JPH10513475A - 細胞−細胞接着を阻止する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細胞−細胞接着の阻止を必要とするヒトに、有効量の、式（Ｉ）： ［式中、Ｒ¹及びＲ³は独立に、水素、−ＣＨ₃、（ａ）又は（ｂ）（ここでＡrは、場合により置換されていることもあるフェニルである）であり；Ｒ²は、ピロリジノ、ヘキサメチレンイミノ、及びピペリジノからなる群から選択される］で示される化合物、又はその薬学的に許容し得る塩若しくは溶媒和物を投与することを含んでなる、細胞−細胞接着を阻止する方法。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞−細胞接着を阻止する方法 血管内皮は、血液凝固、炎症の調節物として、そして血管内区分と実質組織と の間の体液及び媒介物質の交換における調節物として機能する重要な器官を構成 する。このように、血管内皮の正常な機能は、全身の恒常性にとって重要である 。重要な表面分子の発現の変化によって起こる血管内皮の機能不全は、凝固欠陥 、局所的及び全身的な血管の炎症、並びにアテローム硬化斑の進行と破裂の増長 をもたらすことがある。これらの作用は、さらに、心筋梗塞、深部静脈血栓、播 種性血管内血栓、及び発作を含む状態を引き起こすことがある。 ある種の細胞表面タンパク質は、血管の損傷又は発作に応答して変化し、機能 不全の内皮のマーカーとして使用することができる。このようなタンパク質のう ちで重要なものには、細胞−細胞接着を媒介するレセプター／リガンドであり、 インテグリン、セレクチン（例えばＥＬＡＭ）、及びＩＣＡＭやＶＣＡＭといっ た、免疫グロブリンスーパーファミリーの構成員が含まれる。このような分子は 、サイトカインを含む様々な刺激に応答して増加し、さらに、機能不全の内皮の 重要なマーカーであって、血管壁における血栓、炎症及びアテローム発生過程に おいて重要な役割を果している。表面抗凝固応答等の他の活性もまた、内皮機能 不全の状態において損なわれる。細胞−細胞接着又は凝血促進活性の発現を阻止 する活性について測定することによって決定されるように、内皮機能不全を阻止 することができる化合物は、敗血症、主要組織の障害及び外傷を伴う損傷、全身 性炎症性反応症候群、敗血症症候群、敗血症ショック及びＤＩＣを含む多器官の 機能不全症候群、並びにアテローム硬化斑破裂及びそれに関連した続発症等の状 態を処置するのに有用である。細胞−細胞接着は広い生物学的重要性を有する根 本的過程であるので、接着タンパク質を特異的に調節する能力は、血管組織のほ かにも、抗炎症剤として使用することを含め多くの臨床上の応用について潜在的 な可能性を有している。 本発明は、細胞−細胞接着の阻止を必要とするヒトに、有効量の、式（Ｉ）： であり； Ｒ²は、ピロリジノ、ヘキサメチレンイミノ、及びピペリジノからなる群から 選択される］ で示される化合物、及びその薬学的に許容し得る塩及び溶媒和物を投与すること を含んでなる、細胞−細胞接着を阻止する方法を提供する。 本発明は、２−フェニル−３−アロイルベンゾチオフェン類（ベンゾチオフェ ン類）の選択された群、すなわち式（Ｉ）で示される化合物が、細胞−細胞接着 、特に血管の細胞−細胞接着の阻止に有用であるという発見に関する。また、こ の化合物は、血管内皮機能不全を阻止するのにも有用である。 本発明によって提供される使用方法は、その方法を必要とするヒトに、式（Ｉ ）で示される化合物又はその薬学的に許容し得る塩若しくは溶媒和物の、細胞− 細胞接着又はその作用を阻止するのに有効な投与量を投与することによって実施 される。「阻止」なる用語には、一般に受け入れられている意味を含み、進行、 重篤度の禁止（prohibiting）、予防(preventing)、抑制(restraining)、及び緩 和(slowing)、停止(stopping)、若しくは逆転(reversing)、又は生じた症状若し くは影響の改善を包含する。したがって、本発明の方法は、医学的治療及び／又 は 予防的な投与の両方を適宜包含するものである。 ラロキシフェン、すなわち、Ｒ¹とＲ³が水素であり、Ｒ²が１−ピペリジニル である式（Ｉ）で示される化合物の塩酸塩である本発明の化合物は、中核をなす 調節分子である。ラロキシフェンは、エストロゲンレセプターに結合することが わかり、子宮組織とエストロゲン依存性乳癌を活性化するエストロゲンの能力を 阻止するという点において、その分子の機能と薬理は、抗エストロゲンのそれで あると当初考えられた。確かに、ラロキシフェンは、ある細胞中においては、エ ストロゲンの作用を阻止する。しかしながら、他のタイプの細胞においては、ラ ロキシフェンは、エストロゲンが活性化するのと同し遺伝子を活性化し、例えば 、骨粗鬆症、高脂質血症といった同じ薬理を呈する。その結果、ラロキシフェン は、アゴニスト−アンタゴニスト混在の特性を有する抗エストロゲンであるとい われてきた。ラロキシフェンが示す、エストロゲンとは異なる、この独特のプロ ファイルは、ラロキシフェン−エストロゲンレセプター複合体による様々な遺伝 子機能の独特の活性化及び／又は抑制が、エストロゲン−エストロゲンレセプタ ー複合体による遺伝子の活性化及び／又は抑制とは対照的であることによるもの であると、現在は考えられている。したがって、ラロキシフェンとエストロゲン は、同一のレセプターに作用し、競合するけれども、この両者による遺伝子調節 の結果得られるこの薬理学的な成果は、容易に予想することができないのであり 、各々にとって独特なものなのである。 一般に、本発明の化合物は、慣用の添加剤、希釈剤又は担体と共に調剤され、 そして錠剤に圧縮され、又は経口投与に便利なエリキシル剤又は液剤として調剤 され、あるいは筋肉内若しくは静脈内の経路で投与される。本発明の化合物は、 経皮投与でき、また、徐放性の剤型などに調剤してもよい 本発明の方法に使用する化合物は、米国特許第４，１３３，８１４号、米国特 許第４，４１８，０６８号、及び米国特許第４，３８０，６３５号に記載のよう な、確立された手順にしたがって製造することができ、これらはすべて本明細書 の一部を構成する。一般に、６−ヒドロキシル基と２−（４−ヒドロキシルフェ ニル）基を有するベンゾ［ｂ］チオフェンで、製造工程を開始する。出発化合物 を、保護し、アシル化し、脱保護して式（Ｉ）の化合物を形成する。このような 化合物の製造例は、上記に述べた米国特許に記載されている。置換されているこ ともあるフェニルには、フェニル、及び１又は２の、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₁− Ｃ₄アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、クロロ、フルオロ、又はトリ（クロロ又 はフルオロ）メチルで置換されたフェニルが含まれる。 本発明の方法に使用される化合物は、広範囲の有機及び無機の酸及び塩基と薬 学上許容し得る酸及び塩基の付加塩を形成し、薬化学においてしばしば使用され る生理学的に許容し得る塩を含む。このような塩もまた、本発明の一部を構成す る。このような塩の形成に使用される典型的な無機の酸には、塩酸、臭化水素酸 、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、次リン酸などが含まれる。脂肪族のモノ 及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸及びヒドロ キシアルカン二酸、芳香族の酸、脂肪族及び芳香族のスルホン酸などの有機の酸 から誘導される塩もまた使用し得る。従って、このような薬学的上許容し得る塩 には、酢酸塩、フェニル酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、アクリル酸塩、アスコル ビン酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安 息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ｏ−アセトキシ安息香酸塩 、ナフタレン−２−安息香酸塩、臭化物、イソ酪酸塩、フェニル酪酸塩、β−ヒ ドロキシ酪酸塩、ブチン−１，４−二酸塩、ヘキシン−１，４−二酸塩、カプリ ン酸塩、カプリル酸塩、塩化物、ケイ皮酸塩、クエン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩 、グリコール酸塩、ヘプタン酸塩、馬尿酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸 塩、ヒドロキシマレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシラート、ニコチ ン酸塩、イソニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩 、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、 プロピオル酸塩、プロピオン酸塩、フェニルプロピオン酸塩、サリチル酸塩、セ バシン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、ピロ硫酸塩、亜硫 酸塩、重亜硫酸塩、スルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−ブロモフェニル スルホン酸塩、クロロベンゼンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、２−ヒドロ キシエタンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩 、ナフ タレン−２−スルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩 、酒石酸塩などが含まれる。好ましい塩は塩酸塩である。 薬学上許容し得る酸付加塩は、典型的には式（Ｉ）の化合物を、等モル又は過 剰量の酸と反応させることによって形成する。反応成分は一般に、ジエチルエー テル又はベンゼンなどの相互溶媒中で混合する。塩は普通、約１時間から１０日 以内に溶液から沈殿し、濾過によって分離するか又は慣用の方法によって溶媒を 除去し得る。 塩の形成に一般的に使用される塩基には、水酸化アンモニウム及びアルカリ及 びアルカリ土類金属の水酸化物、並びに脂肪族の第一級、第二級及び第三級アミ ン、脂肪族のジアミンが含まれる。付加塩の製造に特に有用な塩基には、水酸化 アンモニウム、炭酸カリウム、メチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミ ン及びシクロヘキシルアミンが含まれる。 薬学上許容し得る塩は一般に、それらが由来する化合物と比較すると溶解度が 増大しており、したがって、液体又はエマルジョンとしてより容易に調剤するこ とができる場合が多い。 医薬製剤は当技術分野で知られている手順により製造できる。例えば、化合物 を、慣用の添加剤、希釈剤、又は担体と共に調剤し、錠剤、カプセル剤、懸濁剤 、散剤などに形成することができる。このような製剤に適当な添加剤、希釈剤、 及び担体の例には次のものが含まれる：デンプン、糖類、マンニトール及びケイ 酸誘導体などの賦形剤及び展開剤；カルボキシメチルセルロース及び他のセルロ ース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、及びポリビニル‐ピロリドンなどの結合 剤；グリセリンなどの湿潤剤；炭酸カルシウム及び重炭酸ナトリウムなどの崩壊 剤；パラフィンなどの溶出遅延剤；第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤 ；セチルアルコール、グリセリンモノステアラートなどの界面活性剤；カオリン 及びベントナイトなどの吸着担体；そして、タルク、ステアリン酸カルシウム、 ステアリン酸マグネシウム、及び固体のポリエチルグリコール類などの滑沢剤。 本発明の化合物はまた、便利な経口投与のためのエリキシル剤若しくは液剤、 又は、例えば筋肉、皮下又は静脈経路による非経口投与に適当な液剤として調剤 することができる。さらに本発明の化合物は、徐放性の剤型等としての製剤によ く適合する。この製剤は、腸管の特定の部分においてのみか又はその部分にて好 ましく、できるだけ一定期間活性成分を放出するように構成することができる。 例えばポリマー物質又はワックス類でコーティング、薬袋、及び保護マトリック スを製造し得る。 細胞−細胞接着又はその作用を阻止するため、又は本明細書に開示された他の 何れかの使用に必要で、本発明にしたがう、式（Ｉ）で示される化合物の具体的 な投与量は、状態の重さ、投与経路、及び主治医によって決定されるであろう関 連する因子に依存する。一般に、受け入れられ、効果的である１日の投与量は、 約０.１〜約１０００ｍg／日であり、より典型的には約５０〜約２００ｍg／日 である。このような投与量を、必要とする患者に、１日に１回〜３回投与するが 、患者の症状、細胞−細胞接着若しくはその作用を効果的に阻止するのに、又は 本明細書に開示された他の何れかの使用に必要な場合は、より頻繁に投与する。 ピペリジノ環等の塩基性の基を有する医薬の投与においては慣用であるように 、式（Ｉ）の化合物を酸付加塩の形態として投与することが通常好ましい。経口 投与によってこのような化合物を投与するのも都合良い。このような目的のため に、以下の経口投与剤形が有効である。 製剤例 以下の製剤中、「活性成分」は式（Ｉ）の化合物を意味する。製剤１ ：ゼラチンカプセル剤 以下の成分を用いて硬質ゼラチンカプセル剤を製造する 成 分 量（ｍg/カプセル） 活性成分 ０.１−１０００ デンプン（ＮＦ） ０− ６５０ デンプン（流動性粉末） ０− ６５０ シリコーン油 ３５０センチストーク ０− １５ 成分を混合し、Ｎo.４５メッシュＵ.Ｓ.シーブに通し、硬質ゼラチンカプセル 中へ充填する。 製造したラロキシフェンのカプセル製剤の具体的な例には、以下に示したもの が含まれる。製剤２ ：ラロキシフェンカプセル剤 成 分 量（ｍg/カプセル） ラロキシフェン １ デンプン（ＮＦ） １１２ デンプン（流動性粉末） ２２５.３ シリコーン油 ３５０センチストーク １.７ 製剤３ ：ラロキシフェンカプセル剤 成 分 量（ｍg/カプセル） ラロキシフェン ５ デンプン（ＮＦ） １０８ デンプン（流動性粉末） ２２５.３ シリコーン油 ３５０センチストーク １.７ 製剤４ ：ラロキシフェンカプセル剤 成 分 量（ｍg/カプセル） ラロキシフェン １０ デンプン（ＮＦ） １０３ デンプン（流動性粉末） ２２５.３ シリコーン油 ３５０センチストーク １.７ 製剤５ ：ラロキシフェンカプセル剤 成 分 量（ｍg/カプセル） ラロキシフェン ５０ デンプン（ＮＦ） １５０ デンプン（流動性粉末） ３９７ シリコーン油 ３５０センチストーク ３.０ 上記の具体的な製剤は、規定された合理的な変化にしたがって変更してもよい 。 錠剤は、以下の成分を用いて製造する。製剤６ ：錠剤 成 分 量（ｍg／錠剤） 活性成分 ０.１−１０００ セルロース（微結晶） ０− ６５０ 二酸化ケイ素（ヒューム） ０− ６５０ ステアリン酸 ０− １５ 成分を混合して圧縮し、錠剤を形成する。 若しくは、活性成分０.１〜１０００ｍgをそれぞれ含有する錠剤を以下のよう に製造する。製剤７ ：錠剤 成 分 量（ｍg／錠剤） 活性成分 ０.１−１０００ デンプン ４５ セルロース（微結晶） ３５ ポリビニルピロリドン（１０％水溶液） ４ ナトリウムカルボキシメチルセルロース ４.５ ステアリン酸マグネシウム ０.５ タルク １ 活性成分、デンプン及びセルロースをＮo.４５メッシュＵ.Ｓ.シーブに通し、 十分に混合する。ポリビニルピロリドンの溶液を得られた粉末と混合し、Ｎo.１ ４メッシュＵ.Ｓ.シーブに通す。得られた顆粒を５０〜６０℃で乾燥し、Ｎo.１ ８メッシュＵ.Ｓ.シーブに通す。あらかじめＮo.６０メッシュＵ.Ｓ.シーブに通 したナトリウムカルボキシメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、及び タルクを顆粒に加え、混合した後、打錠機で圧縮して錠剤を得る。 ５ｍL用量あたり、薬物０.１〜１０００ｍgをそれぞれ含有する懸濁剤を以下 のように製造する。製剤８ ：懸濁剤 成 分 量（ｍg／５ｍL） 活性成分 ０.１〜１０００ｍg ナトリウムカルボキシメチルセルロース ５０ｍg シロップ １.２５ｍL 安息香酸溶液 ０.１０ｍL 香料 ｑ.ｖ. 着色料 ｑ.Ｖ. 精製水を加えて５ｍLとする 薬物を、Ｎo.４５メッシュＵ.Ｓ.シーブに通し、ナトリウムカルボキシメチル セルロース及びシロップと混合してなめらかなペーストにする。安息香酸溶液、 香料、及び着色料を少量の水で希釈して、撹拌しながら加える。さらに水を加え て所要の容量にする。 イン・ビトロ細胞接着分析 ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）又はヒト動脈内皮（ＨＡＥ）をClonetic s社（San Diego）より得、Clonetics社より供給されたＥＢＭ培地中で培養した 。細胞を９６ウェルプレートに、３７℃で一晩インキュベーションした後に集密 的単層が得られるような密度でプレーティングした。試験化合物を加え、血清を 含まない培地中で８〜２０時間インキュベートした。次いで、単層を、結合分析 前の４〜２４時間、２ｎｇ／ｍLＩＬ−１を添加し若しくは添加せずに、又は２ ０ｎｇの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を添加して、試験化合物の存在下に、総体積７ ５〜１００μLでインキュベートした。インキュベーションの後、トリチウム標 識したＵ９３７細胞を、各ウェルあたり１〜３×１０（６）細胞になるように５ ０μLの体積で加えた。Ｕ９３７細胞は、３Ｈ−チミジンを加えて、１マイクロ キュリー／ｍLの最終濃度とした後、１８〜２０時間インキュベートすることに より、トリチウム標識した。細胞を使用する前に、ＰＢＳで洗浄して過剰の標識 を除いた。標識したＵ９３７細胞を内皮細胞とともに２０分間インキュベートし た後、 ウェルを吸引し、カルシウム含有ＰＢＳで４回洗浄した。単層及び接着Ｕ９３７ 細胞を、０.２５％ＳＤＳ／０.１Ｎ ＮaＯＨを添加して５分間振盪することによ り可溶化した。結合のレベルを可溶化した細胞のシンチレーション計数により決 定した。 抗凝血活性分析 ９６ウェルプレート中の、ＩＬ１処理（２ｎｇ／ｍL）した、又は処理してい ないヒト内皮細胞の集密培養細胞をＨＢＳＳで１回洗浄して、血清タンパク質を 除き、４００ｎＭ組換えヒトプロテインＣ及び１０ｎＭヒトトロンビンを含む、 血清不含培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２ 培地、２０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、pＨ７．５、 ５０ｍg／ｍLゲンタミシン、１ｍg／ｍLヒトトランスフェリン及び１ｍg／ｍLウ シインスリン）とインキュベートした。細胞を３７℃でインキュベートし、様々 な時間で培地を取り出し、２０ｍＭ トリス−ＨＣl、pＨ７．５、１５０ｍＭ Ｎ aＣl、１ｍg／ｍLＢＳＡ及び１０Ｕ／ｍLヒルジンの、同体積の溶液に加えた。 試料を、ヒルジンを含む緩衝液中で５分間インキュベートしてトロンビン活性を 阻止した。産生した活性化プロテインＣの量を、クロモゲニック（chromogenic ）基質（Ｓ−２３６６）を加えて最終濃度０.７５ｍＭとし、ThermoMax カイネ ティック マイクロ‐タイター プレート リーダー（Molecu1ar Devices）により 、４０５nｍで吸光度／分の変化を測定することによって測定した。すべての実 験において、プロテインＣ／トロンビンの試料溶液を、細胞なしのウェル中でイ ンキュベートして、プロテインＣのトロンビン触媒による活性化の基底レベルを 測定した。産生した活性化プロテインＣの量は、細胞タンパク質の、吸光度（m ＯＤ）／分／μgとして表される。 結果 ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、Ｒ¹及びＲ³が水素であり、Ｒ³がピ ロリジノである化合物Ａで処理し、同時にＴＮＦによる接着分子発現の誘発を行 った。表Ｉに示すように、この分析において、１００ｎＭの化合物Ａの存在は、 約４０％の細胞−細胞接着のレベルの減少をもたらした。ＴＮＦによる誘発前の 約２０時間、１０ｎＭの化合物Ａのみで細胞を前処理した場合は、約６５％の接 着 の減少が観察された（表２）。我々はまた、ＨＵＶＥＣとヒト動脈内皮細胞（Ｈ ＡＥＣ）の両方を、化合物Ａ１０ｎＭの存在下で、ＩＬ１、即ち接着分子の発現 を誘発する別の炎症媒介物質で処理した。表３に示すように、化合物Ａは、ＩＬ １による接着の誘発を、両方の細胞系において効果的に阻止した。したがって化 合物Ａは、２つの異なる手段によって媒介される、そして静脈と動脈細胞の両方 における、接着分子発現を阻止できる。 内皮の機能的な特性を調節するこの化合物の能力に関する、さらなる証拠とし て、我々は、ヒトプロテインＣを活性化する内皮細胞の能力、即ち内皮機能不全 の状態において抑制される自然の調節機能を測定した。表４に示されるように、 細胞のＩＬ１処理は、プロテインＣ産生を支援する内皮細胞の能力を有意に減じ た。しかし、化合物Ａで細胞を処理した後では、ＩＬ１によるこの機能の抑制が 本質的に排除された。上記のデータは、化合物Ａが、炎症の活性化と凝血促進活 性とから、細胞を保護していることを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ， ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，Ｔ Ｄ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，Ｌ Ｓ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞−細胞接着の阻止を必要とするヒトに、有効量の、式： ある）であり； Ｒ²は、ピロリジノ、ヘキサメチレンイミノ、及びピペリジノからなる群から 選択される］ で示される化合物、又はその薬学的に許容し得る塩若しくは溶媒和物を投与する ことを含んでなる、細胞−細胞接着を阻止する方法。 ２．前記化合物が塩酸塩である、請求項１に記載の方法。 ３．前記化合物が、 又はその塩酸塩である、請求項１に記載の方法。 ４．炎症及び正常な凝血過程の破壊の阻止を必要とする患者に、有効量の、式： であり； Ｒ²は、ピロリジノ、ヘキサメチレンイミノ、及びピペリジノからなる群から 選択される］ で示される化合物、又はその薬学的に許容し得る塩若しくは溶媒和物を投与する ことを含んでなる、血管内皮の疾患を有する患者における炎症及び正常な凝血過 程の破壊を阻止する方法。 ５．前記化合物が塩酸塩である、請求項４に記載の方法。 ６．前記化合物が、 又はその塩酸塩である、請求項４に記載の方法。