JPH11113597A - ヒトミトコンドリアｄｎａを用いた遺伝子診断方法 - Google Patents
ヒトミトコンドリアｄｎａを用いた遺伝子診断方法Info
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- JPH11113597A JPH11113597A JP27912797A JP27912797A JPH11113597A JP H11113597 A JPH11113597 A JP H11113597A JP 27912797 A JP27912797 A JP 27912797A JP 27912797 A JP27912797 A JP 27912797A JP H11113597 A JPH11113597 A JP H11113597A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 成人病に罹患する確率の高いグループをヒト
ミトコンドリアＤＮＡを用いた遺伝子診断により決定す
る方法を提供すること。 【解決手段】 １６，５６９塩基対のヒトミトコンドリ
アＤＮＡの塩基配列のうち、５ヶ所の塩基置換（３０１
０、４８８３、５１７８、８４１４、及び１４６６８
位）に基づき、この５ヶ所の塩基置換のうちの少なくと
も１ヶ所の塩基置換をＰＣＲ法を応用したＲＦＬＰ法ま
たは、ＴａｑＭａｎ法により検出する遺伝子診断方法。
ミトコンドリアＤＮＡを用いた遺伝子診断により決定す
る方法を提供すること。 【解決手段】 １６，５６９塩基対のヒトミトコンドリ
アＤＮＡの塩基配列のうち、５ヶ所の塩基置換（３０１
０、４８８３、５１７８、８４１４、及び１４６６８
位）に基づき、この５ヶ所の塩基置換のうちの少なくと
も１ヶ所の塩基置換をＰＣＲ法を応用したＲＦＬＰ法ま
たは、ＴａｑＭａｎ法により検出する遺伝子診断方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトミトコンドリ
アＤＮＡを用いた遺伝子診断方法に関する。
アＤＮＡを用いた遺伝子診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ミトコンドリアは真核細胞内に存在する
細胞内小器官であり、その内部にある酸化的リン酸化系
を使って細胞の活動に必要なエネルギーの大部分を供給
している。このミトコンドリア内には、核ＤＮＡとは独
立したミトコンドリアＤＮＡ（以下には、「ｍｔＤＮ
Ａ」と省略することがある。）が存在することが明らか
にされており、１９８１年にはヒトｍｔＤＮＡの１６，
５６９塩基対の全塩基配列が決定されている（ Anderso
n.S., Bankier.A.T., Barrell,B.G., de Bruijn,M.H.
L., Coulson,A.R., Drouin,J., Eperon,I.C., Nierlic
h,D.P., Ror,B.A., Sanger,F., Schreier,P.H., Smith,
A.H.H., Staden,R.,& Young,I.G.: Sequence and organ
ization of the human mitochondrial genome. Nature
290,457-465, 1981 )。このヒトｍｔＤＮＡ内には、ミ
トコンドリア独自の遺伝子が存在しており、これまでに
その対応関係が明らかにされてきている（図１を参
照）。
細胞内小器官であり、その内部にある酸化的リン酸化系
を使って細胞の活動に必要なエネルギーの大部分を供給
している。このミトコンドリア内には、核ＤＮＡとは独
立したミトコンドリアＤＮＡ（以下には、「ｍｔＤＮ
Ａ」と省略することがある。）が存在することが明らか
にされており、１９８１年にはヒトｍｔＤＮＡの１６，
５６９塩基対の全塩基配列が決定されている（ Anderso
n.S., Bankier.A.T., Barrell,B.G., de Bruijn,M.H.
L., Coulson,A.R., Drouin,J., Eperon,I.C., Nierlic
h,D.P., Ror,B.A., Sanger,F., Schreier,P.H., Smith,
A.H.H., Staden,R.,& Young,I.G.: Sequence and organ
ization of the human mitochondrial genome. Nature
290,457-465, 1981 )。このヒトｍｔＤＮＡ内には、ミ
トコンドリア独自の遺伝子が存在しており、これまでに
その対応関係が明らかにされてきている（図１を参
照）。
【０００３】一方、ｍｔＤＮＡの突然変異が特定の疾患
と結びつくことが、分子生物学的研究の成果から明らか
にされつつある（田中 雅嗣、ミトコンドリア電子伝達
系酵素欠損症の分子生物学、生化学、63(3), 169-187,
1991、 Wataru Sato, Kiyoshi Hayasaka, Yutaka Shoj
i, Tsutomu Takahashi, Goro Takada, Masahiro Saito,
Osamu Fukuwa, and Eiko Wachi: A mitochondrial tRN
A mutation at 3,256 associated with mitochondrial
myopathy, encephalopathy, lactic acidesis,and stro
ke-like episodes(MELAS). BIOCHEMISTRY and MOLECULA
R BIOLOGY INTERNATIONAL 33(6), 1055-1061, 1994）。
と結びつくことが、分子生物学的研究の成果から明らか
にされつつある（田中 雅嗣、ミトコンドリア電子伝達
系酵素欠損症の分子生物学、生化学、63(3), 169-187,
1991、 Wataru Sato, Kiyoshi Hayasaka, Yutaka Shoj
i, Tsutomu Takahashi, Goro Takada, Masahiro Saito,
Osamu Fukuwa, and Eiko Wachi: A mitochondrial tRN
A mutation at 3,256 associated with mitochondrial
myopathy, encephalopathy, lactic acidesis,and stro
ke-like episodes(MELAS). BIOCHEMISTRY and MOLECULA
R BIOLOGY INTERNATIONAL 33(6), 1055-1061, 1994）。
【０００４】ところで、近年の日本人の美食化及び過食
化傾向に伴い、加齢するにつれて、ガン・心臓病・高血
圧・糖尿病・脳疾患等のいわゆる成人病が増加してい
る。
化傾向に伴い、加齢するにつれて、ガン・心臓病・高血
圧・糖尿病・脳疾患等のいわゆる成人病が増加してい
る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】このような成人病とヒ
トｍｔＤＮＡとの因果関係については、明確にされたも
のはない。もし、ヒトｍｔＤＮＡの塩基置換に基づい
て、成人病に罹患しやすい人を予め診断することができ
れば、その人が食生活や運動量等の生活態度を改善する
ことによって、成人病の罹患率を減少させることが可能
となる。
トｍｔＤＮＡとの因果関係については、明確にされたも
のはない。もし、ヒトｍｔＤＮＡの塩基置換に基づい
て、成人病に罹患しやすい人を予め診断することができ
れば、その人が食生活や運動量等の生活態度を改善する
ことによって、成人病の罹患率を減少させることが可能
となる。
【０００６】本発明は、上記事情に鑑みてなされたもの
で、その目的は成人病に罹患する確率の高いグループを
ヒトｍｔＤＮＡを用いた遺伝子診断により決定する方法
を提供するところにある。
で、その目的は成人病に罹患する確率の高いグループを
ヒトｍｔＤＮＡを用いた遺伝子診断により決定する方法
を提供するところにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の課題
を解決するため鋭意検討を行った結果、次のことを明ら
かにし、基本的には本発明を完成するに至った。 （１）百寿者（本明細書中において、「百寿者」とは、
満年齢で９９．１歳以上の者を表現するのに使用してい
る。）のｍｔＤＮＡの塩基配列と、アンダーソンら（前
出、Nature 290,457-465, 1981）が発表したｍｔＤＮＡ
の塩基配列との間にはいくつかの塩基置換が確認され
た。 （２）上記の塩基置換のうち、３０１０位の塩基がグア
ニンからアデニンに、４８８３位の塩基がシトシンから
チミンに、５１７８位の塩基がシトシンからアデニン
に、８４１４位の塩基がシトシンからチミンに、１４６
６８位の塩基がシトシンからチミンに、それぞれ置換さ
れている５ヶ所のものが多く、かつこの５ヶ所の塩基置
換は連鎖している確率が高かった。 （３）百寿者のｍｔＤＮＡの５１７８位の塩基は、シト
シン：アデニン＝２３例：１４例であった。 （４）５１７８位の塩基置換に注目し、患者群を年齢別
にグループ分けしたところ、４５歳を越えた患者群のｍ
ｔＤＮＡのうち、シトシンのものがアデニンのものに比
べ２倍程度と高かった。 （５）健常人のｍｔＤＮＡの５１７８位の塩基は、シト
シン：アデニン＝５５％：４５％であった。 （６）以上より、ｍｔＤＮＡの５１７８位がシトシン型
であるものは、アデニン型であるものに比べ、成人病に
罹患しやすいことが判明した。
を解決するため鋭意検討を行った結果、次のことを明ら
かにし、基本的には本発明を完成するに至った。 （１）百寿者（本明細書中において、「百寿者」とは、
満年齢で９９．１歳以上の者を表現するのに使用してい
る。）のｍｔＤＮＡの塩基配列と、アンダーソンら（前
出、Nature 290,457-465, 1981）が発表したｍｔＤＮＡ
の塩基配列との間にはいくつかの塩基置換が確認され
た。 （２）上記の塩基置換のうち、３０１０位の塩基がグア
ニンからアデニンに、４８８３位の塩基がシトシンから
チミンに、５１７８位の塩基がシトシンからアデニン
に、８４１４位の塩基がシトシンからチミンに、１４６
６８位の塩基がシトシンからチミンに、それぞれ置換さ
れている５ヶ所のものが多く、かつこの５ヶ所の塩基置
換は連鎖している確率が高かった。 （３）百寿者のｍｔＤＮＡの５１７８位の塩基は、シト
シン：アデニン＝２３例：１４例であった。 （４）５１７８位の塩基置換に注目し、患者群を年齢別
にグループ分けしたところ、４５歳を越えた患者群のｍ
ｔＤＮＡのうち、シトシンのものがアデニンのものに比
べ２倍程度と高かった。 （５）健常人のｍｔＤＮＡの５１７８位の塩基は、シト
シン：アデニン＝５５％：４５％であった。 （６）以上より、ｍｔＤＮＡの５１７８位がシトシン型
であるものは、アデニン型であるものに比べ、成人病に
罹患しやすいことが判明した。
【０００８】すなわち、上記の課題を解決するための請
求項１の発明に係るヒトミトコンドリアＤＮＡを用いた
遺伝子診断方法は、ヒトミトコンドリアＤＮＡの塩基配
列のうち、３０１０位の塩基がグアニンからアデニン
に、４８８３位の塩基がシトシンからチミンに、５１７
８位の塩基がシトシンからアデニンに、８４１４位の塩
基がシトシンからチミンに、１４６６８位の塩基がシト
シンからチミンに、置換されていることに基づき、前記
５ヶ所の塩基置換のうちの少なくとも１ヶ所の塩基置換
を検出することを特徴とする。
求項１の発明に係るヒトミトコンドリアＤＮＡを用いた
遺伝子診断方法は、ヒトミトコンドリアＤＮＡの塩基配
列のうち、３０１０位の塩基がグアニンからアデニン
に、４８８３位の塩基がシトシンからチミンに、５１７
８位の塩基がシトシンからアデニンに、８４１４位の塩
基がシトシンからチミンに、１４６６８位の塩基がシト
シンからチミンに、置換されていることに基づき、前記
５ヶ所の塩基置換のうちの少なくとも１ヶ所の塩基置換
を検出することを特徴とする。
【０００９】請求項２の発明は、請求項１に記載のもの
であって、前記遺伝子診断方法が、ＰＣＲ法を用いたも
のであることを特徴とする。
であって、前記遺伝子診断方法が、ＰＣＲ法を用いたも
のであることを特徴とする。
【００１０】請求項３の発明は、請求項１に記載のもの
であって、前記５ヶ所の塩基置換のうち５１７８位の塩
基がシトシンからアデニンに置換したものであり、前記
遺伝子診断方法がＰＣＲ−ＲＦＬＰ法であり、ＤＮＡを
分解する制限酵素がＡｌｕＩであることを特徴とする。
であって、前記５ヶ所の塩基置換のうち５１７８位の塩
基がシトシンからアデニンに置換したものであり、前記
遺伝子診断方法がＰＣＲ−ＲＦＬＰ法であり、ＤＮＡを
分解する制限酵素がＡｌｕＩであることを特徴とする。
【００１１】
【発明の実施の形態】ポリメラーゼ連鎖反応法（以下に
は、「ＰＣＲ法」と記載する。）によるｍｔＤＮＡの塩
基配列の決定は、Masashi Tanaka, Mika Hayakawa, and
Takayuki Ozawa, Automated Sequencing of Mitochond
rial DNA, Methods in Enzymology, Volume 264, 407-4
21 ,1996 に示されている方法に従った。この方法は、
図２に示したように二度のＰＣＲ法を行った後に、二度
目のＰＣＲ産物を直接にＰＣＲ法によりシークエンスす
るものである。
は、「ＰＣＲ法」と記載する。）によるｍｔＤＮＡの塩
基配列の決定は、Masashi Tanaka, Mika Hayakawa, and
Takayuki Ozawa, Automated Sequencing of Mitochond
rial DNA, Methods in Enzymology, Volume 264, 407-4
21 ,1996 に示されている方法に従った。この方法は、
図２に示したように二度のＰＣＲ法を行った後に、二度
目のＰＣＲ産物を直接にＰＣＲ法によりシークエンスす
るものである。
【００１２】一度目のＰＣＲ法では、ｍｔＤＮＡをテン
プレートとしてＬ１及びＨ１の二種類のプライマーを用
い、約３０００ｂｐを増幅させた。次に、一度目のＰＣ
Ｒ産物をテンプレートとしてＦＬ２及びＨ２の二種類の
プライマーを用い、二度目のＰＣＲ法を行い約５００〜
１０００ｂｐを増幅させた。最後に、二度目のＰＣＲ産
物をテンプレートとして塩基配列を決定するためのＰＣ
Ｒ法を行った。なお、ＰＣＲ法を行ったときのプライマ
ーの組合せ、及びプライマーＤＮＡの塩基配列について
は、後述する実施例中にて示した。
プレートとしてＬ１及びＨ１の二種類のプライマーを用
い、約３０００ｂｐを増幅させた。次に、一度目のＰＣ
Ｒ産物をテンプレートとしてＦＬ２及びＨ２の二種類の
プライマーを用い、二度目のＰＣＲ法を行い約５００〜
１０００ｂｐを増幅させた。最後に、二度目のＰＣＲ産
物をテンプレートとして塩基配列を決定するためのＰＣ
Ｒ法を行った。なお、ＰＣＲ法を行ったときのプライマ
ーの組合せ、及びプライマーＤＮＡの塩基配列について
は、後述する実施例中にて示した。
【００１３】得られた塩基配列は、コンピュータにより
比較解析した。その結果、百寿者のｍｔＤＮＡの塩基配
列には、複数の塩基置換が確認された。これらの塩基置
換から、百寿者のみに特有のものを抽出するために、患
者群のｍｔＤＮＡの塩基配列を解析した。この結果、特
に５ヶ所の塩基置換と、長寿者との間に強い相関関係が
確認された。
比較解析した。その結果、百寿者のｍｔＤＮＡの塩基配
列には、複数の塩基置換が確認された。これらの塩基置
換から、百寿者のみに特有のものを抽出するために、患
者群のｍｔＤＮＡの塩基配列を解析した。この結果、特
に５ヶ所の塩基置換と、長寿者との間に強い相関関係が
確認された。
【００１４】この５ヶ所の塩基置換のうち、５１７８位
がシトシンからアデニンに置換していることに基づきＰ
ＣＲ−ＲＦＬＰ法を確立した。これは、野生型のｍｔＤ
ＮＡでは５１７８位が制限酵素ＡｌｕＩの認識部位であ
ることを利用したものである。ＰＣＲ法に使用するため
のプライマーとしては、本発明に記載のものだけでな
く、５１７８位を挟むところであれば使用可能である。
なお、そのときにＡｌｕＩによって切断されたフラグメ
ントＤＮＡの長さが等しくなるように設計しておくと、
判別のさいに便利である。また、長寿者に特に関係の深
いその他の４ヶ所（３０１０，４８８３，８４１４，１
４６６８位）の塩基置換のうち、いずれの置換に基づい
てもｍｔＤＮＡのタイプを確認することが可能である。
がシトシンからアデニンに置換していることに基づきＰ
ＣＲ−ＲＦＬＰ法を確立した。これは、野生型のｍｔＤ
ＮＡでは５１７８位が制限酵素ＡｌｕＩの認識部位であ
ることを利用したものである。ＰＣＲ法に使用するため
のプライマーとしては、本発明に記載のものだけでな
く、５１７８位を挟むところであれば使用可能である。
なお、そのときにＡｌｕＩによって切断されたフラグメ
ントＤＮＡの長さが等しくなるように設計しておくと、
判別のさいに便利である。また、長寿者に特に関係の深
いその他の４ヶ所（３０１０，４８８３，８４１４，１
４６６８位）の塩基置換のうち、いずれの置換に基づい
てもｍｔＤＮＡのタイプを確認することが可能である。
【００１５】また、遺伝子診断方法においては、既知の
もの、例えばサザンブロット法、ＦＩＳＨ法、ＲＩＧＳ
法、ＣＧＨ法、ＬＯＨ法、直接シークエンス法、ＰＣＲ
−ＳＳＣＰ法、ＭＡＳＡ法、ＡＳＯプローブ法、ＰＣＲ
法、ＯＰＡ法等を使用することができる（BIOCLinica 1
0(9),1995,18-23）。遺伝子診断方法として、ＰＣＲ法
を応用したＴａｑＭａｎ（アプライドシステムズ社登録
商標）法を用いる場合には、塩基置換点を中心として
５’末端側及び３’末端側にそれぞれ１０〜３０塩基対
を合成してプローブ用ＤＮＡとする。このとき、ほぼ中
央の一つの塩基対の置換によりアニーリング温度が数度
変化すること、及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’
ヌクレアーゼ活性により、標的ＤＮＡに結合しているプ
ローブの蛍光色素を選択的に解離させることができる。
また、ＰＣＲ法を応用するに際して、プライマーＤＮＡ
の位置は本実施形態により限定されるものではない。
もの、例えばサザンブロット法、ＦＩＳＨ法、ＲＩＧＳ
法、ＣＧＨ法、ＬＯＨ法、直接シークエンス法、ＰＣＲ
−ＳＳＣＰ法、ＭＡＳＡ法、ＡＳＯプローブ法、ＰＣＲ
法、ＯＰＡ法等を使用することができる（BIOCLinica 1
0(9),1995,18-23）。遺伝子診断方法として、ＰＣＲ法
を応用したＴａｑＭａｎ（アプライドシステムズ社登録
商標）法を用いる場合には、塩基置換点を中心として
５’末端側及び３’末端側にそれぞれ１０〜３０塩基対
を合成してプローブ用ＤＮＡとする。このとき、ほぼ中
央の一つの塩基対の置換によりアニーリング温度が数度
変化すること、及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’
ヌクレアーゼ活性により、標的ＤＮＡに結合しているプ
ローブの蛍光色素を選択的に解離させることができる。
また、ＰＣＲ法を応用するに際して、プライマーＤＮＡ
の位置は本実施形態により限定されるものではない。
【００１６】
【実施例】次に、本発明を実施例によって説明するが、
本発明はこれら実施例により限定されるものではない。 実施例１：全ＤＮＡサンプルの抽出 全ＤＮＡは宝酒造株式会社の「Ｇｅｎとるくん」を使用
した。その方法について簡単に記載すると、次のようで
ある。1.5mlのマイクロチューブに、500μlのキット中
ＧｅｎＴＬＥ溶液Ｉと100μlの血液を加え、直ちに数秒
間攪拌した。室温で10分間以上静置後、室温にて12,000
xｇ以上で5分間遠心した。上清を取り除き、沈殿に1ml
のキット中ＧｅｎＴＬＥ溶液ＩＩを加えた。マイクロチ
ューブを転倒混和した後、室温にて12,000xｇ以上で2分
間遠心し、上清を取り除いた。沈殿に500μlのキット中
ＧｅｎＴＬＥ溶液IIIを加え、10秒間攪拌した。室温に
て12,000xｇ以上で5分間遠心し、上清を新たなマイクロ
チューブに移した。500μlのイソプロパノールを加え、
転倒混和した後、4℃、12,000xｇで5分間遠心した。上
清を取り除いた後、70%エタノールで沈殿を洗浄し、真
空乾燥機で乾燥させた。全ＤＮＡを50μlのTE緩衝液（1
0mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA）に溶解した。
本発明はこれら実施例により限定されるものではない。 実施例１：全ＤＮＡサンプルの抽出 全ＤＮＡは宝酒造株式会社の「Ｇｅｎとるくん」を使用
した。その方法について簡単に記載すると、次のようで
ある。1.5mlのマイクロチューブに、500μlのキット中
ＧｅｎＴＬＥ溶液Ｉと100μlの血液を加え、直ちに数秒
間攪拌した。室温で10分間以上静置後、室温にて12,000
xｇ以上で5分間遠心した。上清を取り除き、沈殿に1ml
のキット中ＧｅｎＴＬＥ溶液ＩＩを加えた。マイクロチ
ューブを転倒混和した後、室温にて12,000xｇ以上で2分
間遠心し、上清を取り除いた。沈殿に500μlのキット中
ＧｅｎＴＬＥ溶液IIIを加え、10秒間攪拌した。室温に
て12,000xｇ以上で5分間遠心し、上清を新たなマイクロ
チューブに移した。500μlのイソプロパノールを加え、
転倒混和した後、4℃、12,000xｇで5分間遠心した。上
清を取り除いた後、70%エタノールで沈殿を洗浄し、真
空乾燥機で乾燥させた。全ＤＮＡを50μlのTE緩衝液（1
0mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA）に溶解した。
【００１７】実施例２：百寿者及び患者のｍｔＤＮＡの
塩基配列の確認 百寿者のｍｔＤＮＡに特異的な塩基置換が確認されるか
否かを明らかにするため、百寿者（１１例）及び患者
（最大４３例、部位によっては４３例に満たないところ
もある。）のｍｔＤＮＡの全塩基配列を確認した。百寿
者として９９歳以上の者から、頬粘膜細胞を歯ブラシを
用いて採取し、プロテイナーゼＫとＳＤＳ処理を行い、
フェノール／クロロホルム抽出した後、全ＤＮＡを得
た。一方、百寿者の試料を得た地域の基幹病院において
全血球計算検査を受けた患者を無作為に抽出し、その検
査終了後の全血を試料として用い、実施例１に記載した
方法により全ＤＮＡを抽出後、ｍｔＤＮＡの塩基配列を
確認した。ＤＮＡシークエンスは、前出の Methods in
Enzymology, Volume 264, 407-421, 1996 に報告されて
いる方法に基づき、次のようにして行った。また、一度
目および二度目のＰＣＲ法に使用したプライマーＤＮＡ
の組合せは、表１〜表３に示した。
塩基配列の確認 百寿者のｍｔＤＮＡに特異的な塩基置換が確認されるか
否かを明らかにするため、百寿者（１１例）及び患者
（最大４３例、部位によっては４３例に満たないところ
もある。）のｍｔＤＮＡの全塩基配列を確認した。百寿
者として９９歳以上の者から、頬粘膜細胞を歯ブラシを
用いて採取し、プロテイナーゼＫとＳＤＳ処理を行い、
フェノール／クロロホルム抽出した後、全ＤＮＡを得
た。一方、百寿者の試料を得た地域の基幹病院において
全血球計算検査を受けた患者を無作為に抽出し、その検
査終了後の全血を試料として用い、実施例１に記載した
方法により全ＤＮＡを抽出後、ｍｔＤＮＡの塩基配列を
確認した。ＤＮＡシークエンスは、前出の Methods in
Enzymology, Volume 264, 407-421, 1996 に報告されて
いる方法に基づき、次のようにして行った。また、一度
目および二度目のＰＣＲ法に使用したプライマーＤＮＡ
の組合せは、表１〜表３に示した。
【００１８】
【表１】
【００１９】
【表２】
【００２０】
【表３】
【００２１】
【表４】
【００２２】
【表５】
【００２３】
【表６】
【００２４】
【表７】
【００２５】
【表８】
【００２６】
【表９】
【００２７】
【表１０】
【００２８】一度目のＰＣＲ法は全ＤＮＡをテンプレー
トとし、Ｌ１及びＨ１（各プライマーの塩基配列は表４
〜表６に記載した。）をプライマーとして使用した。反
応溶液の組成は次の通りである。1μlの全ＤＮＡ（10 n
g/μl）、5μlのＬ１（10μM）、5μlのＨ１（10μ
M）、4μlの2.5 mM dNTP、0.25μlの5 units/μl Taq
ＤＮＡポリメラーゼ、5μlの10x PCR緩衝液（100 mM Tr
is-HCl pH8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2）に29.75μl
の精製水を加えて全量を50μlとして 0.2-ml MicroAmp
チューブ中で混和した。この反応溶液をパーキンエルマ
ー社製の GeneAm PCRsystem Model 9600 によりＰＣＲ
法を行った。反応条件は、94℃で15秒間の変性、60℃で
15秒間のアニーリング、72℃で185秒間の伸長反応を１
サイクルとして、４０サイクル繰り返した。反応溶液に
5μlの3 M酢酸ナトリウム(pH 7.4)と100μlのエタノー
ルを添加後、氷上に10分間静置し、4℃にて13,000xgで1
0分間遠心した。沈殿を150μlの70%エタノールで洗浄
後、4℃にて13,000xgで5分間遠心した。沈殿を10分間乾
燥した後、50μlの精製水又はＴＥ(10 mM Tris-HCl pH
8.0, 1 mM EDTA）に溶解した。
トとし、Ｌ１及びＨ１（各プライマーの塩基配列は表４
〜表６に記載した。）をプライマーとして使用した。反
応溶液の組成は次の通りである。1μlの全ＤＮＡ（10 n
g/μl）、5μlのＬ１（10μM）、5μlのＨ１（10μ
M）、4μlの2.5 mM dNTP、0.25μlの5 units/μl Taq
ＤＮＡポリメラーゼ、5μlの10x PCR緩衝液（100 mM Tr
is-HCl pH8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2）に29.75μl
の精製水を加えて全量を50μlとして 0.2-ml MicroAmp
チューブ中で混和した。この反応溶液をパーキンエルマ
ー社製の GeneAm PCRsystem Model 9600 によりＰＣＲ
法を行った。反応条件は、94℃で15秒間の変性、60℃で
15秒間のアニーリング、72℃で185秒間の伸長反応を１
サイクルとして、４０サイクル繰り返した。反応溶液に
5μlの3 M酢酸ナトリウム(pH 7.4)と100μlのエタノー
ルを添加後、氷上に10分間静置し、4℃にて13,000xgで1
0分間遠心した。沈殿を150μlの70%エタノールで洗浄
後、4℃にて13,000xgで5分間遠心した。沈殿を10分間乾
燥した後、50μlの精製水又はＴＥ(10 mM Tris-HCl pH
8.0, 1 mM EDTA）に溶解した。
【００２９】二度目のＰＣＲ法は上記した一度目のＰＣ
Ｒ産物をテンプレートとし、ＦＬ２及びＨ２（ＦＬ２プ
ライマーの塩基配列は表７〜表１０に記載した。）をプ
ライマーとして使用した。反応溶液の組成は次の通りで
ある。0.4μlの一度目のＰＣＲ産物溶液、5μlのＦＬ２
（0.04μM）、5μlのＨ２（4μM）、0.16μlの2.5 mMdN
TP、0.1μlの5 units/μl Taq ＤＮＡポリメラーゼ、2
μlの10x PCR緩衝液に7.34μlの精製水を加えて全量を2
0μlとして 0.2-ml MicroAmp チューブ中で混和した。
ＰＣＲ法の反応条件は一度目のＰＣＲ法のものと同様な
ので記載を省略する。反応溶液に1.5μlの3 M酢酸ナト
リウム(pH7.4)と30μlのエタノールを添加後、氷上に10
分間静置し、4℃にて13,000xgで10分間遠心した。沈殿
を45μlの70%エタノールで洗浄後、4℃にて13,000xgで5
分間遠心した。沈殿を10分間乾燥した後、10μlの精製
水に溶解した。
Ｒ産物をテンプレートとし、ＦＬ２及びＨ２（ＦＬ２プ
ライマーの塩基配列は表７〜表１０に記載した。）をプ
ライマーとして使用した。反応溶液の組成は次の通りで
ある。0.4μlの一度目のＰＣＲ産物溶液、5μlのＦＬ２
（0.04μM）、5μlのＨ２（4μM）、0.16μlの2.5 mMdN
TP、0.1μlの5 units/μl Taq ＤＮＡポリメラーゼ、2
μlの10x PCR緩衝液に7.34μlの精製水を加えて全量を2
0μlとして 0.2-ml MicroAmp チューブ中で混和した。
ＰＣＲ法の反応条件は一度目のＰＣＲ法のものと同様な
ので記載を省略する。反応溶液に1.5μlの3 M酢酸ナト
リウム(pH7.4)と30μlのエタノールを添加後、氷上に10
分間静置し、4℃にて13,000xgで10分間遠心した。沈殿
を45μlの70%エタノールで洗浄後、4℃にて13,000xgで5
分間遠心した。沈殿を10分間乾燥した後、10μlの精製
水に溶解した。
【００３０】ケミカルロボットによるシークエンス反応
は、Molecular Biology LabStationCatalyst 800（アプ
ライドバイオシステム社）を用いて次のようにして行っ
た。反応溶液としてアデニン又はシトシンの位置確認用
には、2μlのＡ mix[375μM ddATP(ダイデオキシアデノ
シン３リン酸), 15.6μM dATP, 62.5μM dCTP, 93.8μM
c7dGTP(7-デアザ-2'-デオキシグアノシン 5'-３リン
酸), 62.5μM dTTP, 0.1 pmol/μl JOE染色プライマー,
100 mM Tris-HCl pH 8.9, 25 mM (NH4)2SO4,6.3 mM Mg
Cl2, 0.18 units/μl AmpliTaq DNA ポリメラーゼ]また
は、2μlのＣmix[187.5μM ddCTP, 62.5μM dATP, 15.6
μM dCTP, 93.8 μM c7dGTP, 62.5μMdTTP, 0.1 pmol/
μl FAM染色プライマー, 100 mM Tris-HCl pH 8.9, 25
mM (NH 4)2SO4, 6.3 mM MgCl2, 0.18 units/μl AmpliTa
q DNA ポリメラーゼ]に0.6μlの二度目のＰＣＲ溶液を
添加した。また、グアニン又はチミンの位置確認用に
は、4μlのＧ mix[31.3μM ddGTP, 62.5μM dATP, 62.5
μM dCTP, 23.5μM c7dGTP, 62.5μM dTTP, 0.1 pmol/
μl TAMRA染色プライマー, 100 mM Tris-HCl pH 8.9, 2
5 mM (NH4)2SO4, 6.3 mM MgCl2, 0.18 units/μl Ampli
Taq DNA ポリメラーゼ]または、4μlのＴ mix[312.5μM
ddTTP, 62.5μM dATP, 62.5μM dCTP, 93.8μM c7dGT
P, 15.6μM dTTP, 0.1 pmol/μl ROX染色プライマー, 1
00 mM Tris-HCl pH 8.9, 25mM (NH4)2SO4, 6.3mM MgC
l2, 0.18 units/μl AmpliTaq DNA ポリメラーゼ]に1.2
μlの二度目のＰＣＲ溶液を添加した。シークエンス反
応条件は、３ステップ反応（96℃で20秒間の変性、60℃
で20秒間のアニーリング、70℃で30秒間の伸長反応）を
２５サイクル繰り返した後、さらに２ステップ反応（96
℃で10秒間の変性、70℃で60秒間の伸長反応）を１５サ
イクル繰り返した。各反応溶液に4.5μlの3 M酢酸ナト
リウム(pH 5.2)と150μlのエタノールを添加後、氷上に
10分間静置し、4℃にて13,000xgで15分間遠心した。沈
殿を150μlのエタノールで洗浄後、4℃にて13,000xgで5
分間遠心した。沈殿を10分間乾燥した後、5μlの電気泳
動用溶液（脱イオン処理済ホルムアルデヒドと30 mg/ml
のBlue dextran 2000（ファルマシア社）含有50 mM EDT
A pH 8.0を５対１の割合で混合した溶液）に溶解し、90
℃で2分間の変性処理後、氷上に静置したものを Model
373A（アプライドバイオシステムズ社）を使用して電気
泳動処理した。
は、Molecular Biology LabStationCatalyst 800（アプ
ライドバイオシステム社）を用いて次のようにして行っ
た。反応溶液としてアデニン又はシトシンの位置確認用
には、2μlのＡ mix[375μM ddATP(ダイデオキシアデノ
シン３リン酸), 15.6μM dATP, 62.5μM dCTP, 93.8μM
c7dGTP(7-デアザ-2'-デオキシグアノシン 5'-３リン
酸), 62.5μM dTTP, 0.1 pmol/μl JOE染色プライマー,
100 mM Tris-HCl pH 8.9, 25 mM (NH4)2SO4,6.3 mM Mg
Cl2, 0.18 units/μl AmpliTaq DNA ポリメラーゼ]また
は、2μlのＣmix[187.5μM ddCTP, 62.5μM dATP, 15.6
μM dCTP, 93.8 μM c7dGTP, 62.5μMdTTP, 0.1 pmol/
μl FAM染色プライマー, 100 mM Tris-HCl pH 8.9, 25
mM (NH 4)2SO4, 6.3 mM MgCl2, 0.18 units/μl AmpliTa
q DNA ポリメラーゼ]に0.6μlの二度目のＰＣＲ溶液を
添加した。また、グアニン又はチミンの位置確認用に
は、4μlのＧ mix[31.3μM ddGTP, 62.5μM dATP, 62.5
μM dCTP, 23.5μM c7dGTP, 62.5μM dTTP, 0.1 pmol/
μl TAMRA染色プライマー, 100 mM Tris-HCl pH 8.9, 2
5 mM (NH4)2SO4, 6.3 mM MgCl2, 0.18 units/μl Ampli
Taq DNA ポリメラーゼ]または、4μlのＴ mix[312.5μM
ddTTP, 62.5μM dATP, 62.5μM dCTP, 93.8μM c7dGT
P, 15.6μM dTTP, 0.1 pmol/μl ROX染色プライマー, 1
00 mM Tris-HCl pH 8.9, 25mM (NH4)2SO4, 6.3mM MgC
l2, 0.18 units/μl AmpliTaq DNA ポリメラーゼ]に1.2
μlの二度目のＰＣＲ溶液を添加した。シークエンス反
応条件は、３ステップ反応（96℃で20秒間の変性、60℃
で20秒間のアニーリング、70℃で30秒間の伸長反応）を
２５サイクル繰り返した後、さらに２ステップ反応（96
℃で10秒間の変性、70℃で60秒間の伸長反応）を１５サ
イクル繰り返した。各反応溶液に4.5μlの3 M酢酸ナト
リウム(pH 5.2)と150μlのエタノールを添加後、氷上に
10分間静置し、4℃にて13,000xgで15分間遠心した。沈
殿を150μlのエタノールで洗浄後、4℃にて13,000xgで5
分間遠心した。沈殿を10分間乾燥した後、5μlの電気泳
動用溶液（脱イオン処理済ホルムアルデヒドと30 mg/ml
のBlue dextran 2000（ファルマシア社）含有50 mM EDT
A pH 8.0を５対１の割合で混合した溶液）に溶解し、90
℃で2分間の変性処理後、氷上に静置したものを Model
373A（アプライドバイオシステムズ社）を使用して電気
泳動処理した。
【００３１】実施例３：百寿者及び患者の塩基配列の解
析 実施例２に記載の方法により、ｍｔＤＮＡの塩基配列を
決定した後、その塩基配列の解析を行った。表１１に
は、確認された１４ヶ所の塩基置換を二つのグループに
分けて示した。
析 実施例２に記載の方法により、ｍｔＤＮＡの塩基配列を
決定した後、その塩基配列の解析を行った。表１１に
は、確認された１４ヶ所の塩基置換を二つのグループに
分けて示した。
【００３２】
【表１１】
【００３３】１４ヶ所の塩基置換のうちグループＩに属
する９ヶ所（８７０１，１０３９８，９５４０，１０４
００，１０８７３，１２７０５，１４７８３，１５０４
３，１５３０１位）のものは、百寿者に多く確認されて
いる（１１例中８例以上）。しかしながら、この塩基置
換は患者中にも比較的多く確認されていることから（２
４例以上）、グループＩに示す位置の塩基置換と成人病
との関連性は高くないと考えられた。
する９ヶ所（８７０１，１０３９８，９５４０，１０４
００，１０８７３，１２７０５，１４７８３，１５０４
３，１５３０１位）のものは、百寿者に多く確認されて
いる（１１例中８例以上）。しかしながら、この塩基置
換は患者中にも比較的多く確認されていることから（２
４例以上）、グループＩに示す位置の塩基置換と成人病
との関連性は高くないと考えられた。
【００３４】一方、グループＩＩに属する５ヶ所（５１
７８，８４１４，４８８３，１４６６８，３０１０位）
の塩基置換は、百寿者に多く確認されている（１１例中
６例以上）が、このグループＩＩに属する塩基置換は患
者群の中にはそれほど多くの例数が見られなかった（４
２〜４３例中、１０〜１２例）。表１２には、グループ
ＩＩの５ヶ所の塩基置換が、各百寿者に確認された様子
を示した。
７８，８４１４，４８８３，１４６６８，３０１０位）
の塩基置換は、百寿者に多く確認されている（１１例中
６例以上）が、このグループＩＩに属する塩基置換は患
者群の中にはそれほど多くの例数が見られなかった（４
２〜４３例中、１０〜１２例）。表１２には、グループ
ＩＩの５ヶ所の塩基置換が、各百寿者に確認された様子
を示した。
【００３５】
【表１２】
【００３６】この表から明らかなように、グループＩＩ
の５ヶ所の塩基置換は連鎖していることが多く、日本人
集団の中でこれらの塩基置換を有するｍｔＤＮＡを持っ
ていた祖先に由来する系統の人と、これらの塩基置換を
持っていなかった祖先に由来する系統の人との２群に、
日本人集団を大別することができることを示している。
また、これらのデータは、グループＩＩの一連の塩基置
換を有するｍｔＤＮＡを細胞内に持つ人が、百寿者とし
て生存する可能性の高いことを示唆するものである。
の５ヶ所の塩基置換は連鎖していることが多く、日本人
集団の中でこれらの塩基置換を有するｍｔＤＮＡを持っ
ていた祖先に由来する系統の人と、これらの塩基置換を
持っていなかった祖先に由来する系統の人との２群に、
日本人集団を大別することができることを示している。
また、これらのデータは、グループＩＩの一連の塩基置
換を有するｍｔＤＮＡを細胞内に持つ人が、百寿者とし
て生存する可能性の高いことを示唆するものである。
【００３７】実施例４：制限酵素断片長多型（以下、Ｒ
ＦＬＰ（restriction fragment length polymorphism
を省略したもの）と記載する。）によるｍｔＤＮＡのグ
ループ分け さらに多くの百寿者について、上記したグループＩＩの
ｍｔＤＮＡを持つ人と、そうでないｍｔＤＮＡを持つ人
との割合を確認するために、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法による
グルーピングを行った。実施例２に示すように、各人の
ｍｔＤＮＡの塩基配列を確認すれば、何れのグループの
ｍｔＤＮＡを有するかは明らかとなるが、多数のサンプ
ルを処理するためには、より簡易かつ迅速な検査方法が
要求される。そこで、本発明者はグループＩＩに属する
５ヶ所の塩基置換のうち、５１７８位の塩基置換（野生
型Ｃ→置換型Ａ）に注目してＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を開発
した。これは、グループＩＩの５ヶ所の塩基置換が連鎖
していること、及び、５１７８位は野生型において制限
酵素ＡｌｕＩの認識部位となっていることとに基づくも
のである。
ＦＬＰ（restriction fragment length polymorphism
を省略したもの）と記載する。）によるｍｔＤＮＡのグ
ループ分け さらに多くの百寿者について、上記したグループＩＩの
ｍｔＤＮＡを持つ人と、そうでないｍｔＤＮＡを持つ人
との割合を確認するために、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法による
グルーピングを行った。実施例２に示すように、各人の
ｍｔＤＮＡの塩基配列を確認すれば、何れのグループの
ｍｔＤＮＡを有するかは明らかとなるが、多数のサンプ
ルを処理するためには、より簡易かつ迅速な検査方法が
要求される。そこで、本発明者はグループＩＩに属する
５ヶ所の塩基置換のうち、５１７８位の塩基置換（野生
型Ｃ→置換型Ａ）に注目してＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を開発
した。これは、グループＩＩの５ヶ所の塩基置換が連鎖
していること、及び、５１７８位は野生型において制限
酵素ＡｌｕＩの認識部位となっていることとに基づくも
のである。
【００３８】百寿者２６名から採血し、この血液から既
述の方法により全ＤＮＡを抽出した。次に、この全ＤＮ
Ａサンプルを用いて、配列表の配列番号：１及び配列番
号：２に示すＤＮＡをプライマーとして、５１７８位を
含む領域をＰＣＲ法により増幅した。配列番号：１に示
す塩基配列はｍｔＤＮＡの４９４９位から４９６８位ま
でのものであり、配列番号：２に示す塩基配列はｍｔＤ
ＮＡの５３６５位から５３４６位までのものである。こ
の２つの合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行
うことにより、ｍｔＤＮＡの４９４９位から５３６５位
までの４１７塩基対のＤＮＡ産物が合成される。
述の方法により全ＤＮＡを抽出した。次に、この全ＤＮ
Ａサンプルを用いて、配列表の配列番号：１及び配列番
号：２に示すＤＮＡをプライマーとして、５１７８位を
含む領域をＰＣＲ法により増幅した。配列番号：１に示
す塩基配列はｍｔＤＮＡの４９４９位から４９６８位ま
でのものであり、配列番号：２に示す塩基配列はｍｔＤ
ＮＡの５３６５位から５３４６位までのものである。こ
の２つの合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行
うことにより、ｍｔＤＮＡの４９４９位から５３６５位
までの４１７塩基対のＤＮＡ産物が合成される。
【００３９】このＤＮＡ産物中にＡｌｕＩの認識部位
は、４９９２位と５１７８位との二ヶ所にあり得る。こ
のうち、４９９２位の認識部位は全てのｍｔＤＮＡに存
在し、５１７８位の認識部位は野生型のｍｔＤＮＡにの
み存在する。このため、ＰＣＲ法によるＤＮＡ産物をＡ
ｌｕＩにより処理したときに、野生型のｍｔＤＮＡでは
１８６及び１８８塩基対（４９９２位から５３６５位ま
での３７４塩基対が５１７８位で切断される）と４３塩
基対との二つのバンドが確認される。また、置換型のｍ
ｔＤＮＡでは３７４塩基対と４３塩基対との二つのバン
ドが見られることになる。
は、４９９２位と５１７８位との二ヶ所にあり得る。こ
のうち、４９９２位の認識部位は全てのｍｔＤＮＡに存
在し、５１７８位の認識部位は野生型のｍｔＤＮＡにの
み存在する。このため、ＰＣＲ法によるＤＮＡ産物をＡ
ｌｕＩにより処理したときに、野生型のｍｔＤＮＡでは
１８６及び１８８塩基対（４９９２位から５３６５位ま
での３７４塩基対が５１７８位で切断される）と４３塩
基対との二つのバンドが確認される。また、置換型のｍ
ｔＤＮＡでは３７４塩基対と４３塩基対との二つのバン
ドが見られることになる。
【００４０】ＰＣＲ法に使用した溶液組成は、次の通り
である。1μlの全ＤＮＡ、5μlの配列番号：１（10μ
M）、5μlの配列番号：２（10μM）、4μlの2.5 mM dNT
P、0.25μlの5 units/μl Taq ＤＮＡポリメラーゼ、5
μlの10xPCR緩衝液（100 mM Tris-HCl pH8.3, 500 mM K
Cl, 15 mM MgCl2）に29.75μlの精製水を加えて全量を5
0μlとして 0.2-ml MicroAmp チューブ中で混和した。
反応条件は、94℃で30秒間の変性、51℃で30秒間のアニ
ーリング、72℃で90秒間の伸長反応を１サイクルとし
て、３０サイクル繰り返した。さらに、その後に72℃で
10分間の伸長反応を行った。
である。1μlの全ＤＮＡ、5μlの配列番号：１（10μ
M）、5μlの配列番号：２（10μM）、4μlの2.5 mM dNT
P、0.25μlの5 units/μl Taq ＤＮＡポリメラーゼ、5
μlの10xPCR緩衝液（100 mM Tris-HCl pH8.3, 500 mM K
Cl, 15 mM MgCl2）に29.75μlの精製水を加えて全量を5
0μlとして 0.2-ml MicroAmp チューブ中で混和した。
反応条件は、94℃で30秒間の変性、51℃で30秒間のアニ
ーリング、72℃で90秒間の伸長反応を１サイクルとし
て、３０サイクル繰り返した。さらに、その後に72℃で
10分間の伸長反応を行った。
【００４１】次に、ＰＣＲ溶液をＡｌｕＩにて処理し
た。ＡｌｕＩ反応の詳細は、次の通りである。反応溶液
の組成は、10μlのＰＣＲ溶液、1μlのＡｌｕＩ（宝酒
造株式会社製）、2μlの10x Ｔ緩衝液（ＡｌｕＩに添
付）、2μlの10x BSA溶液（ＡｌｕＩに添付）に5μlの
精製水を加えて全量を20μlである。この反応溶液を37
℃にて３時間反応させた後、アガロースゲル電気泳動に
より、そのパターンを確認した。
た。ＡｌｕＩ反応の詳細は、次の通りである。反応溶液
の組成は、10μlのＰＣＲ溶液、1μlのＡｌｕＩ（宝酒
造株式会社製）、2μlの10x Ｔ緩衝液（ＡｌｕＩに添
付）、2μlの10x BSA溶液（ＡｌｕＩに添付）に5μlの
精製水を加えて全量を20μlである。この反応溶液を37
℃にて３時間反応させた後、アガロースゲル電気泳動に
より、そのパターンを確認した。
【００４２】図３には、電気泳動後のパターンの一例を
示した。この図において、上側のバンド（３７４ｂｐ）
はＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡがＡｌｕＩにより切
断されなかったものであり、５１７８位がＡ（アデニ
ン）であることを示し、これは上記したグループＩＩの
ｍｔＤＮＡのタイプであることを示唆している。以下に
おいては、このグループを「グループＡ」と記載する。
また、下側のバンド（１８６及び１８８ｂｐ）はＰＣＲ
法による増幅ＤＮＡがＡｌｕＩにより切断されたもので
あり、５１７８位がＣ（シトシン）であることを示して
いる。以降では、このグループを「グループＣ」と記載
する。
示した。この図において、上側のバンド（３７４ｂｐ）
はＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡがＡｌｕＩにより切
断されなかったものであり、５１７８位がＡ（アデニ
ン）であることを示し、これは上記したグループＩＩの
ｍｔＤＮＡのタイプであることを示唆している。以下に
おいては、このグループを「グループＡ」と記載する。
また、下側のバンド（１８６及び１８８ｂｐ）はＰＣＲ
法による増幅ＤＮＡがＡｌｕＩにより切断されたもので
あり、５１７８位がＣ（シトシン）であることを示して
いる。以降では、このグループを「グループＣ」と記載
する。
【００４３】次に、表１３にはＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によ
りグループ分けした２６例の百寿者と、前記したＤＮＡ
シークエンスにより５１７８位の塩基を確認した１１例
の百寿者とについてのグループ分けの結果を併せまとめ
た。この結果より、３７例の百寿者のうち、２３例（６
２．２％）がグループＡに属することが判明した。一
方、本発明者は、健常人の血液サンプルに基づき、グル
ープＣとグループＡとの割合を確認した。その結果、健
常人のｍｔＤＮＡのグループ比は、グループＣ（野生
型）：グループＡ（置換型）＝５５：４５であった。
りグループ分けした２６例の百寿者と、前記したＤＮＡ
シークエンスにより５１７８位の塩基を確認した１１例
の百寿者とについてのグループ分けの結果を併せまとめ
た。この結果より、３７例の百寿者のうち、２３例（６
２．２％）がグループＡに属することが判明した。一
方、本発明者は、健常人の血液サンプルに基づき、グル
ープＣとグループＡとの割合を確認した。その結果、健
常人のｍｔＤＮＡのグループ比は、グループＣ（野生
型）：グループＡ（置換型）＝５５：４５であった。
【００４４】
【表１３】
【００４５】実施例５：患者群の年齢別グループ分け試
験 次に、病院に来院した患者群について、年齢別にグルー
プＡまたはＣに関してグループ分けを行った。来院した
患者の血液サンプルから、既述の方法により全ＤＮＡを
抽出し、ＡｌｕＩを用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によりグ
ループ分けをした。図４は、患者の年齢とグループＡま
たはＣの計数をプロットしたものである。この図より明
らかなように、年齢が４５歳を越えるまではグループＡ
とグループＣとの比率はほぼ１：１で推移している。し
かし、年齢が４５歳を越えると、グループＣはグループ
Ａに比べてほぼ二倍の割合で増加している。一般に年齢
が４５歳を越えると、高血圧・糖尿病・心臓病・ガン等
のいわゆる成人病に罹患する割合が増加してくる。実施
例４に記載したように、一般人のｍｔＤＮＡのタイプ
は、グループＣとグループＡとでは、ほぼ１：１程度で
ある。これと本図の結果とを合わせると、グループＣと
グループＡとにおいて、成人病に罹患する人の割合は、
グループＣがグループＡに比べて二倍の高率であること
を示している。
験 次に、病院に来院した患者群について、年齢別にグルー
プＡまたはＣに関してグループ分けを行った。来院した
患者の血液サンプルから、既述の方法により全ＤＮＡを
抽出し、ＡｌｕＩを用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によりグ
ループ分けをした。図４は、患者の年齢とグループＡま
たはＣの計数をプロットしたものである。この図より明
らかなように、年齢が４５歳を越えるまではグループＡ
とグループＣとの比率はほぼ１：１で推移している。し
かし、年齢が４５歳を越えると、グループＣはグループ
Ａに比べてほぼ二倍の割合で増加している。一般に年齢
が４５歳を越えると、高血圧・糖尿病・心臓病・ガン等
のいわゆる成人病に罹患する割合が増加してくる。実施
例４に記載したように、一般人のｍｔＤＮＡのタイプ
は、グループＣとグループＡとでは、ほぼ１：１程度で
ある。これと本図の結果とを合わせると、グループＣと
グループＡとにおいて、成人病に罹患する人の割合は、
グループＣがグループＡに比べて二倍の高率であること
を示している。
【００４６】このことから、４５歳よりも前に、各人の
ｍｔＤＮＡのタイプがグループＡまたはグループＣのい
ずれに属するかを同定しておくことにより、成人病に罹
りやすいか否かを予め知ることができる。これにより、
グループＣに属する人は、通常の生活態度によく注意を
払うことで成人病の予防に資し、もって国民生活の向上
と医療費の軽減化等に寄与することができる。
ｍｔＤＮＡのタイプがグループＡまたはグループＣのい
ずれに属するかを同定しておくことにより、成人病に罹
りやすいか否かを予め知ることができる。これにより、
グループＣに属する人は、通常の生活態度によく注意を
払うことで成人病の予防に資し、もって国民生活の向上
と医療費の軽減化等に寄与することができる。
【００４７】実施例６：ｍｔＤＮＡのグループ分けのた
めの試験方法 実施例４に示したように、５１７８位の塩基置換に基づ
いたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によりグループＡまたはグルー
プＣの分類を行うことができる。しかしながら、多数の
検体を処理するためには、より迅速かつ簡便な各種の方
法が期待される。このため、グループ分けのためのその
他の診断方法を検討・確立した。
めの試験方法 実施例４に示したように、５１７８位の塩基置換に基づ
いたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によりグループＡまたはグルー
プＣの分類を行うことができる。しかしながら、多数の
検体を処理するためには、より迅速かつ簡便な各種の方
法が期待される。このため、グループ分けのためのその
他の診断方法を検討・確立した。
【００４８】以下には、ＴａｑＭａｎ（アプライドバイ
オシステムズ社登録商標）法と呼ばれるＰＣＲ法を応用
した診断方法について記載する。ＴａｑＭａｎ法の原理
は、図５に示す通りである。図５には、グループＣのｍ
ｔＤＮＡを持つものが、図示Ｔの蛍光色素に特有の蛍光
を発することを示している。なお、図示はしないが、グ
ループＡのｍｔＤＮＡを持つものでは、同様の反応様式
を示して、図示Ｆの蛍光色素に特有の蛍光を発すること
で区別される。この方法ではＰＣＲ法に用いる二つのプ
ライマーＤＮＡの他に、二種類のプローブ用ＤＮＡが使
用される。プローブ用ＤＮＡは増幅されるＤＮＡの塩基
配列の一部分に相補的な塩基配列を有しており、その部
分にアニールすることができる。また、プローブ用ＤＮ
Ａの５’末端には蛍光色素であるリポーター（図示Ｔま
たはＦ）が共有結合される一方、３’末端には消光剤で
あるクエンチャー（図示Ｑ）が共有結合されている。プ
ローブ用ＤＮＡが分解されずに、そのままの形で存在す
る場合には、蛍光色素が発する蛍光は同一分子内の消光
剤により消光作用を受ける。ところが、プローブ用ＤＮ
Ａに相補的な塩基配列が存在する場合には、そこにアニ
ールした後、ＰＣＲ法による伸長反応の途中にプローブ
用ＤＮＡの５’末端の蛍光色素がＴａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼが持つ５’−３’ヌクレアーゼ活性により分解反
応を受け、溶液中に解離される。このように解離された
蛍光色素は、もはや消光剤の影響を受け難いため、特有
の蛍光を発する。
オシステムズ社登録商標）法と呼ばれるＰＣＲ法を応用
した診断方法について記載する。ＴａｑＭａｎ法の原理
は、図５に示す通りである。図５には、グループＣのｍ
ｔＤＮＡを持つものが、図示Ｔの蛍光色素に特有の蛍光
を発することを示している。なお、図示はしないが、グ
ループＡのｍｔＤＮＡを持つものでは、同様の反応様式
を示して、図示Ｆの蛍光色素に特有の蛍光を発すること
で区別される。この方法ではＰＣＲ法に用いる二つのプ
ライマーＤＮＡの他に、二種類のプローブ用ＤＮＡが使
用される。プローブ用ＤＮＡは増幅されるＤＮＡの塩基
配列の一部分に相補的な塩基配列を有しており、その部
分にアニールすることができる。また、プローブ用ＤＮ
Ａの５’末端には蛍光色素であるリポーター（図示Ｔま
たはＦ）が共有結合される一方、３’末端には消光剤で
あるクエンチャー（図示Ｑ）が共有結合されている。プ
ローブ用ＤＮＡが分解されずに、そのままの形で存在す
る場合には、蛍光色素が発する蛍光は同一分子内の消光
剤により消光作用を受ける。ところが、プローブ用ＤＮ
Ａに相補的な塩基配列が存在する場合には、そこにアニ
ールした後、ＰＣＲ法による伸長反応の途中にプローブ
用ＤＮＡの５’末端の蛍光色素がＴａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼが持つ５’−３’ヌクレアーゼ活性により分解反
応を受け、溶液中に解離される。このように解離された
蛍光色素は、もはや消光剤の影響を受け難いため、特有
の蛍光を発する。
【００４９】プライマーＤＮＡとして配列番号：３及び
配列番号：４のものを使用する。このものは、それぞれ
ｍｔＤＮＡの５１３１位から５１４９位までの塩基配列
のもの（配列番号：３、以下「５１７８−Ｆ」と記載す
る。）と、５３６９位から５３４９位までの塩基配列の
もの（配列番号：４、以下「５１７８−Ｒ」と記載す
る。）とである。
配列番号：４のものを使用する。このものは、それぞれ
ｍｔＤＮＡの５１３１位から５１４９位までの塩基配列
のもの（配列番号：３、以下「５１７８−Ｆ」と記載す
る。）と、５３６９位から５３４９位までの塩基配列の
もの（配列番号：４、以下「５１７８−Ｒ」と記載す
る。）とである。
【００５０】また、プローブ用ＤＮＡとして配列番号：
５及び配列番号：６に示す二種類のものを作成した。配
列番号：５のものは、ｍｔＤＮＡの５１６５位から５１
９２位までの塩基配列を有し、５１７８位がアデニン
（Ａ）となっている（以下、このプローブ用ＤＮＡを
「５１７８−Ａ」と記載する。）。一方、配列番号：６
のものは、ｍｔＤＮＡの５１６５位から５１９１位まで
の塩基配列を有し、５１７８位がシトシン（Ｃ）となっ
ている（以下、このプローブ用ＤＮＡを「５１７８−
Ｃ」と記載する。）。また、プローブ用ＤＮＡ５１７８
−Ａの５’末端には蛍光色素としてＦＡＭ（６−カルボ
キシフルオレセイン）が結合され、プローブ用ＤＮＡ５
１７８−Ｃの５’末端には蛍光色素としてＴＥＴ（６−
カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオ
レセイン）が結合される。なお、消光剤としては、両方
のプローブ用ＤＮＡともに、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキ
シ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルローダミン）が
使用される。ＦＡＭ、ＴＥＴ及びＴＡＭＲＡは、すべて
４８８ｎｍの波長で励起させ、それぞれ５１８、５３８
及び５８２ｎｍの波長で蛍光強度を観測し、蛍光強度比
を採ることにより、グループＣまたはＡの分類を行うこ
とができる。
５及び配列番号：６に示す二種類のものを作成した。配
列番号：５のものは、ｍｔＤＮＡの５１６５位から５１
９２位までの塩基配列を有し、５１７８位がアデニン
（Ａ）となっている（以下、このプローブ用ＤＮＡを
「５１７８−Ａ」と記載する。）。一方、配列番号：６
のものは、ｍｔＤＮＡの５１６５位から５１９１位まで
の塩基配列を有し、５１７８位がシトシン（Ｃ）となっ
ている（以下、このプローブ用ＤＮＡを「５１７８−
Ｃ」と記載する。）。また、プローブ用ＤＮＡ５１７８
−Ａの５’末端には蛍光色素としてＦＡＭ（６−カルボ
キシフルオレセイン）が結合され、プローブ用ＤＮＡ５
１７８−Ｃの５’末端には蛍光色素としてＴＥＴ（６−
カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオ
レセイン）が結合される。なお、消光剤としては、両方
のプローブ用ＤＮＡともに、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキ
シ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルローダミン）が
使用される。ＦＡＭ、ＴＥＴ及びＴＡＭＲＡは、すべて
４８８ｎｍの波長で励起させ、それぞれ５１８、５３８
及び５８２ｎｍの波長で蛍光強度を観測し、蛍光強度比
を採ることにより、グループＣまたはＡの分類を行うこ
とができる。
【００５１】ＰＣＲ法に使用した溶液組成は、次の通り
である。まず、114μlの10x TaqMan緩衝液（TaqManシス
テムに添付のもの）、287.5μlの25 mM MgCl2、29μlの
10mM dATP、29μlの10 mM dCTP、29μlの10 mM dGTP、2
9μlの20 mM dUTP、14.5μlの5 U/μl AmpliTaq Gold D
NA Polymerase に590μlの精製水を加えて1152μlとし
たものをマスターミックスとした。次に、8μlのマスタ
ーミックス、0.25μlの8μM ５１７８−Ｆプライマー、
0.25μlの8μM ５１７８−Ｒプライマー、0.25μlの4μ
M ５１７８−Ａプローブ、0.25μlの4μM ５１７８−Ｃ
プローブに 1μl の全ＤＮＡ（前記した方法により、血
液から調製したもの。）を加えて全量を10μlとして ９
６穴プレート内にて反応させた。反応条件は、95℃で10
分間反応させた後、３ステップサイクル（95℃で15秒間
の変性、56℃で5秒間のアニーリング、62℃で60秒間の
伸長反応を１サイクルとした。）を５０サイクル繰り返
した。
である。まず、114μlの10x TaqMan緩衝液（TaqManシス
テムに添付のもの）、287.5μlの25 mM MgCl2、29μlの
10mM dATP、29μlの10 mM dCTP、29μlの10 mM dGTP、2
9μlの20 mM dUTP、14.5μlの5 U/μl AmpliTaq Gold D
NA Polymerase に590μlの精製水を加えて1152μlとし
たものをマスターミックスとした。次に、8μlのマスタ
ーミックス、0.25μlの8μM ５１７８−Ｆプライマー、
0.25μlの8μM ５１７８−Ｒプライマー、0.25μlの4μ
M ５１７８−Ａプローブ、0.25μlの4μM ５１７８−Ｃ
プローブに 1μl の全ＤＮＡ（前記した方法により、血
液から調製したもの。）を加えて全量を10μlとして ９
６穴プレート内にて反応させた。反応条件は、95℃で10
分間反応させた後、３ステップサイクル（95℃で15秒間
の変性、56℃で5秒間のアニーリング、62℃で60秒間の
伸長反応を１サイクルとした。）を５０サイクル繰り返
した。
【００５２】ＰＣＲ反応の後、９６穴プレートをPrism
7200 シークエンスディテクター（アプライドバイオシ
ステムズ社）により、５１８，５３８及び５８２ｎｍの
三種類の波長で蛍光強度を測定した。その結果、グルー
プＣ及びグループＡのタイプ分けを行うことができた。
7200 シークエンスディテクター（アプライドバイオシ
ステムズ社）により、５１８，５３８及び５８２ｎｍの
三種類の波長で蛍光強度を測定した。その結果、グルー
プＣ及びグループＡのタイプ分けを行うことができた。
【００５３】
【発明の効果】このように本発明によれば、ｍｔＤＮＡ
中の５ヶ所（３０１０位、４８８３位、５１７８位、８
４１４位、または、１４６６８位）の塩基置換のいずれ
かを確認することにより、その人が成人病に罹患する確
率が高いかどうかを予め診断しておくことができる。こ
れにより、生活態度を良好に維持するように努めれば、
成人病への罹患率を減少させる可能性が高く、健康な高
齢者として生活できる。さらに、このようにすれば、医
療費の増加傾向に歯止めをかけることが可能となり得
る。
中の５ヶ所（３０１０位、４８８３位、５１７８位、８
４１４位、または、１４６６８位）の塩基置換のいずれ
かを確認することにより、その人が成人病に罹患する確
率が高いかどうかを予め診断しておくことができる。こ
れにより、生活態度を良好に維持するように努めれば、
成人病への罹患率を減少させる可能性が高く、健康な高
齢者として生活できる。さらに、このようにすれば、医
療費の増加傾向に歯止めをかけることが可能となり得
る。
【００５４】また、このような遺伝子診断方法を一般の
健康診断に組み込めば、国民生活にとって、有効な情報
を提供することができる。
健康診断に組み込めば、国民生活にとって、有効な情報
を提供することができる。
【００５５】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ATCCATCATA GCAGGCAGTT
【００５６】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GAGTAGATTA GGCGTAGGTA
【００５７】配列番号：３ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TAAACTCCAG CACCACGAC
【００５８】配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGTGGAGTAG ATTAGGCGTA G
【００５９】配列番号：５ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CACCTGAAAC AAGATAACAT GACTAACA
【００６０】配列番号：６ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CACCTGAAAC AAGCTAACAT GACTAAC
【図１】ｍｔＤＮＡの遺伝子地図
【図２】ｍｔＤＮＡのシークエンス方法を示す概念図
【図３】５１７８位の塩基置換をＰＣＲ−ＲＦＬＰ法で
確認したときのゲル電気泳動結果
確認したときのゲル電気泳動結果
【図４】患者群におけるグループＡまたはグループＣの
年齢別推移図
年齢別推移図
【図５】ＴａｑＭａｎ法の原理を示す概念図
Claims (3)
- 【請求項１】 ヒトミトコンドリアＤＮＡの塩基配列の
うち、３０１０位の塩基がグアニンからアデニンに、４
８８３位の塩基がシトシンからチミンに、５１７８位の
塩基がシトシンからアデニンに、８４１４位の塩基がシ
トシンからチミンに、１４６６８位の塩基がシトシンか
らチミンに、置換されていることに基づき、前記５ヶ所
の塩基置換のうちの少なくとも１ヶ所の塩基置換を検出
することを特徴とするヒトミトコンドリアＤＮＡを用い
た遺伝子診断方法。 - 【請求項２】 前記遺伝子診断方法が、ＰＣＲ法を用い
たものであることを特徴とする請求項１記載のヒトミト
コンドリアＤＮＡを用いた遺伝子診断方法。 - 【請求項３】 前記５ヶ所の塩基置換のうち、５１７８
位の塩基がシトシンからアデニンに置換したものであ
り、前記遺伝子診断方法がＰＣＲ−ＲＦＬＰ法であり、
ＤＮＡを分解する制限酵素がＡｌｕＩであることを特徴
とする請求項１記載のヒトミトコンドリアＤＮＡを用い
た遺伝子診断方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27912797A JP3251219B2 (ja) | 1997-10-13 | 1997-10-13 | ヒトミトコンドリアｄｎａを用いた遺伝子検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27912797A JP3251219B2 (ja) | 1997-10-13 | 1997-10-13 | ヒトミトコンドリアｄｎａを用いた遺伝子検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11113597A true JPH11113597A (ja) | 1999-04-27 |
| JP3251219B2 JP3251219B2 (ja) | 2002-01-28 |
Family
ID=17606816
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27912797A Expired - Lifetime JP3251219B2 (ja) | 1997-10-13 | 1997-10-13 | ヒトミトコンドリアｄｎａを用いた遺伝子検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3251219B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005056573A1 (en) * | 2002-06-10 | 2005-06-23 | 1304854 Ontario Ltd. | Complete mitochondrial genome sequences as a diagnostic tool for the health sciences |
| US8008008B2 (en) | 2005-04-18 | 2011-08-30 | Mitomics Inc. | Mitochondrial mutations and rearrangements as a diagnostic tool for the detection of sun exposure, prostate cancer and other cancers |
| US8318686B2 (en) | 2003-05-21 | 2012-11-27 | Andes Biotechnologies S.A. | Markers for pre-cancer and cancer cells and the method to interfere with cell proliferation therein |
| US10308987B2 (en) | 2005-04-18 | 2019-06-04 | Mdna Life Sciences Inc. | 3.4 kb mitochondrial DNA deletion for use in the detection of cancer |
-
1997
- 1997-10-13 JP JP27912797A patent/JP3251219B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005056573A1 (en) * | 2002-06-10 | 2005-06-23 | 1304854 Ontario Ltd. | Complete mitochondrial genome sequences as a diagnostic tool for the health sciences |
| US8318686B2 (en) | 2003-05-21 | 2012-11-27 | Andes Biotechnologies S.A. | Markers for pre-cancer and cancer cells and the method to interfere with cell proliferation therein |
| US8895719B2 (en) | 2003-05-21 | 2014-11-25 | Andes Biotechnologies S.A. | Markers for pre-cancer and cancer cells and the method to interfere with cell proliferation therein |
| US9359648B2 (en) | 2003-05-21 | 2016-06-07 | Andes Biotechnoogies S.A. | Markers for pre-cancer and cancer cells and the method to interfere with cell proliferation therein |
| US9903000B2 (en) | 2003-05-21 | 2018-02-27 | Andes Biotechnologies Global, Inc. | Markers for pre-cancer and cancer cells and the method to interfere with cell proliferation therein |
| US10876166B2 (en) | 2003-05-21 | 2020-12-29 | Andes Biotechnologies Global, Inc. | Markers for pre-cancer and cancer cells and the method to interfere with cell proliferation therein |
| US8008008B2 (en) | 2005-04-18 | 2011-08-30 | Mitomics Inc. | Mitochondrial mutations and rearrangements as a diagnostic tool for the detection of sun exposure, prostate cancer and other cancers |
| US9745632B2 (en) | 2005-04-18 | 2017-08-29 | Mdna Life Sciences Inc. | Mitochondrial mutations and rearrangements as a diagnostic tool for the detection of sun exposure, prostate cancer and other cancers |
| US10308987B2 (en) | 2005-04-18 | 2019-06-04 | Mdna Life Sciences Inc. | 3.4 kb mitochondrial DNA deletion for use in the detection of cancer |
| US10907213B2 (en) | 2005-04-18 | 2021-02-02 | Mdna Life Sciences Inc. | Mitochondrial mutations and rearrangements as a diagnostic tool for the detection of sun exposure, prostate cancer and other cancers |
| US11111546B2 (en) | 2005-04-18 | 2021-09-07 | Mdna Life Sciences, Inc. | 3.4 KB mitochondrial DNA deletion for use in the detection of cancer |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3251219B2 (ja) | 2002-01-28 |
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