【発明の詳細な説明】
抗肥満症タンパク質
本発明は、ヒトの医学の分野、特に肥満症および肥満症に関連した障害の処置
に属する。最も詳しくは、本発明は患者に投与すると脂肪組織を制御する抗肥満
症タンパク質に関する。
肥満症および特に上体の肥満症は、米国および全世界中において共通でありま
た非常に深刻な公衆衛生問題である。最近の統計によると、米国の人口の２５％
以上およびカナダの人口の２７％以上が太り過ぎである。ククツマルスキ（Ｋuc
zmarski）、Ａmer.Ｊ.of Ｃlin.Ｎutr. ５５：４９５Ｓ−５０２Ｓ（１９９２）
；リーダー（Ｒeeder）ら、Ｃan.Ｍed.Ａss.Ｊ.、２３：２２６−２３３（１９
９２）。上体の肥満症はII型真性糖尿病に対して知られた最強の危険因子であり
、心血管障害および癌に対する強い危険因子でもある。肥満症の医療費の最近の
推定額は、全世界で１５０,０００,０００,０００ドルである。この問題は、米
国社会において増加し続けている脂肪症の蔓延に対して公衆衛生局長官が闘いの
指揮をとるほど深刻になってきている。
この肥満症を誘発する病理の多くは、異脂肪症（dyslipidemia）、高血圧およ
びインシュリン耐性との強い関連に帰することができる。多くの研究は、食事療
法および運動による肥満症の減少がこれらの危険因子を劇的に減少させること証
明している。不幸にも、これらの処置は大概は不成功に終わっており、失敗率は
９５％に達している。この失敗は、該状態が、増進した食欲、高カロリー食品の
嗜好、肉体活動の減少および脂質形成代謝の昂進に貢献する遺伝的規定因子に強
く関連しているという事実によるものである。このことは、これらの遺伝的特性
を遺伝している人々が該状態と格闘する努力にもかかわらず肥満症になりがちで
あることを示している。それゆえ、遺伝的性質にかかわらずこの脂肪症という悪
条件を癒すことができ、内科医が肥満症患者をうまく処置することを可能にする
医薬製剤が必要である。
生理学者は何年もの間、哺乳動物が過食すると過剰となった脂肪が脳に体が肥
満症になるというシグナルを伝達し、そのことが今度は体に食べることを減らさ
せ、一層多くの燃料を燃やすようにするという仮説を立てている。ハーベイ（Ｇ
.Ｒ.Ｈervey）、Ｎature ２２７：６２９−６３１（１９６９）。この「フィー
ドバック」モデルはパラビオーゼ実験により支持されており、これは脂肪症を制
御する循環ホルモンを示唆している。
ｏｂ／ｏｂマウスは肥満症および糖尿病のモデルであり、第６染色体における
突然変異に連鎖した常染色体劣性特性を保持することが知られている。最近、イ
イン・ツァン（Ｙiying Ｚhang）およびその共同研究者たちは、この状態に連
鎖したマウスの遺伝子のポジショナルクローニングを出版した。イイン・ツァン
ら、Ｎature ３７２：４２５−３２（１９９４）。この報告は、脂肪組織にのみ
発現している２１アミノ酸のシグナルペプチドを有する１６７アミノ酸のタンパ
ク質をコードする遺伝子を開示している。同様に、ムラカミ（Ｍurakami）ら、
バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ
（Ｂiochemical and Ｂiophysical Ｒesearch Ｃommunications ２０９）（３
）：９４４−５２（１９９５）中には、ラットの肥満遺伝子のクローニングおよ
び発現が報告されている。ｏｂ遺伝子により明らかにコードされているタンパク
質が、今や脂肪症制御ホルモンであると推測される。ツァンらによっては、薬理
活性は全く報告されていない。
しかしながら、ツァンらの開示した該タンパク質は化学的および／または物理
的不安定のために貧弱な医薬製剤であることを見いだした。例えば、そのヒトタ
ンパク質は一層沈澱しやすい。沈澱物を含有する天然のタンパク質の医薬製剤化
は患者における免疫学的応答を生み出す危険性を高める。従って、改善した物理
学的および化学的安定性を提供し、食欲および代謝を制御するのを助けるのに有
用である医薬製剤を開発する必要性がある。
最も顕著なことには、現在、ヒト肥満タンパク質の７７、９７から１１１、１
１８および／または１３８のアミノ酸残基における特定の置換は改善した安定性
を有するすぐれた処置製剤へと導くことがはっきりしている。従って、本発明は
生物学的に活性な肥満タンパク質を提供する。本発明のタンパク質は一層容易に
製剤化でき、保存できる。さらに、本化合物は、一層製薬学的に上品であり、そ
の結果、処置投与量の優れた伝達となる。従って、このような薬剤により患者は
肥満症障害を克服し、II型真性糖尿病、心血管疾患および癌に対するリスクを一
層正常化して通常の生活を送ることができる。
発明の要約
本発明は下式（Ｉ）で示されるタンパク質に関する：
ここで、
第４位のＸaaはＧlnまたはＧlu；
第７位のＸaaはＧlnまたはＧlu；
第２２位のＸaaはＡsn、ＡspまたはＧlu；
第２７位のＸaaはＴhrまたはＡla；
第２８位のＸaaはＧln、Ｇluまたは不在；
第３４位のＸaaはＧlnまたはＧlu；
第５４位のＸaaはＭet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖal、Ａlaまた
はＧly；
第５６位のＸaaはＧlnまたはＧlu；
第６２位のＸaaはＧlnまたはＧlu；
第６３位のＸaaはＧlnまたはＧlu；
第６８位のＸaaはＭet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖal、Ａlaまた
はＧly；
第７２位のＸaaはＡsn、ＡspまたはＧlu；
第７５位のＸaaはＧlnまたはＧlu；
第７７位のＸaaはＳerまたはＡla；
第７８位のＸaaはＧln、ＡsnまたはＡsp；
第８２位のＸaaはＧln、ＡsnまたはＡsp；
第１１８位のＸaaはＧlyまたはＬeu；
第１３０位のＸaaはＧlnまたはＧlu；
第１３４位のＸaaはＧlnまたはＧlu；
第１３６位のＸaaはＭet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖal、Ａlaま
たはＧly；
第１３９位のＸaaはＧln、Ｇluである；
該タンパク質は以下よりなる群から選択された少なくとも１つの置換を有する：
第９７位のＨisがＧln、Ａsn、Ａla、Ｇly、ＳerまたはＰroで置換される；
第１００位のＴrpがＡla、Ｇlu、Ａsp、Ａsn、Ｍet、Ｉle、Ｐhe、Ｔyr、Ｓer、
Ｔhr、Ｇly、Ｇln、ＶalまたはＬeuで置換される；
第１０１位のＡlaがＳer、Ａsn、Ｇly、Ｈis、Ｐro、ＴhrまたはＶalで置換され
る；
第１０２位のＳerがＡrgで置換される；
第１０３位のＧlyがＡlaで置換される；
第１０５位のＧluがＧlnで置換される；
第１０６位のＴhrがＬysまたはＳerで置換される；
第１０７位のＬeuがＰroで置換される；
第１０８位のＡspがＧluで置換される；
第１１１位のＧlyがＡspで置換される；または
第１３８位のＴrpがＡla、Ｇlu、Ａsp、Ａsn、Ｍet、Ｉle、Ｐhe、Ｔyr、Ｓer、
Ｔhr、Ｇly、Ｇln、ＶalまたはＬeuで置換される；
または製薬学的に許容し得るその塩。
本発明は、さらに肥満症の処置を必要とする哺乳動物に式（Ｉ）のタンパク質
を投与することを含む、肥満症を処置する方法を提供する。
本発明はさらに、１つまたはそれ以上の製薬学的に許容し得る希釈剤、担体ま
たはその賦形剤と共に式（Ｉ）のタンパク質を含む医薬製剤を提供する。
本発明の別の態様は、式（Ｉ）のタンパク質を調製する方法であり、以下を含
む：
（ａ）任意にリーダー配列を有する式（Ｉ）のタンパク質をコードするＤＮＡで
宿主細胞を形質転換し；
（ｂ）宿主細胞を培養し、工程（ａ）おいてコードされるタンパク質を単離し；
ついで任意に、
（ｃ）該リーダー配列を酵素的に開裂して式（Ｉ）のタンパク質を調製する。
詳細な説明
本発明の目的のためには、本明細書に開示および特許請求するように、下記術
語および略語を以下のように定義する：
塩基対（bp）・・ＤＮＡまたはＲＮＡをいう。略語Ａ、Ｃ、ＧおよびＴはＤＮ
Ａ分子中の場合にはそれぞれ（デオキシ）アデニン、（デオキシ）シチジン、（
デオキシ）グアニンおよび（デオキシ）チミジンヌクレオチドの５'−一リン酸
の形態に対応する。略語Ｕ、Ｃ、ＧおよびＴはＲＮＡ分子中の場合にはそれぞれ
ウラシル、シチジン、グアニンおよびチミジンヌクレオシドの５'−一リン酸の
形態に対応する。二本鎖ＤＮＡにおいては塩基対はＡとＴ、またはＣとＧと共同
すること（partnership）をいう。ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖においては塩基
対はＴとＵ、またはＣとＧとが共同することをいう。
ＤＮＡ・・デオキシリボ核酸。
ＥＤＴＡ・・エチレンジアミン四酢酸の略語。
免疫応答タンパク質・・抗体、親抗体分子と同様の性質の抗原と結合できる抗
体の断片、および単鎖ポリペプチド結合分子（ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ８
７／０２２０８号、国際公開第ＷＯ８８／０１６４９号に記載）を記載するのに
使用する語句。
ｍＲＮＡ・・メッセンジャーＲＮＡ。
プラスミド・・染色体外自律複製遺伝要素。
ＰＭＳＦ・・フェニルメチルスルホニルフルオライドの略語。
リーディングフレーム・・翻訳が行われるヌクレオチド配列は、ｔＲＮＡ、リ
ボソームおよび関連因子の翻訳装置によってトリプレットにて「読まれ」、各ト
リプレットは特定のアミノ酸に対応する。各トリプレットは別個で同じ長さであ
るため、コーディング配列は３の倍数でなければならない。１塩基対の挿入また
は欠失は（フレームシフト変異という）、同じＤＮＡセグメントによりコードさ
れる２つの異なるタンパク質となる。これを防ぐには、目的のポリペプチドに対
応するトリプレットコドンを開始コドンから３の倍数で並べられなければならな
い、すなわち正確な「リーディングフレーム」が維持されなければならない。
組換えＤＮＡクローニングベクター・・１つまたはそれ以上のＤＮＡセグメン
トを加えうるまたは加えたＤＮＡ分子を含む、プラスミドおよびファージ（これ
らに限られるものではない）などの自律複製因子。
組換えＤＮＡ発現ベクター・・プロモーターが組み込まれている組換えＤＮＡ
クローニングベクター。
レプリコン・・プラスミドその他のベクターの自律複製を制御および可能にす
るＤＮＡ配列。
ＲＮＡ・・リボ核酸。
ＲＰ−ＨＰＬＣ・・逆相高速液体クロマトグラフィーの略語。
転写・・ＤＮＡのヌクレオチド配列中に含まれる情報が相補的なＲＮＡ配列に
移しとられるプロセス。
翻訳・・メッセンジャーＲＮＡの遺伝情報をポリペプチド鎖の合成を具体的に
して指令するのに使用するプロセス。
トリス・・トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタンの略語。
処置・・疾患、症状または障害と闘うための患者の管理および介護であり、兆
候または合併症の発症を防ぎ、兆候または合併症を軽減し、または疾患、症状も
しくは障害を排除するために本発明の化合物を投与することを含む。それゆえ、
肥満症の処置には食物摂取の抑制、体重増加の抑制およびその必要性がある患者
において体重の減少を誘導することが含まれる。
ベクター・・適切なタンパク質分子に対応するポリヌクレオチド配列を含む、
遺伝子操作において細胞の形質転換に使用するレプリコンであって、該配列は適
当な制御配列と組み合わされたときに、形質転換されるべき宿主細胞に対して特
定の性質を付与するもの。プラスミド、ウイルスおよびバクテリオファージは適
当なベクターである。というのはそれらは本来レプリコンであるからである。異
なる源からのＤＮＡ分子を制限酵素およびリガーゼを用いて切断および連結する
ことによって人工ベクターが構築される。ベクターは組換えＤＮＡクローニング
ベクターおよび組換えＤＮＡ発現ベクターを含む。
Ｘ−gal・・５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼの略語。
該アミノ酸略語は米国特許商標局によって３７Ｃ.Ｆ.Ｒ.§１.８２２（ｂ）（
２）（１９９３）に示されるように受容されている。当業者はあるアミノ酸が転
位さ
Ｊ．Ｐeptide Ｐrotein Ｒes. １４：４８５−９４（１９７９）およびそこに引
用されている参考文献に記載されている通り、例えばＡsnはアスパラギン酸およ
びイソアスパルギン酸に転位されうる。これらの転位誘導体は本発明の範囲に含
まれる。特に断らない限りアミノ酸はＬ配置である。
上記のとおり、本発明は式（Ｉ）のタンパク質を提供する。好ましいタンパク
質は式（II）：
ここで、
第２２位のＡsnは任意にＧlnまたはＡsp；
第２７位のＴhrは任意にＡla；
第２８位のＧlnは任意にＧluまたは不在；
第５４位のＭetは任意にＡla；
第６８位のＭetは任意にＬeu；
第７２位のＡsnは任意にＧluまたはＡsp；
第７７位のＳerは任意にＡla；
第１１８位のＧlyは任意にＬeuである；
該タンパク質は以下よりなる群から選択された少なくとも１つの置換を有する：
第９７位のＨisがＧln、Ａsn、Ａla、Ｇly、ＳerまたはＰroで置換される；
第１００位のＴrpがＡla、Ｇlu、Ａsp、Ａsn、Ｍet、Ｉle、Ｐhe、Ｔyr、Ｓer、
Ｔhr、Ｇly、Ｇln、ＶalまたはＬeuで置換される；
第１０１位のＡlaがＳer、Ａsn、Ｇly、Ｈis、Ｐro、ＴhrまたはＶalで置換され
る；
第１０２位のＳerがＡrgで置換される；
第１０３位のＧlyがＡlaで置換される；
第１０５位のＧluがＧlnで置換される；
第１０６位のＴhrがＬysまたはＳerで置換される；
第１０７位のＬeuがＰroで置換される；
第１０８位のＡspがＧluで置換される；
第１１１位のＧlyがＡspで置換される；または
第１３８位のＴrpはＡla、Ｇlu、Ａsp、Ａsn、Ｍet、Ｉle、Ｐhe、Ｔyr、Ｓer、
Ｔhr、Ｇly、Ｇln、ＶalまたはＬeuで置換される；
または製薬学的に許容し得るその塩。
好ましいタンパク質は式II中：
第１００位のＴrpがＧln、Ｔyr、Ｐhe、Ｉle、ＶalまたはＬeu；または第１３８
位のＴrpがＧln、Ｔyr、Ｐhe、Ｉle、ＶalまたはＬeuである。
他の好ましいタンパク質は式III：
ここで、
第９７位のＨisがＧln、Ａsn、Ａla、Ｇly、ＳerまたはＰroで置換される；
第１００位のＴrpがＡla、Ｇlu、Ａsp、Ａsn、Ｍet、Ｉle、Ｐhe、Ｔyr、Ｓer、
Ｔhr、Ｇly、Ｇln、ＶalまたはＬeuで置換される；
第１０１位のＡlaがＳer、Ａsn、Ｇly、Ｈis、Ｐro、ＴhrまたはＶalで置換され
る；
第１０２位のＳerがＡrgで置換される；
第１０３位のＧlyがＡlaで置換される；
第１０５位のＧluがＧlnで置換される；
第１０６位のＴhrがＬysまたはＳerで置換される；
第１０７位のＬeuがＰroで置換される；
第１０８位のＡspがＧluで置換される；
第１１１位のＧlyがＡspで置換される；または
第１３８位のＴrpがＡla、Ｇlu、Ａsp、Ａsn、Ｍet、Ｉle、Ｐhe、Ｔyr、Ｓer、
Ｔhr、Ｇly、Ｇln、ＶalまたはＬeuで置換される；
または製薬学的に許容し得るその塩。
最も好ましいタンパク質は式III中、
第９７位のＨisがＧln、Ａsn、Ａla、Ｇly、ＳerまたはＰroで置換される；
第１００位のＴrpがＡla、Ｇlu、Ａsp、Ａsn、Ｍet、Ｉle、Ｐhe、Ｔyr、Ｓer、
Ｔhr、Ｇly、Ｇln、ＶalまたはＬeuで置換される；
第１０１位のＡlaがＳer、Ａsn、Ｇly、Ｈis、Ｐro、ＴhrまたはＶalで置換され
る；
第１０５位のＧluがＧlnで置換される；
第１０６位のＴhrがＬysまたはＳerで置換される；
第１０７位のＬeuがＰroで置換される；
第１０８位のＡspがＧluで置換される；
第１１１位のＧlyがＡspで置換される；または
第１３８位のＴrpがＡla、Ｇlu、Ａsp、Ａsn、Ｍet、Ｉle、Ｐhe、Ｔyr、Ｓer、
Ｔhr、Ｇly、Ｇln、ＶalまたはＬeuである。
なお一層好ましい式IIIのタンパク質は、
第９７位のＨisがＳerまたはＰroで置換される；
第１００位のＴrpがＡla、Ｇly、Ｇln、Ｖal、ＩleまたはＬeuで置換される；
第１０１位のＡlaがＴhrで置換される；または
第１３８位のＴrpがＡla、Ｉle、Ｇly、Ｇln、ＶalまたはＬeuである。
さらに好ましい式IIIのタンパク質は、
第９７位のＨisがＳerまたはＰroで置換される；
第１００位のＴrpがＡla、ＧlnまたはＬeuで置換される；
第１０１位のＡlaがＴhrで置換される；または
第１３８位のＴrpがＧlnである。
本発明のさらに好ましいタンパク質は配列番号：３、ここで第９７、１００、
１０１、１０５、１０６、１０７、１０８および１１１位のアミノ酸残基が表１
に示すように置換されているものである：
式IIIおよび表１の最も好ましい種としては配列番号：４−１１の種が含まれ
る：
本発明は肥満症の有効な処置を提供する生物学的に活性なタンパク質を提供す
るものである。意外にも、特許請求されたタンパク質がヒト肥満症タンパク質に
特定の置換のため改良された特性を有する。特許請求されたタンパク質はマウス
およびヒト両者の肥満症タンパク質より安定であり、故に、治療剤として優れて
いる。
特許請求されたタンパク質は通常、組換え技術により調製される。既知の配列
を有するＤＮＡ中での前以て決定した部位で置換変異を形成する技術は、例えば
、Ｍ１３プライマー突然変異誘発のようによく知られている。本発明の抗肥満症
タンパク質をコードするＤＮＡ中に形成する変異は、該配列をリーディングフレ
ーム外に置いてはならなず、二次ｍＲＮＡ構造を生成しうる相補的領域を形成し
ないのが好ましいであろう。ドゥ・ボーア（ＤeＢoer）ら、ＥＰ ７５,４４４Ａ
（１９８３）参照。
本発明の化合物は組換えＤＮＡ技術またはよく知られた化学的手法、例えば溶
液または固相ペプチド合成、または常法の溶液法によりカップリングしたタンパ
ク質断片から開始する溶液中での半合成により調製できる。Ａ．固相
特許請求されているタンパク質の合成は固相ペプチド合成または組換え方法に
よって行う。ポリペプチドの固相化学合成の原理は当該技術分野においてよく知
られており、デュガス（Ｄugas,Ｈ.）およびペニー（Ｐenny,Ｃ.）のバイオオー ガニック・ケミストリー（Ｂioorganic Ｃhemistry）
、スプリンガー−フェアラ
ーク（Ｓpringer-Ｖerlag）、ニューヨーク、５４−９２頁（１９８１）などの
当該領域の一般的なテキストに記載されている。例えば、ペプチドの合成は、Ｐ
Ｅ−アプライド・バイオシステムズ（ＰＥ−Ａpplied Ｂiosystems）４３３Ａペ
プチド合成機（アプライド・バイオシステムズ、フォスター・シティー、カリフ
ォルニアより市販されている）およびアプライド・バイオシステムズにより提供
される合成サイクルを用いた固相法により行うことができる。Ｂocアミノ酸その
他の試薬はＰＥ−アプライド・バイオシステムズその他の化学会社により市販さ
れている。Ｃ−末端カルボキシアミドを製造するため、ダブルカップルプロトコ
ール（double couple protocol）を用いた連続Ｂoc化学を出発物質のｐ−メチル
ベンズヒドリルアミン樹脂に行う。Ｃ−末端酸の製造のため、対応するＰＡＭ樹
脂を使用する。アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジンおよびメチ
オニンを、前以て形成したヒドロキシベンゾトリアゾールエステルを用いて結合
させる。以下の側鎖保護が使用される：
Ａrg、トシル
Ａsp、シクロヘキシルまたはベンジル
Ｃys、４−メチルベンジル
Ｇlu、シクロヘキシル
Ｈis、ベンジルオキシメチル
Ｌys、２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｍet、スルホキシド
Ｓer、ベンジル
Ｔhr、ベンジル
Ｔrp、ホルミル
Ｔyr、４−ブロモカルボベンゾキシ
Ｂoc脱保護は、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で行う。Ｔrpから
のホルミル脱保護は、ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンでペプチド樹
脂を４℃で６０分間処理することにより行う。Ｍet（Ｏ）の還元は、ペプチド樹
脂をＴＦＡ／ジメチルスルフィド／濃ＨＣｌ（９５／５／１）で２５℃で６０分
間処理することにより行うことができる。上記の前処置に続いて、１０％ｍ−ク
レゾールまたはｍ−クレゾール／１０％ｐ−チオクレゾールまたはｍ−クレゾー
ル／ｐ−チオクレゾール／ジメチルスルフィドの混合物を含む無水フッ化水素で
該ペプチドをさらに脱保護および開裂できる。側鎖保護基およびペプチドの樹脂
からの開裂は、０℃またはそれより低い温度、好ましくは−２０℃で３０分間、
ついで０℃で３０分間行う。ＨＦを除去した後、ペプチド／樹脂をエーテルで洗
浄する。ペプチドを氷酢酸にて抽出し、凍結乾燥させる。精製は、アセトニトリ
ル濃度の上昇勾配を用いた０．１％ＴＦＡ中にて、逆相Ｃ１８クロマトグラフィ
ーヴィダック（Ｖydac）カラムにより行う。
当業者は、固相合成はまたＦＭＯＣ法およびＴＦＡスカベンジャー開裂混合物
を用いても行うことができると認識する。Ｂ．組換え合成
特許請求されているタンパク質はまた、組換え法を用いても製造できる。組換
え法は高収率が望まれる場合に好ましい。タンパク質の組換え産生における基本
的工程は以下が含まれる：
（ａ）特許請求されているタンパク質をコードする合成または半合成（または天
然資源からの単離）ＤＮＡの構築、
（ｂ）コーディング配列を単独または融合タンパク質のいずれかの発現に適した
やり方にて発現ベクターに組み込むこと、
（ｃ）該発現ベクターで適当な真核生物または原核生物宿主細胞を形質転換する
こと、および
（ｄ）組換えにより産生したタンパク質を回収および精製すること。
ａ.遺伝子構築
そのイン・ビトロまたはイン・ビボでの転写および翻訳がタンパク質の産生と
なるであろう合成遺伝子は、当該技術分野においてよく知られた技術によって構
築できる。遺伝子コードの天然の縮重により、特許請求されたタンパク質をコー
ドする相当量であるが限られた数のＤＮＡ配列を構築しうることを当業者は認識
するであろう。本発明の好ましい実施態様においては、合成は組換えＤＮＡ技術
により行う。
合成遺伝子構築の方法は当該技術分野においてよく知られている。例えば、ブ
ラウン（Ｂrown）ら（１９７９）メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍethods
in Ｅnzymology）、アカデミック・プレス（Ａcademic Ｐress）、ニューヨー
ク、第６８巻、１０９−１５１頁を参照。特許請求されたタンパク質の合成遺伝
子に対応するＤＮＡ配列は、アプライド・バイオシステムズ・モデル３８０Ａま
たは３８０Ｂ ＤＮＡ合成機（アプライド・バイオシステムズ、インク、８５０
リンカーン・センター・ドライブ、フォスター・シティー、カリフォルニア９４
４０４より市販）などの従来のＤＮＡ合成装置を用いて製造できる。
幾つかの応用においては、例えば、融合タンパク質構築物からのシグナルペプ
チドの制御された切り出しを容易にすべくシグナルペプチドと構造タンパク質と
の間に都合のよいプロテアーゼ感受性開裂部位を組み込むために、特許請求され
たタンパク質のコーディング配列を修飾するのが望ましい。
特許請求されたタンパク質をコードする遺伝子はまた、ポリメラーゼチェーン
リアクション（ＰＣＲ）を用いて製造できる。鋳型はｃＤＮＡライブラリー（ク
ローンテク（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ）またはストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮ
Ｅ）から市販されており入手可能）またはヒト脂肪組織から単離されたｍＲＮＡ
であってよい。このような方法は、当該技術分野のマニアチス（Ｍaniatis）ら
、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual）
、コールド・スプリング・ハーバー・プレ
ス（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory）、コールド・スプリング・ハ
ーバー、ニューヨーク（１９８９）においてよく知られている。
ｂ.直接発現または融合タンパク質
特許請求されたタンパク質は、直接発現するか、または特許請求されたタンパ
ク質を含む融合タンパク質として発現した後に酵素的または化学的に開裂するこ
とによって製造されてよい。特定の部位でポリペプチドを開裂するかまたはペプ
チド鎖のアミノ末端もしくはカルボキシル末端からペプチドを消化する（例えば
、ジアミノペプチダーゼ）多様なペプチダーゼ（例えば、トリプシン）が知られ
ている。さらに、特定の化学物質（例えば、臭化シアン）はポリペプチド鎖を特
定の部位にて開裂するであろう。当業者は、部位特異的な内部開裂部位を組み込
むためアミノ酸配列（および組換え法を使用する場合には合成または半合成コー
ディング配列）に修飾が必要であること認めるであろう。例えば、カーター（Ｃ
arter Ｐ.）、サイト・スペシフィック・プロテオリシス・オブ・フュージョン
・プロテインズ（Ｓite Ｓpecific Ｐroteolysis of Ｆusion Ｐroteins）、第
１３章、プロテイン・ピュアリフィケーション：フロム・モレキュラー・メカニ ズムズ・トゥー・ラージ・スケール・プロセスィズ（Ｐrotein Ｐurification： Ｆrom Ｍolecular Ｍechanisms to Ｌarge Ｓcale Ｐrocesses）
中、アメリカン
・ケミカル・ソサイエティー（Ａmerican Ｃhemical Ｓoc.）、ワシントンＤ．
Ｃ、（１９９０）参照。
ｃ.ベクター構築
所望のコーディング配列および調節配列を含む適当なベクターの構築には標準
ライゲーション技術を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を開裂し、
結合し、ついで必要とするプラスミド形成するための望ましい形態にて再度ライ
ゲーションする。
所望のタンパク質の翻訳を行うため、適当な制限エンドヌクレアーゼの使用に
より適当な過剰の組換えＤＮＡ発現ベクターに遺伝子操作した合成ＤＮＡ配列を
挿入する。合成コーディング配列は、転写物のいずれかの末端に制限エンドヌク
レアーゼ開裂部位を有することにより、これら発現プラスミドおよび増幅発現プ
ラスミドからの単離および該プラスミドへの組み込みを容易にするよう設計され
ている。該単離したｃＤＮＡコーディング配列は、合成リンカーを使用すること
により、当該技術分野においてよく知られた技術により所望のクローニングベク
ター中に該配列を組み込むことを容易にすべく容易に修飾できる。使用した特定
のエンドヌクレアーゼは、使用すべき親発現ベクターの制限エンドヌクレアーゼ
開裂パターンによって規定されるであろう。制限部位の選択は、調節配列を有す
るコーディング配列が、特許請求されたタンパク質の適切なイン・フレームでの
読み取りおよび発現を達成できるように適切な方向になるよう選択する。
一般に、宿主細胞と調和する種由来のプロモーターおよび調節配列を含むプラ
スミドベクターをこれらの宿主とともに使用する。該ベクターは通常、複製部位
並びに形質転換した細胞中での表現型選択を提供することができるマーカー配列
を有する。例えば、Ｅ.coli（大腸菌）は典型的に大腸菌種由来のプラスミドで
あるｐＢＲ３２２を用いて形質転換する（ボリバー（Ｂolivar）ら、Ｇene ２：
９５（１９７７））。プラスミドｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイ
クリン耐性の遺伝子を含み、従って形質転換した細胞を容易に同定する手段を提
供する。該ｐＢＲ３２２プラスミドまたは他の微生物プラスミドはまた、組換え
ＤＮＡ技術において通常使用されるプロモーターその他の調節要素を含むかまた
は含むように修飾されなければならない。
所望のコーディング配列は、プロモーターおよびリボソーム結合部位から転写
されるように発現ベクターに適切な方向にて挿入され、プロモーターおよびリボ
ソーム結合部位の両者は、該タンパク質が発現される宿主細胞において機能的で
なければならない。そのような発現ベクターの例は、ベラガージュ（Ｂelagaje
）らの米国特許第５,３０４,４９３号（その教示を参照のため本明細書に引用す
る）に記載されたプラスミドである。米国特許第５,３０４,４９３号に記載され
たＡ−Ｃ−Ｂプロインシュリンをコードする遺伝子は、制限酵素ＮdeＩおよびＢ am
ＨＩによりプラスミドｐＲＢ１８２から除去することができる。本発明のタン
パク質をコードする遺伝子は、ＮdeＩ／ＢamＨＩ制限断片カセット上にて該プラ
スミド骨格に挿入することができる。
ｄ.原核生物発現
一般に、原核生物は、本発明において有用なベクターを構築するに際してＤＮ
Ａ配列のクローニングに使用する。例えば、大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ受
託番号第３１４４６号）は特に有用である。使用できる他の微生物株には大腸菌
Ｂおよび大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ受託番号第３１５３７号）が含まれる。こ
れらの例は制限するものではなく例示にすぎない。
原核生物はまた発現にも使用する。上記株ならびに大腸菌Ｗ３１１０（原栄養
株、ＡＴＣＣ受託番号第２７３２５号）、バシラス・サチリス（Ｂacillus subt
ilis）などの桿菌、およびサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓalmonella typhim
urium）またはセラチア・マルセスセンス（Ｓeratia marcescens）などの他の腸
内細菌、および種々のシュードモナス種が使用できる。原核生物宿主に使用する
のに適したプロモーターには、β−ガラクトシダーゼ（ベクターｐＧＸ２９０７
［ＡＴＣＣ受託番号第３９３４４号］はレプリコンおよびβ−ラクタマーゼ遺伝
子を含む）およびラクトースプロモーター系（チャン（Ｃhang）ら、Ｎature、２７５
：６１５（１９７８）；およびゲッデル（Ｇoeddel）ら、Ｎature ２８１
：５４４（１９７９））、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）
プロモーター系（ベクターｐＡＴＨ１［ＡＴＣＣ受託番号第３７６９５号］はｔ
ｒｐプロモーターの制御下でtrpＥ融合タンパク質としてオープン・リーディン
グ・フレームの発現を容易にすべく設計されている）およびtacプロモーター(プ
ラスミドｐＤＲ５４０ ＡＴＣＣ受託番号第３７２８２号から単離)などのハイブ
リッドプロモーターが含まれる。しかしながら、ヌクレオチド配列が一般に知ら
れている他の機能性の細菌プロモーターは、必要な制限部位を提供するためにリ
ンカーまたはアダプターを用いて当業者がタンパク質をコードするＤＮＡに該プ
ロモーターをライゲーションすることを可能にする。細菌系において使用するプ
ロモーターはまた、タンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に連結したシャイ
ン−ダルガノ配列をも含むであろう。
ｅ.真核生物発現
該タンパク質は真核生物発現系において組換えにより産生されてよい。哺乳動
物宿主細胞中での転写を制御する好ましいプロモーターは、多様な採取源、例え
ば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロ
ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサイトメガロウイルスなどの
ウイルスのゲノムから、または異種哺乳動物プロモーター、例えばβ−アクチン
プロモーターから得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよ
び後期プロモーターはＳＶ４０制限断片として都合よく得られ、該断片はまたＳ
Ｖ４０ウイルスの複製起点をも含む。フィアーズ（Ｆiers）ら、Ｎature、２７ ３
：１１３（１９７８）。ＳＶ４０全ゲノムはプラスミドｐＢＲＳＶ、ＡＴＣＣ
受託番号第４５０１９号から得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即時初期プ
ロモーターはプラスミドｐＣＭＢβ（ＡＴＣＣ受託番号第７７１７７号）から得
られる。勿論、宿主細胞または関連種からのプロモーターもまた本発明において
有用である。
特許請求されているタンパク質をコードするＤＮＡの高等真核生物による転写
は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加する。エンハンサ
ーはＤＮＡのシス−作用性要素であり、通常約１０−３００ｂｐであり、プロモ
ーターに作用してその転写を増大させる。エンハンサーは方向および位置に対し
て比較的に独立であり、転写ユニットの５'側（レイミンズ（Ｌaimins，Ｌ.）ら
、ＰＮＡＳ ７８：９９３（１９８１））および３'側（ラスキー（Ｌusky，Ｍ.
Ｌ.）ら、Ｍol.Ｃell Ｂio. ３：１１０８（１９８３））、イントロン内（バネ
ルジ（Ｂanerji，Ｊ.Ｌ.）ら、Ｃell ３３：７２９（１９８３））並びにコーデ
ィング配列自体内（オズボーン（Ｏsborne，Ｔ.Ｆ.）ら、Ｍol.Ｃell Ｂio. ４
：１２９３（１９８４））において認められている。現在、多くのエンハンサー
配列が哺乳動物遺伝子（グロビン、ＲＳＶ、ＳＶ４０、ＥＭＣ、エラスターゼ、
アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）から知られている。し
かしながら、典型的には、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーが使用され
るであろう。例としては、ＳＶ４０後期エンハンサー、サイトメガロウイルス初
期プ
ロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、およ
びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたはその他の多細
胞生物からの有核細胞）中で使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影
響を及ぼす転写の終結に必要な配列を含むであろう。これらの領域は、ｍＲＮＡ
コーディングタンパク質の非翻訳部位におけるポリアデニル化セグメントとして
転写される。３'非翻訳領域はまた、転写終結部位をも含む。
発現ベクターはまた選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含んでいてよい。
哺乳動物細胞の適当な選択マーカーの例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨ
ＦＲ、ｐＪＯＤ−１０［ＡＴＣＣ受託番号第６８８１５号］のＢglII／ＨindIII
制限断片に由来するものであってよい）、チミジンキナーゼ（単純ヘルペスウイ
ルスのチミジンキナーゼはｖＰ−５クローン［ＡＴＣＣ受託番号第２０２８号］
のＢamＨＩ断片に含まれる）またはネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子（ｐＮ
Ｎ４１４酵母人工染色体ベクター［ＡＴＣＣ受託番号第３７６８２号］から得る
ことができる）である。そのような選択マーカーがうまく哺乳動物宿主細胞中に
移されると、トランスフェクションされた哺乳動物宿主細胞は選択圧の下に置か
れたときに生存可能である。選択法（selective regimes）として広く使用され
ている２つの異なるカテゴリーが存在する。第一のカテゴリーは細胞の代謝に基
づくものであり、補足された培地なしでは増殖することができない突然変異株の
使用に基づく。２つの例は：ＣＨＯ ＤＨＦＲ-細胞（ＡＴＣＣ受託番号第ＣＲＬ
−９０９６号）およびマウスＬＴＫ-細胞（Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）ＡＴＣＣＣ ＣＬ−
２.３）である。これらの細胞は、チミジンやヒポキサンチンなどの栄養素の添
加なしには増殖することができない。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経
路に必要なある種の遺伝子を欠如しているため、該細胞は欠失したヌクレオチド
が補足培地中で提供されない限り生存できない。培地を補足することの代替法は
、完全なＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子をそれぞれの遺伝子を欠如している細
胞に導入し、それによって、該細胞の増殖条件を変えることである。ＤＨＦＲ遺
伝子またはＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は補足されていない培
地
中では生存できないであろう。
第２のカテゴリーは優性選択であり、これはいずれの細胞タイプにもおいて使
用される選択機構をいい、突然変異株の使用を必要としない。これらの機構では
典型的に宿主細胞の増殖を阻止する薬剤を使用する。新規な遺伝子を有する細胞
は薬剤耐性を伝達するタンパク質を発現し、その選択を生き残るであろう。その
ような優性選択の例では、薬剤のネオマイシン、サザン（Ｓouthern Ｐ.）およ
びバーグ（Ｂerg，Ｐ.）、Ｊ.Ｍolec.Appl.Ｇenet. １：３２７（１９８２）、
ミコフェノール酸、ミュリガン（Ｍulligan，Ｒ.Ｃ.）およびバーグ、Ｓcience ２０９
：１４２２（１９８０）、またはハイグロマイシン、サグデン（Ｓugden,
Ｂ.）ら、Ｍol.Ｃell Ｂiol. ５：４１０−４１３（１９８５）を使用する。上
記に掲げた３つの例では、それぞれ適当な薬剤、Ｇ４１８またはネオマイシン（
ジェネチシン）、xgpt（ミコフェノール酸）またはハイグロマイシンに対する耐
性を付与すべく真核生物の制御の下に細菌遺伝子を使用する。
真核生物の発現の好ましいベクターはｐＲｃ／ＣＭＶである。ｐＲｃ／ＣＭＶ
はインビトロジェン・コーポレーション（Ｉnvitrogen Ｃorporation）、３９８
５ ソレント・バレイ・ブールバード、サンディエゴ、カリフォルニア９２１２
１から市販されている。構築したプラスミド中の配列が正確か確認するため、ラ
イゲーション混合物を用いて大腸菌Ｋ１２株ＤＨ５ａ（ＡＴＣＣ受託番号第３１
４４６号）を形質転換し、ついで首尾よい形質転換体を抗生物質耐性により適切
に選択する。形質転換体からのプラスミドを、メッシング（Ｍessing）らの方法
（Ｎucleic Ａcids Ｒes. ９：３０９（１９８１））によって制限および／また
は配列により調製、分析する。
宿主細胞を本発明の発現ベクターで形質転換し、ついでプロモーターの誘導、
形質転換体の選択、または遺伝子の増幅のために適切であるように修飾した通常
の栄養培地において培養する。その培養条件（温度、ｐＨなど）は、発現につい
て選択した宿主細胞で以前に使用したものであり、当業者には明らかであろう。
上記ベクターで細胞を形質転換する技術は当該技術分野においてよく知られてお
り、マニアチスら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュア ル
、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９
）またはカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃur rent Ｐrotocols in Ｍolecular Ｂiology
）（１９８９）および補遺などの概説
参照文献に記載されている。
高等真核生物における特許請求されたタンパク質をコードするベクターを発現
するのに適した宿主として好ましいものは以下のものである：ＳＶ４０により形
質転換されたアフリカミドリザル腎細胞株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１
６５１）；形質転換したヒト初代胎児（human primary embryonal）腎細胞株２
９３（グラハム（Ｇraham，Ｆ.Ｌ.）ら、Ｊ.Ｇen Ｖirol. ３６：５９−７２（
１９７７）、Ｖirology ７７：３１９−３２９、Ｖirology ８６：１０−２１）
；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１
０、Ｖirology １６：１４７（１９６２））；チャイニーズハムスター卵巣細胞
ＣＨＯ−ＤＨＦＲ-（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ
４、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７１５、Ｂiol.Ｒeprod. ２３：２４３−２５０（１９
８０））；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ ７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５
８７）；ヒト頸部上皮癌腫細胞（ＨeＬa、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）；イヌ腎細胞
（ＭＤＣＫ ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３
Ａ）ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４４２）；ヒト２倍体肺細胞（ＷＩ−３８、ＡＴＣＣ
ＣＣＬ−７５）；ヒト肝細胞癌腫細胞（Ｈep Ｇ２、ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６５）
；およびマウス乳腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）。
ｆ.酵母発現
原核生物に加えて、酵母培養体などの真核微生物も使用されてよい。サッカロ
ミセス・セレビシエ（Ｓaccharomyces serevisie）、すなわち通常のパン酵母が
最もよく使用される真核微生物であるが、他の多くの株が一般に利用できる。サ
ッカロミセス中での発現には、例えば、プラスミドＹＲｐ７（ＡＴＣＣ−４００
５３、スティンチコーム（Ｓtinchcomb）ら、Ｎature ２８２：３９（１９７９
）；キングスマン（Ｋingsman）ら、Ｇene ７：１４１（１９７９）；チェンパ
ー
（Ｔschemper）ら、Ｇene １０：１５７（１９８０））が一般に使用される。こ
のプラスミドは既にｔｒｐ遺伝子を含有しており、トリプトファン中で増殖する
能力を欠如した酵母の突然変異体株、例えば、ＡＴＣＣ受託番号第４４０７６号
またはＰＥＰ４−１（ジョーンズ（Ｊones）、Ｇenetics ８５：１２（１９７７
））のために選択マーカーを提供する。
酵母宿主で使用するのに適したプロモーティング配列には、３−ホスホグリセ
リン酸キナーゼ（プラスミドｐＡＰ１２ＢＤ ＡＴＣＣ受託番号５３２３１号に
おいて見いだされ、１９９０年６月１９日に発行された米国特許第４,９３５,３
５０号に記載されている）または他の解糖系酵素、例えば、エノラーゼ（プラス
ミドｐＡＣ１ ＡＴＣＣ受託番号第３９５３２号において見いだされる）、グリ
セルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（プラスミドｐＨｃＧＡＰＣ１Ａ
ＴＣＣ受託番号第５７０９０号、５７０９１号に由来）、ザイモモナス・モビリ
ス（zymomonas mobilis）（１９９１年３月１９日に発行された米国特許第５,０
００,０００号）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフ
ルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン
酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグル
コースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのプロモーターが含まれる。
他の酵母プロモーターは、増殖条件によって制御される転写のさらに別の利点
を有する誘導性プロモーターであるが、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシ
トクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオ
ネイン（プラスミドベクターｐＣＬ２８ＸhoＬＨＢＰＶ ＡＴＣＣ受託番号第３
９４７５号、米国特許第４,８４０,８９６号に含まれる）、グリセルアルデヒド
３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース（プラスミ
ドｐＲＹ１２１ ＡＴＣＣ受託番号第３７６５８号上に見いだされるＧＡＬ１）
の利用に関与する酵素のプロモーター領域である。酵母発現において使用するの
に適したベクターおよびプロモーターはさらに、ヒッツェマン（Ｒ.Ｈitzeman）
らのヨーロッパ特許公開第７３,６５７Ａ号にさらに記載されている。サッカロ
ミセス・セレビシエ由来のＵＡＳ Ｇalなどの酵母のエンハンサー（プラスミド
ＹＥpsec--hI1β ＡＴＣＣ受託番号第６７０２４号上のＣＹＣ１プロモーターと
ともに見出される）もまた、酵母プロモーターと共に都合よく使用される。
下記実施例を、特許請求されるタンパク質の調製をさらに説明するために提供
する。本発明の範囲は下記実施例からのみなるものと解釈されるべきではない。
実施例 １
ベクターの構築
配列番号：１２の遺伝子を化学的に合成したオリゴヌクレオチドに由来する〜
２２０塩基対から〜２４０塩基対セグメントを組み立てる。
２２０塩基対セグメントは、コーディング領域内の２２０位のＮdeＩ部位からＸ
baＩ部位まで広がり、３４から８３塩基の間にわたる長さの範囲にある７つの重
複オリゴヌクレオチドから組み立てられる。ＸbaＩからＢamＨＩまでに広がる２
４０塩基対セグメントはまた、５７から９２塩基の間の長さにわたる範囲にある
７つの重複オリゴヌクレオチドから組み立てられる。
これらの断片を組み立てるために、それぞれ７つのオリゴヌクレオチドを等量
モル、通常は１μリットル当たり約１−２ピコモルの濃度にて混合する。組み立
て前にセグメントの５''末端のオリゴヌクレオチドを除くすべてを試薬の提供者
によって特定された条件を使用してＴ４ ＤＮＡキナーゼを用いた標準キナーゼ
バッファー中でリン酸化した。その混合物を９５℃に熱し、１−２時間かけてゆ
っ
くりと室温にまで放冷し、オリゴヌクレオチドの適切なアニーリングを確実にす
る。ついでそのオリゴヌクレオチドを互いにＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いてｐＵ
Ｃ１８またはｐＵＣ１９などの適切化したクローニングベクターにライゲーショ
ンする。そのバッファーおよび条件は酵素の供給者によって推奨されたものであ
る。使用前に、２２０塩基対断片のベクターはＮdeＩおよびＸbaＩにて消化し、
一方２４０塩基対断片のベクターは使用前にＸbaＩおよびＢamＨＩにて消化する
。そのライゲーション混合物を大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞（ギブコ／ＢＲＬから市販
されており入手可能である）を形質転換し、ついで形質転換した細胞を１００μ
g／mlのアンピシリン、Ｘ−galおよびＩＰＴＧを含むトリプシン−酵母（ＴＹ）
プレートにプレーティングする。一夜増殖させたコロニーを１００μｇ／mlのア
ンピシリンを含む液体ＴＹ培地中で増殖させ、プラスミドの単離およびＤＮＡ配
列分析に使用する。完全な遺伝子を組み立てるため、正確な配列を有するプラス
ミドを保持する。これは２２０塩基対および２４０塩基対断片のゲル精製および
Ａ−Ｃ−Ｂプロインシュリンのコーディング配列が欠失され、ＮdeＩおよびＢam
ＨＩによって使用前に消化されるｐＲＢ１８２などの発現ベクターにこれらの２
つの断片をライゲーションすることにより行う。
実施例 ２
所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドをＰmlＩおよびＢ
su３６Ｉにて消化する。これらの酵素の認識配列はそれぞれ２７５位のヌクレオ
チドおよび３６０位のヌクレオチドでのタンパク質のコーディング領域内にある
。そのクローニングベクターはこれらの認識配列を含まない。結果的にただ２つ
の断片がＰmlＩおよびＢsu３６Ｉにて制限酵素消化して見られ、１つはベクター
断片に対応するもの、他方はタンパク質コーディング配列内から遊離した〜８５
塩基対断片に対応するものである。この配列は表１に列挙しているアミノ酸置換
をコードするＤＮＡ配列によって置換することができる。これらのＤＮＡ配列は
化学的に２つのオリゴヌクレオチドが互いに相補的な塩基であるように合成され
、ＰmlＩおよびＢsu３６Ｉによる消化によって産生された末端と一致する。その
化
学的に合成されたオリゴヌクレオチドを等量モル（１−１０ピコモル／μリット
ル）で混合し、９５℃に加熱し、ついで温度を２０−２５℃にまでゆっくりと放
冷することによりアニーリングさせることができる。そのアニーリングしたオリ
ゴヌクレオチドを標準ライゲーション反応において使用する。ライゲーション産
物を形質転換し、ついで実施例１に記載されたように分析する。
実施例 ３
Ｍet Ａrgリーダー配列を有する表１中のタンパク質２５５によって代表され
るタンパク質をコードするＤＮＡ配列を実施例２に記載されるプラスミドおよび
手続きを使用して得る。そのプラスミドをＰmlＩおよびＢsu３６Ｉにて消化する
。
配列番号：１３の５''配列：
配列番号：１４の５'配列：
とアニーリングした合成ＤＮＡ配列は、ＰmlＩおよびＢsu３６Ｉ部位の間に挿入
した。ライゲーション、形質転換およびプラスミドの単離に続いて合成断片の配
列をＤＮＡ配列分析によって正確であることを確認した。
実施例 ４
Ｍet Ａrgリーダー配列を有する配列番号：４をコードするＤＮＡ配列を実施
例２に記載されるプラスミドおよび手続きを使用して得る。そのプラスミドをＰ
mlＩおよびＢsu３６Ｉにて消化する。配列番号：１５の５''配列：
配列番号：１６の５'配列：
とアニーリングした合成ＤＮＡ配列は、ＰmlＩおよびＢsu３６Ｉ部位の間に挿入
した。ライゲーション、形質転換およびプラスミドの単離に続いて合成断片の配
列をＤＮＡ配列分析によって正確であることを確認した。
上記ベクターで細胞を形質転換する技術は当該技術分野においてよく知られて
おり、マニアチスら（１９８８）モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリ ー・マニュアル
、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
クまたはカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（１９
８９）および補遺などの概説参照文献に記載されている。本明細書に例示するよ
うな発明の好ましい実施態様において使用する大腸菌細胞の形質転換に関する技
術は当該技術分野においてよく知られている。形質転換された大腸菌細胞を培養
する正確な条件は、使用した大腸菌宿主細胞株および使用された発現ベクターま
たはクローニングベクターの性質に依存する。例えば、ｃ１８５７の熱誘導性λ
−ファ−ジプロモーター−オペレーター領域などの熱誘導性プロモーター−オペ
レーター領域を組み込んだベクターは、タンパク質の合成を誘導するのに培養条
件において約３０℃から４０℃への温度変化を必要とする。
本発明の好ましい態様においては大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８細胞を宿主細胞と
して使用する。以下に限られるものではないが、例えば大腸菌Ｋ１２、Ｌ２０１
、Ｌ６８７、Ｌ６９３、Ｌ５０７、Ｌ６４０、Ｌ６４１、Ｌ６９５、Ｌ８１４（大腸菌
Ｂ）などのその他の多数の細胞株も利用することができる。ついで形質転
換した宿主細胞を、発現プラスミド上に存在する耐性遺伝子に応じて抗生物質の
選
択圧下で適切な培地上にプレーティングする。ついで使用した宿主細胞株に適し
た時間および温度にて培養物をインキュベーションする。
高レベル細菌発現系で発現されたタンパク質は過剰発現タンパク質を高レベル
で発現する顆粒または封入体として化学的に凝集する。クロイガー（Ｋreuger）
ら、プロテイン・フォールディング（Ｐrotein Ｆolding）中、ギーラッシュ（
Ｇierasch）およびキング（Ｋing）編、１３６−１４２頁（１９９０）、アメリ
カン・アソシエイション・フォー・ジ・アドバンスメント・オブ・サイエンス（
Ａmerican Ａssociation for the Ａdvancement of Ｓcience）公開番号８９−
１８Ｓ、ワシントンＤ．Ｃ.。このようなタンパク質の凝集物はさらに所望のタ
ンパク質産物の精製および単離をするために可溶化しなければならない。上記。
タンパク質を可溶化するためグアニジウムＨＣｌなどの強変性溶液および／また
は尿素などの弱変性溶液を用いた種々の技術を使用する。溶液中の変性薬剤を徐
々に（しばしば透析により）除去することにより、変性タンパク質が天然の形態
を回復することが可能になる。変性および折り畳みの特定の条件は特定のタンパ
ク質発現系および／または問題となっているタンパク質によって決定される。
実施例 ５
Ｍet Ａrgリーダー配列を有する実施例３のタンパク質を大腸菌に発現させ、
ＰＢＳまたは８Ｍ 尿素（両者とも５mＭのシステインを含有する）に希釈するこ
とによって単離しついで折り畳み、ついでＰＢＳに対して完全透析（ezhaustive
dialysis）を行う。タンパク質の集合は全くないかまたは殆どこれらのいずれの
手続き中にも見られない。サイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質の
最終精製の後、そのタンパク質をＰＢＳ中３−３.５mg／mＬに濃縮した。実質的
にそのタンパク質の集合がないことを実際の集合が濃度に関して見られる本来の
ヒトのタンパク質に対比して記録した。
逆相ＨＰＬＣによるタンパク質の分析はヒトＯｂタンパク質が約５６.６％の
アセトニトリルで、マウスタンパク質は５５.８％で、ついでＭet Ａrgリーダー
配列を有する表題のタンパク質は５３.７％にて溶出されることを示した。従っ
て、意外にも、マウスのインサートを有するヒトは、ヒトまたはマウス分子のい
ずれかより高い親水性を有するようである。
実施例 ６
Ｍet Ａrgリーダー配列を有する配列番号：４のタンパク質を大腸菌に発現さ
せる。顆粒を単離し、ついで５mＭのシステインを有する８Ｍの尿素中に可溶化
する。そのタンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製し、つい
で８Ｍの尿素（５mＭのシステインを含む）に希釈することにより折り畳み、つ
いで上記実施例と同様の技術によってＰＢＳに対して完全に透析する。そのタン
パク質溶液のｐＨを約２.８にまで低下させる。そのＭet Ａrgリーダー配列をタ
ンパク質１mgあたり６−１０ミリ単位のｄＤＡＰを加えることによって開裂する
その変換反応を室温で２−８時間進めた。その反応の進行を高性能逆相クロマト
グラフィーによってモニターした。その反応をＮaＯＨにてｐＨを８に調製する
ことにより停止させた。そのdes（Ｍet-Ａrg）タンパク質をさらに７−８Ｍの尿
素の存在下にて陽イオン交換クロマトグラフィーおよびＰＢＳ中でのサイズ排除
クロマトグラフィーによって精製した。サイズ排除クロマトグラフィーによって
タンパク質を最終的に精製した後で、タンパク質をＰＢＳ中の３−３.５mg／mＬ
に濃縮した。実質的にそのタンパク質の凝集がないことを実際の凝集が濃度に関
して見られる本来のヒトのタンパク質に対比して認識した。
本タンパク質をリーダー配列で発現させるのが好ましい。作動可能なリーダー
配列は当業者に公知である；しかしながら、好ましいリーダー配列はＭet-Ｒ1−
で、式中Ｒ1はＰroを除く任意のアミノ酸であって、その結果発現されたタンパ
ク質は容易にカセプシンＣ（ＣathepsinＣ）で特許請求されたタンパク質に変換
される。好ましくはＲ1はＡrg、ＡspまたはＴyrである；および最も好ましくは
そのタンパク質はＭet-Ａrgリーダー配列を伴って発現する。興味深いことには
、そのリーダー配列は活性化タンパク質の安定性または活性にはそれほど影響し
ない。しかしながら、そのリーダー配列はそのタンパク質から開裂されるのが好
ましい。従って、式のタンパク質：Ｍet-Ｒ1−配列番号：１は、生物学的薬剤と
し
て有用であり、中間体として好ましい。
特許請求されたタンパク質の精製は当該技術分野において公知の技術である、
逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを含む。
特許請求されたタンパク質は２つのシステイン残基を含む。従って、ジスルフ
ィド結合が形成されてタンパク質が安定化される。本発明は式（Ｉ）または（II
）のタンパク質で式中の９６位のＣysが１４６位のＣysに架橋したタンパク質、
ならびにこのようなジスルフィド結合を形成していないタンパク質を含む。さら
に、本発明のタンパク質はとりわけ製剤化したときに二量体、三量体、四量体お
よびその他の多量体として存在する。このような多量体も本発明の範囲に含まれ
る。
本発明は肥満症を処置する方法を提供する。該方法は、抗肥満症タンパク質の
有効量を約１〜１０００μg／kgの間の投与量にて生物体に投与することを含む
。好ましい投与量は約１０〜１００μg／kgの活性化合物である。ヒト成人に対
する典型的な１日当たりの投与量は約０.５〜１００mgである。該方法を実施す
る際、式（Ｉ）の化合物を１日投与量を１回で投与するかまたは数回で投与する
ことができる。処置計画には長期間にわたる投与が必要であるかもしれない。１
回の投与当たりの投与量または総投与量は医師により決定され、ついで疾患の性
質および重篤度、患者の年齢および一般的な健康状態および該化合物に対する耐
性などの因子に依存するであろう。
本発明はさらに、本発明の化合物を含む医薬製剤を提供する。好ましくは製薬
学的に許容し得る塩の形態のタンパク質を、肥満症の治療学的または予防学的な
処置のための非経口投与のために調合することができる。例えば、式（Ｉ）の化
合物を従来の製薬学的担体および賦形剤と混合することができる。特許請求され
るタンパク質を含む組成物は、好ましくは可溶性の形態にて、約０.１〜９０重
量％、一般的には１０〜３０％を含む。さらに、本発明のタンパク質は単独で、
さらにまたは他の抗肥満症または糖尿病を処置するのに有用な薬剤と組み合わせ
て投与されてよい。
静脈内（ｉｖ）で使用するため、該タンパク質を通常使用される静脈液中にて
、
注入により投与する。例えば、生理食塩水、リンガー液または５％のデキストロ
ース溶液などの液体が使用できる。
筋肉内注射製剤のためには、滅菌製剤、好ましくは式（Ｉ）または（II）のタ
ンパク質の適切な可溶性塩の形態、例えば塩酸塩を発熱物質不含の水（蒸留）、
生理食塩水または５％のグルコース溶液などの製薬学的希釈剤中にて溶解および
投与することができる。適切な不溶性形態の該化合物は水性基剤または製薬学的
に許容し得る油基剤、例えばオレイン酸エチルなどの長鎖脂肪酸エステル中の懸
濁液として調製および投与してよい。
本化合物の肥満症を処置する能力は下記のようにイン・ビボで示される。
生物学的試験
パラビオーゼ実験はタンパク質が末梢脂肪組織により放出されること、該タン
パク質が正常ならびに肥満症マウスの体重の増加を制御することができることを
示唆している。故に、最も密接に関連した生物学的実験は、被験物質を幾つかの
投与経路（例えば、静脈内、皮下、腹腔内またはミニポンプまたはカニューレに
より）にて注射し、ついで、食物および飲料の摂取、体重増加、血，漿化学また
はホルモン（グルコース、インシュリン、ＡＣＴＨ、コルチコステロン、ＧＨ、
Ｔ４）を多様な期間経過でモニターすることである。
適切な試験動物には、正常マウス（ＩＣＲなど）および肥満症マウス（ｏｂ／
ｏｂ、Ａvy／a、ＫＫ−Ａｙ、tubby、fat）を含む。肥満症および糖尿病のｏｂ
／ｏｂマウスモデルは当該技術分野においては肥満症状態を示すものとして一般
に受け入れられている。これらの注射の非特異的な作用のための対照は、同じパ
ラメーターをモニターする同じ動物において活性成分を含有するかまたは含有し
ない同様の組成中のビヒクルを用い、またはその受容体を欠如していると思われ
る動物（ｄｂ／ｄｂマウス、ｆａ／ｆａまたはｃｐ／ｃｐラット）において、活
性剤自体を用いて行う。これらモデルにおいて、活性を示すタンパク質は、他の
哺乳動物、とりわけヒトにおいても同様の活性を示すであろう。
その標的組織は食物摂取および脂質形成状態を制御する視床下部にあると思わ
れるので、被験物質を脳へ直接（例えば、側脳室または第三脳室を介したｉ.ｃ.
ｖ.注射または特定の視床下部の核（例えば、弓状核、傍室核、辺縁弓核（perif
ornical））に直接注入することも同様のモデルである。上記と同様のパラメー
ターを測定するか、または摂食または代謝を制御すると知られている神経伝達物
質の放出（例えば、ＮＰＹ、ガラニン、ノルエピネフリン、ドーパミン、β−エ
ンドルフィン放出）をモニターできる。
表２中に概説してある代表的なタンパク質は、本明細書中に提供された教示お
よび実施例に従って調製した。表２、表３に続くタンパク質の記載は式Ｉに提供
されたように配列番号：３の置換したアミノ酸を示している。例えば、Ａla（１
００）は配列番号：３のタンパク質で式中、第１００位のＴrpがＡlaであること
を示している。Ｍet Ａrgの表示は、そのタンパク質を付着したＭet Ａrgリーダ
ー配列を有して調製しついで試験することを示している。表２および３のタンパ
ク質のアミノ酸配列は拡大実体顕微鏡および／またはアミノ酸分析によって確認
された。本タンパク質のＯＢ／ＯＢマウス中の肥満症を処置する能力をもまた表
２に示す。
同様の実験を灌流または組織浴系（tissue bath system）中で単離した視床下
部組織を用いてイン・ビトロにおいて行う。この場合は、神経伝達物質の放出ま
たは電気生理学的な変化をモニターする。本化合物の生理学および化学的特性を
以下に示す。
振盪試験
出発溶液はリン酸緩衝食塩水（ギブコＢＲＬ、リン酸カルシウムまたはリン酸
マグネシウムなしのダルベッコＰＢＳ（Ｄulbecco's ＰＢＳ）、ライフ・テクノ
ロジーズ、インク（Ｌife Ｔechnologies，Ｉnc．）、グランド・アイランド（
Ｇrand Ｉsland）、ニューヨーク）中の精製したＯｂタンパク質を含む。そのタ
ンパク質濃度は吸光度２８０nmにより一般的に決定する。しかしながら、別法で
は０.５またはまたは１mg／mＬより少ない溶液の１cmキュベット中にての吸光度
が、理論値で２８０nmであるタンパク質を使用する。総取り込みピーク領域を２
５μlのサンプルを分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム（ス
ーパーデックス−７５（Ｓuperdex-７５）、ファルマシア）に注入し、ＰＢＳ中
での周辺温度にて流し、ついで２１４nmにてモニターする。このピーク領域をつ
いで吸光度２８０nmにて最初に決定された濃度のＯｂタンパク質の総ＳＥＣピー
ク領域と比較する。これらの分析から、ＰＢＳで希釈して最終濃度が約１.６mg
／mＬのＯｂタンパク質を各々得る。これらの溶液のアリコートを微量の希酢酸
または希ＮａＯＨを用いてｐＨ５.０、ｐＨ６.０、ｐＨ７.０およびｐＨ８.０に
合わせる。これらのｐＨ調整溶液をついでＵＶ吸収またはＳＥＣ技術によって定
量する。
そのＯｂタンパク質溶液をついで２mＬのガラス・オートサンプラー・バイア
ル（glass autosampler vials）（バリアン・インストルメント・グループ（Ｖa
rian Ｉnstrument Ｇroup）、サニーベール（Ｓunnyvale）、カリフォルニア）
に各々直径が１／８の１５のテフロン球（カーティン・マテソン・サイエンティ
フィック（Ｃuratin Ｍatheson Ｓcientific）、フローレンス（Ｆlorence）、
ケンタッキー）を含むものに加える。空気の泡状物を穏やかに振盪させながらバ
イアル中の溶液から除去する。そのバイアルを上部にてわずかに過剰に充填させ
ついでテフロンでコートした蓋とねじ式キャップで閉じた。分離したバイアルを
評価されるべき各振盪試験時間使用する。
試験バイアルを正確に４０℃に設定したインキュベーター中での回転装置にお
く。そのバイアルを１分間に３０回転の速度でくるくると回転させ、テフロンビ
ーズが溶液が完全に残っている間にバイアル中で穏やかに上下逆転することがで
きるようにする。
前以て決定していた時間の後、バイアルの内容物を除去し、ついで周辺温度に
て５分間遠心する（フィッシャー・サイエンティフィック・モデル（Ｆisher Ｓ
cientific Ｍodel）２３５Ｃ セントリフュッジ（Ｃentrifuge））。透明な上清
中のタンパク質の濃度を再びＵＶ吸収またはＳＥＣ技術によって決定する。その
溶液中に残存するＯｂタンパク質のパーセンテージをｐＨ調整出発溶液中および
振盪試験の後の上清中のＯｂ濃度から計算する。
本化合物の化学的および物理的安定性を表３に証明する。表３中のタンパク質
の記載は式（Ｉ）中に提供されるように配列番号：３の置換したアミノ酸を示す
。例えば、Ａla（１００）は配列番号：３のタンパク質で式中、第１００位のＴ
rpがＡlaで置換されていることを示している。参照のため、ヒトＯｂタンパク質
およびマウスのｏｂタンパク質もまた示している。
その化合物は少なくとも１つの上記生物学的試験において活性であり、抗肥満
症薬剤である。このように、それらは肥満症および肥満症によって示される障害
の治療に有用である。しかしながら、本発明のタンパク質は治療剤として有用な
だけではない。当業者であれば、本発明のタンパク質が診断に使用するための抗
体産生において有用であり、タンパク質としては動物の食物添加剤として有用で
あることを認識するであろう。さらに、本発明の化合物は哺乳動物において美容
目的のために体重を制御するためにも有用である。美容目的は体の外観をよくす
るために哺乳動物の体重を制御することを追及するものである。哺乳動物は必ず
しも肥満症である必要はない。このような美容目的の使用も本発明の一部を構成
する。
本発明の原理、好ましい態様および実施態様は上記明細書に記載した。しかし
ながら、本明細書において保護しようとする本発明は、開示した特定の態様に制
限されるものではない。というのは、これらの開示は限定ではなく、例示とみな
されるからである。本発明の範囲から逸脱することなく当業者は変更および改変
をなすことができるであろう。
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フロントページの続き
(31)優先権主張番号 ６０／０００，４５０
(32)優先日 1995年６月22日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ６０／００２，１６１
(32)優先日 1995年８月11日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(81)指定国 ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，
ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，Ｔ
Ｄ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ
)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ
，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，
ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，Ｌ
Ｓ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ
，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，
ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ
Ｚ，ＶＮ
(72)発明者 フローラ，デイビッド・ビー
アメリカ合衆国46140インディアナ州 グ
リーンフィールド、300イースト、ノース
5096番
(72)発明者 ヘイル，ジョン・イー
アメリカ合衆国46038インディアナ州 フ
ィッシャーズ、フォレスト・ドライブ7644
番
(72)発明者 ヒース，ウィリアム・エフ・ジュニア
アメリカ合衆国46038インディアナ州 フ
ィッシャーズ、タフトン・ストリート
11214番
(72)発明者 ホフマン，ジェイムズ・エイ
アメリカ合衆国46143インディアナ州 グ
リーンウッド、ウッドランド・ストリーム
ズ・ドライブ4272番
(72)発明者 ショーナー，ブリジット・イー
アメリカ合衆国46157インディアナ州 モ
ンロビア、ボックス30エフ、ルーラル・ル
ート２番