JPH1094394A

JPH1094394A - レトロウイルス

Info

Publication number: JPH1094394A
Application number: JP8271467A
Authority: JP
Inventors: Takashi Kurimura; 敬栗村; Seiji Kageyama; 誠二景山
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1996-09-20
Filing date: 1996-09-20
Publication date: 1998-04-14

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明の課題は、ＡＩＤＳの原因となる新規な
レトロウイルスとその塩基配列を提供することにある。【構成】本発明は、特定の塩基配列を含む新規なレトロ
ウイルス、その塩基配列によってコードされるたんぱく
質、そしてそれらの応用である。【効果】本発明によって、公知のＨＩＶ−１やＨＩＶ−
２サブタイプに基づく診断技術ではスクリーニングが困
難な新規なレトロウイルスが明らかにされる。本発明
は、より確実なＨＩＶのスクリーニング技術の開発と、
新しいＡＩＤＳ原因ウイルスの確定診断を可能とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なレトロウイルス
に関するものである。具体的には、後天性免疫不全症候
群患者の血液から得ることができる新たなレトロウイル
スと、このレトロウイルスの構造を決定している遺伝
子、ならびに遺伝子によってコードされるペプチドやた
んぱく質、更にはこれら遺伝子やたんぱく質の診断や治
療への応用に関する。

【０００２】

【従来技術の問題点】ＡＩＤＳ（Acquired immune defi
ciency syndorome、後天性免疫不全症候群）は、ＬＡ
Ｖ、ＨＴＬＶ−III、あるいはＡＲＶなどと名付けられ
たレトロウイルスの感染によってもたらされる伝染性疾
患であることが明らかにされた[ 1][ 2][ 3]。これらの
レトロウイルスは、その後互いにきわめてよく似た構造
を持っていることが明らかにされ、ＨＩＶ（Human Immu
nodefficiency Virus）と統一して命名された[ 4]。Ｈ
ＩＶは、レトロウイルス(retrovirus)に属するウイルス
で、その遺伝子はＲＮＡである。同じくレトロウイルス
として分離されたＨＴＬＶ等とは異なり、レンチウイル
ス(lentivirus)と呼ばれるグループに分類される。構造
的には、遺伝子の両端にＬＴＲ(Long Terminal Rpeat)
と呼ばれる調節領域を持ち、更にgag(group specific a
ntigen)、pol(polymerase)、env(envelope)、tat(trans
-actingtranscriptional activator)、trs/art(trans-r
egulator of splicing/anti-repressiontrans-activato
r)、sor(short open reading frame)、そして3'orf(3'o
penreading frame)と名付けられた構造遺伝子等で構成
されている。このうちgagやpolの遺伝子配列は保存性が
高く、envやtat等では多様な変異の起きることが報告さ
れている[ 5]。更に世界各地で幅広いサンプルから分離
した多くの株について構造を比較した結果、最初に原因
ウイルスとして分離されたＨＩＶとは異なった構造を持
つ西アフリカの患者に由来する新しいウイルスが報告さ
れた[ 6][ 7][ 8]。類似の新しいウイルスはその後も報
告され、遺伝子の配列も決定された[ 9][10]。新しいウ
イルスはＨＩＶ type ２（ＨＩＶ−２）と名付けられ、
一方最初に報告されたＨＩＶはtype １（ＨＩＶ−１）
として区別されている。

【０００３】ＨＩＶ−２は、比較的保存性が高いとされ
ているgag、およびpol領域でもＨＩＶ−１との間でアミ
ノ酸配列を比較すると６０%程度のホモロジーを示すに
過ぎない。変異の大きいenvのみならず、保存性の高い
とされているgagやpolにおいてもホモロジーが低いた
め、両者は遺伝的にも遠い関係に有ると推測された。た
だし免疫学的にみた場合は、gagやpol領域に対する両者
の抗体は交差することが確認されている[11]。一方env
においては、免疫学的にもＨＩＶ−１とは明らかに異な
った反応性を持っている。そのためＨＩＶ−１のサブタ
イプの間では共通性を持った抗原決定部位が存在し、あ
るサブタイプの抗原によって他のサブタイプに対する抗
体の検出が可能となる。他方ＨＩＶ−１の間で共通性を
持つ抗原をもってしても、ＨＩＶ−２に対する抗体の一
部（たとえば抗env抗体）は検出することはできない。
このような背景からＨＩＶに対する抗体を幅広く検出す
るために、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２に対応する合成ペプ
チドを組み合わせて抗体検出用抗原とする試みが報告さ
れている[12][13][14][15]。

【０００４】ＨＩＶ−２についても、ＨＩＶ−１と同じ
ように異なるサンプルからいろいろな株が分離され構造
の比較が行われた。現在では少なくとも５つのサブタイ
プ、すなわちＡ−Ｅが知られている[16]。これらの５つ
のサブタイプは遺伝的には明確に区別できるが、免疫学
的にはよく似た性質を持っており、いずれも商業的に供
給されている免疫学的な試験方法によって抗体を検出す
ることが可能とされている。ＨＩＶ−２のサブタイプに
共通する抗原については、いくつかの変異株に由来する
抗原の利用が公知である[17]。こうして多くのＨＩＶ関
連ウイルスが分離され、その構造的な違いや免疫学的な
特徴が解明されつつあるが、それでもなお未知の感染因
子の存在が予想されている。具体的には、ＨＩＶ−２の
サブタイプ[18][19][20]や、ＨＩＶ−３と称するＨＩＶ
−１や２の配列とはハイブリダイズしないゲノムを持つ
ウイルスに関する報告もある[21]。

【０００５】更に本発明者らは、合成ペプチドを用いた
市販のＨＩＶ−１／２抗体検出用のキットでは反応しな
い患者血漿、あるいは血清（以下、特に区別する必要の
無いときには血液試料と記載する）のあることを確認し
た。この患者血漿はインド人ＨＩＶ感染者のもので、Ｐ
ＣＲ法による遺伝子レベルでの検出結果ではＨＩＶ−１
／ＨＩＶ−２重複感染でありながら、商業的に供給され
ているＨＩＶ−２抗体検出用のキットでは陰性の結果を
与える。

【０００６】ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の間で免疫学的に
交差するgagやpolに対する抗体を指標として診断できれ
ば検出洩れの防止につながる可能性もある。しかし実際
にはこれらの領域に対する抗体が必ずしも測定可能なレ
ベルに有るとは限らないため、env領域に対する抗体を
スクリーニングの指標とすることは重要な条件となって
いる。特にブロッティング抗原を利用した抗体の検出用
キットでは、env領域に対する抗体の反応性が不十分な
場合には陽性と判定できないものが有る。また、ＨＩＶ
−１とＨＩＶ−２のどちらのウイルスに感染しているの
かを明確にするには、免疫学的に異なっているenv抗原
を利用せざるをえない。このような理由により、ＨＩＶ
−２に感染していながらenvを抗原とした市販の抗体検
出用キットで陰性と判定される感染者血液試料の存在は
重大な問題である。

【０００７】ＨＩＶ感染細胞を抗原として用いる蛍光抗
体法や粒子凝集反応法に基づくキットでは、かなり幅広
いサブタイプを十分な感度で検出することができるもの
もある。しかし感染細胞を安定した品質で大量に供給す
るには高度な技術が要求され、またコストの面でも高価
な抗原を多量に使うことになるので不利である。

【０００８】ＨＩＶ−２に対する抗体検出用の抗原につ
いては多くの報告が有るが[22][23][24][25][26]、いず
れも市販のキットで利用されているものと同じタイプＡ
のアミノ酸配列をもとにしたものである。したがって本
発明者らが確認した市販のキットでＨＩＶ−２陰性とな
る血液試料に対しては、同様の陰性結果を与えるものと
推測される。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、市販
の抗体検出用試薬では検出洩れにつながる可能性のある
未知のＡＩＤＳ原因ウイルスを明らかにし、そのウイル
スによる感染を確実に検出することができる新たな診断
技術を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列１、配列
２、配列３、配列４、配列５、および配列６で構成され
る群から選択される塩基配列、またはその断片を含み、
後天性免疫不全症候群患者血清と反応するたんぱく質を
コードするＤＮＡを提供する。配列１−６に示した塩基
配列を備えたＤＮＡは、以下のような特徴ａ）、ｂ）を
持ったＨＩＶ感染患者血漿をもとにＲＴ−ＰＣＲ法によ
り得られたものである。ａ）ＰＣＲ反応でＨＩＶ−２のＬＴＲ領域の配列が増幅
されるｂ）ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２のサブタイプＡを抗原とす
るウエスタンブロッティングアッセイによって、env領
域に対する抗体を検出できない

【００１１】本発明者らはこのような特殊な患者の血液
試料をインド人のＨＩＶ感染者より得た。実験に用いた
血液試料はＰＣＲ法でＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の重複感
染と判定されたものであるが、別の実験によればＨＩＶ
−２単独感染の患者からも同じ塩基配列を持つ核酸が増
幅されることを確認しているので、重複感染そのものは
必要な条件ではない。前記ＤＮＡは、あるいはこのよう
な免疫学的な反応性を示す患者の末梢血単核球（ＰＢＭ
Ｃｓ）に含まれるプロウイルスＤＮＡを鋳型としてＰＣ
Ｒ反応を行うことによって得てもよい。いずれの方法を
用いるにしても、本発明の提供する新規なＨＩＶ−２
は、サブタイプＡのような公知のＨＩＶ−２に比べて血
中濃度が低いと推測されるため、通常のＰＣＲよりも増
幅効率の大きい方法を利用するのが有利である。このよ
うな遺伝子増幅技術としては、たとえばnsetedＰＣＲと
呼ばれる遺伝子増幅技術が知られている。nsetedＰＣＲ
では、標的配列の両端を規定するプライマーに加え更に
その外側に位置する１組のプライマーセットを組み合わ
せるため、外側のプライマーによる増幅産物が内側のプ
ライマーの鋳型として機能し、結果的に高い特異性と大
きな増幅効率を達成することができる遺伝子増幅方法で
ある。

【００１２】ＨＩＶ−１、あるいは公知のＨＩＶ−２の
ＲＮＡゲノムやプロウイルスＤＮＡに対してnestedＰＣ
Ｒを適用した例は公知で[27][28]、ＨＩＶ−１ではga
g、ＨＩＶ−２（サブタイプＡ）に対してはLTR領域を標
的としている。具体的な操作は実施例において詳細に触
れるが、これらの先行技術に対して本発明では、ＨＩＶ
−２のenv内にある膜貫通領域（trans membrane regio
n、ＴＭと省略する）の配列から選択したＨＩＶ−２に
特異的な配列をプライマーに用いて同じくnestedＰＣＲ
法により配列１等に示す塩基配列を持つＤＮＡを得、そ
の配列を決定した。

【００１３】配列１−６に示した塩基配列は、互いに高
い相同性を備えている（図１）が、公知のＨＩＶ−２の
サブタイプのいずれともまったく相同性を示さない。ま
た他の生物で得られた遺伝子の塩基配列に対しても高い
相同性を示すものは知られておらず、まったく新規な塩
基配列である。また配列１−６に示した塩基配列の増幅
に利用したプライマーは、ＨＩＶ−２のＴＭの特異的な
増幅に用いられている配列を持つが、得られる増幅産物
の配列も長さもまったく異なっている。すなわち、本発
明の配列１−６の長さは、２１０bpああるいは２０７bp
である。一方同じプライマーでＨＩＶ−２を増幅すれ
ば、５００bpのバンドが増幅される。この特徴を利用
し、配列１２−１３によって示した塩基配列を持つプラ
イマーを利用し、約２１０bpのバンドが増幅産物として
得られるかどうかを観察することによって、本発明の新
規なレトロウイルスの検出が可能である。鋳型となるウ
イルス遺伝子の濃度が低い時には、更に配列１０−１１
に示すプライマーセットと組み合わせてnestedＰＣＲを
行うと良い。

【００１４】本発明は、ＨＩＶ−２に感染した患者の血
液から得られた新規な塩基配列のみならず、ゲノムＲＮ
Ａがこの塩基配列に対応する配列を含むことで特徴付け
られるレトロウイルス粒子、ならびにこのレトロウイル
スのプロウイルスＤＮＡを与えるものである。前記配列
１−６に示す塩基配列を持つＤＮＡを得た患者のＰＢＭ
Ｃｓでは、ＨＩＶ−２に特異的なLTR領域を増幅するnse
tedＰＣＲによって明らかにＨＩＶ−２特異的なバンド
が増幅されており、ＨＩＶ−２が存在することが明らか
である。また、実験データは示していないが、ＨＩＶ−
１感染細胞を利用した市販の蛍光抗体法による抗体検出
キットでも陽性反応を確認しているので、gagやpolとい
ったＨＩＶ−１と免疫学的に交差性のある領域を備えた
構造を持つことが示唆される。これらの性状を総合的に
判断すると、本発明によって確認された新規なレトロウ
イルスは、次のような特徴を持つ。またもともとＴＭの
ためのプライマーによって増幅されたことから、配列１
−６に示す配列はやはりenvのＴＭに相当しているもの
と推測される。

【００１５】・ＨＩＶ−２サブタイプＡのLTRに特異的
なプライマーによってＰＣＲ法を行うと、ＨＩＶ−２に
特異的なバンドが増幅される・ＨＩＶ−２のenv領域のＴＭに特異的なプライマーに
よってＰＣＲ法を行うと、ＨＩＶ−２サブタイプＡでは
５００bpのバンドが増幅されるのに対して本発明のレト
ロウイルスでは約２１０bpのバンドが得られる・ＨＩＶ−１のgagやpol等の構造たんぱく質と免疫学的
に交差する・後天性免疫不全症候群患者の血液から得ることができ
る

【００１６】本発明のレトロウイルス粒子の構造は、前
記配列１−６の情報をもとに当業者であれば常法に従っ
て決定することができる。たとえば、配列１−６は本発
明によるレトロウイルスに特異的な配列であることがわ
かっているので、この配列の一部を一方のプライマーと
することで本発明によるレトロウイルスの遺伝子を特異
的に増幅することが可能である。もう一方のプライマー
は、やはり本発明によるレトロウイルスが備えているこ
とが明らかなLTR領域の配列を利用したり、あるいは免
疫学的に交差することがわかっているＨＩＶ−２サブタ
イプＡのpolやgagの配列を利用することもできる。この
ようなプライマーペアを利用してＰＣＲ等の遺伝子増幅
反応を行えば、本発明によるレトロウイルスの遺伝子を
特異的に増幅し、クローニングすることができる。後で
触れるように配列１−６に示す塩基配列を持つＤＮＡ
が、ＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ反応であっても、
あるいはプロウイルスＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応で
あっても増幅されてくることから、構造決定のための出
発材料は、リンパ球であってもウイルス粒子の存在が疑
われる血液であっても良い。どのような材料を用いるに
しろ、前記のような特徴を持つＨＩＶ−２感染患者血液
を出発材料とするかぎりは、本発明のレトロウイルスの
遺伝子の増幅が可能である。

【００１７】構造決定には、酵素的な遺伝子増幅反応を
利用したクローニングの他、以下のような方法を採用す
ることもできる。すなわち、ＲＮＡを抽出してランダム
プライマーによりｃＤＮＡを増幅する。得られたｃＤＮ
Ａの５’側と３’側にクローニングベクターに組み込む
ための制限酵素サイトを含む２本鎖のリンカープライマ
ーをライゲーションして鋳型とする。このリンカーを付
加したｃＤＮＡについて、リンカー部分の配列をプライ
マーとしＰＣＲ法によって増幅する。生成した増幅産物
を制限酵素で処理してから適当なクローニング用のベク
ターに組み込む。クローニング用のベクターには、患者
血清によるイムノスクリーニングも可能とするλｇｔ１
１等が一般に利用されている。こうして得られたベクタ
ーライブラリーを、配列１−６の配列を持つ標識ＤＮＡ
をプローブとしてスクリーニングし、ポジティブクロー
ンの配列を決定する。決定した配列の一部をプローブに
使って更に先のベクターライブラリーをスクリーニング
する作業を繰りかえすことによって、ウイルスゲノムの
構造が決定される。

【００１８】出発材料として用いる血液にウイルスが低
い濃度でしか存在していなければ、ウイルスを他の培養
細胞に感染させてもよい。たとえば公知のＨＩＶ−２サ
ブタイプであるROD（サブタイプＡ）では、ＨＵＴ７８
細胞やＣＥＭ細胞に感染させることが可能で、培地上清
中の逆転写酵素活性を指標としてウイルス粒子が回収さ
れている。いずれにせよ、このような操作を行うには、
ＨＩＶ−１との重複感染患者よりも、本発明のレトロウ
イルス単独感染患者の材料を利用した方が望ましいこと
は言うまでもない。

【００１９】構造が決定できれば、診断等に必要な配列
１−６以外の領域の遺伝子もＰＣＲや増幅用のベクター
に組み込むことで容易に入手できる。またその遺伝子が
コードするたんぱく質は、公知の発現ベクターに組み込
み、適当な宿主を形質転換することで製造することが可
能である。またワクチンや、ＨＩＶの他のタイプ、ある
いはサブタイプの抗体を確認するための抗原を得ること
を目的として、他の遺伝子と融合させることが可能であ
る。このような例は、ＨＩＶのgag-env融合たんぱく質
等として公知である。

【００２０】更に、決定したゲノムＲＮＡの塩基配列情
報を公知の他の生物（特にＨＩＶ−１やＨＩＶ−２のサ
ブタイプ）の遺伝子配列と比較し、本発明による新規な
レトロウイルスに特異的な領域を選択することができ
る。こうして設定した特異的な遺伝子配列（またはそれ
にハイブリダイズする配列）は、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイ用のプローブや、遺伝子増幅用のプライマー
として有用である。たとえば配列１−６に示した、本発
明によるレトロウイルスの塩基配列は、明らかに本発明
のレトロウイルスに特異的なものであり、プローブやプ
ライマーとして利用することができる。遺伝子の増幅に
はＰＣＲ法のような酵素的な増幅技術が公知である。

【００２１】本発明は、配列１−６に示す塩基配列を持
つＤＮＡによってコードされるペプチド、このペプチド
と免疫学的に交差するペプチド、あるいはそのペプチド
のエピトープを含む断片をコードするＤＮＡをも含むも
のである。配列１−６が与えられれば、本明細書の以下
の記述によってそれがコードするペプチドのアミノ酸配
列が明らかにされる。そして本発明の与えるアミノ酸配
列をもとに、そのエピトープを決定すること、あるいは
そのエピトープを含むペプチド断片をコードするＤＮＡ
の塩基配列を決定することは、当業者であれば自明であ
る。

【００２２】本発明は配列１−６の塩基配列によってコ
ードされるペプチドを提供する。これらの配列を増幅し
たプライマーがもともとＨＩＶ−２サブタイプＡのenv
ＴＭの増幅に用いられたものであることから、このプラ
イマーに対応する配列がサブタイプＡのＴＭにおいてア
ミノ酸をコードしているフレームに沿って、配列１−３
においてもアミノ酸への翻訳を行った。配列２は２０７
塩基で３塩基短くなっているが、これは３１からの３塩
基が欠損しているためである。前記のような読み取り枠
でアミノ酸への翻訳を行えば、この３塩基の欠損がちょ
うどアミノ酸１残基に相当するので、他の配列との間で
アミノ酸配列の相同性が高い水準で維持される。このよ
うな理由からも、配列１−３がコードするアミノ酸配列
は、配列７−９に示すような配列であると考える。更
に、このような考え方で翻訳したアミノ酸配列に基づい
て合成したペプチドが、患者血液試料と特異的な免疫反
応を示したことから考えても、配列７−９に示したアミ
ノ酸配列は本発明のレトロウイルスに由来するものであ
る。なお本発明においてアミノ酸の名称は以下のように
省略する。

【００２３】アラニン A or Ala アルギニン R or Arg アスパラギン N or Asn アスパラギン酸 D or Asp システイン C or Cys グルタミン Q or Gln グルタミン酸 E or Glu グリシン G or Gly ヒスチジン H or His イソロイシン I or Ile ロイシン L or Leu リジン K or Lys メチオニン M or Met フェニルアラニン F or Phe プロリン P or Pro セリン S or Ser トレオニン T or Thr トリプトファン W or Trp チロシン Y or Tyr バリン V or Val

【００２４】本発明のペプチドは、それをコードするＤ
ＮＡを適当な発現用ベクターに組み込んで発現用の宿主
を形質転換することによって得ることができる。後で述
べるように、配列７−９に示した本発明のペプチドは疎
水性の高いアミノ酸を多く含むため、一般的なホスト・
ベクター系では高い生産量を期待できない場合がある。
このような場合は、ベクターのコピー数が十分に増加後
に発現を誘導できる発現ベクターを利用すると良い成績
を得ることができる。このようなベクターにはｐＥＴ２
１等が知られている。またエピトープを含む比較的短い
ペプチド断片であれば、化学合成によって製造すること
も可能である。

【００２５】配列７−９に示したアミノ酸配列を含む本
発明のペプチド、またはそのエピトープを含むペプチド
断片は、未知のＨＩＶ−２に対する抗体を検出するため
の抗原として有用である。なお配列７−９に示したアミ
ノ酸配列を持つペプチド、あるいはその断片は、場合に
より疎水性が高いことが予想される。実際、実験データ
は示さないものの、配列７をもとに合成したいくつかの
ペプチド断片はきわめて疎水性が高く、水系溶媒には溶
け難いものが有った。このような疎水性アミノ酸を多く
含むペプチドの場合、水に対する溶解性に乏しいため、
試料として取り扱いづらい。しかし疎水性ペプチドのＮ
末端やＣ末端に親水性アミノ酸を付加し、溶解性を高め
ることが可能である。親水性アミノ酸としては、アルギ
ニン、リジン、アスパラギン、アスパラギン酸などを挙
げられる。付加するアミノ酸は３−５個程度である。目
的とするペプチド領域との間で高次構造に影響を与え、
そのものの持つ免疫活性等に望ましくない結果をもたら
してはならない。そのため付加するアミノ酸は３個程度
が望ましい。もちろん付加するアミノ酸の一次配列も免
疫活性に大きな影響を与ないように注意する。水溶性を
与えるためには、アミノ酸のほか合成高分子であるポリ
エチレングリコールで化学修飾する方法も知られてい
る。モノメトキシポリエチレングリコール(CH₃O-PEG-O
H)を用い、トリアジン環を介してペプチドに存在するア
ミノ基と結合させる方法が一般的である。

【００２６】ペプチドを抗体検出用の抗原とするときに
は、ある種のリンカーや担体たんぱく質とのコンジュゲ
ートとする事によって、水溶性や抗原活性の改善を期待
できることが知られている。リンカーには、ｓｕｌｆｏ
−ＳＭＣＣ(sulfosuccinimidyl -4-(N-maleimidomethy
l)cyclohexane-1-carboxylate)、ＥＭＣＳ(N-(ε-malei
midocaproiloxy)succinimido)、ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−Ｓ
ＰＤＰ、あるいはＤＳＳ(2,2-Dimethyl-2-silapentane-
5-sulfonate)等が公知である。これらのリンカーは、目
的とするペプチドとともに室温で反応させ、グリシンの
ようなアミノ酸を添加して反応を停止すればペプチドに
導入することができる。リンカーはもともとペプチド間
を結合するために開発された化合物であるが、単にペプ
チドに結合するだけでも抗原活性の改善などにつながる
ため、抗体検出用抗原に導入されることも多い。あるい
は更に以下に述べるような担体たんぱく質の結合に利用
することもできる。

【００２７】担体たんぱく質には、ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）や、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が利用で
きる。担体たんぱく質に各種リンカー導入ペプチドを結
合するために、担体となるたんぱく質に内在するＳ−Ｓ
結合を還元により解離するか、またはアミノ基に新たに
−ＳＨ基を導入する。この−ＳＨ基に前述のリンカー導
入ペプチドを最適な反応条件で反応させ、未反応の遊離
合成ペプチドから分離する。

【００２８】これらの抗原、あるいは親水性アミノ酸を
導入した誘導体等は、ビーズやプレートに吸着させた状
態でスクリーニングの対象となる血液試料と接触させら
れ、更にヒトイムノグロブリンに対する標識抗体を反応
させることによって抗ＨＩＶ−２抗体の検出が可能とな
る。標識には、酵素、発光成分、蛍光成分、そしてラジ
オアイソトープ等が知られている。このときに、公知の
ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２サブタイプの抗原とともに組み
合わせて利用すれば、ＨＩＶに対する抗体を幅広くチェ
ックすることができる。またヒトイムノグロブリンに対
する標識抗体にイムノグロブリンクラスを認識するもの
を用いれば、クラス別にイムノグロブリンを測定するこ
とが可能である。血液試料中に特定のウイルス抗原に対
する抗体を検出する時には、過去に宿主がそのウイルス
に接触した事実を示すもので、一般的には感染経験の指
標とされている。

【００２９】これら固相イムノアッセイの他、ラテック
スやゼラチンのような人工的な粒子担体を利用した抗体
検出技術も簡便なスクリーニング方法として公知であ
る。粒子担体には、本発明のペプチド（誘導体）を化学
的な結合によって、あるいは物理吸着によって結合させ
る。ペプチドを結合した粒子は抗体の存在下で凝集する
ので、凝集像を観察するか、あるいは凝集状態を光学測
定することによって抗体活性を測定することが可能であ
る。

【００３０】

【発明の効果】本発明の知見により、公知のＨＩＶ−２
の５つのサブタイプ（Ａ−Ｅ）とは明瞭に区別される未
知のＨＩＶ−２株が存在し、その感染が確認された。本
発明のＨＩＶ−２は、ちょうどＨＩＶ−１におけるサブ
タイプＯのように市販の免疫学的なテストキットで感染
をチェックすることができない。したがってenvのペプ
チドを使ったＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２抗体のためのスク
リーニングテストでは、ＨＩＶ−２の単独感染、あるい
はＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２重複感染の広がりを確実に防
止できていない可能性がある。本発明によって提供され
る新規なレトロウイルスに関する情報を基に、現在のス
クリーニング技術では洩れてしまう未知のウイルスの感
染を捕捉することが可能となる。また、本発明によって
明らかにされた新規なレトロウイルスの遺伝子情報は、
ＨＩＶに対するワクチンの開発にもきわめて有用な情報
を提供することになろう。以下に実施例に基づいて本発
明を更に具体的に説明する。

【００３１】

【実施例】

１．患者血漿血漿とＰＢＭＣｓは、インドの病院でＨＩＶ感染が疑わ
れた患者のものを用いた。血漿サンプルは、市販のウエ
スタン・イムノブロット用キット（NEW LAV BLOT 1/2、
およびPEPTILAV 1/2、いずれもSanofi-Diagnostics Pas
teur製、商品名）、ならびに合成ペプチドによる抗体検
出用キット（SELECT-HIV、BioChem Immunosystems Inc.
製、登録商標）によって指示書にしたがい抗ＨＩＶ抗体
の試験を行った。NEW LAV BLOT 1/2はＨＩＶ抗原を（ウ
エスタンブロット）、またPEPTILAV 1/2は、合成したペ
プチドをライン状にブロッティングしたもの（ラインブ
ロット）である。ＥＩＡキットは、ＨＩＶ−１と２に対
するいずれの抗体も検出可能なものである。

【００３２】２．ＰＣＲタイプ特異的な配列をプライマーとしたnestedＰＣＲ(p
olymerase chain reaction)により、ＰＢＭＣｓからプ
ロウイルスＤＮＡを鋳型として長鎖ＤＮＡを増幅し抽出
した。ＨＩＶ−１のターゲットにはgag領域を選び、外
側のプライマーセットとしてＭＺ１３−１４を、内側の
プライマーセットにＭＺ８−９を用いた。ＨＩＶ−２に
ついてはLTR領域をターゲットに選び、外側のプライマ
ーセットにＯＧ０１−２４を、内側のプライマーセット
にはＯＧ０４−１９を用いた。実験に用いたプライマー
は化学合成したものである。ＰＣＲ反応は公知の方法[2
7][28]にしたがって行った。コンタミネーションを避け
るために、全ての試薬は分注済みのものを用い、更にポ
ジティブ−ディスプレイスメントピペット、フィルター
付きチップ、ＵＶキャビネットを利用した。各ＰＣＲ反
応ごとに、陰性対照である健常人のサンプルについてタ
イプ特異的なプライマーを反応させた。更に、ＨＩＶ−
２のenvＤＮＡ断片（ＨＩＶ−２RODのヌクレオチド７７
８２−８２８１に相当）をnestedＰＣＲ法で増幅した。
外側のプライマーは、envＡ（配列１０）とenvＢ（配列
１１）、内側のプライマーにはenvＣ（配列１２）とenv
Ｄ（配列１３）を利用した。各プライマーの詳細は表１
に示した。

【００３３】

【表１】

【００３４】３．ＱＣ−ＲＴＰＣＲ血漿中に存在するＨＩＶ−２関連ＲＮＡはＱＣ−ＲＴ
ＰＣＲ法(QuantitativeCompetitive Reversetranscript
ase PCR)によって定量できることが知られている[29]。
その原理は次のようなものである。まず、両端は増幅対
象としている領域の配列と同じ配列を持つが、中間部分
の配列が欠損している短いＲＮＡテンプレート(competi
tive RNA template)を調製した。一方、サンプルからは
ISOGEN-LS（ニッポンジーン製）でＲＮＡを抽出し、Eth
achinmate（ニッポンジーン製）で沈殿させて回収し
た。２５０μlの血漿（ウイルス濃度が低いものでは１m
lの血漿を用いた）から抽出したＲＮＡをテンプレート
とし、先に調製した５μlのＲＮＡテンプレートをコピ
ー数を段階的に増やして添加し逆転写した。ひき続いて
先に述べたnestedＰＣＲ法によってＨＩＶ−２のLTR領
域の遺伝子増幅を行った。血漿中に存在するＨＩＶ−２
関連ＲＮＡの量を、添加したＲＮＡテンプレートの増幅
産物（野生型のものよりも中間部分を欠損している分だ
け短い）との比によって定量した。

【００３５】４．配列分析ＨＩＶ−２の増幅したLTR領域とenv領域のＤＮＡ産物
は、クローン化し、dyeprimer cycle sequencing kit
あるいは dyedeoxy（登録商標） terminator cycle seq
uencing kit（いずれもアプライドバイシステムズ製、
商品名）を利用して指示書にしたがい配列決定した。

【００３６】５．結果表２にまとめたように、ＰＣＲ法の結果９０例の感染が
疑われた患者サンプルのうち、４７例がＨＩＶ−１の単
独感染、５例がＨＩＶ−２の単独感染、１７例がＨＩＶ
−１／ＨＩＶ−２重複感染、そして２１例を感染無しと
判定した。ＨＩＶ−１単独感染、ＨＩＶ−２単独感染、
そしてＨＩＶ非感染の場合、免疫学的試験の結果はＰＣ
Ｒ法の結果と一致していた。しかしＰＣＲ法でＨＩＶ−
１／２重複感染と判定された１７例のうち、１３例で免
疫学的な試験ではＨＩＶ−１の単独感染と判定され、両
者の結果に食い違いが生じた。ＰＣＲ法と免疫学的な試
験で結果が一致していたのは４例のみである。

【００３７】

【表２】

【００３８】更にＱＣ−ＲＴＰＣＲ法による血中ＨＩ
Ｖ−２濃度には特筆すべき多様性が観察された。すなわ
ち、１４例の重複感染患者を選んでその免疫学的な試験
結果を見たところ、免疫学的試験で陰性となった１０例
ではウイルスのコピー数が低く（２０以下−２０６）な
っていた。これに対して免疫学的試験でＨＩＶ−２陽性
となったものでは６５０−１３０８８０という高い値を
示した。

【００３９】ＰＣＲ法によるＨＩＶ−２の検出結果を検
証するために、次の実験を行った。ＰＣＲで重複感染／
免疫学的にＨＩＶ−１単独感染となったサンプル２例
（TK-62と71）、そしてＰＣＲと免疫学的試験の両方で
重複感染となった１例（TK-64）を選んで、ＨＩＶ−２
診断用プライマーＯＧ０１−２４／ＯＧ０４−１９によ
るＰＣＲ産物である１６９bpをダイレクトシーケンスし
た。ＨＩＶ−２RODのLTR領域に相当するＰＣＲ産物を比
較すると、ＴＫ−６２、７１そして６４の間で９５．
９、９４．７、そして９５．３%という高いホモロジー
が確認された。この結果から、ＰＣＲ法で重複感染、免
疫学的にはＨＩＶ−１単独感染と判定される集団におい
て、ＨＩＶ−２感染のあることが立証された。

【００４０】今回用いた免疫学的な試験キットは、主に
envに相当する合成ペプチドに基づくものである。具体
的には、PEPTILAV 1/2はＨＩＶ−２のenvから選択した
アミノ酸配列qdqarlnswgcafrqvcを、またSELECT-HIVも
同じ領域から選択したkvtaiekylqdqarlnswgcafrqvchttv
pwvndsというアミノ酸配列を利用している。このように
envの部分的な配列しか利用していないため、ＨＩＶ−
２のenv配列に対する抗体の反応性が不十分な可能性が
ある。ＨＩＶ−２のenv領域におけるＤＮＡ断片は、通
常のプライマーでＰＢＭＣｓから増幅することができ
た。５例のＨＩＶ−２単独感染の全て、ならびにＰＣＲ
と免疫学的な試験の両方で重複感染と判定された４例
（TK-8、29、64、そして106）において、５００bpの増
幅産物を確認した。また増幅産物の配列解析の結果（図
２）も９２%以上と非常にホモロジーが高く、いずれも
遺伝的にはサブタイプＡと考えられた。これに対して１
３例のＰＣＲ重複感染／免疫学的ＨＩＶ−１単独感染の
サンプルでは、驚くべきことに約２１０bpの増幅産物が
誘導されていた。配列１−３に示す２０７−２１０bpの
増幅産物は３人の違う患者に由来するＰＢＭＣｓサンプ
ル（TK-62、71、および102）からプロウイルスＤＮＡを
鋳型として得たものでありながら、ほとんど同じ配列と
ほぼ同じ大きさ（２１０bp）を持っていた（図１）。同
じような核酸塩基配列は、違う３人の患者（ＴＫ−１
２、３４、そして７３）血漿から抽出したＲＮＡを鋳型
としたＲＴ・ＰＣＲによっても得ることができたため、
これらの２１０bpの配列はウイルスに特異的なものと考
えた。なおＴＫ−１２とＴＫ−３４では、今回決定した
２１０bpの範囲においては塩基配列が完全に一致してい
る。更にＤＮＡデータベースによる検索によって、過去
に相同性の高い配列は報告されておらず、配列１−６は
新規な塩基配列であることがわかった。更にＴＫ−６２
やＴＫ−７１の結果から、LTRはＨＩＶ−２RODとの間で
高い相同性を持ちながら、envの一部ではまったく異な
った構造を持つウイルスの存在が示唆された。しかもen
vの一部（ＴＭ）として増幅された本発明の遺伝子は、n
estedＰＣＲによって得られたものである。この遺伝子
増幅方法は、２組のプライマーにハイブリダイズするこ
とができる限られた遺伝子のみが増幅されるという特徴
を持つ、特異性に優れた反応である。にもかかわらず、
生成する増幅産物の塩基配列に、プライマーに相当する
部分以外に共通性が見られないという事実は、本発明に
よるウイルスの特殊性を示していると言えよう。

【００４１】ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２との免疫学的な交
差性のため、実際にはＨＩＶ−１単独感染であってもＨ
ＩＶ−２との重複感染陽性結果の原因となり、ＨＩＶ−
１／ＨＩＶ−２重複感染が実際よりも多く報告されてい
るという指摘がある[30]。一方、今回の試験結果によれ
ばＰＣＲ重複感染／免疫学的ＨＩＶ−１単独感染の患者
を確認した。６ヶ月後にも同じ患者（TK-7、12、59）の
血漿とＰＢＭＣｓを採取して、免疫学的な試験とＰＣＲ
法による測定を実施したが、最初の実験結果と同じよう
にＰＣＲ法と免疫学的な試験の結果は一致しなかった。
これらの患者血漿では公知のＨＩＶ−２に対する免疫学
的な反応性が無く、免疫応答の時間的な問題でＨＩＶ−
２陰性となったのではないと結論した。ＨＩＶ−２の５
つのサブタイプ（Ａ−Ｅ）による感染ならばウエスタン
・ブロット法のような免疫学的手法によって検出できる
ことから、これらの患者（実際にはＨＩＶ−１／ＨＩＶ
−２重複感染でありながら免疫学的にはＨＩＶ−２陰性
となる）では新しいＨＩＶ−２サブタイプの感染が考え
られる。これらの集団のＨＩＶ−２血中濃度レベルは、
ＨＩＶ−２サブタイプＡによる４例（単独感染、あるい
はＨＩＶ−１との重複感染）の患者に比べて低く、この
新しいウイルスはサブタイプＡよりも病原性が低いと思
われる。

【００４２】これまでＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２重複感染
に関する研究では、一般に免疫学的なスクリーニングの
結果に基づいてＰＣＲ分析が行われていた。つまり免疫
学的に重複感染が確認された患者についてのみ、ＰＣＲ
分析を行っていたのである。そのため本発明のような異
なるＨＩＶ−２株に関する知見が報告されていないもの
と思われる。本発明者らも免疫学的な、あるいは臨床的
な知見に基づいて実験材料を選ぼうとしたが、実際には
ＨＩＶ−２単独感染グループにおける異なるＨＩＶ−２
感染を確認できなかった。その理由は、免疫学的スクリ
ーニングの問題と、この新しいＨＩＶ−２株の病原性が
低いことによるものと思われる。また本発明らは、ＲＴ
−ＰＣＲ（ＯＧ０１−２４とＯＧ０１−１９をプライマ
ーとするnestedＰＣＲ）によっても別の患者血漿からＨ
ＩＶ−２ウイルス粒子関連ＲＮＡを検出した。この患者
は、免疫学的にはＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２陰性であり、
本発明で確認した新規なＨＩＶ−２株が、ＨＩＶ−１／
ＨＩＶ−２重複感染のみならず、単独感染患者で確認で
きることも解明されている（表２、ＴＫ−）。

【００４３】６．ペプチドの合成以上の実験で明らかにされた新規なＨＩＶ−２の塩基配
列にコードされるペプチドを合成した。実験に利用した
のは配列１の塩基配列によってコードされるアミノ酸配
列のうち、プライマーに用いた塩基配列に相当する部分
に合わせて翻訳したアミノ酸配列の部分配列である。つ
まりＨＩＶ−２RODにおけるenvＴＭにおいては、プライ
マーであるenvＣの５’末端からGIVH....と翻訳されて
いるので、配列１をもとに翻訳したアミノ酸配列は配列
７に示すとおりとなる。この配列７で示されるアミノ酸
配列の３１−５６番目に相当するアミノ酸配列（配列１
４：LLLIIGRKSF FLHLPPMLQA SPIWLK）を持つペプチドを
合成した。操作は次のとおりである。

【００４４】ペプチド合成は段階的固相法に従って行っ
た。固相には9-Fluorenylmethoxycarbonyl-O-Resin p-A
lkoxybenzyl Alcohol Resin（Fmoc-アミノ酸アルコ・レ
ジン、渡辺化学工業製）を用い、アミノ酸（Ｌ体）は、
アミノ基を9-Fluorenylmethoxycarbonyl基（以下Fmocと
略す）で保護した。また各アミノ酸の側鎖は、各々以下
の保護基で保護した。 Arg：Pmc (2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl) AspとGlu：OtBu (beta-t-butyl) CysとHis：Trt (S-trityl) Lys：Boc (t-butoxycarbonyl) SerとThrとTyr：tBu (t-butyl) その他のアミノ酸の側鎖：無保護

【００４５】カップリングは、樹脂上ペプチド末端Fmoc
アミノ酸のFmoc基をピペリジンで脱保護し、カップリン
グする次のアミノ酸のカルボキシル基をN-methylmorpho
line、ＨＯＢｔ(1-hydroxybenzotriazole)およびＢＯＰ
reagent(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris(dimethylamin
o)phosphonium hexafluorophosphate)で活性化し、室温
で１〜３時間混合し反応を行った。反応時間はアミノ酸
の種類と組み合わせによって設定した。なお、グルタミ
ンおよびアスパラギンに関しては、既に活性化している
エステル体を用いた。反応しなかった遊離のアミノ酸は
ＤＣＭ(Dichloromethane)、ＤＭＦ(N,N-Dimethylformam
ide)で樹脂を洗浄し除去した。必要な反応サイクル終了
後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、チオアニソール、エ
タンジチオールおよびm-クレゾールで保護基の除去と合
成ペプチドの樹脂からの切り離しを行い、冷エーテルで
ペプチドを回収した。回収した粗ペプチドは逆相ＨＰＬ
Ｃで精製した。すなわち、粗ペプチドをＯＤＳ−８０Ｔ
ｓカラム（東ソー製、１．８×１５cm）にロードし、水
−アセトニトリル（０．１%ＴＦＡ含有）を０．５ml/mi
n.の速度で送液して０．５mlづつ分取しピークフラクシ
ョンをプールした。

【００４６】７．合成ペプチドと患者血清の反応６で得た合成ペプチドをラジオアイソトープで標識し、
患者血清との反応性を調べた。精製したペプチド４μg
をクロラミンＴ法により４０MBqのＮａ¹²⁵Ｉで標識し
た。全量を前記ＯＤＳ−８０Ｔｓカラムによる逆相ＨＰ
ＬＣと同じ操作により精製した。得られた各フラクショ
ンを感染者血清および健常人血清と反応させ、更に抗ヒ
トＩｇＧヤギ血清を加えてインキュベートし２０００g
で３０分間遠心分離して沈殿分画の放射活性を測定し
た。両者のカウント数の差の大きいフラクションを選
び、以下のＲＩＡ用標識抗原に用いた。

【００４７】７−１．ＲＩＡ標識抗原と検体１μlを混合し、室温で１時間反応後、
抗ヒトＩｇＧヤギ血清を加えて３０分−１時間インキュ
ベートし、２０００gで３０分間遠心分離し、沈殿部分
の放射活性をウエル型γカウンターで測定した。患者血
清には、これまでの結果から本発明によるレトロウイル
スの感染が疑われる感染者血清９例、対照にはＰＣＲ法
によりウイルスの感染を確認できないボランティアの血
清９例を用いた。７−２．インヒビションＲＩＡの標識抗原との反応系に標識していないペプチド
を添加して反応させた。この実験により、標識抗原が標
識していないペプチドと競合的に患者血清中のＩｇＧと
反応し、７−１の反応が免疫学的な反応によるものであ
ればカウント数は低下する。７−３．希釈直線性ＲＩＡの結果で抗ＨＩＶ−２抗体陽性となった患者血清
については、健常人の血清で段階希釈して希釈直線性を
観察した。この実験により、７−１の反応が免疫学的な
反応であればカウント数は希釈段階に応じて低下するは
ずである。

【００４８】８．合成ペプチドによる実験結果まず標識抗原の免疫活性に関する結果を表３および図３
に示した。これらの結果により、フラクション番号４２
を標識抗原に用いることにした。この標識抗原と患者血
清との反応性を示すのが表４である。ペプチド未添加の
列が抗体と反応した標識抗原のカウント数と、添加カウ
ント数（total）に対する反応カウント数（bound）の%
（Ｂ／Ｔ%）を示している。患者血清は健常人の血清と
比較していずれも標識抗原との高い結合活性を示し、我
々が合成したペプチドがＨＩＶ−２感染患者血清に含ま
れるＩｇＧと反応していることが確認できた。更に、イ
ンヒビション試験（表４のペプチド添加の列）、希釈直
線性試験（表５）のいずれの結果においても理論どおり
のカウント数の低下が観察されているので、表４（ペプ
チド未添加の列）に示した患者血清と標識抗原との反応
は、特異的な免疫学的な反応であると考えられる。

【００４９】

【表３】

【００５０】

【表４】

【００５１】

【表５】

【００５２】引用文献 [ 1] Science, 220, 868-870, 1983 [ 2] Science, 224, 497-500, 1984 [ 3] Science, 225, 840-842, 1984 [ 4] Science, 232, 697, 1986 [ 5] Science, 230, 949-951, 1985 [ 6] Lancet II,1387-1389, 1985 [ 7] Science, 233, 343-346, 1986 [ 8] WO87/04459（公表昭63-502242） [ 9] Nature, Vol.326,662-669, 1987 [10] EP 239425 [11] Nature, 324,691-695,1986 [12] 特開平1-224397 [13] 特開平2-218693 [14] WO92/00997（公表平6-508837） [15] WO93/03376（公表平6-509868） [16] J.Virol.,68,7433-7447,1994 [17] 特開平2-131576 [18] 特開平2-131575 [19] 特開平7-278189 [20] 特開平1-289486 [21] WO89/12094（公表平2-504583） [22] WO88/08005（公表平1-503462） [23] WO88/05440（公表平1-502119） [24] 特開平1-163198 [25] 特開平2-448 [26] 特開平2-119791 [27] J.Med.Virol.,38:172-174,1992 [28] J.Acq.Immune.Def.Synd.,5:286-293,1992 [29] BioTech,14:70-79,1993 [30] Lancet 340:339-340,1992

【００５３】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：210 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源：Human Immunodefficiency Virus 他の情報：ＨＩＶの感染が疑われるインド人患者の血漿
ＴＫ−６２からＲＴ−ＰＣＲにより得られた増幅産物配列： GGGATAGTGC ATCAACAGCA ACAGCAACAA CAACCTTTAA ACCCTGTCTG TCCTCTAAAT 60 ATTGGGAATC TGTGCTCTGA TTGCTGGTTG CTGCTTCTGA TCATAGGCAG GAAATCATTC 120 TTTTTGCATC TCCCCCCCAT GTTGCAAGCT TCCCCCATTT GGTTGAAGTG ACTTCCAAAG 180 TTATTTAAAG GGCTATAGGC CTGTTTTCTC 210

【００５４】配列番号：2 配列の長さ：207 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源：Human Immunodefficiency Virus 他の情報：ＨＩＶの感染が疑われるインド人患者の血漿
ＴＫ−７１からＲＴ−ＰＣＲにより得られた増幅産物配列： GGGATAGTGC AGCAACAGCA ACAGCAACAA CCTTTAAACC CTGTCTGTCC TCTAAATATT 60 GGGAATCTGT GCTCTGATTG CTGGTTGCTG CTTCTGATCA TAGGCAGGAA ATCATTCTTT 120 TTGCATCTCC CCCCCATGTT GCAAGCTTCC CCCATTTGGT TGAAGTGACT TCCAAAGGTA 180 TTTAAAGGGC TATAGGCCTG TTTTCTC 207

【００５５】配列番号：3 配列の長さ：210 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源：Human Immunodefficiency Virus 他の情報：ＨＩＶの感染が疑われるインド人患者の血漿
ＴＫ−１０２からＲＴ−ＰＣＲにより得られた増幅産物配列： GGGATAGTGC AGCAACAGCA ACAACAACAA CAACCTTTAA ACCCTGTCTG TCCTCTAAAT 60 ATTGGGAATC TGTGCTCTGA TTGCTGGTTG CTGCTTCTGA TCATAGGCAG GAAATCATTC 120 TTTTTGCATC TCCCCCCCAT GTTGCAAGCT TCCCCCATTT GGTTGAAGTG ACTTCCAAAG 180 TTATTTAAAG GGCTATAGGC CTGTTTTCTC 210

【００５６】配列番号：4 配列の長さ：210 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源：Human Immunodefficiency Virus 他の情報：ＨＩＶの感染が疑われるインド人患者の血漿
ＴＫ−３４からＲＴ−ＰＣＲにより得られた増幅産物配列： GGGATAGTGC AGCAACAGCA ACAGCAACAA CAACCTTTAA ACCCTGTCTG TCCTCTAAAT 60 ATTGGGAATC TGTGCTCTGA TTGCTGGTTG CTGCTTCTGA TCATAGGCAG GAAATCATTC 120 TTTTTGCATC TCCCCCCCAT GTTGCAAGCT TCCCCCATTT GGTTGAAGTG ACTTCCAAAG 180 TTATTTAAAG GGCTATAGGC CTGTTTTCTC 210

【００５７】配列番号：5 配列の長さ：210 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源：Human Immunodefficiency Virus 他の情報：ＨＩＶの感染が疑われるインド人患者の血漿
ＴＫ−１２からＲＴ−ＰＣＲにより得られた増幅産物配列： GGGATAGTGC AGCAACAGCA ACAGCAACAA CAACCTTTAA ACCCTGTCTG TCCTCTAAAT 60 ATTGGGAATC TGTGCTCTGA TTGCTGGTTG CTGCTTCTGA TCATAGGCAG GAAATCATTC 120 TTTTTGCATC TCCCCCCCAT GTTGCAAGCT TCCCCCATTT GGTTGAAGTG ACTTCCAAAG 180 TTATTTAAAG GGCTATAGGC CTGTTTTCTC 210

【００５８】配列番号：6 配列の長さ：210 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源：Human Immunodefficiency Virus 他の情報：ＨＩＶの感染が疑われるインド人患者の血漿
ＴＫ−７３からＲＴ−ＰＣＲにより得られた増幅産物配列： GGGATAGTGC AGCAACAGCA ACAGCAACAA CAACCTTTAA ACCCTGTCTG TCCTCTAAAT 60 ATTGGGAATC TGTGCTCTGA TTGCTGGTTG CTGCTTCTGA TCAGAGGCAG GAAATCATTC 120 TTTTTGCATC TCCCCCCCAT GTTGCAAGCT TCCCCCATTT GGTTGAAGTG ACTTCCAAAG 180 TTATTTAAAG GGCTATAGGC CTGTTTTCTC 210

【００５９】配列番号：7 配列の長さ：56 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド他の情報：ＨＩＶの感染が疑われるインド人患者の血漿
ＴＫ−６２からＲＴ−ＰＣＲにより得られた増幅産物に
よってコードされるペプチド配列： Gly Ile Val His Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Leu Asn Pro 1 5 10 15 Val Cys Pro Leu Asn Ile Gly Asn Leu Cys Ser Asp Cys Trp Leu 20 25 30 Leu Leu Leu Ile Ile Gly Arg Lys Ser Phe Phe Leu His Leu Pro 35 40 45 Pro Met Leu Gln Ala Ser Pro Ile Trp Leu Lys 50 55

【００６０】配列番号：8 配列の長さ：55 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド他の情報：ＨＩＶの感染が疑われるインド人患者の血漿
ＴＫ−７１からＲＴ−ＰＣＲにより得られた増幅産物に
よってコードされるペプチド配列： Gly Ile Val Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Leu Asn Pro Val 1 5 10 15 Cys Pro Leu Asn Ile Gly Asn Leu Cys Ser Asp Cys Trp Leu Leu 20 25 30 Leu Leu Ile Ile Gly Arg Lys Ser Phe Phe Leu His Leu Pro Pro 35 40 45 Met Leu Gln Ala Ser Pro Ile Trp Leu Lys 50 55

【００６１】配列番号：9 配列の長さ：56 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド他の情報：ＨＩＶの感染が疑われるインド人患者の血漿
ＴＫ−１０２からＲＴ−ＰＣＲにより得られた増幅産物
によってコードされるペプチド配列： Gly Ile Val Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Leu Asn Pro 1 5 10 15 Val Cys Pro Leu Asn Ile Gly Asn Leu Cys Ser Asp Cys Trp Leu 20 25 30 Leu Leu Leu Ile Ile Gly Arg Lys Ser Phe Phe Leu His Leu Pro 35 40 45 Pro Met Leu Gln Ala Ser Pro Ile Trp Leu Lys 50 55

【００６２】配列番号：10 配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状他の情報：nestedＰＣＲによるＨＩＶ−２RODのenvＴＭ
増幅用プライマーenvＡ配列： GCTAGGGTTC TTGGGTTTTC TCGCGAC

【００６３】配列番号：11 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状他の情報：nestedＰＣＲによるＨＩＶ−２RODのenvＴＭ
増幅用プライマーenvＢ配列： CAAGAGGCGT ATCAGCTGGC GGATCAGGAA

【００６４】配列番号：12 配列の長さ：24 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状他の情報：nestedＰＣＲによるＨＩＶ−２RODのenvＴＭ
増幅用プライマーenvＣ配列： GGGATAGTGC AGCAACAGCA ACAG

【００６５】配列番号：13 配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状他の情報：nestedＰＣＲによるＨＩＶ−２RODのenvＴＭ
増幅用プライマーenvＤ配列： GAGAAAACAG GCCTATAGCC CTT

【００６６】配列番号：14 配列の長さ：26 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド他の情報：ＨＩＶの感染が疑われるインド人患者の血漿
ＴＫ−６２からＲＴ−ＰＣＲにより得られた増幅産物に
よってコードされるペプチドの断片配列： Leu Leu Leu Ile Ile Gly Arg Lys Ser Phe Phe Leu His Leu Pro 1 5 10 15 Pro Met Leu Gln Ala Ser Pro Ile Trp Leu Lys 20 25

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の新規なレトロウイルスに由来する塩基
配列の比較。図中、−は塩基の一致を示し、．はデリー
ションを示す。塩基の異なる部分のみ配列を記載してあ
る。

【図２】免疫学的な試験結果でもＨＩＶ−１／ＨＩＶ−
２重複感染と判定した患者のenvＴＭのＰＣＲ増幅産物
の塩基配列比較。図中、−は塩基の一致を示し、塩基の
異なる部分のみ配列を記載してある。

【図３】¹²⁵Ｉ標識した合成ペプチドの精製フラクショ
ンの免疫学的な活性を示す。図中、縦軸は放射活性(MB
q)、横軸はフラクション番号（０．５ml）を示す。また
図中に−○−で示したのは、各フラクションそのものの
放射活性である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＧ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/569 33/569 Ｈ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列１、配列２、配列３、配列４、配列
５、および配列６で構成される群から選択される塩基配
列を含み、後天性免疫不全症候群患者血清と反応するた
んぱく質をコードするＤＮＡ、またはその断片、あるい
はそれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズしうるＤＮＡ
【請求項２】配列７、配列８、および配列９で構成され
る群から選択されるアミノ酸配列を含む後天性免疫不全
症候群患者血清と反応するたんぱく質、またはそのエピ
トープを含む断片
【請求項３】後天性免疫不全症候群患者の血液から得る
ことができるレトロウイルス粒子であって、ゲノムＲＮ
Ａが、配列１、配列２、配列３、配列４、配列５、およ
び配列６で構成される群から選択される塩基配列に対応
する配列、またはこれらの配列を持つ核酸とストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズしうる配列を含むこと
によって特徴付けられるレトロウイルス粒子
【請求項４】下記の特徴を持つ後天性免疫不全症候群患
者血清と反応するたんぱく質を含む請求項３のレトロウ
イルス粒子ａ）ＰＣＲ反応でＨＩＶ−２のＬＴＲ領域の配列が増幅
されるｂ）ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２のサブタイプＡを抗原とす
るウエスタンブロッティングアッセイによって、env領
域に対する抗体を検出できない
【請求項５】後天性免疫不全症候群の患者血清と反応
し、配列１、配列２、配列３、配列４、配列５、および
配列６で構成される群から選択される塩基配列でコード
されるアミノ酸配列を含むペプチド、このペプチドと免
疫学的に交差するペプチド、あるいはそれらのペプチド
のエピトープを含む断片
【請求項６】請求項５のペプチドをコードするＤＮＡ、
またはその断片
【請求項７】請求項５のペプチド、またはそのエピトー
プを含む断片からなることを特徴とする、後天性免疫不
全症候群患者の血液から得ることができるレトロウイル
スに対する抗体検出用抗原
【請求項８】請求項７の抗原を被検血液試料と接触さ
せ、前記抗原と反応するイムノグロブリンを測定する抗
体測定方法
【請求項９】請求項８の抗体測定方法によって、後天性
免疫不全症候群患者の血液から得ることができるＨＩＶ
−１、ＨＩＶ−２サブタイプＡ以外のレトロウイルスの
感染をスクリーニングする方法
【請求項１０】抗原が、その免疫学的な性状に影響を与
えず、かつ親水性を与える付加的なアミノ酸配列を持つ
請求項７の抗原
【請求項１１】親水性を与えるアミノ酸配列が、アルギ
ニン、リジン、アスパラギン、アスパラギン酸からなる
群から選択されるアミノ酸で構成される２−５アミノ酸
残基である請求項１０の抗原
【請求項１２】配列１、配列２、配列３、配列４、配列
５、および配列６からなる群から選択される塩基配列、
またはこの塩基配列を持つ核酸に対してストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズしうる配列を持つＤＮＡ、
あるいはその部分配列で構成されることを特徴とする、
後天性免疫不全症候群患者の血液から得ることができる
レトロウイルスの遺伝子検出用プローブ、またはプライ
マー
【請求項１３】下記の性状によって特徴付けられる後天
性免疫不全症候群患者の血液から逆転写酵素によって誘
導したｃＤＮＡ、またはその患者のリンパ球に感染した
プロウイルスＤＮＡを鋳型とし、配列１２に示す５’プ
ライマーと配列１３に示す３’プライマーを用いてＰＣ
Ｒ反応を行ったときに２０７−２１０bpの長さを持つＤ
ＮＡを生じることを特徴とする、前記血液に含まれるウ
イルスの核酸、またはその断片ａ）ＰＣＲ反応でＨＩＶ−２のＬＴＲ領域の配列が増幅
されるｂ）ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２のサブタイプＡを抗原とす
るウエスタンブロッティングアッセイによって、env領
域に対する抗体を検出できない
【請求項１４】請求項１３のウイルス核酸、またはその
断片によってコードされるたんぱく質、またはそのたん
ぱく質と免疫学的に交差するたんぱく質