JPH11123079A - エクジステロイドｕｄｐ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 日本産ヨトウガ核多角体病ウイルスの遺伝子
のうちエクジステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子を提供する。 【解決手段】 以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を
コードするＤＮＡ。 （Ａ）配列表配列番号２に示すアミノ酸配列を有する日
本産ヨトウガ核多角体病ウイルスのエクジステロイドＵ
ＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ。 （Ｂ）配列表配列番号２において、１個若しくは数個の
アミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ
酸配列を有し、かつ、エクジステロイドＵＤＰ−グルコ
シルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、農薬等の分野で利
用され得るヨトウガ核多角体病ウイルスのエクジステロ
イドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子に関
するものである。

【０００２】

【従来の技術】エクジステロイドＵＤＰ−グルコシルト
ランスフェラーゼ遺伝子は、昆虫の蛹化等に関連してい
るホルモンとして知られているエクジステロイドを不活
化し蛹化を妨害するタンパク質として知られるエクジス
テロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼタンパ
ク質をコードする。

【０００３】核多角体病ウイルスは、りん翅目昆虫など
に感染する昆虫病原ウイルスであり、宿主の異なる多く
の株が知られている。また、同じ宿主を持つウイルスに
も、いくつかの株が存在することが知られている。これ
らのウイルスのうちいくつかのものではエクジステロイ
ドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子が報告
されている。たとえば、オートグラファ・カリフォルニ
カなどの昆虫に対するそれぞれの核多角体病ウイルス由
来のエクジステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子の配列が報告されている。（ＮＰＨＥＧ
Ｔ，ＧｅｎｅＢａｎｋ） また、英国産ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓ
ｉｃａｅ）においても、核多角体病ウイルスのエクジス
テロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子
の配列が報告されている。（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．
１９９６，Ｎｏｖ；７７（Ｐｔ １１）：２８６５−２
８７１） しかしながら、本発明の日本産ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔ
ｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）核多角体病ウイルスのこの
領域に関する知見は少なく、その塩基配列も報告されて
いない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、日本産ヨトウガ核多角体病ウイ
ルスのエクジステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子を単離し、これを日本産ヨトウガ核多角
体病ウイルスの検定、およびエクジステロイドＵＤＰ−
グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター部
位および遺伝子を改変して感染致死期間を短縮したウイ
ルス等の有用ウイルスの作製に利用するための遺伝子を
提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は上記課題を解
決するために鋭意研究を行った結果、日本産ヨトウガ核
多角体病ウイルスからエクジステロイドＵＤＰ−グルコ
シルトランスフェラーゼ遺伝子を取得することに成功
し、本発明にいたった。

【０００６】すなわち本発明は、以下の（Ａ）又は
（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡである。

【０００７】（Ａ）配列表配列番号２に示すアミノ酸配
列を有する日本産ヨトウガ核多角体病ウイルスのエクジ
ステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ （Ｂ）配列表配列番号２において、１個若しくは数個の
アミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ
酸配列を有し、かつ、エクジステロイドＵＤＰ−グルコ
シルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。

【０００８】上記ＤＮＡとして具体的には、以下の
（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが挙げられる。

【０００９】（ａ）配列表の配列番号１において、塩基
番号１〜１８４からなる配列を有するＤＮＡ。

【００１０】（ｂ）配列表の配列番号１において、塩基
番号１８５〜１７３２からなる塩基配列を有するＤＮＡ
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、か
つ、エクジステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェ
ラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

【００１１】本発明はまた、配列番号１において、塩基
番号１８５〜１７３２からなる塩基配列の少なくとも一
部を有する請求項１記載のＤＮＡ配列、及び、配列番号
１において、塩基番号１〜１８４なる塩基配列の少なく
とも一部を有するプロモーター配列を提供する。

【００１２】なお、本明細書においては、エクジステロ
イドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子のプ
ロモーター、エクジステロイドＵＤＰ−グルコシルトラ
ンスフェラーゼをコードする構造遺伝子、及びこれら両
者を含むＤＮＡ配列を、併せて「エクジステロイドＵＤ
Ｐ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子」ということ
がある。以下、本発明を詳細に説明する。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明のＤＮＡは、日本産ヨトウ
ガ核多角体病ウイルスのエクジステロイドＵＤＰ−グル
コシルトランスフェラーゼ遺伝子、すなわち、上記
（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ、及
びこの遺伝子のプロモーター配列である。このＤＮＡ
は、本発明を完成するに際しては、後に述べるようにし
て、日本産ヨトウガ核多角体病ウイルスＤＮＡから単離
されたものであるが、その塩基配列が明らかにされたの
で、配列番号１又は２に示す配列に基づいて化学合成す
ることによっても取得することができる。

【００１４】以下に、本発明のＤＮＡ配列を得る方法の
一例を示す。尚、以下の方法において、ＤＮＡ断片の合
成（化学的合成、制限酵素による切断）、分離および検
索、ＤＮＡ配列の解析、大腸菌等の処理（形質転換、培
養、プラスミドベクターの取得等）などの一般的操作の
手順は特に記述しない限り、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら （１９８２）：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎ
ｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ等に記載されている方法に従って行え
ばよい。。

【００１５】（１）ウイルスＤＮＡの調製 ヨトウガ核多角体病ウイルスは世界各地で分離されてい
るが、本発明においては、日本産ヨトウガから分離され
たウイルスを使用する。例えば、東京都において分離さ
れたＴｏ株は農林水産省農業研究センターより入手する
ことができる。ヨトウガ核多角体病ウイルスの多角体か
ら、単一のヨトウガ核多角体病ウイルスを得る。単一ウ
イルスの調製は、Ｇ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ、Ｍ．Ｄ．Ｓｕｍ
ｍｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 第８９巻第５１７頁−５
２０頁（１９７８）、あるいはＧ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ、
Ｍ．Ｄ．Ｓｕｍｍｅｒｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ 第３９巻第１２３頁−１３７頁（１９８
１）に記載の方法に準じて行えばよい。すなわち、前記
多角体をアルカリで溶解してウイルス粒子を放出させ、
培養細胞に感染させ、単一のプラークを選択することに
より、単一ウイルスを得る。

【００１６】次に、得られた単一ウイルスからＤＮＡを
調製する。例えば、単一ウイルスからアルカリで溶解し
てウイルス粒子を放出させ、ショ糖密度勾配遠心分離、
超高速遠心分離などによりウイルス粒子を精製する。こ
のウイルス粒子をプロテアーゼＫでタンパク質を分解し
た後、フェノール処理などを行なうことによりＤＮＡが
得られる。（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ．Ｍ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ Ｚｏｏｌｏｇｙ第１９巻
（３）第２８０頁−２８７頁（１９８４）、Ｓ．Ｔ．Ｔ
ｚｉａら Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第９９巻第３９９頁−４０
９頁（１９７９）等）。

【００１７】（２）本発明のＤＮＡ配列の選択 上記で得られたＤＮＡから、エクジステロイドＵＤＰ−
グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を選択する。ＤＮ
Ａを各種制限酵素で切断した後、０．５から１．５％、
好ましくは１％のアガロースを用いて電気泳動を行ない
ナイロン膜に転写して４８〜６８℃でサザンハイブリダ
イゼーションを行なう。プローブは従来報告され、生物
間でよく保存されているエクジステロイドＵＤＰ−グル
コシルトランスフェラーゼ遺伝子、例えばオートグラフ
ァ・カリフォルニカ核多角体病ウイルスのエクジステロ
イドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子の塩
基配列に基づいて作製した合成ＤＮＡにＲＩやビオチン
で標識したものを使用すればよい。

【００１８】ＤＮＡ断片を転写したナイロン膜をプロー
ブ溶液に浸漬し、洗滌した後オートラジオグラフィー等
により、プローブがハイブリダイズした位置を検出す
る。その位置に相当するアガロースゲルからＤＮＡ断片
を常法により精製することにより、エクジステロイドＵ
ＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子あるいはそ
の一部を含むＤＮＡ断片が得られる。

【００１９】また、ビオチンで標識したプローブを用い
る場合は、ハイブリダイゼーションを行った後に、アビ
ジン、色素を結合させた抗アビジン抗体を順次結合さ
せ、発色液と反応させると発色するので、目的配列の位
置を検出することができる。

【００２０】（３）ＤＮＡの塩基配列の決定 上記により得られたエクジステロイドＵＤＰ−グルコシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、プラ
スミドベクターあるいはファージベクターに挿入して、
エクジステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラー
ゼ遺伝子を含む組換えベクターを構築する。必要に応じ
て、エクジステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子以外のウイルスＤＮＡ配列を除くためにサ
ブクローニングを行ってもよい。

【００２１】こうして得られる組換えプラスミドあるい
は組み換えファージに含まれるエクジステロイドＵＤＰ
−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む断片の塩
基配列を、ダイデオキシ法等により決定する。得られた
塩基配列、あるいはその配列から推定されるアミノ酸配
列を従来報告されているエクジステロイドＵＤＰ−グル
コシルトランスフェラーゼ遺伝子の配列、あるいは常法
により精製したヨトウガ核多角体病ウイルスのエクジス
テロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼタンパ
クのアミノ酸配列と比較することによって、エクジステ
ロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を
含む断片であることの確認ができ、また、エクジステロ
イドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子の領
域を決定することができる。さらに、エクジステロイド
ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子領域が決
定されれば、エクジステロイドＵＤＰ−グルコシルトラ
ンスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列の上流に隣接す
るプロモーター配列を取得することができる。

【００２２】上記のようにして、後記実施例により得ら
れたエクジステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を、配列表配
列番号１に、この塩基配列から予想されるアミノ酸配列
を配列番号１及び２に示す。配列番号１に示すＤＮＡ配
列のうち、塩基番号１８５〜１７３２からなる配列は、
上記アミノ酸配列をコードする配列の一例であり、それ
ぞれのコドンを同一のアミノ酸をコードする等価のコド
ンに置換した配列も同様に前記アミノ酸配列をコードす
るものとして使用できる。なお、塩基番号１７３３〜１
７３５は終止コドンである。

【００２３】また、配列番号１において塩基番号１〜１
８４からなる配列中には、エクジステロイドＵＤＰ−グ
ルコシルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター配列
が含まれており、有用遺伝子の発現制御に利用すること
ができる。

【００２４】なお、一般に生理活性を有するタンパクを
コードするアミノ酸配列において、１個もしくは複数の
アミノ酸が付加、欠失もしくは置換された場合であって
も、その生理活性が維持される場合があることは当業者
において広く認識されているところである。本発明に
は、このような修飾が加えられ、かつエクジステロイド
ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼタンパク質をコ
ードするＤＮＡ断片も含まれる。すなわち、配列表番号
２において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置
換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、か
つ、エクジステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェ
ラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも、
本発明の範囲に含まれるものである。

【００２５】ここで、「１個もしくは数個」とは、アミ
ノ酸が付加、欠失もしくは置換されるアミノ酸残基のエ
クジステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ
タンパク質の立体構造における部位や、アミノ酸残基の
種類によっても異なるが、通常２〜２０個、好ましくは
２〜１５個程度のアミノ酸をさす。

【００２６】そのような改変されたＤＮＡは、例えば部
位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠
失、置換もしくは付加されるように本発明のＤＮＡの塩
基配列を改変することによって得られる。

【００２７】また、本発明のＤＮＡ又はこれを有する細
胞に変異処理を行い、これらのＤＮＡもしくは細胞か
ら、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下で、ハイブリダイ
ズするＤＮＡを選択することによっても、改変されたＤ
ＮＡを得ることができる。ここでいう「ストリンジェン
トな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成
され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をい
う。この条件を明確に数値化することは困難であるが、
一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば９９．５
％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズ
し、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズし
ない条件が挙げられる。

【００２８】後記実施例で得られたエクジステロイドＵ
ＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮ
Ａ配列のコード配列の上流には５’非コード領域（配列
番号１において塩基番号１〜１８４）が存在し、この領
域の少なくとも一部に、遺伝子発現に必要なプロモータ
ー配列が存在すると考えられる。ここで、「少なくとも
一部」とは、プロモーター活性を示すのに必要な領域を
含むことをいい、プロモーター活性に必要な領域は、上
記５’非コード領域の両末端側を除去し、プロモーター
活性の有無を調べることにより特定することができる。

【００２９】本発明により、日本産ヨトウガ核多角体病
ウイルスのエクジステロイドＵＤＰ−グルコシルトラン
スフェラーゼ遺伝子が得られたので、この塩基配列を指
標として、日本産ヨトウガ核多角体病ウイルスの検定が
可能となる。具体的には、本発明のＤＮＡの少なくとも
一部をプローブとするハイブリダイゼーション、又は、
本発明のＤＮＡの一部の塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドをプライマーとするＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって、ウイル
スの存在を検出することができる。なお、ここで「一
部」とは、少なくともプローブあるいはプライマーとし
て用いることができる程度の長さであり、通常、プロー
ブとしては１００〜２４００ｂｐ（塩基対）、プライマ
ーとしては１５〜２５ｂｐである。

【００３０】また、日本産ヨトウガ核多角体病ウイルス
のエクジステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラ
ーゼ遺伝子あるいはこの遺伝子のプロモーター配列を改
変することにより、感染致死期間を短縮したウイルス等
の有用ウイルスを作成することができる。具体的には、
ゲノムＤＮＡのエクジステロイドＵＤＰ−グルコシルト
ランスフェラーゼ遺伝子から、エクジステロイドＵＤＰ
−グルコシルトランスフェラーゼタンパク質をコードし
ている遺伝子あるいは、そのプロモーター配列の一部あ
るいは全てを削除するなどの方法により、エクジステロ
イドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼタンパク質
の発現量を減少もしくは、発現させなくすることにより
感染致死期間を短縮したウイルスを作成することができ
る。

【００３１】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明する。

【００３２】

【実施例１】エクジステロイドＵＤＰ−グルコシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子の取得 ＜１＞ウイルス粒子の調製 エクジステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラー
ゼ遺伝子を得る材料として、野生株である日本産ヨトウ
ガ（Mamestra brassicae）核多角体病ウイルスＴｏ株
（農林水産省農業研究センターより入手）を使用した。
このＴｏ株からＧ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ、Ｍ．Ｄ．Ｓｕｍｍ
ｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 第８９巻第５１７頁−５２
０頁（１９７８）およびＧ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ、Ｍ．Ｄ．
Ｓｕｍｍｅｒｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ 第３９巻第１２３頁−１３７頁（１９８１）に記
載の方法に準じて、すなわち、前記多角体をアルカリで
溶解してウイルスを放出させ、ヨトウガ培養細胞ＮＩＡ
Ｓ−ＭａＢｒ４細胞（森林総合研究所より入手）に感染
させ、生じた単一プラークを選び、単一ウイルスを得
た。この単一ウイルスをＡ−１２株とした。

【００３３】次に、Ａ−１２株ウイルス粒子がポリヘド
リンタンパクで包埋された多角体病ウイルス３×１０¹⁰
個を、５０ｍＭのＮａ₂ＣＯ₃溶液１５ｍｌに入れ、これ
を０℃で３０分間撹拌して、ポリヘドリンタンパクを溶
解した。この溶液を３，０００ｒｐｍで、１５分間遠心
分離して不純物を除去した後、上清１４ｍｌをショ糖濃
度３０〜６０％、２５，０００ｒｐｍで２時間ショ糖密
度勾配遠心を行ないウイルス粒子を得た。このウイルス
溶液２０ｍｌを５ｍＭのＮａ₂ＣＯ₃に対して一晩透析し
た。次いでこの溶液１８０ｍｌを３０，０００ｒｐｍ、
９０分間遠心分離し、単一ウイルス粒子を沈殿として得
た。

【００３４】＜２＞ウイルスＤＮＡの調製 上記で得られたウイルス粒子を、５００μｌのイオン交
換水に懸濁し、２ｍｇのプロテイナーゼＫ（ＭＥＲＣＫ
社製）を加え、さらに０．５％のＳＤＳ溶液を５００μ
ｌ加えた後、３７℃で１時間反応させて、ウイルスタン
パクを消化した。この溶液にＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）で飽
和させたフェノール溶液を等量加えてよく撹拌した後、
これを１６，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して水層を
分取した。同処理を２回繰り返した後、得られた水溶液
０．９ｍｌにクロロホルム：イソアミルアルコール（２
４：１）を等量加えてよく撹拌し、１６，０００ｒｐ
ｍ、５分間遠心分離して水層０．９ｍｌを分取した。

【００３５】こうしてタンパクを変性除去した水層０．
９ｍｌを１／１０に希釈したＳＳＣ（１５ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１．５ｍＭ クエン酸ナトリウム）に対して透析を
行ない、ウイルスＤＮＡ５０μｇを調製した。

【００３６】＜３＞エクジステロイドＵＤＰ−グルコシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子の単離 次に、上記で得られたウイルスＤＮＡから、サザンハイ
ブリダイゼーションによりヨトウガ核多角体病ウイルス
のエクジステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラ
ーゼ遺伝子の単離を行った。ウイルスＤＮＡ５００ｎｇ
を常法により制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉ
ｎｄIII、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＢｇｌII、
ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ、ＰｖｕII、ＳａｃII、Ｓｍａ
Ｉ）で消化した。このＤＮＡ溶液全量を１％アガロース
を用いて電気泳動を行なった後、サザンブロッティング
によりナイロン膜にＤＮＡ断片を転写した。

【００３７】サザンハイブリダイゼーションに用いたプ
ローブは、前記ＧｅｎｅＢａｎｋ、ＮＰＨＥＧＴに記載
の方法に準じて得た。すなわちオートグラファ・カリフ
ォルニカ核多角体病ウイルスのエクジステロイドＵＤＰ
−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む１．５ｋ
ｂｐ（キロ塩基対）のＤＮＡを、配列番号３および４に
示す配列を有するプライマーを用いたＰＣＲ（ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用
いて増幅し、プローブとした。なお、オートグラファ・
カリフォルニカ核多角体病ウイルスのウイルスＤＮＡ
は、Ｓｆ９細胞を用いて上記＜２＞と同様にして調製し
た。

【００３８】上記プローブの標識は、市販の標識・検出
キット（ＤＩＧ ＤＮＡ ｌａｂｅｒｉｎｇ ａｎｄ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｈｅｉｍｓ社製）を用い、添付のプロトコールに準
じて行なった。すなわち、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘ
ｉｇｅｎｉｎ）標識ｄＵＴＰ存在下で、ランダム・プラ
イマー法によるポリメラーゼ反応を行い、プローブＤＮ
Ａにｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ標識ｄＵＴＰを取り込ませ
た。

【００３９】上記プローブ溶液にウイルスＤＮＡ断片を
転写したナイロン膜を浸漬し、６８℃でハイブリダイゼ
ーションを行ない、ナイロン膜を洗滌した後、前記標識
・検出キットを用いてプローブがハイブリダイズした位
置の検出を行った。すなわち、上記ナイロン膜を、アル
カリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体、発色
試薬（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドールリン酸
／ニトロブルーテトラゾリウム）と反応させ、発色を行
った。

【００４０】その結果、制限酵素ＰｓｔＩの消化断片に
おいてポジティブな断片が見られた。その断片をクロー
ニングするため、ウイルスＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで
切断し、常法により約１０．２キロベースの断片を分離
精製した。これをＰｓｔＩで切断したプラスミドベクタ
ーｐＢＳ−ＳＫ（Ｍ１３−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社
製）に、Ｔ４リガーゼを用いて連結することにより、エ
クジステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ
遺伝子を含む約１０．２キロベースの断片を含むプラス
ミドベクターを作成した。さらにこのプラスミドより、
２種類の制限酵素ＨｉｎｄIII及びＳａｌＩを用いて、
約３．８キロベースの断片を常法によりサブクローニン
グすることにより、エクジステロイドＵＤＰ−グルコシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子を含む約３．８キロベース
の断片を含むプラスミドベクターｐＭＢＥＧＴ−ＳＨを
得た。

【００４１】この組換えプラスミドを保持する大腸菌Ｊ
Ｍ１０９は、エシェリシア コリ（Escherichia coli）
ＪＭ１０９（ｐＭＢＥＧＴ−ＳＨ）と命名し、平成９年
１０月７日より通産省工業技術院生命工学工業技術研究
所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１６４６１として寄託されてい
る。

【００４２】上記の約３．８Ｋｂｐの挿入断片の制限酵
素地図を図１に示す。この挿入断片の塩基配列の一部を
をダイデオキシ法により決定した。この塩基配列及びこ
の配列からコンピュータ解析により推定されたアミノ酸
配列を配列表配列番号１及び配列番号２に示す。この結
果、上記で得られたＤＮＡ断片は、５１６個のアミノ酸
からなるタンパク質をコードする１５４８ｂｐ（塩基番
号１８５〜１７３２）のコード領域が存在した。また、
この断片中には、１８４ｂｐの５’非コード領域が存在
し、遺伝子発現に必要なプロモーター配列が含まれると
考えられた。

【００４３】一方、常法により精製した日本産ヨトウガ
核多角体病ウイルスのエクジステロイドＵＤＰ−グルコ
シルトランスフェラーゼタンパクについて、Ｎ末端から
２０個のアミノ酸配列を調べた。その結果、このアミノ
酸配列（第１番目から第２０番目のアミノ酸配列）とＤ
ＮＡの塩基配列から推測されるアミノ酸配列は完全に一
致した。このことから、上記ＤＮＡ断片は日本産ヨトウ
ガ核多角体病ウイルスＡ−１２株のエクジステロイドＵ
ＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼタンパクをコード
している遺伝子を含むことが確認された。

【００４４】尚、本発明のエクジステロイドＵＤＰ−グ
ルコシルトランスフェラーゼタンパクのアミノ酸配列
と、オートグラファ・カリフォルニカあるいは英国産ヨ
トウガの核多角体病ウイルスのエクジステロイドＵＤＰ
−グルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列との相
同性は、それぞれ４７％及び９４％であるが、他の領域
では異なっており、日本産ヨトウガ核多角体病ウイルス
特有の配列である。

【００４５】

【発明の効果】本発明により、日本産ヨトウガ核多角体
病ウイルスのエクジステロイドＵＤＰ−グルコシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子が提供される。

【００４６】本発明のエクジステロイドＵＤＰ−グルコ
シルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列を指標とし
て、日本産ヨトウガ核多角体病ウイルスの検定が可能と
なる。また、この遺伝子あるいはこの遺伝子のプロモー
ター配列を改変することにより、感染致死期間が短縮さ
れたウイルス等の有用ウイルスを作成することができ
る。

【００４７】

【配列表】

配列番号 ：１ 配列の長さ：2396 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：日本産ヨトウガ（Mamestra brassicae）核多角
体病ウイルス 配列の特徴 特徴を示す記号：5'UTR 存在位置：1..184 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を示す記号：CDS 存在位置：185..1735 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を示す記号：3'UTR 存在位置：1736..2396 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 AAGCTTATCC GTTATTCGAG TCACGTTTAT GGGGTCACCT TCTCCTAAGA TGACGCTGTG 60 TCTGCGCTGA TTAGTAGTCA TAACGTGTTT TATTGACCTT ATTAATGCGT GGGCGCATCC 120 GTTGGCCTAC TTGTATATAA AGAATTTTTT GGGTCACCTA CATATTGTCC ATTGGCGTCT 180 CACC ATG AAC GGA GCT ATT GCT GCA TTG TTC TTG TGT TTG GTT ATG GTG 229 Met Asn Gly Ala Ile Ala Ala Leu Phe Leu Cys Leu Val Met Val 1 5 10 15 CAT CAG CAA CAT GCA GTC AGG ATC TTG GCG GTG TTT CCG ACT CCG GCT 277 His Gln Gln His Ala Val Arg Ile Leu Ala Val Phe Pro Thr Pro Ala 20 25 30 TAC AGC CAT CAC AGC GTG TTC AAA GTG TAC ATC GAG GCG CTG GCC GAA 325 Tyr Ser His His Ser Val Phe Lys Val Tyr Ile Glu Ala Leu Ala Glu 35 40 45 CGC GGC CAC GAC GTA GTG GTC ATT AAA TCT ACC GAC AGA ATC AAC TAT 373 Arg Gly His Asp Val Val Val Ile Lys Ser Thr Asp Arg Ile Asn Tyr 50 55 60 GCC AAC AGA AAT GGC TTG AGA GGA AAC GTT TCT GAA ATT GAC GCT TCA 421 Ala Asn Arg Asn Gly Leu Arg Gly Asn Val Ser Glu Ile Asp Ala Ser 65 70 75 CTC TCT CAA GAA TAC TAT GGC CGT CTA ATG CGT CAC GCC GGA GTT TTT 469 Leu Ser Gln Glu Tyr Tyr Gly Arg Leu Met Arg His Ala Gly Val Phe 80 85 90 95 AGG AAA AGA GGC ATT GTG GCC GAC AGT TCC ACG GTC ACC GCC CAC AAC 517 Arg Lys Arg Gly Ile Val Ala Asp Ser Ser Thr Val Thr Ala His Asn 100 105 110 TAC ATG GGA CTG GTG CGC ATG ATG AGC GAT CAA TTT GAT TTG CCC ATT 565 Tyr Met Gly Leu Val Arg Met Met Ser Asp Gln Phe Asp Leu Pro Ile 115 120 125 GTC AAA AGT TTT ATT GAG GAA GCA CAC AAG CAC AAA TTT GAT TTG TTA 613 Val Lys Ser Phe Ile Glu Glu Ala His Lys His Lys Phe Asp Leu Leu 130 135 140 ATA ACC GAG GCG TAC ATC GAT TAT CCT CTT GTT TTG TCA CAT TTG TTT 661 Ile Thr Glu Ala Tyr Ile Asp Tyr Pro Leu Val Leu Ser His Leu Phe 145 150 155 GGT GAT CTG CCA GTG GTG CAA ATT TCA TCG GGA TAC GCT GTG GCT GAA 709 Gly Asp Leu Pro Val Val Gln Ile Ser Ser Gly Tyr Ala Val Ala Glu 160 165 170 175 AAC TTT GAA ACT ATG GGA GCG GTC AGT CGT CAT CCC GTG TAC TAT CCT 757 Asn Phe Glu Thr Met Gly Ala Val Ser Arg His Pro Val Tyr Tyr Pro 180 185 190 AAT TTG TGG CGG GAC AAG TTT AGC GGA CTA AAC GTG TGG GAA ACA ATC 805 Asn Leu Trp Arg Asp Lys Phe Ser Gly Leu Asn Val Trp Glu Thr Ile 195 200 205 AAT GAA ATG TAC GTT GAG TTG GCG TTA CAA AAT GAA TTT AGT AAA TTG 853 Asn Glu Met Tyr Val Glu Leu Ala Leu Gln Asn Glu Phe Ser Lys Leu 210 215 220 GCC GAC GAA CAG AAT GCA CTA TTG AAA CGC CAG TTT GGC GAG AGC ACT 901 Ala Asp Glu Gln Asn Ala Leu Leu Lys Arg Gln Phe Gly Glu Ser Thr 225 230 235 CCC ACT ATT CAA GAA TTG CGC AAT AGA GTC GAG CTG TTG TTT GTT AAC 949 Pro Thr Ile Gln Glu Leu Arg Asn Arg Val Glu Leu Leu Phe Val Asn 240 245 250 255 ACA CAC GCC GTA TTC GAT AAC AAT AGG CCG GTA CCG CCG AGT GTG CAA 997 Thr His Ala Val Phe Asp Asn Asn Arg Pro Val Pro Pro Ser Val Gln 260 265 270 TAT TTG GGC GCA TTA CAT TTG CAC GAT AAG CGA CCG GAT AGC ATG TAC 1045 Tyr Leu Gly Ala Leu His Leu His Asp Lys Arg Pro Asp Ser Met Tyr 275 280 285 GGT ATG GTT CGT GAA TTT TTA GAT AAC GCA ACA ACA GGC GCT ATT TAC 1093 Gly Met Val Arg Glu Phe Leu Asp Asn Ala Thr Thr Gly Ala Ile Tyr 290 295 300 GTC AGT TTC GGT TCG GCA ATA TCC TCC GAA GAT ATG GAG CCA GAG TTT 1141 Val Ser Phe Gly Ser Ala Ile Ser Ser Glu Asp Met Glu Pro Glu Phe 305 310 315 ATA GAA ATG CTG CTG CGA GTC TTT GAA AAA CTA CCG TAT AGC ATT CTA 1189 Ile Glu Met Leu Leu Arg Val Phe Glu Lys Leu Pro Tyr Ser Ile Leu 320 325 330 335 TGG AAG TAC GAC GGC TAC ATG AAC AGA ATG CCC GCC AAC GTG TTT GTA 1237 Trp Lys Tyr Asp Gly Tyr Met Asn Arg Met Pro Ala Asn Val Phe Val 340 345 350 CAG TCG TGG TTC GAA CAA TAC AAC CTG TTG CAT CAT AAA AAC GTT CGT 1285 Gln Ser Trp Phe Glu Gln Tyr Asn Leu Leu His His Lys Asn Val Arg 355 360 365 GCT TTT GTC ACC CAA GGC GGC GTG CAG AGC ACC GAC GAA GCA GTC GAA 1333 Ala Phe Val Thr Gln Gly Gly Val Gln Ser Thr Asp Glu Ala Val Glu 370 375 380 GCG ATC GTG CCG ATG GTC GGC ATG CCA ATG ATG GGC GAT CAA GCC TAC 1381 Ala Ile Val Pro Met Val Gly Met Pro Met Met Gly Asp Gln Ala Tyr 385 390 395 AAT ATG AAT AAA ATT GTC GAA CTC GGA TTG GGC AAA GTC GTT GAC ACC 1429 Asn Met Asn Lys Ile Val Glu Leu Gly Leu Gly Lys Val Val Asp Thr 400 405 410 415 GTA CGT GTG AAT GCG GAA CAA CTC ATC GAG GCC ATC GTT GAC GTA GCA 1477 Val Arg Val Asn Ala Glu Gln Leu Ile Glu Ala Ile Val Asp Val Ala 420 425 430 GAA AGC CCC AAA TAC CGC AAA CGA TTG CGC GAA TTG CGA CAC ATG ATT 1525 Glu Ser Pro Lys Tyr Arg Lys Arg Leu Arg Glu Leu Arg His Met Ile 435 440 445 CAC CAC CAA CCA ATG ACA CCG CTC CAA AAG GCG GTT TGG TAC ACG GAG 1573 His His Gln Pro Met Thr Pro Leu Gln Lys Ala Val Trp Tyr Thr Glu 450 455 460 CAC GTG ATT GAA AGC CGT CGT CGC GTT GTT CCT ACT ATG CTA AAA ACC 1621 His Val Ile Glu Ser Arg Arg Arg Val Val Pro Thr Met Leu Lys Thr 465 470 475 AGA GCT GCC AAC GTT AAT TAT AGC GAT TAC ATC ATG TCT TAC GTA TTT 1669 Arg Ala Ala Asn Val Asn Tyr Ser Asp Tyr Ile Met Ser Tyr Val Phe 480 485 490 495 GTG CCG TTT ATA ATG TTT ACT GTA ATG AAT CAT TTG CGT CAA TTA CTG 1717 Val Pro Phe Ile Met Phe Thr Val Met Asn His Leu Arg Gln Leu Leu 500 505 510 AAA ATG AAT ATG GTG TAACTAATTT GAAAACAATA AAAAATGTTA ACAACGTAAT 1772 Lys Met Asn Met Val 515 TAATATTCAT TTGTTCATAC CTTTTTTGTT AGTCATGCGC AAACGCCCAC TGCGCAAGTT 1832 TGGCTTATAA ATGGCTGTTG GCGAGGGCAA CTTCATTCAG TATACGCCGT GTTTCGAGAG 1892 CGACACACAT CATGTCCACA ATTAGGAATA AACGCTTGTT GCGCACTATG GAACAGTTGA 1952 ATTTTAGACA AGTGCCCGTC GAAGATTTAA AGAAAGTGTC ACGTGCAATT ACCATATTAC 2012 AACAGTCGAA CGCGAAACTG AGCAAAGTGT TAAAACAAAT GCACGTTTTC TACGAACGCA 2072 AATATAAGCT AAAGCTAGTG GAACTCGAAG GTGCGTTATC TCACAAAAAG CGACAAATTG 2132 AGCAATTGGA AGAAGACATT CCCACGACTT TTTTGTTTTT AGTACGACAG GATAACGTTG 2192 TACATTTAAT TGAAGATTTT GAGAAGGTCA ATGAAATACT CAGCCAAAGC GGAAGTGGCA 2252 AAGTGCTGCT TTGTCGTTTG ACAAAAAGTT TAGCCGTGGA GAGGGCTCTA TGTATAGCCT 2312 TGGCGAAATC AAATTGCGGC GACAGTGTCA AACTACGTGA TAATAATTGT TTAGAATTTA 2372 AACACGCACA CGATATTGAC GCGT 2396

【００４８】配列番号 ：２ 配列の長さ：516 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Asn Gly Ala Ile Ala Ala Leu Phe Leu Cys Leu Val Met Val His 1 5 10 15 Gln Gln His Ala Val Arg Ile Leu Ala Val Phe Pro Thr Pro Ala Tyr 20 25 30 Ser His His Ser Val Phe Lys Val Tyr Ile Glu Ala Leu Ala Glu Arg 35 40 45 Gly His Asp Val Val Val Ile Lys Ser Thr Asp Arg Ile Asn Tyr Ala 50 55 60 Asn Arg Asn Gly Leu Arg Gly Asn Val Ser Glu Ile Asp Ala Ser Leu 65 70 75 80 Ser Gln Glu Tyr Tyr Gly Arg Leu Met Arg His Ala Gly Val Phe Arg 85 90 95 Lys Arg Gly Ile Val Ala Asp Ser Ser Thr Val Thr Ala His Asn Tyr 100 105 110 Met Gly Leu Val Arg Met Met Ser Asp Gln Phe Asp Leu Pro Ile Val 115 120 125 Lys Ser Phe Ile Glu Glu Ala His Lys His Lys Phe Asp Leu Leu Ile 130 135 140 Thr Glu Ala Tyr Ile Asp Tyr Pro Leu Val Leu Ser His Leu Phe Gly 145 150 155 160 Asp Leu Pro Val Val Gln Ile Ser Ser Gly Tyr Ala Val Ala Glu Asn 165 170 175 Phe Glu Thr Met Gly Ala Val Ser Arg His Pro Val Tyr Tyr Pro Asn 180 185 190 Leu Trp Arg Asp Lys Phe Ser Gly Leu Asn Val Trp Glu Thr Ile Asn 195 200 205 Glu Met Tyr Val Glu Leu Ala Leu Gln Asn Glu Phe Ser Lys Leu Ala 210 215 220 Asp Glu Gln Asn Ala Leu Leu Lys Arg Gln Phe Gly Glu Ser Thr Pro 225 230 235 240 Thr Ile Gln Glu Leu Arg Asn Arg Val Glu Leu Leu Phe Val Asn Thr 245 250 255 His Ala Val Phe Asp Asn Asn Arg Pro Val Pro Pro Ser Val Gln Tyr 260 265 270 Leu Gly Ala Leu His Leu His Asp Lys Arg Pro Asp Ser Met Tyr Gly 275 280 285 Met Val Arg Glu Phe Leu Asp Asn Ala Thr Thr Gly Ala Ile Tyr Val 290 295 300 Ser Phe Gly Ser Ala Ile Ser Ser Glu Asp Met Glu Pro Glu Phe Ile 305 310 315 320 Glu Met Leu Leu Arg Val Phe Glu Lys Leu Pro Tyr Ser Ile Leu Trp 325 330 335 Lys Tyr Asp Gly Tyr Met Asn Arg Met Pro Ala Asn Val Phe Val Gln 340 345 350 Ser Trp Phe Glu Gln Tyr Asn Leu Leu His His Lys Asn Val Arg Ala 355 360 365 Phe Val Thr Gln Gly Gly Val Gln Ser Thr Asp Glu Ala Val Glu Ala 370 375 380 Ile Val Pro Met Val Gly Met Pro Met Met Gly Asp Gln Ala Tyr Asn 385 390 395 400 Met Asn Lys Ile Val Glu Leu Gly Leu Gly Lys Val Val Asp Thr Val 405 410 415 Arg Val Asn Ala Glu Gln Leu Ile Glu Ala Ile Val Asp Val Ala Glu 420 425 430 Ser Pro Lys Tyr Arg Lys Arg Leu Arg Glu Leu Arg His Met Ile His 435 440 445 His Gln Pro Met Thr Pro Leu Gln Lys Ala Val Trp Tyr Thr Glu His 450 455 460 Val Ile Glu Ser Arg Arg Arg Val Val Pro Thr Met Leu Lys Thr Arg 465 470 475 480 Ala Ala Asn Val Asn Tyr Ser Asp Tyr Ile Met Ser Tyr Val Phe Val 485 490 495 Pro Phe Ile Met Phe Thr Val Met Asn His Leu Arg Gln Leu Leu Lys 500 505 510 Met Asn Met Val 515

【００４９】配列番号 ：３ 配列の長さ：22 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGACTATTC TCTGCTGGCTTG 23

【００５０】配列番号 ：４ 配列の長さ：22 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTAAAAGTGT GTTAAGTGATTC 23

【図面の簡単な説明】

【図１】 エクジステロイドＵＤＰ−グルコシルトラン
スフェラーゼ遺伝子を含む約３．８Ｋｂｐの挿入断片の
制限酵素地図。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を
   コードするＤＮＡ。 （Ａ）配列表配列番号２に示すアミノ酸配列を有する日
   本産ヨトウガ核多角体病ウイルスのエクジステロイドＵ
   ＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ。 （Ｂ）配列表配列番号２において、１個若しくは数個の
   アミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ
   酸配列を有し、かつ、エクジステロイドＵＤＰ−グルコ
   シルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡで
   ある請求項１記載のＤＮＡ。 （ａ）配列表の配列番号１において、塩基番号１８５〜
   １７３２からなる塩基配列を有するＤＮＡ。 （ｂ）配列表の配列番号１において、塩基番号１８５〜
   １７３２からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジ
   ェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、エクジステ
   ロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有
   するタンパク質をコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列番号１において、塩基番号１８５〜
   １７３２からなる配列の少なくとも一部を有する請求項
   １記載のＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】 配列番号１において、塩基番号１〜１８
   ４からなる配列の少なくとも一部を有するプロモーター
   配列。