
増殖の後の頻繁な癌の退化が説明されうる。正常な複製
の老化を示すチェックポイントを迂回した場合、形質転
換により、さらに２０〜４０回の集団倍加が起こり、こ
の間さらに約２ｋｂｐのテロメアＤＮＡが失われる。２
０〜４０回の倍加（１０6 〜１０12個の細胞となる）に
より、潜在的に広範囲の腫瘍サイズが示されるため、多
くの良性腫瘍がテロメラーゼを欠いているかもしれず、
テロメアが非常に小さくなった時に自然に退化するので
ある。我々は、より攻撃的な、おそらく転移性の腫瘍
は、テロメラーゼを発現する不死化した細胞を含んでい
るのであろう。この仮説を確かめるために、我々は、現
在、種々の腫瘍組織からテロメラーゼを検出して活性と
増殖能を関連づけようとしている。テロメラーゼ発現を
抑制する抗テロメラーゼ剤または機構は、テロメアおよ
び継続的な細胞増殖に関して酵素に依存している癌に対
する効果的な試薬でありうる。」と述べている。
【００２１】レビー（Ｌｅｖｙ）ら、ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．）第２２５巻，９５１頁には、「テロメアの損失が
多細胞生物の老化に関与するということは証明されてい
ないが、いくつかの証拠により、偶発的な関連が存在す
ることが示唆されている。．．．．．．．．加齢に伴う
テロメアの損失はヒトにおいては重要であるが、マウス
においては重要でない。」〔引用省略〕と述べられてい
る。
【００２２】ウィンドル（Ｗｉｎｄｌｅ）およびマクガ
イア（ＭｃＧｕｉｒｅ），プロシーディングス・オブ・
ザ・アメリカン・アソシエイション・フォー・キャンサ
ー・リサーチ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）第３３巻，５９４
頁（１９９２年）には、テロメアの役割について議論さ
れており、「これらの、および他のテロメアの関する研
究は、治療目標および癌撲滅の対策に関して新たな方向
を示すものである。もし、細胞が破壊された染色体を治
癒し、遺伝的不都合を回避できるならば、この方法を容
易にし、あるいは人工的に作り出す方法が存在しうる。
このことは、特に高い危険性を伴う患者に適用可能な、
癌抑止のための予防的手段を提供するであろう。正常対
腫瘍細胞のテロメア長の相違はまた、テロメアの損失が
加速される場合の対策を示唆するであろう。転移性腫瘍
細胞のごとき最も短いテロメアを有する細胞が最も感受
性が高い。」と述べられている。
【００２３】ゴールドステイン，サイエンス第２４９
巻，１１２９頁（１９９０年）において、テロメアの減
少についての理論を含め、細胞老化に関する種々の理論
について議論されている。該著者は、「しかしながら、
かかる機構は、融合ハイブリッド、特に短期間のヘテロ
カリオンにおける若いＨＤＦに対する老化したＨＤＦの
優位性と容易には一致しない。１個または数個のテロメ
アの完全な損失が、ＤＮＡ合成の開始を阻害し、そのこ
とにより分化状態を擬態する負の信号を発信するという
従属状態およびＲＡＤ９遺伝子についての概念を再度導
入することができよう。この考えは、推論的ではある
が、老化による複製の停止のみならず老化ＨＤＳに見ら
れるテロメアの損失後の染色体の変化をも説明するもの
である。」〔引用省略〕と述べている。
【００２４】さらに、ジャンコビッツ（Ｊａｎｋｏｖｉ
ｃ）らおよびハスティ（Ｈａｓｔｉｅ）ら（いずれもネ
イチャー第３５０巻（１９９１年））により癌における
テロメアの損失の役割が議論されている。その中で、ジ
ャンコビッツは、テロメアの短縮はヒトおよびマウスに
おける発癌に有意な影響を及ぼしそうにないことを示し
ている。ハスティらは、もし、テロメアの減少が実際に
細胞のターンオーバーを反映するのであれば、そのこと
に同意している。この現象は、小児癌および中枢神経の
癌においては役割を果たしそうもないと述べている。し
かしながら、ハスティらは、「我々の最もオリジナルで
興味深い結論は、テロメアの損失が組織の履歴における
細胞分裂の回数を反映し、１種の時計を構成しうるとい
うものであった。」と述べている。
【００２５】キプリング（Ｋｉｐｌｉｎｇ）およびクー
ク（Ｃｏｏｋｅ），ヒューマン・モレキュラー・ジェネ
ティクス（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ）第１巻，３頁（１９９２年）には、「ヒトの
胚系細胞（例えば精子）におけるテロメアは、血液のご
とき体組織の細胞におけるテロメアよりも長いことが知
られるようになったのはここ数年のことである。このこ
とに対する提案された１つの説明は、体細胞におけるテ
ロメアの反復の付加の欠如（すなわちテロメア活性の欠
如）である。もしそうであれば、不完全な末端の複製
が、体細胞が連続的な分裂をへて経験するような末端部
の反復の進行的損失を引き起こすと考えられる。このこ
とは、実際には、ドナーの年齢が増加するにつれて短く
なるテロメアを有するヒトの血液細胞および皮膚細胞に
ついて、インビボで何が起こるかということである。そ
して、テロメアの損失は、老化細胞に典型的に見られる
染色体の変化に関与しうる。老化および細胞時間の測定
は興味深く結び付いた主題であり、普通はどの程度まで
テロメアが短縮されるのかを調べるのは興味あることで
あろう。若いマウスおよび老マウスいずれにもある大き
なテロメアは、テロメアの損失と加齢との単純な関連づ
けを妨げるものであるように思われるが、より丹念なス
キームを排除するものではない。」と述べられている。
【００２６】グレイダー（Ｇｒｅｉｄｅｒ），バイオエ
ッセイズ（ＢｉｏＥｓｓａｙｓ）第１２巻，３６３頁
は、テロメア，テロメラーゼおよび老化の間の関係につ
いてのレビューを提供する。該著者は、テロメラーゼ
が、テロメアの反復の合成のための鋳型を提供するＲＮ
Ａ成分を含んでいることを示している。該著者は、「該
ＲＮＡに相補的であり、ＧＡＡＣＣＣＣＡＡ配列を含
み、ｄ（ＴＴＧＧＧＧ）、プライマーと競争し、インビ
トロでテロメラーゼ活性を阻害する」オリゴヌクレオチ
ドについて記載している（グレイダーおよびブラックバ
ーン（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ），ネイチャー第３３７巻，
３３１頁（１９８９年）を引用）。該著者は、「テロメ
ラーゼがインビボにおけるテロメア合成に必要であると
いう直接的証拠を提供する」と確信する実験について記
載している。該著者は、さらに、「多くの形質転換され
た細胞系におけるテロメアの制限断片は、体細胞のそれ
よりずっと小さい。さらに、腫瘍組織中のテロメア長
は、隣接している腫瘍でない組織中のそれより有意に短
い。形質転換細胞系が継代された場合には、テロメア長
は変化しない。よって、形質転換されていない細胞がテ
ロメア長の平衡を維持する能力を欠いているならば、大
部分の形質転換細胞はその能力を回復し、平衡テロメア
長をインビボにおける大部分の組織に見られるサイズよ
りも小さいサイズにリセットすると考えられる。これら
のデータの最も単純な解釈は、テロメア長を維持するの
に必要なテロメラーゼのごとき酵素が、形質転換細胞の
増殖に必要であり、正常な体細胞の生存には必要でない
ということである。このことは、テロメラーゼが抗癌剤
の好ましい標的でありうることを示唆する。」〔引用省
略〕と述べている。
【００２７】ブラックバーン，ネイチャー第３５０巻、
５６９頁（１９９１年）には、テロメアにおける薬剤の
作用についての潜在能力について議論されており、「テ
ロメアのＧに富む鎖は、別々のＲＮＡ配列をコピーする
ことにより合成されることが知られている染色体ＤＮＡ
配列にのみ必須である。テロメアＤＮＡのこのユニーク
な合成方法および特別な構造ならびに振舞いは、テロメ
ア合成は選択的な薬剤の作用の標的となりうることを示
唆する。テロメラーゼ活性は原虫および酵母にとり必須
であると思われるが、哺乳動物の体細胞にとっては必須
かどうかは明らかでない。著者は、伝染性原虫または病
原微生物のごとき真核細胞の病原性あるいは伝染性微生
物に対する薬剤の標的としてテロメアが調査されること
を期待する。テロメラーゼに選択的に結合する薬剤（そ
の逆転写酵素に結合する性質またはＤＮＡ基質に結合す
る性質いずれによってもよい）は、下等真核細胞の分裂
の長期にわたる維持には選択的に作用するが、短時間で
は哺乳動物宿主を損なわないであろう。なぜならば、そ
の体細胞中のテロメラーゼ活性は、通常は低いかまたは
無いかであるからである。検討されているはっきりとし
た一群の薬剤は、他のＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ
に対抗するものとしての逆転写酵素に特異的に指向され
る薬剤、およびテロメアＤＮＡ自体に結合する薬剤であ
る。これらは、染色体末端のＧに富む鎖の突起部分のＧ
０Ｇ塩基対の形態に選択的に結合する薬剤を包含する
か、または不適当なＧ０Ｇ塩基対の形態を安定化して、
インビボにおける適切な機能にとり必要な構造に適合し
ないようにしておく薬剤を包含する。テロメアは、染色
体のアキレスけんとして記載されてきた。おそらく、薬
剤による方法が現在目的となっている。」〔引用省略〕
と述べられている。
【００２８】ルンドブラッド（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）およ
びブラックバーン，セル（Ｃｅｌｌ）第７３巻，３４７
頁（１９９３年）には、酵母のテロメアの維持に関する
別の経路が議論されており、「．．．．．この論文の研
究は、テロメア複製の欠損は、必ずしもすべての細胞の
死滅を引き起こすものではないことを示している。そし
てテロメアの損失およびその哺乳動物細胞の老化との関
連が、さらに研究されなくてはならない。」と述べられ
ている。
【００２９】テロメアに関する他のレビュー論文として
は、ブラックバーンおよびソスターク（Ｓｚｏｓｔａ
ｋ），アニュ・レビ・バイオケミ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．）第５３巻，１６３頁（１９８４年）；
ブラックバーン，ネイチャー第３５０巻，５６９頁（１
９９１年）；グレイダー，セル第６７巻，６４５頁（１
９９１年）、およびモイジス（Ｍｏｙｚｉｓ），サイエ
ンティフィック・アメリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ａｍｅｒｉｃａｎ）第２６５巻，４８頁（１９９１年）
が挙げられる。テロメアの種々の態様についての関連論
文としては、クークおよびスミス，コールド・スプリン
グ・ハーバー・シンポジア・オン・クワンタテイティブ
・バイオロジー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ Ｑｕａｎｔａｔｉｖｅ
Ｂｉｏｌｏｇｙ）第ＬＩ巻，２１３〜２１９頁；モリン
（Ｍｏｒｉｎ），セル第５９巻，５２１頁（１９８９
年）；ブラックバーンら、ジェノム（Ｇｅｎｏｍｅ）第
３１巻，５５３頁（１９８９年）；ソスターク，ネイチ
ャー第３３７巻，３０３頁（１９８９年）；ゴール（Ｇ
ａｌｌ），ネイチャー第３４４巻，１０８頁（１９９０
年）；ヘンダーソン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）ら、バイオ
ケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２９巻，
７８３２頁（１９９０年）；ゴットシュリング（Ｇｏｔ
ｔｓｃｈｌｉｎｇ）ら、セル第６３巻，７５１頁（１９
９０年）；ハリントン（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ）および
グレイダー，ネイチャー第３５３巻，４５１頁（１９９
１年）；ムラー（Ｍｕｌｌｅｒ）ら、セル第６７巻，８
１５頁（１９９１年）；ユー（Ｙｕ）およびブラックバ
ーン，セル第６７巻，８２３頁（１９９１年）；および
グレイ（Ｇｒａｙ）ら、セル第６７巻，８０７頁（１９
９１年）が挙げられる。いくらか関連のある他の論文ま
たは議論としては、ルンドバルドおよびソスターク，セ
ル第５７巻，６３３頁（１９８９年）；およびユーら，
ネイチャー第３４４巻，１２６頁（１９９０年）が挙げ
られる。
【００３０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、テロメア長
およびテロメラーゼ活性の調節に関連した方法を用いる
細胞老化の治療および予防方法および不死化に関する。
本発明治療方法は、テロメアの繰り返し部分の長さの損
失の速度またはその損失の絶対量を減少させること、あ
るいは細胞増殖の間にテロメアの反復の長さを増加させ
ることにより、細胞の老化を遅らせ、そして染色体の融
合のレベルおよび他の染色体の変化を減少させることを
包含する。さらに、インビボまたはインビトロにおける
テロメラーゼ活性の阻害を用いて新生物および病原性伝
染病のごとき細胞の不死化に関連した疾患をコントロー
ルする。
【００３１】
【課題を解決するための手段】本発明は、試験化合物が
テロメラーゼ活性を調節するか否かを決定するためにス
クリーニングする方法であって、反応混合物中で、テロ
メラーゼ活性を含む調製物、テロメラーゼ活性により伸
長されることができる基質オリゴヌクレオチド、ヌクレ
オチド三リン酸、および試験化合物を合わせ；反応混合
物を、テロメラーゼ活性の調節剤の不在下で、基質オリ
ゴヌクレオチドがテロメラーゼ活性により伸長されて１
つまたはそれ以上のヌクレオシド三リン酸を取り込む条
件下でインキュベートし；基質オリゴヌクレオチドが伸
長されるか否かを決定し；そして基質オリゴヌクレオチ
ドの促進された伸長または伸長の阻害をテロメラーゼ活
性の調節と相関させる、の各工程を含む方法を提供す
る。
【００３２】本発明はまた、試験化合物がテロメラーゼ
活性を調節するか否かを決定するためにスクリーニング
する方法であって、試験化合物の存在下で、テロメラー
ゼ活性の調節剤の不在下でテロメラーゼ活性を妨害しな
い条件下でテロメラーゼ活性アッセイを実施し；試験化
合物がテロメラーゼ活性を調節するか否かを決定し；そ
して調節する場合には、試験化合物をテロメラーゼ活性
の調節剤として同定する、の各工程を含む方法を提供す
る。
【００３３】出願人は、インビトロにおけるテロメアの
短縮を抑制することが、偶然にも、細胞の複製的寿命の
長さの延長に関連していることを見いだした。出願人
は、インビトロにおける細胞のテロメラーゼ活性を阻害
することが、偶然にも、細胞の不死的方法での増殖能を
減少させることを見いだした。よって、出願人は、ま
ず、インビボまたはインビトロにおいてテロメアの短縮
を抑制すること、およびインビボまたはインビトロにお
いてテロメラーゼ活性を阻害することが治療的に有利で
あることを明確に示すデータを提供する。出願人の実験
以前には、上記したように、かかる実験が出願人により
観察されたデータを提供すること、あるいはかかる操作
が治療上有用であることを予測しうるという当業者の一
致した意見は得られていなかった。
【００３４】本発明はまた、テロメア長およびテロメラ
ーゼ活性を分析する診断的方法により細胞の状態を調べ
ること、すなわち細胞の増殖能の診断に関する。テロメ
ア長のアッセイを行いうること、多くの組織中の広範囲
なタイプの細胞の相対的年齢および残存する増殖能につ
いての有用な情報が提供される。出芽酵母のテロメアの
配列も記載する。該配列は、株によりさまざまである。
また、酵母株の迅速な同定、そしてヒトおよび動物の病
原体の場合には、その病原体株の診断を可能にするヌク
レオチドプローブの配列を提供する。
【００３５】テロメラーゼ活性および該酵素の存在を、
新生物の診断および段階付け、そして病原性伝染病の検
知のマーカーとして使用する。出願人は、最初に、テロ
メア長とインビボにおける細胞の加齢状態との関連のみ
ならずテロメラーゼ活性と腫瘍細胞の表現形との関連を
調べた。上記したように、当該分野においては、かかる
関連があるという一致した意見は得られていない。対照
的に、出願人は、この関連を明確にし、よって、つい
に、有用な臨床的データを調べるための有用な診断手段
を確立した。かかるデータを用いて治療プロトコールを
確立することができ、さもなくばかかるプロトコールは
無用なものとなる。
【００３６】よって、第１の態様において、本発明は、
細胞の老化または細胞の増殖速度の増加（例えば、テロ
メラーゼ不存在下での細胞増殖に関連したテロメアの反
復の損失）に関連した症状の治療方法を提供する。第１
の方法は、細胞増殖中にテロメアの反復の損失を減少さ
せる活性のある治療上有効量の薬剤を細胞に投与するこ
とを包含する。かかる治療薬は、特に、上昇した細胞増
殖速度の症状に適用することができる。
【００３７】細胞の「上昇した増殖速度」は、細胞が、
当該タイプの正常細胞と比較して、あるいは当該タイプ
の細胞の他の個体に含まれる正常細胞と比較して大きな
増殖速度を有することを意味する。かかる細胞の例とし
ては、ＨＩＶ感染個体のＣＤ４+細胞（下記実施例参
照）、退行性関節疾患に関連した結合組織繊維芽細胞、
老化に関連した黄斑変性、アルツハイマー症に関連した
星状細胞、およびアテローム性動脈硬化に関連した内皮
細胞（下記実施例参照）が挙げられる。それぞれの場
合、ある種の特別な形態の細胞または細胞群が、その周
辺の組織の細胞と比較して、あるいは正常個体（例えば
ＨＩＶウイルスに感染していない個体）と比較して増大
したレベルで増殖していることが見いだされる。よっ
て、本発明は、それらの細胞が増殖している間、それら
の細胞におけるテロメア長の損失を減少させる薬剤をそ
れらの細胞に投与することを特徴とする。薬剤自身は増
殖過程を遅くする必要はないが、むしろ、該薬剤の不存
在下で観察されるよりも多くの細胞分裂のために増殖過
程を継続させる必要がある。また該薬剤は、正常な加齢
が起こっている間（細胞は正常な速度で増殖し、生涯の
後半に老化する）におけるテロメアの反復の損失の遅延
に有用であり得るし、細胞に基礎を置く治療（例えば、
遺伝子治療の後の骨髄移植）のために、エクスビボ（ｅ
ｘ ｖｉｖｏ）で細胞数が増加している一方でテロメア
の反復の損失を減少させることに有用でありうる。
【００３８】本明細書記載のごとく、当業者は、常用さ
れるスクリーニング法を用いて、有用な薬剤を容易に同
定できる。例えば、既知のテロメア長を有する特定の細
胞を選択し、増殖させ、増殖中のテロメア長を測定す
る。かかる増殖中のテロメア長の損失を減少させること
が示されている薬剤は本発明に有用である。かかる薬剤
に関する特定の実施例を下記に示す。例えば、テロメア
末端においてＤＮＡ合成を促進しうるオリゴヌクレオチ
ドは本発明に有用である。さらに、遺伝子治療法、ある
いはテロメラーゼまたはその等価物を細胞に投与するこ
とのいずれかにより（例えば、注射またはリポジェクシ
ョン（ｌｉｐｏｊｅｃｔｉｏｎ）により）、テロメラー
ゼを細胞に添加することができる。
【００３９】細胞の老化を治療する第２の方法は、テロ
メラーゼが通常は抑制されている細胞においてテロメラ
ーゼを脱抑制する薬剤の使用を包含する。テロメラーゼ
活性は、ヒトのいかなる体細胞においても検出されない
が、正常細胞が不死細胞へと形質転換されている間に該
酵素が異常に再活性化された細胞において検出されう
る。それゆえ、テロメラーゼ活性は、胚系細胞およびあ
る種の幹細胞において適当に存在しうる（現在、ヒト組
織においては、後者に存在する証拠はない）。体細胞を
老化に導くテロメアの繰り返し部分の損失は、十分なテ
ロメラーゼ活性がないことにより引き起こされるので、
テロメラーゼを活性化する効果のある薬剤が、テロメア
の反復配列をテロメアに付加する効果を有する。それに
より、死ぬべき体細胞が複製能を与えられ、老化細胞に
増殖能が与えられて、その細胞周期から出ることができ
るようになる（典型的に不適当に老化細胞中で発現され
たコラゲナーゼ、ウロキナーゼおよび他の分泌性プロテ
アーゼならびにプロテアーゼインヒビターのごとき細胞
周期に関連した遺伝子の適当な調節に関連した増殖因子
の刺激の不存在下で）。テロメラーゼを脱抑制するかか
る因子を一時的または長期的に投与してテロメア長を増
加させ、ついで、これを除去し、これにより体細胞が本
来の抑制機構を用いて再び該酵素の発現を抑制するよう
にすることができる。
【００４０】かかるテロメラーゼ活性化剤を、ヒト・細
胞を用いてＳＶ４０ Ｔ−抗原の発現により老化のＭ１
機構を廃棄するスクリーニング法により見いだすことが
できる。かかる細胞は、Ｍ２機構がその増殖をさまたげ
ているような危機的状況で増殖させた場合、テロメラー
ゼを脱抑制する薬剤に応答して増殖するであろう。かか
る活性を、放射性標識したヌクレオチドの取り込みとし
て評価するか、または増殖しているクローンをコロニー
形成アッセイにて選択することができる。
【００４１】かかるテロメラーゼ活性化剤は、細胞の老
化を遅らせ、または逆行させるための治療薬として有用
であろう。しかし、細胞の老化に関連した症状に限定さ
れない。細胞としては、例えば，（ａ）アルツハイマー
症、パーキンソン病、ハンチントン病、および卒中のご
とき加齢に関連した疾患において役割を演じる星状細
胞、内皮細胞および線維芽細胞をはじめとする中枢神経
系における複製能を有する細胞、（ｂ）皮膚の萎縮、弾
性組織分解および皮膚のしわ、皮脂腺の過血漿、老人性
ほくろ、白髪および脱毛、慢性皮膚潰瘍のごとき加齢に
関連した外皮疾患、および加齢に関連した傷の治療不全
において役割を演じうる線維芽細胞、皮脂腺細胞、メラ
ノサイト、ケラチノサイト、ランゲルハンス（Ｌａｎｇ
ｅｒｈａｎ’ｓ）細胞、および毛包細胞をはじめとする
外皮において有限の複製能を有する細胞、（ｃ）変質性
関節疾患において役割を演じうる軟骨細胞および間隙な
らびに滑液線維芽細胞のごとき関節の軟骨において有限
の複製能を有する細胞、（ｄ）骨粗鬆症において役割を
演じる骨芽細胞および骨前駆細胞のごとき骨において有
限の複製能を有する細胞、（ｅ）加齢に関連した免疫系
損傷において役割を演じうるＢおよびＴリンパ球、単
球、好中球、好酸球、好塩基球、ＮＫ細胞ならびにそれ
らの前駆細胞のごとき免疫系において有限の複製能を有
する細胞、（ｆ）アテローム性動脈硬化、カルシウム沈
着、血栓、および動脈瘤をはじめとする加齢に関連した
血管系疾患において役割を演じうる内皮細胞、平滑筋細
胞、および外膜の線維芽細胞をはじめとする血管系にお
いて有限の複製能を有する細胞、および（ｇ）加齢に関
連した黄斑変性において重要な役割を演じうる色素上皮
および内皮細胞のごとき目において有限の複製能を有す
る細胞も包含される。
【００４２】第２の態様において、本発明は、細胞中の
テロメラーゼ活性の上昇したレベルに関連した症状の治
療方法を提供する。該方法は、治療上有効量のテロメラ
ーゼ活性阻害剤を細胞に投与することを包含する。
【００４３】下記のごとく、または他の現存する方法、
あるいは等価な方法により、テロメラーゼ活性のレベル
を測定することができる。かかる活性の「上昇したレベ
ル」は、その個体における正常細胞と比較して、あるい
は当該症状に苦しんでいない他の個体における正常細胞
と比較して、個々の細胞における絶対的なテロメラーゼ
活性のレベルが上昇していることを意味する。かかる症
状の例としては、癌の症状、または通常はその個体に存
在しない伝染性原虫または通性病原体のごとき細胞（そ
の継続的複製のためにはテロメラーゼ活性を必要とす
る）の存在に関連した症状が挙げられる。阻害剤の投与
を、当業者に知られたいかなる所望の方法により行って
もよい。
【００４４】さらに、阻害剤の「治療上有効量」は、十
分に知られた言い回しである。実際に適用される量は、
治療される個人または動物による。好ましくは、有意な
副作用なしに阻害効果が達成されるように量を最適化す
る（該阻害剤の使用により副作用が生じない程度とす
る）。すなわち、一定濃度の該阻害剤による副作用を伴
わずに効果的な阻害が得られるならば、副作用が明確と
なるより高い濃度に対するものとして、その濃度を使用
するべきである。しかしながら、副作用が回避できない
場合は、所望の阻害が達成されるのに必要な最少量の阻
害剤を使用することができる。
【００４５】「阻害剤」は、単に、インビボまたはイン
ビトロにおいてテロメラーゼ活性を阻害しうるすべての
薬品、薬剤、または化学試薬を意味する。テロメラーゼ
活性を有する細胞抽出液または他の標品を、潜在能力の
ある阻害剤に接触させて、ついで、該阻害剤の存在下ま
たは不存在下、あるいは種々の濃度の阻害剤の存在下で
テロメラーゼ活性を測定するスクリーニングのプロトコ
ールを用いて、かかる阻害剤を容易に同定することがで
きる。このようにして、有用な阻害剤を見いだすことが
できるのみならず、かかる阻害剤の最適レベルを、さら
なるインビボ試験のためにインビトロにおいて決定する
ことができる。
【００４６】適当なテロメラーゼ阻害剤のアッセイの一
例を、９６ウェルのマイクロタイタープレート中で行
う。１個のマイクロタイタープレートを用いて試験化合
物の希釈を行い、もう１つのプレートで実際のアッセイ
を行う。各試料につき２系の反応を行う。適量の緩衝
液、鋳型オリゴヌクレオチド、および試験すべき試料数
のテトラヒメナまたはヒトのテロメラーゼ抽出液を含有
する混合物を調製し、その一部をアッセイプレートに入
れる。試験化合物を徐々に添加し、プレートを３０℃で
プレインキュベーションする。ついで、32Ｐ−ｄＧＴＰ
を添加し、３０℃で１０分間反応を進行させる。個々の
反応物の総体積は１０μｌである。ついで、Ｔｒｉｓお
よびＥＤＴＡの添加により反応を停止し、その半量（５
μｌ）をＤＥ８１濾紙にスポットする。試料を風乾し、
濾紙を０．５Ｍリン酸ナトリウム中で数回濯いで取り込
まれなかった標識ヌクレオチドを洗い落とす。乾燥後、
濾紙をホスファー・イメイジング・プレート（ｐｈｏｓ
ｐｈｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｐｌａｔｅ）に暴露し、シ
グナルを定量する。対照試料と個々の試験試料のシグナ
ル量を比較することにより、阻害のパーセント値を決定
することができる。
【００４７】さらに、多くの潜在的に有用な阻害剤を、
単一の試験でスクリーニングすることができる。なぜな
らば、所望なのはテロメラーゼ活性の阻害だからであ
る。よって、１０００種の阻害剤のパネルをスクリーニ
ングする場合、１０００種すべての阻害剤をマイクロタ
イタープレートに置くことが可能である。かかる阻害剤
を発見したならば、１０００種のプールを１００種ずつ
１０個のプールに分け、個々の阻害剤が確認されるまで
該方法を繰り返す。本明細書記載のごとく、特別に有用
な１セットの阻害剤は、テロメラーゼ中に存在するＲＮ
Ａに結合しうるかまたは該ＲＮＡをそのＤＮＡ標的ある
いはテロメラーゼ蛋白成分の１つに結合させないでおく
ことのできるオリゴヌクレオチドを包含する。テロメラ
ーゼ中に存在するＲＮＡの阻害または開裂を引き起こす
ヌクレオチドがさらに好ましい。すなわち、かかるオリ
ゴヌクレオチドは化学的に修飾されているかまたはかか
る開裂を引き起こす酵素活性を有しているのである。上
記スクリーニングは、異なる多くのかかるオリゴヌクレ
オチド配列のプールのスクリーニングを包含する。
【００４８】さらに、多くの潜在的に有用な化合物を、
天然生産物からの抽出物中においてスクリーニングする
ことができる。かかる抽出物の起源は、多種の菌類、放
線菌、藻類、原虫、植物および細菌であってよい。つい
で、阻害活性を示すそれらの抽出物を分析して当該活性
分子を単離することができる。
【００４９】関連した態様において、本発明は、医薬上
許容される緩衝液中に治療上有効量の上記阻害剤または
上記薬剤を含有する医薬組成物を提供する。これらの医
薬組成物は、１種またはそれ以上のこれらの阻害剤また
は薬剤を含有していてもよく、他の医薬と同時投与して
もよい。例えば、ＡＺＴはＨＩＶの治療に通常用いられ
るのであるが、これを本発明阻害剤または薬剤と同時投
与してもよい。
【００５０】関連した態様において、本発明は、細胞の
複製能を高める方法を提供する。この方法において、複
製能を高める量の、細胞中のテロメア長の損失を抑制す
る活性のある薬剤を、細胞増殖の間において提供する。
この薬剤は、細胞の上昇した増殖速度に関連した症状の
治療に有用な薬剤と同様なものである。しかしながら、
この方法は何等特別な症状に苦しんでいない個体の治療
に有用であるが、該方法においては、当該患者において
１種またはそれ以上の形態の細胞に限定され、当該細胞
の複製を続ける能力を高めることによりその患者の寿命
が延長される。すなわち、薬剤を添加して、当該細胞が
個体中でさらに複製を続けることができないことにより
特徴づけられる細胞の老化の発生を遅らせる。かかる一
群の細胞の一例としては、ダウン症候群の患者中のリン
パ球が挙げられる（かかる細胞の治療もまた何等特別な
症状または疾患に苦しんでいるとは認められないのでは
なくて単に１種またはそれ以上の細胞あるいは細胞の集
合が当該個体の寿命を限定するようになっていることが
認められる個体において有用である）。
【００５１】かかる阻害剤または薬剤の投与は、いかな
る特定の個体に対しても有害であるとは考えられないと
いうことに注目すべきである。しかしながら、遺伝子治
療を用いてテロメラーゼを何等かの特定の細胞群に導入
するか、あるいは他の手段を用いて体細胞中のテロメラ
ーゼ活性を可逆的に脱抑制するべきである。例えば、患
者の食事により調節されうるプロモーターの使用によ
り、当該テロメラーゼ活性が注意深く調節されているこ
とを確認するために注意を払うべきである。よって、例
えば、患者が特定の食事を摂取した場合に該プロモータ
ーが活性化され、特定の食事を摂取しない場合には該プ
ロモーターは不活性であるようにする。このようにし
て、細胞が悪性化した場合に、個体は、それ以上かかる
食事を摂取しないことにより容易に細胞のテロメラーゼ
を不活性化させ、簡単に当該細胞を死滅させることがで
きる。
【００５２】さらなる態様において、本発明は、細胞中
のテロメラーゼ活性の上昇したレベルに関連した患者の
症状の診断方法を提供する。該方法は、当該患者の細胞
中のテロメラーゼの存在または量を調べることを包含す
る。
【００５３】さらに別の態様において、本発明は、個体
中の当該細胞の増加した増殖速度に関連した症状の診断
方法を提供する。詳細には、該方法は、細胞中のテロメ
ア長を調べることを包含する。
【００５４】診断が可能な種々の条件は前記した。後記
にて例示するごとく、患者における細胞内のテロメラー
ゼの存在またはその量を測定するための、および該細胞
内のテロメアの長さを測定するための多くの方法が存在
する。テロメラーゼの存在またはその量は、個々の細胞
内で、かつ（それが１の特定酵素または複数の酵素によ
って引き起こされるか否かに拘らず）いずれの個々のテ
ロメラーゼ活性についても測定できることは明らかであ
ろう。当業者ならば、細胞内、または個体内に存在する
テロメラーゼの各タイプの間を区別するための抗体また
はその同等物を容易に処方できるであろう。加えて、テ
ロメアの長さは平均長として、または後記するごとき長
さの範囲として決定できる。これらの各測定により、い
ずれの特定の個体の状態に関しても正確な情報を得るこ
とができるであろう。
【００５５】かくして、出願人の発明は、２つの選択技
−診断的および治療的選択技を有する。これらを詳細に
議論する。
【００５６】本発明の治療的選択技は、不死のままでい
る細胞の能力は、その細胞がその細胞内の染色体のテロ
メアの長さを維持または増大させる能力に存するという
今回の明らかな観察に関係する。かかるテロメアの長さ
は、細胞内のテロメラーゼ、または同等の酵素の十分な
活性の存在によって維持できる。かくして、細胞が不死
のままでいる潜在能力を減少させることに対する治療的
アプローチは、細胞の死滅を引き起こすが望ましいそれ
らの細胞内のテロメラーゼ活性の阻害に焦点を当てるも
のである。かかる細胞の例は癌細胞を包含し、これは、
テロメラーゼを発現する能力を獲得して不死となった体
細胞の一例である。今や、出願人は、かかる細胞は、テ
ロメラーゼ活性の阻害によってもう１回死すべきものと
できることを示した。それ自体、阻害は、後記するごと
く、何らかの方法によって、テロメアをｉｎ ｖｉｖｏ
にて伸長するテロメラーゼの能力を阻止するオリゴヌク
レオチドの使用を含めた種々の方法で達成できる。
【００５７】かくして、オリゴヌクレオチドはテロメア
に結合して（そのテロメアに結合し、それにより、その
テロメアを伸長させるテロメラーゼの能力を阻止する
か、）、あるいはテロメラーゼに存在する定住オリゴヌ
クレオチド（ＲＮＡ）に結合して、それにより、いずれ
かの核酸（テロメア）に対するテロメラーゼを阻害する
ように設計できる。かかるオリゴヌクレオチドは天然に
存在するヌクレオチドから形成できるか、あるいは治療
剤の安定性を向上させるか、またはテロメラーゼの永久
的な不活化、例えば、テロメラーゼと共有結合を形成で
きる反応性基でもって、ヌクレオチド分子の３’末端に
停止ヌクレオチドを位置させることを引き起こすための
修飾したヌクレオチドを包含する。かかる分子はリボザ
イム配列も包含する。加えて、非オリゴヌクレオチドに
基づく療法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでテロメラーゼ活性を
阻害する能力を有する分子をスクリーニングし、次い
で、その分子をｉｎ ｖｉｖｏで使用することによって
容易に行うことができる。かかるスクリーニングは容易
になされ、多数の有用な治療上の分子を提供するであろ
う。これらの分子は、固形の腫瘍および白血病（アプド
ーマ（ａｐｕｄｏｍａ）、分離腫、鰓腫、悪性カルチノ
イド症候群、カルチノイド心臓病、癌腫（例えば、ウォ
ーカー（Ｗａｌｋｅｒ）、基底細胞、基底有さく細胞、
ブラウン−ペアス（Ｂｒｏｗｎ−Ｐｅａｒｃｅ）、管、
エーリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）腫瘍、ｉｎｓｉｔｕ、ク
レブス（Ｋｒｅｂｓ）２、メルケル細胞、ムチン様、非
小（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ）細胞肺、燕麦細胞、乳頭様、
硬性癌、細気管腫支、気管支原性、鱗状細胞、および移
行性細胞）、組織球障害、白血病（例えば、ｂ細胞、混
合細胞、ナル細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞慢性、ＨＴＬＶ−Ｉ
Ｉ関連、リンパ球急性、リンパ球慢性、肥満細胞、およ
び骨髄様）、組織球症悪性、ホジキン病、免疫増殖小、
非ホジキン病リンパ腫、形質細胞腫、網内皮症、黒色
腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉
腫、巨大細胞腫瘍、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮
腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉
腫、滑膜腫、腺線維腫、腺リンパ腫、癌肉腫、脊索腫、
頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉腫、中腎
腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント腫、歯牙腫、奇
形腫、胸腺腫、栄養膜腫、腺癌、腺腫、胆管癌、コレス
テリン腫、円柱腫、嚢腫癌、嚢腺腫、顆粒層細胞腫瘍、
男女性胚細胞腫、肝癌、汗腺腫、島細胞腫、ライジッヒ
細胞腫瘍、乳頭腫、セルトリ細胞腫瘍、胞膜細胞腫瘍、
平滑筋腫、平滑筋肉腫、骨髄芽球腫、筋腫、筋肉腫、黄
紋筋腫、黄紋筋肉腫、脳室上衣細胞腫、節筋肉腫、神経
膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽細胞腫、
神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、傍神経
節腫ノンクロマフィン（ｎｏｎｃｈｒｏｍａｆｆｉ
ｎ）、角化血管腫、好酸球増加を伴う血管リンパ球過形
成、血管腫硬化、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮
腫、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、
リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨
肉腫、嚢肉腫葉状、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、
白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉
腫、卵巣癌、黄紋筋肉腫、肉腫（例えば、ユーリング、
実験的、カポシ、および肥満細胞）、新生物（例えば、
骨、胸、消化系、結腸直腸、肝臓、すい臓、下垂体、精
巣、眼窩、頭部および首、中枢神経系、聴覚、骨盤、気
管、および尿生殖器）、神経線維腫症、および頚形成異
常）を含めた、細胞が不死となるものを含む）を包含す
るいずれものタイプの癌の治療、および細胞が不死とな
る他の疾患の治療にも用いることができる。
【００５８】また、出願人は、特にある種の病気と関連
する細胞でのテロメア配列の喪失を遅くするのが重要で
あると判断した（かかる治療はこれに限られず、通常の
老化およびｅｘ ｖｉｖｏ治療で使用できるが）。例え
ば、いくつかの病気は、細胞の１またはそれを超える特
別のグループの異常に速い増殖速度によって発現され
る。出願人は、結局はその患者が死亡に至るのは、（患
者の年齢と比較した）異常に早期の年齢におけるその細
胞のグループの老化であると判断した。かかる病気の１
の例はエイズであり、そこでは、死亡はＣＤ４+細胞の
早期老化によって引き起こされる。テロメア配列の異常
な喪失ではなく（これは因子であるかも知れないが）、
むしろＣＤ４+細胞の複製速度のため、かかる細胞の年
齢は増加し、テロメアの消耗がそのグループの細胞につ
いて通常よりも速い速度で引き起こされるのが重要であ
ることに注意すべきである。かくして、出願人は、かか
る病気の治療で用いることができる治療剤を提供し、ま
た、適当な治療プロトコルがつくられ、進展されるよう
に同様の病気がそれにより検出できる関連した診断手法
を提供する。
【００５９】特に、いずれかの特定の細胞集団内のテロ
メアの喪失は、細胞分裂の間のテロメア消耗の程度を減
少させるオリゴヌクレオチドを供することによって低減
化でき、かくして、細胞が老化する前に起こり得る細胞
分裂の数を増大させる。テロメアの喪失を減少させるた
め、あるいはその細胞を不死とするために、他の試薬、
例えば、テロメラーゼを細胞内に供することができる。
当業者ならば、他の酵素活性を用いて、例えば、テロメ
アーゼを活性するか、あるいは細胞内でテロメアの配列
を合成するように機能させるある種のウイルス配列を供
することによって、かかる細胞内のテロメアを長くする
ことを促進できることを認識するであろう。加えて、同
等のかかる分子、または他の分子を容易にスクリーニン
グしてテロメアの喪失を減少させるものを決定できる。
かかるスクリーニングはｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことが
でき、前記ｉｎ ｖｉｖｏで利用したスクリーニングに
よって治療剤が発見された。
【００６０】他の治療処置は、菌類グループ、特に、い
くつかの病原を含む出芽酵母のグループであるカンジダ
・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎ
ｓ）、カンジタ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒ
ｏｐｉｃａｌｉｓ）およびカンジダ・パラトロピカリス
（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、な
らびに非病原性菌類における異常なテロメアＤＮＡ配列
の発見に関する。これらの結果を以下に詳細に記載す
る。薬物または化学剤を用いて真菌類のテロメアＤＮＡ
の異常な性質を特に開発することができる。これは、こ
れら、およびいずれかの関連病原においてテロメア合成
を阻止するために、テロメア反復ＤＮＡ配列に特異的な
アンチセンスポリヌクレオチドの導入を含む。かかる阻
止は菌類の死滅に導く。
【００６１】これらの菌類におけるテロメアＤＮＡの異
常な性質のため、このアプローチは有利である。これら
の菌類のテロメア反復の異常に高いＤＮＡ配列の複雑さ
は、抗菌類剤または該アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮ
Ａの、特異性および最小副作用の可能性を与える。
【００６２】潜在的に有用な抗菌類剤である薬剤は：Ａ
ＺＴ、ｄ４Ｔ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、およびｄｄＡを包含す
る。これらの菌類のテロメア合成はこれらの薬剤に対す
る異なる阻害を示し、ある場合には、ヒトもしくは他の
動物または植物宿主細胞におけるテロメア合成よりも感
受性となることが予測される。
【００６３】本発明者らは、生きている菌類細胞でアン
チセンス技術を使用する予備テストを行った。カンジダ
・アルビカンス染色体ＤＮＡの領域の側にある保存され
た配列に埋設された、テロメアＤＮＡ配列の４０ｂｐの
ストレッチを環状分子に乗せてカンジダ・アルビカンス
細胞に導入した。形質転換された細胞は高コピー数の導
入テロメア細胞ＤＮＡ配列を有していた。形質転換体の
１０％はテロメアＤＮＡの長さを大いに増大された（〜
３倍）。この結果は、テロメアＤＮＡは、テロメア配列
ポリヌクレオチドの細胞への導入によってｉｎ ｖｉｖ
ｏで調節できることを示す。これは、それが所望の活性
を有することを保証するための特定のオリゴヌクレオチ
ドをテストする要求を示す。
【００６４】診断手法に関し、かかる手法の例は、治療
に関する前記議論から明らかとなる。出願人は、テロメ
アの長さは、そのテロメアを含有する細胞、およびその
細胞を含有する個体の寿命の指標となると判断した。か
くして、テロメアの長さは個体細胞の寿命に直接相関す
る。前記したごとく、細胞のある種の集団は、個体内の
他の細胞よりも大きい速度でテロメアを喪失し得、また
それらの細胞はかくして個々の生物内で年齢を限定する
ものとなる。しかしながら、今や、いずれかの個々の細
胞タイプの可能な寿命を示し、その寿命に対する訂正さ
れた評価を経時的に共に行うことができるようにテロメ
アの喪失を追跡するのに使用できる診断手法が（本明細
書に記載したごとくに）開発できる。
【００６５】ある種の病気、例えば、前記したエイズに
おいては、勿論、ＣＤ４+細胞におけるテロメアの長さ
を追跡するのが重要であろう。加えて、ＣＤ４+細胞は
かかる個体において限定的であるという認識は、エイズ
がまず検出され、貯蔵箇所（ｂａｎｋ）に貯蔵され、次
いで、その個体がもはや必要な利用可能なＣＤ４+細胞
を持たない後の年齢にて当該個体に再導入される場合
に、早期の年齢において個体からＣＤ４+細胞が除去で
きるという治療プロトコルの設計を可能とする。これら
の細胞は、テロメア反復の喪失を遅延させる剤、例え
ば、テロメアーゼを一次的に脱抑制して、個体に再投与
された細胞が最大複製能を有することを保証するための
Ｃ−リッチなテロメリック・オリゴヌクレオチドもしく
は薬剤の存在下で数を増やすことができる。かくして、
個体の寿命は、適当な時点におけるその個体の限定的細
胞の継続的投与を含むプロトコルによって延長させるこ
とができる。これらの適当な時点は、ＣＤ４+細胞老化
を追跡することによって、あるいは（細胞が老化した時
の指標として）かかるＣＤ４+細胞内のテロメアの長さ
を測定することによって決定することができる。エイズ
の場合、依然複製能を有する骨髄幹細胞と共に末梢血液
リンパ球において老化テロメアの長さの起伏があり得
る。このように、細胞が老化するまで待ち（それによ
り、個体を死滅の危険にさらす）よりもむしろ、テロメ
アの長さが予め老化であると決定されたものを下回って
減少するまで該長さを追跡し、それにより、新しいＣＤ
４+細胞またはコロニー刺激因子の投与のタイミングを
最適化することができる。
【００６６】かくして、本発明の診断手法は、異なる細
胞集団におけるテロメアの長さを測定して、いずれの特
定の細胞集団が個体の寿命において限定的であるかを決
定し、次いで、かかる細胞がもはやその個体にとって限
定的でないことを保証する治療プロトコルを決定する手
法を包含する。加えて、前記したごとく、特異的な薬物
を投与して、テロメアの長さの喪失が減少するのを保証
することによって、かかる細胞集団を特異的に標的化す
ることができる。
【００６７】他の診断手法は、個体内の不死細胞の存在
の指標としてのテロメアーゼ活性の測定を含む。かかる
不死性のより正確な測定は、テロメアーゼ酵素それ自体
の存在である。かかる酵素は、テロメアーゼ活性のアッ
セイを含む標準的な手法を用いるが、テロメアーゼに対
する抗体も用いることによって、あるいはテロメアー
ゼ、またはテロメアーゼ蛋白のｍＲＮＡについてのＤＮ
ＡもしくはＲＮＡプローブに存在する核酸（鋳型ＲＮ
Ａ）にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの使用に
よって容易に検出することができる。免疫組織化学およ
びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術により、
診断および予後徴候テストのために組織学的検体中のテ
ロメアーゼ陽性細胞の正確な同定が可能となる。テロメ
アーゼの存在は、不死であってしばしば転移性である細
胞の指標であり、かかる診断剤はかかる転移性細胞を正
確に決定することを可能とし、ましてや、ＣＤ４４はそ
うであると主張されている。レフ（Ｌｅｆｆ）、３（２
１７）バイオワールド・トゥデイ（ＢｉｏＷｏｒｌｄ
Ｔｏｄａｙ）１、３、１９９２参照。
【００６８】本発明の診断方法は、ある個体がある病気
においてどれ位進行しているかを決定するための第１の
真実の方法を提供する。例えば、エイズ病において、こ
れは、ＨＩＶ陽性個体が免疫無防備状態となった時点に
おける事前投与を可能とする最初の方法である。この情
報は、ＡＺＴ投与のごとき薬物投与のタイミングを決定
するのに有用であり、新しい薬物投与法または療法の開
発の助けとなる。加えて、ある種の薬物の投与の最適タ
イミングの決定は個体の治療費用を低減化させ、薬物が
個体にとって毒性となる機会を減少させ、また、個体が
かかる薬物に対して耐性となる可能性を低下させる。
【００６９】他の関連態様において、本発明は、老化し
つつある細胞においてテロメラーゼを抑制する活性のあ
る薬剤の治療上有効量を投与することによって、細胞老
化に関連する病気または疾患を治療することをその要旨
とする。関連態様は、潜在的薬剤をテロメラーゼ活性を
欠く細胞と接触させ、次いで、該薬剤がテロメラーゼ活
性のレベルを増大させるか否かを、例えば、誘導性Ｔ抗
原を発現する細胞を用いることによって決定することに
よる、テロメラーゼ抑制剤のスクリーニングを含む。か
かるアッセイは、組合せライブラリーに存在する、ある
いは癌原性物質であることが知られている薬剤の迅速な
スクリーニングを可能とする。
【００７０】出願人は、公知の薬剤はテロメラーゼそれ
自体において、あるいはテロメラーゼを発現する遺伝子
において活性であるので、癌の治療で有用であることを
認識している。かくして、かかる薬剤は、本発明におい
て、効果的であることが従前知られていなかった病気ま
たは疾患で有用であると確認される。事実、治療の２４
〜４８時間後においてのみ細胞の生存に対してほとん
ど、あるいはあったとしても少ししか効果がない故に従
前は利用性を欠くと考えられていた薬剤は、もしそれが
ｉｎ ｖｉｖｏでテロメラーゼに対して活性であり、か
くして、数回の細胞分裂の後においてのみ細胞生存に影
響するならば、利用性を有すると示すことができる。
【００７１】本発明の他の特徴および利点は、好ましい
具体例および請求の範囲の記載から明らかであろう。
【００７２】
【発明の実施の形態】テロメアおよびテロメラーゼ すべての正常なジプロイド脊椎動物細胞は限定された増
殖能、すなわち、Ｈａｙｆｌｉｃｋ限定または複製的老
化として知られるに至った現象を有する。ヒト繊維芽細
胞において、この限定は５０〜１００回の集団倍加の後
に起こり、その後、細胞は生きたままであるが、何カ月
も分裂しない老化状態にとどまる。これは、その増殖能
を限定する制御から逃れ、効果的に不死となるほとんど
の癌細胞の挙動とは対照的である。
【００７３】細胞の老化の原因を説明する１つの仮説
は、テロメアと呼ばれる染色体末端の役割に関する。該
仮説は、体細胞はＤＮＡ分子のまさに末端を複製する能
力を欠くというものである。この結果、いくつかの機能
が変化し、その時点で細胞が増殖能を失うまで染色体の
端部は徐々に短くなる。
【００７４】ＤＮＡポリメラーゼは５’から３’の方向
にＤＮＡを合成し、合成を開始するのにプライマーを必
要とする。このため、「ラギング鎖」は直線状の染色体
のまさに末端までは複製しない。かくして、染色体は各
細胞分裂に伴い短くなる。染色体の末端はテロメアと呼
ばれ、長いＴＴＡＧＧＧ反復よりなる。酵素テロメラー
ゼはテロメリックＤＮＡの３’末端にＴＴＡＧＧＧ反復
を付加することができ、かくして、当該ＤＮＡを延長
し、短縮化を防ぐ。
【００７５】生殖細胞系は長いテロメアおよび活性なテ
ロメラーゼを有する。体細胞はテロメラーゼ活性を欠
き、そのテロメアはｉｎ ｖｉｖｏおよび培養双方にお
いて細胞分裂に伴って短くなることが判明している。癌
細胞は不死であり、テロメラーゼ活性を獲得しており、
かくして、その染色体の端部を維持できる。テロメアの
短化およびテロメラーゼの活性が細胞の老化および不死
化における鍵となる因子であることを示す明確な実験を
以下にて示す。
【００７６】方法 前記したごとく、本発明は、テロメア長を測定し、テロ
メラーゼ依存性伸張またはテロメラーゼ非依存性短縮化
を測定することに関連する診断および治療に関する。本
発明はヒトに指向されるが、他の動物、特に、他の霊長
類のごとき哺乳動物、およびウマ、ウシ、鳥、ヒツジ、
ブタ、ネコ、およびイヌのごとき家畜に適用することも
できる。本発明は治療および診断双方で用いることがで
きる。治療の場合、例えば、テロメアの短縮化は、テロ
メラーゼ活性またはその機能的同等物を再活性化もしく
は導入することによるＤＮＡオリゴヌクレオチドを供す
ることによって遅らし、また阻止することができ、ある
いは無限増殖はテロメラーゼを阻害することによって低
減化することができる。診断の場合、特定の染色体また
は染色体群に関してテロメアの長さ、あるいはテロメア
の平均長を検出できる。また、診断はテロメラーゼの活
性、あるいは細胞、組織等において蛋白またはＲＮＡレ
ベルについての酵素の成分の存在を測定することに関連
する。
【００７７】相対的年齢、残存する増殖能、ならびにテ
ロメアおよびテロメラーゼの状態に関する他の細胞の特
徴についての情報は、胚細胞、他の幹細胞、（肝硬変の
文脈における肝細胞のごとき）体細胞、（繊維芽細胞、
軟骨細胞、および骨芽細胞のごとき）結合組織細胞、
（内皮細胞および平滑筋細胞のごとき）血管細胞、（脳
星状細胞のごとき）中枢神経系に存在する細胞、および
種々の新生物組織、および増殖性細胞の残存する複製能
および増殖潜在性を予測するための不死増殖についての
その能力の双方を測定するのが望ましい寄生虫病原のよ
うな広範囲の細胞型および組織で得ることができる。
【００７８】テロメア長の維持 ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞で
のテロメア長は、有用には、種々の手法によって維持で
きる。これらは、後記にて例示する方法を包含する。し
かしながら、これらの例は本発明では非限定的である。
というのは、当業者ならば同等の方法を認識するであろ
うからである。すべての方法は、テロメア長を維持する
のに有用であることが予測され、出願人は今回これを実
験的に証明した。かかる方法はオリゴヌクレオチド、ま
たはテロメアに干渉して細胞分裂の間における短縮化を
防ぐ薬剤の提供に基づき得るものである。加えて、該方
法は短縮化を防ぐために細胞内でテロメラーゼまたはそ
の同等活性を包含する薬剤での処理を含む。最終的に、
該方法は、細胞の老化に関連した遺伝子発現の調節も包
含する。
【００７９】有用な薬剤は、ルーチン的なスクリーニン
グ手法によって決定できる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
系にてテロメアに干渉し、テロメア端部の喪失を阻止す
るか、あるいはテロメア長の増大を助ける薬剤をスクリ
ーニングすることによる。かかる方法の非限定的例を以
下に述べる。テロメア端部の短縮化が細胞分裂の間に減
少するか否かを決定するアッセイが必要なだけである。
所望の結果が得られる限り、かかる薬剤が作用するメカ
ニズムは知られている必要はない。しかしながら、有用
な標的遺伝子（例えば、Ｍ２死滅調節遺伝子）を同定す
ることによって、アンチセンスおよび同等の手法を、所
望の遺伝子の発現または非発現（例えば、テロメラーゼ
の脱抑制）をより適当に引き起こすように設計すること
ができる。
【００８０】特別の例において（本発明では非限定
的）、細胞へのプライマーとして、核酸、例えば（修飾
形態も含めた）ＤＮＡもしくはＲＮＡを提供することに
よって、テロメアの短縮化速度を低減化させることがで
きる。かかる核酸は、通常、２〜３個の反復、より通常
には２個の反復を包含するが、そこでは、該反復はＤ−
リッチＤＮＡテロメア鎖と相補的である。かかるオリゴ
ヌクレオチドは細胞の増殖能を拡大するのに使用でき
る。
【００８１】自然に（例えば、特別の修飾無しに）、ま
たは細胞膜と融合するリポソームを使用することによっ
て、オリゴヌクレオチドを細胞質に移入することができ
るか、あるいは細胞の表面膜蛋白レセプターに結合する
リガンドを用いることによって細胞質に取り入れて、エ
ンドサイトーシスが起こる。別法として、細胞を透過性
として、宿主細胞を傷つけることなく、オリゴヌクレオ
チドの細胞への輸送を促進することができる。もう１つ
の方法は、ＤＮＡ結合蛋白、例えば、オリゴヌクレオチ
ドを細胞に輸送することが知られているＨＢＧＦ−１を
用いることである。このようにして、分裂当たり平均約
５０ｂｐから分裂当たり平均約６〜１２ｂｐヘテロメア
の短縮化速度を実質的に減少させることができ（後記実
施例参照）、かくして、誘導された細胞の老化前に起こ
る分裂の数を有意に拡大する。
【００８２】「老化」とは、通常に適当な複製シグナル
の存在下において複製する細胞の能力の喪失を意味し、
コラゲナーゼのごとき分解的酵素の発現に関係し得る。
該用語は、適当な条件下で複製することが誘導されるで
あろう静止状態細胞を包含しない。この用語は後記実施
例で例示し、そこでは、老化に先立っての細胞倍加の数
が増大する。
【００８３】前記プロセスはｉｎ ｖｉｖｏで有用であ
る。すでに示したごとく、リポソームを使用することに
よって、リポソーム表面が標的細胞に特異的なリガンド
を担持するか、あるいはリポソームが特異的器管に優先
的に向けられている場合、ｉｎ ｖｉｖｏにて標的細胞
にオリゴヌクレオチドを導入することができる。例え
ば、負傷した血管内皮細胞から放出されたホスファチジ
ルセリンについてのリポコルチン親和性を利用して、オ
リゴヌクレオチドをかかる部位に向けることができる。
別法として、カテーテル、シリンジ、デポー剤等を用い
て高局在化濃度を供することもできる。かかるオリゴヌ
クレオチドの細胞への導入の結果、細胞分裂に応答して
老化が減少することは治療効果を有する。
【００８４】テロメア長の維持は、細胞老化の開始を遅
らせる組織培養技術で応用を有する。例えば、自己患者
への再導入については細胞のクローン伸張を要する細胞
をベースとする療法は約２０〜３０の倍化に限定され
る。本発明は、遺伝的操作に先立ち、および、次いでの
該操作した細胞の伸張、テロメア長の維持双方にての、
遺伝子治療の場合における細胞の伸張を可能とする。こ
れは、正常な細胞が、ｉｎｖｉｔｒｏにて延長された倍
化にて培養できることを可能とする。後記する実験はｉ
ｎ ｖｉｔｒｏにてのこの方法の有用性を証明し、また
ｉｎ ｖｉｖｏにてのその応用を証明する。
【００８５】テロメアの臨界的短縮化は「危機」または
Ｍ２老化なる語の現象に導く。シャイ（Ｓｈａｙ）ら、
１９９２、前掲参照。危機にある細胞の中で、希に突然
変異体が不死となり、そこでは、Ｍ２遺伝子は調節を変
更しており、またそこではテロメラーゼの発現は再活性
化されており、テロメアの長さを安定化する。Ｍ２調節
遺伝子はテロメア長およびテロメラーゼ活性を調節する
有用な手段を供するために調節できる。該Ｍ２遺伝子
は、レトロウイルスを用いるＭ２危機への挿入的突然変
異によって同定できる。該Ｍ２遺伝子がダメになった細
胞はテロメラーゼの再活性化に応答して増殖し、かかる
細胞は、それからＭ２遺伝子をクローンする源またはＤ
ＮＡを供することができる。この技術は、レトロウイル
スが共通の制限断片に挿入された多数の細胞クローンを
有する。アンチセンスまたは他の手段によるＭ２調製遺
伝子（類）の抑制は、テロメラーゼを可逆的に活性化す
る手段を与え、テロメアは伸張でき、次いで、テロメラ
ーゼは再度抑制される。このようにして、増殖能力はオ
リゴヌクレオチドの添加または無添加にて伸張できて、
テロメア短縮化を遅らすことができる。従って、かかる
細胞は、骨髄移植、結合組織の再編成、および初期継代
副腎皮質細胞、繊維芽細胞、上皮細胞、および筋芽細胞
の移植のごとき細胞ベースの療法で使用することができ
る。
【００８６】テロメラーゼ調節 前記したごとく、癌細胞はテロメラーゼ活性を含有し、
それにより不死となる。加えて、多数のタイプの寄生的
病原は不死であって活性なテロメラーゼを有する。かく
して、かかる細胞においてテロメラーゼ活性を調節（例
えば、増加）して、有限の複製寿命を付与するのは有用
である。正常なヒト細胞において長いテロメア・トラク
トとは対照的に、原生動物細胞、菌類細胞、およびいく
つかの寄生虫、ならびに多くの癌細胞におけるテロメア
ＤＮＡのトラクトは典型的にはより短い。これは、これ
らの細胞を、正常なヒト細胞（例えば、生殖系細胞）よ
りもテロメラーゼ阻害剤を弱くする。
【００８７】かくして、テロメラーゼの阻害または誘導
は、種々の状況において応用を有する。テロメラーゼを
細胞内で阻害することによって、癌細胞が増殖する能力
を減少させることができる。合成剤、例えば、５’−
３’Ｇ−リッチ鎖（鋳型として働く鎖）のテロメアのモ
チーフの、２もしくはそれ以上、通常約５０反復以下よ
りなるオリゴヌクレオチドを添加することによって、テ
ロメラーゼを競合的に阻害することができる。オリゴヌ
クレオチドは天然もしくは非天然ユニット、例えば、ホ
スフェート酸素が硫黄またはメチレンで置き換えられて
いる炭素誘導体、修飾糖、例えば、アラビノース等から
合成することができる。前記したごとく、他の同等の薬
剤を用いてテロメラーゼ活性を阻害したりあるいはその
発現を引き起こしたりできる。
【００８８】前記したごとくオリゴヌクレオチドを導入
して培養にてあるいはｉｎ ｖｉｖｏにて不滅細胞で老
化を誘導することができる。培養中の増殖する細胞の場
合、不死細胞が培養を過剰増殖させるのを妨げるのを欲
する時は、主題のオリゴヌクレオチドを用いてかかる過
剰増殖の可能性を減じることができる。かくして、オリ
ゴヌクレオチドを培地に維持することによって、オリゴ
ヌクレオチドは細胞によって摂取され、テロメラーゼ活
性を阻害する。金属キレートでテロメア配列への結合を
提供することができる。かくして、テロメア・モチーフ
に結合した鉄キレートを供することによって、テロメラ
ーゼＲＮＡを切断して非機能的とできる。別法として、
反応性基を、テロメラーゼに共有結合するオリゴヌクレ
オチドにカップリングさせることができるか、あるいは
３’残基をジデオキシとして、鎖停止を強制することが
できる。
【００８９】別法として、テロメラーゼＲＮＡに相補的
な５’および３’末端配列を有するリポザイムを導入し
て、該ＲＮＡの切断を提供できる。このようにして、テ
ロメラーゼ活性を実質的に阻害して、癌細胞が増殖する
能力を有意に制限することができる。また、Ｍ２レギュ
レーター遺伝子産物の投与によってテロメラーゼを阻害
することもできる。テロメラーゼの発現を直接調節する
いずれかの蛋白の発現を調節することによって、細胞テ
ロメラーゼ活性を調節することもできる。
【００９０】別法として、小さな分子、例えば、ヌクレ
オシドアナログ様ａｖａ−Ｇ、ｄｄＧ、ＡＺＴ等および
ＲＮＡおよびＤＮＡプロセッシング酵素阻害剤、アルキ
ル化剤、および種々の可能な抗腫瘍薬剤をスクリーニン
グするために、ヒトまたはテトラヒメナ・テロメラーゼ
を利用するスクリーニングアッセイを用いることができ
る。次いで、これらをさらに修飾する。
【００９１】前記したごとく、核酸配列を細胞に導入す
ることができる。腫瘍に関連したデポー剤を可能とする
種々の技術が存在する。かくして、阻害剤または核酸を
薬物として投与することができる。というのは、それら
はテロメラーゼを誘導する細胞のみにおいて効果的であ
るからである。ほとんどの場合、ヒト体細胞はテロメラ
ーゼを欠くので、それらは効果的でないであろう。テロ
メラーゼ活性を発現する生殖細胞にかかる薬物が侵入す
るのを防ぐために、いくらか注意を払わなければならな
い。
【００９２】従って、主題の組成物は、腫瘍細胞がテロ
メラーゼの不適当な活性化を通じて不死の表現型を獲得
した新生物、ならびに種々のヒトおよび動物寄生虫病
（エンタアメバ・ヒストリティカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ
ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）からのアメーバ症、ネグレ
リア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ）属またはアカンタメバ（Ａ
ｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）属からのアメーバ髄膜脳炎、
プラスモジウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｖｉｖａｘ）、プラスモジウム・オバレ（Ｐｌａｓｍｏ
ｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）、プラスモジウム・マラリア
（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）およびプ
ラスモジウム・ファシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）からのマラリア、リーシュマニ
ア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎ
ｉ）、リーシュマニア・インファンタム（Ｌｅｉｓｈｍ
ａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ）、リーシュマニア・シャ
ガシ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｃｈａｇａｓｉ）、リー
シュマニア・トロピカ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔｒｏ
ｐｉｃａ）、リーシュマニア・マジョール（Ｌｅｉｓｈ
ｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、リーシュマニア・エチオピ
カ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ）、
リーシュマニア・メキシカナ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ
ｍｅｘｉｃａｎａ）およびリーシュマニア・ブラジリエ
ンシス（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓ
ｉｓ）のごとき原生動物からのリーシュマニア症、原生
動物トリパノソーマ・クルジ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ
ｃｒｕｚｉ）からのシャガス（Ｃｈａｇａｓ）病、ト
リパノソーマ・ブルチェイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ
ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・ガンビエンシス（Ｔ
ｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｇａｍｂｉｅｎｓｅ）およびト
リパノソーマ・ロデシエンス（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ
ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ）からの睡眠病、トキソプラ
ズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｅ ｇｏｎｄｉ
ｉ）からのトキソプラズマ症、ジアルジア・ランブリア
（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）からのジアルジア
鞭毛虫症、クリプトスポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐ
ｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）からのクリプ
トスポリジウム症、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉ
ｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、トリコモナ
ス・テナクス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｔｅｎａ
ｘ）、トリコモナス・ホミニス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａ
ｓ ｈｏｍｉｎｉｓ）からのトリコモナス症、ニューモ
システィス・カリニィ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃ
ａｒｉｎｉｉ）からのニューモシスチス肺炎、バンベシ
ア・ミクロティ（Ｂａｍｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔ
ｉ）、バンベシア・ディベルゲンス（Ｂａｍｂｅｓｉａ
ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）およびバンベシア・ボリス（Ｂ
ａｍｂｅｓｉａ ｂｏｒｉｓ）からのベンジア症（ｂａ
ｍｂｅｓｏｓｉｓ）、ならびにバランティジウム・コリ
（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）およびイソスポ
ラ・ベリ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｂｅｌｌｉ）のごとき他
の原生動物が引き起こす腸疾患のようなヒ原生動物病原
を含む）の治療で用いることができる。また、テロメラ
ーゼ阻害剤は、種テニア・ソリウム（Ｔａｅｎｉａ ｓ
ｏｌｉｕｍ）、テニア・サギナタ（Ｔａｅｎｉａ ｓａ
ｇｉｎａｔａ）、ジフィロボシリウム・ラタ（Ｄｉｐｈ
ｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ ｌａｔａ）、エチノコッカ
ス・グラニュロサス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒ
ａｎｕｌｏｓｕｓ）、エチノコッカス・ムルティロクラ
リス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｌｔｉｌｏｃｕ
ｌａｒｉｓ）、ヒメノレピス・ナナ（Ｈｙｍｅｎｏｌｅ
ｐｉｓ ｎａｎａ）、シストソマ・マンソミ（Ｓｃｈｉ
ｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｍｉ）、シストソマ・ヤポ
ニカム（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕ
ｍ）、シストソマ・ヘマトビウム（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏ
ｍａ ｈｅｍａｔｏｂｉｕｍ）、クロノルキス・シネン
シス（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、パ
ラゴニムス・ウェステルマニ（Ｐａｒａｇｏｎｉｕｍ
ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ）、ファシオラ・ヘパティカ（Ｆ
ａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）、ファシオロプシ
ス・ブスキィ（Ｆａｓｃｉｏｌｏｐｓｉｓ ｂｕｓｋ
ｉ）、ヘテロフィエス・ヘテロフィエス（Ｈｅｔｅｒｏ
ｐｈｙｅｓ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｅｓ）、エンテロビウ
ス・ベルミクラリス（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｖｅｒｍ
ｉｃｕｌａｒｉｓ）、トリクリス・トリキウラ（Ｔｒｉ
ｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）、アスカリス・ル
ンブリコイデス（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉ
ｄｅｓ）、アンシロストマ・ドゥオデナレ（Ａｎｃｙｌ
ｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、ネカトール・ア
メリカナス（Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕ
ｓ）、ストロンギロイデス・ステルコラリス（Ｓｔｒｏ
ｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、トリ
キネラ・スピラリス（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉ
ｒａｌｉｓ）、ウケレリア・バンクロフティ（Ｗｕｃｈ
ｅｒｅｒｌａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、オンコセルカ・
ボルブルス（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕ
ｓ）、ロア・ロア（Ｌｏａ ｌｏａ）、ドラクンクラス
・メディネンシス（Ｄｒａｎｃｕｎｃｕｌｕｓ ｍｅｄ
ｉｎｅｎｓｉｓ）を含めたある種の寄生虫病、およびス
ポロトリックス・シェンキィ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘｓ
ｃｈｅｎｃｋｉｉ）、コクシィジオイデス・イミティス
（Ｃｏｃｃｉｉｄｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ヒス
トプラズマ・カプスラタム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ
ｃａｐｓｕ−ｌａｔｕｍ）、ブラストミセス・デルマテ
ィティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔ
ｉｔｉｄｉｓ）、パラコクシィジオイデス・ブラジリエ
ンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓ
ｉｌｉｅｎｓｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎ
ｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコッカス・ネ
オフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆ
ｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルグ
ルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕ
ｓ）のごとき真菌病原、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）および
リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属の菌類、ならびにフィ
アロフォア（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）およびクラドス
ペリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属のごときクロ
モミセス症を引き起こす種、ならびに；バベシア・カバ
リィ（Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｂａｌｌｉ）、バベシア・
カニス（Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ）、バベシア・エ
キィ（Ｂａｂｅｓｉａ ｅｑｕｉ）、バベシア・フェリ
ス（Ｂａｂｅｓｉａ ｆｅｌｉｓ）、バランチジウム・
コリ（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）、ボスノイ
ティア・ダルリンギ（Ｂｅｓｎｏｉｔｉａ ｄａｒｌｉ
ｎｇｉ）、エイメリア・アセルブリナ（Ｅｉｍｅｒｉａ
ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・アデノエイデ
ス（Ｅｉｍｅｒｉａ ａｄｅｎｏｅｉｄｅｓ）、エイメ
リア・アヘサタ（Ｅｉｍｅｒｉａ ａｈｓａｔａ）、エ
イメリア・アラバメンシス（Ｅｉｍｅｒｉａ ａｌａｂ
ａｍｅｎｓｉｓ）、エイメリア・アウブルネンシス（Ｅ
ｉｍｅｒｉａ ａｕｂｕｒｎｅｎｓｉｓ）、エイメリア
・ボビス（Ｅｉｍｅｒｉａ ｂｏｖｉｓ）、エイメリア
・ブラジリエンシス（Ｅｉｍｅｒｉａ ｂｒａｓｉｌｉ
ｅｎｓｉｓ）、エイメリア・ブルネッティ（Ｅｉｍｅｒ
ｉａ ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、エイメリア・カナデンシス
（Ｅｉｍｅｒｉａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、エイメリ
ア・セルドニス（Ｅｉｍｅｒｉａ ｃｅｒｄｏｎｉ
ｓ）、エイメリア・クランダリス（Ｅｉｍｅｒｉａ ｃ
ｒａｎｄａｌｌｉｓ）、エイメリア・シリンドリカ（Ｅ
ｉｍｅｒｉａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）、エイメリア・
デブリエッキィ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｄｅｌｂｉｅｃｋ
ｉ）、エイメリア・デスペルサ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｄｅ
ｓｐｅｒｓａ）、エイメリア・エリプソイダリス（Ｅｉ
ｍｅｒｉａｅｌｌｉｐｓｏｉｄａｌｉｓ）、エイメリア
・ファウベイ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｆａｕｖｅｌ）、エイ
メリア・ガロパボニス（Ｅｉｍｅｒｉａ ｇａｌｌｏｐ
ａｖｏｎｉｓ）、エイメリア・ギルルシィ（Ｅｉｍｅｒ
ｉａ ｇｉｌｒｕｔｈｉ）、エイメリア・グラヌロセ
（Ｅｉｍｅｒｉａ ｇｒａｎｕｌｏｓａ）、エイメリア
・ハガニ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｈａｇａｎｉ）、エイメリ
ア・イリノイセンシス（Ｅｉｍｅｒｉａ ｉｌｌｉｎｏ
ｉｓｅｎｓｉｓ）、エイメリア・イノクア（Ｅｉｍｅｒ
ｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、エイメリア・イントリカタ
（Ｅｉｍｅｒｉａｉｎｔｒｉｃａｔａ）、エイメリア・
ロイトカルティ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｌｅｕｓｋａｒｔ
ｉ）、エイメリア・マキシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘ
ｉｍａ）、エイメリア・メレアグリディス（Ｅｉｍｅｒ
ｉａ ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｄｉｓ）、エイメリア・メ
レアクセリミティス（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｅｌｅａｇｒ
ｉｔｉｓ）、エイメリア・ミティス（Ｅｉｍｅｒｉａ
ｍｉｔｉｓ）、エイメリア・ミバティ（Ｅｉｍｅｒｉａ
ｍｉｖａｔｉ）、エイメリア・ネカトリックス（Ｅｉ
ｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ）、エイメリア・ネオデ
ブリエッキィ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｏｄｅｂｌｉｅｃ
ｋｉ）、エイメリア・ニナコールヤキモレ（Ｅｉｍｅｒ
ｉａ ｎｉｎａｋｏｈｌｙａｋｉｍｏｒａｅ）、エイメ
リア・オビナ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｏｖｉｎａ）、エイメ
リア・パリダ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｐａｌｌｉｄａ）、エ
イメリア・パルバ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｐａｒｖａ）、エ
イメリア・ペルミヌタ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｅｒｍｉｎ
ｕｔａ）、エイメリア・ポルチ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｏ
ｒｃｉ）、エイメリア・プレコックス（Ｅｉｍｅｒｉａ
ｐｒａｅｃｏｘ）、エイメリア・プンクタタ（Ｅｉｍ
ｅｒｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ）、エイメリア・スカルバ
（Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｃａｂｒａ）、エイメリア・スピ
ノザ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｐｉｎｏｚａ）、エイメリア
・スブロテゥンダ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｕｂｒｏｔｕｎ
ｄａ）、エイメリア・スブシェリカ（Ｅｉｍｅｒｉａ
ｓｕｂｓｈｅｒｉｃａ）、エイメリア・スイス（Ｅｉｍ
ｅｒｉａ ｓｕｉｓ）、エイメリア・テネッラ（Ｅｉｍ
ｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ）、エイメリア・ウォミング
ゲンシス（Ｅｉｍｅｒｉａ ｗｙｏｍｉｎｇｅｎｓｉ
ｓ）、エイメリア・ズエルニィ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｚｕ
ｅｒｎｉｉ）、エンドリマックス・グレガリニフォルミ
ス（Ｅｎｄｏｌｉｍａｘ ｇｒｅｇａｒｉｎｉｆｏｒｍ
ｉｓ）、エンドリマックス・ナナ（Ｅｎｄｏｌｉｍａｘ
ｎａｎａ）、エンタメバ・ボビス（Ｅｎｔａｍｏｅｂ
ａ ｂｏｖｉｓ）、エンタメバ・ガリナルム（Ｅｎｔａ
ｍｏｅｂａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンタメバ・ヒ
ストリティカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔ
ｉｃａ）、エンタメバ・スイス（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ
ｓｕｉｓ）、ジアルディア・ボビス（Ｇｉａｒｄｉａ
ｂｏｖｉｓ）、ジアルディア・カニス（Ｇｉａｒｄｉａ
ｃａｎｉｓ）、ジアルディア・カティ（Ｇｉａｒｄｉ
ａ ｃａｔｉ）、ジアルディア・ランブリア（Ｇｉａｒ
ｄｉａｌａｍｂｌｉａ）、ヘモプロテウス・メレアグリ
ディス（Ｈａｅｍｏｐｒｏｔｅｕｓ ｍｅｌｅａｇｒｉ
ｄｉｓ）、ヘキサミタ・メレアグリディス（Ｈｅｘａｍ
ｉｔａ ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）、ヒストモナス・メ
レアグリディス（Ｈｉｓｔｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｅａｇ
ｒｉｄｉｓ）、イオダメバ・ブエツキリ（Ｉｏｄａｍｏ
ｅｂａ ｂｕｅｔｓｃｈｉｌｉ）、イソスポラ・バヒエ
シス（Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｂａｈｉｅｎｓｉｓ）、イソ
スポラ・ブッロウシ（Ｉｓｏｓｐｏｒａｂｕｒｒｏｗｓ
ｉ）、イソスポラ・カニス（Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｃａｎ
ｉｓ）、イソスポラ・フェリス（Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｆ
ｅｌｉｓ）、イソスポラ・オヒエンシス（Ｉｓｏｓｐｏ
ｒａ ｏｈｉｏｅｎｓｉｓ）、イソスポラ・リボルタ
（Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｒｉｖｏｌｔａ）、イソスポラ・
スイス（Ｉｓｏｓｐｏｒａｓｕｉｓ）、クロシエラ・エ
キ（Ｋｌｏｓｓｉｅｌｌａ ｅｑｕｉ）、ロイコシトゾ
ーン・カーレルギ（Ｌｅｕｃｏｃｙｔｏｚｏｏｎ ｃａ
ａｌｌｅｒｇｉ）、ロイコシトゾーン・スミシ（Ｌｅｕ
ｃｏｃｙｔｏｚｏｏｎ ｓｍｉｔｈｉ）、パラヒストモ
ナス・ウェンリキ（Ｐａｒａｈｉｓｔｏｍｏｎａｓ ｗ
ｅｎｒｉｃｈｉ）、ペンタトリコモナス・ホミニス（Ｐ
ｅｎｔａｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｈｏｍｉｎｉｓ）、
サルコシスティス・ボトラミ（Ｓａｒｃｏｃｙｔｉｓ
ｂｅｔｒａｍｉ）、サルコシスティス・ビゲミナ（Ｓａ
ｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｂｉｇｅｍｉｎａ）、サルコシス
ティス・クルジ（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｃｒｕｚ
ｉ）、サルコシスティス・ファイエビィ（Ｓａｒｃｏｃ
ｙｓｔｉｓ ｆａｙｅｖｉ）、ヘミオニラトランティス
（ｈｅｍｉｏｎｉｌａｔｒａｎｔｉｓ）、サルコシステ
ィス・ヒルスタ（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｈｉｒｓｕ
ｔａ）、サルコシスティス・ミエシェビアナ（Ｓａｒｃ
ｏｃｙｓｔｉｓ ｍｉｅｃｈｅｖｉａｎａ）、サルコシ
スティス・ムリス（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｍｕｒｉ
ｓ）、サルコシスティス・オビカニス（Ｓａｒｃｏｃｙ
ｓｔｉｓ ｏｖｉｃａｎｉｓ）、サルコシスティス・テ
ネッラ（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｔｅｎｅｌｌａ）、
テトラトリコモナス・ブッテレイィ（Ｔｅｔｒａｔｒｉ
ｃｈｏｍｏｎａｓ ｂｕｔｔｒｅｙｉ）、テトラトリコ
モナス・ガリナルム（Ｔｅｔｒａｔｒｉｃｈｏｍｏｎａ
ｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、セイレリア・ムタンス
（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ ｍｕｔａｎｓ）、トキソプラズ
マ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉ
ｉ）、トキソプラズマ・ハモンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓ
ｍａ ｈａｍｍｏｎｄｉ）、トリコモナス・カニストメ
（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｃａｎｉｓｔｏｍａｅ）、
トリコモナス・ガリネ（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｇａ
ｌｌｉｎａｅ）、トリコモナス・フェリストメ（Ｔｒｉ
ｃｈｏｍｏｎａｓ ｆｅｌｉｓｔｏｍａｅ）、トリコモ
ナス・エベルシ（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｅｂｅｒｔ
ｈｉ）、トリコモナス・エキ（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ
ｅｑｕｉ）、トリコモナス・フェタス（Ｔｒｉｃｈｏ
ｍｏｎａｓ ｆｏｅｔｕｓ）、トリコモナス・オビス
（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｏｖｉｓ）、トリコモナス
・ロトウンダ（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｒｏｔｕｎｄ
ａ）、トリコモナス・スイス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ
ｓｕｉｓ）、およびトリパノソーマ・メロファギウム
（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｍｅｉｏｐｈａｇｉｕｍ）
のごとき重要な獣医学的原生動物病原を治療するのにも
有用である。加えて、それらは、細胞の老化、全能幹細
胞、例えば、胚性幹細胞からの細胞の分化および突然変
異におけるテロメアの役割、および精子形成におけるテ
ロメラーゼの役割を研究するのに用いることができる。
【００９３】テロメア長さ テロメア長さの測定方法は、当該技術分野において公知
であり、本発明において使用することができる。典型的
には、（テロメアＤＮＡを切断しない酵素と一緒に）制
限エンドヌクレアーゼ消化を利用し、検出可能なテロメ
アＤＮＡを有するフラグメントの長さは、アガロースゲ
ル電気泳動によって、分子量に従って分離される。テロ
メアのＤＮＡ配列が知られているとすると、かかるＤＮ
Ａの検出は、特異的なオリゴヌクレオチドの使用によっ
て比較的容易である。これらの方法の実施例を以下に示
す。
【００９４】診断については、テロメア長さの検出にお
いて、特定の細胞タイプ、（種々の細胞が存在する）組
織中の全細胞、または細胞タイプのサブセットなどが研
究される。かかるテロメアを有するＤＮＡの調製は、テ
ロメア長さの測定方法に依存して変化する。
【００９５】好都合には、ＤＮＡは、抽出、次いで、沈
殿によって、ＤＮＡをタンパクから遊離させる慣用手段
に従って、単離される。次いで、全ゲノムＤＮＡを、少
なくとも約８０℃、通常、少なくとも約９４℃に加熱す
ることによって、または、６Ｘ ＳＣＣ、チオシアン酸
グアニジニウム、尿素などのカオトロピックイオンを有
する高い塩分を使用することによって溶融させる。次い
で、溶融方法の性質に依存して、媒質をＤＮＡ合成用媒
質に換えてもよい。
【００９６】（ａ）ＤＮＡ合成 １つの方法において、テロメア配列の少なくとも約２反
復、好ましくは、少なくとも約３反復、一般に、約８以
下の反復、好都合には、約６以下の反復を有するプライ
マーを使用する。（テロメアの突出またはＧ−リッチ鎖
に相補的なヌクレオシド、例えば、ヒト染色体について
Ａ、ＴおよびＣを有する）４ヌクレオシド三リン酸のう
ちの３つだけ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰの存
在下、該プライマーをゲノムＤＮＡに付加する。通常、
少なくとも該プライマーまたは少なくとも１つのトリホ
スフェートを、標識が該鎖における取込み後に保持され
る検出可能な標識、例えば、放射性同位元素で標識す
る。標識を使用しない場合、別の方法を使用して、ＤＮ
Ａ合成を検出することができる。ＤＮＡポリメラーゼ、
例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメン
ト、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼまたはＴａｑ ＤＮＡポ
リメラーゼによって、該プライマーを伸長させる。
【００９７】次いで、種々の技術、例えば、ゲル電気泳
動などのその分子量に基づいて合成ＤＮＡを分離する方
法によって、伸長したＤＮＡの長さを測定することがで
きる。次いで、合成されたＤＮＡを標識に基づいて、例
えば、ＤＮＡ１μｇ当たりに取り込まれた数を検出す
る。この数は、テロメア長さに正比例する。したがっ
て、ＤＮＡの量に関係する放射能の測定は、テロメア長
さを定量化するのに充分である。
【００９８】所望により、既知の長さのテロメアを標準
として使用し、これにより、テロメア長さに関係付けら
れた標準曲線から放射能の測定が読み取られる。代わり
に、組織を調製し、その個々の細胞を、ｉｎ ｓｉｔｕ
ハイブリダイゼーションによって相対的なテロメア長さ
についてアッセイする。このアプローチにおいて、例え
ば、プライマーを検出可能な標識、通常、ビオチンまた
はジゴキシゲニンで標識する。アニーリングに付して、
組織断片または細胞を調製した後、通常、オートラジオ
グラフィー（標識が放射性である場合）、アビジン／ス
トレプトアビジン（標識がビオチンである場合）または
アンチジゴキシゲニン抗体（標識がジゴキシゲニンであ
る場合）を使用して、標識を組織化学的に示す。細胞当
たりのシグナルの量は、テロメア反復の数に、したがっ
て、テロメア長さに比例している。これは、微量蛍光光
度法または同様の手段によって定量化することができ、
既知のテロメア長さの標準的な細胞からのシグナルと比
較して、試験試料におけるテロメア長さを測定すること
ができる。
【００９９】（ｂ）制限エンドヌクレアーゼ消化 別法としては、テロメアＤＮＡに対するプライマーの共
有結合を生じさせるプライマーを使用する。この場合、
４塩基認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼでＤＮ
Ａを全体的に消化させ、その結果、認識部位を欠失して
いるテロメアＤＮＡを除いて、ＤＮＡの比較的短いフラ
グメントを生成させる。使用が見いだされる制限エンド
ヌクレアーゼとしては、ＡｌｕＩ、ＨｉｎｆＩ、Ｍｓｐ
Ｉ、ＲｓａＩおよびＳａｕ３Ａが挙げられ、該制限エン
ドヌクレアーゼは、個別に、または組み合わせて使用さ
れる。ゲノムＤＮＡの消化後、ハイブリダイゼーション
条件下でプライマーを添加し、その結果、テロメア配列
の突出鎖に結合させる。プライマーに結合した２つの部
分、すなわち、テロメア配列に共有結合用の部分および
特異的結合対メンバーとの複合体形成用の部分のために
提供することによって、テロメア配列の表面への結合の
ために提供することができる。例えば、テロメア配列へ
の共有結合のために、結合または鎖によってソラレンま
たはイソソラレンをヌクレオチドの１つに結合させ、Ｕ
Ｖ−照射後にプライマーとテロメアとの間の架橋を形成
させる。
【０１００】特異的結合対メンバーは、通常、適切な相
補的メンバーに結合するハプテン、例えば、ビオチンと
ストレプト／アビジン、トリニトロ安息香酸と抗トリニ
トロベンズアミド抗体、または、メトトレキセートとジ
ヒドロ葉酸レダクターゼである。プライマーと共有結合
した共有結合に関する部分を有するよりも、核酸中に挿
入可能な化合物を媒質中に添加し、その結果、二本鎖核
酸配列間に挿入することができる。この方法で、同一の
目的を達成することができる。実質的に過剰な挿入可能
な化合物の使用によって、存在する別のＤＮＡの部分の
中に挿入させることもできる。サイズ分離などの、この
方法の種々の変形例によって、標識含有ＤＮＡの量を減
少させることできる。
【０１０１】ビーズ上、カラム中の粒子上などに存在す
る相補的な対メンバーに結合させることによって、汚染
ＤＮＡを含まないテロメアＤＮＡの分離のために、特異
的結合対メンバーを使用する。該分離の性質にしたがっ
て、共有結合したテロメア鎖を精製し、サイズまたは分
子量について測定する。再度、所望により、分布値の比
較のために標準を使用する。
【０１０２】特異的結合対メンバーハプテンは、プライ
マーの５’−末端または中間ヌクレオチドに存在するこ
とができる。詳細には、ビオチンコンジュゲードヌクレ
オチドは、一般に、入手可能であり、公知の方法に従っ
て、合成プライマー配列中に容易に導入される。
【０１０３】前記方法は、テロメアに隣接するＤＮＡの
単離および同定のために使用することもできる。
【０１０４】（ｃ）平均テロメア長さ 本発明の方法において、染色体のテロメア部分の、染色
体の他の部分からの分離前に、テロメアにプライマーを
結合させることによって平均テロメア長さを測定するこ
とは有用である。これは、テロメアのオーバーハングお
よびプライマーからなる二本鎖テロメアＤＮＡを提供す
る。次いで、存在する他のＤＮＡと比較して、テロメア
ＤＮＡを特異的に同定させる反応を行う。該反応は、標
識ヌクレオチドを使用するヌクレオチド（ｄＮＴＰ）の
うち３つのヌクレオチドのみによるプライマーの伸長、
プライマーのテロメア配列への共有結合、または、テロ
メア配列を他の配列から分離させる他の方法を含む。検
出された合成ＤＮＡの長さは、平均テロメア長さを表
す。
【０１０５】テロメア長さは、「アンカード・ターミナ
ル・プライマー」法（”ａｎｃｈｏｒｅｄｔｅｒｍｉｎ
ａｌ ｐｒｉｍｅｒ”ｍｅｔｈｏｄ）によって直接測定
することもできる。この方法では、ゲノムＤＮＡの３’
末端を、まず、ターミナルトランスフェラーゼを使用し
て、ｄＧヌクレオチドで「テール化」する。そこで、
３’オーバーハングを有することが知られているテロメ
アは、以下の３つの配列： .....5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGGGGGGGGG...3' .....5'-TTAGGGTTAGGGTTGGGGGGGGGGGG...3' .....5'-TTAGGGTTAGGGTGGGGGGGGGGGGG...3' のうちの１つを有する。剪断によって生じたゲノムＤＮ
Ａの別の末端は、Ｇでテイル化されるが、隣接するＴＴ
ＡＧＧＧ反復を有していない。したがって、以下の３つ
のビオチニル化オリゴヌクレオチドの混合物： 5'B-CCCCCCCCTAACCCTA 5'B-CCCCCCCCAACCCTAA オリゴ混合物〔Ｍ〕 5'B-CCCCCCCCACCCTAAC は、ストリンジェント条件下、全ての可能なテロメア末
端に特異的にアニーリングに付される。オリゴ混合物
〔Ｍ〕は、５’ビオチン（Ｂ）を有する１６塩基オリゴ
ヌクレオチドからなっているが、Ｃ−リッチテロメア反
復に隣接する５’−Ｃ−トラクトの他の組合せは、天然
テロメアの３’末端に対して特異的なハイブリダイゼー
ションを提供することができる。
【０１０６】ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰの存在下
（ｄＧＴＰは存在せず、ｄｄＧＴＰを有するかまたは有
せず）での、クレノウ、ＤＮＡポリメラーゼＩまたはＴ
ａｑポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼによるプラ
イマーの伸長は、プライマー−鋳型配置を安定化させ、
ストレプトアビジンビーズを使用して、テロメアＤＮＡ
を含有するＤＮＡの末端フラグメントを選択させる。ク
レノウは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失し
ており、ＣＴＲで行き詰まるので、クレノウを使用した
プライマー伸長の長さ（標識ヌクレオチドでモニターし
た）は、テロメア（ＧＴＲ）３’オーバーハングの長さ
を示す。この長さ分布は、テロメラーゼ−ポジティブ細
胞におけるテロメラーゼ活性のレベルを表示する（すな
わち、より長い伸長は、より大きなテロメア活性に対応
する）。反対に、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性お
よびポリメラーゼ活性を有する酵素ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉによるプライマーの伸長は、鋳型鎖（ＧＴＲに対して
サブテロメリック）においてＣが出会うまで、ＣＴＲを
介して伸長させる。標識ヌクレオチドによってモニター
されるこの反応の長さ分布は、ＧＴＲの長さ分布を表示
する。両方の場合、ストレプトアビジンビーズを用い
て、ビオチニル化プライマーから生じた標識生成物を選
択して、非特異的プライミングからのシグナルを減少さ
せる。別法としては、テール化した染色体末端のリプラ
イミングおよび伸長は、部分的に伸長した生成物のスト
レプトアビジンビーズによる選択後、および、二重鎖か
らのＣ−リッチ鎖の変性後に起こすことができる。
【０１０７】実験により、末端当たり約５０Ｇ残基が付
加されるように染色体末端のＧ−テーリングを充分に行
うことができること、ジャンクションオリゴヌクレオチ
ド混合物によるプライミングがテール化したテロメア末
端に対して非常に特異的であること、ならびに、ストレ
プトアビジンビーズが、ビオチニル化プライマーから生
じるが、他の意外なプライミング事象からは生じない伸
長生成物について特異的に選択することが確認された。
したがって、概略前記した条件下での伸長生成物の長さ
は、末端ＴＴＡＧＧＧ反復トラクトの長さの直接推定値
を提供する。この情報は、ＴＴＡＧＧＧ反復の伸長が染
色体の末端ではなく近くで生じる場合に特に重要であ
る。真の末端ＴＴＡＧＧＧ反復およびかかる内部反復の
間で区別することができる他の方法は、今日まで開示さ
れていない。
【０１０８】前記のテロメア長さの測定は、診断的関心
を有する種々の条件に関連させることができる。腫瘍細
胞におけるテロメア長さの追跡によって、テロメラーゼ
の阻害剤の投与（または、前記テロメア長さを不安定に
させる他の治療）の前後のかかる細胞の増殖能に関する
情報が提供される。いずれかの治療の効果を追跡し、疾
患の経過の予後を提供する手段も提供する。
【０１０９】疾患組織が含まれる場合、増幅能について
天然組織を評価することができる。「増殖能」なる語
は、組織中の細胞の、正常な増殖条件下で固定された分
裂数についての先天的分裂能を意味する。すなわち、分
裂の「ハイフリック」数は、実施例において以下に例示
した。したがって、組織が異なる増殖能の細胞のスペク
トルを有するという事実にもかかわらず、平均値は、一
般に、組織の状態の情報を与える。組織の生検材料を採
取し、平均テロメア長さを測定する。次に、該数値を使
用して、増殖能について平均正常健康組織に対する値と
比較し、この場合、特に、組織を同様の年齢の他の組織
と比較する。
【０１１０】肝臓疾患、例えば、肝硬変、または筋肉疾
患、例えば、筋ジストロフィーなどの細胞疾患の場合、
増殖能の認識は、ありそうな患者の回復能を診断するの
に有用でありうる。他の事態は、手術、創傷、熱傷など
の組織に対する損傷を含み、この場合、線維芽細胞の組
織再生能は、関心のあるものである。同様に、骨の欠
損、骨粗鬆症、または骨の再形成を必要とする他の疾患
の場合、骨芽細胞および軟骨細胞の更新能は、関心のあ
るものである。
【０１１１】テロメア長さの平均測定値を測定すること
による組織の増殖能を評価するための方法は、本明細書
に記載されているが、組織が、異なる増殖能の細胞のス
ペクトルを有することに注意する。実際、肝臓を含む多
くの組織は、少数の幹細胞（全細胞の数％未満）だけか
ら再生する。したがって、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイ
ゼーション（例えば、蛍光標識テロメアプローブを用い
る）を使用すること、かかる幹細胞および／または集合
的ではなく個別に基づいたかかる細胞のテロメア状態を
同定および定量化することは、本発明において有用であ
る。これは、例えば、自動化顕微鏡画像装置を使用し
て、個々の細胞核についての蛍光強度を測定することに
よって行われる。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーショ
ンに加えて、ゲル電気泳動は、組織試料中の細胞におけ
る平均テロメア長さだけではなく、最長テロメア長さ
（幹細胞の存在を示すことができる）およびテロメア長
さのサイズ分布（組織内の異なる組織学的細胞タイプを
反映する、図１０−１１を参照）を測定するためのオー
トラジオグラフィーと一緒に有用である。したがって、
オートラジオグラム、または、その等価物は、細胞また
は細胞のグループの全テロメア状態に関する有用な情報
を提供する。かかる情報の各セグメントは、本発明の診
断方法において有用である。
【０１１２】ｄ）変形したマキサム−ギルバート反応 現在、テロメア長さを測定するために使用されている最
も一般的な技術は、ＨｉｎｆＩのような４塩基認識配列
を有する制限酵素によりゲノムＤＮＡを消化すること、
ＤＮＡを電気泳動に付すこと、ＤＮＡを放射性標識（Ｔ
ＴＡＧＧＧ）3プローブにハイブリダイズさせるサザン
ブロットを行うことである。この技術の難点は、得られ
た末端制限フラグメント（ＴＲＦ）が、制限部位を欠失
し、これによって、測定されたテロメア長さのサイズに
有意に付加する３〜５ｋｂｐ伸張のサブテロメアＤＮＡ
を含有することである。このＤＮＡを削除し、テロメア
長さアッセイの精度を改良するための別のアプローチ
は、このサブテロメアＤＮＡが両方の鎖にＧおよびＣ残
基を含有しており、したがって、Ｇ残基で分解させる条
件下で切断されるという事実を利用する。反対に、テロ
メア反復から排他的に構成されるＤＮＡは、Ｇ残基を欠
失する１つの鎖を有しており、この鎖は、Ｇ−切断条件
下で無傷のままである。マキサム−ギルバートＧ−反応
は、ピペリジンを使用して、ジメチルスルフェート（Ｄ
ＳＭ）処理によってメチル化されたグアニジン残基を切
断する。マキサム−ギルバートＧ−反応（９０℃で３０
分間、１Ｍピペリジン中で処理）の初期条件は、未メチ
ル化ＤＮＡを１〜２ｋｂｐのフラグメントに分解し、非
特異的であるが、適度な条件（３７℃で３０分間、０．
１Ｍピペリジン）は、未処理ＤＮＡを無傷のままにす
る。したがって、該ＤＮＡを前記のようにＤＳＭおよび
ピペリジンで処理し、エタノールで沈殿させ、電気泳動
に付し、（ＴＴＡＧＧＧ）3プローブに対してサザンブ
ロットでハイブリダイズさせる。かかる試験の結果を図
２６に示す。
【０１１３】テロメラーゼ活性 テロメラーゼ活性は、特に、新生細胞または始原細胞、
例えば、胚幹細胞に関して、成長ポテンシャルのマーカ
ーとして有用である。ヒトテロメラーゼ活性は、２以
上、通常３以上のテロメア単位配列ＴＴＡＧＧＧの反復
を有する適切な反復配列（プライマー）の伸長速度を測
定することによって決定される。該配列は、好都合な部
位、例えば、５’−末端で特異的結合対メンバーで標識
され、該特異的結合対メンバーは、伸長した配列を分離
させる。前記のように、１以上の放射性ヌクレオシド三
リン酸または別の標識ヌクレオシド三リン酸を使用する
ことによって、テロメラーゼ活性の尺度として、時間の
単位の関数としてＤＮＡの単位重量当たりのｃｐｍとし
て取り込まれた放射能を測定することができる。他の検
出可能なシグナルおよび標識、例えば、フルオレセイン
を使用することもできる。
【０１１４】該活性は、細胞質抽出物、核抽出物、溶解
細胞、全細胞などを用いて測定される。使用される特定
の試料および予備処理方法は、主に、便利さの１つであ
る。予備処理は、テロメラーゼの変性を避け、結果とし
て、テロメラーゼ活性を維持することができる条件下で
行われる。プライマー配列は、試料中に存在する他のＤ
ＮＡから分離させることができるように、選択または標
識化される。したがって、ハプテン標識を使用して、試
料のテロメラーゼ活性を表す伸長した配列を容易に分離
させることができる。使用されるヌクレオシド三リン酸
は、標識される少なくとも１つのヌクレオシド三リン酸
を含む。標識は、通常、放射性標識であるが、他の標識
が存在してもよい。該標識は、特異的結合対メンバーを
含んでおり、相互のメンバーは、フルオレサー（ｆｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｒｓ）、酵素、または他の検出可能な標識
で標識される。別法としては、ヌクレオシド三リン酸
は、蛍光標識などの他の標識で直接標識される。
【０１１５】配列伸長は、通常、好都合な温度、通常、
約２０℃〜４０℃で、少なくとも約１００ｂｐを平均し
て初期配列に付加させるのに充分な時間、一般に、３０
〜９０分間行われる。テロメラーゼ触媒伸長させるため
のインキュベーション時間の後、慣用手段、例えば、変
性、例えば、加熱、阻害剤の添加、標識による配列の迅
速な取り出し、および洗浄などによって、該反応を停止
させる。次いで、分離されたＤＮＡを洗浄して、非特異
的結合ＤＮＡを除去し、次いで、慣用手段によって標識
を測定する。
【０１１６】テロメラーゼ活性の測定は、種々の方法で
使用される。例えば、新生物に関連する組織を扱う場
合、細胞が不死化されているかを測定するために使用す
ることができる。したがって、細胞がテロメラーゼ活性
を有しているか、不死化されているかを、腫瘍の周縁で
測定することができる。テロメラーゼの存在および活性
は、癌または他の疾患のステージングにも関連してい
る。テロメラーゼに関連する他の診断的関心は、酵素を
阻害するように設計された治療計画における効力につい
てのアッセイとしての活性の測定を含む。
【０１１７】他のテロメラーゼ活性の測定方法は、テロ
メラーゼタンパクに対して特異的な抗体を使用すること
ができ、種々の方法でテロメラーゼタンパクの量を測定
することができる。例えば、表面に結合した第１エピト
ープに対するモノクローナル抗体の表面に結合したポリ
クローナル抗血清および媒質中で分散させられた第２エ
ピトープに対する標識ポリクローナル抗血清または標識
モノクローナル抗体を使用し、２つの抗体間に架橋する
テロメラーゼまたはそのサブユニットの結果として表面
に結合された標識の量を検出することができる。別法と
しては、テロメラーゼＲＮＡに対するプライマーを準備
し、リバーストランスクリプターゼおよびポリメラーゼ
連鎖反応を使用して、細胞中に存在するテロメラーゼの
量の指標としてテロメラーゼＲＮＡの存在および量を測
定する。
【０１１８】以下の実施例は、説明のために記載するの
であって、限定のためではない。
【０１１９】
【実施例】当業者に本発明を更に説明するために、本発
明の詳細な態様の例を以下に記載する。これらの実施例
は、本発明を限定するものではなく、本発明の実施にお
いて有用な特定の方法を示すものである。それらは、本
発明の利用性、ならびに、テロメア長さ、テロメラーゼ
活性および細胞の老化間の相互関係を明白に示すもので
もある。かかる相互関係は、これらの実施例を超えて本
発明の広さを当業者に示す。
【０１２０】実施例１：テロメア長さおよび細胞増殖 細胞増殖に対するテロメア長さ変調の効果を研究した。
体細胞中での細胞分裂当たり平均５０ｂｐが失われる。
テロメア末端は、以下の一本鎖領域： 5'TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAG GGTTA GGG 3'AATCCCAATCCC （配列番号１） を有すると考えられる（しかし、オーバーハングの量
は、未知である）。出願人は、細胞に配列ＣＣＣＴＡＡ
ＣＣＣＴＡＡ（配列番号２）の合成オリゴヌクレオチド
を提供する場合、この一本鎖オーバーハングの欠失が有
意に遅くなると仮定した。このオリゴヌクレオチドは、
露出した一本鎖領域にハイブリダイズし、体細胞中に存
在する正常なＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成のた
めのプライマーとして供される。この方法では、分裂当
たり平均５０ｂｐによる短縮よりも、該テロメアは、よ
り少量の分裂当たりの量による短縮だけであり、したが
って、テロメア短縮が細胞老化を誘発する前に、分裂の
数を有意に拡張することが必要であった。この仮説を、
対照オリゴヌクレオチドに対するこの所定のオリゴヌク
レオチドで処理された培養細胞中での増殖寿命の変化お
よびテロメア短縮速度を測定することによって試験し
た。
【０１２１】ＣＴＯ−１２オリゴヌクレオチド（５’−
ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡ−３’配列番号２）の細胞老
化に関連するテロメア短縮低下能（図１）は、１０％ウ
シ胎児血清を補足した最少必須培地中、標準的な細胞培
養条件下で培養された標的細胞を使用して研究した。該
細胞は、コンフリューエンシーに達成した後、トリプシ
ン化によって４日毎に継代培養し、継代培養時または２
日毎に新しい培地を供給した。いずれも最初に行った。
種々の集団倍加レベルの細胞をウエル当たり細胞１０，
０００個の割合で接種し、種々の濃度のオリゴヌクレオ
チドを含有する培地を供給した。研究したオリゴヌクレ
オチドは、シチジン−リッチ末端オリゴヌクレオチド
（ＣＴＯ−１２）、グアニジン−リッチ末端オリゴヌク
レオチド−１２ｂｐ（ＧＴＯ−１２、配列５’−ＴＴＡ
ＧＧＧＴＴＡＧＧＧ−３’（配列番号３））および位置
毎にランダムヌクレオチドを有する１２塩基対ランダマ
ー（ｒａｎｄｏｍｅｒ）であった。さらなる対照とし
て、細胞にオリゴヌクレオチドを含有しない同一の培地
を供給した。４８時間毎に１０Ｘ母液から細胞にオリゴ
ヌクレオチドを供給した。（かかるオリゴヌクレオチド
は、例えば、ホスホロチオエート、ジチオエートおよび
２−Ｏ−メチルＲＮＡを用いて、安定性を増強するため
に修飾した。）ホスホロチオエートの場合、５’−ＣＣ
ＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴ−３’、５’−ＣＣＣＴ
ＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡ−３’または５’−ＣＣ
ＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣ−３’などの、
より長いＣＴＯプライマーを使用するのが望ましい。
【０１２２】詳細には、約５５回の集団倍加（ＰＤ）の
増殖能を有するＩＭＲ−９０ヒト肺線維芽細胞を、４８
ウエル組織培養皿中、ウエル当たり細胞１０，０００個
の割合でＰＤ４５で接種し、培地のみまたはＣＴＯ−１
２（１．０μＭおよび０．１μＭ）および１．０μＭの
１２塩基対ランダマーを補足した培地を供給した。図１
に示すとおり、オリゴヌクレオチドを含有しない培地ま
たは１．０μＭ未満のＣＴＯ−１２もしくはランダム配
列のオリゴヌクレオチドを含有する培地中で増殖した細
胞は、約５２回の集団倍加で同様に複製老化に達した。
細胞に１．０μＭのＣＴＯ−１２オリゴヌクレオチドを
供給したが、対照細胞よりも約１０回多い倍加の間増殖
し続けた。
【０１２３】実施例２：癌細胞におけるテロメラーゼの
阻害 癌細胞が細胞老化を逃れることができる１つの方法は、
複数回の細胞分裂にもかかわらず、それらのテロメアの
長さを維持させるテロメラーゼ活性を回復させることに
よる。酵素テロメラーゼは、ＴＴＡＧＧＧに相補的なＲ
ＮＡを含有しており、それにテロメアを認識させ、さら
なるＴＴＡＧＧＧ反復の添加によってそれらを伸長させ
る。実際、テロメラーゼについての１つのアッセイは、
ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧプライマーを使用し、細胞抽
出物の、この基質への６ｂｐ添加物のラダー（ｌａｄｄ
ｅｒ）を合成する能力を測定する。癌細胞中のテロメラ
ーゼ活性は、テロメア長さが比較的安定であるので、限
定量中に存在すると思われる（したがって、延長および
短縮が均衡するように、テロメア当たり約５０ｂｐを添
加する）。
【０１２４】出願人は、細胞に供給すると、合成ＴＴＡ
ＧＧＧＴＴＡＧＧＧオリゴヌクレオチド（配列番号３）
がテロメラーゼの染色体末端伸長能を競争的に阻害し、
したがって、癌細胞中のテロメアを短縮および老化させ
ると仮定した。体細胞は、テロメラーゼ活性を欠いてい
るので、この治療の効果は、癌細胞および生殖細胞系に
厳格に限定されるべきである。
【０１２５】詳細には、１２ウエル組織培養皿中、ウエ
ル当たり細胞１０，０００個の割合で、不死表現型を有
するＭＤＡ １５７ヒト乳癌細胞を接種し、培地のみま
たはＧＴＯ−１２（１．０μＭ、０．１μＭおよび０．
０１μＭ）を補足した培地を供給した。図２に示すとお
り、オリゴヌクレオチドを含有しない培地または１．０
μＭ未満の投薬を含有する培地中で増殖した細胞は、不
死表現型において複製し続けた。細胞に１．０μＭのＧ
ＴＯ−１２オリゴヌクレオチドを供給したが、１０回未
満の倍加の後、増殖が止まった。１．０μＭ ＣＴＯ−
１２または１．０μＭ ＣＴＯ−１２および１．０μＭ
ＧＴＯ−１２（Ｇ＋Ｃ）の存在下で増殖した細胞は、
不死表現型を発現し続け、ＧＴＯ−１２オリゴヌクレオ
チドが本質的に毒性ではないことを示唆した（図３）。
Ｇ＋Ｃ混合物の効果の欠失は、ＣＴＯ−１２オリゴヌク
レオチドがＧＴＯ−１２オリゴヌクレオチドと競争また
は塩基対化することを示す。これは、癌細胞テロメラー
ゼに対するその阻害剤効果を予防する。
【０１２６】実施例３；バイオマーカーとしてのテロメ
ア長さ アメリカ合衆国および西ヨーロッパでは、アテローム性
動脈硬化症は、心臓血管疾患による死亡数に対する主要
な因子である〔ロス（Ｒｏｓｓ）、３１４、ニュー・イ
ングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ．Ｅｎ
ｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．）、４８８、１９８６〕。アテロー
ム性動脈硬化症は、動脈組織の内膜表面上での脂質およ
び細胞−リッチ病変または「プラーク」の壁状または巣
状形成によって特徴付けられる。これに、病変の管腔中
への年齢依存性拡大が続き、閉塞および心筋梗塞および
／または脳梗塞を誘発する可能性がある〔ハウスト（Ｈ
ａｕｓｔ）、（１９８１）バスキュラー・インジャリー
・アンド・アセロウスクラロウシス（Ｖａｓｃｕｌａｒ
Ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓ
ｉｓ）、ムーア，エス（Ｍｏｏｒｅ，Ｓ．）編、（マー
セル・デッカー・インコーポレイテッド（Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．）、ニューヨーク）、第１〜
２２頁；ロスおよびグロムセット（Ｒｏｓｓ ａｎｄ
Ｇｌｏｍｓｅｔ）、２９５（７）、ニュー・イングラン
ド・ジャーナル・オブ・メディシン、３６９、１９７
６；およびロス（Ｒｏｓｓ）、２９５（８）、ニュー・
イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン、４２
０、１９７６〕。アテローム性動脈硬化症の病原を説明
するために提案されたメカニズムのうち重要なものは、
「損傷に対する応答」（ｒｅｓｐｏｎｓｅ−ｔｏ−ｉｎ
ｊｕｒｙ）仮説であり〔ロス、３１４、ニュー・イング
ランド・ジャーナル・オブ・メディシン、４８８、１９
８６；ムーア、（１９８１）バスキュラー・インジャリ
ー・アンド・アセロウスクラロウシス、ムーア，エス
編、（マーセル・デッカー・インコーポレイテッド、ニ
ューヨーク）、第１３１〜１４８頁；およびムーア、２
９（５）、ラボラトリー・インベスティゲーション（Ｌ
ａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、４７８、１９７１〕、ここで
は、内皮に対して繰り返される機械的、血流力学的およ
び／または免疫学的損傷が開始事象である。
【０１２７】この仮説の予言は、アテローム性動脈硬化
性プラークからなる領域における内膜および中間組織が
周囲の正常組織よりも高い細胞ターンオーバー速度を有
することである。いくつかの証拠の系は、この予言を支
持する。ロスら〔ロスおよびグロムセット、２９５
（７）ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メデ
ィシン、３６９、１９７６；ロス、２９５（８）ニュー
・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン、４２
０、１９７６〕は、培養した線維性プラーク由来平滑筋
細胞が、下にある中間層からの細胞と比較すると血清増
殖に対して低い応答性を示すことを開示した。モスおよ
びベンディット（Ｍｏｓｓ ａｎｄ Ｂｅｎｄｉｔｔ）
７８（２）（１９７３）アメリカン・ジャーナル・オブ
・パソロジー（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．）１７５、１
９７３は、動脈プラークからの細胞培養物の複製寿命が
非プラーク領域の細胞からの複製寿命と等しいかまたは
それ未満であることを開示した。ダルチュ（Ｄａｒｔｓ
ｃｈ）ら、１０アーティリオウスクリロウシス（Ａｒｔ
ｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）６２、１９９２は、原発
性狭窄病変から得られたヒト平滑筋細胞が、培養物中
で、再狭窄病変からの平滑筋細胞よりもかなり遅く老化
することを開示した。これらの結果によって、アテロー
ム性動脈硬化性プラークの領域から誘導された細胞が非
プラーク領域からの細胞よりも多く細胞分裂を受け、そ
の結果、それらをより古くさせ、それらの最大複製能に
近づけることが示唆される。
【０１２８】したがって、アテローム性動脈硬化症の病
原を理解するために、動脈病変上またはそれに隣接する
細胞ターンオーバーの行動の変調を試験しなければなら
ない。内膜および中間組織の細胞ターンオーバーについ
てのバイオマーカーが必要である。数人の研究者は、ア
テローム性動脈硬化症の進行または個人のアテローム性
動脈硬化症発病傾向についてのバイオマーカーを試験し
た。前者の目的は、血漿中で検出されるが、内皮に源を
発する多くの生化学化合物の測定を伴った。例えば、血
清ＩＩＩ型コラーゲン〔ボネット（Ｂｏｎｎｅｔ）ら、
１８ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・クリニカル・イ
ンベスティゲーション（Ｅｖｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．）１８、１９８８〕、フォン・ウイルブランド
因子（ＶＩＩＩ因子）〔バロン（Ｂａｒｏｎ）ら、１０
アーテイリオウスクリロウシス、１０７４、１９９
０〕、コレステロール、トリグリセリド、アポリポ蛋白
Ｂ〔ストリンジャーおよびカッカー（Ｓｔｒｉｎｇｅｒ
ａｎｄ Ｋａｋｋａｒ）、４（１９９０）Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．、５１３、１９９０〕、リポ
蛋白（ａ）〔ブレッケンリッジ（Ｂｒｅｃｋｅｎｒｉｄ
ｇｅ）、１４３、カナディアン・メディシナル・アソシ
エイション・ジャーナル（Ｃａｎ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏ
ｃ．Ｊ．）、１１５、１９９０；メッダウー（Ｍｅｚｄ
ｏｕｒ）ら、４８アナレ・ドウ・ビオロジー・クリニク
（Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．）（パリ）、１３９、
１９９０；およびスキャヌ（Ｓｃａｎｕ）、１４クリニ
カル・カルディオロジー（Ｃｌｉｎ．Ｃａｒｄｉｏ
ｌ．）、１３５、１９９１〕、エンドテリン（ｅｎｄｏ
ｔｈｅｌｉｎ）〔ラーマン（Ｌｅｒｍａｎ）ら、３２
５、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディ
シン、９９７、１９９１〕およびヘパリン−放出可能な
血小板第４因子〔サダヤス（Ｓａｄａｙａｓｕ）ら、１
４（１９９１）クリニカル・カルディオロジー、７２
５、１９９１〕が挙げられる。多くのマーカーは、細胞
表面に源を発する〔ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）ら、１１
（１９９１）アーティリオウスクリロウシス・アンド・
スロンボウシス（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏ
ｍｂ．）７４５、１９９１；およびシブルスキーおよび
ガーンブロン（Ｃｙｂｕｌｓｋｙ ａｎｄ Ｇｉｒｎｂ
ｒｏｎｅ）、２５１サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）７８
８、１９９１〕。他のマーカーは、アテローム発生の結
果として生理的異常をモニターする〔ヴィタ（Ｖｉｔ
ａ）ら、８１（１９９０）サーキュレーション（Ｃｉｒ
ｃｕｌａｔｉｏｎ）４９１、１９９０〕。アテローム性
動脈硬化症に対して感作性のためのもののＲＦＬＰプロ
フィルを描くために使用された候補遺伝子〔セペフルニ
ア（Ｓｅｐｅｈｒｎｉａ）ら、３８（１９８８）Ｈｕ
ｍ．Ｈｅｒｅｄ．１３６、１９８８；およびチャンバー
レインおよびガルトン（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ ａｎ
ｄ Ｇａｌｔｏｎ）、４６Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．９
１７、１９９０〕も確立された。しかしながら、細胞タ
ーンオーバーを直接モニターするために開発された比較
的少ないマーカーがあった。
【０１２９】今、出願人は、テロメア長さがアテローム
発生に含まれる組織中の細胞ターンオーバーのバイオマ
ーカーとして供されることを示す。この結果は、内皮細
胞が複製年齢の関数としてｉｎ ｖｉｔｒｏでテロメア
を失い、ｉｎ ｖｉｖｏテロメア損失が一般に非プラー
ク領域からの対照組織と比較してアテローム性動脈硬化
性プラークの組織についての方が大きいことを示す。
【０１３０】一般に、末端制限フラグメント〔ＴＲＦ、
ヒトゲノムＤＮＡのＨｉｎｆＩ／ＲｓａＩ消化を介して
生じた。ＴＲＦは、ゲル電気泳動によって分解され、テ
ロメアオリゴヌクレオチド（32Ｐ−（ＣＣＣＴＡＡ）3
（配列番号４）とハイブリダイズさせた〕のサザン分析
によって、テロメア長さを評価した。平均ＴＲＦ長さ
は、臍静脈からのヒト内皮細胞培養物における集団倍加
の関数として（ｍ＝−１９０ｂｐ／ＰＤ、Ｐ＝０．０
１）、ならびに回腸動脈におけるドナー年齢の関数（ｍ
＝−１２０ｂｐ／ＰＤ、Ｐ＝０．０５）および回腸静脈
におけるドナー年齢の関数（ｍ＝−１６０ｂｐ／ＰＤ、
Ｐ＝０．０５）として減少した。したがって、平均ＴＲ
Ｆ長さは、全細胞培養物のｉｎ ｖｉｔｒｏ年齢に伴っ
て減少した。初期に継代細胞培養物をドナー年齢の関数
として平均ＴＲＦ長さについて評価すると、回腸動脈に
ついて有意な減少（ｍ＝−１０２ｂｐ／ｙ、Ｐ＝０．０
１）があっが、回腸静脈についてはなかった（ｍ＝４７
ｂｐ／ｙ、Ｐ＝０．１４）。中間組織の平均ＴＲＦ長さ
は、ドナー年齢の関数として有意に（Ｐ＝０．０５）減
少した。アテローム性動脈硬化性プラークの広範囲にわ
たる発生を示した個人からの内膜組織は、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで老化細胞について観察されたものと近接した平均
ＴＲＦ長さを有した（−６ｋｂｐ）。これらの観察結果
は、テロメアの大きさが、実際に、内膜および中間の複
製暦についてのバイオマーカーとして供され、内皮細胞
の複製老化がアテローム発生に含まれることを示す。
【０１３１】詳細には、以下の物質および方法を使用し
て、以下の結果を得た。
【０１３２】内皮細胞培養物 ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、米国赤十字社の
ジェロウム・エイチ・ホーランド・ラボラトリー（Ｊｅ
ｒｏｍｅ Ｈ．Ｈｏｌｌａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ）のドクター・トーマス・マシアグ（Ｄｒ．Ｔｈｏｍ
ａｓ Ｍａｃｉａｇ）から入手した。回腸動脈および回
腸静脈からのヒト内皮細胞は、セル・リポジトリー・オ
ブ・ザ・ナショナル・インスティチュート・オブ・エイ
ジング（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａ
ｇｉｎｇ）（ニュージャージー州カンデン）から入手し
た。内部を０．４％ゼラチンの一晩コーティング（３７
℃）で処理した１００ｍｍ組織プレート上で５％ＣＯ2
中、３７℃で、細胞を増殖させた。補足された培地は、
Ｍ１９９、１５％ウシ胎児血清、５Ｕ／ｍｌヘパリンお
よび２０μｇ／ｍｌ粗製内皮細胞増殖補足（コラボレイ
ティブ・リサーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ））または粗製内皮細胞増殖因子（ベーリ
ンガー−マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ））からなっていた。培養物をコンフリューエ
ンスでトリプシン化し（０．０５％、３分間）、最終細
胞密度の２５％で再接種し、２〜３日毎に再供給した。
【０１３３】組織試料 大動脈弓、腹大動脈、回腸動脈および回腸静脈からの組
織試料は、マクマスター・ユニバーシナィ（ＭｃＭａｓ
ｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、デパートメント・オ
ブ・パソロジー，ヘルス・サイエンシズ・センター（Ｄ
ｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｈｅ
ａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ）での剖検
から入手した。死後５〜８時間の範囲であった。動脈ま
たは静脈を切開し、管腔表面をＮｏ．１０メス〔ランス
・ブレイディズ（Ｌａｎｃｅ Ｂｌａｄｅｓ）、シェフ
ィールド〕で注意深く削り落とすことによって、内膜を
得た〔リャン（Ｒｙａｎ）、５６Ｅｎｖｉｒ．Ｈｅａｌ
ｔｈ Ｐａｒ．１０３、１９８４〕。得られた物質をＤ
ＮＡの抽出のために直接処理するか、または、細胞培養
のために処理した。
【０１３４】血管の非管腔側を切断または削り落とすこ
とによって、外膜層を除去した。液体Ｎ2中で凍結さ
せ、液体Ｎ2冷却した乳鉢および乳棒で粉砕し、残りの
中間層を調製した〔ケネディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ）ら、１
５８、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．、４４５、１９８
５〕。組織を粉末に磨砕した後、凍結消化バッファー
（１０ｍＭトリス；１００ｍＭ ＮａＣｌ；２５ｍＭ
ＥＤＴＡ；０．５％ＳＤＳ；ｐＨ８．０）５ｍｌを添加
し、粉末化した組織に磨砕した。次いで、該粉末を５０
ｍｌファルコン管に移し、解凍するまで、４８℃でイン
キュベートした。０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度にプロテ
ィナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。１２−１６
時間インキュベーション後、該溶液を水浴から取り出
し、ＤＮＡ抽出のために調製するか、または２０℃で貯
蔵した。
【０１３５】ゲノムＤＮＡの抽出および制限酵素消化 従前の記載に従い、ＤＮＡを抽出した〔ハーリィ（Ｈａ
ｒｌｅｙ）ら、３４５、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４
５８、１９９０；オールソップ（Ａｌｌｓｏｐｐ）ら、
８９プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ）１０１１
４，１９９２〕。すなわち、プロテイナーゼＫ−消化溶
解物を、１容量倍のフェノール：クロロホルム：イソア
ミルアルコール（２５：２４：１）で２回、次いで、ク
ロロホルムで１回抽出した。水性層に２容量倍の１００
％ＥｔＯＨを添加することによって、核酸を沈殿させ、
７０％ＥｔＯＨで１回洗浄し、最後に、１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）１００〜２
００μｌに再懸濁させた。ＤＮＡを蛍光光度法によって
定量化し、１μｇを、３７℃で３〜２４時間、各１単位
のＨｉｎｆＩ／ＲｓａＩで消化させた。ゲル電気泳動に
よって、完全な消化をモニターした。消化前および後の
ＤＮＡの完全性を、ゲル電気泳動による対照試験でモニ
ターした。
【０１３６】サザンブロットハイブリダイゼーション 従前の記載に従い、全６５０−７００Ｖ／時間につい
て、標準的なトリス、ホウ酸ナトリウム、ＥＤＴＡバッ
ファー中で、消化したゲノムＤＮＡの電気泳動を行った
〔ハーリィ（Ｈａｒｌｅｙ）ら、３４５ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ）、４５８、１９９０；オールソップら、８
９プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ、１０１１
４、１９９２〕。電気泳動後、該ゲルを３ｍｍワットマ
ン濾紙上に置き、６０℃で２５分間、真空乾燥させた。
ゲルを、室温で１０分間、０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５
Ｍ ＮａＣｌ中に浸漬させることによって変性させ、次
いで、０．５Ｍトリス、１．５Ｍ ＮａＣｌ中での浸漬
を介して中和させた。ゲノムＤＮＡを、３７℃で１２〜
１６時間、テロメア32Ｐ−（ＣＣＣＴＡＡ）3プローブ
（配列番号４）を有する標準ハイブリダイゼーション溶
液〔ハーリィら、３４５、ネイチャー、４５８、１９９
０〕（６Ｘ ＳＣＣ）中に浸漬させた。テロメア塗抹標
本を、予めフラッシュした（ＯＤ545 ＝０．１５）コダ
ック（Ｋｏｄａｋ）ＸＡＲ−５フィルム上でオートラジ
オグラフィを介して可視化した。従前の記載に従って、
現像したフィルムの比重走査から、末端制限フラグメン
ト（ＴＲＦ）の平均長さを算出した〔ハーリィら、３４
５、ネイチャー、４５８、１９９０〕。
【０１３７】ｉｎ ｖｉｔｒｏ結果 アテローム性動脈硬化症における細胞ターンオーバーに
ついてのバイオマーカーとしてテロメア長さを使用する
ことの可能性を決定するために、本発明者らは、まず、
細胞分裂をｉｎ ｖｉｔｒｏで直接モニターすることが
できる培養した内皮細胞中のテロメア長さの変化を実験
した。ＤＮＡをＨｉｎｆＩおよびＲｓａＩで消化し、得
られた末端制限フラグメント（ＴＲＦ）をサザン分析に
付した。ヒト皮膚線維芽細胞におけるように〔オールソ
ップら、８９プロシーディングズ・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ、
１０１１４、１９９２〕、平均ＴＲＦ長さは、集団倍加
（ＰＤ）の関数として減少した。したがって、テロメア
長さは、ヒト臍静脈内皮細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ年齢に
伴って減少した。平均ＴＲＦ長さは、１９０±１０ｂｐ
／ＰＤの速度で直線的に（Ｐ＝０．０１）減少した（図
４を参照）。０ ＰＤＬでの平均ＴＲＦを表すＹ−切片
は、１４．０ｋｂｐであり、一方、老化時の平均ＴＲＦ
は、５．７±０．４ｋｂｐであった。
【０１３８】テロメア長さの減少が別の動脈および静脈
供給源からの内皮細胞中で生じていることを証明するた
めに、ヒト回腸動脈およびヒト回腸静脈からの内皮細胞
のいくつかの株について、平均ＴＲＦ長さ対集団倍加レ
ベル（ＰＤＬ）を測定した。回腸動脈および回腸静脈の
両方において、培養物の年齢に伴う平均ＴＲＦ長さの有
意な（Ｐ＝０．０５）直線的減少が見られた：内皮細胞
からの、回腸動脈についての集団倍加当たり１２０±６
０ｂｐおよび回腸静脈についての集団倍加当たり１６０
±３０ｂｐ。
【０１３９】ｉｎ ｖｉｖｏ結果 アテローム性動脈硬化性プラークの形成は、回腸静脈に
おけるよりも回腸動脈における方がよく生じ〔クロウフ
ォード（Ｃｒａｗｆｏｒｄ）、（１９８２）パソロジー
・オブ・アセロウスクレロウシス（Ｐｈａｔｈｏｌｏｆ
ｙ ｏｆ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）（バター
ワース・アンド・カンパニー・リミテッド（Ｂｕｔｔｅ
ｒｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）、Ｕ．
Ｋ．）、第１８７〜１９９頁〕、したがって、回腸動脈
からのｉｎ ｖｉｖｏ内膜組織のターンオーバーが回腸
静脈からよりも大きくあるべきであると思われる。これ
を試験するために、１４〜５８歳の年齢範囲のドナーか
らの回腸動脈および静脈からの内皮細胞培養物の９種類
の株を培養し、最も初期の可能なＰＤＬからのＴＲＦ長
さを測定した（図５）。
【０１４０】静脈におけるよりも大きな、動脈における
ｉｎ ｖｉｖｏ細胞ターンオーバーの仮説と一致する平
均ＴＲＦ長さの減少速度は、回腸動脈について（−１０
０ｂｐ／ｙｒ、Ｐ＝０．０１）２０〜６０年の範囲より
も有意であり、回腸静脈について（−４７ｂｐ／ｙｒ、
Ｐ＝０．１４）よりも大きい。内皮細胞の９種類の株の
中に、ドナーのうち３人、２１歳、４７歳および４９歳
のドナーについて同一の個体から回腸動脈および回腸静
脈からの培養物があった。高齢ドナー２人については、
静脈細胞と比較して、回腸動脈の培養物中の平均ＴＲＦ
長さが有意に短かった。若いドナーは、２つの培養物間
で平均ＴＲＦ長さの有意な差異を示さず、２１歳のドナ
ーの血管間の細胞ターンオーバーの比較的小さな差異を
示すことができた。
【０１４１】異なる年齢のドナーにおける回腸動脈およ
び回腸静脈からの細胞培養物の平均ＴＲＦ長さの差異
は、一次組織の初期平均ＴＲＦ長さの差異だけではな
く、分析のために充分な細胞を回収するために必要な時
間じゅう、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの異なる培養物間のテロ
メア損失速度の差異も示す（約５〜１０ＰＤＬ）。細胞
ターンオーバーおよびアテローム性動脈硬化性プラーク
形成度の間に相関関係があるかを測定するために、本発
明者らは、一次組織における平均ＴＲＦ長さを試験し
た。３歳、１１歳、１２歳、１４歳、１８歳、２６歳、
７５歳の女性および７７歳の男性からの剖検を試験し
た。大動脈弓、腹大動脈、回腸動脈および回腸静脈の切
片を採取し、内膜および中間組織を分離し、ＴＲＦ長さ
について評価した。
【０１４２】ＴＲＦ分析のために、３人のドナー（２７
歳、７５歳および７７歳）の大動脈弓、腹大動脈、回腸
動脈および回腸静脈から充分な内膜組織を入手すること
ができた。２７歳の女性（１０．４±０．７ｋｂｐ）対
７５歳（８．８＋０．６ｋｂｐ）および７７歳の男性
（６．３＋０．４ｋｂｐ）において、これらの部位にわ
たって平均された平均ＴＲＦ長さの間に著しい差異があ
った。７７歳の男性は、血管系に広範囲のアテローム性
動脈硬化性病変を有しており、彼の内膜組織の平均ＴＲ
Ｆ長さは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの老化時、内皮細胞のも
のと近接していること（約６ｋｂｐ、図４）は、注目す
べきことである。
【０１４３】図６は、中間組織（大動脈弓から）の平均
ＴＲＦが、小さいが有意な速度（４７ｂｐ／ｙｒ、Ｐ＝
０．０５）で、ドナー年齢に伴って減少することを示
す。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでの中間細胞ターンオ
ーバーは、静脈または動脈内皮細胞のものよりも小さな
速度で生じる。
【０１４４】一般に、アテローム性動脈硬化性プラーク
の下にある中間組織におけるテロメア損失は、非プラー
ク領域での損失よりも大きかった（第１表）。７５歳の
女性について、平均ＴＲＦは、大動脈弓（Ｐ＝０．０
４）および腹大動脈（Ｐ＝０．０１）の両方の非プラー
ク領域に対するプラーク領域からの中間ＤＮＡにおいて
有意に減少した。７７歳の男性については、これは、腹
大動脈において観察された（Ｐ＝０．０１）。
【０１４５】
【表１】 プラークおよび非プラーク領域の一次中間組織についての平均ＴＲＦ値 プラーク領域 非プラーク領域 Ｐ７５歳のドナー 大動脈弓 １０．２＋０．５ １１．１±０．１ ０．０４ 腹大動脈 ９．５±０．６ １１．０±０．１ ０．０１７７歳のドナー 大動脈弓 ８．２±０．４ ８．４±０．２ ＮＳ 腹大動脈 ７．１±０．１ ８．２±０．４ ０．０１ これらの結果は、平均ＴＲＦ長さが一次中間および内膜
組織についてドナー年齢の関数として減少することを示
しており、細胞ターンオーバーが心臓血管組織において
生じることを示唆する。同一の血管からの中間組織の透
明領域に対するプラーク領域についての平均ＴＲＦ長さ
の減少は、アテローム性動脈硬化性プラークに関連する
組織の増加した細胞ターンオーバーと一致する。したが
って、結果は、テロメア長さの測定が、心臓血管疾患に
関連する組織、すなわち、内膜および中間の細胞中の細
胞ターンオーバーの変調についてのバイオマーカーを提
供することを示す。
【０１４６】テロメア長さの測定は、増殖暦の直接的な
レジスターであるが、テロメアＤＮＡを得るためには、
内皮細胞の生検を入手しなければならない。内皮自体の
除去は、プラーク形成を誘発するので、生検ストラテジ
ーは、明らかに、倫理上および実用上の問題を伴う。剖
検試料による経験に基づいて、本明細書の記載に従って
サザン分析を行うために、最小面積１ｃｍ2を必要とす
る。実用的な生検については、このことは、支持できな
い。この問題を回避するための検出技術は、同焦点蛍光
顕微鏡である。
【０１４７】実施例４：テロメア長さについての簡素化
試験 テロメア長さは、異なる年齢のドナーから培養した細胞
の残存寿命の最良の予言者である。したがって、テロメ
ア長さ測定能は、有意な臨床用途を有する。それらの簡
単な反復性質のために、テロメアは、多くの制限酵素に
よって認識されたＤＮＡ配列を欠失している。テロメア
長さを測定する１つの方法は、ＤＮＡのほとんどを非常
に小さな小片に切断し、比較的大きなＴＲＦ（末端制限
フラグメント）におけるテロメアを離脱させる４塩基認
識部位を有する制限酵素でＤＮＡを消化することであ
る。次いで、ＤＮＡのサザンブロットを放射性ＴＴＡＧ
ＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ（配列番号５）オリゴヌ
クレオチドでプローブ化し、ＴＲＦのサイズを測定す
る。
【０１４８】テロメア長さを測定するための非常に簡単
な方法は、テロメア配列がＣ−リッチ鎖におけるグアニ
ジン残基を欠失しているという事実を利用する。ゲノム
ＤＮＡを溶融させ、ＤＮＡポリメラーゼおよび３種類だ
けのデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよび
放射性ｄＣＴＰ）の存在下、ＤＮＡ合成プライマーＣＣ
ＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡ（配列
番号６）と混合させることができる。ゲノムの全体にわ
たって分散された稀な相補的配列は、ｄＧＴＰの欠失た
めに伸長し損じる。次いで、伸長したＤＮＡの長さを、
簡単なゲル電気泳動から測定することができる。合成し
たＤＮＡの量（ＤＮＡ１μｇ当たりに取り込まれた数）
は、テロメア長さに正比例し、診断目的のためには、簡
単な放射能測定がテロメア長さを定量化するのに充分で
ある。
【０１４９】実施例５：テロメア付近のＤＮＡ配列の同
定 細胞および生物老化を制御する調節因子がテロメア付近
に配置されており、隣接するテロメアの長さによって自
己調節されているということを信じるのに良好な理由が
ある。したがって、老化プロセスを理解し、操作するこ
とができるためには、それらを同定し、クローン化する
ことが重要である。さらに、マッピングの目的のための
テロメアマーカーが染色体の末端について欠落している
ので、ヒトゲノムプロジェクト内で固有のテロメアＤＮ
Ａを同定するのに大きな関心がある。
【０１５０】１つの方法では、大きなテロメアＤＮＡ
は、以下のとおり精製される。ビオチニル化したＣＣＣ
ＴＡＡＣＣＣＴＡＡ（配列番号７）オリゴヌクレオチド
を使用して、二本鎖ゲノムＤＮＡにおけるＤＮＡ合成を
活性化させる。このオリゴヌクレオチドがアニールする
ことができる唯一の配列は、テロメア末端の一本鎖塩基
オーバーハングである。次いで、伸長したＤＮＡをＮｏ
ｔＩなどの制限酵素で消化して、大きな制限フラグメン
トを生成させる。ビオチニル化したフラグメントを、ス
トレプトアビジン被覆磁気ビーズを使用して回収し、パ
ルス化磁場電気泳動によって分析した。４６フラグメン
ト（２３ヒト染色体の両端に１つずつ）が生成される。
【０１５１】複数ストラテジーを使用して、大きなテロ
メアＤＮＡの好結果の単離を追跡することができる。テ
ロメア近辺にある遺伝子を同定するために、ＤＮＡを標
識し、これを使用して、ｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーンにかける。次いで、これらのｃＤＮＡの発現を試験
することができる。次いで、細胞老化の関数として別々
に表され、したがって、加齢を制御する調節因子である
ための候補であるこれらを同定するために、古い細胞に
対する若い細胞において、これらのｃＤＮＡの発現を試
験することができる。
【０１５２】精製したテロメアＤＮＡをさらなる制限酵
素で消化し、１００倍過剰のゲノムＤＮＡと混合し、溶
融し、再アニールさせることもできる。これらの環境下
で、テロメアＤＮＡ中の反復配列は、ゲノムＤＮＡでア
ニールし、一方、精製されたＤＮＡにおける固有の配列
は、自己アニールする。自己アニールした固有の配列だ
けは、両端に制限オーバーハングを含有しており、した
がって、アニールしたＤＮＡの簡単なクローニングは、
固有のフラグメントだけの好結果のクローニングを生じ
る。
【０１５３】実施例６：ダウン症候群患者におけるテロ
メア損失 ヒト染色体からのテロメアＤＮＡの損失は、最後には複
製老化の間に細胞サイクル出口を生じる。リンパ球が限
定された複製能を有しており、血球がｉｎ ｖｉｖｏで
加齢の間にテロメアＤＮＡを損失することを予め示した
ので、本発明者らは、加速されたテロメア損失がダウン
症候群（ＤＳ）を有する個体におけるリンパ球の早期免
疫老化に関連するか、および、テロメアＤＮＡもｉｎ
ｖｉｔｒｏでのリンパ球の加齢の間に損失されるかを判
定することを希望した。
【０１５４】加齢および三染色体性２１のｉｎ ｖｉｖ
ｏテロメア損失に対する効果を研究するために、ゲノム
ＤＮＡを１４０個体（０〜１０７ｙ）および２１ＤＳ患
者（０〜４５ｙ）の末梢血管リンパ球から単離した。制
限酵素ＨｉｎｆＩおよびＲｓａＩによる消化は、テロメ
ア特異的プローブ（32Ｐ−（ＣＣＣＴＡＡ）3）を使用
してサザン分析によって検出することができる末端制限
フラグメント（ＴＲＦ）を生じた。テロメア損失速度
を、ドナー年齢の関数として平均ＴＲＦ長さの減少から
算出した。ＤＳ患者は、年齢匹敵対照（４１±７．７ｂ
ｐ／ｙ）と比較して、ドナー年齢について有意に高いテ
ロメア損失速度（１３３±１５ｂｐ／ｙ）を示し（Ｐ＜
０．０００５）、これは、加速したテロメア損失がＤＳ
患者の早期免疫老化のバイオマーカーであることを示し
た。
【０１５５】ｉｎ ｖｉｔｒｏでの加齢の間のテロメア
損失は、２０〜３０回の集団倍加のための培養中で増殖
した２人の正常な個体からのリンパ球について算出し
た。テロメア損失速度は、９０ｂｐ／細胞倍加であっ
た。すなわち、他の体細胞において見られたものと比較
した。１００歳程度の人および年老いたＤＳ患者からの
リンパ球のテロメア長さは、培養物中の老化リンパ球の
ものと同様であった。これは、複製老化が、特に、ＤＳ
患者およびかなり年とった個体における免疫系の加齢の
原因であることを示唆している。
【０１５６】以下の物質および方法を使用して、以下の
結果を得た。
【０１５７】ヒト末梢血液Ｔリンパ球の培養 成人の末梢血液試料を回収し、フィコール−ハイパック
比重差遠心によって単核細胞を単離し、次いで、液体窒
素中で寒冷保存した。４８ウエルのクラスタープレート
（コスター（Ｃｏｓｔａｒ））の各ウエル中、１０-6単
核細胞を１０6放射線照射（８０００Ｒａｄ）リンパ芽
球様細胞（エプスタイン−パーウイルス形質転換Ｂ細
胞）と混合するか、または１０6単核細胞を１０μｇ／
ｍｌリンパフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ−Ｐ，ディ
フコ（Ｄｉｆｃｏ））と混合することによって、培養を
開始した。８〜１１日後、細胞を洗浄し、２〜４×１０
5／ｍｌの濃度で、２４ウエルのクラスタープレートの
２ｍｌウエル中で平板培養した。３〜４日毎に培養物を
通過させたが、いかなる場合にも、生存細胞濃度（トリ
パンブルー排除法によって測定した）は、８×１０5／
ｍｌを達成した。培養物が放射線照射リンパ芽球様細胞
に対する増殖応答を示さなくなった時、および／また
は、血球計の全可視領域に存在する生存細胞がなくなっ
た時に培養を停止させた。２ｍｌウエルに移した後、細
胞を組換えインターロイキン−２（アムゲン（Ａｍｇｅ
ｎ））２５Ｕ／ｍｌに連続的に暴露した。使用した培地
は、（ａ）１０〜２０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミ
ンおよび１ｍＭヘペスを捕捉したＲＰＭ１（アーヴィン
・サイエンティフィック（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ））；（ｂ）ＡＩＭ ＶTM、２５％Ｅｘ−ｃｙ
ｔｅ（リポタンパク、コレステロール、リン脂質および
脂肪酸の混合水溶液（マイルズ・ダイアグノスティクス
（Ｍｉｌｅｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））を補足した
精製ヒトアルブミン、トランスフェリン、および組換え
インシュリン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を含有するＤＭ
ＥＭ／栄養混合物Ｆ−１２基本培地であった。
【０１５８】各細胞継代時の集団倍加（ＰＤ）の数は、
式：ＰＤ＝１ｎ（最終生存細胞数初期細胞数）／１ｎ２
に従って算出した。
【０１５９】ＤＮＡの単離 フィコール−ハイパック比重差遠心〔ボュム（Ｂｏｙｕ
ｍ）ら、２１（９７）、Ｓｃａｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａ
ｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７７、１９６８〕を使用して、Ｐ
ＢＬ（＝１５％単球を含む）を単離し、次いで、ＰＢＳ
で３回洗浄した。細胞ペレットを０．１ｍｇ／ｍｌプロ
テイナーゼＫを含有するプロテイナーゼＫ消化バッファ
−（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス（ｐＨ
８）、５ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）５００μｌに
再懸濁させ、次いで、４８℃で一晩インキュベートし
た。溶解物をフェノール／クロロホルム／イソアミルア
ルコール（２５：２４：１ ｖ／ｖ／ｖ）で２回、次い
で、クロロホルムで１回抽出した。９５％エタノールを
用いて、ＤＮＡを沈殿させ、ＴＥ（１０ｍＭトリス、１
ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ＝８）に溶解させた。
【０１６０】テロメアＤＮＡの分析 ゲノムＤＮＡ（１０μｇ）をＨｉｎｆＩおよびＲｓａＩ
（ＢＲＬ）（各々、２０Ｕ）で消化し、前記のとおり、
再抽出し、９５％エタノールを用いて沈殿させ、７０％
エタノールで洗浄し、ＴＥ ５０μｌに溶解させ、蛍光
光度法によって定量化した。７００Ｖ−ｈの間、ゲル・
バウンド（Ｇｅｌ Ｂｏｕｎｄ）〔ＦＭＣ・バイオプロ
ダクツ（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）〕上に注い
だ０．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中での電気泳動に
よって、消化したＤＮＡ１μｇを分離した。ゲルを６０
℃で３０分間乾燥させ、変性させ、中和し、前記のよう
な５’−末端標識32Ｐ−（ＣＣＣＴＡＡ）でプローブ化
した。シグナル応答の直線領域内で暴露させたオートラ
ジオグラムを、ヘファー（Ｈｏｅｆｅｒ）デシトメータ
で走査した。該シグナルをデジタル化し、式Ｌ＝Σ，
（ＯＤi Ｌi ）／ΣＯＤi 〔式中、ＯＤi ＝間隔におけ
る総合シグナル、Ｌ＝間隔ｉの中間点でのＴＲＦ長さ〕
を使用して、平均ＴＲＦ長さ（Ｌ）を算出するために、
２ｋｂｐから２１ｋｂｐまで１ｋｂｐ間隔に微分割し
た。
【０１６１】ＴＲＦ長さ対年齢 ドナー年齢の関数として測定した場合、１４０人の無関
係正常個体（０〜１０７歳）のＰＢＳ中の平均ＴＲＦ長
さは、４１±２．６ｂｐ／ｙの割合で傾斜した（ｐ＜
０．００００５、ｒ＝０．８３）。ＰＢＬについてのこ
のＴＲＦ損失割合は、ハスティー（Ｈａｓｔｉｅ）ら、
３４６ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）８６６、１９９０に
よる末梢血球について予め見いだされているものと近接
している。本発明者らのデータを性に従って分離する
と、男性は、女性よりも僅かに速い速度でテロメアＤＮ
Ａを損失するが（５０±４．２ｖｓ４０±３．６ｂｐ／
ｙ）、この差異は、統計学的有意さ（ｐ＝０．１）に達
していなかったことに注意した。本発明者らの正常な集
団のうち１８人の１００歳程度の人（９９〜１０７歳）
は５．２８±０．４ｋｂｐの平均ＴＲＦ長さを有してい
た（図７）。関心のあることには、１００歳の人の平均
ＴＲＦ値（０．４ｋｂｐ）の標準偏差は、他の年齢グル
ープのものよりも非常に小さかった。これは、年齢に伴
う細胞より均一な集団の選択を表すこともあるが、１０
０歳程度の人のグループは、本発明者らの研究におい
て、若い集団よりも遺伝子的にあまり多様ではないこと
もある。
【０１６２】２１人のダウン症候群個体（２〜４５歳）
のＰＢＬにおいて、平均ＴＲＦ長さを分析し、損失速度
を６８歳適合対照（０〜４３歳）と比較した。本発明者
らは、ＤＳ患者からの細胞が有意に大きなテロメア損失
速度を示すことを見いだした（１３３±１５ｂｐ／ｙ対
４１±７．７ｂｐ／ｙ；ワン・テイルド・ｔ−試験、ｔ
＝５．７１、ｐ＜０．０００５）（図８）。
【０１６３】細胞倍加の関数としてテロメア損失速度を
測定するために、本発明者らは、複製老化まで、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでの２人の個体からの正常なリンパ球を培養
し、数回の集団倍加レベルでの平均ＴＲＦ長さを測定し
た（図９）。平均ＴＲＦ長さは、他のヒト体細胞タイプ
について観察された範囲内で、これらの株中で９０ｂｐ
／集団倍加減少した。ここに示したリンパ球細胞株につ
いての老化時の平均ＴＲＦ長さおよび最終継代で分析し
たもう１つ（図９）は、５．１±０．３５ｋｂｐであっ
た。１００歳程度の人（５．３±０．４ｋｂｐ）および
年老いたＤＳ患者（４．８９±０．５９ｋｂｐ）のＰＢ
Ｌについてのｉｎ ｖｉｖｏで観察されたＴＲＦ値は、
この値に近かった。これは、これらの個体からの細胞の
フラクションがそれらの複製能の限界に近かったことを
示唆している。
【０１６４】正常な個体からのＰＢＬ中のテロメアがｉ
ｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの加齢の間に短
縮するということを示す結果は、ヒト線維芽細胞上での
同様の観察結果を与え〔ハーリィ（Ｈａｒｌｅｙ）ら、
３４５、ネイチャー、４５８、１９９０〕、テロメア損
失が複製老化に含まれるという仮説を支持する。本発明
者らは、またダウン症候群において、ｉｎ ｖｉｖｏで
のＰＢＳにおけるテロメア損失速度が年齢匹敵正常ドナ
ーにおけるよりも有意に高かったことも見いだした。し
たがって、早期免疫老化および他の加速加齢の特徴によ
って特徴付けられる症候群である三染色体性２１のＰＢ
Ｓ中の加速したテロメア損失〔マーチン（Ｍａｒｔｉ
ｎ）、「ジェネティク・シンドロームズ・イン・マン・
ウイズ・ポテンシャル・リバンス・トゥ・ザ・パソバイ
オロジー・オブ・エイジング」（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙ
ｎｄｒｏｍｅｓ ｉｎ Ｍａｎｗｉｔｈ Ｐｏｔｅｎｔ
ｉａｌ Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｐａｔｈ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ）：ジェネティク
・エフェクツ・オン・エイジング（Ｇｅｎｅｔｉｃｅｆ
ｆｅｃｔｓ ｏｎ Ａｇｉｎｇ）、バーグスマ，ディ
（Ｂｅｒｇｓｍａ，Ｄ．）およびハリソン・ディ・イー
（Ｈａｒｒｉｓｏｎ Ｄ．Ｅ．）（編集）、第５−３９
頁、バース・ディフェクツ（Ｂｉｒｔｈ Ｄｅｆｅｃｔ
ｓ）：オリジナル・アーティクル・シリーズ（Ｏｒｉｇ
ｉｎａｌ ａｒｔｉｃｌｅ ｓｅｒｉｅｓ）、第１４
号、ニューヨーク：アラン・アール・リス（Ａｌａｎ
Ｒ．Ｌｉｓｓ）（１９７８）〕は、リンパ球の初期老化
を示すことができた。
【０１６５】ＤＳ患者からのＰＢＳにおける高いテロメ
ア損失速度は、三染色体性２１細胞の低下した生存率の
ために、ｉｎ ｖｉｖｏでの高い細胞ターンオーバー速
度を示すことができた。しかしながら、ＤＳ患者からの
ＰＢＳにおけるテロメア損失速度は、細胞倍加当たり、
正常な個体におけるよりも大きいこともある。
【０１６６】ＤＳの病理学は、多くの場合、正常な加齢
と類似している。ＤＳ患者は、高い癌出現率を有してお
り、自己免疫病に罹るので、免疫系の早期老化は、この
類似性における役割を果たすのが可能である。この思想
を支持して、年老いたＤＳ患者のリンパ球および年老い
た個体は、抗原に対する応答において活性化および増殖
されるためのＴ−細胞の減少した応答、低い複製能なら
びに減少したＢ−およびＴ−細胞数を含むいくつかの特
徴を共有している〔フランセス（Ｆｒａｎｃｅｓｈｉ）
ら、６２１、Ａｎｎ，ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、４２
８、１９９１〕。本発明者らの、テロメア長さが正常な
個体よりもＤＳ患者において速く減少したこと、および
ｉｎ ｖｉｖｏにおける１００歳程度の人および年老い
たＤＳ患者の平均ＴＲＦ長さがｉｎ ｖｉｔｒｏでの老
化リンパ球のものと同様であった（＝５ｋｂｐ）という
発見は、これらの観察結果を与える。さらにまた、これ
らのデータは、ｉｎ ｖｉｖｏでのリンパ球系列内の複
製老化が若い個体およびダウン症候群患者の両方の日和
見免疫系に寄与することを示唆している。
【０１６７】実施例７：卵巣癌およびテロメラーゼ活性 以下の記載はテロメラーゼ活性が癌細胞の存在と相関し
ていることを示す方法の一例である。加えて、ＴＲＦ長
を腫瘍細胞の存在を表示するものとして測定した。一般
に、腫瘍細胞は、周辺の正常細胞よりも有意に低いＴＲ
Ｆ値を有し、テロメラーゼ活性を有することがわかっ
た。かくして、これらの２つの特徴は腫瘍細胞の存在に
ついてのマーカーである。
【０１６８】以下に示す方法を用いてこれらの結果を得
た：腫瘍と非腫瘍細胞の分離 一の方法にて、（卵巣癌であると診断された患者から）
診断側腹部切開または治療穿開により腹水を得、６００
Ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離に付した。細胞ペレッ
トを１０〜３０ｍｌのリン酸緩衝セイライン（ＰＢＳ：
２．７ｍＭ ＫＣ１、１．５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１３７
ｍＭ ＮａＣｌおよび８ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4）中に２回
洗浄し、５７０Ｘｇで４分間、４℃で遠心分離に付し
た。最終洗浄を行った後、細胞ペレットを再びＰＢＳ２
０ｍｌに懸濁させ、単細胞は保持しないが、腫瘍塊を保
持する３０または１０μｍのナイロンメッシュフィルタ
ー（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（スペクトル））を介して濾過し
た。フィルターを逆流させて洗浄し、高精製の腫瘍塊を
遊離させた。フロースルーは、繊維芽細胞、リンパ球お
よび腫瘍細胞の組み合わせであった。
【０１６９】もう一つ別の方法にて、腹水細胞を収集
し、前記の方法にて洗浄した。細胞ペレットを１０％ウ
シ胎児血清を含むａ−ＭＥＭに再び懸濁させ、１５０ｍ
ｍ皿にて培養した。１２時間後、培地を取り除き、新た
なプレートを用いて、該培地中の付着繊維芽細胞を非付
着細胞より分離した。１２時間後、主として腫瘍塊を含
有する培地をその第２のプレートから取り除き、３％ウ
シ胎児血清、５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、５μｇ／ｍｌのイ
ンスリン、１０μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン、５
×１０-5Ｍのホスホエタノールアミンおよび５×１０-5
Ｍのエタノールアミンを補足したＤＭＡ Ｆ１２培地中
にて付着させた。これらの腫瘍細胞をＤＮＡ分析および
Ｓ１００抽出物のために培養した。
【０１７０】ＤＮＡ抽出 細胞を溶解させ、タンパクを１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＥ
ＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌのプロテイ
ナーゼＫ中、４８℃で一夜消化した。フェノールで２
回、そしてクロロホルムで１回抽出した後、エタノール
を用いてＤＮＡを沈殿させ、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＴＥ）に溶かし
た。
【０１７１】ＴＲＦ長およびテロマーＤＮＡの量の測定 ゲノムＤＮＡをＨｉｎｆＩおよびＲｓａＩで消化し、前
記のように抽出および沈殿させ、ＴＥに再び溶かした。
ＤＮＡ濃度を蛍光測定により測定した（モーガン（Ｍｏ
ｒｇａｎ）ら、７ ヌクレイック・アシッド・レス（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．），５４７，１９７
９）。ＤＮＡ試料（各１μｇ）を０．５％アガロースゲ
ル上に負荷し、９０Ｖで１３時間電気泳動させた。該ゲ
ルを６０℃で３０分間乾燥させ、１．５Ｍ ＮａＣｌお
よび０．５Ｍ ＮａＯＨ中に１５分間変性させ、１．５
Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）中に１０分間中和させ、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ
ＮａＣｌおよび７５ｍＭナトリウムシトレート）、５×
デンハート（Ｄｅｎｈａｒｔ）溶液（マニアティス（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー・クローニング；ア
・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ），コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ）（１９８２）および
０．１×Ｐ洗浄液（０．５ｍＭピロリン酸塩、１０ｍＭ
Ｎａ2ＨＰＯ4）中、３７℃で１２時間、５’32Ｐ（Ｃ
ＣＣＴＡＡ）3テロマープローブと雑種形成させた。
０．２４×ＳＳＣ中、２０〜２２℃で３回、厳重に洗浄
を行った後（各洗浄、７分間）、ゲルを増強スクリーン
を用いプレフラッシュ（ＯＤ＝０．１５）したコダック
ＸＡＲ−５ Ｘ線フィルムにて３日間オートラジオグラ
フィーに付した。各レーンを濃度計でスキャンし、その
データを用い、前記したようにテロマーＤＮＡの量およ
び平均ＴＲＦ長を測定した（ハーレー（Ｈａｒｌｅｙ）
ら、３４５ ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４５８、１９
９０）。
【０１７２】Ｓ−１００細胞抽出物の調製 各抽出物について、最小６×１０8個の細胞を用いた。
腹水または精製した腹水腫瘍細胞（前記の第１の方法に
よる）を５７０×ｇで４分間４℃にて遠心分離に付し
た。前記の第２の方法により分離した腹水腫瘍細胞（単
層にて増殖）をラバー冠ポリスマンでこすり落とすこと
で収穫し、前記のように遠心分離に付した。ペレットを
冷ＰＢＳ中にて２回リンスし、つづいて前記のように遠
心分離に付した。最終ペレットを冷２．３×Ｈｙｐｏ緩
衝後（１×Ｈｙｐｏ緩衝液：１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐ
Ｈ８．０））、３ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、
１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１０Ｕ／
ｍｌのＲＮＡｓｉｎ、１μＭロイペプチンおよび１０μ
ＭペプスタチンＡ中にリンスし、５分間遠心分離に付
し、０．７５倍容量の２．３×Ｈｙｐｏ緩衝液に再び懸
濁させた。氷上で１０分間インキュベートした後、その
試料を氷冷した７または１ｍｌのデュンス（Ｄｏｕｎｃ
ｅ）ホモジナイザーに移し、Ｂペストル（２５〜５５μ
ｍクリアランス）を用いて氷上にて均質化した。氷上に
てさらに３０分間経過した後、１ｍｌより大きな容量の
試料を、ベックマンＪ３−１３．１（Ｂｅｃｋｍａｎ
Ｊ３−１３．１）スイングバケットローター中、１０，
０００ｒｐｍ（１６，０００ｘｇ）で１０分間４℃で遠
心分離に付した。１５分の１の容量の５Ｍ ＮａＣｌを
加え、その試料上澄をベックマンＴｉ５０ローター中、
３８，０００ｒｐｍ（１００，０００ｘｇ）で１時間４
℃で遠心分離に付した。２０％の最終濃度までグリセロ
ールを加え、抽出物をアリコートし、−７０℃で貯蔵し
た。１ｍｌより小さな試料は、ＴＬＡ１００．２ロータ
ー（ベックマン）中、５５，０００ｒｐｍで１時間４℃
で遠心分離に付し、ＮａＣｌおよびグリセロールを前記
のようにその上清に加えた。典型的な抽出物中のタンパ
ク濃度は約４ｍｇ／ｍｌであった。
【０１７３】テロメラーゼ検定 テロメラーゼ活性をモリン（Ｍｏｒｉｎ）法、５９セル
（Ｃｅｌｌ）５２１，１９８９の変形により検定した。
Ｓ−１００細胞抽出物のアリコート（２０μｌ）を２ｍ
Ｍ ｄＡＴＰ、２ｍＭ ｄＴＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、１μＭ（ＴＴＡＧＧＧ）3プライマー、３．１３μ
Ｍ（５０μＣｌ）ａ−32Ｐ−ｄＧＴＰ（４００Ｃｉ／ミ
リモル）、１ｍＭスペルミジン、５ｍＭβ−メルカプト
エタノール、５０ｍＭ酢酸カリウムおよび５０ｍＭトリ
ス−酢酸塩（ｐＨ８．５）を含有する４０μｌの最終容
量に希釈した。いくつかの実験において、反応容量を２
倍にした。反応物を６０分間３０℃でインキュベート
し、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）（０．１ｍｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅＡを含
有）５０μｌを添加することにより反応を停止させ、つ
づいて３７℃で１５分間インキュベートした。タンパク
を評価するのに、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、０．５％ＳＤＳ中、０．３ｍｇ／ｍｌのプロテイ
ナーゼＫ５０μｌを３７℃で１０分間にわたって加え
た。フェノールおよびクロロホルムで抽出した後、該試
料を、ニック・スピン（ＮＩＣＫ ＳＰＩＮ）カラム
（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を介し、スイ
ング・バケット・ローター中、５００ｘｇで４分間遠心
分離に付すことにより、組み込まれていないａ−32Ｐ−
ｄＧＴＰを分離した。４Ｍ ＮａＣｌ ５．３μｌ、キ
ャリアｔＲＮＡ ４μｇおよびエタノール５００μｌを
−２０℃で加えることによりＤＮＡを沈殿させた。ＤＮ
Ａペレットをホルムアミド充填色素３μｌに再び懸濁さ
せ、１分間煮沸し、氷上にて冷却し、８％ポリアクリル
アミド、７Ｍ尿素の連続ゲル上に負荷し、０．６×ＴＢ
Ｅ緩衝液を用い、１７００Ｖで２時間操作した。乾燥ゲ
ルを増強スクリーンと一緒に−７０℃でコダックＸＡＲ
−５プレフラッシュフィルムに、またはホスホイメージ
ャースクリーン（モレキュラー・ダイナミックス（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）に７日間暴露した。
【０１７４】前記実験の結果を以下の第２表および第３
表に示す：
【表２】 ＡＴＣＣ卵巣細胞株の特徴 細胞株 平均ＴＲＦ長（ｋｂｐ） テロメラーゼ活性 ＨＥＹ ３．７で安定 ＋ ＣＡＯＶ−３ ３．７で安定 Ｎ．Ｄ． ＳＫＯＶ−３ ６０ｂｐ／ｐｄで増加 Ｎ．Ｄ．
【表３】 腹水由来の卵巣癌腫瘍細胞の特徴 患者 記載 平均ＴＲＦ長 テロメラーゼ （ｋｂｐ） 活性 Ｐｒｅｓ−３ 精製した腫瘍細胞 ３．７ ＋ Ｍａｃ−２ 精製した腫瘍細胞 ３．７ Ｎ．Ｄ． Ｓｉｂ−１ 精製した腫瘍細胞 ４．２ Ｎ．Ｄ． Ｒｉｃ２０７ 精製した腫瘍細胞 ３．３ Ｎ．Ｄ． Ｃｒａ−１ 精製した腫瘍細胞 ５．２ Ｎ．Ｄ． Ｉｎｇ−１ 精製した腫瘍細胞 ５．８ Ｎ．Ｄ． Ｌｅｐ−１ 精製した腫瘍細胞 ５．８ Ｎ．Ｄ． Ｌｅｐ−４ 精製した腫瘍細胞 ５．６ Ｎ．Ｄ． Ｓｏｌ−１ 精製した腫瘍細胞 ５．６ Ｎ．Ｄ． Ｒｕｄ−１ 腹水細胞 ３．４ ＋ Ｍｕｒｒ−１ 腹水細胞 ３．８ ＋ Ｄｅｍ−１ 腹水細胞 Ｎ．Ｄ． ＋ Ｃａｓ−１ 腹水細胞 ５．３ ＋ Ｗａｄ−１，２ 腹水細胞 ４．９ Ｎ．Ｄ．＊ Ｎ．Ｄ．＝測定せず ＊ 高バックグラウンド排除の検出 第４表は腹水由来の細胞のＴＲＦ長を示す。サイズの範
囲２〜２１ｋｂｐにわたって２つのオートラジオグラフ
の最小値を濃度計でスキャンし、その温度計の値を用い
て平均ＴＲＦ長をｋｂｐにて測定した。該データの平均
標準偏差は０．５ｋｂｐであり、最大偏差は２ｋｂｐで
あった。３文字の患者コードの後の数は穿開数をいう
（すなわち、ＯＣ１−１はＯＣ１患者の最初の試料をい
う）。Ｅ（初期）と定義されている試料は提供時付近で
得たのに対して、試料Ｌ（後期）は死亡付近で得た。穿
開術を４〜２２カ月の過程で４〜１５回行った。
【０１７５】
【表４】 ＊ 少なくとも３０ＰＤの経過にわたって各試料に
ついて平均ＴＲＦ長を測定した。ＴＲＦはすべての集団
で安定しているため、平均化した。
【０１７６】＊＊ すべての試料の平均ＴＲＦ長の平
均値および標準偏差 ＊＊＊ ＯＣ２２−１３を含む平均値 第５表は正常細胞および腫瘍細胞におけるテロメラーゼ
活性を示す。白血球および腹水細胞を単離し、腹水細胞
を正常および腫瘍フラクションに分別し、テロメラーゼ
活性について検定した。すべての抽出物のタンパク濃度
は＜２ｍｇ／ｍｌ、すなわち、対照の２９３ＣＳＨ抽出
物にて活性が検出された最低濃度の２０倍であった。
【０１７７】
【表５】 分別 非分別 テロメラーゼ テロメラーゼ活性 患者 活性 患者 正常 腫瘍 ＯＣ４−１ ＋ ＯＣ１９−３ Ｎ．Ｄ． ＋ −５ ＋ ＯＣ１７−１ − Ｎ．Ｄ． ＯＣ２−１ ± ＯＣ８−１ − Ｎ．Ｄ． ＯＣ１−１ ＋ ＬＥＫ − Ｎ．Ｄ． ＯＣ２３−１ ＋ ＴＲＦ検定にて、腫瘍塊は、各々、関連する正常細胞よ
りもＴＲＦ長が有意に短かった。（第１０図参照）。
【０１７８】テロメラーゼ検定にて、ある患者の腹水に
おけるテロメラーゼ活性は、対照腫瘍株ＨＥＹおよびＰ
ＲＥＳ、または対照細胞株２９３ＣＳＨにおけるよりも
有意に大きいことは明らかであった（第１１，３３
図）。
【０１７９】実施例８：ＴＲＦ長についてのＨＩＶ感染
の効果 ＨＩＶ感染は、ウイルス様症候群としての徴候が現れる
急性ウイルス感染症に、ついで症状および徴候のないこ
とにより特徴付けられる長期間の潜伏期間に至る。この
長期の無症候性期間（通常、７〜１０年続く）の間、ウ
イルス被覆タンパクに対する抗体の有無以外に感染症の
過程の発達段階について利用できる診断法はない。これ
は疾患の発達の段階を明らかにし、または予防薬の効果
を医者が測定する手助けとなることはほとんどない。
【０１８０】メイアード（Ｍｅｙａａｒｄ）らは、２５
７サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２１７，１９９２に
て、ＨＩＶ感染対象のＣＤ４+およびＣＤ８+細胞につい
てのプログラムされた細胞死を提案しているが、本願発
明者らは、その７〜１０年間、免疫系が感染症を相対的
に抑制された状態に維持しうるが、感染したＣＤ４+Ｔ
−細胞のターンオーバーの著しい増加があることを提案
する。これは、いくぶん、ウイルス媒介細胞破壊による
ものである。本願発明者らは、このことが、本質的に、
特定の副次集団のＴ−細胞の複製老化を促進し、時間と
共に、増殖能が著しく減少した多能性細胞先駆体の集団
を生じさせると提案している。最終的に、これは、刺激
に対して相対的に非応答性であって増殖するＣＤ４+Ｔ
−細胞をもたらし、それはイン・ビトロにて観察される
細胞の増殖性老化の典型である。
【０１８１】本願発明者らはさらに、全末梢リンパ球ま
たはＣＤ４+細胞の複製能が、特に、前記の方法を用
い、例えば、分子の大きさのマーカーと一緒に、患者か
ら単離されたＣＤ４+リンパ球ＤＮＡに雑種形成された
オリゴヌクレオチドプローブ５’ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ
ＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ（または同様のもしくは
相補配列の一つ）を用いて、テロメア反復長を検定する
ことにより効果的に測定できると提案している。これら
の検定は、医者が、長い無症候性期間の間、該疾患の過
程をチャートし、予防的療法の効果を評価することを可
能とする。
【０１８２】ＴＲＦ長がＨＩＶ感染症の診断における有
用なマーカーであるかどうかを決定するために、無症候
性ＨＩＶ−感染対象についてＣＤ４+細胞の計数を行
い、前記のように測定したＴＲＦ長と比較した。前記に
示されるように、末梢リンパ球は誕生の際には約１０ｋ
ｂのＴＲＦ長であり、約年齢１２０歳で５．０のＴＲＦ
長となる。結果は以下のとおりである：ＣＤ４数が４７
６の３０歳のＨＩＶ＋は、７．６のＴＲＦを有した。
【０１８３】４６歳のＨＩＶ−対照は、７．０のＴＲＦ
を有した。
【０１８４】ＣＤ４数が３３６の３４歳のＨＩＶ＋は、
７．７のＴＲＦを有した。
【０１８５】４６歳のＨＩＶ−対照は、７．１のＴＲＦ
を有した。
【０１８６】ＣＤ４数が４４８の３２歳のＨＩＶ＋は、
６．９のＴＲＦを有した。
【０１８７】ＣＤ４数が３５８の３３歳のＨＩＶ＋は、
５．０のＴＲＦを有した（すなわち、老化細胞について
観察される長さであった）。
【０１８８】該結果は、３３歳のＨＩＶ＋患者がＣＤ４
+細胞にて老化テロメア長を有することを示唆し、それ
は該細胞がその複製能が末期であることを意味する。対
照的に、ＣＤ４+数はこの患者の症状について何ら徴候
を示さなかった。実際、一の患者では、ＣＤ４+数が低
かった。
【０１８９】検定の２週間後、この患者はＣＤ４+数の
著しい低下、３５８から１５９への低下を経験し、した
がってＡＩＤＳと診断され、速やかに舌にてロイコプラ
キーを獲得した。他の患者は無症候性を保持した。すな
わち、この診断操作は、ＨＩＶ感染症の過程の末期に近
い患者を区別することができ、それに対して今まで使用
されているマーカー（ＣＤ４+数）は区別することがで
きなかった。
【０１９０】ＨＩＶ感染症の過程の間で、ＣＤ４+リン
パ球の促進された複製老化は、テロメア短縮を防止する
ようにデザインされた、例えば、前記のようなＣＴＯオ
リゴヌクレオチドを用いる、治療についての適当な必要
性を示す。加えて、前記したように、感染の初期段階に
ある患者のＣＤ４+細胞を、その患者に後に投与するた
めに預けることができる。ＡＴＺのような薬剤の効能は
また、該薬剤がＣＤ４+細胞の増殖速度を減少させるか
どうか、すなわち該疾患のあらゆる段階で有用であるか
どうかを研究するために測定される。有用でないなら
ば、該薬剤は該疾患の過程で必要な場合にのみ投与でき
る。
【０１９１】実施例９：ヒト哺乳動物上皮（ＨＭＥ）細
胞のテロメア短縮 図１２を参照して、４−塩基の認識部位を有する制限酵
素（Ｈｉｎｈ１のような）で消化した場合、ゲノムＤＮ
Ａの大部分は小さなフラグメントに消化される。しか
し、反復テロマー配列は制限部位を欠くため、テロメア
は、２〜５ｋｂのサブテロマーＤＮＡと年齢依存のテロ
マー反復量からなる相対的に大きな末端制限フラグメン
ト（ＴＲＦ）を保持する。ヒト繊維芽細胞、リンパ球お
よび内皮細胞について前記したように、テロメア長は、
イン・ビトロにおける細胞老化の間、（レーン１（ＰＤ
Ｌ２１）およびレーン２（ＰＤＬ４０）におけるＴＲＦ
長と比較して）正常なヒト哺乳動物上皮細胞にて短縮さ
れる。ヒト乳頭腫ウイルス１６のＥ６を発現するヒト哺
乳動物上皮細胞において、ＴＲＦ長は、危機的状況とな
り、その後に不死が起こるまで、伸長された寿命の間、
短縮し続ける（レーン３（ＰＤＬ６８）。ＴＲＦは、一
般に、不死細胞（レーン４（ＰＤＬ８１）およびレーン
５（ＰＤＬ１０７））にて安定化し、テロメラーゼ活性
の再発現と矛盾しない。
【０１９２】実施例１０：哺乳動物の上皮細胞における
テロメア喪失の遅れは複製寿命の増加をもたらす 正常なヒト哺乳動物上皮細胞はオルガノイド（乳房形成
の減少により得られる）より確立でき、血清不含の標準
培地（ＭＣＤＢ１７０）中、制限条件にて培養できる。
典型的な丸石形態の上皮細胞がこの培地中に置かれたオ
ルガノイドの回りに広がる。最初の二次培養後、小さ
な、高複屈折性の速やかに分割する細胞の集団がより大
きな細胞の間に伸長するまで、これらの培養物は２〜３
週間の増殖阻止期間にはいる。培地（ＭＣＤＢ１０４）
は、明らかに、高増殖能を有するほとんど分化されてい
ない細胞型を選択する。これらの細胞は、細胞老化を受
ける前に、さらに４０〜４５回の倍加にて二次培養でき
る。
【０１９３】実施例１にあるように、増殖寿命における
変化および指示量のＣＴＯ（時に、Ｃ−リッチの末端反
復単位（ＣＴＲ）という）で処理した培養哺乳動物上皮
細胞におけるテロメア短縮速度を、対照のランダムオリ
ゴヌクレオチドと比較した。ドナー（３１）からの正常
なヒト哺乳動物上皮細胞をヒト乳頭腫ウイルス１６のＥ
６遺伝子で感染させた。この遺伝子産物はｐ５３タンパ
クと結合し、危機的状況となった時に、ＨＭＥ３１細胞
を、ＰＤＬ４２からＰＤＬ６２までの増殖により、寿命
を伸長させることができる。この伸長された寿命の間
に、ＴＲＦは平均が約５ｋｂから２．５ｋｂに短縮する
（図１２のＨＭＥ３１ ＰＤ４０とＨＭＥ３１Ｅ６ Ｐ
Ｄ６８の比較）。
【０１９４】図１３にて示されるように、ＰＤＬ３６で
のＨＭＥ３１Ｅ６を用いて開始した実験体を３、１０、
３０および１００μＭのＣＴＯの存在下にて培養した。
対照として、オリゴヌクレオチド（ｎｉｌ）なしで、ま
たは３０μＭのランダムオリゴヌクレオチドと一緒に細
胞を培養した。図１３は、ｎｉｌ対照および３０μＭの
ランダムオリゴヌクレオチドと比較して、ＰＤＬ３６と
５０の間で、ＴＲＦ短縮の用量関連の阻止があったこと
を示す。これは、別個のトレールバンドを付与する、レ
ストよりもよりゆっくりと移動するテロメアＴＲＦの副
次集団を試験することにより容易に観察される。培地を
変え、１週間に３回新たなオリゴヌクレオチドを添加
し、細胞を対数増殖に維持した。
【０１９５】ＨＰＶ１６Ｅ６を発現するヒト哺乳動物上
皮細胞はＭ１を迂回し、複製寿命を伸長させた。ＨＭＥ
３１細胞は、通常、ＰＤＬ４２〜４５で老化する。Ｅ６
を発現すると、Ｍ１を迂回し、ＰＤＬ５３〜６２で危機
的状況（Ｍ２）に達するまで分割する。ＰＤＬ４０での
ＨＭＥ３１（Ｅ６）細胞におけるＴＲＦは、約５〜６ｋ
ｂであるのに対して、ＰＤＬ６２では３〜４ｋｂである
（図１２参照）。図１７に示されるように、ＰＤＬ３６
のＨＭＥ３１Ｅ６細胞を用いて開始した実験を、血清不
含の制限培地中、３０μＭおよび１００μＭのＣＴＲの
存在下にて培養した。対照として、細胞をオリゴヌクレ
オチド（対照）なしで、またはＣＴＲオリゴヌクレオチ
ドに適合する塩基内容物を含む、３０μＭのランダムオ
リゴヌクレオチドと共に培養した。図１７は、対照およ
び３０μＭのランダムオリゴヌクレオチドと比較した場
合、ＣＴＲオリゴヌクレオチドで処理した細胞にて、用
量に関連して複製寿命の伸長があった。対照細胞は実験
の間に約２０回分割したのに対して、ＣＴＲ処理細胞は
少なくとも４０〜５０回分割した。これらの結果は図１
３にて観察されるテロメア短縮の阻止とよく相関する。
【０１９６】実施例１１：ＩＭＲ９０繊維芽細胞の寿命
の伸長 図１４を参照して、ＰＤＬ３０のＩＭＲ−９０肺繊維芽
細胞ＴＲＦを１０μＭ、３０μＭまたは１００μＭのホ
スホジエステルＣＴＯで、または単に培地を添加するだ
け（対照）で処理した。細胞をウシ血清を補足して制限
されたレギュラー含有の培地にて培養した。細胞を２４
個のウェル皿にて継代させ、ウェル当たり２５，０００
細胞で全面成長するまでトリプシン処理に付すことで二
次培養した。該細胞に、毎日、種々の濃度のオリゴヌク
レオチド含有の培地を付与した。対照として、細胞にオ
リゴヌクレオチド不含の同一培地を付与した。図１４に
示すように、ＣＴＯで、全寿命が約１２〜１５％伸び
た。これらの実験にて、対照細胞は実験の間に約１５〜
１８回分割したのに対して、処理細胞は２３〜２６回分
割した。ＩＭＲ−９０テロメアは、１回の分割当たり約
５０ｂ．ｐ．短縮し、老化の際の対照ＩＭＲ−９０繊維
芽細胞のＴＲＦの長さは約９ｋｂであった。１００μＭ
のＣＴＯ処理ＩＭＲ−９０細胞はＰＤＬ５５で老化する
ため、対照と１００μＭのＣＴＯの間にあるＴＲＦ喪失
速度の違い（９ｋｂ対９．４ｋｂ）は、非常に小さく、
通常の技法を用いて分離できない。
【０１９７】実施例１２：ＧＴＯ実験 実施例２に示すように、非常に短いＴＲＦを有する、不
死ヒト繊維芽細胞株、ＩＤＨ４を、ＧＴＯオリゴヌクレ
オチドと一緒にインキュベートした。図１５および図１
６を参照して、１０μＭ、３０μＭおよび１００μＭの
ＧＴＯの存在下、細胞を血清含有レギュラー培養培地に
てインキュベートした。該細胞に、一日おきに新たなホ
スホジエステルＧＴＯオリゴヌクレオチドを付与し、二
次培養し、合計９０日間で集密的状態になった。細胞
は、たとえ、高ＧＴＯ濃度でさらにゆっくりと増殖し、
わずかに集合倍加するとしても、用いた全ての濃度で、
９０日経過後でもなおＧＴＯ中で増殖した（対照、４５
ＰＤＬ；１０μＭ ＧＴＯ４０ＰＤＬ；３５μＭ ３５
ＰＤＬ；１００μＭ ２５ＰＤＬ）。ＴＲＦ分析を９０
日後に行った場合、ＩＤＨ４細胞は、用量依存的方法に
て、３０μＭと１００μＭで、ほぼ同じであるＴＲＦ長
を得た（図１５）。これは、細胞中の過剰の一本鎖ＴＴ
ＡＧＧＧ ＤＮＡの存在が、おそらく、テロメラーゼの
フィードバック調整に影響を及ぼし、実際、テロメラー
ゼ活性を増加させ、テロメア長を伸長させたことを示唆
する。対照および３０μＭ ＧＴＯをオリゴヌクレオチ
ドの添加なくさらに９０日間継代した（約３５〜４０Ｐ
ＤＬ）。図１６に示されるように、ＴＲＦはゆっくりと
短縮する。
【０１９８】これらのデータおよび実施例２のデータ
は、細胞株はＧＴＯオリゴヌクレオチドに対するその応
答にて異なることを示す。かくして、治療用組成物にて
そのようなオリゴヌクレオチドを使用する前に、標的細
胞を所望のように応答させることが重要である。前記に
示す効果が起こるならば、その場合、オリゴヌクレオチ
ドはその応答を実施例２に示す応答に変えるように選択
されるべきである。これは、ＧＴＯが結合する部位と異
なる部位でテロメラーゼに結合するオリゴヌクレオチド
を選択することにより行うことができる。本願出願人は
前記の観察される効果がＧＴＯの必要なタンパクへの結
合により引き起こされ、テロメラーゼが活性化し、テロ
メアを伸長させると考える。かくして、そのような蛋白
質に結合しないオリゴヌクレオチドを選択することによ
り、テロメラーゼ活性を減少させる所望の効果を得るこ
とができる。
【０１９９】実施例１３：テロメラーゼの小分子阻害 以下はテロメラーゼの阻害剤としての小分子の活性をス
クリーニングする方法の実施例である。類似の実施例が
当業者には明らかであろう。スクリーン可能な化合物に
は、直ちには細胞死を引き起こさないため、細胞毒性が
あるとは考えられていないものも含まれる。どちらかと
いえば、そのような化合物はテロメラーゼ活性の阻害が
数回生じた後にのみ作用する。それゆえ、標準的方法で
試験された以前の薬剤は、本明細書中で請求されるごと
く、それらの有益性を決定するために再試験されるべき
である。テロメラーゼ活性を阻害し、もしくはある場合
にはインビボ（例えば、転写段階のレベル）でそれを活
性化する薬剤は、本明細書中に記載される病気の治療に
有用である。
【０２００】本発明者らは、テトラヒメナ・サーモフィ
ラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ａ）のインビボのテロメラーゼ活性、およびテロメアの
長さ、ならびにテトラヒメナ細胞のインビボにおける維
持、細胞分裂、接合におけるレトロウイルスの逆転写酵
素の鎖終結阻害剤である種々のヌクレオシドアナログの
効果を分析した。テロメラーゼ活性のインビトロ分析よ
り、低い阻害剤濃度においてさえも、アラビノフラニル
−グアノシントリホスフェート（Ａｒａ−ＧＴＰ）およ
びｄｄＧＴＰは、双方とも、ラベルしたヌクレオチドの
テロメアＤＮＡ繰り返し配列への取り込みの、非常に効
果的な阻害剤である一方で、アジドチミジントリホスフ
ェート（ＡＺＴ−ＴＰ）、ジテオキシイノシントリホス
フェート（ｄｄＩＴＰ）もしくはｄｄＴＴＰは取り込み
の、あまり効果的な阻害剤ではないことが示された。し
かしながら、これら全てのヌクレオシド三リン酸のアナ
ログは、テロメラーゼの合成産物の電気泳動に見られる
通常のバンディング・パターン（ｂａｎｄｉｎｇ ｐａ
ｔｔｅｒｎ）の、アナログ特異的な変化を生み出し、こ
れはＲＮＡ鋳型に沿った、異なる位置では異なっている
拮抗および／または鎖終結作用を示唆する。
【０２０１】テトラヒメナ細胞の成長、接合、およびテ
ロメア長に対するこれらのアナログの効果を試験した。
細胞の分裂速度および生存能力は、Ａｒａ−Ｇを加えた
培養中において、数週間後でも影響を受けなかったが、
テロメア長さは、ＡＺＴもしくはＡｒａ−Ｇを含む培養
中では、一貫して、そして急速に短縮され、細胞分画の
成育速度および生存率は、ＡＺＴ中では減少した。ｄｄ
Ｇ、ｄｄＩ、もしくは３’デオキシ−２’，３’−ジデ
ハイドロチミジン（ｄ４Ｔ）を含む培養での短期間の実
験では、ｄ４Ｔもまた短縮されたテロメアを示した。ｄ
ｄＧまたはｄｄＩはテロメアの長さにおいて効果がなか
った。ＡＺＴＮ Ａｒａ−Ｇ、アシクログアノシン（Ａ
ｃｙｃｌｏ−Ｇ）、ｄｄＧおよびｄｄＩが接合している
細胞に添加されたが、いずれも子孫細胞形成における効
果の定量により示されるように、接合もしくは大核の形
成の不可逆的崩壊を示さなかった。ＡＺＴ中で交配した
細胞からのＤＮＡのＰＣＲ分析は、大核の形成の間のテ
ロメア付加のマーカーである１１ｋｂのｒＤＮＡの形成
における減少を示した。
【０２０２】以下の材料および方法は、これらの結果を
得るために使用された：テトラヒメナ・サーモフィラ株
ＳＢ２１０（ＶＩ）およびＰＢ９Ｒ（ＩＩ）〔ここに
丸括弧内の数字は交配型を示す〕は、１％ＰＰＹＳ（１
％プロテオースペプトン（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））、
０．１％酵母エキス（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））および
０．００１５％セクエストリン（チバ−ガイギー（Ｃｉ
ｂａ−Ｇｅｉｇｙ）））中、室温において、ストックと
して維持された。ストックは毎三週〜四週ごとに継代さ
れた。
【０２０３】ヌクレオシドアナログＡＺＴ（シグマ（Ｓ
ｉｇｍａ））を含む培養からの、またはアナログを欠く
対照からの、栄養分裂中様々な時点における大核ＤＮＡ
の分析のために、静置ストックカルチャーからの細胞
は、２５０ｍｌフラスコ中の、２５ｍｌのチミン欠乏イ
ソ−センシテストブロス（「イソ−ブロス（ｉｓｏｂｒ
ｏｔｈ）」、オキソイド（Ｏｘｏｉｄ）ＵＳＡ）に接種
した。培養を、振とう（１００ｒｐｍ）しながら、３０
℃で４８時間インキュベートした。細胞を計数し、２４
ウェルプレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）中１００
０細胞／１．５ｍｌの割合で接種し、４８時間にわた
り、振とうせずに、３０℃で成育させた。これらの対数
期の細胞５μｌを、ヌクレオシドアナログの様々な濃度
を含む１ｍｌの培地（イソブロス）に接種するために使
用した。その後、毎二日後ないし毎四日後に、細胞を、
多枝型レプリケーターを用いて、ウェルあたり５μｌ、
または１ないし３μｌを、ＡＺＴを含む新鮮な１ｍｌの
ブロスに移した。残った細胞を沈澱させ、ＤＮＡ分析の
ために処理するまで−８０℃に保存した。
【０２０４】ヌクレオシドアナログＡｒａ−Ｇ（カルバ
イオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））、ｄｄＧ（カルバ
イオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））、もしくはｄｄＩ
（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））を含む栄
養培養からの大核ＤＮＡの分析のために、記載されるご
とくストックカルチャーを一晩２％ＰＰＹＳ中で成育さ
せた。細胞を計数し、アナログの種々の量、１％ ＤＭ
ＳＯ（フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ））（ｄｄＧおよ
びＡｒａ−Ｇの対照のため）、もしくは２％ＰＰＹＳの
みを含む、２ｍｌの２％ＰＰＹＳ当たり１００細胞の割
合で接種した。細胞を毎二日ないし毎六日ごとに、新鮮
な培地にレプリカプレートし、残渣の細胞を沈澱させ、
ＤＮＡ分析に使用するまで−８０℃に保存した。
【０２０５】ｄ４Ｔ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含む栄
養培養から、またはそのアナログを欠く対照からの大核
ＤＮＡの分析のために、ストックカルチャー（ＳＢ２１
０ＶＩ）を、記載されたごとくイソブロス中で一晩培養
した。次いで細胞を計数し、二連の培養を５０ｍｌコニ
カルチューブ中、５００細胞／５ｍｌイソブロスの割合
で接種し、８０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で培養し
た。５００ないし２０００個の細胞を毎二日ないし毎四
日ごとに新鮮なブロスに移し、残渣を沈澱させ、ＤＮＡ
分析のために処理するまで−８０℃に保存した。
【０２０６】ヌクレオシドアナログの存在下で接合した
細胞からのｒＤＮＡ分析のため、５０ｍｌの一晩培養液
（２％ＰＰＹＳ）を、細胞を沈澱させ、等容のドリル
（Ｄｒｙｌ’ｓ）溶液に再懸濁することにより飢えさせ
た後、１８時間にわたり３００℃の振とう（１００ｒｐ
ｍ）インキュベーターに戻した。（１×ドリル溶液＝
０．５ｇ クエン酸ナトリウム、０．１６ｇ ＮａＨ2
ＰＯ4・Ｈ2Ｏ、０．１４ｇＮａ2ＨＰＯ4／リットル）。
次いで、細胞を計数し、等しい数を混合した後沈澱させ
（ＩＥＣ卓上遠心機、３／４スピード）、１．５ないし
２×１０6個／ｍｌになるようにドリル溶液に再懸濁し
た。細胞を、６ウェルプレート（ファルコン）に平均密
度１．５細胞／ウェルになるように接種し、振とうせず
に３０℃において６時間接合させた。擬接合したＳＢ２
１０細胞を同様に処理したが、ＰＢ９Ｒ細胞とは混合し
なかった。６時間で培養は接合をチェックされ（＞９０
％、ＳＢ２１０の照を除く）、緩やかに渦巻かせながら
１ｍｌのドリル溶液、またはヌクレオシドアナログ（シ
グマから購入するＡｃｙｃｌｏ−Ｇ）を含む２％ＰＰＹ
Ｓをゆっくりと添加するか、対照としては何の薬剤も添
加しなかった。培養をさらに１８時間３０℃に戻した
後、ＤＮＡ分析のために収集した。
【０２０７】ヌクレオシドアナログＡＺＴもしくはＡｒ
ａ−Ｇを含む単細胞培養からの栄養成長および大核ＤＮ
Ａの分析のために、静置ストックカルチャーからのＳＢ
２１０（ＶＩ）細胞を、５０ｍｌのＰＰＹＳまたはイソ
ブロス中で、振とう（１００ｒｐｍ）しながら３０℃で
一晩培養した。細胞を計数し、適当な培地およびアナロ
グ（２％ＰＰＹＳ中Ａｒａ−Ｇを１ｍＭになるように、
またはＤＭＳＯを対照として１％になるように；イソブ
ロス中ＡＺＴを１０μＭまたは１ｍＭになるように、ま
たは対照としては何も添加しない）に添加し、ウェル当
たり１細胞の密度で、ウェル当たり１００μｌを、９６
ウェルプレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））に接種
した。各のアナログまたは対照につき５プレートを調製
した。ウェルの細胞増殖を測定し、各々の継代当たり、
ウェル当たり約１ないし１０細胞の接種濃度を維持する
よう、毎一日ないし毎二日（Ａｒａ−ＧおよびＤＭＳＯ
プレート）または毎二日ないし毎四日（ＡＺＴおよびイ
ソブロスの対照プレート）ごとにプレートをレプリカプ
レートした。単細胞培養は各継代で移される際の低い見
込みにより、時間がたつにつれ失われるので、プレート
当たり使えるウェルの数を拡大するため、時々、手で
（ピペッターを用い、ウェル当たり１μｌ接種）いくつ
かの空のウェルに入れることにより個々のウェルを継代
した。継代後、細胞を収集し、沈澱させ、ＤＮＡ分析の
ために処理するまで−８０℃で保存した。
【０２０８】ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３５２８−
ＣｓＣｌグラジエント精製工程を省略する以外は、ラル
ソン（Ｌａｒｓｏｎ）らの、セル（Ｃｅｌｌ）、第５０
巻、第４４７頁（１９８７年）に記載されるごとく、実
質的に全細胞ＤＮＡを調製した。
【０２０９】制限消化、アガロースゲル電気泳動、ナイ
トランフィルター（Ｎｙｔｒａｎｆｉｌｔｅｒ）（シュ
ライヒャー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）・アンド・シュエ
ル（Ｓｃｈｕｅｌｌ））へのＤＮＡのトランスファーお
よび、32Ｐ−ニック−トランスレイテッド（ｎｉｃｋ−
ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）もしくはランダム−プライムド
（ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｅｄ）プローブとのハイブリ
ダイゼーションを、標準的工程（マニアティス（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ）ら、１９８９年）により行った。テロメア
の長さを、以前テトロヒメナについて記載されたごとく
〔ラルソン（Ｌａｒｓｏｎ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、第
５０巻、第４７７頁、１９８７年〕、分析した。
【０２１０】アナログの存在下において接合する細胞の
シクロヘキシミド（ＣＨＸ）感受性分析のために、各細
胞タイプの５０ｍｌの培養を、２％ＰＰＹＳ中で一晩培
養し、ドリル中で１８時間飢えさせ、６時間にわたり接
合（５×１０5細胞／ｍｌ）させ、ついでアナログを添
加した。細胞を、アナログの存在下、接合を完結させ
た。混合後２４時間で、細胞をドリル溶液で希釈し、計
数し、アナログ無しの１％ＰＰＹＳ中、９６ウェルプレ
ートのウェル当たり１細胞の割合で接種した。細胞を、
振とうせずに、３０℃において加湿チャンバー中４日間
培養した。細胞を、次いで１％ＰＰＹＳおよび１５μｇ
／ｍｌシクロヘキサミドの上にレプリカプレートし、計
数前に４日間成長させ、ＣＨＸ耐性細胞の割合を計算し
た。シクロヘキサミドマーカーを発現している子孫の誕
生には、新しい大核がうまく生産されることが要求され
るので、大核の形成がアナログにより中断された細胞
は、ＣＨＸ中で殺される。
【０２１１】アナログの存在下接合した培養からのｒＤ
ＮＡの１１ｋｂの型のＰＣＲ分析のために、各テロメア
のプライマー（Ｃ4Ａ2）4１．２５μＭ、およびｒＤＮ
Ａの５’末端から１３７１塩基に位置した２５マーのｒ
ＤＮＡプライマー（５’ＧＴＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＡＡ
ＡＴＣＴＡＡＧＣＧＣ ３’）を、１ｍＭ各ＭｇＣ
ｌ2、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ反応緩衝液
（パーキン・エルマー・シータス（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）、および０．５μｌアンプリタッ
ク・ポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ）を含む反応の「ホット・スタート（ｈｏｔ ｓ
ｔａｒｔ）」において用いられた。試料ＤＮＡとポリメ
ラーゼを、製造者の指示に従い、アンプリワックス（Ａ
ｍｐｌｉｗａｘ）ＰＣＲ Ｇｅｍ １００ Ｗａｘビー
ズ（（パーキン・エルマー・シータス（Ｐａｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ））の使用により分離した状態
に保った。試料を９５℃で１分、次いでパーキン−エル
マー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）サーモサイクラーに
おいて以下のように４０回循環した：９４℃で１分、５
８℃において３０秒、６８℃において３分。同一の反応
を、５’末端から９６１０塩基の位置にある３’大核ｒ
ＤＮＡプライマー、および、５’末端から１０３００塩
基の位置にある（５’ＣＡＡＴＡＡＴＧＴＡＴＴＡＡＡ
ＡＡＴＡＴＧＣＴＡＣＴＴＡＴＧＣＡＴＴＡＴＣ
３’）を用いて行なった。
【０２１２】合成オリゴマーを、グライダー（Ｇｒｅｉ
ｄｅｒ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、第４３巻、第４０５
頁、１９８５年に記載されているごとく調製した。抽出
物を、ブラックバーン（Ｂｌａｃｂｕｒｎ）ら、ゲノム
（Ｇｅｎｏｍｅ）、第３１巻、第５５３頁、１９８９頁
に記載されるごとく調製した。
【０２１３】標準的分析は、無塩緩衝液中の、体積にし
て５０％のヘパリン−アガロースにより精製したテロメ
ラーゼ、２５μＭ ＴＴＰ、１．２５μＭ 32Ｐでラベ
ルしたｄＧＴＰ（４００Ｃｉ／ｍＭｏｌ、アマシャム
（Ａｍｅｒｓｈａｍ））、１μＭ オリゴ（水と混合し
た（Ｔ2Ｇ4）4または（Ｔ2Ｇ4）2のいずれかであって、
２分間９０℃で加熱し、１０分間３０℃で冷却したも
の）、および０．１μｌＲＮａｓｉｎ （４０Ｕ／ｍ
ｌ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を含んでいた。ＡＺ
Ｔ−トリホスフェートはブロウズ・ウェルカム（Ｂｕｒ
ｒｏｕｇｈｓ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）、ノース・キャロラ
イナから入手した。Ａｒａ−Ｇ−トリホスフェートはカ
ルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）から、ｄｄＮＴ
Ｐ混合物はシグマ（Ｓｉｇｍａ）から購入した。反応混
合物を使用の準備が整うまで氷上に放置し、次いで、ア
ナログを含むチューブに混合し、３０℃でインキュベー
ションした。対照として、同一の反応をプライマー無し
で行った。反応を、次いで、グライダー（Ｇｒｅｉｄｅ
ｒ）およびブラックバーン（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ）、ネ
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３３７巻、第３３１頁、
１９８９年に記載されるごとく実質的に行った。定量分
析のために、グライダー（Ｇｒｅｉｄｅｒ）の、セル
（Ｃｅｌｌ）、第４３巻、第４０５頁、１９８５年に記
載されるごとく、反応混合物の一部分をＤＥ８１ペーパ
ーに三連でスポットし、洗浄した。反応速度をモニター
するために、32Ｐ−ＴＴＰまたは32Ｐ−ｄＧＴＰからの
32Ｐラベルの取り込みを測定した。伸長反応混合物の視
覚化のために、試料を９５℃で２分間加熱し氷上で冷却
した後、１２％ポリアクリルアミドゲル／８Ｍ尿素ゲル
に負荷した。
【０２１４】テトラヒメナ由来のテロメラーゼ・リボヌ
クレオプロテイン・エンザイムの機構モデルを図１８Ａ
に示す。該酵素は、酵素のＲＮＡ部分にある鋳型配列を
コピーすることにより、適当なＤＮＡプライマーの３’
末端にＴＴＧＧＧＧ繰り返し配列を合成する。結果を議
論する際の参考の容易のために、鋳型領域の塩基には１
から９までの番号（ＲＮＡに沿って５’から３’方向
に）を付ける。この実施例で用いられる標準的テロメラ
ーゼ分析は、１つの三リン酸が32Ｐでラベルされた、ｄ
ＧＴＰあるいはＴＴＰ基質の、図１８Ａに示される反応
中の合成ＤＮＡへの取り込みからなる。この実施例で議
論される実験のために、ラベルの全体の取り込み率が、
時間がたつにつれて直線になるように予め決定された条
件下で、１μＭ（Ｔ2Ｇ4）4または（Ｔ2Ｇ4）2のいずれ
かをＤＮＡプライマーとして使用した。反応速度をモニ
ターするために、32Ｐ−ＴＴＰまたは32Ｐ−ｄＧＴＰか
らの32Ｐラベルの取り込みを測定し、伸長生産物の分布
は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し
た。
【０２１５】ＡＺＴ−トリホスフェート（ＡＺＴ−Ｔ
Ｐ）の量に増加分を添加することによる、テロメラーゼ
活性の標準的分析への効果を図１９Ａに示す。ＡＺＴ−
ＴＰと同一濃度で添加した、ラベルされていないＴＴＰ
を用いた、一連の対照実験を平行して行った（図１９
Ａ）。ＡＺＴの取り込みは鎖終結につながるので、この
結果は、ＡＺＴがテロメラーゼに対し、ＴＴＰほどには
効果的に競合しないことを示している。類似の結果が、
32Ｐ−ｄＧＴＰの取り込みをモニターした際に得られ
（図１９Ｂ）、ＡＺＴ−ＴＰの濃度が約８０μＭの場合
に、５０％の阻害が起こった。
【０２１６】反応中にアラビノフラニル−グアノシン・
トリホスフェート（Ａｒａ−ＧＴＰ）の濃度を増加させ
ていく類似の実験において、全体の取り込みの顕著な低
下が、低いアナログの濃度においてさえも起こった（図
１９Ｃ）。ラベルしないｄＧＴＰを拮抗剤として加えた
平行する実験より（図１９Ｃ）、これらの反応条件下で
のｄＧＴＰに対するＫｍ値は、１ないし２μＭであるこ
とが判明した。０．７μＭ Ａｒａ−ＧＴＰで５０％阻
害が起こり、それゆえＡｒａ−ＧＴＰは、ラベルしてい
ないｄＧＴＰと同様に、32Ｐ−ＧＴＰに対して、潜在的
に競合する。しかしながら、Ａｒａ−Ｇの取り込みは鎖
終結を引き起こすので、取り込まれた各Ａｒａ−Ｇが、
ラベルしていないｄＧＴＰとの競合よりむしろ、全体の
取り込みにより大きな影響を与えることが期待される。
【０２１７】本発明者らは、テロメラーゼ反応に対する
ジデオキシヌクレオシドトリフェーツ（ｄＮＴＰｓ）の
影響も試験した。テロメラーゼに対して以前示されたよ
うに〔グライダー（Ｇｒｅｉｄｅｒ）ら、セル（Ｃｅｌ
ｌ）、第４３巻、第４０５頁、１９８５年〕、また、多
くの他のリバース・トランスクリプターゼの例のごと
く、ｄｄＮＴＰは、該酵素により認識され、取り込ま
れ、バンディングパターンにおいて、続いておこるシフ
トによる鎖終結と、生産物の、平均の長さの減少を引き
起こす。テトロヒメナとヒト・テロメラーゼの、以前の
定量分析と矛盾せず〔グライダー（Ｇｒｅｉｄｅｒ）、
セル（Ｃｅｌｌ）、第４３巻、第４０５頁、１９８５；
モリン（Ｍｏｒｉｎ）、セル（Ｃｅｌｌ）、第５９巻、
第５２１頁、１９８９年〕、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴ
Ｐは、各、伸長生産物への、ラベルした32Ｐ−ＮＴＰの
取り込みを阻害する（図１９ＤおよびＥ）。ｄｄＧＴＰ
はｄｄＴＴＰよりもずっとより効果的な阻害剤であっ
た：これらの条件下において、５０％阻害が、＜０．１
および５μＭ ｄｄＧＴＰならびにｄｄＴＴＰのそれぞ
れにおいて起こった。以前にテトラヒメナ・テロメラー
ゼにおいてみられたように〔グライダー（Ｇｒｅｉｄｅ
ｒ）、セル（Ｃｅｌｌ）、第４３巻、第４０５頁、１９
８５〕、ｄｄＣＴＰまたはｄｄＡＴＰのいずれに対して
も、顕著な効果は見られなかった。それに加え、ｄｄＩ
ＴＰはテロメラーゼを阻害するが（図１９Ｅ）、ｄｄＧ
ＴＰほどは効果的でなく、３μＭ ｄｄＩＴＰにおいて
５０％の阻害が起こった。
【０２１８】ラベルした生産物のサイズ分布は、変性ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。鎖終結
因子の期待と矛盾せず、コールド（ｃｏｌｄ）・ＴＴＰ
拮抗剤の対照と比較して、ＡＺＴの存在下では、長いほ
うのテロメラーゼ生産物の割合が減少した（図２０Ａ；
レーン１および２を、レーン３ないし７と比較された
し）。生産物の平均の長さもまた、Ａｒａ−ＧＴＰ、ｄ
ｄＧＴＰおよびｄｄＩＴＰの存在下で減少した（図２０
ＡおよびＢ）。それに加え、特有に生産された各ヌクレ
オシド三リン酸アナログおよび、鎖終結の特徴的なパタ
ーンを、伸長生産物のバンディングパターンにおけるシ
フトの分析に示されるごとく生み出す。ＡＺＴについ
て、本発明者らは、Ｔ残基の取り込みに対応するバンド
の、増加した相対強度を見いだした。（鋳型ＲＮＡの２
および３の位置でＡ残基をコピーする（図１８Ａ参
照））。バンディングにおけるこの変化は、単純な鎖終
結と矛盾せず、このことは、双方の取り込まれたＴ残基
と関連するバンドの増加を予言する。類似の効果がｄｄ
ＴＴＰに関して見られた。本発明者らは、このことを、
ＡＺＴが該酵素により認識され、成長途中のテロメアの
配列の正しい位置に取り込まれたのだと解釈する。しか
しながら、二番目のＴの付加に先立つ、鋳型の３の位置
に対応するバンドの相対強度の増加もまた、ＴＴＰとの
競合および位置２でのＡＺＴ−トリホスフェートのより
遅い反応速度に帰することができることには疑いの余地
がない。
【０２１９】Ａｒａ−ＧＴＰに関する結果はまた、Ａｒ
ａ−Ｇの取り込みと、それに続く鎖終結とも矛盾しない
（図２０Ａ、レーン７および８）。Ｇ残基が取り込まれ
得る、そしてそれゆえ鎖終結が起こり得る４つの位置が
あるが、最も強い増加は、テロメラーゼＲＮＡ鋳型の中
央の、位置４により特徴付けられるＧ残基に関するバン
ドにある（図１８Ａ）。ｄｄＧＴＰに関しては、鎖終結
は位置６および５において最も効率的に起こるように思
われ（図２０Ｂ、レーン１を、レーン４ないし６と比較
されたし）、ｄｄＩＴＰに関しては、位置５においてそ
うであるように思われる（レーン７ないし９）。
【０２２０】図１８Ｂには、鋳型に沿った６つの点の各
における多量化に対する種々のトリホスフェートアナロ
グの効果を、模式的に示す。鋳型上の最大の鎖終結が起
こる位置では、阻害剤としてのヌクレオシドアナログの
効率の間に何の関連もない。例えば、テロメラーゼＲＮ
Ａ鋳型上の異なる位置において、潜在的阻害剤であるｄ
ｄＧ−およびＡｒａ−Ｇ−トリホスフェートは、最大の
鎖終結を起こす（ｄｄＧに関しては５の位置および６の
位置、Ａｒａ−Ｇに関しては４の位置）。
【０２２１】鎖終結因子として作用すると期待されるヌ
クレオシドトリホスフェートアナログに加えて、本発明
者らは細菌ＲＮＡポリメラーゼの阻害剤であるリファン
ピンおよびストレプトマインシ硫酸をも試験した。スト
レプトマイシン硫酸は、高濃度において、グループＩの
セルフ−スプライシングイントロンの活性を阻害するこ
とが知られており〔フォン・アーセン（Ｖｏｎ Ａｈｓ
ｅｎ）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、第１９巻、第２２６
１頁、１９９１年〕、Ｇ−リッチなＤＮＡプライマーに
対する特異性の一部分として、テロメラーゼにより認識
され得るであろうグアニジノ基を有する（グライダー
（Ｇｒｅｉｄｅｒ）、セル（Ｃｅｌｌ）、第５１巻、第
８８７頁、１９８７年）。１００μｇ／ｍｌの濃度まで
リファンピンを加えることによっても、定量的なラベル
の取り込みに影響したり、あるいは伸長生産物のバンデ
ィング・パターンを変化させたりはしなかった。４０ｍ
Ｍ ストレプトマイシン硫酸は量を劇的に減少させ（図
１９Ｆ）、４０ｍＭ硫酸ナトリウムの対照に見られるよ
うな微量な活性の減少を伴い、伸長生産物の平均長を減
少させた。しかしながら、ヌクレオシドトリホスフェー
トアナログとは異なり、繰り返し配列の特別な位置にお
ける取り込みには、ストレプトマイシンによる阻害は影
響しないように思われた。ストレプトマイシンによる阻
害は、インビトロにおけるテロメラーゼ活性の基準とし
て、実験的に有用であり得る。しかしながら、ストレプ
トマインシンによる阻害の重要性は、その効果がテロメ
ラーゼのＲＮＡ部分あるいはＤＮＡプライマーのいずれ
かへの非特異的結合の結果である可能性を否定するのは
困難であるため、はっきりしていない。
【０２２２】アナログ類ＡＺＴ、Ａｒａ−Ｇ、ｄｄＴお
よびｄｄＩの三リン酸の付いた形は、各々インビトロに
おいてテロメラーゼを阻害する（種々の効率で）ので、
本発明者らは、これらヌクレオシドアナログの各々を、
細胞成長培地に供給することにより、テロメアの長さあ
るいは老化における、インビボの変化が引き起こされる
かどうかを試験した。付加的に、Ａｃｙｃｌｏ−Ｇおよ
びｄ４Ｔを、接合および栄養細胞の各々に対して試験し
た。
【０２２３】テトラヒメナに関する以前の研究により、
テロメラーゼＲＮＡの、少なくとも一カ所の変化がテロ
メアの短縮および細胞の老化を引き起こすことが示され
た〔ユ（Ｙｕ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３４
４巻、第１２６頁、１９９０年〕。テトラヒメナにおい
て、そのような表現型が、テロメラーゼの阻害剤により
生み出されるのかどうかを試験するために、二連の対数
期の培養を、アナログの種々の濃度の存在下で、延長し
た期間、培養した。これらの培養の成長と細胞の形態学
をモニターし、テロメア長分布のために、ＤＮＡを異な
る時期に単離した。５ないし１０ｍＭのＡＺＴを、イソ
ブロス培地に添加した際に、強く細胞成長を阻害し、一
日のうちに細胞を殺し、それゆえ、これらの濃度におい
て、老化よりむしろ、細胞への即時の毒性を示唆するよ
うな方法で作用する。低濃度（１ｍＭまで）でＡＺＴを
イソブロス培地に添加しても、トランスファー当たり約
１０3細胞の継代培養で維持されている培養の老化を起
こさず、これら細胞培養の５０日にわたる継続的な成長
およびサブカルチャリングを続けた。成長速度の測定に
より、細胞は、この５０日間に、１５０ないし２００の
細胞世代を通過したと見積もられた。類似の大量移行の
実験においては、２％ＰＰＹＳに、２ｍＭ、すなわち即
時的な毒性を引き起さなかった最大濃度のＡｒａ−Ｇを
加えた細胞に関して得られた、細胞倍加速度、形態学、
あるいは長期間生存率に対する効果は得られなかった。
【０２２４】異なったアナログ類の存在下で増殖してい
る細胞のテロメア長が、継代培養している間の、一連の
時点に抽出したＤＮＡサンプルのサザン・ブロット分析
によりモニターした。薬剤の非存在下で、２％ＰＰＹＳ
培地中の１および５ｍＭ ＡＺＴの存在下で栄養的に成
長している対照の培養と比較し、平均して１７０塩基ま
で、再現性をもって短縮された（図２１ＡおよびＢ）。
このテロメアの短縮は、濃度に依存して起こり（図２１
Ｂ）、試験された最低濃度である１０μＭ ＡＺＴによ
って引き起こされる、少なくとも５０％の最大短縮を起
こした。試験された各ＡＺＴ濃度に対し、最大の減少
は、薬剤の存在下における培養の三日間に見られた（１
５ないし３０細胞分裂）が、この最初の長さの調整後、
各薬剤濃度において、テロメアはその後、経時的に、統
計学的に有意な短縮を示さず、平均のテロメア長は、少
なくとも２８日間の大量移行継代培養を行っている間
は、首尾一貫して静止していた。
【０２２５】１または２ｍＭのＡｒａ−Ｇを２％ＰＰＹ
Ｓ培養培地に添加すると、同様な程度かつタイミングで
のテロメア短化が誘起された（図２１Ｃ）。イソブロス
（Ｉｓｏｂｒｏｔｈ）培養培地に１０μＭないし１ｍＭ
の濃度範囲のｄ４Ｔを添加すると、培養５日後（１６世
代）に、１００μＭおよび１ｍＭにて短化テロメアが再
度、濃度依存的に誘起された。それに対して、１ｍＭま
でのｄｄＧまたはｄｄＩでは、２％ＰＰＹＳ培地中での
５日間のサブ培養（１５−２０細胞世代）にわたり、対
照培養に比してテロメア長の変化は誘起されなかった。
【０２２６】テロメラーゼが試験したアナログの少なく
ともいくつかによりイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
にて強く阻害されること、ならびに、これらのアナログ
によるイン・ビボでのテロメア長が１５ないし３０細胞
世代の範囲で影響を受けることを以前に本発明者らは見
い出しているので、テロメア付加が実際にはイン・ビボ
で中断され、テロメア短化または老化の進行が、該アナ
ログのテロメラーゼへの阻害効果を回避する細胞集団の
一部に起因するいずれの事実も見い出せなかった可能性
があった。以前に本発明者らは、ほとんどの細胞中の老
化テロメラーゼＲＮＡを突然変異させることによりイン
・ビボでテロメラーゼを損傷させることを示したが、こ
れらの実験においては、わずか〜１０2単細胞のサブク
ローンを分析したに過ぎなかった（ユウ（Ｙｕ）、３４
４、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第１２６巻、１９９０
年）。一世代につき約１０3細胞を移行させる本発明者
らの大量移行継代培養のプロトコールの下では、細胞の
うち〜１％程度の少ない画分が老化を回避した場合、な
らびに、それらの増殖優位性がテロメアを失した細胞に
比して十分に高い場合には、それらはいずれの細胞世代
においても優勢な集団となり得、いずれの表現型も検出
できないであろう。かかる細胞亜集団を見過ごしたかど
うかを試験するため、本発明者らは、これらの実験にお
いて、１０μＭおよび１ｍＭのＡＺＴならびに１０μＭ
および１ｍＭのＡｒａ−Ｇの存在下のミクロタイター・
プレートウェルでウェル当たり平均１ないし１０の細胞
を平板することによってサブ培養を行うことを除いて、
薬物の存在および不在下で栄養分裂テトラヒメナ（Ｔｅ
ｔｒａｈｙｍｅｎａ）細胞での同実験を行った。各々の
薬物について、この方法にて連続して３０日（９０ない
し１５０細胞世代）、ならびに、連続して１６日（５０
ないし８０細胞世代）、それぞれ１０μＭおよび１ｍＭ
の薬物濃度にて細胞を平板培養した。該ウェルの合一し
た試料から間隔をおいてテロメア長を分析するためのＤ
ＮＡを抽出した。
【０２２７】１０μＭのＡＺＴならびに１０μＭまたは
１ｍＭのＡｒａ−Ｇ中で増殖させた細胞の該実験過程に
わたっては、該ヌクレオシドアナログを欠く対照培地に
比しての平板効率の変化が認められなかった。しかしな
がら、１ｍＭのＡＺＴの存在下にて、単一細胞を移行さ
せる方法で維持した細胞の増殖速度をモニターすると２
つの一般的な増殖クラス、すなわち、遅いもの（一日当
たり０ないし１回の細胞分裂）および速いもの（一日当
たり２ないし４回の細胞分裂）を同定できた。速い細胞
の増殖速度は、ＡＺＴを含有しないイソブロスで増殖さ
せた対照のものと同様であった。遅い細胞が単に移行可
能性が低い場合には、実験期間中に予想したように遅い
細胞のウェルの比率は減少した。なぜなら、遅い細胞は
速い細胞よりも低細胞密度で存在しており、速い細胞は
より高い細胞密度で増殖し、平板プロトコールのタイミ
ングがうまくいったからである。しかしながら、それら
から移行させた後に残った細胞をモニターすると、完了
時には該遅い細胞が死滅していることが示された。加え
て、該移行のプロセスを通して、先の速い細胞ウェルか
ら遅い細胞が出現した。本発明者らは、遅い増殖ウェル
からの細胞を保存し（サザン・ブロッティング用の十分
なＤＮＡを得るためにいくつかのミクロタイターウェル
の保存が必要）、それらのテロメア長分布を、保存した
速い細胞のものと比較した。保存した速い細胞からの平
均テロメアＤＮＡ長および平均の大きさの分布は、ＡＺ
Ｔなしに増殖させた対照細胞のものと区別できなかっ
た。それに対して、保存した遅い細胞ＤＮＡは、テロメ
アの平均長および不均一性がわずかに減少していること
が示された（図２１Ｄ）。イソブロス培地中にて増殖さ
せた対照細胞は、１％ＰＰＹＳ培地中で増殖させた細胞
より平均１６５ｂｐ短いテロメアを有していた。イソブ
ロス培地中にて増殖させた細胞の該テロメアＧ4Ｔ2リピ
ート域は、豊富なＰＰＹＳ培地中にて増殖させた細胞の
もよりすでに著しく短いため、１ｍＭのＡＺＴ中で増殖
させることにより多いテロメア短化量は、テロメア画分
を連続的かつ確率論的に、作用するに要する臨界低閾値
（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｌｏｗｅｒ ｔｈｒｅｓｈｏｕｌ
ｄ）以下に減じるに十分であり、かくして亜集団の細胞
を生存能力を減じると本発明者らは確信する。
【０２２８】本発明者らは、接合した細胞により子孫形
成に対する、ＡＺＴ、Ａｒａ−Ｇ、Ａｃｙｃｌｏ−Ｇ、
ｄｄＩおよびｄｄＧの影響を評価した。このプロセス
は、子孫細胞中での新しい大核テロメアのデ・ノボ（ｄ
ｅ ｎｏｖｏ）形成を包含する。テトラヒメナのごとき
繊毛のある原生動物中の大核発生は、発生的にプログラ
ムされた、生殖系染色体の（末端が、テロメアのデ・ノ
ボ付加により修復されている）直鎖状サブ染色体への部
位特異的断片化を含有する。テロメラーゼが、栄養細胞
分裂の間に予め存在していたテロメアのみをイン・ビボ
にて伸長させるのみならず（ユウ（Ｙｕ）、３４４、ネ
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第１２６巻、１９９０
年）、この発生的制御された染色体の修復の間に、非テ
ロメア配列上にテロメアＤＮＡを直接付加するようにも
作用することを我々は以前に示した。断片化したＤＮＡ
へのテロメア付加が即時に要求されるため、その後のプ
ロセスが、栄養増殖の間のテロメア維持よりテロメラー
ゼ阻害に感受性かもしれない。ヌクレオシドアナログ
が、テロメア形成の分解に起因する大核発生を阻害を誘
起するかどうかを試験するために、本発明者らは（シク
ロヘキシミド感受性であるが、接合後の子孫はシクロヘ
キシミド抵抗性である）２株のテトラヒメナを接合させ
た。同時に接合させた細胞を、１０μＭないし５ｍＭの
濃度範囲のＡＺＴで、大核の発生が始まる直前に開始し
て大核の発生の間に続けて処理した（接合開始後６−２
４時間の期間）。この時点で、アナログを欠く新しい培
地中のミクロタイター・プレートウェルに、ウェル当た
り１細胞の平均細胞密度で細胞を希釈し、子孫を形成す
るのに成功した細胞を選抜する前に、最も短い時間増殖
させた。ＡＺＴの効果を最大化させる試みにおいては、
細胞を、２％のＰＰＹＳもしくはイソブロス培地で６時
間付するか、あるいは２４時間（ＡＺＴ処理の期間）ま
で飢餓状態にする。かかる飢餓状態は、大核の発生を中
間期に拘束する。再度フィードすると、大核の発生がＡ
ＺＴの存在下にて推し進められる。対照として、非接合
の親細胞も平板し薬物に暴露させた。同様な実験をＡｒ
ａ−Ｇ、Ａｃｙｃｌｏ−Ｇ、ｄｄＩおよびｄｄＧで行っ
た。その結果を表４に示す。
【０２２９】該対照平板は、ＣＨＸ中の細胞が９９−１
００％死滅する一方で、アナログと接合させたものや、
させていない大多数の細胞は生存したことを示した。該
ヌクレオシドアナログは、いずれの統計学的に有意な効
果も子孫形成に効果を奏さなかった。この実験の意図
は、前記したごとく、該薬剤の効果を回避した少数集団
による該培養の支配を妨げることである。従って、減損
したテロメラーゼ活性による大核発生の不可逆的な中断
はほとんどまたは全くなく、ＡＺＴ、Ａｒａ−Ｇ、Ａｃ
ｙｃｌｏ−Ｇ、ｄｄＧまたはｄｄＩの存在下でテロメア
形成が起きた。
【０２３０】大核発生は有意に中断されなかったが、大
核発生の間のテロメア付加のマーカー形成の分析は、Ａ
ＺＴがテロメア付加の効率を減じることを示唆してい
る。
【０２３１】アナログの存在または不在下に接合させ、
それを６時間再フィードした細胞あるいは接合の期間中
十分に飢餓させた細胞のいずれからのＤＮＡを、テロメ
ア・プライマーおよび５’ｒＤＮＡプライマーと共にＰ
ＣＲに用いた。これにより、テロメアを付加した１１ｋ
ｂのｒＤＮＡの断片を選抜した。該１１ｋｂのｒＤＮＡ
は、大核発生の間またはこのプロセスの中間かのいずれ
かに生成した該２１ｋｂのｒＤＮＡの副産物である。そ
れは、新しい大核発生の間に一時的にだけ提示され、そ
れ自体はイン・ビボのテロメア付加の優れたマーカーで
ある。１１ｋｂｒＤＮＡからの１４００ヌクレオチドの
相対量のＰＣＲ生成させた断片のノック−ダウンは、Ａ
ＺＴの存在下で接合させた細胞からのＤＮＡには見い出
されたが、Ａｒａ−Ｇ、Ａｃｙｃｌｏ−Ｇ、水またはＤ
ＭＳＯを含有する対照、あるいはｍｏｃｋ−接合させた
ＳＢ２１０細胞には見い出されなかった。該ＰＣＲ反応
に用いたＤＮＡが存在し、ＰＣＲに適することを示すた
め、ｒＤＮＡの３’−小核複製物からのプライマーを用
いて同一反応を行った。全ての試料において、予期した
８１０ヌクレオチドの断片が実質量で生成すること（図
２２）は、ＡＺＴ中にて接合させた細胞からの試料の１
４００ヌクレオチドのテロメアを含有するＰＣＲ生成物
の減少が、該ＤＮＡまたは試薬中の夾雑物よりむしろア
ナログの存在によることを示している。５’−ｒＤＮＡ
プローブでのサザーン・ブロッティングにより、該テロ
メア−含有ＰＣＲ生成物が予期したｒＤＮＡ配列からの
ものであり（図２２Ｂ）、３’ＰＣＲ生成物には交差ハ
イブリダイゼーションしないことが確認された。テロメ
ア−含有ＰＣＲ生成物の全体的な減少は、混合後６時間
に再度フィードした全ての試料で見い出されたが、ＡＺ
Ｔの存在下に接合させた試料での減少はさらに顕著であ
った。
【０２３２】
【表６】 ヌクレオシド・アナログの生殖能形成への影響 細胞処理 ＃ＣＨＸ−Ｒ ＃全細胞 ％ＣＨＸ−Ｒ ＳＢ２１０（非接合） １ ２１５ ０．５ ＰＢ９Ｒ（非接合） ３ ３０７ １ ＡＺＴ（ｍＭ）０ １３９ ２１２ ６６ ０．０１ １２１ １６９ ７２ ０．１ １００ １４８ ６８ １．０ ９１ １６６ ５５ ５．０ ７５ １２０ ６３ ＳＢ２１０（非接合） ０ ５７ ０ ＡＺＴ（ｍＭ）０ １６５ ２１４ ７７ ０．０１ ６７ ９２ ７３ ０．１ １２８ １９０ ６７ １．０ ６０ １２５ ４８ ５．０ ８９ １６８ ５３ １％ ＤＭＳＯ ８４ １０９ ７７ ＡＲＡ−Ｇ（ｍＭ）０．０１ １１４ １４１ ８１ ０．１ １３４ １６７ ８０ １．０ ８９ １６１ ５５ １％ ＤＭＳＯ ５１ ７５ ６８ ＡＲＡ−Ｇ（ｍＭ）１．０ ５１ ８６ ５９ ２．０ ４０ ９２ ４３ ＳＢ２１０（非接合） ０ ９ ０ ＰＢＰＲ（非接合） ０ ３７ ０ ｄｄＩ（ｍＭ）０ ６３ ７５ ８４ ０．００１ ５９ ７１ ８３ ０．０１ ８５ ９６ ８９ ０．１ ８３ １０６ ７８ １．０ １００ １１０ ９１ １％ ＤＭＳＯ ２１ ４４ ４８ ｄｄＧ（ｍＭ）０．００１ ８６ １０２ ８４ ０．１ ７３ ８６ ８５ １．０ ５１ ６６ ７７ ＡＣＹＣＬＯ−Ｇ （ｍＭ） ０ ３６ ４５ ８０ ０．０１７ ８０ １０７ ７５ ０ ７８ １１６ ６７ ０．０１７ １０１ １４６ ６９実施例１４ ：末端制限断片の大きさの減少に関するＧ−
反応 制限酵素で消化し、電気泳動に対し、サザーンブロット
によってハイブリダイズさせたヒト繊維芽細胞ＤＮＡ
は、テロメア反復配列の相対的長さを反映する末端制限
断片（ＴＲＦ）の分割を可能とする（図２６参照、Ｈｉ
ｎｆ消化ＤＮＡ、記号「Ｈｉｎｆｌ」；消化していない
ＤＮＡ、記号「Ｏ」）。このサザーン分析は、ヒトおよ
び多くの他の種が、ＴＲＦサイズに付加するサブテロメ
ア反復配列の長いストレッチを有するという事実によっ
て複雑化されている。テロメア反復長の測定へのこのサ
ブテロメア反復の人為的導入を排除する手段として、修
飾したマキサム−ギルバート反応を用いてＧ残基におい
てＤＮＡを加水分解した。記号「Ｐのみ」（下に負荷）
のレーンにおいて、それ自体ＤＮＡのサイズを減少させ
ない温和な条件においてピペリジンでＤＮＡを処理す
る。記号「Ｐ＋ＤＭＳ」のレーンにおいて、試料をＤＭ
Ｓで予備処理する。ＴＲＦのサイズの実質的でない減少
を、Ｇ残基を含有する富Ｃ鎖におけるサブテロメア配列
の欠失を反映するＨｉｎｆｌ消化と比較する。すべての
レーンを（ＴＴＡＧＧＧ）3でプローブした。このアッ
セイは、かくして、診断手法においてテロメア長の分析
で有用である。
【０２３３】実施例１５：菌類テロメア 以下の実施例は、特異的菌類を同定するのに用いること
ができる種々の特異的テロメア配列を説明する。当業者
ならば、かかる配列はオリゴヌクレオチドでプローブし
て、選択された菌類の存在を特異的に診断できることを
認識するであろう。加えて、菌類の特異的処理は、かか
る配列に結合し、菌類細胞の長期間の生存を減少させる
薬剤を使用することによって行うことができる。
【０２３４】本明細書中に記載するごとく、テロメアＤ
ＮＡは特異的薬物療法の魅力的な標的である。テロメア
は、特異的薬物に接近可能な短い一本鎖の突出である。
かかる薬物による結合は、正常なテロメアの機能に干渉
し、かくして、菌類の細胞の生存に干渉する。同様の実
験（本明細書に記載したごとくに実行すれば当業者にと
ってルーチン的）において、かかるテロメアの複製（ま
たはテロメラーゼの活性）の阻害剤または促進剤を見い
だすことができ、それを抗癌剤、抗寄生虫剤および抗菌
類剤として使用できる。
【０２３５】菌類テロメアの有意に増大した長さは、そ
れらをアンチセンス療法もしくは診断を理想的な標的と
する。加えて、この異なるテロメア構造は、テロメラー
ゼの作用の異なるメカニズムを示し、かくして、ヒトも
しくは他の動物細胞に対して不活性な抗菌類剤について
の標的としてのその利用可能性を示す。
【０２３６】テロメアＤＮＡ配列は、一般に、進化にお
いて顕著に保存されており、典型的には、Ｇ残基のクラ
スターを含有する、反復され、非常に短い配列単位であ
ることが判明している。しかしながら、最近、出芽酵母
のカンジタ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉ
ｃａｎｓ）のテロメアＤＮＡはかなり長い反復単位より
なることが見いだされている。本明細書において、本発
明者らは、出芽酵母からの７つのさらなる新しいテロメ
ア配列の同定を報告する。出芽酵母内では、長さ（８−
２２５ｂｐ）、配列および組成において、テロメア配列
は、他の真核生物の全系統発生的範囲を通じて従前に見
られるものよりも、より多くの系統発生的発散を示すに
も拘わらず、本発明者らは、すべての公知の出芽酵母テ
ロメア反復は、より典型的なテロメア配列に似たＴおよ
びＧ残基の顕著に保存された６ｂｐモチーフを含有する
ことを示す。本発明者らは、テロメアにおけるＧクラス
ターは、テロメアＤＮＡの特異的共通構造特性について
の基本的要件によるよりもむしろ合成のその態様によっ
て課される制限のため、保存されていると提案する。
【０２３７】テロメアのＤＮＡ配列、すなわち、真核生
物染色体の端部は、典型的には、Ｇ残基のクラスターに
よって特徴付けられる５〜８ｂｐの反復する単位のタン
デム配列よりなり、非常に発散した真核生物の間におい
てさえ保存されており、これは顕著な鎖組成の偏りを生
じていることが従前に見いだされている。しかしなが
ら、日和見病原カンジタ・アルビカンスのテロメア反復
は、いずれの認識可能な鎖組成の偏りをも欠く２３ｂｐ
の均質反復よりなることが示されている。
【０２３８】より通常で単純なテロメア配列に対して、
見掛け上例外的で複雑なカンジダ・アルビカンスのテロ
メア反復配列の関係を調べるために、シイ・アルビカン
スおよびエス・セレビシエ双方に関係する出芽酵母種か
らのゲノミックＤＮＡを、クローン化シイ・アルビカン
スのテロメア反復をハイブリダイゼーションプローブと
して用いて、サザーンブロットによって分析した。低ス
トリンジェンシィのハイブリダイゼーション条件下、本
発明者らは、いくつかの種における多重クロス−ハイブ
リダイズするバンドを検出した（図２８）。いくつかの
場合において、クロス−ハイブリダイズするバンドは明
らかにブロードであり、細胞集団の中で個々のテロメア
におけるテロメア反復の異なる数によってテロメア制限
断片の特徴が引き起こされた。
【０２３９】テロメアが豊富なライブラリーは、７つの
出芽細胞種および株からのゲノミックＤＮＡから構築し
た。テロメアクローンは、公知の酵母テロメア反復（２
３ｂｐのシィ・アルビカンス反復またはエス・レセビシ
エのＴＧ1-3反復いずれか）にハイブリダイズするその
能力によって、あるいは特異的プローブを使用すること
なく、端部が連結した反復的ＤＮＡ配列についてスクリ
ーニングすることによって同定した。７つの種からの推
定テロメア断片インサートの配列を決定することによ
り、単位長さが８〜２５ｂｐであるタンデム反復を含有
するクローンを同定した。１の例外があるが、該反復は
種内で配列の変異を示さなかった。各場合において、反
復配置は、クローン化テロメアについて予測されるごと
く、ベクター配列に直接隣接して、インサートのまさに
端部に存在した。各種からの反復含有クローンは、ライ
ブラリースクリーニングで用いたシイ・アルビカンスま
たはエス・レセビシエのプローブで元来観察された制限
断片の同一パターンにバックハイブリダイズした。バン
ドのほとんどは、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼに対して優先
的に感受性であり（図２９）、これは、反復配列のバル
クが染色体の端部に存在することを示す。異なる酵母種
からクローン化した反復のトラクトの長さは、典型的に
は、２５０〜６００ｂｐであった（２つのシイ・トロピ
カリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）株からのものは１
３０〜１７５ｂｐにすぎなかったが）。この種が特に短
いテロメアを有することは、Ｂａｌ３１消化の間におけ
るその非常に迅速な喪失によって、および比較的弱いハ
イブリダイゼーションによって、種特異的テロメアプロ
ーブをもってさえ、支持される。
【０２４０】図３０は、シイ・アルビカンスおよびエス
・セレビシエのものと一緒に、これらの新しく発見され
たテロメアの反復単位の配置を示す。２つの顕著な特徴
は明らかである：反復単位長および配列の複雑性に関す
るかなり多数の出芽酵母テロメア、およびほとんどが典
型的なテロメア配列に似たＴおよびＧ残基の保存された
６塩基クラスター。
【０２４１】テロメア反復の中での配列の関係は、一般
に、これらの出芽酵母の系統発生的関係と一致する。２
つのシイ・トロピカリス株のテロメア反復は、単一塩基
多形性のみが異なる。密に関連するケイ・ラクティス
（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）およびシイ・シュードトロピカリ
ス（Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）の２５ｂ
ｐテロメア反復は、１つの位置においてのみ異なる。シ
イ・アルビカンス、シイ・マルトサ（Ｃ．ｍａｌｔｏｓ
ａ）、シイ・シュードトロピカリス、シイ・トロピカリ
スおよびケイ・ラクティスからのテロメア反復配列は長
さが２３〜２５ｂｐであり、反復の中央部分に大いにま
たは完全に限定された差異がある。シイ・グラブラタ
（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）（エス・レセビシエに最も密
に関連している可能性のあるこの実験における種）から
の１６ｂｐ反復単位は非常にＧに富んでおり、これは、
恐らくは、異種であってより小さいエス・レセビシエの
テロメア反復に対するそのクロス−ハイブリダイゼーシ
ョンに寄与する。不規則なエス・レセビシエの反復を含
めたすべての出芽酵母配列は完全な、あるいは５／６の
マッチないし６ｂｐＴ／Ｇの配列を有する（ボック
ス）。
【０２４２】シイ・トロピカリス株Ｂ−４４１４からの
クローン化テロメアにおいて、本発明者らは、Ｂ−４４
１４テロメアにおける図３０の反復単位に示したごと
く、反復の第２塩基位置で異なる２つのテロメア反復配
列は均質であったが（「ＡＣ反復」なる語で示す）、残
りの反復（以後、「ＡＡ反復」と示す）は株シイ・トロ
ピカリスＢ−４４４３からクローンした均質なテロメア
反復と同一であることを見い出した。
【０２４３】シイ・トロピカリスのテロメアおよび株の
間におけるこれらの変異反復の分布を調べるために、Ｂ
−４４１４およびＢ−４４４３を含めたいくつかのシイ
・トロピカリス株、ならびに対照のシイ・アルビカンス
株からのゲノミックＤＮＡを、ＡＡまたはＡＣ反復いず
れかに特異的なオリゴヌクレオチドプローブでプローブ
した（図３１左パネル）。株Ｂ−４４１４および１７３
９−８２のみが、また、ある程度ならばシイ・アルビカ
ンスのテロメアが、ＡＣ反復特異的オリゴヌクレオチド
プローブとハイブリダイズした（図３１左パネル）。し
かしながら、シイ・アルビカンスからのものを除き、Ｂ
−４４４３を含めテストしたシイ・トロピカリス株のす
べてからのゲノミックＤＮＡは、「ＡＡ」反復に特異的
なオリゴヌクレオチドと十分にハイブリダイズした（図
３１右パネル）。これらの結果は、Ｂ−４４１４および
１７３９−８２は、共に、２つのプローブに関するシグ
ナルの定量は個々のテロメア断片の間で異なるので、異
なるテロメアで非常に可変的に分布している。少なくと
も２つの形態のテロメア反復を含有することを明らかに
示す（図３１ＡおよびＢ、レーン１および２）。
【０２４４】実施例１６：ヒト腫瘍細胞増殖に対するテ
ロメラーゼ阻害剤の影響 テトラヒメナからのテロメラーゼを阻害することが示さ
れている薬剤、例えば、ＡＺＴ、ｄｄＴおよびａｒａ−
Ｇをテストして、ヒト・テロメラーゼ活性、テロメア反
復長および細胞増殖の不死性について調べた。テストし
た化合物のうち、ｄｄＧおよびａｒａ−Ｇは、腫瘍細胞
系２９６から得られたヒト・テロメラーゼの効果的な阻
害剤であった。ｄｄＧについてのデータを図２７に示
す。次いで、０．２５Ｍ Ｈｅｐｅｓ、１０％ＦＣＳお
よびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１
６４０（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ））に維持されたリンパ腫
細胞系ＪＹ６１６を用いて、完全な細胞におけるテロメ
ラーゼに対する薬剤の効果を実験した。該細胞を、２連
にて、ウェル当たり５．０ＭＬの培地を含む６−ウェル
のプレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））で培養し
た。細胞を７〜１０日毎に継代したが、これは、５〜７
回の平均集団倍加（ＭＰＤ）に相当し、ウェル当たり３
×１０4細胞にて、アナログまたは対照を含有する新鮮
な培地に接種した。ヘモサイトメーターで計数する間、
トリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ）株（ジブコ
（Ｇｉｂｃｏ）を利用して収穫前に細胞の生存をモニタ
ーした。染色された：未染色細胞（死滅：生存）の平均
比率は９０％を超えた。該ＤＮＡの完全性を、制限酵素
による消化に先立ってゲル中でその移動性を観察するこ
とによって平行して測定した。
【０２４５】図２３から分かるように、低濃度の潜在的
テロメラーゼ阻害剤の存在下で、すべてのＪＹ細胞は不
死状態にて増殖した。高濃度においては（図２４）、５
０μＭ ＡＺＴの存在下では細胞は増殖を停止し、２０
μＭ ａｒａ−Ｇの存在下においては遅延された増殖を
示した。５０μＭ ＡＺＴの存在下における細胞増殖の
この阻害はテロメラーゼ阻害によるものであると信じる
ことの裏付けは、細胞は３週まで正常の速度で増殖し、
継いで、分割を停止したという観察である。これは、細
胞増殖の阻害はテロメラーゼ阻害を介するものである
（すなわち、細胞はそのテロメア反復を失うのに多数ラ
ウンドの細胞分裂を要する）ことを予期するであろうと
いう効果である。また、ＡＺＴはテロメラーゼの阻害を
介して細胞の増殖を阻害したという信念の裏付けは図２
５に示された知見であり、そこでは、第１週、および細
胞が分裂を停止した第３週と比較して、ＡＺＴで処理し
た細胞は、同時点における対照培地「Ｒ」と比較して平
均テロメア長が顕著に増加していた。
【０２４６】加えて、１０μＭ ｄｄＧは対照（この場
合、ＤＭＳＯ対照）と比較してテロメア長の減少を引き
起こすことが示された。図３２において、前記したのと
同様に実験し、ｄｄＧで処理したＪＹ細胞は、ＤＭＳＯ
対照と比較して、９および１０週の後、顕著により短い
テロメア反復長を示したことが分かる。記載した条件下
で培養した場合、ＪＹ細胞は不死であるが、１０週間に
わたっていくらかテロメア反復を失うことに注意すべき
である。ｄｄＧの添加はこの喪失を顕著に加速した。
【０２４７】組成物 本発明に関する組成物または生成物は、非経口または鼻
腔内投与もしくは経口投与に適当な溶液の形態にて簡便
に提供されうる。多くの場合においては、投与用として
一回使用溶液での剤で提供されるのが簡便であろう。
【０２４８】該剤が両性の場合、それらは遊離塩基、酸
付加塩または金属塩として利用しうる。勿論、該塩は、
医薬上許容されるものでなければならず、これらとして
は、金属塩、特に例えばカリウムまたはナトリウムの塩
のごときアルカリおよびアルカリ土類金属塩が包含され
よう。広範な医薬上許容される酸付加塩が利用できる。
これらとしては、有機酸および無機酸、好ましくは鉱酸
から調製したものを包含する。その例として記載しうる
典型的な酸としては、クエン酸、コハク酸、乳酸、塩酸
および臭化水素酸を包含する。かかる生成物は、当業者
によく知られている方法により容易に調製できる。
【０２４９】本発明の該剤（および阻害剤）は、通常、
注射または点滴用の非経口組成物として提供されよう。
それらは、例えば、不活性油、適当にはゴマ、落花生ま
たはオリーブ油のごとき植物油の中に懸濁できる。別法
として、それらは、約ｐＨ５．６ないし７．４の水性の
等張緩衝液に懸濁することもできる。有用な緩衝液とし
ては、クエン酸ナトリウム−クエン酸およびリン酸ナト
リウム−リン酸緩衝液を包含する。
【０２５０】所望の等張圧は、塩化ナトリウムまたはデ
キストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレン
グリコールまたは他の無機溶質あるいは有機溶質のごと
き他の医薬上許容される剤を用いて達成しうる。ナトリ
ウムイオンを含有する緩衝液は、塩化ナトリウムが特に
好ましい。
【０２５１】所望により、前記の組成物の溶液は、メチ
ルセルロースのごとき増粘剤で増粘化させることもでき
る。それらは、油中水型または水中油型のいずれの乳化
形態にて調製することができる。例えば、アカシア粉
末、または硫酸アルカリポリエーテルアルコールもしく
はトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）のごときスルホネートを包
含するいずれの広範な医薬上許容される乳化剤も用いる
ことができる。
【０２５２】本発明の治療的に有用な組成物は、一般的
に認められている方法に従って該成分を混合することに
より調製する。例えば、選択した成分を、ブレンダーま
たは他の標準的な装置中にて単純に混合して、濃縮混合
物を製造し、次いで、それを水または増粘剤を添加する
ことにより最終濃度および粘度に調整したり、緩衝液を
添加してｐＨをコントロールしたり、あるいは、さらな
る溶質を添加して張度をコントロールすることができ
る。
【０２５３】医薬用途としては、所望の機能を奏させる
には、１回または複数回用量にて有効な剤の量を含有す
る単位投与形態で該組成物が提供されよう。当業者には
認識されるであろうごとく、治療剤の有効量は、患者の
年齢および体重、患者の身体状態、結果そうなる血糖レ
ベル、および他の要因を包含する多くの要因で変化する
であろう。
【０２５４】投与 選択した剤、例えば、オリゴヌクレオチドまたはリボザ
イムは予防的に投与するか、あるいは、イオン導入、エ
レクトロポレーションまたはイオン対分子もしくは共有
結合させた付加物、および他の薬理的に許容されたデリ
バリー方法を用いることにより、例えば、制御された放
出ビヒクルであるリポソームのごとき適当なデリバリー
ビヒクルの手段により、例えば、感染組織に外因的に剤
をデリバリーすることにより、標的疾病に苦しむ患者に
投与することができる。投与経路としては、筋肉内、エ
アロゾール、（錠剤または丸剤形態の）口腔、局所、全
身、眼、腹膜内および／またはクモ膜下を包含する。リ
ボザイムで免疫するための発現ベクターおよび／または
オリゴヌクレオチドのデリバリーも適当である。
【０２５５】選択したいずれの剤の特定のデリバリー経
路は、該剤の用途によるであろう。一般的に、各々の剤
の特定のデリバリー・プログラムは、細胞内の局在化に
関する裸の剤の取り込み、それに続く効力の証明に焦点
が当てられるであろう。別法として、動物の器官または
動物の組織の中のこれら同じ細胞へのデリバリーも追跡
することができる。取り込み実験は、デリバリー担体ま
たはデリバリー戦略にかかわりなく、例えば、細胞性オ
リゴヌクレオチドの取り込み、を評価する取り込みアッ
セイを包含するであろう。また、かかるアッセイは、取
り込んだ後の該剤の細胞内局在化を評価し、究極的に
は、該標的配列（核および／または細胞質）を含有する
細胞コンパートメント内の安定状態濃度の維持に対する
要望を確立するであろう。次いで、効力および細胞毒性
を試験できる。毒性は、細胞生存性のみならず細胞機能
をも含有するであろう。
【０２５６】例えば、オリゴヌクレオチドの用いうるい
くつかのデリバリー方法は： ａ．リポソーム中へのカプセル化、 ｂ．レトロウイルスベクターによる形質導入、 ｃ．コレステロールでの接合、 ｄ．ほとんどのｓｎＲＮＡに見い出される抗原結合部位
を利用した核コンパートメントへの局在化、 ｅ．ヌクレオチド誘導体を用いることによるオリゴヌク
レオチド電荷の中和、および ｆ．血液幹細胞を用いてオリゴヌクレオチドを全身を通
して分布させることを包含する。
【０２５７】本発明に有用なデリバリー戦略の少なくと
も３つのタイプは：剤の修飾、粒子担体ドラッグデリバ
リービヒクルおよびレトロウイルス発現ベクターを含有
する。非修飾は、ゆっくりとではあるが、細胞により取
り込まれうる。細胞への取り込みを向上させるため、剤
の電荷は減じうるが特定の官能基は残す方法により、該
剤をランダムに本質的に修飾しうる。その結果、細胞膜
を通過して拡散できる分子が得られ、かくして透過性の
遮蔽物がなくなる。
【０２５８】電荷を減じる剤の修飾は、これらの大きな
分子の細胞への取り込みを向上させる１アプローチにす
ぎない。剤の活性を維持するために必要な構造要件は、
当業者によりよく理解されている。細胞へのデリバリー
を向上させる修飾を設計する場合にはこれらの要件を考
慮する。また、該修飾は、酵素分解に対する感受性を減
じるように設計される。これらの性質の双方は、該剤の
効力を大いに改善させるものでなければならない。
【０２５９】オリゴヌクレオチドのリン酸骨格の化学的
な修飾は、該膜を通過しての自由な拡散を許容する負電
荷を減じるであろう。この原理は、アンチセンスＤＮＡ
技術に関して成功したことが立証されている。身体内に
おいては、該修飾オリゴヌクレオチドを組織の細胞に拡
散を駆動するためには、外部濃度の維持が必要であろ
う。発病組織を一時的に高濃度のオリゴヌクレオチドに
暴露でき、全身的な吸着により徐々に放散させる投与経
路が好ましい。オリゴヌクレオチドの循環半減期を高め
るよう設計した薬物担体での静脈内投与を用いることが
できる。該薬物担体の大きさおよび組成は、血流からの
迅速な消失を制限する。感染部位に蓄積するよう作製し
た担体は、該オリゴヌクレオチドを分解プロセスから保
護できる。
【０２６０】ドラッグデリバリービヒクルは、全身投与
および局所投与の双方に有効である。それらは、徐放性
貯蔵器として機能するよう、あるいは、それらの内容物
を直接標的細胞にデリバリーするよう設計できる。直接
デリバリーする薬物ビヒクルを用いる利点は、１回の取
り込み当たりに複数の分子がデリバリーされる点であ
る。かかるビヒクルが、他の方法では血流から迅速に消
失するであろう薬物の循環半減期を向上させることが見
い出された。この範疇に入るかかる特化されたドラッグ
デリバリービヒクルのいくつかの例としては、リポソー
ム、ハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノ
カプセル、および生体粘着性ミクロスフィアである。
【０２６１】このデリバリー・システムの範疇からは、
リポソームが好ましい。リポソームは、細胞内安定性を
向上し、取り込み効率を向上し、生物活性を改善する。
【０２６２】リポソームは、細胞膜を構成する脂質と同
じ様式で配列した脂質より構成される中空の球形ベシク
ルである。それらは、水溶性化合物を捕捉する内部水性
空間を有し、直径０．０５マイクロないし数ミクロンの
範囲の大きさである。リポソームが細胞まで剤をデリバ
リーし、該剤が生物活性を維持していたことを、いくつ
かの研究が示している。
【０２６３】例えば、元来は探査ツール「リポフェクチ
ン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）」として設計されたリポソ
ームデリバリービヒクルは、無傷のｍＲＮＡ分子を細胞
にデリバリーし、相当する蛋白を生成させることが示さ
れている。
【０２６４】リポソームはいくつかの利点を供する：そ
れらは、組成物において非毒性かつ生分解性であり；そ
れらは、長い循環半減期を示し；また、組織を標的とす
るそれらの表面に、認識分子が容易に結合しうる。最終
的に、リポソームを基礎とする医薬のコスト有効産業
は、液体懸濁剤または凍結乾燥生成物のいずれかにおい
て、許容できる薬物デリバリーシステムとしてのこの技
術の実行可能性を立証した。
【０２６５】ナノ粒子およびハイドロゲルのごとき他の
制御放出ドラッグデリバリーシステムは、潜在的な剤の
デリバリービヒクルたり得る。これらの担体は、化学療
法剤および蛋白を基礎とする医薬物用に開発された。
【０２６６】投与部位の局在した濃度が最小限の全身吸
着となるため、剤の局所投与が有利である。これは、該
剤の発病部位へのデリバリー戦略を単純なものとし、毒
性の程度を減じる。さらに、適用する物質量が、他の投
与経路に要するものよりはるかに少なくて済む。有効な
デリバリーは、該剤が感染細胞内に拡散していくことを
要する。該剤の負電荷または正電荷を中和する化学修飾
が、浸透するのに要する全てとなり得る。しかしなが
ら、電荷の中和が不十分な場合には、該修飾剤を、アゾ
ン（Ａｚｏｎｅ）またはオレイン酸のごとき浸透向上剤
とリポソーム中にて一緒に処方することができる。該リ
ポソームは、該修飾剤および浸透向上剤がリポソームか
ら該標的細胞中に移行する徐放性提示ビヒクル、あるい
は、細胞性デリバリーを促進するのに、該修飾剤および
浸透向上剤と直接関係しうるリポソームリン脂質のいず
れかで表すことができる。いくつかの場合においては、
徐放させるために、該剤および透過向上剤の両方を坐薬
処方に処方化できる。
【０２６７】また、剤は全身投与することもできる。全
身吸収とは、血流中の剤の蓄積に続く身体全体を通して
の分布を示す。全身吸収に導く投与経路としては；静脈
内、皮下、腹膜内、鼻腔内、クモ膜下内および経眼を包
含する。これら各々の投与経路は、該剤を近付きやすい
発病組織または他の組織に暴露する。皮下投与は、リン
パネットワークを通して循環系に伸びる局在したリンパ
節に排出する。該循環への流入速度は、分子量または分
子サイズの関数であることが示された。リポソームまた
は他のドラッグ担体を使用して、該剤をリンパ節に局在
させる。該剤を細胞内へ拡散するよう修飾したり、非修
飾または修飾した剤を細胞にデリバリーするのに該リポ
ソームを直接関係させることができる。
【０２６８】最も好ましいデリバリー方法としては、リ
ポソーム（１０−４００ｎｍ）、ハイドロゲル、放出が
制御されたポリマー、マイクロインジェクションまたは
（例えば、生体外治療のごとき）エレクロトポレーショ
ンおよび他の医薬上許容されるビヒクルを包含する。該
用量は、疾病の標徴および投与経路によるであろうが、
１０−２０００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間とすべきであ
る。治療期間は、疾病症状の過程を通して、通常少なく
とも１４−１６日、恐らく連続して延長されよう。複数
の日用量は、局所適用、眼（ｏｃｕｌａｒ）適用および
膣適用では予測される。用量数は、疾病デリバリービヒ
クルおよび臨床的試行からの効率データによるであろ
う。
【０２６９】該標的細胞内の剤の治療レベルの確立は、
取り込みおよび分解の速度による。分解の程度を減じる
ことは、該剤の細胞内半減期を延ばすことになろう。か
くして、化学修飾剤、例えば、リン酸骨格を修飾したオ
リゴヌクレオチド、または該オリゴヌクレオチドの５’
および３’末端をヌクレオチド・アナログでキャップす
るには異なった用量を要しうる。
【０２７０】テロメラーゼ活性を調整し、テロメア長お
よびテロメラーゼ活性をモニターすることにより、増殖
性疾病の治療を提供でき、新生組織細胞および／または
細胞の増殖能をモニターでき、ここにおいて特定の細胞
型の再生を研究することができることは、前記の結果か
ら明らかである。特に細胞集団の平均値としてのテロメ
ア長、または細胞集団のテロメラーゼ活性を測定できる
アッセイが提供される。次いで、疾病診断、結果の予
想、および特定の治療法を提供するのにこの情報を用い
ることができる。
【０２７１】本明細書に引用した全ての刊行物および特
許出願は、各々の刊行物および特許出願を特別かつ個別
に本明細書に明示したものとして出典明示して本明細書
の一部とみなす。
【０２７２】理解を明瞭なものにする目的の図示および
実施例の方法にて先行発明を詳細に記載したが、添付し
た請求の範囲の趣旨から逸脱することなく、ある種の変
化および修飾を行いうることは、本発明の教示の見地か
ら当業者には自明であろう。
【０２７３】実施例１７：テロメア反復長を測定する別
法 テロメア長を測定する別法が、該テロメア配列がＣに富
んだ鎖中のグアニン残基を欠くという事実を明らかにす
る。未融解のゲノムＤＮＡを、Ｇに富んだ一本鎖化した
突出部にアニーリングする配列ビオチニル−Ｘ−ＣＣＣ
ＴＡＡＣＣＣＴＡＡを含有するビオチン化オリゴヌクレ
オチドと混合し、続いてｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよび放射
能のｄＣＴＰの存在下にて、ＤＮＡポリメラーゼのクレ
ノー断片で伸長させる。次いで、該ＤＮＡをストレプト
アビジンを被覆させた磁性ビーズと混合し、ＤＮＡ−ビ
オチン−ストレプトアビジン複合体を磁石で回収する。
この手法によりテロメアが精製され、この段階で回収さ
れた放射能はテロメア数に比例する。次いで、該ＤＮＡ
を融解し、新しいＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡオリゴヌク
レオチド、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよび放射能のｄＣＴＰ
でＤＮＡ合成を開始させる。この段階の間に取り込まれ
た放射能は、第一段階の間に測定した存在するテロメア
数を補正した後のテロメア反復数（テロメア長）に比例
する。次いで、予め測定した長さのテロメアから作成し
た標準曲線と比較することによって、この値を実際のテ
ロメア長に変換できる。
【０２７４】実施例１８：テロメア配列を単離する別法 大きなテロメアＤＮＡは以下のごとく精製する。配列
が、ビオチニル−Ｘ−ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡである
ビオチン化オリゴヌクレオチドを用いて、二本鎖ＤＮＡ
でのＤＮＡ合成を開始させる。このオリゴヌクレオチド
がアニーリングできる唯一の配列はテロメア末端として
の一本鎖化した塩基突出部であろう。今や、最初の１２
ｂｐの重複で提供したものよりより安定な構造を有する
伸長させたＤＮＡを、次いで、ストレプトアビジンを用
いて回収する。大きなＤＮＡに関しては、該ＤＮＡをＮ
ｏｔＩごとき稀にしか切断しない制限エンドヌクレアー
ゼで消化し、次いで、基準近くのアガロースブロックに
共有結合させたストレプトアビジンのパルス−フィール
ド電気泳動に付すと、該ストレプトアビジンがビオチン
化ＤＮＡに結合し、大きなゲノムＤＮＡのゲル中への移
動を許容する一方でテロメアの移動を制限するであろ
う。次いで、テロメアＤＮＡを回収し、クローン化して
特徴付ける。
【０２７５】別法として、ストレプトアビジン被覆磁性
ビーズを用いて、剪断したＤＮＡから小さなテロメアＤ
ＮＡ断片を回収する。以下の方法を用いてこれらの結果
を得た：指針実験は、混合および分離工程の間に生じる
剪断力により約２０ｋｂｐ長のＤＮＡ断片が得られるこ
とを示した。得られるサブテロメアＤＮＡ量を最大化と
するために、Ｔ−抗原無限増殖細胞系（ＩＭＲ９０ ヒ
ト肺フィブロブラスト由来のＩＤＨ４）からのものであ
って、ほんどテロメア反復がほとんどないＤＮＡ（短い
ＴＲＴ）をＤＮＡ源として用いた。５０μｇのＩＤＨ４
ＤＮＡを、１．２５ｐｍｏｌのビオチン化ＣＣＣＴＡ
ＡＣＣＣＴＡＡプライマー、各々３３μＭのｄＡＴＰ、
ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ、ならびに２ＵのＤＮＡポリメ
ラーゼのクレノー断片とを最終容量１００μｌのベーリ
ンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ）制限エンドヌクレアーゼ緩衝液Ａと混合し、
３７℃にて３時間伸長させた。同量の（Ｇに富んだテロ
メア突出部にはアニーリングするはずのない）ビオチン
化ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧプライマーを第２反応に陰
性対照として添加した。次いで、５μｌのＭ−２８０ス
トレプトアビジン被覆磁性ビーズ（ダイナル・インコー
ポレイション社製（Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．））を添加
し、室温にて２時間静かに混合し、次いで、試験管の側
壁に対して磁石を保持することによりビオチン化ＤＮＡ
−ストレプトアビジン−ビーズ複合体を回収し、最初に
０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００および
０．１％の牛血清アルブミンを含有する等張のセーライ
ンで、次にＳａｕ３ａ制限酵素消化緩衝液で洗浄した。
次いで、該ＤＮＡを２０μｌのＳａｕ３ａ消化緩衝液
（ニュー・イングランド・バイオラボズ社製（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））に懸濁し、サブテ
ロメアＤＮＡを遊離させるために、３ＵのＳａｕ３ａで
消化してビーズに結合した末端の制限断片を得た。該ビ
ーズ−ＴＲＦ複合体を磁石で除去し、サブテロメアＤＮ
Ａを含有する上清を７０℃にて１時間加熱しＳａｕ３ａ
を不活化させた。該緩衝液を５ｍＭのＤＴＴおよび０．
５ｍＭのＡＴＰに調整することにより、２５ｐｍｏｌア
ニーリングしたＰＣＲリンカーと１．５ＵのＴ４ＤＮＡ
リガーゼを添加し、１６℃にて一晩インキュベートする
ことによってＰＣＲリンカーを該サブテロメアＤＮＡ断
片に付加した。用いたＰＣＲリンカーの配列は： OLM2: 5' TGGTACCGTCGAAAGCTTGACTG 3' DMO1: 3' ATGAACTGACCTAG 5' これらのリンカーは、アニーリングしたリンカーがＳａ
ｕ３ａ親和性末端（５’ＧＡＴＣ３’）を有し、（リン
酸化されていない）ＤＭＯ１の５’末端は結合しないま
ま残す一方でＯＬＭ２の３’末端はサブテロメアＤＮＡ
断片に結合するよう設計されている。ＯＬＭ２およびＤ
ＭＯ１の間の重複部位は、結合した混合物を７０℃にて
２０分間加熱するとリガーゼが不活化しＤＭＯ１を解離
するよう、約２４℃の融点を有する。次いで、結合混合
物の半分を１００ｐｍｏｌのＯＬＭ２／１００μｌを唯
一のプライマーとして有するＰＣＲ緩衝液に希釈した。
７２℃×１分間、（該ＤＮＡを融解させる前にＯＬＭ２
に相補的な配列を満たすために）８５℃×１分間の熱サ
イクルを３回行った後に、該ＤＮＡを２０サイクルの
（９４℃×１分間、５５℃×１分間、７２℃×３分間
の）ＰＣＲ増幅に付した。
【０２７６】中期の染色体へのイン・サイチュー・ハイ
ブリダイゼーションにより、該ＰＣＲ増幅させたサブテ
ロメア・ライブラリーの純度を評価した。ジゴキシゲニ
ン標識ＵＴＰの存在下にてライブラリーを増幅させるこ
とにより３つのプローブを調製した：ＰＣＲリンカーを
鎖状化ＴＴＡＧＧＧオリゴヌクレオチドに結合させて、
約１ｋｂｐの平均サイズのテロメア反復を含有する増幅
混合物を生成させた陽性対照（「鎖状化ＧＴＲ」）；ビ
オチン化ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧプライマーで選択し
たＤＮＡの陰性対照（「ＧＴＲ−選択」）；および、ビ
オチン化ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡプライマーで選択し
た実験ライブラリー（「ＣＴＲ−選択」）。該スライド
（ｓｌｉｄｅ）を異なったプローブにハイブリダイズさ
せ、抗−ジゴキシゲニンモノクローナル抗体、続いてア
ルカリホスファターゼ結合抗−マウス抗体で染色し、次
いで、テロメア末端に対する内部部位におけるシグナル
の存在につきコードしスコアを採った。分析を行った後
にのみ、該コードが破壊された。その結果を表７に示
す：
【表７】 サブテロメアＤＮＡのイン・サイチュー・ハイブリダイゼーション分析 （２実験） プローブ 末端シグナル 内部シグナル ％テロメア 鎖状化ＧＴＲ １０４，４６ ２０，１９ ８１％，７１％ ＧＴＲ−選択 ２０，３２ ９０，９５ １８％，２５％ ＣＴＲ−選択 ７６，７９ ５７，２９ ５７％，７３％ 次いで、該ＣＴＲ−選択ＰＣＲ増幅生成物をクローン化
し、３７の個別のクローンを採り出し、イン・サイチュ
ー・ハイブリダイゼーションにより分析した。これらの
クローンのうち１０／３７（２７％）がテロメアシグナ
ルを呈した。はるかに少数の画分の個々のクローンが、
表７中のシグナル画分よりテロメリックである理由は、
ＰＣＲ増幅物質の複雑さによるものである：実際のテロ
メアＤＮＡは、相対的に豊富であり、かくしてシグナル
を呈しうる一方で、混入した内部配列は高度に発散して
おり、かくして混合物中の各々個々の配列が稀すぎてシ
グナルを呈せないのであろう。各々の４６本の染色体末
端の２０ｋｂｐのＤＮＡは、ゲノムの約１／３０００を
表す。クローン化したＣＴＲに富んだＤＮＡの約１／３
のテロメア位置は、かくして、ビオチン化ＣＴＲを用い
るとテロメアＤＮＡについて１０００倍に富んだものと
なる。
【０２７７】３つのクローンが複数のテロメアにハイブ
リダイズした一方で、７つのテロメアクローンが個々の
テロメア上に指示された。１０のテロメアクローンの性
質を表８に示し、クローンＣＳＩＴＵ６以外の全てから
の部分ＤＮＡ配列を表９に示す。
【０２７８】
【表８】サブテロメアクローンの性質 クローン だいたいの大きさ テロメアシグナル数 ＣＳＩＴＵ５ １．５Ｋｂｐ 単一 ＣＳＩＴＵ６ ０．５Ｋｂｐ 複数 ＣＳＩＴＵ９ ０．９Ｋｂｐ 単一 ＣＳＩＴＵ１３ ０．９Ｋｂｐ 単一 ＣＳＩＴＵ２２ ０．９Ｋｂｐ 複数 ＣＳＩＴＵ２４ ０．９Ｋｂｐ 複数 ＣＳＩＴＵ３３ ０．８Ｋｂｐ 単一 ＣＳＩＴＵ３７ ０．９Ｋｂｐ 単一 ＣＳＩＴＵ３８ ０．９Ｋｂｐ 単一 ＣＳＩＴＵ５１ １．５Ｋｂｐ 単一
【表９】サブテロメア５ａクローンの配列 CSITU5 1 GATCTAGGCACAGCTGCTTCTCATTAGGCAGGTCTCAGCTAGAAGACCAC 51 TTCCCTCCCTGAGGAAGTCAACCCTTCTGCCACCCCATGGCCTTGCTTAA 101 TTTTCAGACTGTCGAATTGGAATCCTACCTCCATTAGCTACTAGCTTGGG 151 CAAGATACAGAGCCCTCCC 全塩基数：１６９ ＤＮＡ配列組成：３９Ａ；５４Ｃ；３３Ｇ；４３Ｔ；その他０ CSITU9 1 ATATATGCGCTACATAAATGTATCTAGATGCAATTATCTAGATACATATA 51 AGAAAGTATTTGAAGGCCTTCTACAAGGCTTAGTTATTATATTGGTTCAT 101 ACAAGTTCTTCTTCAG 全塩基数：１１６ ＤＮＡ配列組成：３９Ａ；１７Ｃ；１８Ｇ；４２Ｔ；その他０ CSITU13 1 ATCCTTCTCCGCAAACTAACAGGAACAGAAAACCAAACACTGCATGTTCT 51 CACATCATTGTGGGAGTTGAACAATGAGAACACATGGACACAGGGAGGGG 101 AACATCACACACTCGGGGTGTCAGCCGGGTGGGAGGGTAGAGGAGGAGAA 151 ATACCTAAGTTCCAGATGACAGGTTG 全塩基数：１７６ ＤＮＡ配列組成：５８Ａ；３７Ｃ；５０Ｇ；３１Ｔ；その他０ CSITU22 1 GATCTATGCTACCTCTAGGGATGGCACCATTCACAAGCACAAAGGAGATG 51 TCAGTGATTAAAAACACATGCTCTGGAGTCTGAGAGACTTTGAGACTTGC 101 TAGCTTGTGACTCTGCAGAGTTTAAGGTATCTGGACCCCTTTTTCCCTCA 151 TGTGCATAATGAAGAGATT 全塩基数：１６９ ＤＮＡ配列組成：４７Ａ；３５Ｃ；３９Ｇ；４８Ｔ；その他０ CSITU24 1 GATCAACACTGTTAGTTGAGTACCCACATCACAAACGTGATTCTCAGAAT 51 GCCTTCCTTCCTGTCTAGTTTCTATAGGTAGATATTTCCTTTTTCAGCAT 101 AGGCCTGAAAAGCCGCCTCCAAATGCCCGCCTTCCAGACACTATAAAAAG 151 AGGGTTCAAACCTACTCTATGAAAGGGAATGTTCAACACAGA 全塩基数：１９２ ＤＮＡ配列組成：５８Ａ；４９Ｃ；３３Ｇ；５２Ｔ；その他０ CSITU33 1 GATCTGTTTATTATTCTTCCAATATCTCCCCATCTCTTAAAAATTGGTTA 51 TTTCTTCGTTCATACATTTTTATCTCCCAAATTANNNNTGAGACTGGTTT 101 GAAGAGAGGAAAGCAATGTACACACTTTTATATTCCACCATGTATATCCG 151 GATATCC 全塩基数：１５７ ＤＮＡ配列組成：４３Ａ；３２Ｃ；１９Ｇ；５９Ｔ；その他４ 1 AATCCTCCTACCTTAACCTCCCTTTGTTAGCCTGCCATTACAGGTGTGAG 51 CCACCATTGCTCATTCGTCCGTTTATTCATTCAACAAATCAATCGATCTA 101 TTACATGTGAGGGACTCTTCAGGTCATGGGAATTC 全塩基数：１３５ ＤＮＡ配列組成：３２Ａ；３７Ｃ；２２Ｇ；４４Ｔ；その他０ CSITU38 1 GATCACTTGAGCCCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGGTGACATGGCAAAAC 51 CCCATCTCTACCAAAAGAAAAAAANNNNACAAATTGGTGGTGTTGATGGT 101 CGGCGACCATTGATCCC 全塩基数：１１７ ＤＮＡ配列組成：３５Ａ；２７Ｃ；２８Ｇ；２３Ｔ；その他４ CSITU51 1 GATCAGGGAGGGGCCGAAAACTGGAGATGCAGGTGTGCTGTAAGACACTG 51 CAGAGAGGGCATTTACCTGCCCCATCATCCAGCACAGGAACAGCGACTGA 101 CAGCGCTCACCCACCCACCATCGCCAGTCACACTGGG 全塩基数：１３７ ＤＮＡ配列組成：３７Ａ；４２Ｃ；３９Ｇ；１９Ｔ；その他０ また、該ＣＴＲに富んだサブテロメアＰＣＲ増幅ライブ
ラリーを用いてもｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グした。３２クローンが単離され、５クローンから部分
配列が得られた。それらの配列を表１０に示す。
【０２７９】これらのクローンのうち２つ、すなわち、
ＰｈＣ４およびＰＨＣ５を、ノーザン・ブロッティング
で特徴付けた。その双方は、約６．２および７．７Ｋｂ
の同じ２つのｍＲＮＡにハイブリダイスした。ＰＨＣ４
およびＰＨＣ５の３’配列は異なるため、このことは、
同一遺伝子の別のスプライシング生成物を表しうること
を示唆している。双方のメッセージは、比較的長いテロ
メアを有するＰＤＬ３８ＩＭＲ９０細胞に豊富にあり、
ＩＭＲ９０由来の（非常に短いテロメアを有する）無限
増殖性ＩＤＨ４細胞には双方とも発現されていない。こ
れは、サブテロメアＤＮＡに位置する遺伝子の発現がテ
ロメア長により調節されているという仮説を支持する。
このデータは、前記した工程がテロメアに隣接して位置
する配列（そのいくつかはｍＲＮＡをコードしている）
を得る手段を提供する証拠である。個々の染色体に独特
のこれらの配列は、ゲノム・マッピングに有用であろ
う。異なったテロメア長を有し、細胞中で活性な遺伝子
であって、該細胞中で分化中に発現するものは、テロメ
アの長さに関連した該細胞への伝達情報に重要な役割を
担っているかもしれない。Ｍ１老化の開始を調節する遺
伝子、ならびにテロメラーゼ活性を調節する遺伝子はこ
れらの手段により単離されうる。該テロメア遺伝子の機
能は、若くて老化した無限増殖細胞中での過発現または
ノック−アウトにより同定しうる。かかるｃＤＮＡ、ア
ンチセンス分子、およびコードされている蛋白は、年齢
関連性の疾病および癌のごとき増殖疾病の細胞増殖のそ
れらの調節に関して、重要な治療および診断価値を有し
得る。
【０２８０】
【表１０】 サブテロメアｃＤＮＡクローンの部分配列 PHC4-5' 末端 1 GGCTCGAGAACGGGAGGAGGGGGCTCTTGTATCAGGGCCCGTTGTCACAT 51 CTGCTCTCAGCTTGTTGAAAACTCATAATC 全塩基数：８０ ＤＮＡ配列組成：１７Ａ；１９Ｃ；２４Ｇ；２０Ｔ；その他０ PHC5-3' 末端 1 AGGTCCCTTGGTCGTGATCCGGGAAGGGGCCTGACGTTGCGGGAGATCGA 51 GTTTTCTGTGGGCTTGGGGAACCTCTCACGTTGCTGTGTCCTGGTGAGCA 101 GCCCGGACCAATAAACCTGCTTTTCTTAAAAGGAAAAAAAAAAAAAAAAA 151 AAAAAAA 全塩基数：１５７ ＤＮＡ配列組成：４７Ａ；３１Ｃ；４４Ｇ；３５Ｔ；その他０ PHC7 1 ATCTAGGTTTTTTAAAAAAGCTTTGAGAGGTAATTACTTGCATATGAGAG 51 AATAAAACATTTGGCACATTGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 101 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 全塩基数：１２０ ＤＮＡ配列組成：７３Ａ；７Ｃ；１４Ｇ；２６Ｔ；その他０ PHC8 1 CTCATTTACTTTTCTCTTATAGCGTGGCTTTAAACATATATACATTTGTA 51 TATATGTATATATGAATATAATGTATAAAATGTATGTAGATGTATATACA 101 AAAAATAAACGAGATGGGTTAAAGATATGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 全塩基数：１４９ ＤＮＡ配列組成：６９Ａ；１１Ｃ；１９Ｇ；５０Ｔ；その他０ PHC9 1 AGTCCCAGCTACTCGGGAGGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCAGG 51 AGGCGAAGCTTGCAGTGAGCTGAGATCGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGA 101 CGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 全塩基数：１６９ ＤＮＡ配列組成：４７Ａ；３５Ｃ；３９Ｇ；４８Ｔ；その他０実施例２９ ：テロメラーゼの発現を抑制する因子の単離 不十分な数のテロメア反復が持続した細胞増殖性を支持
するままでいる場合には、細胞老化のＭ２機構が起こ
る。該Ｍ２機構および不死化からの回避は、テロメラー
ゼ活性の誘導およびテロメア長の安定化と同時に起こ
り、かくしてＭ２機構の不活化が直接的または間接的に
テロメラーゼの発現を抑制する。
【０２８１】Ｍ２機構を調節する遺伝子は、レトロウイ
ルス配列で釣り上げた。これを達成する方法は、最初に
ＳＶ４０ Ｔ−抗原をトランスフェクトしたヒト肺フィ
ブロブラストのクローンがＭ２を回避し不死化となりう
る（Ｔ−抗原がＭ１機構を遮断し、かくして、Ｍ２機構
がこれらの細胞の不死化に対する唯一の残ったものであ
る）頻度を測定することからなる。次いで、潜在的なＭ
２遺伝子を挿入的に突然変異させるために、該前−危機
（ｐｒｅ−ｃｒｉｓｉｓ）細胞を欠損レトロウイルスで
感染させると、不死化の頻度はほぼ３倍に増加すること
が示された。最後に、異なって不死化された挿入的突然
変異系のパルス−フィールド電気泳動を用いて、どの系
が同一のＭ２遺伝子への挿入により不死化となったのか
を同定する。今やＭ２機構遺伝子はレトロウイルス配列
で釣り上げたため、当業者なら該特定遺伝子をクローン
化でき同定できる。用いた方法は以下の通りであった：
（例えば、Ｔ−抗原発現細胞の不死化頻度である）危機
から回避する頻度は、本質的には以前に記載した（シェ
イ，ジェイ・ダブリュ（Ｓｈａｙ，Ｊ．Ｗ．）およびラ
イト，ダブリュ・イイ（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｗ．Ｅ．）、
（１９８９年）、エクスペリメンタル・セル・リサーチ
（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．）、第１８４巻、１０９
−１１８頁）ごとき変動（ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ）解
析の本質に基づいたアプローチを用いて算出する。（Ｓ
Ｖ４０の大きなＴ抗原を発現するベクターでトランスフ
ェクトしたＩＭＲ９０正常ヒト肺フィブロブラストから
単離したクローンである）ＳＷ２６細胞を、危機の前に
約１５ＰＤＬにて、６６６７細胞／ｃｍ-1の一定の細胞
密度で複数のシリーズに拡げた。続いて、該実験の終了
時に、不死細胞系を生じる各々のシリーズを特定しうる
ように、各々のシリーズを別々の培養として維持した。
６６６７細胞／ｃｍ-1にて密集した時またはその丁度前
に培養を分けた。一旦細胞が危機に達したら、それらを
少なくとも毎３週間に一度は分割し、それを実質上生存
細胞が残っていないか該培養が不死化するまで続けた。
得られた細胞が少なすぎる場合には、全ての細胞を単一
のデッシュ中の培養に戻した。１０００細胞を５０ｃｍ
2のディッシュに植え、各サイクルにつき３週間の増殖
を許容するサブ培養を２回行う間に、危機の後の急成長
が起こった場合には、フィブロブラストを不死化したと
判断した。
【０２８２】ＳＷ２６細胞はおよそＰＤＬ８２−８５で
危機に入る。（８×１０6細胞／バイアルの）ＳＷ２６
細胞の膨大な数のバイアルをＰＤＬ７１にて凍結し、自
然発生の不死化がまだ起きていないことを確認するテス
トを行った。５つのバイアルを解凍し、約１０8細胞に
約４日間でスケールアップし（かくして、およそＰＤＬ
７４）、次いで、トリプシン処理して、４０ｍｌの培地
中の単一細胞プールに合わせて、２００の１０ｃｍ2デ
ッシュに撤いた。３０のディシュを１日後に無血清培地
中の２５μｇ／ｍｌの硫酸ブレオマイシン（化学突然変
異剤）で２時間処理した。この濃度の硫酸ブレオマイシ
ンでは、約５０％のＩＭＲ−９０ ＳＷ２６細胞が死滅
するため、これらのディシュ残りとして２倍の細胞密度
で平板培養した。
【０２８３】該デッシュの残りを、対照（７０デッシ
ュ）として用いるか、またはＬＮＬ６欠損レトロウイル
スで感染させた（１００デッシュ）。以前に記載された
方法（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）およびロスマン（Ｒｏｓ
ｍａｎ）、１９８９年、バイオテクニックス（Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第７巻、９８０−９９０頁）に
従って、ＬＭＬ６を両性充填系（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｈ
ｉｃ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｌｉｎｇ）ＰＡ３１７中で
生成させた。ＰＡ３１７細胞に感染したＬＭＬ６からの
培養上清を用いて、２μｇ／ｍｌのポリブレン存在下に
て約５×１０5細胞を含有する１００デッシュを感染さ
せた。ポリブレンを含有する非感染のＰＡ３１７細胞か
らの対照培養上清を用いて７０デッシュを処理し対照と
して供した。感染後数日以内に、全ての対照および実験
デッシュを計数すると、各々のデッシュは１−２×１０
6細胞を含有していた。各々のデッシュのＰＤＬを算出
し、次いで、細胞を５０ｃｍ2デッシュ中に０．３３×
１０6にて置換し、変動解析を行うため別々に維持し
た。
【０２８４】ブレオマイシン処理したＳＷ２６細胞は、
自然発生率（４．７×１０-7）に比して約２倍も高い頻
度（７．７×１０-7）で危機を回避した。非感染充填系
からの培養上清で同時にｍｏｃｋ−感染した対照シリー
ズの比率によりも２−３倍も高い頻度（１０．９×１０
-7）で危機から回避できる挿入突然変異を生成させるた
めに、前−危機のＳＷ２６細胞を欠損したレトロウイル
スＬＮＬ６で感染させた。
【０２８５】
【表１１】 硫酸ブレオマイシン暴露およびレトロウイルス感染は不死化を増加させる 添加物 不死化 頻度 Ｎｉｌ １０／６８ ４．４×１０-7 硫酸ブレオマインシ ７／２７ ７．７×１０-7 ＬＮＬ６レトロウイルス ３６／９９ １０．９×１０-7 不死化は、培養シリーズ数当たりの不死化系の数で示
し、各々のシリーズは実験初期の単一のデッシュ由来で
ある。頻度は、（細胞分裂当たりではなく）各継代にて
平板培養した細胞数に基づいて不死化細胞系が得られる
確率として示す。
【０２８６】ＬＮＬ６での挿入突然変異に従い得た３６
の独立細胞系のうち２３からＤＮＡを単離し、サザーン
・ブロッティングで分析したところ、残りのほとんどが
単一の挿入を含有していた一方でこれらの７（３０％）
はレトロウイルス配列を含有していなかった。レトロウ
イルス挿入を持たないものは自然発生の不死化現象を表
すはずであったと仮定すれば、永続性の頻度が実際に２
−３倍も上昇している場合には、レトロウイルス挿入を
有する残りのほとんどのクローンは挿入突然変異に起因
するにちがいない。１２の系からのＤＮＡを、稀にしか
切断しない酵素Ｓｆｉ１で消化し、続いてパルス−フィ
ールド電気泳動に付し、ナイロン膜に移してレトロウイ
ルスＬＴＲで探査する。１２の系のうち６は、レトロウ
イルスＬＴＲにハイブリダイズする約３５０Ｋｂｐの共
通のバンドを含有していた。これらの６のうちの４につ
いても、ＢａｍＨ１消化により分析したところ、これら
の４のうちの３も約２０Ｋｂｐの共通のバンドを含有し
ていた。レトロウイルスが６Ｋｂｐ長であるとすれば、
これは、ＤＭＮＡの１４Ｋｂｐ領域内にレトロウイルス
が複数回数挿入されたことを強く示唆し、このことは単
一の遺伝子であることを強く示唆している。レトロウイ
ルス内で切断するＥｃｏＲ１で消化すると、各々の系で
異なった大きさの断片が得られ、それらに異なった挿入
があったことを表し、真に独立した単離物であることが
明確にされる。レトロウイルス配列を用いて挿入部位に
つながったゲノムＤＮＡをクローン化することで、今や
Ｍ２機構に関与する遺伝子を積極的に同定できる。（例
えば、アンチセンス技術を用いて）その遺伝子の機能を
妨害することにより、テロメラーゼが脱抑制され、正常
ヒト細胞の寿命を延ばすこととなるであろう。また、こ
の遺伝子が、種々の癌細胞中で突然変異したものであ
り、かくして癌において優れた診断価値および治療価値
がありそうであることが判明するにちがいない。
【０２８７】実施例２０：霊長類におけるテロメラーゼ
活性の組織分布 １２歳の健康なオスのレーサス・マカークザル（Ｒｈｅ
ｓｕｓ Ｍａｃａｑｕｅ）からＳ１００抽出物を調製し
て、テロメラーゼ活性の組織分布を検討した。豊富なテ
ロメラーゼ活性は、精巣からのみ検出された。脳、腎臓
および肝臓からの組織試料では、活性を検出できなかっ
た。このことは、癌の治療療法としてのテロメラーゼ阻
害が、生殖系を除く通常の組織には豊富にないという独
特の利点を有することを示している。従って、テロメラ
ーゼ阻害剤は、出生欠陥の機会を減じるため、生殖年齢
の個体の生殖系細胞から離れて標的とするものでなけれ
ばならない。かかる標的化は、該腫瘍部位近くに有効な
剤を局所注射または局所放出させることにより達成しう
る。オスにおける該テロメラーゼ阻害剤の効果は、精子
中のテロメア反復長を測定することにより容易に評価し
うる。
【０２８８】
【配列表】
＜１１０＞ マイケル、ディイ・ウェスト（Ｍｉｃｈａ
ｅｌ Ｄ．Ｗｅｓｔ），ジェリー、ダブリュ・シェイ
（Ｊｅｒｒｙ Ｗ．Ｓｈａｙ），ウッドリング、イイ・
ライト（Ｗｏｏｄｒｉｎｇ Ｅ．Ｗｒｉｇｈｔ） ＜１２０＞ テロメア長および／またはテロメラーゼ活
性に関連する治療および診断 ＜１３０＞ ＜１５０＞ ＵＳ０７／８８２４３８ ＜１５１＞ １９９２．５．１３ ＜１５０＞ ＵＳ０８／０３８７６６ ＜１５１＞ １９９３．４．２４ ＜１６０＞ ７ ＜２１０＞ １ ＜２１１＞ ６０ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Artificial Sequence ＜４００＞ １ TTAGGGTTAG GGTTAGGGTT AGGGTTAGGG TTAGGGTTAG GGTTAGGGTT 50 AGGGTTAGGG 60 ＜２１０＞ ２ ＜２１１＞ １２ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Artificial Sequence ＜４００＞ ２ CCCTAACCCT AA 12 ＜２１０＞ ３ ＜２１１＞ １２ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Artificial Sequence ＜４００＞ ３ TTAGGGTTAG GG 12 ＜２１０＞ ４ ＜２１１＞ １８ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Artificial Sequence ＜４００＞ ４ CCCTAACCCT AACCCTAA 18 ＜２１０＞ ５ ＜２１１＞ １８ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Artificial Sequence ＜４００＞ ５ TTAGGGTTAG GGTTAGGG 18 ＜２１０＞ ６ ＜２１１＞ ２４ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Artificial Sequence ＜４００＞ ６ CCCTAACCCT AACCCTAACC CTAA 24 ＜２１０＞ ７ ＜２１１＞ １２ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Artificial Sequence ＜４００＞ ７ CCCTAACCCT AA 12
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、細胞型および／または培養条件を変
更し、培養長の日数（水平軸）と細胞数（垂直軸）とを
プロットしたグラフである。
【図２】 図２は、細胞型および／または培養条件を変
更し、培養長の日数（水平軸）と細胞数（垂直軸）とを
プロットしたグラフである。
【図３】 図３は、細胞型および／または培養条件を変
更し、培養長の日数（水平軸）と細胞数（垂直軸）とを
プロットしたグラフである。
【図４】 図４は、平均末端制限断片（ＴＲＦ）の長さ
と、ヒト臍静脈内皮細胞培養についてのＰＤＬとの直線
プロットである。該プロットは、−１９０±１０ｂｐ／
ＰＤ、ｒ＝−０．９８、Ｐ＝０．０１の傾き（ｍ）を有
する。
【図５】 図５は、供与者の年齢の関数としての、ヒト
腸骨動脈および腸骨静脈からの内皮細胞培養の平均ＴＲ
Ｆのプロットである。腸骨動脈についてのパラメーター
は：ｍ＝−１０２ ｂｐ／ｙｒ、ｒ＝−０．９８、Ｐ＝
０．０１であって、腸骨静脈については：ｍ＝−４２
ｂｐ／ｙｒ、ｒ＝−０．７１、Ｐ＝０．１４である。
【図６】 図６は、供与者の年齢の関数としての、大動
脈弓、腹大動脈、腸骨動脈および腸骨静脈からの内側組
織の平均ＴＲＦの減少のプロットである。直線プロット
についてのパラメーターは：ｍ＝−４７ ｂｐ／ｙｒ、
ｒ＝−０．８５、Ｐ＝０．０５である。
【図７】 図７は、供与者の年齢の関数としてプロット
したＰＢＬからの平均ＴＲＦ長のプロットである。直線
回帰線の傾き（−４１±２．６ ｂｐ／ｙ）は０とは有
意に異なる（ｐ＜０．００００５）。
【図８】 図８は、ダウン症候群（ＤＳ）患者において
促進されたテロメア喪失を示すプロットである。ＤＳ患
者のＰＢＬから単離したゲノミックＤＮＡを図７に記載
したごとくに分析した。平均ＴＲＦ長は、ＤＳ患者（中
空き四角の記号）および年齢を合致させた対照（塗り潰
した四角の記号）につき、供与者の年齢の関数として示
す。直線回帰線の傾き（−１３３±１５ ｂｐ／ｙ、ト
リソミー、ｖｓ−４３±７．７、通常）は有意に異なる
（ｐ＜０．０００５）。
【図９】 図９は、（２の正常な個体からのＤＮＡにつ
いて示した）集団倍加の関数としての、培養したＴ−リ
ンパ球における平均ＴＲＦ長の減少を示すプロットであ
る。これらの細胞の供与者年齢は入手できなかった。こ
れらの線の傾き（−８０±１９（°）および−１０２±
５．４（０）ｂｐ／倍加）はゼロから有意に異なる（ｐ
＜０．０００１）。複数継代が利用できなかった第３の
供与体からの最後の継代における平均ＴＲＦ長も示す
（上下反対のＶ−記号）。
【図１０】 図１０は、卵巣肉腫および対照の正常細胞
のＴＲＦ長を示すオートラジオグラムのコピーである。
２の患者からの腹水中の細胞からのＤＮＡ（ｃａｓおよ
びｗａｄ）をＨｉｎｄｆＩおよびＲｓａＩで消化し、電
気泳動によって分離し、テロメリック・プローブ32Ｐ
（ＣＣＣＴＡＡ）3にハイブリダイズさせ、厳密に洗浄
し、オートラジオグラフィーにかけた。７の他の患者か
らの腹水の細胞を、接着性の通常細胞（Ｎ）に分離し、
腫瘍を培地に集めた（Ｔ）。該ＤＮＡを抽出し、前記し
たごとくに泳動させた。患者からのＤＮＡは第１および
第４穿開から得た。患者からの腫瘍細胞を培養し、ＤＮ
Ａは関係する集団倍加（ｐｄ）から得た。
【図１１】 図１１は卵巣肉腫細胞におけるテロメラー
ゼ活性を示す。前に実験した形質転換体細胞系２９３Ｃ
ＳＨ、腫瘍細胞系ＨＥＹ、精製した腫瘍細胞集団および
患者の腹水からの直接の細胞からのＳ１００抽出物を、
ｄＡＴＰおよびＴＴＰ、32ＰｄＧＴＰおよび緩衝液の存
在下、テロメアプライマー（ＴＴＡＧＧＧ）3と共にイ
ンキュベートした。反応生成物を配列決定用ゲルで分離
し、ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒスクリーンにさらし
た。単一（１）または２の反応（２）をテストした。
【図１２】 図１２は、延長された寿命（ＰＤ６８）に
対するＨＭＥ−３１細胞およびＨＥＭ３１−Ｅ６細胞に
おけるＴＲＦ長を示すオートラジオグラフィー、および
続いての不死化およびテロメア長の安定化のコピーであ
る（ＰＤ８１、１０７）。
【図１３】 図１３は、ＨＭＥ３１：Ｅ６細胞の老化の
間におけるテロメア長に対するＣＴＯの効果を示すオー
トラジオグラムのコピーである。中間の時点を選択して
ＣＴＯオリゴヌクレオチドの用量依存性保護効果を示
す。
【図１４】 図１４は、該ＣＴＯオリゴヌクレオチドに
応答するＩＭＲ９０肺腺維芽細胞の寿命の延長を示すグ
ラフである。
【図１５】 図１５は、ＩＤＨ４細胞のテロメア長に対
するＧＴＯの効果を示すオートラジオグラムのコピーで
ある。
【図１６】 図１６は、ＩＤＨ４細胞のテロメア長に対
するＧＴＯの効果を示すオートラジオグラムのコピーで
ある。
【図１７】 図１７は、該ＣＴＯオリゴヌクレオチドに
応答するＨＭＥ３１：Ｅ６ヒト胸内皮細胞の寿命の延長
を示すグラフである。
【図１８】 図１８は、テロメラーゼＲＮＡ鋳型および
その上の主要な鎖終止の位置を示す。図１８Ａは、残基
にその下に１（５’）から９（３’）の番号を付した、
テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）テロメラーゼ
ＲＮＡの鋳型部分を示す。配列Ｔ2Ｇ4Ｔ2Ｇ4を持つオリ
ゴヌクレオチドプライマーは示した塩基対合によって鋳
型に結合する。エロンゲーション、続いての鋳型トラン
スロケーションは示したように起こると考えられる。図
１８Ｂは、異なるヌクレオシド三リン酸アナログによる
テロメラーゼＲＮＡ鋳型上の主要な鎖終止の位置を示
す。テロメラーゼＲＮＡ鋳型配列は図１８Ａに示す。矢
印は、示した各ヌクレオシド三リン酸（該ヌクレオシド
由来）についての最大鎖終止の位置を示す。
【図１９】 図１９は、ヌクレオシドアナログ三リン酸
がテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）テロメラー
ゼアッセイにおける32Ｐ標識の取り込みを阻害すること
を示すグラフである。該アナログ、非標識ｄＧＴＰまた
は非標識ＴＴＰの添加濃度を順次増加させたときの、標
識ヌクレオチドの取り込みに対する影響を、定量的テロ
メア反応アッセイを用いて測定した。取り込まれた放射
能（ｃｐｍ）を各パネルに示した競合物質の濃度に対し
てプロットした。（Ａ．〔α−32Ｐ〕ＴＴＰで標識 Ｂ
−Ｆ、〔α−32Ｐ〕ｄＧＴＰで標識 Ｆ．ストレプトマ
イシン硫酸塩のテロメラーゼ反応に対する効果。４０ｍ
Ｍ硫酸ナトリウムの存在下における取り込みをストレプ
トマイシン硫酸塩についての対照として示す）。
【図２０】 図２０はヌクレオシド三リン酸アナログ
が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてのテロメラーゼのパター
ンおよび進行度を中止させることに対する効果を示す。
特に、図２０Ａは、示したヌクレオシド三リン酸アナロ
グの存在下および不存在下におけるテロメラーゼ反応を
示す。また、反応ミックス中にプライマー有りと無しの
場合において、非標識ＴＴＰ競合物質を対照として分析
した。次いで、生成物を変性ポリアクリルアミドゲルで
分析した。図２０Ｂは、標準テロメラーゼ反応は、ｄｄ
ＧＴＰ（レーン４〜６）、ｄｄＩＴＰ（レーン７〜
９）、またはＤＭＳＯ（レーン１）の存在下で行ったこ
とを示す。ＤＭＳＯはｄｄＧＴＰについての溶媒であ
り、テストした最大濃度（１％）において、アナログま
たはＤＭＳＯ無しでの対照反応泳動と比較して反応に影
響を示さなかった（対照レーン２〜３）、生成物を変性
ポリアクリルアミドゲルで分析した。
【図２１】 図２１は、ニック−トランスレーションを
行った、３’ｒＤＮＡ断片をプローブとして含有する
〔α−32Ｐ〕標識プラスミドを用い、テロメア長に対す
るｉｎ ｖｉｖｏでのヌクレオシドアナログの影響を示
すためのサザーンブロット分析を示す。ゲノミックＤＮ
ＡをＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、該ｒＤＮＡテ
ロメアを分析した。該ｒＤＮＡからのテロメリックＰｓ
ｔＩ断片は１．６および１．０ｋｂのマーカーの間にあ
り、各パネルの両側に線として示す。一定の２．８ｋｂ
バンドは隣接する内部ＰｓｔＩ ｒＤＮＡ断片である。
特に、図２１Ａは、５ｍＭ ＡＺＴの不存在下（−）、
２％ＰＰＹＳ中で増殖させたテトラヒメナ・テルモフィ
ラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ａ）のクローン、および５ｍＭ ＡＺＴの存在下（＋）
での３のクローンについての結果を示す。３つのレーン
の各セットは、３日（レーン１、４、７、１０）、１０
日（レーン２、５、８、１１）および１６日（レーン
３、６、９、１２）後に栄養的に増殖させ、移した単一
の細胞クローンについての結果を示す。図２１Ｂは、Ａ
ＺＴの異なる濃度における増殖の結果、チミン欠乏ブロ
ス（Ｉｓｏｂｒｏｔｈ）＋ＡＺＴで増殖させた対数相細
胞においてテロメアの濃度依存性短縮となることを示
す。６、１０および１６日にサンプリングした細胞から
作製したＤＮＡは、短縮されたテロメア長は、培養中６
および１６日の間、一定であることを示す。レーン１、
５、９ ０ｍＭ ＡＺＴ対照；レーン２、６、１０
０．０１ｍＭ ＡＺＴ；レーン３、７、１１ ０．１ｍ
Ｍ ＡＺＴ；レーン４、８、１２１ｍＭ ＡＺＴ。図２
１Ｃは、培養中、１４および２７日において、添加無し
（レーン１）、１％ＤＭＳＯ（Ａｒａ−Ｇ用溶媒）添
加、（「Ｃ」、レーン２および５）、およびＡｒａ−Ｇ
（レーン３ １ｍＭ；レーン４および６ ２ｍＭ）添加
にて、２％ＰＰＹＳ中で栄養的に増殖させた細胞を示
す。図２１Ｄは、増殖速度：「遅い」（「Ｓ」、１日当
たり０〜１倍加、レーン２）または「速い」（「Ｆ」、
１日当たり２〜４倍加、レーン３）に基づいて２つのク
ラスに分けた。Ｉｓｏｂｒｏｔｈ＋１ｍＭ ＡＺＴ（レ
ーン２および３）で増殖させた単一細胞培養からのＤＮ
Ａの分析を示す。ＡＺＴの不存在下で増殖させた対照培
養からのＤＮＡを示す（「Ｃ」、１日当たり２〜４倍
加、レーン１）。分析用に十分なＤＮＡを得るためにい
くつかの培養をプールした。
【図２２】 図２２は、アナログの存在下で連結させ、
接合の間飢餓としたテトラヒメナ細胞からのＤＮＡのＰ
ＣＲ分析を示す。テロメリックプライマーおよび５’ｒ
ＤＮＡプライマーを、アナログの存在下または不存在下
で連結させた細胞からのＤＮＡと共にＰＣＲ反応で用い
て、大核発生の間に形成された１１ｋｂ ｒＤＮＡへの
テロメアの付加を検出した。対照としてＤＮＡ無しで反
応を行った。テストは、５ｍＭ ＡＺＴ；１ｍＭ Ａｒ
ａ−Ｇ、および１ｍＭ Ａｃｙｃｌｏ−Ｇの使用を含む
ものであった。また、ＳＢ２１０細胞を対照として模擬
連結させた。予期された生成物はほぼ１４００ｂｐであ
る。加えて、３’小核ｒＤＮＡプライマーを同ＤＮＡで
用いて、ＰＣＲ用のＤＮＡ試料の存在およびコンピテン
スを証明した。予期されたバンドは８１０ｋｂｐであ
る。図面において、ランダム起点とした32Ｐ−標識５’
ｒＤＮＡプローブを用いる５’ｒＤＮＡテロメリックＰ
ＣＲ反応のサザーンブロット分析により、大核発生の間
に一時的に形成された１１ｋｂ ｒＤＮＡ種からの、テ
ロメアを持つ５’ｒＤＮＡの部分としての１４００ｂｐ
ＰＣＲ生成物が確認された。該ＤＮＡ対照において
（レーン１）、あるいはＳＢ２１０模擬連結対照（レー
ン６）においてハイブリダイゼーションが観察されなか
った。レーン２、アナログ無添加；レーン３ ５ｍＭ
ＡＺＴ、レーン４ １ｍＭ Ａｒａ−Ｇ；レーン５ １
ｍＭ Ａｃｙｃｌｏ−Ｇ；レーン６ 模擬連結ＳＢ２１
０細胞ＤＮＡ。これらの結果は、３つの別の実験で再現
された。
【図２３】 図２３は、ＲＰＭＩ培地、薬剤無添加にて
（対照）および比較的低用量のｄｄＧ、ＡＺＴ、ａｒａ
−Ｇ、およびｄｄＩにて培養したＪＹリンパ腫細胞の増
殖を示す。該ＤＭＳＯはｄｄＧ用の対照である。
【図２４】 図２４は、図２３と同様にして培養した
が、比較的高用量の潜在的なテロメラーゼ阻害剤で処理
した培養ＪＹリンパ腫細胞の増殖を示す。
【図２５】 図２５は、テロメリック反復配列（ＴＴＡ
ＧＧＧ）3でプローブをした第１週および第３週におけ
るＪＹリンパ腫細胞から単離したＤＮＡのサザーンプロ
ットを示す。最初のレーンは実験の開始時における細胞
からのＤＮＡであって、３番目は示した時間についての
ＡＺＴで処理した細胞である。
【図２６】 図２６は、サザーンブロットによって該テ
ロメリック（ＴＴＡＧＧＧ）3プローブにハイブリダイ
ズした腺維芽細胞ＤＮＡを示す。「ＨｉｎｆＩ」の記号
を付したレーンは制限酵素ＨｉｎｆＩで消化したＤＮＡ
であり、「Ｏ」の記号を付したレーンは処理を受けてい
ないものであり、「Ｐのみ」の記号を付したレーンはピ
ペリジンで処理したものであり、「Ｐ＋ＤＭＳ」の記号
を付したレーンはピペリジンおよびジメチル硫酸で処理
したものである。
【図２７】 図２７は、３つの別々の実験において、種
々の用量の薬剤ｄｄＧによって達成されたヒト・テロメ
ラーゼの阻害を示す。該テロメラーゼは腫瘍細胞系２９
３に由来するものであった。
【図２８】 図２８は、種々の他のカンジタ種のゲノミ
ックＤＮＡへの、シイ・アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎ
ｓ）のテロメリック反復のハイブリダイゼーションを示
す。酵母の８の種のゲノミックＤＮＡをＥｃｏＲＩで消
化し、０．８％アガロース上で電気泳動に付し、ブロッ
トを行い、次いで、シイ・アルビカンスＷＯ−１からの
32Ｐ−標識テロメリック断片でプローブした。ハイブリ
ダイゼーションは５５℃で行い、洗浄は２００ｍＭ Ｎ
ａ+および２％ＳＤＳにおけるＮａ2ＨＰＯ4中にて同温
におけるものであった。キロ塩基対（ｋｂ）で測定した
ＤＮＡサイズマーカーは右に示す。用いた種はシイ・ギ
レルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）、エ
ス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シイ・
シュードトロピカリス（Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃ
ａｌｉｓ）、クルベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、シイ・ルシタニエ
（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、シイ・マルトサ（Ｃ．
ｍａｌｔｏｓａ）、シイ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐ
ｉｃａｌｉｓ）、およびシイ・アルビカンス（Ｃ．ａｌ
ｂｉｃａｎｓ）である。星印は、テロメアがそれからク
ローン化された特定の株を示す。「Ｂ」で始まる株はビ
イ・ウィッケス（Ｂ．Ｗｉｃｋｅｓ）から得られたＮ．
Ｉ．Ｈ．株である。
【図２９】 図２９は、ケイ・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔ
ｉｓ）ＡＴＣＣ３２１４３（左パネル）およびシイ・ギ
レルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）Ｂ−
３１６３（右パネル）におけるタンデム反復のゲノミッ
クコピーのＢａ１３１の感度を示す。未切断酵母ゲノミ
ックＤＮＡを時間を増大させてＢａ１３１ヌクレアーゼ
と共にインキュベートし（各レーンにおいて分で表
す）、次いで、ＥｃｏＲＩで消化し、０．８％アガロー
スゲル上の電気泳動に付し、ナイロン膜にブロットし
た。ケイ・ラクチスについては、図３０に示したケイ・
ラクチスのテロメリック反復と配列が同一の32Ｐ−キナ
ーゼ処理した２５塩基のオリゴヌクレオチドでプロービ
ングを行った。ハイブリダイゼーションおよび洗浄は４
９℃で行った。シイ・ギレルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌ
ｅｒｍｏｎｄｉｉ）については、32Ｐ−標識ｐＣｇｕｉ
３、シイ・ギレルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎ
ｄｉｉ）からのα−２ ｋｂテロメリッククローンを担
持するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（ストラタジー
ン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラジョラ（ＬａＪｏｌｌ
ａ）、カリフォルニア州）でプロービングを行った。ハ
イブリダイゼーションおよび（２００ｍＭ Ｎａ+中で
の）洗浄は５４℃で行った。ほとんどのバンドは１分の
地点までは進行するほぼ３つの他のバンドは順次短くな
っているが、３分においては進行しない。これらの後者
のバンドは、推定すると、ｐＣｇｕｉ３に存在する特定
のサブテロメリック配列に相同である。ＤＮＡサイズマ
ーカー（ｋｂ）は各パネルの右に示す。
【図３０】 図３０は、いくつかの出芽酵母種からのテ
ロメリック反復の配列を示す。特に、テロメアが豊富な
ライブラリーは標準的な方法によってゲノミックＤＮＡ
から構築した。未切断酵母のゲノミックＤＮＡを平滑末
端直線化プラスミドベクターに結び、次いで、この結ん
だミックスを、ベクターのポリリンカー内および問題と
する種の推定テロメリック端部の少なくともいくつかに
おける数キロ塩基内で共に切断する制限酵素で消化し
た。最初の連結に先立ち、ゲノミックＤＮＡにおいてテ
ロメアの平滑末端を生じさせるために酵素による予備処
理は行わなかった。次いで、プラスミドをＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで再環化し、コロニーハイブリダイゼーションに
よって推定テロメアクローンについてのスクリーニング
に先立ってイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換
した。シイ・マルトサ（Ｃ．ｍａｌｔｏｓａ）、シイ・
シュードトロピカリス（Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃ
ａｌｉｓ）、２つの株シイ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏ
ｐｉｃａｌｉｓ）およびケイ・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔ
ｉｓ）ＡＴＣＣ３２１４３（これらは、シイ・アルビカ
ンスのテロメリック反復プローブへクロスハイブリダイ
ズした多重バンドを示した種である）からのライブラリ
ーをこのプローブでスクリーニングした。クローン化エ
ス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）テロメア
プローブ（反復単位ＴＧ2-3（ＧＴ）1-3）を用いて、そ
のゲノミックＤＮＡがこれとクロスハイブリダイズした
がシイ・アルビカンスのテロメリック反復プローブとは
クロスハイブリダイズしなかった、該テロメアが豊富な
シイ・グラブラダ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）からのライ
ブラリーをスクリーニングした。シイ・ギレルモンディ
（Ｃ．ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）ＤＮＡは、テスト
したストリンジェンシィにおいて、シイ・アルビカンス
またはエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
テロメックプローブいずれともクロスハイブリダイズが
認められなかった。該テロメアが豊富なこの種からのラ
イブラリーを、全ゲノミック・シイ・ギレルモンディ
（Ｃ．ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）ＤＮＡをプローブ
として用いてスクリーニングした。この手法は反復的配
列を含有するすべてのクローンを同定するのに用いるこ
とができ、本発明者らは、テロメアは、テロメア豊富ラ
イブラリーで見い出された反復的配列の合理的パーセン
トであるべきであると理由付けした。典型的には、数百
のイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体が各小さなラ
イブラリーにつき得られ、９つまでの推定テロメアクロ
ーンが各々から得られた。９の反復的ＤＮＡクローンが
シイ・ギレルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉ
ｉ）から得られ、そのうち３つのテロメリックであるこ
とが判明した。
【図３１】 図３１は、ある種のシイ・トロピカリス
（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）株に存在するテロメリッ
ク反復の２つのタイプを示す。１０（ここでは５つのみ
示す）のシイ・トロピカリス株およびシイ・アルビカン
スＷＯ−１からのゲノミックＤＮＡをＣｌａＩで消化
し、０．８％アガロースゲル上で電気泳動に付し、ブロ
ットし、シイ・トロピカリスのテロメリック反復（左パ
ネル）からの「ＡＣ」形態または反復からの「ＡＡ」形
態いずれかに対して特異的なオリゴヌクレオチドでプロ
ーブした。これらの２つのオリゴヌクレオチドの配列
は：５’ＡＣＧＧＡＴＧＴＣＡＣＧ（「ＡＣ」）および
５’ＧＴＧＴＡＡＧＧＡＴＧ（「ＡＡ」）であり、下線
で示したのは二形態性塩基の位置である。キナーゼ処理
した「ＡＣ」プローブでのハイブリダイゼーションは４
７℃におけるものであり、「ＡＡ」プローブでのハイブ
リダイゼーションは２４℃におけるものであった。両者
についての洗浄は５００ｍＭ Ｎａ+を含む２％ＳＤＳ
におけるものであった。「ＡＡ」プローブの特異性は、
ただ１つのみミスマッチがあり、用いたシイ・アルビカ
ンス細胞はシイ・トロピカリス株よりもかなり長いテロ
メアを有し（従って、多くのテロメリック反復を有す
る）という事実にも拘わらず、シイ・アルビカンスのテ
ロメアとハイブリダイズしないことによって示される。
シイ・トロピカリスのテロメアの短いことは、個々のテ
ロメリックバンドが比較的鋭いことによって示唆される
ごとく、それがサイズが特に均一のようであることによ
って説明されよう。
【図３２】 図３２は、（ＴＴＡＧＧＧ）3プローブに
ハイブリダイズしたＪＹ細胞から単離したＤＮＡのサザ
ーンブロットを示す。細胞を、０．０１％ＤＭＳＯ中の
１０μＭ ｄｄＧまたは０．０１％ＤＭＳＯのみを含む
培地のいずれかで１０週間にわたって処理した。ｄｄＧ
で処理した細胞は、テロメラーゼ活性の阻害と矛盾しな
い平均テロメア長の顕著な減少を示した。
【図３３】 図３３は、腹水からの細胞におけるテロメ
ラーゼ活性を示す。特に、Ｓ１００抽出物を調製し、蛋
白濃度を測定し、緩衝液、テロメアプライマー（ＴＴＡ
ＧＧＧ）3、α32ＰｄＧＴＰ、ＴＴＰおよびｄＡＴＰを
含有する等容量の反応混合物と共に３０℃で１時間イン
キュベートすることによってテロメラーゼ活性を検定し
た。反応はＲＮａｓｅで終了させ、プロテイキナーゼＫ
で脱蛋白した。取り込まれなかったα32ＰｄＧＴＰは、
供給業者の指示に従い、ＮＩＣＫ ＳＰＩＮカラム（フ
ァルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いて除去し
た。生成物は配列決定ゲルで分割し、Ｐｈｏｓｐｈｏｒ
Ｉｍａｇｅｒスクリーン（モレキュラー・ダイナミック
ス（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｍａｎｉｃｓ））に暴露し
た。ラダー（Ｌ）およびキナーゼ処理した５’32Ｐ（Ｔ
ＴＡＧＧＧ）3（Ｏ）をマーカーとして泳動させた。図
３３Ａは、対照ヒト細胞系２９３ＣＳＨ、２９３細胞系
のサブ系、および患者Ｄｅｍ−１およびＲｕｄ−１から
の未分画腹水細胞から調製した同等の蛋白濃度（〜１１
ｍｇ／ｍｌ）でのＳ１００抽出物でアッセイしたテロメ
ラーゼを示す。レーン１において３および５のＲＮＡｓ
ｅを、α32ＰｄＧＴＰの添加に先立って抽出物に加え
た。図３３Ｂは、単離し、２９３細胞と比較した患者Ｐ
ｒｅｓ−３およびＮａｇ−１からの細胞の早期継代培養
からのテロメラーゼ活性につき検定したＳ１００抽出物
を示す。すべての抽出物は〜２−３ｍｇ／ｍｌの蛋白濃
度でアッセイした。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (71)出願人 598111490 ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシ ティ・オブ・カリフォルニア Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆ ｏｒｎｉａ アメリカ合衆国カリフォルニア州94607− 5200，オークランド，フランクリン・スト リート 1111，トウェルブス・フロア 1111 Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｓｔｒｅｅｔ, 12ｔｈ Ｆｌｏｏｒ，Ｏａｋｌａｎｄ，Ｃ ａｌｉｆｏｒｎｉａ 94607−5200，Ｕｎ ｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒ ｉｃａ (72)発明者 ウエスト，マイケル・ディ アメリカ合衆国94002カリフォルニア州、 ベルモント、ウェイクフィールド・コート 15番 (72)発明者 シェイ，ジェリー アメリカ合衆国75209テキサス州、ダラス、 ホースシュー・トレイル5060番 (72)発明者 ライト，ウッドリング アメリカ合衆国76011テキサス州、アーリ ントン、カントリー・グリーン・レイン 2300番 (72)発明者 ブラックバーン，エリザベス・エイチ アメリカ合衆国カリフォルニア州、サンフ ランシスコ、イエルバ・ブエナ・アベニュ ー294番

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 試験化合物がテロメラーゼ活性を調節す
    るか否かを決定するためにスクリーニングする方法であ
    って、反応混合物中で、テロメラーゼ活性を含む調製
    物、テロメラーゼ活性により伸長されることができる基
    質オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド三リン酸、および
    試験化合物を合わせ；反応混合物を、テロメラーゼ活性
    の調節剤の不在下で、基質オリゴヌクレオチドがテロメ
    ラーゼ活性により伸長されて１つまたはそれ以上のヌク
    レオシド三リン酸を取り込む条件下でインキュベート
    し；基質オリゴヌクレオチドが伸長されるか否かを決定
    し；そして基質オリゴヌクレオチドの促進された伸長ま
    たは伸長の阻害をテロメラーゼ活性の調節と相関させ
    る、の各工程を含む方法。
  2. 【請求項２】 テロメラーゼ活性が、真菌、哺乳動物、
    および原生動物のテロメラーゼ活性からなる群より選択
    される、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 テロメラーゼ活性が哺乳動物テロメラー
    ゼ活性である、請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 哺乳動物テロメラーゼ活性がヒトテロメ
    ラーゼ活性である、請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 基質オリゴヌクレオチドの伸長の阻害
    が、試験化合物によるテロメラーゼ活性の阻害と相関す
    る、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 基質オリゴヌクレオチドの促進された伸
    長が、試験化合物によるテロメラーゼ活性の活性化と相
    関する、請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 試験化合物が、核酸、蛋白質、および合
    成化学物質からなる群より選択される、請求項５記載の
    方法。
  8. 【請求項８】 試験化合物が核酸である、請求項５記載
    の方法。
  9. 【請求項９】 核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチド
    である、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが１
    つまたはそれ以上のリボヌクレオチドを含む、請求項９
    記載の方法。
  11. 【請求項１１】 試験化合物がリボザイムである、請求
    項６記載の方法。
  12. 【請求項１２】 試験化合物が合成化学物質である、請
    求項６記載の方法。
  13. 【請求項１３】 合成化学物質がヌクレオシド類似体で
    ある、請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 ヌクレオシド類似体がリバーストラン
    スクリプターゼ阻害剤である、請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 合成化学物質が、抗癌化合物、抗寄生
    体化合物および抗真菌化合物からなる群より選択され
    る、請求項１２記載の方法。
  16. 【請求項１６】 複数の反応混合物が存在し、各反応混
    合物がマイクロタイタープレートの異なるウエルに置か
    れるハイスループットスクリーニング方法である、請求
    項１記載の方法。
  17. 【請求項１７】 基質オリゴヌクレオチドが伸長される
    か否かの決定が、反応混合物中の反応生成物をテロメア
    反復配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプロ
    ーブと接触させることにより実施される、請求項１記載
    の方法。
  18. 【請求項１８】 試験化合物がテロメラーゼ活性調節剤
    として同定された後、次に細胞を試験化合物に暴露して
    化合物が細胞におけるテロメア維持を調節するか否かを
    決定する、請求項１記載の方法。
  19. 【請求項１９】 試験化合物が基質オリゴヌクレオチド
    の伸長を阻害するテロメラーゼ活性調節剤として同定さ
    れ、次にテロメラーゼ活性調節剤に暴露される細胞が、
    テロメラーゼ活性の阻害剤の不在下でテロメアを維持す
    る条件下でテロメラーゼ活性を発現する、請求項１８記
    載の方法。
  20. 【請求項２０】 試験化合物が基質オリゴヌクレオチド
    の伸長を促進するテロメラーゼ活性調節剤として同定さ
    れ、次にテロメラーゼ活性調節剤に暴露される細胞が、
    テロメラーゼ活性の促進剤の存在下でテロメア維持を促
    進する条件下でテロメラーゼ活性を発現する、請求項１
    ８記載の方法。
  21. 【請求項２１】 試験化合物がテロメラーゼ活性を調節
    するか否かを決定するためにスクリーニングする方法で
    あって、試験化合物の存在下で、テロメラーゼ活性の調
    節剤の不在下でテロメラーゼ活性を妨害しない条件下で
    テロメラーゼ活性アッセイを実施し；試験化合物がテロ
    メラーゼ活性を調節するか否かを決定し；そして調節す
    る場合には、試験化合物をテロメラーゼ活性の調節剤と
    して同定する、の各工程を含む方法。
  22. 【請求項２２】 テロメラーゼ活性の阻害剤を同定する
    ために用いられる、請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 テロメラーゼ活性の活性化剤を同定す
    るために用いられる、請求項２１記載の方法。
  24. 【請求項２４】 テロメラーゼ活性アッセイがインビト
    ロでの生化学的アッセイを含む、請求項２１記載の方
    法。
  25. 【請求項２５】 インビトロでの生化学的アッセイが、
    反応混合物中で、テロメラーゼ活性を含む調製物、テロ
    メラーゼ活性により伸長されることができる基質オリゴ
    ヌクレオチド、ヌクレオチド三リン酸、および試験化合
    物を合わせ、そしてテロメラーゼ活性の調節剤の不在下
    で基質オリゴヌクレオチドがテロメラーゼ活性により伸
    長されて１つまたはそれ以上のヌクレオシド三リン酸を
    取り込む条件下で反応混合物をインキュベートすること
    を含む、請求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 テロメラーゼ活性アッセイが、培養細
    胞を試験化合物に暴露することを含む、請求項２１記載
    の方法。
  27. 【請求項２７】 培養される細胞がテロメラーゼ活性を
    発現する、請求項２６記載の方法。
  28. 【請求項２８】 試験化合物がテロメラーゼ活性を調節
    するか否かの決定が、試験化合物に暴露された細胞にお
    けるテロメア長を、試験化合物に暴露されていない細胞
    におけるテロメア長と比較して測定することにより実施
    される、請求項２６記載の方法。
  29. 【請求項２９】 試験化合物がテロメラーゼ活性を調節
    するか否かの決定が、試験化合物に暴露された細胞の増
    殖能力をモニターすることにより実施される、請求項２
    ６記載の方法。
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