JPH1087484A - アポプトーシスのモジュレーションのためのイソオキサゾールおよびクロトンアミド誘導体の使用 - Google Patents

アポプトーシスのモジュレーションのためのイソオキサゾールおよびクロトンアミド誘導体の使用

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JPH1087484A
JPH1087484A JP9204344A JP20434497A JPH1087484A JP H1087484 A JPH1087484 A JP H1087484A JP 9204344 A JP9204344 A JP 9204344A JP 20434497 A JP20434497 A JP 20434497A JP H1087484 A JPH1087484 A JP H1087484A
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apoptosis
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Stefan Dr Muellner
シユテフアン・ミユルナー
Claudia Dch Dax
クラウデイア・ダクス
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Hoechst AG
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 アポプトーシスのモジュレーションのための
医薬としてイソオキサゾールおよびクロトンアミド誘導
体を提供することを課題とする。 【解決手段】 次の式ＩまたはIIの化合物を医薬の製造
に使用する。 【化１】 【効果】 これらの化合物は、梗塞、発作、神経変性ま
たは肥大性疾患の治療に有効に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】壊死とは著しく異なって、アポプトーシス
は多細胞生物の生命の必須の構成要素である遺伝子的に
抑制された（プログラム）細胞死である。生命にとって
正常かつ必須であるこのアポプトーシス・プロセスとは
著しく異なって、数多くの形態の疾病またはそれらの症
状は、異常なアポプトーシス、すなわちａ）制御されて
いないか、またはｂ）制御されているアポプトーシス
〔ａ）：梗塞、発作または神経変性、ｂ）肥大性疾患〕
の発現である。それで、疾病の治癒の進行はアポプトー
シスの抑制または活性化（例えば、脊髄の横径病変、免
疫防衛等）により可能となるものである。アポプトーシ
スは、互いにからみ合っている生化学的な事象から二次
的に誘起される複雑なカスケードを経由して、例えばあ
る種の受容体（例えばＦａｓ受容体）の刺激により、定
められた死滅のシグナルが誘発されるのに従って進行
し、この終わりで、無傷の細胞が分解して膜充填単位を
生じ、これらが周囲の細胞に対して損傷を与えることな
く、またはごく僅か与えるだけで、生体によって処理さ
れ得るものである（壊死とは正反対である）。或る場合
には、壊死とアポプトーシスとの間の移り変わりは流動
的であり、それで壊死がアポプトーシスとなる（あるい
はその逆もあり得る）事例が存在する（例えば、梗塞、
発作等）。
【０００２】Ｔ細胞中の補助刺激因子として、コフィリ
ンすなわち１９kDaアクチン結合タンパク質は免疫反応
において重要な役割を果たしている。コフィリンはリン
酸化された形態で細胞質ゾル中に存在し、脱リン酸後に
細胞核中に輸送される。この場合、コフィリンは明らか
に核認識配列を全く有しておらず、ＤＮＡｓｅ Ｉ阻害
剤として知られている、タンパク質アクチンのための輸
送分子として役立つものである。このメカニズムによっ
て、細胞質ゾルのコフィリンのリン酸化の程度が、細胞
のアポプトーシスに影響を与える調節およびモジュレー
ション効果をもたらすことができる。
【０００３】化合物ＩおよびIIがコフィリンの脱リン酸
を阻害するのに適当であり、それ故これらの化合物がア
ポプトーシスに対してモジュレーション効果を有するこ
とが見い出された。
【０００４】従って、本発明はアポプトーシスのモジュ
レーションのための医薬を製造するための次の式Ｉおよ
び／またはII
【化２】 〔式中、 Ｒ1はａ） (Ｃ1〜Ｃ4)−アルキル、 ｂ） (Ｃ3〜Ｃ5)−シクロアルキル、 ｃ） (Ｃ2〜Ｃ6)−アルケニルまたは ｄ） (Ｃ2〜Ｃ6)−アルキニル であり、 Ｒ2はａ） −ＣＦ3、 ｂ） −Ｏ−ＣＦ3、 ｃ） −Ｓ−ＣＦ3、 ｄ） −ＯＨ、 ｅ） −ＮＯ2、 ｆ） ハロゲン、 ｇ） ベンジル、 ｈ） フェニル、 ｉ） −Ｏ−フェニル、 ｋ） −ＣＮまたは ｌ）１） (Ｃ1〜Ｃ4)−アルキル、 ２） ハロゲン、 ３） −Ｏ−ＣＦ3または ４） −Ｏ−ＣＨ3 により一置換または多置換されている−Ｏ−フェニルで
あり、 Ｒ3はａ） (Ｃ1〜Ｃ4)−アルキル、 ｂ） ハロゲンまたは ｃ） 水素 であり、そして Ｘはａ） −ＣＨ基または ｂ） 窒素原子 である〕で表される化合物および／または光学立体異性
体の形態の式ＩまたはIIの化合物および／または式Ｉの
化合物の生理学的に許容し得る塩の少なくとも１種の使
用に関する。
【０００５】用いるのに好ましい式Ｉまたは式IIの化合
物は式中、 Ｒ1がａ） メチル、 ｂ） シクロプロピルまたは ｃ） (Ｃ3〜Ｃ5)−アルキニル であり、Ｒ2がＣＦ3またはＣＮであり、Ｒ3が水素原子
またはメチルであり、そしてＸが−ＣＨ基であるものお
よび／または光学立体異性体の形態の式ＩまたはIIの化
合物および／または式Ｉの化合物の生理学的に許容し得
る塩である。
【０００６】Ｎ−（４−トリフルオロメチルフェニル）
−２−シアノ−３−ヒドロキシクロトンアミド、２−シ
アノ−３−シクロプロピル−３−ヒドロキシアクリル酸
（４−シアノフェニル）アミドまたはＮ−（４−トリフ
ルオロメチルフェニル）−２−シアノ−３−ヒドロキシ
ヘプタ−２−エン−６−イン−カルボン酸アミドの使用
が特に好ましい。
【０００７】式ＩおよびIIの化合物の製造は、既知の方
法に従って、例えばＥＰ ４８４ ２２３；ＥＰ ５２９
５００；ＵＳ ４ ０６１ ７６７；ＥＰ ５３８ ７８３
またはＥＰ ５５１ ２３０に記載されているようにし
て、実施される。
【０００８】「アルキル」、「アルケニル」または「ア
ルキニル」なる用語は、炭素鎖が直鎖または有枝鎖であ
ってよい基を意味するものと解される。さらには、アル
ケニルまたはアルキニル基は１個または２個以上の二重
結合または１個または２個以上の三重結合を含有するこ
とができる。環状アルキル基は例えば３員環〜５員環の
単環基、例えばシクロプロピル、シクロブチルまたはシ
クロペンチルである。「アポプトーシスのモジュレーシ
ョン」(modulation of apoptosis)は、アポプトーシス
の阻害または誘発を意味するものと解される。化学反応
の出発物質は既知であるか、または文献から知られてい
る方法によって容易に製造することができる。
【０００９】本発明はアポプトーシスのモジュレーショ
ンのための医薬の製造方法にも関するものであり、この
方法は式Ｉまたは式IIの化合物を、生理学的に許容し得
る賦形剤およびさらに適当な有効化合物、添加剤または
補助剤と共に適当な投与形態とすることからなる。本発
明による医薬は、非経口、経口または経腸投与され、ま
たは適宜局所適用もできる。
【００１０】適当な固体または液体の製剤形態は、例え
ば、顆粒剤、散剤、コーチング錠、錠剤、（ミクロ）カ
プセル剤、坐剤、シロップ剤、ジュース剤、懸濁剤、乳
剤、滴剤、または液状注射剤であり、そしてまた有効化
合物の徐放性製剤であり、これらの製剤において、通常
の補助剤例えば賦形剤、崩壊剤、結合剤、コーチング
剤、膨潤剤、滑剤または滑沢剤、着香剤、甘味剤または
可溶化剤を使用する。よく使用される補助剤としては、
例えば二酸化チタン、炭酸マグネシウム、乳糖、マンニ
ットおよびその他の糖類、タルク、乳タンパク、ゼラチ
ン、澱粉、セルロースおよびその誘導体、動植物油、ポ
リエチレングリコールおよび溶媒例えば滅菌水および一
価または多価アルコール例えばグリセロールをあげるこ
とができる。
【００１１】式Ｉおよび式IIの化合物の薬理学的性質に
より、これらの化合物は特定のアポプトーシスのモジュ
レーションに使用することができる。それで制御されて
いないアポプトーシスを伴う疾患、例えば梗塞、発作、
移植、自己免疫疾患、炎症、神経変性、筋腫、筋萎縮、
悪液質、筋ジストロフィー、全身性炎症反応症候群（Ｓ
ＩＲＳ）、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、大脳マラ
リア、瘢痕形成、肺サルコシド−シス(sarosidosis)、
腸炎、慢性肺炎、再灌流損傷、火傷障害、後天性免疫不
全症候群（ＡＩＤＳ）、がん、タンパク質喪失の増大を
伴う疾患、慢性腎不全または肥大性疾患を治療すること
ができる。
【００１２】好ましくは、製剤は投与量単位で調製し、
投与される。各々の単位は、有効成分として式Ｉおよび
／または式IIの化合物および／または式Ｉの化合物の生
理学的に許容し得る塩の一定の投与量を含有している。
患者（７０kg）の治療のためには、初期の相では多くと
も３５０mg／日の静脈内注入処置が適用される。後期の
リハビリテーション相では、式Ｉおよび／または式IIの
化合物および／または式Ｉの化合物の相当する塩が、２
〜２５０mg、好ましくは５〜１５０mg、特に１０〜５０
mg、特に好ましくは１０〜２０mgの量で、２〜３回の投
与量で適用される。適用される投与量は、言うまでもな
く、種々の要因例えば処置すべき生物体（すなわち、ヒ
トまたは動物）、年令、体重、一般的な健康状態、可能
性のある合併疾患（もしあるとすれば）、その他の医薬
との併用による処置の種類または処置の頻度によって左
右される。投与量は一般には１日数回、好ましくは１日
２〜３回投与される。この場合、式Ｉの化合物の使用量
は、式Ｉまたは式IIのそれぞれの化合物についての所要
１日量および化合物ＩまたはIIの溶解度を基としてい
る。
【００１３】さらに、式Ｉまたは式IIの化合物は、他の
適当な有効化合物、例えば尿路系疾患治療剤(antiurico
pathics)、鎮痛剤、ステロイド系または非ステロイド系
抗炎症剤、血小板凝阻害剤または免疫抑制作用を有する
化合物例えばシクロスポリンＡ、ＦＫ ５０６またはラ
パマイシン(rapamycin)と併用することもできる。
【００１４】
【実施例】
実施例１ 薬理試験 １.１ 細胞培養 マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ ２６４.７をＡＴＣ
Ｃ（Rockville，MD)から入手し、グルコース４.５ｇ／
リットル、ピルビン酸ナトリウム１１０mg／リットル、
１０％熱不活性化ＦＣＳ（Gibco, Grand Island, NY)お
よびペニシリン／ストレプトマイシン（５０Ｕ／５０mg
／ml）を有するＤＭＥＭ（Sigma, St. Louis, MO)で培
養した。マクロファージを２〜３日毎に継代培養し、そ
して実験開始１日前に２.１０6細胞で組織培養フラスコ
（７５cm2、Falcon, Becton Dickinson GmbH, Heidelbe
rg, Germany)に移した。細胞に新しい培地を供給し、そ
して適当な濃度で調製物を加えた。Ｎ−（４−トリフル
オロメチルフェニル−２−シアノ−３−ヒドロキシクロ
トンアミドナトリウム塩（化合物１）を２０mMで細胞培
地に溶解した。このものの各１００μl（最終濃度６０
μM）、３３μl（最終濃度２０μM）および１６.７μl
（最終濃度１０μM）を培地２０mlにピペットで加え
た。リポ多糖（ＬＰＳ；E. coli、血清型0127：Ｂ８；S
igma, St. Louis,MO)１０ng／ml濃度での刺激を、調製
物によるプレインキュベーション後１時間で実施した。
リポ多糖の原液（ＬＰＳ １mg／１０％ジメチルスルオ
キシド（ＤＭＳＯ）中１ml）のアリコートを培地で希釈
して１μg／mlの濃度とし、そして−２０℃で保存し
た。細胞を１０％ＣＯ2中３７℃で２４時間（ｈ）イン
キュベートした。
【００１５】１.２ 試料調製 使用した化学薬品はすべて分析用の純度のものである
か、または電気泳動用の品質のものであり、他の供給源
が別個に指示されていないときは、Millipore Co.(Bedf
ord. MA)またはSigma（St. Louis, MO)から入手した。
２−Ｄ電気泳動（２−ＤＥ）をInvestigator System(R)
(Millipore)を用いて実施し、そして試料は多少の変更
をして製造業者の手順に従って仕上げた。氷上に静置し
た粘着マウスマクロファージを氷冷ＰＢＳ １０mlで各
６０秒３回洗浄した。次に細胞を沸騰溶解緩衝剤（１０
０ml中ＳＤＳの０.３ｇ、ＤＴＴの３.０８８ｇ、トリス
ＨＣｌの０.４４４ｇおよびトリス塩基の０.２６６ｇか
らなる）１ml中で溶解した。細胞溶解物をかき落とし、
２ml試料容器中沸騰水中で１０分間（min）加熱した。
ポリヌクレオチドをBenzonase(R) (Merck, Darmstadt,
Germany)の添加により３７℃で３０分で開裂した。試料
調製のこの点で、アリコートを取りPoporの方法により
タンパク質含量を測定した。２−ＤＥのために、試料の
タンパク質を氷冷アセトン（８０％v/v）に滴加するこ
とによって沈殿させた。試料を氷上で２０分間冷却し、
次に１０分間２４０ｇで遠心分離した。乾燥ペレットを
溶解緩衝剤１部および試料緩衝剤４部にとりタンパク質
含量５mg／mlとした。試料緩衝剤は、１００ml中尿素の
５９.７ｇ、ＮＰ−４０の４.０ml、ＤＴＴの１.５４
ｇ、担体両性電解質の５.５ml（pH３〜１０、２−ＤＥ
最適化）からなっている。電気泳動前に、試料を１６０
００×ｇで遠心分離することにより、未溶解物質を分離
した。
【００１６】１.３ ２−ＤＥゲル電気泳動 高分解能の二次元ゲル電気泳動を例えばGarrelsが記載
しているように変法を伴うO'Farrellの方法に従って実
施した。この実施のために、Millipore Investigator
(R) ２−Ｄ電気泳動システム（Millipore Co., Bedfor
d. MA)を用いた。ロッドの膨張および破損を防止する
０.０８mm厚のファイバーを用いてガラス毛細管（直径
１mm）中で等電点電気泳動を実施した。ＩＥＦゲルは、
３０.８％Ｔ、２.６％Ｃ原液、９.５Ｍ尿素、２.０％
（v/v）ＮＰ−４０、１０mM ＣＨＡＰＳおよび２％（v/
v）担体両性電解質（pH３〜１０、２−ＤＥ最適化）か
ら調製した４.１％Ｔ、２.４％Ｃポリアクリルアミドマ
トリックスからなっている。０.０１Ｍ Ｈ3ＰＯ4を陽極
緩衝剤として用い、また０.１Ｍ ＮａＯＨを陰極緩衝剤
として用いた。pH勾配を形成させるための予備電気泳動
前に、０.５Ｍ尿素、０.２％（v/v）ＮＰ−４０、０.１
％（v/v）担体両性電解質および５０mM ＤＴＴからなる
試料コーチング緩衝剤１５μlを適用した。１５００ボ
ルトの最大電圧が最大電流１１０μA／ゲルで９０分以
内に得られた。電気泳動後、試料の２０μl（タンパク
質１００μg）およびコーチング緩衝剤のさらに１５μl
を適用した。タンパク質の等電点電気泳動が１８０００
Vh内で行われた。電気泳動完了後、ロッドを氷冷し、そ
して０.３Ｍトリス塩基、０.０７５ＭトリスＨＣｌ、６
％ＳＤＳ、５０mM ＤＴＴおよび０.０１％ブロモフェノ
ールブルーからなる緩衝剤中で平衡化した。ロッドゲル
を第二のディメンションの垂直ゲルの表面に直接転移さ
せるか、または使用時まで−２０℃で保存した。第二の
ディメンションは、ゲルを収集することなく、ＳＤＳ勾
配ゲル（１０〜１７％）中で実施した。勾配は２種のゲ
ル溶液を混合することによって生成された。
【００１７】Ａ：アクリルアミド１００ml（３０.５％
Ｔ、１.６４％Ｃ）、トリス７３ml（１.５Ｍ、pH８.
８）、Ｈ2Ｏ １２３ml、ＳＤＳ（１０％）３ml、ＴＥＭ
ＥＤ １５０μlおよびペルオクソ二硫酸アンモニウム
（１０％）７５０μl。 Ｂ：アクリルアミド１７０ml、トリス７３ml、グリセロ
ール６６.７８ｇ、ＳＤＳ ３ml、ＴＥＭＥＤ １５０μ
l、ペルオクソ二硫酸アンモニウム７５０μl。電気泳動
は、ゲルの末端から約１cmの距離にブロモフェノールブ
ルーの前部があるまで、２５mMトリス塩基、１９２mMグ
リシンおよび０.１％ＳＤＳからなる流れ緩衝剤中定温
で一夜実施した。電気泳動完了後、ゲル中のタンパク質
をHeukeshovenおよびDernickに従って銀試薬で染色し
た。 ２−Ｄゲルの分析および合成イメージの調製は、Biolma
ge System(Biolmage System Co.)を用いて実施した。得
られたタンパク質パターンをKodak Megaplusカメラ・モ
デル１.４によって走査し、そしてデータをＨＡＭステ
ーションによってプロセシングした。
【００１８】１.４ 結果 未刺激のコントロールの結果を１００％に等しいと設定
した。ＬＰＳの添加により、コフィリンの５０％脱リン
酸が行われた。しかし、ＬＰＳ（１０ng／ml）および化
合物１（６０μM）の併用では、コフィリンの脱リン酸
は行われなかった。それ故、化合物１の存在下では、Ｌ
ＰＳで処理しただけのマクロファージの場合に達成され
た阻害と比較して、マクロファージのコフィリンの脱リ
ン酸の１００％阻害が結果として得られる。ＬＰＳ（１
０μg／ml）および２０μM化合物１または１０μM化合
物１の添加により、化合物１の無添加と同じ脱リン酸が
結果として得られた。それ故、化合物１の２０μMまた
は１０μMでは、もはやコフィリンの脱リン酸の阻害をも
たらさない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/42 ＡＣＪ Ａ６１Ｋ 31/42 ＡＣＪ ＡＣＶ ＡＣＶ ＡＤＹ ＡＤＹ ＡＤＺ ＡＤＺ ＡＥＤ ＡＥＤ 31/435 ＡＤＳ 31/435 ＡＤＳ 31/445 ＡＤＡ 31/445 ＡＤＡ 45/00 45/00 // Ｃ０７Ｄ 213/40 Ｃ０７Ｄ 213/40 213/75 213/75 263/34 263/34 413/12 ２１３ 413/12 ２１３

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アポプトーシスのモジュレーションのた
    めの医薬を製造するための次の式Ｉおよび／またはII 【化１】 〔式中、 Ｒ1はａ） (Ｃ1〜Ｃ4)−アルキル、 ｂ） (Ｃ3〜Ｃ5)−シクロアルキル、 ｃ） (Ｃ2〜Ｃ6)−アルケニルまたは ｄ） (Ｃ2〜Ｃ6)−アルキニル であり、 Ｒ2はａ） −ＣＦ3、 ｂ） −Ｏ−ＣＦ3、 ｃ） −Ｓ−ＣＦ3、 ｄ） −ＯＨ、 ｅ） −ＮＯ2、 ｆ） ハロゲン、 ｇ） ベンジル、 ｈ） フェニル、 ｉ） −Ｏ−フェニル、 ｋ） −ＣＮまたは ｌ）１） (Ｃ1〜Ｃ4)−アルキル、 ２） ハロゲン、 ３） −Ｏ−ＣＦ3または ４） −Ｏ−ＣＨ3 により一置換または多置換されている−Ｏ−フェニルで
    あり、 Ｒ3はａ） (Ｃ1〜Ｃ4)−アルキル、 ｂ） ハロゲンまたは ｃ） 水素 であり、そして Ｘはａ） −ＣＨ基または ｂ） 窒素原子 である〕で表される化合物および／または光学立体異性
    体の形態の式ＩまたはIIの化合物および／または式Ｉの
    化合物の生理学的に許容し得る塩の少なくとも１種の使
    用。
  2. 【請求項２】 Ｒ1がａ） メチル、 ｂ） シクロプロピルまたは ｃ） (Ｃ3〜Ｃ5)−アルキニルであり、 Ｒ2がＣＦ3またはＣＮであり、 Ｒ3が水素原子またはメチルであり、そしてＸが−ＣＨ
    基である式Ｉおよび／またはIIの化合物および／または
    光学立体異性体の形態の式ＩまたはIIの化合物および／
    または式Ｉの化合物の生理学的に許容し得る塩を使用す
    る請求項1記載の使用。
  3. 【請求項３】 Ｎ−（４−トリフルオロメチルフェニ
    ル）−２−シアノ−３−ヒドロキシクロトンアミド、２
    −シアノ−３−シクロプロピル−３−ヒドロキシアクリ
    ル酸（４−シアノフェニル）アミドまたはＮ−（４−ト
    リフルオロメチルフェニル）−２−シアノ−３−ヒドロ
    キシヘプタ−２−エン−６−イン−カルボン酸アミドを
    使用する請求項１または２に記載の使用。
  4. 【請求項４】 梗塞、発作、移植、自己免疫疾患、炎
    症、神経変性、筋腫、筋萎縮、悪液質、筋ジストロフィ
    ー、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、成人呼吸困難
    症候群（ＡＲＤＳ）、大脳マラリア、瘢痕形成、肺サル
    コシド−シス、腸炎、慢性肺炎、再灌流損傷、火傷障
    害、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、がん、タンパ
    ク質喪失の増大に伴う疾患、慢性腎不全または肥大性疾
    患の治療のための請求項１〜３のいずれかに記載の使
    用。
  5. 【請求項５】 タンパク質のコフィリンの脱リン酸の阻
    害するための請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
  6. 【請求項６】 式Ｉおよび／またはIIの化合物を２mg〜
    ２５０mg、特に１０mg〜５０mgの投与量で投与する請求
    項１〜５のいずれかに記載の使用。
  7. 【請求項７】 尿路系疾患治療剤、鎮痛剤、ステロイド
    系または非ステロイド系抗炎症剤、血小板凝集阻害剤ま
    たは免疫抑制作用を有する化合物をさらに加えて使用す
    る請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
  8. 【請求項８】 ミクロスポリンＡ、ＦＫ ５０６または
    ラパマイシンをさらに加えて使用する請求項７記載の使
    用。
  9. 【請求項９】 請求項１〜３に記載の式Ｉおよび／また
    はIIの化合物を使用するアポプトーシスをモジュレーシ
    ョンするための医薬。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜３に記載の式Ｉまたは式II
    の化合物を、生理学的に許容し得る賦形剤およびさらに
    適当な活性化合物、添加剤または補助剤と共に、適当な
    投与形態とすることを特徴とする請求項９に記載のアポ
    プトーシスをモジュレーションするための医薬の製造方
    法。
JP9204344A 1996-07-31 1997-07-30 アポプトーシスのモジュレーションのためのイソオキサゾールおよびクロトンアミド誘導体の使用 Pending JPH1087484A (ja)

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