CZ240497A3 - Proteiny proti obezitě a způsob jeho přípravy - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká léčeni obezity a poruch souvisejících s obezitou. Zvláště se vynález týká proteinů proti obezitě, které při podávání pacientovi regulují tukové tkáně.

Dosavadní stav techniky

Obezita a zejména obezita horní části těla je známým a velmi závažným problémem zdravotního stavu veřejnosti ve Spojených Státech a všude ve světě. Podle posledních statistik více než 25 % populace Spojených států amerických a 27 % kanadské populace má nadváhu (Kuczmarskí Amer. J.of Clin.Nutr. 55, str. 495S až 502S (1992), Reeder a kol. Can.Med.Ass.J. 23, str. 226 až 233 (1992). Obezita horní části těla je nezávažnějším rizikovým faktorem známým u diabetes mellitus typu II a je silným rizikovým faktorem u kardiovaskulárních onemocnění a také u rakoviny. Poslední odhady nákladů na obezitu činí v celém světě $ 150 000 000 000. Problém se stal dosti vážným, takže lékaři všeobecně zahájili iniciativu k boji proti stále rostoucí otylosti v americké společnosti.

Velká část patologie zaviněné obezitou může být přičítána silné souvislosti s dyslipidemií, hypertensí a odolností insulinu. Mnohé studie dokázaly, že snižování obezity dietou a cvičením dramaticky redukuje rizikové faktory. Naneštěstí jsou tyto léčebné pochody do velké míry neúspěšné až v 95 procentech. Toto selhávání může souviset se skutečností, že stav je silně závislý na geneticky inherentních faktorech, které přispívají na chuti k jídlu, dávání přednosti kaloricky hodnotným potravinám, ke snížené fyzické činnosti a k rostoucímu lipogenickému matabolisrnu. To znamená, že lidé, kteří zdědili tyto genetické vlohy jsou náchylní k otylosti, nezávisle na snaze bojovat s tímto stavem. Proto je zřejmé, že je žádoucí farmakologické činidlo, které může korigovat tento otylostní «·· * • ¢44/ handikep a umožní lékařům úspěšně léčit pacienty přes jejich genetické dědictví.

Fyziologové už po léta předpokládají, že přejídaní savců vede k nadbytečným tukovým signálům do mozku, tělo je obézní, což zpětně působí na to, aby tělo jedlo méně a spalovalo více paliva (G.R. Hervey, Nátuře 227, str. 629 až 631 (1969). Tento model zpětné vazby“ je podporován parabiotickými pokusy, které implikují cirkulujícími hormony řízenou obezitu.

Myš ob/ob jeanodělem obezity a diabetes/o kterém je známo, že nese autosomální recesivní znak zaměřený na mutaci šestého chromosomu. V poslední době publikovali Yiying Zhank a spolupracovníci poziční klonování myšího genu, řízeného tímto stavem. Yiying Zhank a kol. Nátuře 372, str. 425 až 432 (1994). Tato zpráva objevila klonování genu 167 proteinu aminokyseliny se signálním peptidem 21 aminokyseliny, který je výlučně expresován v tukové tkáni. Podobně uvádí Murakani a kol. (Biochemical and Biophysical Research Communications 109 (3), str. 844 až 952, 1995) klonování a expresi obezitního genu krys. Protein, který je zřejmě zakódován ob- genem je nyní považován za hormon regulující obezitu. Zhank a kol. neuvádějí žádnou farmakologickou aktivitu.

Zjistilo se však, že proteiny, objevené Zhangem a kol., jsou slabými farmakologickými Činidly vzhledem ke své chemické a/nebo fyzikální nestabilitě. Lidský protein například, je t

náchylnější k precipitaci. Farmakologické prostředky přírodního proteinu, obsahující precipitát, zvyšují nebezpečí vytváření imunologické odezvy pacienta. Proto zůstává potřeba vyvinout farmakologická činidla, která zaručí zlepšenou chemickou a fyzikální stabilitu, a která budou užitečná k nápomoci paci€ ntům regulovat jejich chuť k jídlu a metabolismus.

S překvapením se nyní zjistilo, že specifické substituce aminokyse1 inobých zbytků 77, 97 až 111, 118 a/nebo 138 * ·« l[£ proteinu lidské obesity vedou k vynikajícímu farmaceutickému činidlu se zlepšenou stálostí. Tento vynález tedy poskytuje biologicky akt i vní^§bezí Levé—píro te iny. Proteiny podle vynálezu se snáze formulují a skladují. Kromě toho jsou tyto sloučeniny farmaceuticky elegantnější, což znamená vynikající dodávání terapeutických dávek. Taková činidla tudíž pacientům umožňují překonávat jejich obezitní hjjldikap a žít normální život s více normalizovaným rizikem diabetes typu II, kardiovaskulárních onemocnění a rakoviny.

Podstata vynálezu 'Podstatou vynálezu je protein obecného vzorce I (SEQ ID č.:l) (SEQ ID ¢.-. 1)

Val 1

Pro

Ile

Xaa Lys Val Xaa Asp Asp Thr Lys Thr Leu

Ile

Lys 15

Thr

5

10

Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Xaa

Asp

Ile

Ser

His

Xaa

Xaa

Ser

Val

ser

Ser

20

25

30

Lys

Xaa

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu

His

Pro

Ile

35

40

45

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Xaa

Asp

Xaa

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

Xaa

Xaa

Ile

50

55

.60

Leu

Thr

Ser

Xaa

Pro

Ser

Arg

Xaa

Val

Ile

Xaa

Ile

Xaa

Xaa

Asp

Leu

65

70

75

80

•

Glu

Xaa

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys

e·

85

90

95

í

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly

Gly

i

100

105

110

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Xaa

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

Val

Ala

Leu

Ser

Arg

115

120

125

Leu

Xaa

Gly

Ser

Leu

Xaa

Asp

Xaa

Leu

Trp

Xaa

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro

130

135

140

145

Gly Cys (I) • 44 4 99

9 9 9 9

9 9 9 9 » 4 4 444 4

4· · 4

444 44 4

kde : Xaa	v	po 1 oze	4	je
Xaa	v	poloze	7	je
Xaa	v	po1oze	22	je
Xaa	v	poloze	27	je
Xaa	v	poloze	28	je
Xaa	v	poloze	34	je
Xaa	v	poloze	54	je
Xaa	v	poloze	56	je
Xaa	v	po1oze	62	je
Xaa	v	poloze	63	je
Xaa	v	poloze	68	je
Xaa	v	poloze	72	je
Xaa	v	poloze	75	je
Xaa	v	po1oze	77	je
Xaa	v	poloze	78	je
Xaa	v	poloze	82	je
Xaa	v	poloze	118	! j'

Gin, Asn nebo Asp, Gin, Asn nebo Asp,

Gly nebo Leu,

Gin	nebo	Glu,
Gin	nebo	Glu,
Asn,	Asp	nebo Glu,
Thr	nebo	Ala,
Gin,	Glu	nebo chyb í,
Gin	nebo	Glu,
Met,	meth i on i nsulfoxid,
Ala	nebo	Gly
Gin	nebo	Glu,
Gin	nebo	Glu,
Gin	nebo	Glu,
Met,	methioninsulfoxid,
Ala	nebo	Gly
Asn,	Asp	nebo Glu
Gin	nebo	Glu,
Ser	nebo	Ala,

Leu, Ile, Val

Leu, Ile, Val

Xaa v poloze 130 je Gin nebo Glu,

Xaa v poloze 134 je Gin nebo Glu

Xaa v poloze 136 je Met, methiominsulfoxid, Leu, Ile, Val Ala nebo Gly

Xaa v poloze 139 je Gin nebo Glu, pFičemá tento protein má alespoň jednu substituci volenou ze souboru zahrnuj ícího:

His v poloze 97 je nahražen Gin, Asn, Ala, Gly, Ser, nebo Pro, !

·>

Trp	v	poloze 100 je nahražen Ala,	Glu, Asp, n, Val nebo	Asn, Leu,	Met,	Ile.
Phe, Tyr, Ser,	Thr, Gly, G1
Ala	v	poloze 101 je	nahrazen Ser,	Asn, Gly,	His,	Pro,	Thr nebo
		Val;
Ser	v	poloze 102 je	nahražen Arg,
Gly	v	poloze 103 je	nahražen Ala,
Glu	v	po1oze 105 je	nahražen Gin,
Thr	v	poloze 106 je	nahražen Lys	nebo Ser,

«· t· β • · · * ··» · • « « · · · ···« · * » · · · · · »·«· *· ··· ··

Leu	v	po1oze	107	je	nahražen	Pro,
Asp	v	poloze	108	je	nahražen	Glu nebo
Gly	v	poloze	111	je	nahražen	Asp,
Trp	v	poloze	138	je	nahražen	Ala, Glu,	Asp,	Asn, Met,
		Ile, Phe, '	Tyr,	Ser, Thr, Gly, Gin,	Val	nebo Leu,

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.

Vynález se dále týká způsobu léčení obezity spočívajícího v tom, Se se savcům, kteří to potřebují, podává protein obecného vzorce I.

Vynález se dále týká farmaceutického prostředku, který obsahuje protein obecného vzorce I a alespoň jednu přísadu že souboru zahrnujícího farmaceutické ředidlo, nosič nebo excipient.

Způsob přípravy proteinu obecného vzorce X spočívá podle vynálezu v tom, že se ía) transformuje hostitelská buňka DNA, která kóduje protein obecného vzorce I, přičemž protein má případnou vedoucí sekvenci, (b) kultivuje se hostitelská buňka a izoluje se proteinu zakódovaný v operaci (a) a případně íc) se enzymaticky odštěpí vedoucí sekvence za získání proteinu obecného vzorce (I) .

Nadále se používá následujících termínů a zkratek'

Pár bází íbp) - se týká DNA nebo RNA. Zkratky A, C, G a T odpovídají případné 5 -monofosfátové formě nukleotidů (deoxy)adenin, (deoxy)cytidin, (deoxy)guanin a (deoxy)thamin v molekulách DNA. Zkratky U, C, G a T odpovídají případným 5 monofosfátovým formám nukleotidů uracilu, cytidinu, guaninu a thyminu v molekulách RNA. V DNA s dvojím řetězcem se může pár bátl ·· · * · • · · · · · · * · · • ·· · · · · * · '· · * · * Φ · · ··* · φ · · · « · · · ·«·· ·* ··· ·* »· · sí týkat partnerství A s T nebo C s G. V heteroduplexu DNA/ RNA, se můše pár bází týkat partnerství T s U nebo C s G.

DNA -deoxyribonukleová kyselina

EDTA - zkratka ethylendiamintetraoctové kyseliny.

Imunoreaktivní protein(y) - výraz použitý ke kolektivnímu popisu protilátek, fragmentů protilátek schopných vázat antigeny podobné povahy jako je mateřská protilátka, ze které jsou odvozeny a polypeptidové vazné molekuly s jednoduchým řetězcem, jak jsou popsány ve zveřejněné přihlášce . vynálezu PCT číslo PCT/US/02208, mezinárodní zveřejněná přihláška vynálezu číslo HO 88/001649.

mRNA - mediátorm AlM

Plasmid - extrachromosomální samočinně se replikující genetický element.

PMSF - zkratka pro fenylmethylsulfonylfluorid

Reading frame (čtecí rámec) - sekvence nukleotidů, ze které nastává transformace čteni v tripletech translačním aparátem tRNA, ribosomů a souvisejících faktorů, přičemž každý triplet odpovídá příslušné aminokyselině. Jelikož každý triplet je oddělený a má stejnou délku, musí být kódovací sekvence násobkem tří. Inzerce nebo vypuštění (nazývaná mutace posun^St -rámce) může následovat ve dvou různých proteinech, přičemž je kódována tímtéž segmentem DNA. K ujištění o tom, musejí tripletové kodony, odpovídající žádanému polypeptidu, být seřazeny v trojnásobcích od iniciačního kodonu, to znamená, že musí být zachován správný čtecí rámec.

Rekombinantní klonovací vektor DNA - kterékoli autonomně repli kuj ící činidlo zahrnuj í c í, bez j akéhoko1 i v omezen í, pl as midy a fágy obsahující molekuly DNA, k nimž může být přidán nebo byl přidán jeden nebo několik přídavných segmentů DNA.

Rekombinantní expresní vektor DNA - kterýkoli rekombinantní klonovací vektor DNA, do něhož byl začleněn promotor.

Replikon - sekvence DNA, která ovládá nebo připouští autonomní replikaci plasmid nebo jiného vektoru.

RNA - ribonukleová kyselina.

999 9

9 9

9

RO-HPLC - zkratka referzní fázové vysoce výkonné kapalinové chromatograf i e.

Transkripce - proces, kterým se převádí informace obsažená v nukleotidové sekvenci DNA do komplementární sekvence RNA.

Translace - proces, pří kterém se používá genetické 7 informace signální RNA ke specifikování a řízení synthesy polypeptidového řetězce.

( Tris - zkratka pro tris(hydroxymethyl)aminomethan.

[ Treating (ošetřování) - popisuje zařízení a péči o pacienta za účelem boje proti nemoci, stavu nebo poruchy a zahrnuje podávání sloučeniny podle vynálezu k prevenci proti nástupu symptomů nebo komplikací, zmírňující symptomy nebo komplikace nebo k eliminaci nemoci, stavu nebo poruchy. Léčení obezity proto zahrnuje inhibici přijímání potravy, inhibici vzrůstu hmotnosti a navozuje ztrátu hmotnosti u potřebných pacientů.

Vektor - replikon používaný k transformací buněk při gegenové manipulaci, mající polynukleotidové sekvence odpovídající příslušným molekulám proteinu, které při zkombinování s příslušnou kontrolní sekvencí, propůjčují specifické vlastnosti hostitelské buňce, jež je transformována. Vhodnými vektory jsou plasmidy, viry a bakteriofág, jelikož jsou replikony ve své podstatě. Umělé vektory se konstruují rozřezáváním a spojováním molekul DNA 2 různých zdrojů pomocí restrikčních enzymů, a ligandů. Vektory zahrnují rekombinantní klonovací . vektory DNA a rekombinantní expresní vektory DNA.

‘ X-gal - zkratka pro 5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-ga« laktosid.

Zkratky aminokyselin jsou přijaté úřadem United States Patent and Trademark Office podle ustanovení 37 C.R.R. S 1.822 (b)(2) (1993). Pracovníkům oboru je známo, že určité aminokyseliny jsou náchylné k novému uspořádání. Například Asn může být nově uspořádána na asparagovou kyselinu a isoaspartát (I.

• *

«··· ·♦ »44 ·· *·

Schón a kol., Int. J. Peptide Protein Res. 14, str. 485 aš 494, 1979 a tam citované odkazy). Vynález zahrnuje deriváty s novým uspořádáním. Pokud není uvedeno jinak, jsou aminokyseliny v konfiguraci L.

Jak bylo uvedeno shora, týká se vynález proteinu obecného vzorce (I). Vhodný je protein obecného vzorce (II) (SEQ ID 2)

Val

Pro

Ile

Gin

5 Lys

Val

Gin

Asp

Asp

10 Thr

Lys

Thr

Leu

Ile

15 Lys

Thr

Ile

Val

Thr

20 Arg

Ile

Asn

Asp

Ile

25 Ser

His

Thr

Gin

Ser

30 Val

Ser

Ser

Lys

Gin

.35 Lys

Val

Thr

Gly

Leu

40 Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

45 Leu

His

Pró

Ile.

Leu

50 Thr

Leu

Ser

Lys

Met

55 Ašp

Gin

Thr

Leu

Ala

60 Val

Tyr

Gin

Gin

Ile

65 Leu

Thr

Ser

Met

Pro

70 Ser

Arg

Asn

Val

Ile

75 Gin

Ile

Ser

Asn

Asp

80 Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

85 Asp

Leu

Leu

His

Val

90 Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

95 Ser

Cys

His

Leu

Pro

100 Trp

Ala

Ser

Gly

Leu

105 Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

110 Leu

Gly

Gly

Val

Leu

115 Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

120 Ser

Thr

Glu

Val

Val

125 Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

130 Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

135 Asp

Met

Leu

Trp

Gin

140 Leu

Asp

Leu

Ser

Pro

145

Gly Cys (II) kde

Asn	v	po1oze	22	je	případně	Gin	nebo	Asp
Thr	v	poloze	27	je	př í pádně	Ala
Gin	v	poloze	28	je	případně	Glu	nebo	chybí
Met	v	poloze	54	je	př í pádně	Ala
Met	v	poloze	68	je	případně	Leu
Asn	v	po1oze	72	je	případně	Glu	nebo	Asp

- 9 *4 ··

4 4 ·

4 4 · · · ·

4444 4· k 4 44 4

Ser v poloze 77 je případně Ala

Gly v poloze 118 je případně Leu přičemž uvedené proteiny mají alespoň jednu substituci volenou ze souboru zahrnujícího:

His	v	poloze	97	je	nahrašen	Gin, ňsn,	Ala, Gly,Ser nebo Pro,
Trp	v	po1oze	100	je	nahražen	Ala, Glu,	Asp, Asn,Met, Ile, Phe,
					Tyr, Ser,	Thr, Gly,	Gin, Val, nebo Leu,
Ala	v	poloze	101	je	nahražen	Ser, Asn,	Gly, His, Pro, Thr ne-
					bo Val,
Ser	v	poloze	102	je	nahražen	Arg,
Gly	v	poloze	103	je	nahražen	Ala,
Glu	v	poloze	105	je	nahražen	Gin,
Thr	v	po1oze	106	je	nahražen	Lys nebo Ser,
Leu	v	po1oze	107	je	nahražen	Pro,
Asp	v	poloze	108	je	nahražen	Glu,
Gly	v	po1oze	111	je	nahražen	Asp nebo,
Trp	v	po1oze	138	je	nahražen	Ala, Glu,	Asp, Asn, Met, Ile, Phe
					Tyr, Ser,	Thr, Gly,	Gin, Val nebo Leu
nebo	jeho farmaceuticky vhodné soli.
	Výhodné	proteiny mají obecný vzorec II, kde
Trp	v	polo2e	100	je	Gin, Tyr,	Phe, Ile,	Val nebo Leu, nebo
Trp	v	poloze	138	je	Gin, Tyr,	Phe, Ile,	Val nebo Leu.

Výhodný je také protein obecného vzorce III ' (SEQ ID X.: 3)

5

10

15

Val

Pro

Ile

Gin

Lys

; Val

Gin

Asp

i Asp

1 Thr

Lys

Thr

Leu

Ile

Lys

Thr

20

25

30

Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

35

40

45

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu

His

Pro

Ile

55 60

Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tvr Gin Gin Ile

- 10 «« *· • · 9 « • · · * * · 9 •••9 9»

99 99 9999

9 · 9 9 9

9 9 9 9 9 * 9« 999 9

9 9 9 9

999 9· 99 *

65

70

75

80

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

Ile

Gin

Ile

Ser

Asn

Asp

Leu

85

90

95

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys

100

105

110

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly

Gly

115

120

125

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

Val

Ala

Leu

Ser

Arg

ňř

130

135

140

*

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Met

Leu

Trp

Gin

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro

145

Gly Cys _{III) kde

His

v

poloze

97

je

nahražen

Gin,

Asn,

Ala,

Gly,

Ser

nebo

Pro,

Trp

v

poloze

100

je

nahražen

Ala,

Glu,

Asp,

Asn,

Met,

Ile,

Phe, Tyr,

Ser,

Thr,

Gly,

Gin,

Val

nebo

Leu,

Ala

v

poloze

101

je

nahražen

Ser,

Asn,

Gly,

His,

Pro,

Thr

nebo Val,

Ser

v

po1oze

102

je

nahražen

Arg,

Gly

v

po1oze

103

je

nahražen

Ala,

Glu

v

poloze

105

je

nahražen

Gin,

Thr

v

poloze

106

je

nahražen

Lys nebo Ser,

Leu

v

po1oze

107

je

nahražen

Pro,

Asp

v

poloze

108

je

nahražen

Glu,

Gly

v

poloze

111

je

nahražen

Asp,

nebo

Trp,

_v

poloze

138

je

.nahražen.

Ala,..

Glu,. _

Asp,

Asn,

Met,

.Ile.,

.. Phe

Tyr, Ser,

Thr,

Gly,

Gin,

Val

nebo

Leu,

nebo jeho farmaceuticky vhodné soli.

Nejvýhodnějšl je protein obecného vzorce III, kde

His	v	poloze	97	je	nahražen	Gin,	Asn,	Ala,	Gly,	Ser nebo Pro,
Trp	v	poloze	100	je	nahražen	Ala,	Glu,	Asp,	Asn,	Met, Ile,
					Phe, Tyr,	Ser,	Thr,	Gly,	Gin,	Val nebo Leu
Ala	v	poloze	101	je	nahražen	Ser,	Asn,	Gly,	His,	Pro, Thr

nebo Val,

- 11 ·« »· • 9 9 « • ♦ « • * * a « « a··· ·· b 9 a·*

Glu	v	ρθ1θΞβ	105	je	nahrašen	Gin,
Thr	v	poloze	106	je	nahrašen	Lys nebo Ser, ,
Leu	v	polo2e	107	je	nahrašen	Pro,
Asp	v	poloze	108	je	nahrazen	Glu,
Gly	v	po1oze	111	je	nahrašen	Asp nebo,
Trp	v	poloze	138	je	nahrašen	Ala, Glu.	Asp,	Asn,	Met,	Ile
					Phe, Tyr,	Thr, Gly,	Gin,	Val	nebo	Leu.

Ještě výhodnějšími jsou proteiny obecného vzorce III, kde:

His	v	poloze	97	je	nahrašen	Ser nebo	Pro,
Trp	v	poloze	100	je	nahrašen	Ala, Gly,	Gin,	Val,	Ile	nebo	Leu,
Ala	v	poloze	101	je	nahrašen	Thr nebo
Trp	v	poloze	138	je	Ala, Ile,	, Gly, Gin, Val	nebo	Leu.
	Dalšími	výhodnými jsou proteiny obecného vzorce	III,	kde
His	v	po1oze	97	je	nahrašen	Ser nebo	Pro,
Trp	v	poloze	100	je	nahrašen	Ala, Gin	nebo	Leu,
Ala	v	poloze	101	je	nahrašen	Thr nebo
Trp	v	poloze	138	je	Gin.

Dalšími výhodnými jsou proteiny podle vynálezu SEQ ID δ.^:3, kde zbytky aminokyseliny v polohách 97, 100, 101, 105, 106, 107, 108,. a .1.1.1 jsou nahrašeny jak uvedeno v tabulce I =

- 12 Po1oha ara i nokyse1 i ny

97	100	101	105	106	107
Ser .	Trp	Ala	Glu	Thr	Leu
His	Gin	Ala	Glu	Thr	Leu
His	Trp	Thr	Glu	Thr	Leu
His	Trp	Ala	Gin	Thr	Leu
His	Trp	Ala	Glu	Lys	Leu
His	Trp	Ala	Glu-	Thr.	Pro
His	Trp	Ala	Glu	Thr	Leu
His	Trp	Ala	Glu	Thr	Leu
Ser	Gin	Ala	Glu	Thr	Leu
Ser	Trp	Thr	Glu	Thr	Leu
Ser	Trp	Ala	Gin	Thr	Leu
Ser	Trp	Ala	Glu	Lys	Leu
Ser	Trp	Ala	Glu	Thr	Pro
Ser	Trp	Ala	Glu	Thr	Leu
Ser	Trp	Ala	Glu	Thr	Leu
His	Gin	Thr	Glu	Thr	Leu
His	Gin	Ala	Gin	Thr	Leu
His	Gin	Ala	Glu	Lys	Leu
His	Gin	Ala	Glu	Thr	Pro
His	Gin	Ala	Glu	Thr	Leu
His	Gin	Ala	Glu	Thr	Leu
His	Trp	Thr	Gin	Thr	Leu
His	Trp	Thr	Glu	Lys	Leu
His	Trp	Thr	Glu	Thr	Pro
His	Trp	Thr	Glu	Thr	Leu
His	Trp	Thr	Glu	Thr	Leu
His	Trp	Ala	Gin	Lys	Leu
His	Trp	Ala	Gin	Thr	Pro
His	Trp	Ala	Gin	Thr	Leu
His	Trp	Ala	Gin	Thr	Leu
HÍS	Trp	Ala	Glu	Lys	Pro
HÍS	Trp	Ala	Glu	Lys	Leu

-13··** ···· · · · ·»· ··« *«· • β »· · · · · ··· · * ♦ · · · · · · ·· ·· ··· ·· ·» ·

33	His	Trp	Ala	Glu	Lys	Leu	Asp	Asp
34	His	Trp	Ala	Glu	Thr	Pro	Glu	Gly
35	His	Trp	Ala	Glu	Thr	Pro	Asp	Asp
36	His	Trp	Ala	Glu	Thr	Leu	Glu	Asp
37	Ser	Gin	Thr	Glu	Thr	Leu	Asp	Gly
38	Ser	Gin	Ala	Gin	Thr	Leu	Asp	Gly
39	Ser	Gin	Ala	Glu	Lys	Leu	Asp	Gly
40	Ser	Gin	Ala	Glu	Thr	Pro	Asp	Gly
41	Ser	Gin	Ala	Glu	Thr	Leu	Glu	Gly
42	Ser	Gin	Ala	Glu	Thr	Leu	Asp	Asp
43	Ser	Trp	Thr	Gin	Thr	Leu	Asp	Gly
44	Ser	Trp	Thr	Glu	Lys	Leu	Asp	Gly
45	Ser	Trp	Thr	Glu	Thr	Pro	Asp	Gly
46	Ser	Trp	Thr	Glu	Thr	Leu	Glu	Gly
47	Ser	Trp	Thr	Glu	Thr	Leu	Asp	Asp
48	Ser	Trp	Ala	Gin	. Lys	Leu	Asp	Gly
49	Ser	Trp	Ala	Gin	Thr	Pro	Asp	Gly
50	Ser	Trp	Ala	Gin	Thr	Leu	Glu	Gly
51	Ser	Trp	Ala	Gin	Thr	Leu	Asp	Asp
52	Ser	Trp	Ala	Glu	Lys	. Pro	Asp	Gly
53	Ser	Trp	Ala	Glu	Lys	Leu	Glu	Gly
54	Ser	Trp	Ala	Glu	Lys	Leu	Asp	Asp
55	Ser	Trp	Ala	Glu	Thr	Pro	Glu	Gly
56	Ser	Trp	Ala '	Glu	Thr	Pro	ASp	Asp
57	Ser	Trp	Ala	Glu	Thr	Leu	Glu	Asp
58	His	Gin	Thr	Gin	Thr	Leu	ASp	Gly
59	His	Gin	Thr	Glu	Lys	Leu	Asp	Gly
60	His	Gin	Thr	Glu	Thr	Pro	Asp	Gly '
61	His	Gin	Thr	Glu	Thr	Leu	Glu	Gly
62	His	Gin	Thr	Glu	Thr	Leu	Asp	Asp
63	His	Gin	Ala	Gin	Lys	Leu	Asp	Gly
64	His	Gin	Ala	Gin	Thr	Pro	Asp	Gly
65	His	Gin	Ala	Gin	Thr	Leu	Glu	Gly
66	HÍS	Gin	Ala	Gin	Thr	Leu	Asp	Asp
67	His	Gin	Ala	Glu	Lys	Pro	Asp	Gly
68	His	Gin	Ala	Glu	Lys	Leu	Glu.	Gly

• 99

-14• 9 · * ·

9 9 « · ·9 • 9 · ••«9 ·· · · · 9 • »99

9 999. 9 • 9 9 ·

69	His	Gin	Ala	Glu	Lys	Leu	Asp	Asp
70	His	Gin	Ala	Glu	Thr	Pro	Glu	Gly
71	His	Gin	Ala	Glu	Thr	Pro	Asp	Asp
72	His	Gin	Ala	' Glu	Thr	Leu	Glu	Asp
73	His	Trp	Thr	Gin	Lys	Leu	ASp	Gly
74	His	Trp	Thr	Gin	Thr	Pro	ASP	Gly
75	HÍS	Trp	Thr	Gin	Thr	Leu	Glu	Gly
76	HÍS	Trp	Thr	Gin	Thr	Leu	Asp	Asp
77	His	Trp	Thr	Glu	Lys	Pro	Asp	Gly
78	His	Trp	Thr	Glu	Lys	Leu	Glu	Gly
79	HÍS	Trp	Thr	Glu	Lys	Leu	Asp	Asp
80	HÍS	Trp	Thr	Glu	Thr	Pro	Glu	Gly
81	HÍS	Trp	Thr	Glu	Thr	Pro	ASp	Asp
82	HÍS	Trp	Thr	Glu	Thr	Leu	Glu	Asp
83	His	Trp	Ala	Gin	Lys	Pro	Asp	Gly.
84	HÍS	Trp	Ala	Gin	Lys	Leu	Glu	Gly
85	HÍS	Trp	Ala	Gin	Lys	Leu	Asp	Asp
86	HÍS	Trp	Ala	Gin	Thr	Pro	Glu	' Gly
87	HÍS	Trp	Ala	Gin	Thr	Pro	Asp	Asp
88	HÍS	Trp	Ala	Gin	Thr	Leu	Glu	Asp
89	HÍS	Trp	Ala	Glu	Lys	Pro	Glu	Gly
90	HÍS	Trp	Ala	Glu	Lys	Pro	Asp	Asp
91	His	Trp	Ala	Glu	Lys	Leu	Glu	Asp
92 .	HÍS	Trp	Ala	Glu	Thr	Pro	Glu	ASp
93	Ser	Gin	Thr	Gin	Thr	Leu	Asp	Gly
94	Ser	Gin	Thr	Glu	Lys	Leu	Asp	Gly
95	Ser	Gin	Thr	Glu	Thr	Pro	Asp	Gly
96	Ser	Gin	Thr	Glu	Thr	Leu	Glu	Gly
97	Ser	Gin	Thr	Glu	Thr	Leu	Asp	Asp
98	Ser	Gin	Ala	Gin	Lys	Leu	Asp	Gly
99	Ser	Gin	Ala	Gin	Thr	Pro	Asp	Gly
100	Ser	Gin	Ala	Gin	Thr	Leu	Glu	Gly
101	Ser	Gin	Ala	Gin	Thr	Leu	Asp	Asp
102	Ser	Gin	Ala	Glu	Lys	Pro	Asp	Gly
103	Ser	Gin	Ala	Glu	Lys	Leu	Glu	Gly
104	Ser	Gin	Ala	Glu	Lys	Leu	Asp	Asp

-15«φ ·· φ · * · • · « • · • · · *·♦♦ ·· » · • · ··«

105	Ser	Gin	Ala	Glu	Thr	Pro	Glu	Gly
106	Ser	Gin	Al a	Glu	Thr	Pro	Asp	Asp
107	Ser	Gin	Ala	Glu	Thr	Leu	Glu	Asp
108	Ser	Trp	Thr	Gin	Lys	Leu	Asp	Gly
109	Ser	Trp	Thr	Gin	Thr	Pro	Asp	Gly
110	Ser	Trp	Thr	Gin	Thr	Leu	Glu	Gly
111	Ser	Trp	Thr	Gin	Thr	Leu	Asp	Asp
112	Ser	Trp	Thr	Glu	Lys	Pro	Asp	Gly
11.3	Ser	Trp	Thr	Glu	Lys	Leu	Glu	Gly
114	Ser	Trp	Thr	Glu	Lys	Leu	Asp	ASp
115	Ser	Trp	Thr	Glu	Thr	Pro	Glu	Gly
116	Sér	Trp	Thr	Glu	Thr	Pro	Asp	Asp
117 .	Ser	Trp	Thr	Glu	Thr	Leu	Glu	Asp
118	Ser	Trp	Ala	Gin	Lys	Pro	Asp	Gly
119	Ser	Trp	Ala	Gin	Lys	Leu	Glu	Gly
120	Ser	Trp	Ala	Gin	Lys	Leu	ASp	Asp
121	Ser	Trp	Ala	Gin	Thr	Pro	Glu	Gly
122	Ser	Trp	Ala	Gin	Thr	Pro	Asp	Asp
123	Ser	Trp	Ala	Gin	Thr	Leu	Glu	Asp
124	Ser	Trp	Ala	Glu	Lys	Pro	Glu	Gly
125	Ser	Trp	Ala	Glu	Lys	Pro	Asp	Asp
126	Ser	Trp	Ala	Glu	Lys	Leu	Glu	Asp
127	Ser	Trp	Ala	Glu	Thr	Pro	Glu	Asp
128	His	Gin	Thr	Gin	Lys	Leu	Asp	Gly
129	His	Gin	Thr	Gin	Thr	Pro	Asp	Gly
130	His	Gin	Thr	Gin	Thr	Leu	Glu	Gly
131	His	Gin	Thr	Gin	Thr	Leu	Asp	Asp
132	HÍS	Gin	Thr	Glu	Lys	Pro	Asp	Gly
133	His	Gin	Thr	Glu	Lys	Leu	Glu	Gly
134	His	Gin	Thr	Glu	Lys	Leu	Asp	Asp
135	His	Gin	Thr	Glu	Thr	Pro	Glu	Gly
136	His	Gin	Thr	Glu	Thr	Pro	Asp	Asp
137	His	Gin	Thr	Glu	Thr	Leu	Glu	Asp
138	His	Gin	Ala	Gin	Lys	Pro	Asp	Gly
139	His	Gin	Ala	Gin	Lys	Leu	Glu	Gly
140	His	Gin	Ala	Gin	Lys	Leu	Asp	Asp

-16I*.

• φ ·> · * φ φ · • Φ · ·; ·φ Φ Φ; ··· · φ « · φφφ Φ· • φφφ φφ ·Φ· φφ · *

141	His	Gin	Ala	Gin	Thr	Pro	Glu	Gly
142	His	Gin	Ala	Gin	Thr	Pro	Asp	Asp
143	HiS	Gin	Ala	Gin	Thr	Leu	Glu	Asp
144	His	Gin	Ala	Glu	Lys	Pro	Glu	Gly
145	HiS	Gin	Ala	Glu	Lys	Pro	Asp	Asp
146	His	Gin	Ala	Glu	Lys	Leu	Glu	Asp
147	HiS	Gin	Ala	Glu	Thr	Pro	Glu	Asp
148	HÍS	Trp	Thr	Gin	Lys	Pro	Asp	Gly
149	HÍS	Trp	Thr	Gin	Lys	Leu	Glu	Gly
150	His	Trp	Thr	Gin	Lys	Leu	Asp	Asp
151	His	Trp	Thr	Gin	Thr	Pro	Glu	Gly
152	HiŠ	Trp	Thr	Gin	Thr	Pro	Asp	Asp
153	HÍS	Trp	Thr	Gin	Thr	Leu	Glu	Αερ
154	HiS	Trp	Thr	Glu	Lys	Pro	Glu	Gly
155	His	Trp	Thr	Glu	Lys	Pro	Asp	Asp
156	HÍS	Trp	Thr	Glu	Lys	Leu	Glu	Asp
157	His	Trp	Thr	Glu	Thr	Pro	Glu	Asp
158	HiS	Trp .	Ala	Gin	Lys	Pro	Glu	Gly
159	HÍS	Trp	Ala	Gin	Lys	Pro	Asp	Asp
160	His	Trp	Ala	Gin	Lys	Leu	Glu	ASp
161	HiS	Trp	Ala	Gin	Thr	Pro	Glu	Asp
162	HÍS	Trp	Ala	Glu	Lys	Pro	Glu	Asp.
163	His	Trp	Ala	Gin	Lys	Pro	Glu	ASp
164	HÍS	Trp	Thr	Glu	Lys	Pro	Glu	Asp
165	HÍS	Trp	Thr	Gin	Thr	Pro	Glu	Asp
166	HiS	Trp	Thr	Gin	Lys	Leu	Glu	Asp
167	HÍS	Trp	Thr	Gin	Lys	Pro	Asp	Asp
168	His	Trp	Thr	Gin	Lys	Pro	Glu	Gly
169	His	Gin	Ala	Glu	Lys	. Pro	Glu	ASp
170	HÍS	Gin	Ala	Gin	Thr	Pro	Glu	Asp
171	HÍS	Gin	Ala	Gin	Lys	Leu	Glu	ASp
172	HÍS	Gin	Ala	Gin	Lys	Pro	Asp	Asp
173	His	Gin	Ala	Gin	Lys	Pro	Glu	Gly
174	HiS	Gin	Thr	Glu	Thr	Pro	Glu	Asp
175	HÍS	Gin	Thr	Glu	Lys	Leu	Glu	Asp
176	His	Gin	Thr	Glu	Lys	Pro	Asp	Asp

Φ·

-17• ♦ · · ·· · · e φ · · φ · φ φ · φ • · · · φ · ·«··+» • · · * · φ · ···· ·* «φ* ·Φ ·· φ

177	His	Gin	Thr	Glu	Lys	Pro	Glu	Gly
178	His	Gin	Thr	Gin	Thr	Leu	Glu	Asp
179	His	Gin	Thr	Gin	Thr	Pro	Asp	Asp
180	HÍS	Gin	Thr	Gin	Thr	Pro	Glu	Gly
181	His	Gin	Thr	Gin	Lys	Leu	ASp	Asp
182	HÍS	Gin	Thr	Gin	Lys	Leu	Glu	Gly
183	HÍS	Gin	Thr	Gin	Lys	Pro	Asp	Gly
184	Ser	Trp	Ala	Glu	Lys	Pro	Glu	Asp
185	Ser	Trp	Ala	Gin	Thr	Pro	Glu	Asp
186	Ser	Trp	Ala	Gin	Lys	Leu	Glu	Asp
187	Ser	Trp	Ala	Gin	Lys	Pro	Asp	ASp
188	Ser	Trp	Ala	Gin	Lys	Pro	Glu	Gly
189	Ser	Trp	Thr	Glu	Thr '	Pro	Glu	Asp
190	Ser	Trp	Thr	Glu	Lys	Leu	Glu	Asp
191	Ser	Trp	Thr	Glu	Lys	Pro	Asp	ASp-
192	Ser	Trp	Thr	Glu	Lys	Pro	Glu	Gly
193	Ser	Trp	Thr	Gin	Thr	Leu	Glu	ASp
194	Ser	Trp	Thr	Gin	Thr	Pro	Asp	Asp
195	Ser	Trp	Thr	Gin	Thr	Pro	Glu	Gly
196	Ser	' Trp	Thr	Gin	Lys	Leu	Asp	Asp
197	Ser	Trp	Thr	Gin	Lys	Leu	Glu	Gly
198	Ser	Trp	Thr	Gin	Lys	Pro	Asp	Gly
199	Ser	Gin	Ala	Glu	Thr	Pro	Glu	Asp
200	Ser	Gin	Ala '	Glu	Lys	Leu	Glu	Asp
201	Ser	Gin	Ala	Glu	Lys	Pro	Asp	Asp
202	Ser	Gin	Ala	Glu	Lys	Pro	Glu	Gly'
203	Ser	Gin	Ala	Gin	Thr	Leu	Glu	Asp
204	Ser	Gin	Ala	Gin	Thr	Pro	Asp	Asp
205	Ser	Gin	Ala	Gin	Thr	Pro	Glu	Gly
206	Ser	Gin	Ala	Gin	Lys	Leu	Asp	Asp
207	Ser	Gin	Ala	Gin	Lys	Leu	Glu	Gly
208	Ser	Gin	Ala	Gin	Lys	Pro	Asp	Gly
209	Ser	Gin	Thr	Glu	Thr	Leu	Glu	Asp
210	Ser	Gin	Thr	Glu	Thr	Pro	Asp	Asp
211	Ser	Gin	Thr	Glu	Thr	Pro	Glu	Gly
212	Ser	Gin	Thr	Glu	Lys	Leu	Asp	Asp

-18ίϊ «· ·♦ · · · •

·» • · • ♦ • · · ··· ·· ·· » « · ·* ·«

213	Ser	Gin	Thr	Glu	Lys	Leu	Glu	Gly
214	Ser	Gin	Thr	Glu	Lys	Pro	Asp	Gly
215	Ser	Gin	Thr	Gin	Thr'	Leu	Asp	Asp
216	Ser	Gin	Thr	Gin	Thr	Leu	Glu	Gly
217	Ser	Gin	Thr	Gin	Thr	Pro	Asp	Gly
218	Ser	Gin	Thr	Gin	Lys	Leu	Asp	Gly
219	His	Trp	Thr	Gin	Lys	Pro	Glu	Asp
220	His	Gin	Ala	Gin	Lys	Pro	Glu	Asp
221	His	Gin	Thr	Glu	Lys	Pro	Glu	Asp
222	His	Gin	Thr	Gin	Thr	Pro	Glu	Asp
223	His	Gin	Thr	Gin	Lys	Leu	Glu	Asp
224	His	Gin	Thr	Gin	Lys	Pro	Αερ	Asp
225	His	Gin	Thr	Gin	Lys	Pro	Glu	Gly
226	Ser	Trp	Ala	Gin	Lys	Pro	Glu	Asp
227	Ser'	Trp	Thr	Glu	Lys	Pro	Glu	Asp
228	Ser	Trp	Thr	Gin	Thr	Pro	Glu	Asp
229	Ser	Trp	Thr	Gin	Lys	Leu	Glu	Asp-
230	Ser	Trp	Thr	Gin	Lys	Pro	Asp	Asp
231	Ser	Trp	Thr	Gin	Lys	Pro	Glu	Gly
232	Ser	Gin	Ala	Glu	Lys	Pro	Glu	Asp
233	Ser	Gin	Ala	Gin	Thr	Pro	Glu	Asp
234	Ser	Gin	Ala	Gin	Lys	Leu	Glu	Asp
235	• Ser	Gin	Ala	Gin	Lys	Pro	Asp	Asp
236	Ser	Gin	Ala	Gin	Lys	Pro	Glu	. Gly
237	Ser	Gin	Thr	Glu	Thr	Pro	Glu	Asp
238	Ser	Gin	Thr	Glu	Lys	Leu	Glu	Asp
239	Ser	Gin	Thr	Glu	Lys	Pro	Asp	Asp
240	Ser	Gin	Thr	Glu	Lys	Pro	Glu	Gly
241	Ser	Gin	Thr	Gin	Thr	Leu	Glu	Asp,
242	Ser	Gin	Thr	Gin	Thr	Pro	Asp	Asp
243	Ser	Gin	Thr	Gin	Thr	Pro	Glu	Gly
244	Ser	Gin	Thr	Gin	Lys	Leu	Asp	Asp
245	Ser	Gin	Thr	Gin	Lys	Leu	Glu	Gly
246	Ser	Gin	Thr	Gin	Lys	Pro	Asp	Gly
247	His	Gin	Thr	Gin	Lys	Pro	Glu	Asp
248	Ser	Trp	Thr	Gin	Lys	Pro	Glu	l Asp

···♦

-19·· ·♦ • 4 ·' · 4 ·

4> « · · · ·<·· 4« · • 4

4 4 » 4 · 4 4 4

4 4; 44 4 *

4 4 «

44 «4 4

249	Ser	Gin	Ala	. Gin	Lys	Pro	Glu	Asp
250	Ser	Gin	Thr	Glu	Lys	Pro	Glu	Asp
251	Ser	Gin	Thr	Gin	Thr '	Pro	Glu	Asp
252	Ser	Gin	Thr	Gin	Lys	Leu	Glu	ASp
253	Ser ’	Gin	Thr	Gin	Lys	Pro	Asp	Asp
254	Ser	Gin	Thr	Gin	Lys	Pro	Glu	Gly
255	Ser	Gin	Thr	Gin	Lys	Pro	Glu	Asp
256	His	Ala	Ala	Glu	Thr	Leu	Asp	Gly
257	His	Leu	. Ala	Glu	Thr	Leu	Asp	Gly
258	Pro	Trp	Ala	Glu	Thr	Leu I	Asp	Gly

Mezi nejvýhodnější bílkoviny obecného vzorce III podle tabulky I patří bílkoviny se SEQ ID č. ' 4 -11 = (SEQ ID NO:. 4)

Val

Pro

Ile

Gin

5 Lys

Val

Gin

Asp

Asp

10 Thr

Lys

Thr

Leu

Ile

15 Lys

Thr

Ile

Val

Thr

20 Arg

Ile

Asn

Asp

Ile

25 Ser

His

Thr

Gin

Ser

30 Val

Ser

Ser

Lys

Gin

35 Lys

Val

Thr

Gly

Leu

40 Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

45 Leu

His

Pro

Ile

Leu

50 Thr

Leu

Ser

Lys

Met

55 Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

60 Val

Tyr

Gin

Gin

Ile

65 Leu

Thr

Ser

Met

Pro

70 Ser

Arg

Asn

Val

Ile

75 Gin

Ile

Ser

Asn

Asp

80 Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

85 Asp

Leu

Leu

His

Val

90 Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

95 Ser

Cys

His

Leu

Pro

100 Ala

Ala

Ser

Gly

Leu

105 Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

110 Leu

cly

Gly

Val

Leu

115 Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

120 Ser

Thr

Glu

Val

Val

125 Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

130 Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

135 Asp

Met

Leu

Trp

Gin

140 Leu

Asp

Leu

Ser

Pro

145

Gly Cys (SEQ ID NO: 5)

10 15

Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr «· ·· • · r · • · · • · · · • · · • η» ·· ·« ♦* ···« • · *“» · · • · · * • · · 99« · • 9 * a

V 99 99 9 •Ř.

•i*;·

-2020 25 30

Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gin Ser Val Ser Ser

40 45

Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile

55 60

Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin Ile

70 75 80

Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gin Ile Ser Asn Asp Leu

90 95

Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys

100 105 110

His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

115 120 125

Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

130 135 140

Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser Pro

145

Gly Cys (SEQ ID NO: 6)

10 15

ííj·-

Val Ile

Pro Ile Gin 20

Lys Val Gin Asp Asp

Thr Lys Thr Leu

Ile 30 Val

Lys Ser

Thr Ser

Ile Asn Asp

Ile

25 Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

Thr

Arg

*

35

40

45

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu

His

Pro

Ile

50

•

55

60

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin

Gin

Ile

65

70

75

80

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

Ile

Gin

Ile

Ser

Asn

Asp

Leu

9

85

90

95

9

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

cys

9

100

105

110

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly

Gly

115

120

125

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

Val

Ala

Leu

Ser

Arg

130

135

140

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Met

Leu

Gin

Gin

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro

145

Gly cys

-21«* ·♦ • ·« * • · · · · •i·· ·· • « • ♦ • · « ♦ ♦ · ·« ··· (SEQ ID NO: 7)

10 15

Val

Pro

Ile

Gin 20

Lys

Val Gin Asp Asp Thr Lys 25

Thr

Leu

Ile 30

Lys

Thr

Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

35

40

45

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu

His

Pro

Ile

50

55

1

60

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin

Gin

Ile

65

70

75

80

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

Ile

Gin

Ile

Ser

Asn

Asp

Leu

65

90

95

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys

100

105

110

His

Leu

Pro

Gin

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly

Gly

115

120

125

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

Val

Ala

Leu

Ser

Arg

130

135

140

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Met

Leu

Gin

Gin

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro

145

Gly Cys (SEQ ID NO: 8) .10 15

Val

Pro

Ile

Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Asp

Thr

Lys

Thr

Leu

Ile

Lys

Thr

20

25

30

Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser

His

Ala

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

35

40

45

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu

His

Pro

Ile

ít

50

55

60

¥

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin

Gin

Ile

•

65

70

75

80

6

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

Ile

Gin

Ile

Ser

Asn

Asp

Leu

85

90

95

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys

100

105

110

His

Leu

Pro

Ala

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly

Gly

115 120 125

Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

Μ ·· » · · · · • * · ♦ • · * ···* ♦· «· • · • · · • · ·

9 9

999 99 ·· «·«· • · * 9 9 9

999 9

9

9

-22130 135 140

Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser Pro

145

Gly Cys ι,^:* (SEQ ID NO: 9)

Val

5

Asp

10 Thr Lys Thr

Leu

Ile

15 Lys

Thr

Pro

Ile Gin Lys

Val Gin

Asp

20

25

30

Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

35

40

45

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu

His

Pro

Ile

50

55

60

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin

Gin

Ile

65

70

75

80

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

Ile

Gin

Ile

Ser

Asn

Asp

Leu

85

90

95

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys

100

105

110-

His

Leu

Pro

Ala

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly

Gly

115

120

125

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

Val

Ala

Leu

Ser

Arg

130

135

140

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Met

Leu

Gin

Gin

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro

145

Gly Cys (SEQ ID NO: 10)

10 15

Val

Pro

Ile

Gin Lys 20

Val Gin

Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr

25

30

Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

35

40

45

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu

His

Pro

Ile

50

55

60

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin

Gin

Ile

65

70

75

80

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

Ile

Gin

Ile

Ser

Asn

Asp

Leu

85

90

95

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys

100 105 110

Ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

-23• * · • · · ι·*« ·

115 120 125

Val Leu 130 Leu Gin 145

Glu Gly

Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu 135

Val Val Ala Leu Ser

Arg Pro

Gin

140 Leu Asp

Leu

Ser

Ser

Leu Gin Asp Met Leu

Gin

Gly

Cys

(SEQ ID

NO

: 11

)

5

10

15

Val

Pro

lle

Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Asp

Thr

Lys

Thr

Leu

lle

Lys

Thr

20

25

30

lle

Val

Thr

Arg

lle

Asn

Asp

lle

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

35

40

45

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

lle

Pro

Gly

Leu

His

Pro

lle

50

55

60

Leu-

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin

Gin

lle-

65

70

75

80

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

lle

Gin

lle

Ser

Asn

Asp

Leu

85 ,

90

95

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys

100

105

110

Ser

Leu

Pro

Gin

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly

Gly

115

120

125

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

Val

Ala

Leu

Ser

Arg

130

135

140

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Met

Leu

Gin

Gin

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro

145

Gly Cys

Vynále2 se týká biologicky aktivních proteinů, které umožňují účinnou léčbu obezity. S překvapením se zjistilo, že proteiny podle vynálezu mají zlepšené vlastnosti způsobené specifickými substitucemi v proteinu lidské obezity. Proteiny podle vynálezu jsou stálejší než protein myší a lidské obezity a jsou proto vynikajícími léčebnými činidly.

Proteiny podle vynálezu se obvykle připravují rekombinantní technikou. Technika vytváření substitučních mutací v předem určených místech v DNA mající známé sekvence je dobře 2náma,

V 9

- 24 například PII3 primer mutagenesis. Mutace, které mohou být provedeny v DNA zakódováním přítomných protiobezitriích proteinů, nemusí umisťovat sekvence mimo čtecí rámec a s výhodou nevytváří komplementární oblasti, které by mohly vytvářet sekundární strukturu mRNA (DeBoer a kol., evropská zveřejněná přihláška vynálezu číslo EP 75,444A, 1983).

,*¹

Protein podle vynálezu může být připraven buď rekombinantní technologií DNA nebo dobře známými chemickými postupy, jako je peptidová synthesa v rozpouštědlech nebo v pevné fázi, nebo polosyntesa v roztoku vycházející z X proteinových fragt mentů spojená s běáymi roztokovými způsoby.

A. Pevná fáze

A, *!

Příprava proteinů podle vynálezu může probíhat synthesou peptidové pevné fáze nebo rekombinantními způsoby. Principy chemické synthesy peptidů v pevné fázi jsou v oboru dobře známy a obecně popsány (například Dugas, H. a Penney, C. Bioorganic Chemistry nakladatelství Springer, New York, str. 54 až 92, 1981). Například lze peptidy syntetizovat metodikou pevné fáze za použití peptidového syntetizátoru PE-Applied Biosystems 433A (obchodně dostupného od Applied Biosystems, Foster City California) a syntetizačnich cyklů dodaných organizací Applied Biosystems. Boc aminokyseliny a jiné reagencie jsou obchodně dostupné (PE-Applied Biosystems a jiní dodavatelé chemilálií). Sekvenční Boc chemie používající protokolů dvojné vazby se aplikuje na výchozí p-methylbenzhydrylaminové pryskyřice pro výrobu C-koncových karboxamidů. Pro výrobu Ckoncových kyselin se používá odpovídající PAM pryskyřice. Arginin, asparagin, glutamin, histidin a methionin se kopulují za pomoci předformovaných hydroxybenztriazolesterů. Použít lze následující ochrany bočního řetězce:

Arg, tosyl

Asp, cyklohexyl nebo benzyl

Cys, 4-methylbenzyl

- 25 44 44 · ·4 444444 • 444 4 4 4 4 4 4 · ^444 444 44 4 *4 4 4 ·· 4 4 ♦ 4

444 444 44 •44444 44444 44 4

Glu, cyklohexyl

His, benzyloxymethyl

Lys, 2-chlorbenzyloxykarbonyl

Met, sulfoxid

Ser, benzyl . Thr, benzyl Trp, formy1

Tyr, 4-bromkarbobenzoxy

Odstraňování chránící skupiny Boc je možné kyselinou trifluoroctovou (TFA) v methylenchloridu. Ostraňování formylu z Trp se provádí postupem s peptidylovou pryskyřicí se 20 % pyridinu v dimethyl formámidu po dobu 60 minut při teplotě 4 C. Met (0) se může redukovat zpracováním peptidylovou pryskyřicí se systémem TFA/dimethylsulfid/koncentrovaná kyselina o

chlorovodíková 95/5/1 při teplotě 25 C po dobu 60 minut. Po shora uvedeném předběžném zpracování mohou být peptidy dále zbaveny chránících skupin a odštěpeny od pryskyřic bezvodým hydrogenfluoridem obsahujícím systém 10% m-kresol nebo m-kresol/10% p-thiokresol nebo ra-kresol/p-thiokresol/dimethylsul fid. Odštěpení skupiny chránící vedlejší řetězec od pryskyřice • 4 se provádí při teplotě 0 C nebo nižší, s výhodou -20 C po dobu 30 minut a následně 30 minut při teplotě 0 C. Po odstranění HF se systém peptid/pryskyřice promyje etherem. Peptid se extrahuje ledovou kyselinou octovou a lyofylizuje se. Čistí se reversní fázovou CIS sloupcovou chromatografií (Vydac) v 0,1% TFA s gradientem vzrůstající koncentrace acetonitrilu.

Pracovníkům v oboru je zřejmé, že synthesa v pevné fázi se může provést také strategií FMOC a odětěpovací směsí TFA/1apaS.

B, Rekombinantní syntesa

Proteiny podle vynálezu se dají též připravovat rekombinantní mi způsoby. Rekombinantním metodám se dává přednost, je4

4··

- 26 li žádoucí vysoký výtěžek. Základními kroky v rekombinantní produkci proteinu jsou:

(a) konstrukce syntetické nabo semi-syntetické DNA (nebo izolace z přírodních zdrojů), kódující protein podle vynálezu, (b) - integrování kódovací sekvence do expresního vektoru způsobe! vhodným pro expresi proteinu buď samotného nebo jako fusního proteinu, (c) transformování příslušné eukaryotické nebo prokaryotické hostitelské buňky expresním vektorem, (d) izolace a vyčištění rekombinantně vyrobeného proteinu.

a. Konstrukce genu

Syntetické geny, transkripce a translace in vitro nebo in vivo, z nichž vznikne produkce proteinu, mohou být konstruovány technikou v oboru dobře známou. Díky přirozené degeneraci genetického kódu je zkušenému pracovníkovi v obořu zřejmé, že může být zkonstruován zvětšitelný, avšak konečný počet sekvencí DNA, který kóduje proteiny podle vynálezu. Při výhodném provádění vynálezu se synt.hesa provádí rekombintní technologií DNA.

Metodika konstruování syntetických genů je v oboru dobře známa (například Brown a kol., Methods in Enzymology, Academie Press, N.Y. sv. 68, str. 109 až 151, 1979). Sekvence DNA odpovídající genu syntetického nárokovaného proteinu může být generována pomocí konvenčního aparátu syntetizujícího DNA jako je Applied Biosystems Model 380A nebo 380B (obchodně dostupný výrobek společnosti Applied Biosystems,lne. 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404).

V některých aplikacích může být žádoucí modifikovat kódovací sekvenci proteinu podle vynálezu, k začlenění vhodného štěpného místa citlivého na proteázu, například mezi signálním peptidem a strukturálním proteinem, usnadňující řízenou excisi

4« ···· • · 4 4 4 4 * 4 ••444« ··«·· ·· ·

- 27 signálního peptidu od konstrukce fusního proteinu.

Gen, kódující protein podle vynálezu, může být také vytvořen pomocí reakce polymerázového řetězce (PCR). Šablonou může být knihovna cDNA (obchodně dostupná od CLONETECH nebo STRATEGENE) nebo mRNA isolovaná z lidské tukové tkáně. Takové metodiky jsou v oboru dobře známé (například Maniatís a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989).

b. Přímá exprese nebo fusní protein

Protein podle vynálezu lze získat buď přímou expresí nebo jako fusní protein obsahující protein podle vynálezu následovaný enzymatickým nebo chemickým štěpením. Je známa řada peptidáz (například trypsin), které štěpí polypeptid ve specifických místech nebo pohlcují peptidy z aminového nebo z karboxyzakončení (například diaminopeptidása) peptidového řetězce. Kromě toho štěpí polypeptidový řetězec ve specifických místech jednotlivé chemikálie (například kyanogenbromid). Zkušený pracovník v oboru určí potřebné modifikace sekvence aminokyselin (a syntetickou nebo semisyntetickou kódující sekvenci, použije- li se rekombinantních prostředků) k začlenění místně specifických míst vnitřního štěpení (Carter P., Sítě Specific Proteolysis of Fusion Proteins, kapitola 13 v publikaci Protein Purification^: From Molecular Mechanisms to Large Scale Processes, American Chemical Soc. , Washington, D.C., 1990).

c. Konstrukce vektorů

Konstrukce vhodných vektorů, obsahujících žádané kódovací a řídící sekvence, používá standardních ligačních technik. Isolované plasmidy nebo fragmenty DNA se rozštěpí, upraví a vazebně změní do žádané formy k vytvořeni požadovaného plasmidu.

• φ ··· φ

ΦΦ · φ ·· • · φ φ »·· · φ φ φ φ · · φ φ φ φ φ · · • * * · β · φφφ» «« ··· ·♦

- 28 Κ provedení přemístění žádaného proteinu, zařadí se zkonstruovaná syntetická sekvence DNA do kteréhokoli z nadbytku vektorů příslušné rekombinantní exprese DNA použitím příslušných restrikčních endonukleáz. Syntetická kódovací sekvence je konstruována tak, že má restrikční endonukleázová štěpná místa na každém konci transkriptu k usnadnění izolace 2 těchto expresí a integrace do nich a k zesílení a k expresi plasmidů. Kódovací sekvence izolované cDNA může být pohotově modifikována pomocí syntetických 1inkerů ke snadnějšímu začlenění této sekvence do žádaných kódovacích vektorů technikami v oboru dobře známými. Příslušné použité endonukleázy jsou diktovány omezením modelu štěpení základního expresního vektoru, kterého má být použito. Volba restrikčních míst se řídí tak, abý správně orientovala kódovací sekvenci s řídicími sekvencemi k dosažení správého rámcového čtení (in-frame reading) a k expresi proteinu podle vynálezu.

Obecně se s těmito hostiteli používá plasmidových vektorů obsahujících promotory a řídicí sekvence odvozené od druhů kompatibilních s hostitelskou buňkou. Vektor obvykle nese replikační místo i markerové sekvence, které jsou schopné zajistit fenotypickou selekcí v transformovaných buňkách. Například

E. coli je typicky transformován pomocí pBR322, což je plasmid odvozený od druhů E, coli (Bolivar a kol. Gene 2: 95, 1977).

Plasmid pBR322 obsahuje geny pro ampici11inovoú a tetracyklinovou odolnost a zajišťuje tudíž snadné prostředky pro identifikaci transformovaných buněk. Plasmid pBR322 nebo jiný mikrobiální plasmid musí tedy obsahovat nebo být modifikován k tomu, aby obsahoval promotory a jiné řídicí elementy běžně používané v technologii rekombinace DNA.

Žádaná kódovací sekvence se vloží do expresního vektoru ve správné orientaci k transkripci z promotoru a z ribosom vázajícího místa, jež oba mají být funkční v hostitelské buňce, ve které má být éxpresován protein. Příkladem takového

• 9 9 ·**

99 99

9

499 49

9

9« «99 9

9 • 9 9 expresního vektoru je plasmid, popsaný v americkém patentovém spise číslo 5 304 493 (Belagaje a kol.). Gen kódující A-C-B proinsulin popsaný v uvedeném americkém patentovém spise může být vyjmut z plasmidu pRB182 restrikcí enzymů Ndel a BamHI. Geny kódující protein podle vynálezu mohou být vsazeny do plasmidové kostry na kazetě restrikčního fragmentu Ndel/BamHI.

d, Prokaryotická exprese /y

Prokaryoftů se obecně používá ke klonování sekvencí DNA při konstrukci vektorů užitečných podle vynálezu. Například je obzvlášť vhodný kmen E.coli K12 mikrobiální kmeny, kterých může Ba E.coli X1776 (ATCC č.31537). ilustrativní než omezující.

íATCC č.31446). Mezi jiné být použito, patří E.coli

Tyto příklady jsou spíše

Frokaryo^j/ťíů se používá také k expresi. Zmíněných kmenů lze použít stejně jako bacilů E.coli W3110 (fototropický ARCC č.27325) jako Bači 11us subtilis a jiných Enterobácteriaceae jako Salmonella typhimurium nebo Seratia marcescans a jiných Pseudomonas species. Promotory vhodné k použití s prokaryotickými hostiteli zahrnují beta-laktamázu (vektor PGX2907 IATCC č.39344] obsahuje replikon a beta-1aktamázový gen) a promotorové systémy laktosy (Chang a kol. Nátuře 275 str. 615, 1978 a Goeddel a kol. Nátuře 281 str. 544, (1979), alkalickou fosfatážu, tryptophan (trp) promotorový systém (vektor pATHl [ATCC č.37695] je určen k usnadnění exprese otevřeného čtecího rámce jako trpE fusní protein pod řízením trp promotoru) a hybridové promotory jako je tac promotor (izolovatelný z plasmidu pDR540 ATCC č.37282). Avšak jiné funkční bakteriální promotory, jejichž nukleótidové sekvence jsou-obecně známé, umožňují pracovníkům v oboru navázat je na DNA zakódováním proteinu pomocí linkerů nebo adaptorů k poskytnutí jakéhokoli požadovaného restrikčního místa. Promotory k použití v bakteriálních systémech budou také obsahovat sekvence Shine-Dalgařnovy operativně • « «·· · • ♦ · navázané na protein kódující DNA,

e. Eukaryotická exprese

Protein může být rekombinantně vyráběn v eukaryotickém expresním systému. Výhodné promotory řídící transkribci v hostujících buňkách savců lze získat z různých zdrojů, například z genomů virů jako jsou= polyoma, Simian Virus 40 (SV40), adenovirus, retroviry, virus hepatitis-B a nejvýhodněji cytomegalovirus, nebo z heterologních savčích promotorů, například z promotoru beta-actinu. Časné a pozdní promotory viru SV40 se pohodlně získají jako restrikční fragment SV40, který také obsahuje virový původ SV40 replikace (Fiers a kol. Nátuře 273, str. 113 (1978). Celý genora SV40 lze získat z plasmidu pBRSV, ATCC č.45019. Okamžitý Časný promotor lidského cytomegaloviru může být získán z plasmidu pCMBn (ATCC č.77177). Promotory z hostitelských buněk nebo z odvozených druhů jsou zde ovšem také užitečné.

Transkripce DNA kódující nárokovaný protein vyššími eukaryoty se zvyšuje vložením urychlovací sekvence do vektoru. Urychlovači jsou cís-působící elementy DNA, obvykle přibližně 10 . až 300 bp, které působí na promotor ke zvýšení jeho ’ transkripce. Urychlovače jsou poměrně nezávislé na orientaci a poloze, zjištěno 5 (Laimins, L. a kol. PNAS 78, str.933, 1981) a 3' (Lišky, M.L. a kol. Mol.Cel 1.Bio. 3, str.1108, 1983) vůči transkripční jednotce uvnitř intronu (Banerji J.L. a kol. Cell 33, str,729, 1983) i uvnitř samotné kódovací sekvence (Osborne T.F. a kol. Mol. Cell.Bio. 4, str. 1293 (1984). Nyní jsou známy četné sekvence urychlovačů ze savčích genů (globin,' RSV, SV40, EMC, elastasa, albumin, a-fetoprotein a insulin). Zpravidla se však používá urychlovače z viru eukaryotických buněk. Příklady zahrnují pozdní urychlovač SV40, časný promotorový urychlovač cytomegaloviru, urychlovač polyoma na pozdní straně replikaČního počátku a adenovirové urychlovače.

4« 4

4« 4 » · 4 4*4

4 4 4

4·4 44 4*

- 31 Expresní vektory, používané v eukaryotických hostujících buňkách (bufjř kvasnic, hub, hmyzu, zvířecí, lidské nebo nukleované buňky z jiných multicellulárních organismů), budou také obsahovat sekvence nutné k ukončení transkripce, která může ovlivňovat expresi mRNA. Tyto oblasti jsou transkribovány jako polyadenylováné segmenty v nepřemístěné části mRNA kódující protein. Nepřemístěné 3 oblasti také obsahují místa ukončení transkripce.

Expresní vektory mohou obsahovat selekční gen, nazývaný selektovatelný markér. Příklady vhodných selektovatelných markérů ze savčích buněk jsou dihydrofolátová reduktáza (DHFR, která může být odvozena od BgtII/HindIII restrikčního fragmentu pJOD-10 [ATCC č.68815], thimidynkinasy (thymidinkinasa viru herpes simplex je obsažena na fragmentu BamHI klonu vP-5 [ATCC 2028]) nebo resistantní geny neomycinu (G418) (získátelné z chromosomového vektoru kvasnic pNN414 [ATCC 37682]. Jsou-1 i takové selektovatelné markéry úspěšně přeneseny do savčí hostující buňky, může transfektovaná savčí buňka přežít, je^li umístěna pod selektivní tlak. Existují dvě v široké míře používané oddělené kategorie selektivních režimů. První kategorie je založena na buněčném metabolismu a na použití mutantní buněčné linie, které chybí schopnost růst bez doplňujícího media. Dvěma příklady jsou: buňky CHO DHFR* [ATCC CRL-9096] a myší buňky LTK (L-M(TK-) ATCC CCL-2.3). Jelikož těmto buňkám chybí k úplné cestě nukleotidové synthesy, nejsou chybějící nukleotidy zajištěny v doplňujícím mediu. Alternativou doplňování media je zavedení intaktního genu DHFR nebo TK do buněk jimž chybí příslušné geny, tudíž měnící jejich růstové požadavky. Jednotlivé buňky, které nebyly transformovány genem DHFR nebo TK nebudou schopny přežít v nedoplněném mediu.

určité geny, potřebné nemohou přežít, pokud

Druhou kategorii je dominantní selekce, která se týká

• · • *

*· » • ·· selekčního schéma používaného u každého typu buňky a nevyžaduje použití linie mutantních buněk. Tato schémata používají 2pravidla drogy k zastavení růstu hostitelské buňky. Takové buňky, které mají nový gen, by expresovaly odolnost drogy doprovázející protein a selekci by přežily. Příkladně takové dominantní selekce používají drog, jako jsou neomycin (Southern P. a Berg, P. J. Molec.Appl.Genet. 1, str. 327, 1982), mykofenolová kyselina (Mulligan R.C. a Berg P. Science 209, str. 1422, 1980) nebo hydromycin (Sugden B. a kol. Mol.Cel1.Biol. 5 str. 410 až 413, 1985). Podle tří uvedených příkladů se používá bakteriálních genů pod eukaryotickým řízením k udělení odolnosti příslušné droze G418 nebo neomycinu (geneticiriu), xgpt (mykofenolové kyselině) nebo hygromycinu.

Výhodným vektorem pro eukaryotickou expresi je nRc/CMV. pRc/CMV je obchodně dostupný (Invitrogen Corporation, 3985 Sorrento Valley Blvd, San Diego, CA 92121. K potvrzení správné sekvence v konstruovaných plasmidech se používá ligačních směsí k transformování kmene E.coli K12 DH5a (ATCC 31446) a úspěšných transformantů, oddělených případně antibiotickou odolností. Plasmidy z transformandů se připravují, analyzují restrikcí a/nebo sekvencí způsobem, který popsal Messing a kol., Nucleic Acids Res. 9, str. 309 (1981).

Hostitelské buňky mohou být transformovány expresními vektory podle vynálezu a kultivovány v běžném živném prostředí upraveném pro vyvolání promotorů, selekčních transformantů nebo zesilujících genů. Podmínky kultivace, jako jsou například teplota a hodnota pH jsou stejné jako prve použité u hostitelských buněk, vybraných k expresi a pracovníkům v oboru jsou známé. Technika transformace buněk shora uvedenými vektory je v oboru dobře známa a je v literatuře popsána (nepříklad Maniatis a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Col Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor New York, 1989 nebo Current Protocols in Molecular · *· • · · ·

4 · · · • * ♦

44·· ·· ·· *«·· • ··

4· 4 · · « · • 4 · · · · «4 «4 ·4· 4 • « · · · «II ·* ·· ·

- 33 Biology (1989) a doplňky.

Mezí vhodné hostitelské buňky k expresování vektorů kódujících proteiny podle vynálezu ve vyšších eukaryotech patří : Buněčná linie ledviny africké zelené opice transformované SVRO (COS-7, ATCC CRL-1651), transformovaná linie lidských primárních embryonálních ledvinových buněk 293 ,(Graham F.L, a kol. J. Gen.Virol. 36, str. 59 až 72 (1977), Virology 77, str. 319 až 329, Virology 86, str. 10 až 21), ledvinové buňky mláďat křečků CBHK-21ÍC-13), ATCC CCL-10, Virology 16, str. 147 (1962), vaječné buňky čínských křečků CHO-DHFR (ATCC CRL9096), myší Sertoliovy buňky (TM4, ATCC CRL-1715, Biol.Reprod. 23, str.- 243 až 250 (1980), buňky ledvin africké zelené opice (VĚRO 76, ATCC CRL-1587), rakovinové buňky lidského mozkového epitelu (HeLa, ATCC CCL-2), buňky psích ledvin (MDCK, ATCC CCL-34), ledvinové buňky krys buffalo (BRL 3A, ATCC CRL-1442), diploidní lidské plicní buňky (HI-38, ATCC CCL-75), lidské hepatocellulární rakovinové buňky (Hep G2, ATCC HB-8065) a myší buňky z děložních nádorů (MMT 060562, ATCC CCL51).

f. Kvasnicová exprese

Vedle prokaryojtů lze použít i eukaryotických mikrobů, jako jsou kvasnicové buňky. Nejběžněji používaným eukaryotickým mikroorganismem jsou Saccharomyces cerevisiae, nebo běžné pekařské kvasnice, ačkoli je běžně obchodně dostupná celá řada jiných kmenů. Pro expresi Saccharomyces se běžně používá plasmidu YRp7, například (ATCC-40053, Stinchcomb a kol. Nátuře 282, str. 39, 1979), Kingsman a kol. Gene 7' str. 141 (1979), Tschemper a kol. Gene 10, str. 157, 1980). Tento plasmid už obsahuje gen Trp, který zajišťuje selekční markér pro mutantní kmeny kvasnic postrádajících schopnost růst v tryptofanu, například ATCC č.44076 nebo PEP4-1 (Jones, Genetics 85, str. 12, 1977).

· ·· • · φ * • φ φ • « · ♦ φ · · φφφφ ··

ΦΦ φ «4 • · • · • φ φ • φ ΦΦ

ΦΦ ··*· • φ · φ φ φ ·«· φ φ φ

ΦΦ φ

Vhodnými promotujίčími sekvencemi pro použiti kvasnicových buněk jsou promotory pro 3-fosfogy1ycerátovou kinázu (nalezenou na plasmidu pAP12BD ATCC 53231 a popsanou v americkém patentovém spise číslo 4 935 250 (19. Června 1990) nebo jiné glykolytické enzymy jako je enoláza (nalezená na plasmidu pACl ARCC 39532), glyceraldehyd-3-fosfátová dehydrogenáza (odvozená od plasmidu pHcGAPCl ATCC 57090, 57091), zymomonas mobilis (americký patentový spis číslo 5 000 000 (19. března 1991), hexokináza, pyrohroznová dekarboxyláza, fosfofruktokináza, glukosa-6-fosfátisomeráza, 3-fosfoglycerátmutáza, pyruvatkináza, triosefosfatisomeráza, fosfoglukosoisomeráza a glukokináza.

Jinými kvasnicovými promotory, jež jsou indukovatelnými promotory, majícími dodatečnou výhodu transkripce řízené růstovými podmínkami, jsou promotorové oblasti použitelné pro alkoholovou dehydrogenázu 2, isocytochrom C, kyselou fosfatázu, degradatívní enzymy související s dusíkovým metabolismem, metallothionein (obsažený na plasmidovém vektoru pCL28XhoLBPV ATCC 39475, americký patentový spis číslo 4 840 896) glyceraldehyd-3- fosfátdehydrogenáza a enzymy zodpovědné za maltosu a galaktosu (GAL1 na plasmidu pRY121 ATCC 37658). Vhodné vektory a promotory k použití v kvasnicové expresi jsou popsány v literatuře (R. Hitzeman a kol., evropská zveřejněná přihláška vynálezu číslo 75,657A). Jako kvasnicových promotorů se také s výhodou používá kvasnicových urychlovačů jako UAS Gal ze Saccharoiyces cerevisiae (nalezených v souvislosti s promotorem CYC1 na plasmidu YEpsec--hllbeta ATCC 67024).

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.

• •4 ♦ 4 ··

4 4 · «4 4 • · · · · ·

4444 44

44

4 4

4

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1 Konstrukce vektoru

Shromáždí se gen SEQ ID Č. : 12 ze segmentu přibližně 220 páru bází a přibližně 240 páru bází, které jsou odvozeny 'z chemicky syntetizovaných oligonukleotidů, ( SEQ ID č. =12) /

CATATGAGGG TACCTATCCA AAAAGTACAA GATGACACCA AAACACTGAT ' 51 AAAGACAATA GTCACAAGGA TAAATGATAT CTCACACACA CAGTCAGTCT .101 CATCTAAACA GAAAGTCACA GGCTTGGACT TCATACCTGG GCTGCACCCC 151 ATACTGACAT TGTCTAAAAŤ GGACCAGACA CTGGCAGTCT ATCAACAGAT 201 CTTAACAAGT ATGCCTTCTA GAAACGTGAT ACAAATATCT AACGACCTGG 251 AGAACCTGCG GGATCTGCTG CACGTGCTGG CCTTCTCTAA AAGTTGCCAC 301 TTGCCATGGG CCAGTGGCCT GGAGACATTG GACAGTCTGG GGGGAGTCCT 351 GGAAGCCTCA GGCTATTCTA CAGAGGTGGT GGCCCTGAGC AGGCTGCAGG 401 GGTCTCTGCA AGACATGCTG TGGCAGCTGG ACCTGAGCCC CGGGTGCTAA 451 TAGGATCC

Segment 220 párů bází zasahuje od místa Ndel do místa Xbal v poloze 220 uvnitř kódovací oblasti a je shromážděn ze 7 překrývajících se oligonukleotidů, jejichž délka je 34 až 83 bází Segment 240 párůbází, který zasahuje od Xbal do místa BamHI, je rovněž shromážděn ze 7 překrývajících se oligonukleotidů, jejichž délka je 57 až 92 bází,

Ki

V '' Ke shromáždění těchto fragmentů se smísí příslušné 7 ol i gonukleotidy v ekvimolárních množstvích obvykle s koncentrací přibližně 1 až 2 pikomol na mikrolitr. Před shromážděním se všechny oligonukleotidy segmentu až na oligonukleotidy končící 5 fosforylují ve standardním kinasovém pufru s kinásou.T4 DNA za použití podmínek specifikovaných dodavatelem reakčních ČiA nidel. Směsi se zahřejí na 95 C a nechají se pomalu vychlad99 *· • 9 · · • · 9 • 9 9 • 9 ♦ «999 · • 99

9« 999« • * 9 9 • · · * • 9 99» 9

9 9

9

- 36 nout na teplotu místnosti během 1 až 2 hodin k zajištění správného popuštění oligonukleotidů, 01igonukleotidy se pak ligatují navzájem a do příslušného klonovacího vektoru jako pIC18 nebo plIC19 za použití 1 i gázy T4 DNA. Pufry a podmínky jsou podle doporučení dodavatele enzymu. Vektor pro fragment 220 párů bází se digestuje Ndel a Xbal, zatímco vektor pro fragment 240 párů bází se digestuje před použitím Xbal a BamHI. Ligačních směsí se použije k transformování buněk E.coli DH10B (obchodně dostupných od Gibco/BRL) a transformované buňky se umístí na destičky trypton-kvasníce ÍTY) obsahující 100 ug/ffil ampicíllinu, X-gal a IPTG. Kolonie, které vyrostou přes noc se kultivují v tekutém prostředí TY se 100 ug/ml ampicíllinu a použije se jich k izolaci plasmidu a k analyse sekvence DNA. Plasmidy se správnou sekvencí se uchovají k sestavení úplného genu. To se provede gelovým čištěním fragmentů 220 párů bází a 240 párů bází a ligací těchto dvou fragmentů do expresního vektoru jako je pRB182, ze kterého se odvodí kódovací sekvence pro A-C-B proinsulin a před použitím se digestuje Ndel a BamHI.

Příklad 2

Plasmid, obsahující sekvenci DNA, jež kóduje žádaný protein, se digestuje s PmlI a Bsu36I. Rozlišovací sekvence těchto enzymů jsou uvnitř kódovacího oboru pro protein v nukleotidových polohách 275 a 360, Klonovací vektor tyto rozlišovací ‘ sekvence neobsahuje..,. .V . důsledku - toho ·- j sou- -patrné’ po řestr i Kčríí & digescí en2ymu PmlI a Bsu36I pouze dva fragmenty, jeden odpovídající vektorovému fragmentu a druhý odpovídající fragmentu

i.,: přibližně 85 párů bází, osvobozených ze sekvence kódující protein. Tato sekvence může být nahrašena kteroukoli sekvencí DNA kódující substituce aminokyselin, uvedených v tabulce I. Tyto sekvence DNA jsou syntetizovány chemicky jako dva olígonukleotidy s komplementárními bázemi a konci, které jsou kompatibilní s konci generovanými digescí PmlI a Bsu36I. Chemicky syntetizované oligonukleotidy se mísí v ekvimolárních množstvích (1

3$r • Φ ·· • · · · · φ O Φ φ « φ · φ φ * • ••Φ «φ · ·· φφ ·Φ· • φ φ • · φ φ « « Φ·Φ φ • φ * ·· φ až 10 pikomol/mikrolitr), zahřejí se na 95 Ca nechají se poddrobují se teplotní hybridizaci pomalu klesající teplotou až na 20 až 25 C. Teplotně hybridizovaných oligonukleotidů se použije ve standardní ligační reakci. Preodukty ligace se transformují a analysují, jak je popsáno v příkladu 1.

Příklad 3

Pomocí plasmidu a postupu uvedeného v příkladu 2 se získá sekvence DNA kódující protein reprezentovaný proteinem 255 z tabulky I s vůdčí sekvencí Met a Arg. Plasmid se digestuje PmlI a Bsu36I. Syntetický fragment DNA sekvence 5-SEQ ID č.:13·.

(SEQ ID č.:13)

GTGCTGGCCTTCTCTAAAAGTTGCAGCTTGCCACAGACCAGTGGCCTGCAGAAACCGGAAA

GTCTGGACGGAGTCCTGGAAGCC tepelně hybridizovaný se sekvencí 5 -SEQ ID č. =14 (SEQ ID Č. -14)

TGAGGCTTCCAGGACTCCGTCCAGACTTTCCGGTTTCTGCAGGCCACTGGTCTGTGGCAAG

CTGCAACTTTTAGAGAAGGCCAGCAC se vloží mezi místa PmlI a Bsu46I. Po ligaci, transformací a ísolaci plasmidu se sekvence syntetického fragmentu ověří analysou sekvence DNA.

Příklad 4 ____________—

Použitím plasmidu a postupu uvedeného v příkladu 2 se 2Íská sekvence DNA kódující SEQ ID č.^;4 s vedoucí sekvencí Met Arg. Plasmid se digestuje PmlI a Bsu36I. Syntetický fragment DNA sekvence 5-SEQ ID č. :15‘(SEQ ID č.:15)

GTGCTGGCCTTCTCTAAAAGTTGCCACTTGCCAGCTGCCAGTGGCCTGGAGACATTGGACA

GTCTGGGGGGAGTCCTGGAAGCC tepelně hybridizovaný se sekvencí 5 -SEQ Wč. U6 (SEQ ID č. 16)

• 9 ·« 9999

9 9

9 9 • 99 9

TGAGGCTTCCAGGACTCCCCCCAGACTGTCCAATGTCTCCAGGCCACTGGCAGCTGGCAAGTGGCAACTTTTAGAGAAGGCCAGCAC se vloží me2i místa PmlI a Bsu46I. Po ligaei, transformaci a isolaci plasmidu se sekvence syntetického fragmentu ověří analysou sekvence DNA.

Technika transformování buněk uvedenými vektory je v oboru dobře známá a v literatuře popsaná (například Maniatis a kol. Molecular Cloníng: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Laboratory/ Cold Spring Harbor New York (1988) nebo Current Protocols in Molecular Biology, 1989, a doplňky). Techniky, zabývající se transformováním buněk E.coli, použité ve výhodné praxi podle vynálezu a zde vysvětlené, jsou v oboru dobře známy. Přesné podmínky, za kterých jsou buňky E.coli kultivovány, závisí na povaze linie hostitelských buněk E.coli a na použitých expresních nebo klonovacích vektorech. Například vektory, obsahující tepelně indukovatelné oblasti promotor-operátor, jako tepelně indukovatelná lamda-fágová promotor-operátorová oblast cl857, vyžadují teplotní posunutí o přibližně 30 až 40 C v kultivačním stavu k indukování synthesy proteinu.

Jako hostitelské buňky jsou ve výhodném provedení vynálezu použity buňky E.coli K12 RV308, jsou však k disposici četné jiné linie buněk, přičemž se bez záměru na jakémkoliv omezení uvádějí E.coli K12 L20L, L687. L693, - L507,- L640, - L641 , L695', L814 (E.coli B). Transformované hostitelské buňky se pak nanesou na příslušné medium pod selektivním tlakem antibiotik, odpovídajícím resistantnímu genu, přítomnému na expresním plasmidu. Kultury se pak inkubují při teplotě a po dobu příslušející použté linii hostitelských buněk.

Proteiny, které jsou expresovány bakteriálními expresními systémy vysoké úrovně, se charakteristicky shlukují do granuli nebo inklusních těles, která obsahují vysokou míru přeexpreso·· ·· » · ♦ · • · « • « · · • · · ««·· ·· ♦ ··

ΦΦ Φ S Φ Φ φ φ · φ φ φ · φ · φφφ φ φ φ φ • ΦΦ φφ φφ φφ ·*·ι váného proteinu (Kreuger a kol., Protein Folding, vydavatelé Gierasch a King str. 136 až 142, 1990), American Association for the Advancement of^Science Publication č. 89 až 180, Washington, D.C.). K zajištění dalšího čištění a k izolování Sáti, daného proteinového produktu musejí být takové proteinové agregáty rozpuštěny. Id. K rozpouštění proteinů existuje řada technik, používajících silně denaturujících roztoků jako systému guanidin/kysel ina chlorovodíková a/nebo mírně denaturujících roztoků jako je močovina. Postupné odstraňování denaturačních činidel (často dialysou) v roztoku umožňuje, aby protein zaujal svou nativní konformaci, Příslušné podmínky denaturace a vinutí jsou určeny příslušným systémem exprese proteinu a/nebo příslušným proteinem.

Příklad 5

V buňkách E.coli se expresuje protein podle příkladu 3 s vedouc! sekvencí Met a Arg, izoluje se a vine buď zředěním v PBS nebo zředěním v močovině 8M (oba obsahující 5 mM cysteinu) a exhaustivní dialysou vůči PBS. V žádném z těchto postupů se nepozoruje agregace proteinu nebo jen v malé míře. Po konečném vyčištění proteinů chromatografií vylučující velikost se proteiny zkoncentrují na 3 až 3,5 mg/ml v PBS. Nepozoruje se virtuálně žádná agregace proteinu na rozdíl od nativního lidského proteinu, u kterého je patrná značná agregace po zkoncentrování. ...................- - - - —

Analysa proteinů reversní fázovou HPLC naznačuje, že lidský Ob protein eluuje při přibližně 56,6 % acetonitrilu, myší protein při 55,8 % a titulní protein s vedoucí sekvencí Met Arg při 53,7 %. Tudíž neočekávaně má lidský i myším insert vyšší hydrofi 1icitu než molekuly lidské nebo myší.

• · »9 9 999

·

Příklad 6 ·

• *

9

9

99· · »

V E.coli se expresuje protein SEQ ID č. =4 s vedoucí sekvencí Met a Arg. Granule se isolují a rozpustí v 8M močovině s 5mM cysteinem. Protein se vyčistí anexovou chromátografií a vine se zředěním v močovině 8M (obsahující cystein 5mM) a odsávací dialysou vůči PBS. Hodnota pH roztoku proteinu se sníží na přibližně 2,8. Vedoucí sekvence Met Arg se roztěpí přísadou 6 až 10 mi li jednotek dDAP na 1 mg proteinu. Konversní reakce se nechá probíhat 2 až 8 hodin při teplotě místnosti. Postup reakce se sleduje vysoce výkonnou reversní fázovou chromatografií. Reakce se ukončí nastavením hodnoty pH na 8 hydoxídem sodným. Protein děsí Met-Arg) se dále čistí katexovou chromatografií v přítomnosti 7 až 8M močoviny a chomatografií vylučující velikost v PBS. Po konečném vyčištění proteinů chromatografií vylučující velikost se proteiny zkoncentrují na 3 až 3,5 mg/ml v PBS. Nepozoruje se virtuálně žádná agregace.

Obsažené proteiny se s výhodou expresují vedoucí sekvencí. Operativní vedoucí sekvence jsou pracovníkům v oboru známé; avšak s výhodou je vedoucí sekvence Met-Rf, kde Ri je jakákoli aminokyselina s výjimkou Pro, takže expresované proteiny mohou být snadno přeměněny na protein podle vynálezu s Cathepsinem C. S výhodou je Ri Arg, Asp nebo Tyr a nejvýhodněji jsou proteiny expresovány vedoucí sekvencí Met-Arg. Je zajímavé, že vedoucí sekvence neovlivňuje významně stabilitu nebo aktivitu aktivního proteinu. Avšak vedoucí sekvence je s výhodou odštěpena od proteinu. Proteiny obecného vzorce : Met-RiSEQ ID č.:l jsou tudíž užitečné jako biologická činidla a s výhodou jako polotovary.

Proteiny podle vynálezu se čistí v oboru známými způsoby, které zahrnují reversní fázovou chromatografi i, ionexovou chromatografi i a chromatografi i vylučující velikost.

♦ · ·* • · · • · *

9.9

ΙΙ·« ·· • · • 99

9999 · 9 * · • 999 · · 4

Proteiny podle vynálezu obsahují dva cystě i nové zbytky. Může tudíž být'vytvořena disulfídová vazba ke stabilizaci proteinu. Vynález se týká proteinů obecného vzorce ÍI) a (II), kde Cys v poloze 96 je zesltén na Cys v poloze 146 stejně jako takové proteiny bez takových disulfidových vazeb. Kromě toho mohou proteiny podle vynálezu existovat, zejména když se formulují, jako dimery, trimery, tetramery a další multimery. Takové multimery jsou zahrnuty do rozsahu vynálezu.

Vynález se také týká způsobu léčení obezity. Způsob zahrnuje podávání organismu účinného množství protiobezitniho proteinu v dávce přibližně 1 až 1000 qg/kg. Výhodná dávka účinné látky je 10 až 100 qg/kg. Typická denní dávka pro dospělou osobu je přibližně 0,5 až 100 mg. Při praktikování tohoto způsobu mohou být sloučeniny obecného vzorce I podávány v jedné denní dávce nebo v několika dávkách za den. Léčebný režim může vyžadovat podávání ve větším časovém úseku. Množství v podávané dávce a celkové podávané množství určí lékař a závisí na faktorech, jako je povaha a rozsah onemocnění, věk a _# celkový zdravotní stav pacienta a snášenlivosti sloučeniny pacientem .

Vynález se dále týká farmaceutických prostředků zahrnujících sloučeniny podle vynálezu. Proteiny, s výhodou ve formě farmaceuticky přijatelných solí, mohou být formulovány pro parenterální podání pro terapeutické nebo profylatické léčení obezity. Například sloučeniny obecného vzorce I se mohou mísit s běžnými farmaceutickými nosiči a excipienty. Prostředky obsahující proteiny podle vynálezu obsahují hmotnostně přibližně 0,1 až 90 % aktivního proteinu, s výhodou v rozpustné formě a obecněji 10 až 30 %. Kromě toho mohou být tyto proteiny podávány samotné nebo v kombinaci s jinými činidly proti obezitě užitečnými v léčení diabetes.

Pro intravenosní podávání (iv) se protein podává v běžně používaných intravenosních kapalinách a podává se infusí.

·· • 9 ·

* • » • 9 9 « · • *· ·· ···· • · 9 • · 9 ··· 9 »

Použít lze takové kapaliny jako například fyziologický roztok, Ringerův roztok nebo roztok 5% dextrosy.

Pro intramuskulární podávání může být sterilní prostředek s výhodou ve formě vhodně rozpustné soli proteinu obecného vzorce I nebo II, napříkladve formě hydrochloridové soli, rozpuštěn a podáván ve farmaceutickém ředidle, jako je voda prostá pyrogenu (destilovaná), fyziologický roztok nebo 5% roztok glukosy. Vhodná nerozpustná forma sloučeniny může být připravena a podávána jako suspense na vodné bázi, nebo ve farmaceuticky vhodné olejové bázi, jako je například ester mastné kyseliny s dlouhým řetězcem jako ethyloleát.

Schopnost sloučenin podle vynálezu léčit obezitu dokládá následujíc! test:

Biologické zkoušky

Parabiotické pokusy naznačují, že protein je uvolňován periferální tukovou tkání, a že protein je schopen ovládat tělesnou hmotnost normálních i obézních myší. Proto je nejtěsněji závislým biologickým testem injektovat zkušební látku některou z četných cest (e.g.,i.v., s.c., i.p. nebo mini pumpováním nebo kanylou) a pak sledovat spotřebu potravy a vody, přírůstky hmotnosti, plasmovou chemii a hormony (glukosu, insulin, ACTH, kortikosteron, GH, T4) v různých časových obdobích.

Vhodnými pokusnými zvířaty jsou normální myši (například ICR) a obézní myši (ob/ob, Avy/a, KK-Ay, tubby, fat). Model myši obezity ob/ob a diabetes je v oboru všeobecně přijímán jako indikativní pro stav obezity. Kontrolou nespecifických jevů pro tyto injekce je použiti nosné tekutiny bez aktivního činidla podobného složení v těchže zvířatech při sledování stejných parametrů nebo účinné látky samotné ve zvířatech, o kterých je domněnka že jim chybí receptor (myši db/db,

4* ·· * ♦· · 4 444 · • 4 4 9 4 · • 9*4 · · 4

4 · 4 4 ·

44·· ·· ^1,1 ·*

- 43 fa/fa nebo krysy cp/cp). Proteiny demonstrující aktivitu v těchto modelech předvedou podobnou aktivitu u jiných savců, zejména u 1idí.

Jelikož sa cílovou tkáň je považován hypothalamus, kde se reguluje příjem potravy a lipogenický stav, je podobným modelem vstřikováni zkušební látky přímo do mozku (například

i.c.v. injekcí cestou laterálního nebo třetího obratle, nebo přímo do specifických hypothalmických zárodků (například obloukovitých, paraventrikulárních, perifornických zárodků). Měřit se dají stejné parametry jako shora, nebo lze sledovat uvolňování neurotransmitterů o nichž je známo, že regulují krmení nebo metabolismus (například uvolňování NPY, galaninu, norepinefrinu, dopaminu, beta-endorfinu).

V souladu s uvedenými návody a příklady se připraví reprezentativní proteiny, jejichž seznam je v tabulce II. Popis proteinu v tabulce II a v následné tabulce III označuje substituované aminokyseliny SEQ ID č.^;3 podle obecného vzorce I. Například Ala(lOO) značí protein SEQ ID č. '-3, kde Trp v poloze i00 je Ala. Označení Met Arg znamená, že protein byl připraven a zkoušen s připojenou vedoucí sekvencí Met Arg. Aminokyselinové sekvence proteinů v tabulce II a III byly potvrzeny hmotovou spektroskopií a/nebo analysou aminokyselin. Schopnost proteinů léčit obezitu myší ob/ob je rovněž předvedena v tabulce II, kde se uvádějí připravené a zkoušené proteiny.

V tabulce II se ve sloupci I uvádí dávka, ve sloupci II cesta podání, ve sloupci III přijímání potravy v g/myš v den 1, v den 2 a v den 3, ve sloupci IV přijímání potravy v procentech se zřetelem na kontrolu v den 1, v den 2a v den 3 a ve sloupci V změna tělesné hmotnosti ode dne 0.

·« ··· ·

• · ···* ·· tel fí >5C %

ť

>

-

Cl < & ta

fta K oj 1

0 *> o 1

to —ta 1

O ► —ta t

-ta C t

o —ta t

Γ* O 04 1

o - —ta 1

0 ** o 1

O ta o

y *1 1

L ** •H t

to Xj o t

1-4 O 1

Cv ♦H 1

y ‘ θ' 1

0 •«J OJ 1

0 “-i —ta 1

O v OJ r

0 x o 1

to v —ta 1

Cl *. O 4

0 v -ta 1

Cl X o 1

OJ <1

0 — —4 1

CD A 9 1

-ta < Wt 1

0 *» O 1

θ' ta -ta 1

O * »4 1

0 v —4 (

to O l

1-1 X —ta t

OJ ta o l

«-4 1

Cl 1

#*» o 4

04 ta O

0 * O i

OJ * o

0 *. 1—1 1

O ta iC 1

y tn —ta J

o 1

O —« —ta 1

tO ta O 1

—ta ta. —ta 1

d R1 o 4

—

-ta 5 co

tH —i —ta

0 x o 1

—ta O (

0 ta O 1

0 O r

to o 1

r* ta O

to o 1

r* — o

-ta • ta O

θ' ta O 1

CD O í

n *· o 1

y * O 1

fta *- o

LTj O i

ta Ϊ

r* o 1

Ο- Χ o 1

o- o

Γ*· ta o 1

lA 4. O 1

OJ O 1

—ta * O 1

0 š o

Oj v y y

N * Ox to

CD *— <90 Cl

n 0 0

OJ >· to Oí

r* to to

o< ta 0 n

—ta ♦» O- y

0 ** 0 0

cn ». ta θ' to

0 O V»

to f** r*

o ta Ul

«Ο ta 0 tO

Ol ta Oi Oj

O y 0

O y Cl

OJ •ta ΡΊ m

0 to lA

lA y o*

o ta. Oi Cj

y — y 0

04 >0 Cl

0 0 IA

> M

OJ 1

o v o *n

r* < Ol QD

O* — n 0

OJ r r* «Ο

oj * 0 y

® ci r*

ci y ci

to as 0

OJ ta y to

o <· to to

OJ «* y to

o Ό to

to X O r*

U1 * Oí θ'

O taí tA

OJ «* OJ Cl

Γ» y y

tn y o·

0 y to

to ta, 0 Γ*

OJ y 0

-ta 0 to

—ta x 0 y

—ta v fx 0

—ta *g

o »· lA r*

Oj V Ol 0

OJ Τ» —ta to

to ta ^ta O*

tn < σι 0

—ta CD CD

0 Ital 0

y ť —ta to

OJ * o <h o*

tn >*> tn o·

ta 0

l-< tat 0

in to θ'

ďl OJ o·

0 ta to lA

OJ 04 0

OJ O O·

0 ta O 0

—ta Oi 0

Cl f —ta 0

lA o 0 Ό

θ' y 0

a — —ta 0

O ta 0 r*

1 j w H H

n 1

Cl rf

*X> m

to v oj

r* ta ci

^ta ta, -ta

CQ — OJ

CD ta —ta

ci n

—ta Cl

Ό Ol

r- OJ

0 <*l

to OJ

tn ta Cl

O OJ

Cl y

to d

4Π X 04

-ta IA

Ol 04

0 X, Cl

to tn

C| ta OJ

0 Cl

0 * OJ

Cl ta y

£

tO

*n y

to ta. ci

0 ta y

0 -ta

-ta ta Cl

y OJ

*4 ta y

y ta ci

un ΓΊ

y *· C-|

tn ta Oj

to X Cl

o- Cí

to ta OJ

r* *· y

iH cs

Ι/Ί ta Cl

y un

tn ta ci

Cj y

y s LA

04 Cl

0 i, Cl

IA — Cl

—ta v LD

—ta £ o

0 C

CD y

i—l ta, y

CD ta y

to 04

e ci

r- «η

Cl ta y

Ol y

O y

n y

m y

σ> Cj

θ'- ta o

Oi 03

r- y

Cl Cl

CD Cl

to y

—ta y

OJ ta. y

0 *- iA

-ta ta. y

o IA

o* y

r- v 0

p _ta

M W

Φ Xl Z> O lu

(J ca

U «

U W

U tfl

U tn

Q Ul

t» ca

υ ω

U CA

U CA

υ CA

υ CA

O CA

o CA

O in

U CA

u CA

CJ CA

Cl CA

ÍJ CA

Cl CA

U 0

U 0

a w

O CA

U CA

H

σ a

o o m

9 r»

O o ci

O O|

o o ci

o Cl

o o Cl

o ci

O O Ci

O m

O O ΓΊ

O r*n

o O Cl

O c»

o o Cl

O d

O O Cl

O d

O

O a ci

O 0

O

o o Cl

o 0

O O Cl

O C|

c φ taj 0 u O-

cs o> —ta C *-t Q 1 Cn u, < 1 AJ Φ y

o o —ta C -ta U 1 O) u < i aJ Q) X

CO c —ta c —J o 1 O) u < 1 A) Φ X

O o c u r- OJ (0 —ta <

O O «-4 □ Φ «J

J O o taH 3 0) r- Oí <0 <

O o 1—f c —K O r* OJ c <

O O c O

O O 1-^ c —ta o 4 cn μ < 1 AJ Ji

0 Cl —ta C -ta O

O o d C •—4 CP o- Oi M ai CA 1 CA kl < 1 aJ Φ

to o —ta « ΐ > J tA O c —ta O O —ta U J= E-·

rta —* —4 a M 0 O —ta □ tata O θ' o —4 0 u O.

—ta O —ta £ o o —ta c O o* 0 ita Φ CA

0 o —ta 0 u a to o -ta ω >1 LA O —ta c -ta O

-ta —ta —ta Cl V) rt «» 0 O —ta □ a

O O ^ta c -ta 13 o· 0 u Φ CA 01 u <

—ta O —ta k X

v ·« *··«

-45• · · · • · · « ♦ · · • · · «··· ··

I ·· ··

I · · 4 ♦· ♦···

• · · ··· · « « · · ···· *· • ·« *· ·

- 46 Podobné studie se provedou in vitro pomocí isolované tukové tkáně v systému per/fusním nebo v systému tkáňové lázně. V této situaci se sleduje uvolňování neurotransmiterů nebo se monitorují elektrofyziologické směny.

Fyzikální a chemické vlastnosti sloučenin podle vynálezu se posuzují následující zkouškou.

Třepací test

Výchozí roztoky obsahují čištěný Ob protein ve fosfátem pufrované solance (Gibco BRL, Dulbecco PBS bez fosforečnanu vápenatého nebo hořečnatého (Life Technologies, lne. Grand Island, N.Y). Koncentrace proteinu jsou obvykle předurčeny jejich absorbancí při 280 nm. Pro Ob proteiny s teoretickou hodnotou absorbance při 280 nm 0,5 nebo méně pro roztok 1 mg/ml v 1-cm kyvetě je však použito alternativní metody. Celkové integrované plochy pod vrcholy se stanoví z 25 ul vzorku injektovaného do sloupce analytické chromatografie vylučující velikost /SEC) (Superdex-75, Pharmacia), která probíhá při teplotě okolí v PBS a monitoruje se při 214 nm. Tato plocha pod vrcholy se pak porovnává s celkovou plochou SEC Ob proteinu, jehož koncentrace byla napřed určena přiabsorbanci 280 nm. Z těchto analys se provede zředění s PBS k získání konečné koncentrace každého Ob proteinu přibližně 1,6 mg/ml. Podíly těchto roztoků se nastaví na hodnotu pH 5,0, 6,0 , 7,0 a 8,0 pomocí malých dávek zředěné kyseliny octové nebo zředěného roztoku hydroxidu sodného. Tyto nastavené roztoky se pak kvant itavně vyhodnotí pomovcí absorbance UV nebo technikou SEC.

Roztoky 0b proteinu se pak přidají do 2 ml skleněných autovzorkových fiol (Varian Instrument Group, Sunnyvale, CA), z nichž každá obsahuje 15 teflonových kuliček o průměru 3,175 mm (Curtin Matheson Scientific, Florence, KY). Z roztoků ve fiolách se vypudí bublinky vzduchu mírným protřepáním. Fioly

» · ·

ΦΦ ·· • φ φ* φφφ φ

φ φ je mírně přeplní až nahoru a pak se uzavřou šroubovou zátkou s teflonovým těsněním. Pro každý vyhodnocovaný časový úsek protřepávacího testu se použije zvláštní fioly.

Zkušební fioly se umístí do rotačního přístroje v inkubáO toru s teplotou přesně nastavenou na 40 C. Fioly se odsředí 30 otáčkami za minutu, přičemž teflonové kuličky putují ode dna k povrchu, přičemž zůstávají úplně v roztoku.

Po předem určených časových periodách se obsah fiol vyjme a odstřeďuje se 5 minut při teplotě okolí (odstředivka Fisher Scientic Model 2350. Koncentrace proteinů v čirých supernatantech se zjišťují opět technikou absorbance UV a SEC. Procento Ob proteinu, zbývajícího v roztoku, se vypočte z koncentrací Ob v počátečních roztocích s nastavenou hodnotou pH a v supernatantech po třepacím testu.

Chemická a fyzikální stálost sloučenin je vyznačena v tabulce III. Popis proteinu v tabulce III vyznačuje substituované aminokyseliny SEQ IF č.:3 podle vzorce I. Například Ala (100) znamená protein SEQ ID č.=3, kde Trp v poloze 100 je nahrašen Ala. Pro porovnání jsou též uvedeny pro lidský Ob protein a myší ob protein.

Tabulka III

Protein	mg/mL	Teplota	ot/min	pH	Doba (hJL.	Zbytek (?£)
1 i dský	1,6	40	30	5	7	44,7
5	47	36,6
6	7	63,4
6	47	56,9
7	7	98,6
7	47	93.7
8	7	99 í 9
8	47	95,9
myší	1,6	40	30	5	47	73,5
6	47	94,9
7	47	67,4
8	4.7	31/6

'« ·· • · · ♦ » · « · · ♦ · · ···· ·· «* ·*«· ·· · ··

AlalOO	1,6	40	30	5	47	98,4
6	47	98,0
7	47	95,5
8	47	94,2
Met-Arg-(Ser97)	1,6	40	30	5	47	/ 26,4
6	47	38.9
7	47	55',0
8	47	63,3
Met-Arg(GlnlOO)	V	40	30	5	47	93,5
6	47	77'0
7	47	85,6
8	47	98,0
Met-Arg(Ser97,GlnlOO)	1,6	40	30	., 5	47	87,9
6	47	91', 8
7	47	94,6
8	47	?3P
Met-Arg(Ser97,GlnlOO, ThrlOl)	1,6	40	30	5	47	f — 93,8
6	47	96,5
7	47	96',-5
8	47	99,8
Met-Arg-(LyslOfi, Prol07,Glul08, Asplll)	V	40	30	5	47	92 4
6	47	62,8
7	47	46,8
8	47	41,3
Met-Arg(Ser97,GlnlOO, ThrlOl, Lysl06, Prol07,Glul0S, Asplll)	1,6	40	30	5	47	100,3
	6	47	99,9
' 7	47	98'0
	8	47	94,4
Met-Arg-(AlalOO)	1,6	40	30	5	47	91,3
	6	47	' 92.3
	7	47	98^5
8	47	100', 3
Met-Arg-(LeulOO)	1,6	40	30	5 .	47	46 9
	6	47	36 3
	7	.47	51,2
	8	47	84',8

I · · * » ·

Sloučeniny jsou aktivní v alespoň jednom 2 uvedených biologických testů a jsou protioběsitnimi činiteli. Jako takové se hodí k léčení obezity a poruch s obesitou souvisejících. Proteiny se však nehodí poue jako terapeutická činidla; prdovníkům v oboru je 2řejmé, že proteiny se hodí k výrobě protilátek v diagnostickém použití a jako proteiny se hodí jako přísady do krmiv zvířat. Dále se hodí proteiny k řízení hmotnosti pro kosmetické účely u savců. Kosmetické účel^mají ovládat hmotnost savců ke zlepšení tělesného vzhledu. Savci nemusí být nutně obézní. Vynález se týká také takového kosmetického použití sloučenin podle vynálezu.

Shora jsou popsány principy, výhodná provedení a způsoby provádění vynálezu, která jsou však míněna toliko jako bližší objasněni a nijak jako omezení vynálezu. Jsou proto možné varianty a obměny v rámci vynálezu.

9-,

Průmyslová využitelnost Sř _k Protein vhodný pro výrobu farmaceutických prostředků pro léčení obezity a poruch souvisejících s obezitou. Specielně jde o proteiny proti obezitě, které regulují tukové tkáně.

Claims (18)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Protein obecného vzorce I (SEQ ID č.:1)

   Val 1 Pro Ile Xaa Lys Val Xaa 5 Asp Asp Thr Lys 10 Thr Leu Ile Lys 15 Thr Ile Val Thr Arg Ile Xaa Asp Ile Ser His Xaa Xaa Ser Val Ser Ser • 20 25 30 Lys Xaa Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile 35 40 45 Leu Thr Leu Ser Lys Xaa Asp Xaa Thr Leu Ala Val Tyr Xaa Xaa Ile z 50 55 60 Leu Thr Ser Xaa Pro Ser Arg Xaa Val Ile Xaa Ile Xaa Xaa Asp Leu 65 70 75 80 Glu Xaa Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys 85 90 95 His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly 100 105 110 Val Leu Glu Ala Ser Xaa .Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125 Leu Xaa Gly Ser Leu Xaa Asp Xaa Leu Trp Xaa Leu Asp Leu Ser Pro 130 135 140 Gly Cys 145

   kde : Xaa v poloze 4 je Gin nebo Glu, * - Xaa v poloze 7 je Gin nebo Glu, ií Xaa v polo2e .22 je Asn, Asp nebo Glu, Λ Xaa v poloze 27 je Thr nebo Ala, Xaa v polo2e 28 je Gin, Glu nebo chyb í, * Xaa v poloze 34 je Gin nebo Glu, Xaa v po1 ose 54 je Met, methioninsulfoxid, Leu, Ile Ala nebo Gly Xaa v poloze 56 je Gin nebo Glu, Xaa v po1oze 62 je Gin nebo Glu, Xaa v poloze 63 je Gin nebo Glu,

   9'» «V

   I 9 9 · • a 9 a • 9 9 9

   9 9 9 • 9 9 9 B9 • · · a 9 ♦ · ¹ • 99 999 9

   9 9 * ·

   9« ·· ·

   Xaa v po1oze 68 je Met, methioninsulfoxid, Leu, Ile, Val Ala nebo Gly Xaa v po1oze 72 je Asn, Asp nebo Glu Xaa v poloze 75 je Gin nebo Glu, Xaa v poloze 77 je Ser nebo Ala, Xaa v poloze 78 je Gin, Asn nebo Asp, Xaa v po1oze 82 je Gin, Asn nebo Asp, Xaa v poloze 118 je Gly nebo Leu,' Xaa v poloze 130 je Gin nebo Glu, Xaa v poloze 134 je Gin nebo Glu Xaa v poloze 136 je Met, methiominsulfoxid, Leu, Tle, Val Ala nebo Gly Xaa v poloze 139 je Gin nebo Glu,

   přičemž tento protein má alespoň jednu substituci volenou ze souboru zahrnuj í c í ho:

   His v poloze 97 je nahražen Gin, Asn, Ala, Gly, Ser, nebo Pro,

   Trp v poloze 100 je nahražen Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Phe, Tyr, Ser, Thr, Gly. Gin, Val nebo Leu, Ala v po1oze 101 je nahražen Ser, Asn, Gly, His, Pro, Val; Ser v poloze 102 je nahražen Arg, Gly v po1oze 103 je nahražen Ala, Glu v poloze 105 je nahražen Gin, Thr v poloze 106 je nahražen Lys nebo Ser, Leu v poloze 107 je nahražen Pro, Asp v poloze 108 je nahražen Glu nebo Gly v poloze 111 je nahražen Asp, Trp v poloze 138 je nahražen Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Ile, Phe, ' fyr, Ser, Thr, Gly, Gin, , Val nebo Leu,

   nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl
2. 2. Protein podle nároku 1, který má alespoň jednu substituci volenou ze souboru zahrnujícího:

   His v poloze 97 je nahražen Gin, Asn, Ala, Gly, Ser, nebo Pro,

   Trp v poloze 100 je nahrazen Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Ile, Phe. Tyr, Ser , Thr, Gly, Gin, Val nebo Leu, Ala v poloze 101 je nahrašen Ser, Asn, Gly, His, Pro, Thr nebo Val: Ser v po1oze 102 je nahrašen Arg, Gly v poloze 103 je nahrašen Ala, Glu v po 1 oze 105 je nahrašen Gin, Thr v poloze 106 je nahrašen Lys nebo Ser, Leu v po1oze 106 je nahražen Pro, Asp v poloze 108 je nahrašen Glu Gly v po1oze 111 je nahražen Asp,

   nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.
3. 3. Protein obecného vzorec (II)^: (SEQ ID č. 2)

   Val Pro Ile 5 Gin Lys Val 10 Ile 15 Lys Thr Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu 20, 25 30 Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gin Ser Val Ser Ser 35 40 45 Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile 50 55 60 Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin Ile 65 70 75 80 Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gin Ile Ser Asn Asp Leu Glu 85 90 .95 Asn Leu Arg Asp Leu Leu -His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys 4 His 100 105 110 Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly i 115 120 125 Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 130 135 140 Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Léu Ser Pro

   145

   Gly Cys (II)

   kde Asn v poloze 22 je př í pádně Gin nebo Asp Thr v po1oze 27 je př i pádně Ala Gin v po 1 oze 28 je př í pádně Glu nebo chybí Met v poloze 54 je př í pádně Ala Met v poloze 68 je případně Leu Asn v poloze 72 je př í pádně Glu nebo Asp Ser v poloze 77 je př í pádně Ala Gly v poloze 118 ! je případně Leu

   přičemž uvedené proteiny mají alespoň jednu substituci volenou ze souboru zahrnujícího:

   His v poloze 97 je nahražen Gin, Asn, Ala, Gly,Ser nebo Pro, Trp v poloze 100 je nahražen Ala, Glu, Asp, Asn,Met, Ile, Phe, Tyr, Ser, Thr, Gly, Gin, Val, nebo Leu, Ala v po1oze 101 je nahražen Ser, Asn, Gly, His, Pro, Thr ne- bo Val, Ser v poloze 102 je nahražen Arg, Gly v poloze 103 je nahražen Ala, Glu v poloze 105 je nahražen Gin, Thr v poloze 106 je nahražen Lys nebo Ser, Leu v poloze 107 je nahražen Pro, Asp v poloze 108 je nahražen Glu, dy v poloze 111 je nahražen Asp nebo, Trp v poloze 138 je nahražen Ala,Glu, Asp, Asn, Met, Ile, Phe Tyr, Ser, Thr, Gly, Gin, Val nebo Leu

   nebo jeho farmaceuticky vhodné solí.
4. 4. Protein podle nároku 3, kde

   Trp v poloze 100 je Gin, Tyr, Phe, Ile, Val nebo Leu, nebo Trp v poloze 138 je Gin, Tyr, Phe, Ile, Val nebo Leu.

   Protein obecného vzorce III (SEQ ID č. 3)
5. 5.

   ·♦»» · •

   4« 4 4 • 4

   - 5410

   Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr 20 25 30 Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gin Ser Val Ser Ser 35 40 45 Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile 50 55 60 Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin Ile 65 70 ⁷⁵ 80 Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gin Ile Ser Asn Asp Leu 85 90 95 A Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys I 100 105 110 His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 130 135 140 Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser Pro

   145

   Gly Cys kde .(III) '1 í

   i

   His v poloze 97 je nahrašen Gin, Asn, Ala, Gly, Ser nebo Pro, Trp v poloze 100 je nahrašen Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Ile, Phe, Tyr, Ser, Thr, Gly, Gin, Val nebo Leu, Ala v poloze 101 je nahražen Ser, Asn, Gly, His, Pro, Thr •1 nebo Val, Ser v poloze 102 je nahrašen Arg, Gly v po1oze 103 je nahražen Ala, Glu v po1ože 105 je nahražen Gin, Thr v poloze 106 je nahražen Lys nebo Ser, Leu v poloze 107 je nahrašen Pro, Asp v poloze 108 je nahrašen Glu, _f Gly v poloze 111 je nahrazen Asp, nebo Trp v po1 ose 138 je nahrašen Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Ile, Phe Tyr, Ser, Thr, Gly, Gin, Val nebo Leu,

   nebo jeho farmaceuticky vhodné soli.

   ·· ·· • »· · • ·. · • · · · • · · *»·* ·· «·* ·· • l · * ’ ♦ ···

   6. Prote i n podle : nároku 5, kde His v po1oze 97 je nahražen Gin, Asn, Ala, Gly, Ser nebo Pro, Trp v poloze 100 je nahražen Phe, Tyr. Ala, Glu. Asp, Asn, Met, Ile, Ser, Thr, Gly, Gin, Val nebo Leu Ala v po1oze 101 je nahražen nebo Val, Ser, Asn, Gly, His, Pro, Thr Glu v poloze 105 je nahrazen Gin, Thr v poloze 106 je nahražen Lys nebo Ser,, Leu v poloze 107 je nahraěen Pro, Asp v poloze 108 je nahražen Glu, Gly v poloze 111 je nahražen Asp nebo, Trp v poloze 138 je nahražen Phe, Tyr, Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Ile, Thr, Gly, Gin, Val nebo Leu. 7. Prote i n podle nároku 6, kde His v poloze 97 je nahraěen Ser nebo Pro, Trp v poloze 100 je nahraěen Ala, Gly, Gin, Val, Ile nebo Leu, Ala v poloze 101 je nahražen Thr nebo Trp v poloze 138 je Ala, Ile, Gly, Gin, Val nebo Leu.
6. 8. Protein podle nároku 1 až 7, kde

   Cys v poloze 96 je vázána disulfidickou vazbou na Cys v poloze 146.
7. 9. Protein SEQ ID č.=4 (SEQ ID č.:4)

   J Val Pro Ile 5 Gin Lys Val 10 Ile 15 Lys Thr Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu ⁽v 20 25 30 Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gin Ser Val Ser Ser 35 40 45 Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile 50 55 60 Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin Ile 65‘ .70 75 80 Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gin Ile Ser Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys

   100

   105

   110 ·· ·· • · · · • * *4 • · · * • · · ···« »· *· ♦ * « ♦ • Φ · · · · * * · * ·** · • · ♦ « ♦ *·« ♦» ♦» ♦'

   His Leu Pro Ala Ala Ser Gly Leu 120 Glu Thr Leu Asp Ser Leu 125 Gly Gly 115 Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu 130 Gin Gly Ser Leu Gin 135 Asp Met Leu Trp Gin 140 Leu Asp Leu Ser Pro 145 Gly Cys

   kde Cys v poloze 96 je vá2án disulfidickou vazbou na Cys v po1oze 146 nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl.

   10 Prot e in SEQD ID č. 5 :5 . -·5) 15 (seq : [D č 10 Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp. Thr Lys Thr Leu Ile. Lys Thr Xle Val Thr 20 Arg Ile Asn Asp 25 Ile Ser His Thr Gin 30 Ser Val Ser Ser Lys 35 Gin Lys Val Thr Gly Leu 40 Asp Phe Ile Pro Gly 45 Leu His Pro Ile Leu 50 Thr Leu Ser 55 Lys Met Asp Gin Thr Leu 60 Ala Val Tyr Gin Gin Ile 65 Leu Thr Ser Met 70 Pro Ser Arg Asn Val Ile 75 Gin Ile 80 Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg 85 Asp Leu Leu His Val 90 Leu Ala Phe 95 Ser Lys Ser Cys His Leu Pro 100 Gin Ala Ser Gly 105 Leu Glu Thr Leu Asp 110 Ser Leu Gly Gly Val 115 Leu Glu Ala Ser Gly Tyr 120 Ser Thr Glu Val Val 125 Ala Leu Ser Arg Leu 130 Gin Gly Ser 135 Leu Gin Asp Met Leu Trp 140 Gin Leu Asp Leu Ser Pro 145 Gly Cys Kde Cys v poloze 96 je vázán disulfidickou vazbou na Cys

   4 4' 44 • » 4 ·

   4 4 · • 4 4 4

   4 · ·

   4444 44

   4-44 · • 44*

   4 4 444 4

   4 » 4 loze 146 nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl.

   11. Protein SEQ ID č.^;6 (SEQ ID δ. =6)
8. 10 15

   Val Pro Ile Gin 20 Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu 25 Ile Lys Thr 30 Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gin Ser Val Ser Ser 35 40 45 Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile 50 55 60 Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin Ile 65 70 75 80 Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gin Ile Ser Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys 100 105 110 His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 130 135 140 Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp Leu Ser Pro

   145

   Gly Cys ma Cys v pokde Cys v poloze 96 je vázán disulfídickou vazbou loze 146 nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl.
9. 12. Protein SEQ ID δ.·7 (SEQ ID S. =7)

   5 10 15

   Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys

   Thr

   20 25 30

   Ile Val Thr Arg. Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gin Ser Val· Ser Ser ·« *· φ · φ · « · • φ · •It· *· • ί·

   ΦΦ φ · • · · • · φ φ • · φ

   ΦΦ · »♦ • φ φ • φ * φφφ · • φ

   35 40 45 Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile 50 55 60 Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin Ile 65 70 75 80 Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gin Ile Ser Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys 100 105 110 His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Val Leu ' Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 130 135 140 Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp Leu Ser Pro 145 Gly Cys

   kde Cys v poloze 96 je vázán disulfidickou vazbou na Cys v poloze 146 nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl.
10. 13, Protein SEQ ID č. =8 (SEQ ID č.^:8)

    Val Pro Ile Gin 5 Lys Val Gin Asp Asp 10 Thr Lys Thr Leu Il.e 15 Lys Thr Ile Val Thr 20 Arg Ile Asn Asp Ile 25 Ser His Ala Gin Ser 30 Val Ser Ser Lys Gin 35 Lys Val Thr Gly Leu 40 Asp Phe Ile Pro Gly 45 Leu His Pro Ile Leu 50 Thr Leu Ser Lys Met 55 Asp Gin Thr Leu Ala 60 Val Tyr Gin Gin Ile 65 Leu Thr Ser Met Pro 70 Ser Arg Asn Val Ile 75 Gin Ile Ser Asn Asp 80 Leu Glu Asn Leu Arg 85 Asp Leu Leu His Val 90 Leu Ala Phe Ser Lys 95 Ser Cys His Leu Pro 100 Ala Ala Ser Gly Leu 105 Glu Thr Leu Asp Ser 110 Leu Gly Gly Val Leu 115 Glu Ala Ser Gly Tyr 120 Ser Thr Glu Val Val 125 Ala Leu Ser Arg Leu 130 Gin Gly Ser Leu Gin 135 Asp Met Leu Trp Gin 140 Leu Asp Leu Ser Pro

    145

    Gly Cys

    9 * • 9

    99 »· k 9 9 9 9 9 9 >♦· • 9 9 9 • 99 999

    9 9 · · 9«

    - 59 kde Cys v poloze 96 je vázán disulfidíckou vazbou na Cys v po1ose 146 nebo jeho farffiaceutíčky vhodná sůl*
11. 14. Protein obecného vzorce

    Met-R¹-Val 1 Pro lle Xaa Lys 5 Val Xaa Asp Asp Thr 10 Lys Thr Leu lle Lys Thr lle Val Thr Arg lle Xaa Asp lle Ser His Xaa Xaa Ser Val 15 20 25 30 Ser Ser Lys Xaa Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe lle Pro Gly Leu His 35 40 45 Pro lle Leu Thr Leu Ser Lys Xaa Asp Xaa Thr Leu Ala Val Tyr Xaa 50 55 60 Xaa lle Leu Thr Ser Xaa Pro Ser Arg Xaa Val lle Xaa lle Xaa Xaa 65 70 75 Asp Leu Glu Xaa Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys 80 85 90 Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu 95 100 105 110 Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Xaa Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu 115 120 125 Ser Arg Leu Xaa Gly Ser Leu Xaa Asp Xaa Leu Trp Xaa Leu Asp Leu 130 135 140

    Ser Pro i Gly Cys 145 Xaa v poloze 7 je < Gin nebo GÍu, Xaa v poloze 22 je Asn nebo Glu, Xaa v poloze 27 je Thr nebo Ala; Xaa v poloze 28 je Gin, Glu nebo chyb í, Xaa v po1oze 34 je Gin nebo Glu, Xaa v po1oze 54 je Met, methi ominsulfox Ala nebo Gly Xaa v po1oze 56 je Gin nebo Glu, Xaa v po1oze 62 je Gin nebo Glu, Xaa v poloze 63 je Gin nebo Glu,

    I • I ♦ 44.

    ·· ·· * · 4 • 4 • · « · ♦ 44·· ··

    Xaa v poloze Xaa v poloze

    63 je Gin nebo Glu,

    68 je Met, methiominsulfoxid, Leu, Ile, Val Ala nebo Gly

    Xaa v poloze 72 je Asn, Asp nebo Glu Xaa v po1oze 75 je Gin nebo Glu, Xaa v po1oze 77 je Ser nebo Ala, Xaa v poloze 78 je Gin, Asn nebo Asp, Xaa v poloze 82 je Gin, Asn nebo Asp,

    Xaa v poloze 118 je Gly nebo Leu,

    Xaa v poloze 130 je Gin nebo Glu,

    Xaa v poloze 134 je Gin nebo Glu

    Xaa v poloze 136 je Met, methiominsulfoxid, Leu, Ile, Val

    Ala nebo Gly

    Xaa v poloze 139 je DGln nebo Glu, a protein má nejméně jednu substituci ze souboru

    His v poloze 97 je nahrazen Gin, Asn, Ala, Gly, Ser, nebo Pro, Trp v poloze 100 je nahražen Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Ile Phe, Tyr, Ser, Thr, Gly, Gin, Val nebo Ala v poloze 101 je nahrazen Ser, Asn, Gly, His, Pro, Thr nebo Val: Ser v poloze 102 je nahrazen Arg, / v Gly v poloze 103 je nahrazen Ala, 7 s / Glu v po1oze 105 je nahražen Gin, / Thr v poloze 106 je nahrazen Lys nebo Ser, Leu v po1oze 106 je nahraěen Pro, - . Asp v poloze 108 je nahražen Glu £ Gly v poloze lil je nahražen Asp, nebo $ Trp v poloze 138 je nahražen Ala, Glu, Asp, Asn, Met, Ile Tyr, Ser, Thr, Gly, Gin, Val nebo Leu.
12. 15. Protein podle nároku 14, kde R¹ znamená Arg.
13. 16. Způsob přípravy proteinu podle nároku 1 až 13, vy značuj ící t í m, že se ·»*· ·· obecného vzorce I, přičemž protein má případnou vedoucí sekvenci , (b) kultivuje se hostitelská buňka a izoluje se proteinu zakódovaný v operací (a) a případně (c) se enzymaticky odštěpí vedoucí sekvence za získání proteinu obecného vzorce CI).
14. 17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se t i m, že vůdčí sekvencí je.Met-Ri-.
15. 18. Způsob podle nároku 17, vyznačuj ící se t í m, že vůdčí sekvencí je Met-Arg-.
16. 19. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje protein podle nároku 1 až 13 spolu s jedním nebo s několika faramaceuticky přijatelnými ředidly, nosiči nebo excipienty.
17. 20. Způsob léčení obezity, vyznačuj ící se t í m, že se savcům podává v případě potřeby protein podle nároku 1 až 13.
18. 21. Protein podle nároku 1 až 13 k použití jako farmaceutický prostředek.