ES2218623T3

ES2218623T3 - Uso de derivados de isoxazol y amidas del acido crotonico para la modulacion de la apoptosis.

Info

Publication number: ES2218623T3
Application number: ES97112938T
Authority: ES
Inventors: Stefan Dr. Mullner; Claudia Dch. Dax
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 1996-07-31
Filing date: 1997-07-28
Publication date: 2004-11-16
Anticipated expiration: 2017-07-28
Also published as: US6011051A; CA2212207C; AU718728B2; JPH1087484A; DK0821952T3; PT821952E; DE59711463D1; EP0821952B1; AU3236897A; EP0821952A1; ATE262901T1; CA2212207A1

Abstract

LAS COMPOSICIONES DE LA FORMULA I O II SON APTAS PARA LA FABRICACION DE MEDICAMENTOS PARA LA MODULACION DE LA APOPTOSIS. ESTAS COMPOSICIONES PUEDEN EMPLEARSE PARA EL TRATAMIENTO DE INFARTOS, LA DEGENERACION NEUROLOGICA O LAS ENFERMEDADES HIPERTROPICAS.

Description

Uso de derivados de isoxazol y amidas del ácido crotónico para la modulación de la apoptosis.

En el caso de la apoptosis se trata, en contraposición con el de la necrosis, de una muerte celular que discurre de forma genéticamente controlada (programada), y que es en una parte esencial de la vida de organismos pluricelulares.

Al contrario de este proceso de apoptosis, normal y necesario para la vida, hay numerosas formas de enfermedad, o sus síntomas, que son la expresión de una apotosis anormal, es decir a) marginal o b) reprimida [a): infartos, apoplegía o neurodegeneración, b) enfermedades hipertróficas]. Por consiguiente, los procesos de curación de las enfermedades pueden ser posibles por medio de la represión o de la activación de la apoptosis (por ejemplo, paraplejias, defensas inmunitarias, etc.). La apoptosis discurre tras la inducción de determinadas señales de muerte, por ejemplo, mediante la estimulación de determinados receptores (por ejemplo, el receptor Fas), a través de una cascada inducida de forma compleja secundaria, de procesos bioquímicos imbricados, al final de los cuales se produce la disolución de las células intactas en unidades empaquetadas en la membrana, que pueden ser eliminadas del cuerpo sin daños, o sólo con mínimos daños para las células circundantes (al contrario del caso de la necrosis). En este caso, la transición entre necrosis y apoptosis se da en algunos casos de forma fluida; así, existen casos en los que la necrosis conduce a la apoptosis (o al revés) (por ejemplo infarto, apoplegía, etc.).

La cofilina, una proteína de 19 kDa que se une a actina, juega un papel decisivo como factor co-estimulador de las células T en las inmunorreacción. La cofilina se presenta en el citosol fosforilada, y es transportada al núcleo de la célula después de la desfosforilización. Por ello, sirve evidentemente como molécula de arrastre para la proteína actina, la cual no posee una secuencia de reconocimiento nuclear, y se conoce como inhibidor de ADNasa-I. Por medio de este mecanismo, el grado de fosforilización de la cofilina citosólica puede tener una influencia reguladora y moduladora en la apoptosis de las células.

La relación entre la translocación de los complejos de actina/cofilina en el núcleo celular y la apoptosis se pone también de manifiesto por Y. Samstag et al., The Journal of Immunology, 1996, páginas 4167-4173.

Ahora se ha encontrado que los compuestos de las fórmulas I y II son apropiadas para impedir la desfosforilización de cofilina. Y, con ello, tienen una influencia moduladora sobre la apoptosis.

C.B. Thompson, Science, Volumen 267, 1995, páginas 1456 - 1462, describe que, por medio de la modulación de la apoptosis, se pueden tratar una serie de enfermedades.

El invento se refiere, por lo tanto, a la utilización de al menos un compuesto de la fórmula I o II

1

y/o, una forma eventualmente estereoisómera del compuesto de la fórmula I y/o una sal fisiológicamente compatible del compuesto de fórmula I, en que

R^{1} representa

a) alquilo (C_{1}-C_{4}),

b) cicloalquilo (C_{3}-C_{5}),

c)alquenilo (C_{2}-C_{6}) o

d) alquinilo (C_{2}-C_{6}),

R^{2} representa

a) -CF_{3},

b) -O-CF_{3},

c) -S-CF_{3},

d) -OH,

e) -NO_{2},

f) halógeno,

g) bencilo,

h) fenilo,

i) -O-fenilo,

j) -CN,

k) -O-fenilo, sustituido una o varias veces con

: 1) alquilo (C_{1}-C_{4}),

: 2) halógeno,

: 3) -O-CF_{3} o

: 4) -O-CH_{3},

R^{3} representa

a) alquilo (C_{1}-C_{4})

b) halógeno o

c) un átomo de hidrógeno, y

X representa

a) un grupo -CH o

b) un átomo de nitrógeno,

para la preparación de medicamentos para el tratamiento de miomas, sarcaidosis pulmonar, las inflamaciones de los intestinos, lesiones por peperfusión, insuficiencia renal crónica.

Se prefiere el empleo de un compuesto de la fórmula I o II y/o de una forma eventualmente estereoisómera del compuesto de la fórmula I o II y/o una sal del compuesto de la fórmula I, en que

R^{1} representa

a) metilo

b) ciclopropilo o

c) alquinilo (C_{3}-C_{5}),

R^{2} representa -CF_{3} o -CN

R^{3} representa un átomo de hidrógeno o metilo, y

X representa un grupo -CH.

Se prefiere especialmente el empleo de la amida del ácido N-(4-trifluorometilfenil)-2-ciano-3-hidroxi-crotónica, 4-(cianofenil) amida del ácido 2-ciano-3-ciclopropil-3-hidroxi-acrílico o de la amida del ácido N-(4-trifluorometilfenil)-2-ciano-3-hidroxi-hept-2-en-6-in-carboxílico.

La preparación de los compuestos de las fórmulas I y II se lleva a cabo según procesos conocidos, tal y como se describe en los documentos EP 484 223, EP 529 500, US 4 061 767, EP 538 783 o EP 551 230.

Por la expresión alquilo, alquenilo o alquinilo se entienden radicales cuya cadena carbonada puede ser lineal o ramificada. Además, los radicales de alquenilo o alquinilo pueden contener también varios enlaces dobles, y dado el caso, o bien varios enlaces triples. Radicales alquilo cíclicos son, por ejemplo, monociclos con elementos de 3 a 5 miembros, como ciclopropilo, ciclobutilo o ciclopentilo.

Las sustancias de partida de las reacciones químicas son conocidas o se pueden preparar fácilmente de acuerdo con métodos citados en la bibliografía.

Los medicamentos de acuerdo con el invento se pueden aplicar por vía parenteral, oral, rectal o eventualmente también por vía tópica.

Formas apropiadas de preparación galénicas sólidas o líquidas son, por ejemplo, granulados, polvos, tabletas, (micro)cápsulas, supositorios, jarabes, zumos, suspensiones, emulsiones, gotas o disoluciones inyectables, así como preparados con liberación retardada del principio activo, en cuya preparación se emplean agentes coadyuvantes usuales, tales como materiales de soporte, agentes disgregantes, aglutinantes, de recubrimiento, de expansión, deslizantes o sustancias saboreantes, lubricantes, edulcorantes o solubilizantes. Como coadyuvantes usados de forma frecuente pueden nombrarse, por ejemplo, dióxido de titanio, carbonato de magnesio, lactosa, manita y otros azúcares, talco, proteínas de la leche, gelatina, almidón, celulosa y sus derivados, aceites de origen animal y vegetal, polietilenglicoles y disolventes, tal como por ejemplo agua esterilizada y alcoholes monovalentes o polivalentes, por ejemplo glicerina.

Debido a las propiedades farmacológicas del compuesto de fórmula I o II, estos compuestos se pueden emplear para la modulación dirigida de la apoptosis. Por ello, se pueden tratar enfermedades con apoptosis marginal tal como infarto, apoplegía, trasplantes, enfermedades autoinmunitarias, erupciones, neurodegeneración, miomas, atrofia muscular, distrofia muscular, caquexia, síndrome de respuesta de inflamación sistémica (en inglés SIRS), pulmonía crónica, síndrome de alteración de la respiración en adultos (en inglés ARDS), malaria cerebral, infarto, apoplegía, sarcosidosis pulmonar, inflamación intestinal, lesiones por reperfusión, formación de cicatrices, lesiones por quemaduras, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), enfermedades con una pérdida elevada de proteínas, insuficiencia renal crónica o enfermedades hipertróficas.

Preferiblemente el preparado se produce y administra en unidades de dosificación, conteniendo cada unidad, como elemento activo, una dosis determinada del compuesto de la fórmula I y/o II y/o sales fisiológicamente tolerables del compuesto de la fórmula I. Para el tratamiento de un paciente (70 kg) se indica en las fases iniciales un tratamiento por vía intravenosa de cómo máximo 350 mg al día. En las fases posteriores de rehabilitación está indicado que se suministren de dos a tres dosis en una cantidad desde 2 mg a 250 mg, preferiblemente de 5 mg a 150 mg, especialmente de 10 mg a 50 mg, de forma especialmente preferida de 10 mg a 20 mg del compuesto de la fórmula I y/o II y/o de la sal correspondiente del compuesto de la fórmula I. La dosificación a emplear depende, por supuesto, de diferentes factores, como el ser vivo a tratar (es decir, si es un ser humano o un animal), la edad, el peso, su estado general de salud, la criticidad de los síntomas, la enfermedad a tratar, eventuales enfermedades concomitantes (en el caso de que existan), el tipo de la enfermedad concomitante y su tratamiento con otros medicamentos, o la frecuencia del tratamiento. Las dosificaciones se administran, en general, varias veces al día y preferiblemente se administran de una a tres veces al día. Las cantidades empleadas de compuesto de la fórmula I se orientan, según esto, a la dosis diaria recomendada, del respectivo compuesto de la fórmula I o II y la solubilidad del compuesto de la fórmula I o II.

Además, los compuestos de la fórmula I o II pueden combinarse también con otros principios activos apropiados, como por ejemplo antiuricopáticos, analgésicos, antilogísticos esteroides y no estereoides, inhibidores de la agregación de trombocíticos o compuestos inmunosupresores como ciclosporina A, FK 506 o rapamicina.

Ejemplo 1 Ensayo farmacológico 1.1. Cultivo de células

La línea de celulas macrófoga murínica RAW 264.7 se adquirió de ATCC (Rockville, MD) y se cultivó en DMEM (Sigma, St. Louis, MO) con 4,5 g de glucosa/l, 110 mg de piruvato de sodio/l, FCS al 10% inactivado por calor (Gibco, Grand Island, NY) y penicilina/estreptomicina (50 U/50 mg/ml). Los macrófagos se popularon cada 2 - 3 días y se pusieron en contacto un día antes del comienzo del experimento con 2*10^{6} células en frascos de cultivo de tejidos
(75 cm^{2}, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Alemania). Las células se abastecieron con medio fresco y se añadieron los preparados en las concentraciones correspondientes.

Se disolvió la sal de sodio de la amida del ácido N-(4-trufluorometilfenil)-2-ciano-3-hidroxi-crotónico (unión 1) 12 mM en el medio celular. De él se pipetearon sucesivamente 100 \mul (concentración final 60 \muM), 33 \mul (concentración final 20 \muM) y 16,7 \mul (concentración final 10 \muM) a 20 ml de medio. La estimulación con lipopolisacáridos (LPS; E. coli, serotipo 0127:B; Sigma, St. Louis, MO) se llevó a cabo en una concentración de 10 ng/ml, una hora después de la preincubación del preparado.

Se diluyeron partes alícuotas de una disolución de origen de lipopolisacáridos (LPS; 1 mg/ml en DMSO al 10%) en el medio con una concentración de 1 \mug/ml y se almacenaron a -20ºC. Las células se incubaron durante 24 horas (h) a 37ºC en 10% de CO_{2}.

1.2. Preparación de las muestras

Todos los productos químicos empleados eran de calidad analítica o electroforésica, y se adquirieron de Millipore Co. (Bedford, MA) o Sigma (St. Louis, MO), si no se apunta a otras fuentes.

La electroforesis 2-D (2-DE) se llevó a cabo con el Investigator System® (Millipore), y las muestras se trataron de acuerdo con la prescripción del fabricante, con pequeñas modificaciones. Los macrófagos murínicos adherentes se lavaron tres veces en hielo cada 60 segundos con 10 ml de PBS a la temperatura del hielo. Finalmente, se lisaron en 100 ml las células en 1 ml de tampón de lisis en cocción, formado por 0,3 g de SDS, 3,088 g de DDT, 0,444 g de TrisHCl y 0,266 g de base Tris. El lisado de las células se raspó y se calentó en un recipiente para muestras de 2 ml durante 10 minutos (min) en agua hirviendo.

Los polinucleótidos se disociaron por adición de Benzonase® (Merck, Darmstadt, Alemania) durante 30 min a 37ºC. En este momento de la preparación de las muestras se extrajo una parte alícuota, de la que se determinó el contenido en proteínas por medio del método de Popov.

Para la 2-DE se precipitaron las proteínas de la muestra por adición gota a gota a acetona (80% v/v) a la temperatura del hielo. La muestra se enfrió con hielo durante 20 mi y a continuación se centrifugó a 240 g durante 10 min. El sedimento seco se recogió en una parte de un tampón de lisis y en cuatro partes de un tampón de muestra, con un contenido en proteínas de 5 mg/ml. El tampón de muestra contiene 59,7 g de urea, 4,0 ml de NP-40, 1,54 g de DTT, 5,5 ml de anfolitos de soporte (pH 3-10, optimizado para la 2-DE) en 100 ml. El material no disuelto se separó antes de la electroforesis por centrifugación de las muestras a 16000 x g.

1.3. Electroforesis del gel de 2-DE

La electroforesis del gel de desintegración en dos dimensiones se llevó a cabo de acuerdo con el método de O'Farrell, con las modificaciones descritas por Garrels. Para ello se empleó el sistema de electroforesis 2-D de Millipore Investigator® (Millipore Co., Beford, MA).

El enfoque isoeléctrico se llevó a cabo en capilares de vidrio (de 1 mm de diámetro), en fibras con un grosor de 0,08 mm, que evitan una deformación y el desgarro de los bastoncillos. El gel IEF consta de una matriz de poliacrilamida con 4,1% de T y 2,4% de C, que se preparó a partir de una solución de origen con 30,8% de T, 2,6% de C, urea 9,5 M, NP-40 al 2,0% (v/v), Chaps 10 mM y anfolitos de sustrato al 2% (v/v)(pH 3-10, optimizados para 2-DE).

Se empleó como tampón anódico H_{3}PO_{4} 0,01 M, y como tampón catódico NaOH 0,1 M. Antes del preenfoque, y para la creación del gradiente de pH, se aplicaron 15 ml de un tampón de recubrimiento de la muestra, que contenía urea 0,5 M, NP-40 al 0,2% (v/v), anfolitos de sustrato al 0,1% (v/v) y DTT 50 mM. El máximo de tensión de 1500 Voltios se alcanzó en el espacio de 90 minutos para una corriente máxima de 110 \muA/gel. Después del preenfoque se aplicaron 20 \mul de la muestra (100 \mug de proteína) y otros 15 \mul del tampón de recubrimiento.

El enfoque isoeléctrico de las proteínas se produjo dentro de 18000 Vh. Tras la finalización de la electroforesis se enfriaron los bastoncillos en hielo, y se equilibraron en un tampón que contenía base Tris 0,3 M, Tris HCl 0,075 M, 6% de SDS, DTT 50 mM y 0,01% de azul bromo y fenol. Los geles de los bastoncillos se transfirieron directamente a la superficie de la segunda dimensión del gel vertical, o se almacenaron hasta su uso a -20ºC. La segunda dimensión se llevó a cabo en un gel de gradiente SDS (10 - 17%) sin gel de agrupación. El gradiente se fabricó por mezcla de dos disoluciones de gel.

A: 100 ml de acrilamida (30,5% de T, 1,64% de C), 73 ml de Tris (1,5 M, pH 8,8), 123 ml de H_{2}O, 3 ml de SDS (10%), 150 \mul de TEMED y 750 \mul de peroxodisulfato de amonio (10%).

B: 170 ml de acrilamida, 73 ml de Tris, 66,78 g de glicerina, 3 ml de SDS, 150 \mul de TEMED, 750 \mul de peroxodisulfato de amonio.

La electroforesis se llevó a cabo por la noche a una temperatura constante en un tampón de transición, que contenía base Tris 25 mM, glicina 192 mM y 0,1% de SDS, hasta que el frente de azul de bromofenol se alejó aproximadamente 1 cm del extremo del gel. Después de la finalización de la electroforesis se colorearon las proteínas del gel con reactivo de plata de acuerdo con Heukeshoven y Dernick.

El análisis de los geles 2-D y la producción de las imágenes sintéticas se llevó a cabo con el BioImage System (BioImage Systems Co.). El modelo de proteínas obtenido se escaneó con una cámara Kodak Megaplus, modelo 1,4 y los datos se procesaron en una estación HAM.

1.4. Resultados

Los resultados del control no estimulado se establecieron inmediatamente al 100%. La adición de LPS (10 ng/ml) dio lugar a una defosforilización del 50% en la cofilina. La aplicación simultánea de LPS (10 ng/ml) y compuesto I (60 \muM) no causó, por el contrario, la desfosforilización de la cofilina. En consecuencia se consiguió, en presencia del compuesto I, una inhibición del 100% de la desfosforilización de la cofilina en los macrófagos, en comparación con la inhibición que se consiguió con los macrófagos tratados únicamente con LPS.

La adición de LPS (10 ng/ml) y 20 \muM del compuesto 1 a 10 \muM de compuesto 1, produjo la misma desfosforilización de la cofilina que sin la adición del compuesto 1. En consecuencia, 20 \muM ó 10 \muM de la unión 1 no dan lugar al bloqueo de la desfosforilización de la cofilina.

Claims

1. Uso de al menos un compuesto de la fórmula I y/o II

2

y/o una forma eventualmente estereoisómera de la unión del compuesto de la fórmula I y/o una sal fisiológicamente compatible del compuesto de fórmula I, en que

R^{1} representa

a) alquilo (C_{1}-C_{4}),

b) cicloalquilo (C_{3}-C_{5}),

c) alquenilo (C_{2}-C_{6}) o

d) alquinilo (C_{2}-C_{6}),

R^{2} representa

a) -CF_{3},

b) -O-CF_{3},

c) -S-CF_{3},

d) -OH,

e) -NO_{2},

f) halógeno,

g) bencilo,

h) fenilo,

i) -O-fenilo,

k) -CN,

l) -O-fenilo, sustituido sustituido una o varias veces con

: 1) alquilo (C_{1}-C_{4}),

: 2) halógeno,

: 3) -O-CF_{3} o

: 4) -O-CH_{3},

R^{3} representa

a) alquilo (C_{1}-C_{4})

b) halógeno o

c) un átomo de hidrógeno, y

X representa

a) un grupo -CH o

b) un átomo de nitrógeno,

para la preparación de un medicamento para el tratamiento de miomas, sarcosidosis de los pulmones, inflamaciones de los intestinos, lesiones por reperfusión o insuficiencia renal crónica.

2. Uso para la producción de un medicamento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque contiene un compuesto de la fórmula I y/o II y/o una forma eventualmente estereoisómera del compuesto de la fórmula I o II y/o una sal del compuesto de la formula I, en que

R^{1} representa

a) metilo,

b) ciclopropilo o,

c) alquinilo (C_{3}-C_{5}),

R^{2} representa CF_{3} o CN

R^{3} representa un átomo de hidrógeno o metilo, y

X representa un grupo -CH.

3. Uso para la producción de un medicamento de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque contiene amida del ácido N-(4-trifluorometilfenil)-2-ciano-3-hidroxi-crotónico, (4-cianofenil)amida del ácido 2-ciano-3-ciclopropil-2-hidroxi-acrilíco o amida del ácido N-(4-trifluormetilfenil)-2-ciano-3-hidroxi-hepta-2-en-6-in-carboxílico.

4. Uso para la producción de un medicamento de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el elemento de la fórmula I y/o fórmula II puede administrarse en una dosis de 2 mg a 250 mg, preferiblemente de 10 a 50 mg.

5. Uso para la producción de un medicamento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque contiene además antiuricopáticos, analgésicos, antilogísticos esteroides y no estereoides, inhibidores de la agregación de trombocíticos o uniones inmunosupresores.

6. Uso para la producción de un medicamento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque además contiene ciclosporina A, FK 506 o rapamicina.