JPH10511840A

JPH10511840A - 形態形成タンパク質特異細胞表面レセプターおよびその使用

Info

Publication number: JPH10511840A
Application number: JP7528497A
Authority: JP
Inventors: テー．ダイジェック，ペーター; ミヤザノ，コウヘイ; ティー．サンパス，クバー; ハールディン，カール−ヘンリック
Original assignee: クリエイティブバイオモレキュールズ，インコーポレイテッド; ザルッドウイッグインスティテュートフォーキャンサーリサーチ
Priority date: 1994-04-29
Filing date: 1995-04-28
Publication date: 1998-11-17
Also published as: ATE378407T1; EP0756628B1; US5863738A; CA2187902A1; DE69535641D1; AU2466295A; AU702163B2; EP0756628A1; WO1995030003A2; US20050233379A1; US6632618B1; WO1995030003A3; US20020155500A1; US7067260B2

Abstract

(57)【要約】（１）モルフォゲン細胞表面レセプター、特にOP-1結合細胞表面レセプターを特徴付ける、核酸配列、アミノ酸配列、相同性、構造的特徴、および他の種々のデータ；（２）組換えDNA技術を用いて、レセプタータンパク質（そのフラグメントを含む）を生産する方法；（３）新規のモルフォゲンレセプターおよびそれらをコードするDNAを同定する方法；（４）内因性モルフォゲンレセプターのレベルを調節し得る化合物を同定する方法および組成物；および（５）治療、診断、および実験使用のためのモルフォゲンアゴニストおよびアンタゴニストの設計に有用なモルフォゲンレセプター結合アナログを同定するための方法および組成物、を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】形態形成タンパク質特異細胞表面レセプターおよびその使用発明の分野本発明は、一般に、組織形態形成分野に関し、より詳細には、形態形成タンパク質特異細胞表面レセプターに関する。発明の背景細胞分化は、胚形成の間に開始し、そして成体組織の修復および再生機構において生物の生命現象を通して種々の程度で存続する組織形態形成の主な特徴である。成体組織における形態形成の程度は、異なる組織の間で異なり、そして特に特定の組織において細胞の代謝回転の程度に関連する。細胞分化の刺激を支配する細胞的および分子的事象は、さかんに研究が行われているドメインである。医学および獣医学の分野では、細胞分化および組織形態形成を制御する因子の発見により、病気を罹ったまたは損傷を受けた哺乳類の組織および器官を修復および再生させる薬物の能力が顕著に促進されることが期待される。ヒトおよび家畜の治療のための、特に有用なドメインは、再建外科、および組織変性疾患(例えば、関節炎、気腫、骨粗しょう症、心筋症、硬変、変性神経疾患、炎症性疾患、およびガンを含む)の治療、ならびに組織、器官および四肢の再生を含む。（この適用および関連する適用においては、用語「形態形成的(morphogenetic)」および「形態形成的(morphogenic)」は互換的に使用される）。近年、細胞分化に役割を果たしていると思われる多くの異なる因子が単離されてきた。最近では、当該分野で「タンパク質のトランスフォーミング増殖因子-b (TGF-β)スーパーファミリー」と呼ばれる、構造的に関連するタンパク質の「スーパーファミリー」の独自のサブファミリーが真の組織モルフォゲンとして同定された。真の組織形態形成タンパク質のこの独自の「サブファミリー」のメンバーは、保存された６または７システイン骨格を含む、それらの形態形成的に活性なC末端ドメイン内に実質的なアミノ酸配列相同性を共有し(C末端102アミノ酸配列において少なくとも50％の同一性)、そして種々の器官および組織における組織特異的形態形成を誘導するインビボでの活性を共有する。これらのタンパク質は、例えば、形態形成的に可能な環境で適切な細胞表面分子に結合し、細胞が増殖および分化するようにするかまたはそのように刺激することにより、明らかに始原細胞と接触しかつ相互作用する。これらの形態形成タンパク質は、細胞的および分子的事象の発生カスケードを誘導し得、これらの事象は、いずれの血管新生、結合組織形成、および天然に存在する組織に必要されるような神経支配を包含する、新しい器官特異的組織の形成をもたらす。これらのタンパク質は、骨軟骨および骨の両方、ならびに歯周組織、歯質、肝臓および網膜組織を含む神経組織の形態形成を誘導することが示されている。現在まで同定された真の組織形態形成タンパク質は、最初に骨誘導性タンパク質として同定されたタンパク質を包含する。これらには、OP-1(骨形成タンパク質-1、関連する用途では「OP1」とも呼ばれる)、そのショウジョウバエホモログである60A(C末端「７システイン」ドメインでは69％の同一性を共有する)、および関連タンパク質OP-2(関連する用途では「OP2」とも呼ばれる)およびOP-3(両方は共にC末端７システインドメインではOP-1と約70〜75％の同一性を共有する)、ならびにBMP5、BMP6およびそのマウス同族体であるVgr-1(これらの全ては、C末端７システインドメインにおいてOP-1とは85％より高い同一性を共有する)、およびBMP6のアフリカツメガエルホモログであるVgl（これはC末端７システインドメインにおいてOP-1とは約57％の同一性を共有する)が挙げられる。他の骨誘導性タンパク質は、CBMP2タンパク質(当該分野ではBMP2およびBMP4とも呼ばれる) およびそれらのショウジョウバエホモログであるDPPを含む。他の組織形態形成タンパク質はGDF-1である(マウス由来)。例えば、PCT文献US92/01968およびUS92 /07358を参考のこと。これらの開示は、本明細書に参考として援用されている。上記のように、これらの真の組織形態形成タンパク質は、当該分野では、それらがC末端ドメインにおいて高度な配列同一性を共有すること、および真の組織形態形成タンパク質が自身で、単に繊維(瘢痕)組織の形成を誘導するよりもむしろ機能性組織の形成を生じる事象の全カスケードを誘導し得ることにおいて、TG F-βスーパーファミリーの他のメンバーとは異なる独自のタンパク質のサブファミリーとして認識される。特に、形態形成タンパク質のファミリーのメンバーは、形態形成的に可能な環境において以下の全てが可能となる：細胞増殖および細胞分化を刺激すること、および分化し細胞の増殖および維持を支えること。これらの形態形成タンパク質は、明らかに、内分泌因子、パラ分泌因子または自己分泌因子として作用し得る。形態形成タンパク質は、有意な種「クロストーク(crosstalk)」であり得る。すなわち、これらのタンパク質の外因性(外来種)ホモログは、機能活性について互いに置換し得る。例えば、２つのショウジョウバエタンパク質であるDPPおよび60Aは、これらの哺乳動物ホモログであるBMP2/4およびOP-1にそれぞれ置換し得、そして標準的なラット骨形成アッセイにおいて非骨性部位で軟骨内骨形成を誘導し得る。同様に、BMP2はショウジョウバエ中のdpp^-突然変異を補償する(res cue)ことが示されている。しかし、これらのタンパク質は、それらのネイティブ形態では、組織特異的であるようであり、各タンパク質は、代表的に、１つまたは少数の組織のみに発現されるかまたは提供され、あるいは発生の間の特定の時間でしか発現されない。例えば、GDF-1は主として神経組織に発現されるようであるが、OP-2は、早期(例えば、８日)マウス胚において比較的に高いレベルで発現されるようである。内因性モルフォゲンは、それらが作用する細胞により、隣接する細胞により、または離れた組織により合成され得、分泌されたタンパク質が作用される細胞に輸送される。特に強力な組織形態形成タンパク質はOP-1である。このタンパク質、およびその外因性ホモログは、多くの組織(主として尿生殖由来組織、ならびに骨、乳腺および唾液腺組織、生殖組織、および胃腸管組織)に発現される。これはまた、胚発生の間で異なる組織に発現され、その存在は、その組織の形態形成の開始と一致する。細胞膜を横切る形態形成タンパク質シグナルの導入は、１つまたはそれ以上の細胞表面レセプターとの特異的な結合相互作用の結果として起こるようである。 TGF-βタンパク質スーパーファミリーの種々のメンバーの細胞表面レセプター結合に対する最近の研究は、リガンドが、Ｉ型およびII型レセプターと呼ばれる２つの異なるレセプターとの相互作用によりその活性を仲介してヘテロ-複合体を形成し得ることを示唆している。β-グリカンに結合した細胞表面もまた、結合相互作用を促進し得る。I型およびII型レセプターは共にセリン／トレオニンキナーゼであり、そして類似の構造を共有する：本質的にこのキナーゼからなる細胞内ドメイン、短いが、膜を１回貫通するのに十分な延長疎水性配列、および高濃度の保存されたシステインを特徴とする細胞外ドメイン。最近、多くのII型レセプター配列が同定されてきた。これらは、TGF-βII型レセプターである「TGF-βR II」(Linら、（1992）Cell 68:775-785)；および多くのアクチビン-結合レセプターを包含する。例えば、「ActR II」配列を開示する Mathewsら、(1991)Cell 65:973-982および1992年11月26日に公開された国際特許出願第WO92/20793号；「ActR IIB」配列を開示するAttisanoら、(1992)Cell 68: 97-108；およびLegerskiら、(1992)Biochem ．Biophys．Res．Commun 183:672-67 9を参照のこと。アクチビンに対する親和性を有することが示された異なるII型レセプターは、Atr-IIである(Childsら、（1993）PNAS 90:9475-9479)。２つのI I型レセプターはC ．elegansで同定されている：現在まで知られていないリガンドを有するdaf-1遺伝子(Georgiら，（1990）Cell 61:635-645)、およびBMP4と結合するが、アクチビンまたはTGF-βと結合しないことが示されているdaf-4(Este vezら、(1993)Nature 365:644-649)。 Ten Dijkeらは、マウスおよびヒトのcDNAライブラリー由来の６種の異なるＩ型細胞表面レセプターのクローニングを開示している((1993)Oncogene 8:2879-2 887、およびScience（1994）264:101-104)。これらのレセプターは、ALK-1〜ALK -6(「アクチビンレセプター様キナーゼ」)と呼ばれ、かなりの配列同一性(60〜7 9％)を共有し、そしてそのいくつかは、TGF-β結合(ALK-5)またはアクチビン結合(ALK-2、ALK-4)レセプターとして同定されている。Xieらもまた、sax遺伝子によりコードされるショウジョウバエＩ型レセプターを報告している(Science（19 94）263:1756-1759)。作者らは、タンパク質がDPPに結合することを示唆している。現在までは、細胞表面で本明細書に記載の形態形成タンパク質と相互作用するＩ型レセプターがまだ同定されておらず、そしてOP-1およびその関連する配列について結合親和性を有するようなII型レセプターについての記載はない。モルフォゲンと相互作用し、そしてこれらを通じてその生物学的な効果を仲介し得る細胞表面分子の同定は、組織形態形成の分子機構の解明を促進し、そしてモルフォゲンレセプター結合「アナログ」(例えば、レセプター結合アゴニストまたはアンタゴニストのいすれかとして作用するのに十分にモルフォゲンのレセプターに対するモルフォゲンの結合親和性に類似し得る(アミノ酸に基づく巨大分子であり得るかまたはあり得ない)化合物)の開発を可能にすることが期待される。これらの「アナログ」は、治療、診断および実験研究の用途において特に有用性がある。本発明の目的は、形態形成タンパク質結合細胞表面レセプターをコードする核酸分子およびアミノ酸配列、特にOP-1特異的結合レセプター配列を提供することである。別の目的は、種々の種および／または組織中の遺伝子、ならびに形態形成タンパク質結合レセプター、特にOP-1に結合するレセプターをコードする種々の核酸ライブラリー中の遺伝子を同定する方法を提供することである。さらに別の目的は、生合成レセプター-結合リガンドアナログ、特にOP-1アナログを設計する手段、および／または本明細書に記載のレセプター分子およびそのアナログを用いて、アゴニストおよびアンタゴニストを含む天然に存在するリガンドアナログを同定する手段を提供することである。別の目的は、OP1のインビボでのレセプター結合に対する有用性を調節し得る、細胞外リガンド-結合ドメインを含む可溶性レセプター構築物を含むアンタゴニストを提供することである。別の目的は、アクチビン-レセプターおよびBMP2/4-レセプターの相互作用と競合するための手段および組成物を提供することである。さらに別の目的は、リガンドアフィニティー精製するための手段および組成物、およびOP1-特異細胞表面レセプターおよびそのリガンド-結合フラグメントを用いて、体液中のリガンドを診断検出および定量するための手段および組成物を提供することである。さらに別の目的は、これらのレセプター分子の内因性発現または濃度を調節するための手段および組成物を提供することである。さらに別の目的は、リガンド-レセプター複合物およびそのアナログ配列、ならびにその成分タンパク質からこの複合物を同定および区別し得る抗体を提供することである。さらに別の目的は、哺乳類動物における形態形成を調節するための手段および組成物を提供することである。本発明のこれらの目的および別の目的および特徴は、本明細書、図面および以下の請求項により明らかである。発明の要旨今回、真の組織形態形成タンパク質、特にOP-1関連タンパク質との特異的結合親和性を有し得るＩ型およびII型細胞表面レセプター分子を同定した。従って、本発明は、少なくともこれらのレセプターのリガンド結合ドメインおよびOP-1またはリガンドとしてのOP-1レセプター-結合アナログを含むリガンド-レセプター複合体；有用なOP-1レセプター結合アナログおよびOP-1結合レセプターアナログを同定および／または設計するための手段；および細胞の組織形態形成の能力を調節するための手段を提供する。本発明に有用なモルフォゲン細胞表面レセプターは、当該分野では、Ｉ型またはII型セリン／トレオニンキナーゼレセプターと呼ばれる。これらは、一般に約 100〜130アミノ酸(Ｉ型レセプター；II型レセプターは約196までのアミノ酸)、細胞膜を１回で貫通するのに十分な膜貫通ドメイン、およびセリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞内(細胞質)ドメインから構成される、細胞外リガンド結合ドメインを含む保存された構造を共有する。インタクトなレセプターは、約 500〜550アミノ酸の単鎖ポリペプチドであり、そして約50〜55 kDaの見かけの分子量を有する。本発明の方法および組成物に特に有用性があるのは、本明細書および参考文献においてALK-2、ALK-3、およびALK-6と呼ばれるようなＩ型細胞表面レセプターである。それらの核酸配列およびコードされるアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３、５および７で表される配列であり、そしてこれらは、本明細書中以下で示されているように、OP1およびOP1関連のアナログに対して特異的結合親和性を有する。従って、１つの実施態様において、本明細書において意図されるレセプター配列は、本明細書に記載のALK-2、ALK-3およびALK-6タンパク質のOP-1結合アナログを含む。本明細書中で使用される、リガンド-レセプター結合親和性とは、リガンドとレセプターとの間の特異的な、飽和非共有結合的相互作用であって、かつ適切な競合分子により競合的阻害を受ける相互作用を意味することが理解される。好ましい結合親和性(利用可能なレセプター結合部位の半分(50％)を満たすために必要とされるリガンドの量として定義される)は、本明細書では解離定数(Kd)により記載される。１つの実施態様において、本明細書で記載されるリガンド-レセプター複合体の好ましい結合親和性は、10^-7Ｍ未満のKdであり、好ましくは５× 10^-7Ｍ未満、さらに好ましくは10^-8Ｍである。別の好ましい実施態様において、レセプター分子はTGF-βに対する結合親和性をほとんど有さないかまたは実質的に有さない。本明細書で使用される「OP1特異的レセプターアナログ」とは、配列番号７(AL K-6)の残基23〜122により定義される配列を有する細胞外リガンド結合ドメインにおいて、少なくとも40％、好ましくは少なくとも45％、そして最も好ましくは少なくとも50％のアミノ酸同一性を有するALK-2、ALK-3またはALK-6配列の変異体(variant)を意味し、これはALK-2、ALK-3またはALK-6と実質的に同一のOP1に対する結合親和性を有する。ALK-6およびALK-3は、そのリガンド結合ドメインにおいて46％のアミノ酸配列同一性を有する。従って、１つの好適な実施態様において、OP1特異的レセプターアナログは、ALK-6またはALK-3の細胞外リガンド結合ドメインと少なくとも46％のアミノ酸配列同一性を有する。当業者に理解されるように、OP1特異的レセプターアナログはまた、他の関連する形態形成タンパク質に対して結合親和性を有し得る。本明細書で使用される、OP1特異的レセプターアナログは、公知のOP-1結合レセプター(例えばALK-2、A LK-3またはALK-6)を用いる標準的な競合アッセイにおいて首尾よくOP-1結合が競合され得る場合、実質的にALK-2、ALK-3またはALK-6と同じOP-1に対する結合親和性を有することが理解される。１つの好適な実施態様において、OP1特異的レセプターアナログは、約10^-7Ｍ未満、好ましくは約５×10^-7Ｍ未満または10^-8未満の解離定数により定義されるOP-1に対する結合親和性を有する。しかし、より低い結合親和性(例えば、10^-6Ｍのオーダー)を有するアナログもまた有用であることが予測される。例えば、このようなアナログは動物に提供されて、インビボでのレセプター結合についての血清可溶性OP1の利用可能性を調節し得る。同様に、例えば、アナログがリガンド-レセプターのアンタゴニストとして作用するガン治療の一部として、強固な結合相互作用が所望される場合、好ましい結合親和性は５×10^-8Ｍのオーダーであり得る。別の実施態様において、本発明により意図されるOP-1結合レセプターアナログは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でALK-2、ALK-3またはAL K-6の細胞外リガンド結合ドメインをコードするDNA配列とハイブリダイズする核酸によりコードされ、かつ実質的にALK-2、ALK-3またはALK-6と同じOP-1結合親和性を有するタンパク質を包含する。本発明で使用されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、当該分野で定義される通りである(例えば、Mol ecular Cloning ：A Laboratory Manual、 Maniatisら編、第２版、Cold Spring H arbor Press、Cold Spring Harbor、1989を参照のこと)。条件の例示的な設定は以下の通りである：40％のホルムアミド、５×SSPE、５×デンハルト溶液、および0.1％ SDS中、37℃で一晩のハイブリダイゼーション、および0.1×SSPE、0.1 ％ SDS中、50℃での洗浄。さらに別の実施態様において、本発明により意図されるOP-1結合レセプターアナログは、標準的なPCR(ポレメラーゼ連鎖反応)増幅スキームにおいて、ALK-1( 配列番号１)、ALK-2、ALK-3またはALK-6配列に由来する１つ以上のプライマーを用いて増幅され得る核酸によりコードされるセリン/トレオニンキナーゼレセプターの一部または全体を含む。特に、配列番号12〜15の配列のいずれかにより表されるプライマー、または最も好ましくはプライマー対は特に有用であることが予想される。プライマー対(例えば、配列番号12/15；13/15；14/15)の使用は、W O94/11502(PCT/GB93/02367)に記載される。有用なOP1特異的レセプターアナログは、本明細書に記載のマウスおよびヒトA LK配列の外因性(外来種)ホモログを包含し、これは他の哺乳動物から得られる外因性ホモログならびに他の真核生物、非哺乳動物の外因性ホモログを包含する。 ALK-2、ALK-3およびALK-6の生合成構築物および天然に存在する配列変異体もまた、あらゆる状況において、これらの分子がリガンド結合ドメインにおいて適切な同一性を共有し、そして本明細書で定義されるようにOP-1に特異的に結合する場合に限り、意図される。１つの実施態様において、配列変異体は、実質的にAL K-2、ALK-3またはALK-6と同様の、OP1に対する結合親和性を有し、かつALK-2、A LK-3またはALK-6に対する結合特異性を有する抗体により認識されるレセプターアナログを包含する。別の実施態様において、本明細書において意図されるレセプターおよびOP-1結合レセプターアナログは、モルフォゲン(例えばOP-1)が細胞応答を仲介し得る手段を提供する。１つの実施態様において、これらのレセプターは、ALK-2、ALK-3 、またはALK-6、またはそれらの配列変異体またはOP-1結合アナログを包含する。別の実施態様において、OP-1仲介細胞応答に関与するためにALK-1(その配列変異体を含む)が意図される。 OP1特異的レセプターアナログは、OP1のアンタゴニストとして使用され得る。例えば、本質的に細胞外リガンド結合ドメインのみからなる可溶性形態のレセプターは、哺乳動物に全身的投与されて可溶性リガンドに結合し得、細胞表面レセプターに結合するリガンドと効果的に競合し、それによりインビボで細胞表面結合についての自由リガンドの利用可能性を調節(減少)する。本発明において有用なレセプターリガンドとして意図される真の組織形態形成タンパク質は、OP-1およびOP-1レセプター結合アナログを包含する。本明細書で使用される「OP-1アナログ」または「OP-1レセプター結合アナログ」とは、Ｉ型レセプター結合において機能的にOP-1の代用物となり得るすべての分子、例えば、標準的な競合アッセイにおいてレセプター結合についてOP-1と首尾よく競合し得る分子を包含することが理解される。１つの実施態様において、有用なOP-1レセプター結合アナログは、その結合親和性が約５×10^-6Ｍ未満、好ましくは約10^-7 Ｍまたは５×10^-7Ｍ未満の解離定数により定義される分子を包含する。上記の OP-1特異的レセプターについては、より強い結合親和性およびより弱い結合親和性の両方が特定の適用において有用であることが意図される。１つの好適な実施態様において、これらのOP-1レセプター結合アナログはまた、OP-1特異的II型セリン/キナーゼレセプターを結合する。本明細書において意図されるOP-1アナログは、その全てがOP-1またはOP-1関連タンパク質の結合活性と充分に類似し、レセプター結合においてOP-1の代用物として作用し得るが、OP-1のアゴニストとして作用し得、レセプター結合および膜貫通効果(例えば、結合後のトレオニンまたはセリン特異的リン酸化を含む)の誘導の両方において、OP-1と類似性を有し得る。あるいは、OP-1アナログはOP-1のアンタゴニストとして作用し得、レセプター結合においてのみOP-1と類似し得るが、膜貫通効果を誘導し得ず、これにより、例えば天然のリガンドがそのレセプターと相互作用するのをブロックする。アンタゴニストについての有用な適用は、骨肉腫またはパジェット病などの悪性形質転換体において起こるような非制御の未分化組織増殖を調節するための治療としてのその使用を包含する。本発明により意図されるOP-1アナログは、例えば、アミノ酸に基づくOP-1の配列変異体、またはOP-1特異的レセプターに結合するOP-1と機能的に類似し得る抗体由来の配列であり得る。このような抗体の例として、抗イデオタイプ抗体が挙げられる。特定の実施態様において、抗イデオタイプ抗体は、レセプター結合および膜貫通効果を誘導する能力の両方においてOP1と類似性を有する。あるいは、OP-1アナログは、その一部または全体が他の化学構造から構成され得る(例えば、一部または全体が非タンパク質性分子から構成され得るアナログ)。さらに、意図されるOP-1アナログは、天然に得られるか、または合成的に生成され得る。本明細書で使用されるOP-1関連配列は、配列番号７において定義されるOP-1のＣ末端の102個のアミノ酸配列と少なくとも60％、好ましくは65％を超える、あるいは70％の同一性を共有し、かつALK-2、ALK-3またはALK-6に対するリガンド結合においてOP-1の代用となり得る(例えば、１つ以上のこれらのレセプターに対する結合についてOP-1と首尾よく競合し得る)配列を包含する。本発明により意図されるOP-1関連配列は外因性ホモログ(例えば、ショウジョウバエホモログ6 0A)、および本明細書および文献においてOP-2、OP-3、BMP5、BMP6(およびその外因性ホモログVgr-1)と呼ばれる関連配列を包含する。OP-1関連配列はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号９のＣ末端の102個のアミノ酸を含むDNA配列とハイブリダイズする核酸によりコードされ、かつOP1 レセプター結合アッセイにおいてOP1の代用物となり得る配列変異体を包含する。別の実施態様において、OP1配列変異体は、リガンド-レセプター結合アッセイにおいてOP1の代用となり得、かつOP1に対する結合特異性を有する抗体により認識されるタンパク質を包含する。本明細書で使用される「アミノ酸配列相同性」は、アミノ酸配列の類似性を意味することが理解され、そして相同な配列は、同一のアミノ酸または類似のアミノ酸を共有する。ここで、類似のアミノ酸とは、Dayoffら、Atlas of Protein S equence and Structure ；第５巻、補遺３、345〜362頁(M.O.Dayoff編、Nat'l Bi oMed．Research Fdn.、Washington D.C．1978)により定義される保存的アミノ酸である。従って、対照配列と60％のアミノ酸相同性を有する候補配列は、候補配列の対照配列とのアラインメント後、候補配列中の60％のアミノ酸が対照配列中の対応するアミノ酸と同一であるか、またはそこに保存的アミノ酸変化を構成することが必要である。「アミノ酸同一性」とは、２つの並べ合わせた配列間に同一のアミノ酸を必要とすることが理解される。従って、対照配列と60％のアミノ酸相同性を共有する候補配列は、候補配列の対照配列とのアラインメント後、候補配列中の60％のアミノ酸が対照配列中の対応するアミノ酸と同一であることが必要である。本明細書で使用される、算定される全てのレセプターの相同性および同一性は、配列番号７の残基23〜122である細胞外ドメイン対照配列および配列番号７の残基206〜495である細胞外セリン/トレオニンキナーゼドメイン対照配列を用いて、ALK-6を対照配列として使用する。同様に、全てのOP-1関連タンパク質の相同性および同一性は、７つのシステインドメインを構成する、配列番号中に記載のＣ末端の102個のアミノ酸を用いてOP-1を対照配列として使用する本明細書で使用されるように、相同性および同一性の算定のための配列は、以下のように並び合わされる：配列は配列同一性が最大になるように目で並べ合わされる。レセプターの細胞外ドメインアミノ酸配列が比較される場合、最初のアラインメントは２つの配列に存在するシステインのアラインメントを最大にし、次いで２つの配列間のアミノ酸同一性および類似性を最大にするために必要に応じてアラインメントを修正する。細胞内ドメインアミノ酸配列が比較される場合、キナーゼドメイン内の保存的アミノ酸のアラインメントが最大になるように配列は並び合わされる。ここで保存的アミノ酸は図３の四角枠により同定されるアミノ酸である。次いで、アミノ酸同一性および類似性を最大にするために必要に応じてアラインメントを修正する。相同性/同一性の算定を行う場合、いかなる場合でも、並び合わせる候補配列中の中間ギャップおよびアミノ酸挿入物は無視される。アラインメントの例は図２および図３に例示されるが、ここで、細胞外ドメインおよび細胞内ドメインについてのアミノ酸配列は、それぞれ１文字形式で表される。図において、配列アラインメントにより作製される「ギャップ」は、点線で示される。１つの局面において、本発明は、本明細書で定義されるように、OP-1結合Ｉ型レセプターまたはレセプターアナログとの特異的結合相互作用におけるリガンドとしてOP-1またはOP-1アナログを含む単離されたリガンド-レセプター複合体を意図する。別の局面において、本発明は、OP-1結合II型レセプターの一部または全体を含むリガンド-レセプター複合体を意図する。有用であることが意図されるII型レセプターは、BMP-4のようなアクチビンまたは骨形態形成タンパク質に対する結合特異性を有することが文献(本明細書中上記で参照される)に定義されるII型レセプターを包含する。このようなII型レセプターはdaf4、ActRIIおよび AtrIIを包含する。さらに別の局面において、リガンド-レセプター複合体は、Ｉ型レセプターおよびII型レセプターの両方ならびにリガンドとしてOP1またはOP1 アナログを含む。いずれの複合体においても、結合されるレセプターは、細胞外リガンド結合ドメインのみを含み得るか、または膜貫通配列の一部または全体、および/または細胞内キナーゼドメインを含み得る。同様に、OP-1リガンドは、レセプター結合配列のみ、またはより長い配列を含み得、その成熟二量体種またはそのタンパク質またはタンパク質アナログの任意の可溶性形態を包含する。本明細書に記載のOP-1およびOP-1アナログは、他の形態形成タンパク質(例えば、BMP2/BMP4)およびアクビチンとも相互作用することが知られるＩ型レセプターおよびII型レセプターと特異的に相互作用し得る。従って、本発明はまた、特異的BMP-レセプターおよびアクチビン-レセプター相互作用の競合物としてのOP- 1およびOP-1レセプター結合アナログの使用を意図する。当業者に明らかなように、これらの結合競合物は、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用し得る(例えば、アクチビンまたはBMP仲介細胞応答を阻害する)。別の局面において、本発明は、リガンド-レセプター複合体上のエピトープに対する特異的な結合親和性を有する結合パートナーを意図する。好適な実施態様において、結合パートナーは複合体と非複合体リガンドまたは非複合体レセプターとを識別する。別の実施態様において、結合パートナーは、非複合体リガンドまたは非複合体レセプターに対する結合親和性をほとんど有さないかまたは実質的に有さない。別の実施態様において、結合パートナーは結合タンパク質、より好ましくは抗体である。これらの抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、それらのインタクトな分子またはフラグメント(例えば、Fab、Fab'、 (Fab)'₂)、または生合成誘導体であり得、例えば、一本鎖Fvフラグメント(文献においてはsFvと呼ばれる)、BABおよびSCAのようなモノクローナル抗体フラグメント、およびモノクローナル抗体の部分(例えば、相補性決定領域「CDR」のような抗原認識に関係する部分は除く)がヒト化されるキメラモノクローナル抗体が包含される。例えば、米国特許第5,091,513号および同第5,132,405号を参照のこと(これらの開示は本明細書中で参考に援用される)。生合成キメラ抗体、抗体フラグメントおよび他の抗体誘導体は、標準的な組換えDNA方法および/または当該分野で充分に記載され、そして以下に記載される化学的核酸合成方法を用いて合成され得る。さらに別の局面において、本発明は、以下に記載されるようなレセプター結合形態形成タンパク質の設計および/または同定に有用な分子、ならびにキットおよび方法(例えば、これらのアナログを同定するためのスクリーニングアッセイ) を提供する。これらのアッセイに有用な分子は、配列番号３、５または７のレセプターの一部または全体を含み得、アミノ酸配列変異体およびOP-1結合アナログおよびそれらのアミノ酸配列変異体を包含する。上記のように、配列変異体は、OP-1に対して配列番号３〜７の配列で示されるレセプターと実質的に同一の結合親和性を有するように意図される。OP-1結合レセプターアナログは、本明細書で定義したようなOP-1に対する結合親和性および結合特異性を有する他の公知または新規のＩ型またはII型セリン／トレオニンキナーゼレセプターを包含する。これらは、(1)配列番号７の残基23〜残基122と少なくとも40％のアミノ酸同一性を共有する、(2)配列番号７のヌクレオチド256〜 552により定義される配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされる、または(3)配列番号12〜15により定義される１以上のプライマー配列で増幅することにより得られ得る核酸配列によりコードされる。本発明のアッセイに一般に好ましいのは、少なくともこれらのタンパク質の細胞外リガンド結合ドメインを定義する配列を含有するレセプター配列である。キットおよびアッセイは、Ｉ型レセプターのみか、またはＩ型およびII型レセプターの両方を含み得る。同様に、キットおよびスクリーニングアッセイは、OP-1特異的レセプターアナログの設計および／または同定に使用され得る。従って、OP-1レセプター結合アナログおよびOP-1結合レセプターアナログは、同定され、次いで当該分野で周知でありかつ特徴付けられている標準的な組換え発現技術または化学合成技術を用いて合理的な量で生成され得る。あるいは、有望な候補は、例えば、以下の実施例10に記載のように候補アナログの結合親和性を増強するように標準的な生物学的または化学的方法論を用いて改変され得、次いで好ましい候補誘導体は大量に生成される。さらに別の局面において、レセプターおよび／またはOP-1特異的レセプターアナログは、OP1およびOP1アナログをアフィニティ精製および／または定量する標準的な方法論に用いられ得る。例えば、レセプターのリガンド結合ドメインは、まずウェルまたはクロマトグラフ用カラムの表面に固定化され得；次いでサンプル液中のリガンドは、特異的に結合し得る条件下でレセプターに提供され得；次いで、非特異的結合分子は、例えば洗浄により除去され、次いで結合したリガンドは選択的に単離および／または定量される。同様に、OP1およびOP1アナログは、OP-1特異的レセプターおよびレセプターアナログをアフィニティ精製および／または定量するために用いられ得る。１つの実施態様においては、この方法は診断目的のキットおよびアッセイにおいて有用である。ここでは、血清、腹腔液(p eritoneal fluid)、脊髄液、および乳房浸出液(breast exudate)を包含するがこれに限定されない体液サンプルにおけるOP1タンパク質または関連モルフォゲンの存在および／または濃度を検出する。キットおよびアッセイはまた、サンプル中のOP-1特異的レセプターの検出および／または定量に用いられ得る。さらに別の局面において、本発明はOP-1特異的レセプターを発現する器官、組織、および細胞株を同定するスクリーニングアッセイにおいて有用であるOP-1特異的レセプターおよびOP-1結合レセプターアナログを包含する。次いで、これらの細胞は、細胞表面に発現されるレセプターの密度を包含する外来モルフォゲンレセプターの発現レベルを改変するリガンドを同定するスクリーニングアッセイにおいて用いられ得る。有用なアッセイの方法論は、PCT US92/07359記載および以下の記載に基づき得る。従って、本発明は、診断手順、治療手順、および実験手順におけるモルフォゲン特異的レセプター配列の使用のための組成物および方法に関する。本発明の組成物および方法に有用な活性レセプターは、短縮型または完全長の形態、ならびに種々のグリコシル化パターンを有する形態を包含し得る。本発明において有用な活性レセプターはまた、以下に記載のようなキメラ構築物をも包含する。活性なOP-1特異的レセプター／アナログは、インタクトまたは短縮型のゲノムDNAまたはcDNA、または合成DNAから、原核宿主細胞または真核宿主細胞において発現され、そして活性分子を形成するに必要なように精製され、切断され、再折り畳みされ、そして酸化され得る。有用な宿主細胞は、E.coliおよびB.subtilisを包含する原核細胞、および哺乳動物細胞（例えば、線維芽細胞3T3細胞、CHO細胞、 COS細胞、黒色腫細胞、またはBSC細胞、Hela細胞および他のヒト細胞）、昆虫／バキュロウイルス系、ならびに酵母および他の微生物宿主細胞系を包含する真核細胞を含む。従って、本開示を考慮すれば、遺伝子工学の当業者は、例えば、OP-1特異細胞表面レセプターまたはそのアナログを同定および生成し；候補のOP1レセプター結合アナログをスクリーニングするためのアッセイを作製および実施し、そして治療レジメおよび前臨床研究において有望な候補およびその子孫を評価し；細胞表面の相互作用に関する外来モルフォゲンの有効性を改変し；外来モルフォゲン特異細胞表面レセプターのレベルを改変し；モルフォゲン−細胞表面レセプター結合により誘導されるシグナル伝達経路を解明し；そしてインビボの組織形態形成を改変し得る。図面の簡単な説明図１は、コードされるALK-2、ALK-3、ALK-6アミノ酸配列の模式図であり、シグナル配列10、膜貫通ドメイン12、細胞外リガンド結合ドメイン14、および細胞内セリン／トレオニンキナーゼドメイン16を示す；図２は、アミノ酸同一性が最大になるように整列されたALK-2、ALK-3、および ALK-6の細胞外ドメインの相同性アラインメントを示す。ここで、保存されたアミノ酸は四角で同定され、そして保存されたシステインは★で示される；および図３は、アミノ酸同一性が最大になるように整列されたALK-2、ALK-3、および ALK-6の細胞内ドメインの相同性アラインメントを示す。ここで、保存されたアミノ酸は四角で囲まれ、そしてセリン／トレオニンキナーゼドメインは矢印で示される。発明の詳細な説明本明細書において開示されるのは、真の組織形態形成タンパク質、特にOP1およびOP1関連タンパク質に結合特異性を有するＩ型およびII型レセプターである。OP1が、公知の組織モルフォゲンまたはTGF-βファミリーのメンバーよりも広範なレセプターに結合することをさらに決定した。本明細書に開示されるＩ型レセプターは、OP1またはOP1アナログとともに、本明細書において以下で記載のように治療的、診断的、および実験的使用のために使用され得る。さらに、OP1結合レセプタータンパク質の可溶性形態（例えば、本質的に、特異にOP1と結合するに十分なその細胞外ドメインまたはそのフラグメントからなる形態）は、以下に記載のように可溶性の治療的モルフォゲンアンタゴニストとして使用され得る。この開示に従って、OP1アナログおよびOP1特異的レセプターアナログを同定する高度および中程度のフラックススクリーニングアッセイ(high and medium flu x screening assay)として、関連するOP1特異的レセプターが利用可能である。これらのアナログは、天然の分子であり得、またはこれらは、合理的なドラッグデザインおよび確立された構造／機能分析を用いて設計および生合成的に作製され得る。アナログは、アミノ酸に基づくものであり得るか、あるいは一部または全体が非タンパク質性の合成有機分子から構成され得る。有用なアナログはまた、抗体、好ましくはモノクローナル抗体（そのフラグメント、例えば、Fab、Fab '、および(Fab)'₂を含む）、またはその合成誘導体（例えば、当該分野でsFv、B AB、およびSCA（以下を参照のこと）として公知のモノクローナル単鎖Fvフラグメントおよび二重特異性抗体またはその誘導体）を包含し得る。これらの抗体が、結合によりOP-1が行う生物学的反応を誘導せずに細胞表面レセプターへのOP-1の結合活性を模倣する場合、抗体はOP-1結合に競合し得、そしてアンタゴニストとして作用する。これらの抗体またはその誘導体はまた、レセプター結合およびシグナル伝達の両方においてOP-1を模倣し得る。この場合、これらの抗体はOP-1アゴニストとして作用する。抗体および誘導体はまた、Ｉ型およびII型レセプターのホモ複合体またはヘテロ複合体のいずれかを形成するようにレセプターを形態形成タンパク質、特にOP-1およびOP-1関連タンパク質に架橋することにより、形態形成細胞応答を誘導するために使用され得る。本明細書に記載されたOP-1結合レセプターの配列(ALK2、ALK3、ALK6)はまた、キメラ配列を作製するために使用され得る。ここで、例えば、細胞外ドメインまたは細胞内ドメインのいずれかの一部または全部は、非ALK配列であるか、または２以上のALK配列から作製される。これらのキメラレセプターは、当該分野で十分に記載されておりかつ以下で開示する標準的な組換えDNA方法論および／または自動化化学的核酸合成方法論を用いて合成され得る。キメラは、例えば、OP 1アナログアッセイにおいて使用され得る。ここで、OP1結合細胞外ドメインは、以下に記載のセカンドメッセンジャー応答系として十分に特徴付けられ、そして／または容易に検出可能である非ALK細胞内ドメインに結合される。キメラはまた、例えば、高フラックスのOP1アナログスクリーニングにおいて、そして精製プロトコルの一部として使用され得る。ここで、OP1特異的レセプターの可溶性リガンド結合ドメインは、クロマトグラフのマトリックスまたは96ウェルプレートのウエル表面で例えば、共有または非共有相互作用により、支持体に固定化される。クロマトグラフのマトリックス表面に固定された場合、レセプターフラグメントは、OP1またはOP1アナログを単離するためのプロトコルにおいて使用され得る。ウェルの表面に固定化された場合、レセプターフラグメントは、標準的な競合アッセイにおけるレセプター結合OP1アナログを同定するスクリーニングアッセイにおいて特に有用である。本発明の方法および組成物において有用であることが意図される真の組織形態形成タンパク質は、種々のグリコシル化パターンおよび種々のＮ末端を有する形態を包含する。このタンパク質は、天然に存在するかまたは生合成由来であり得、そして原核宿主細胞および真核宿主細胞において組換えDNAの発現により産生され得る。このタンパク質は、単一の種として（例えば、ホモダイマーとして）活性であるか、または混合種として組み合わせられる。有用な配列および真核および原核発現系は、当該分野で十分に記載されている。例えば、有用な発現系については米国特許第5,061,911号および同第5,266,683号を参照のこと。本明細書において特に意図されるのは、OP1およびOP1関連配列である。有用な OP1配列は、米国特許第5,011,691号；同第5,018,753号、および同第5,266,683号；Ozkaynakら(1990)EMBO J 9：2085-2093；およびSampathら(1993)PNAS 90：600 4-6008に列挙されている。OP-1関連配列は、例えば、ショウジョウバエ(Drosoph ila)由来の60A、Whartonら(1991)PNAS 88：9214-9218のような異種ホモログ；およびＣ末端の７つのシステインドメインにおいてOP1と60％を超える同一性、好ましくは少なくとも65％の同一性を共有するタンパク質を包含する。OP-1関連配列の例は、BMP5、BMP6（およびその種ホモログVgr-１、Lyonsら(1989)PNAS 86： 4554-4558）、Celesteら(1990)PNAS 87：9843-9847およびPCT国際出願第WO93/00 432号；OP-2（Ozkaynakら(1992)J.Biol.Chem. 267：13198-13205）およびOP-3(P CT国際出願第WO94/06447号)を包含する。当業者により評価されるように、キメラ構築物は標準的な分子生物学的技術および変異誘発技術を用いて容易に作製され得る。ここでは、異なる形態形成タンパク質配列の種々の部分を組み合わせて新規の配列が作製され、そしてこれらの形態のタンパク質もまた、本明細書において意図される。本発明で意図されるタンパク質の特に好ましい実施態様は、システインリッチなＣ末端ドメインにおけるアミノ酸配列が、OPSのアミノ酸配列(Ｃ末端の保存された６つのシステインを定義するOP-1配列(例えば、配列番号９の残基335〜431) )と60％を超える同一性、そして好ましくは65％を超える同一性を有するタンパク質を包含する。別の好ましい局面において、本発明は、本明細書において「OPX」と呼ばれる一般的なアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖の種を含む骨形成タンパク質を意図する。OPXは、骨形成のOP1およびOP2タンパク質の多種の同定された種の間の相同性に適応し、そしてOPXは、以下に示すアミノ酸配列および配列番号11により記載される。そして、ここて、残基２のXaa＝(LysまたはArg)；残基３のXaa＝(LysまたはArg) ；残基11のXaa＝(ArgまたはGln)；残基16のXaa＝(GluまたはLeu)；残基19のXaa ＝(IleまたはVal)；残基23のXaa＝(GluたはGln)；残基26のXaa＝(AlaまたはSer) ；残基35のXaa＝(AlaまたはSer)；残基39のXaa＝(AsnまたはAsp)；残基41のXaa ＝(TyrまたはCys)；残基50のXaa＝(ValまたはLeu)；残基52のXaa＝(SerまたはTh r)；残基56のXaa＝(PheまたはLeu)；残基57のXaa＝(IleまたはMet)；残基58のXa a＝(AsnまたはLys)；残基60のXaa＝(Glu、Asp、またはAsn)；残基61のXaa＝(Thr 、Ala、またはVal)；残基65のXaa＝(ProまたはAla)；残基71のXaa＝(GlnまたはL ys)；残基73のXaa＝(AsnまたはSer)；残基75のXaa＝(IleまたはThr)；残基80のX aa＝(PheまたはTyr)；残基82のXaa＝(AspまたはSer)；残基84のXaa＝(Serまたは Asn)；残基89のXaa＝(LysまたはArg)；残基91のXaa＝(TyrまたはHis)；および残基97のXaa＝(ArgまたはLys)である。さらに別の好ましい局面においては、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でOP1またはOP2のＣ末端の７個のシステインドメインをコードするDNAまたはRNA配列にハイブリダイズする核酸によりコードされる骨形成タンパク質を意図する。本発明に有用なOP-1の種々の用語の簡単な説明を以下に記載する： OP1 − 一般にhOP1遺伝子の一部または全体の発現により生成される骨形成活性なタンパク質のファミリーをいう。関連出願では、「OPI」および「OP-1」ともいう。 OP1-PP − ヒトOP1タンパク質（プレプロ形態）、配列番号９、残基１〜431のアミノ酸配列をいう。関連出願では、「OP1-PP」および「OPP」ともいう。 OP1-18Ser − 成熟ヒトOP1タンパク質、配列番号９、残基293〜431のアミノ酸配列。Ｎ末端アミノ酸はセリンである。本来、COS細胞においてSDS-PAGEで18kDa で移動するとして同定された。異なる宿主細胞におけるタンパク質グリコシル化のパターンに依存して、SDS-PAGEで23kDa、19kDa、および17kDaでも移動する。関連出願では、「OP1-18」ともいう。 OP1-16Ser；OP1-16Ala；OP1-16Met；OP1-16Leu；OP1-16Val − それぞれ、残基300〜431；316〜431；315〜431；313〜431、および318〜431により定義されるＮ末端短縮型成熟ヒトOP1タンパク質種。 OPS − Ｃ末端の６個のシステインドメイン、配列番号９の残基335〜431により定義されるアミノ酸配列。 OP7 − Ｃ末端の７個のシステインドメイン、配列番号９の残基330〜431により定義されるアミノ酸配列。可溶性形態OP1 − １コピーまたは好ましくは２コピーのプロドメイン（例えば、少なくとも配列番号９の残基158〜292、好ましくは残基48〜292または30〜2 92）を有する、非共有結合により２量体に複合体化している成熟２量体OP1種。 OP1結合ALK核酸配列を得るためのクローニング手順、レセプター配列を発現するための手段、ならびにこれらの配列の性質および有用性に関する材料の他の局面が以下から理解される。これは、請求される内容を作製する方法および使用する方法を包含し、本発明の実施について意図される現在最もよい実施態様を構成する。実施例１．ALK-1、ALK-2、ALK-3、およびALK-6の同定 ALK-1、ALK-2、ALK-3、およびALK-6レセプターのクローニングおよび特徴付けは、Dijkeら（1993）Oncogene 8: 2879-2887および(1994)Science 264: 101-104 に詳細に記載されている。これらのタンパク質の一般構造を図１に示し、そしてALK遺伝子間の配列アラインメントを図２および図３に示す。これらの分子は類似したドメイン構造を有する：Ｎ末端の推定疎水性シグナル配列(von Heijne( 1986)Nucl.Acids Res．14：4683-4690)の後に、比較的小さな細胞外システインリッチリガンド結合ドメイン、単一の疎水性膜貫通領域(KyteおよびDoolittle（ 1982）J.Mol.Biol．157：105-132)およびＣ末端細胞内部分（これは、キナーゼドメインのほとんど全てをなす）が続く（図３）。これらのレセプターの細胞外ドメイン（本質的にはALK-1については残基22〜1 18（配列番号１）；ALK-2については残基16〜123（配列番号３）；ALK-3については残基24〜152（配列番号５）；およびALK-6については残基23〜122（配列番号７）により定義される）は、システインリッチ領域を有するが、しかし配列類似性はタンパク質間で異なる。例えば、ALK-3とALK-6とは、それらの細胞外ドメインにおいて高い程度の配列類似性を共有する（46％同一）が、一方ALK-2はALK 3およびALK6とより少ない配列相同性しか示さない（図２を参照のこと）。これらのレセプターにおける多くのシステイン残基の位置は、整列され得る。これは、細胞外ドメインが同様の構造的配置を採用するようであることを示す。これらのレセプターの細胞内ドメインは、セリン／トレオニンキナーゼにより特徴付けられ、本質的にはALK-1については残基204〜494（配列番号１）；ALK-2 については残基210〜510（配列番号３）；ALK-3については残基236〜527（配列番号５）；およびALK-6については残基206〜497（配列番号７）により定義される。キナーゼの触媒ドメインは、保存されたアミノ酸残基のストレッチを有する 12のサブドメインに分割され得る。鍵となるモチーフは、セリン／トレオニンキナーゼレセプターに見出される。これは、それらが機能的なキナーゼであることを示す。ATPの結合のためのコンセンサス配列(サブドメインＩのGly-X-Gly-X-X- Glyに続くサブドメインIIのさらに下流のLys残基）が、全てのALKに見出される。さらに、ALK-1、ALK-2、AIK-3、およびALK-6は、配列モチーフまたは類似のモチーフHRDLKSKN（サブドメインVIB）およびGTKRYMAPE（サブドメインVIII）を有し、これは、ほとんどのセリン／トレオニンキナーゼレセプターに見出され、そしてこれらとチロシンキナーゼレセプターを区別するために用いられ得る。キナーゼドメインにおける２つの短い挿入（サブドメインVIAとVIBの間およびＸとXI の間）は、このセリン／トレオニンキナーゼレセプターファミリーのメンバーに独特である。細胞内ドメインにおいては、これらの領域は、ファミリーのメンバー間で膜近傍部分(juxtamembrane part)およびＣ末端尾部とともに最も分岐している。当該分野で公知のII型セリン／トレオニンキナーゼレセプターは、本明細書において上記に記載および参照されている。実施例２．レセプター発現Ａ．一般的考察レセプターDNAまたはその合成形態は、当該分野で十分に記載されている従来の技術（例えば、Maniatis（1989）Molecular Cloning A Laboratory Manualを参照のこと）を用いて、種々の発現ベクターの任意のものに挿入され、そして適切な宿主細胞にトランスフェクトされ、完全長およびその短縮形態の両方を含む組換えタンパク質ポリペプチド鎖を生成し得る。例えば、短縮配列は可溶性レセプターフラグメントの生成に用いられ得る。有用な宿主細胞は、E.coli、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、昆虫／バキュロウイルス細胞系、ミエローマ細胞、および種々の他の哺乳動物細胞を包含する。本発明のタンパク質の完全長の形態は、本明細書中に開示したように好ましくは哺乳動物細胞において発現される。可溶性形態は、哺乳動物細胞系または細菌細胞系の両方から発現され得る。ベクターはさらに、組換えタンパク質の正確な発現を促進するために種々の配列を含み得る。これらの配列は、転写プロモーターおよび転写終了配列、エンハンサー配列、好ましいリボソーム結合部位配列、好ましいmRNAリーダー配列、好ましいタンパク質プロセシング配列、タンパク質分泌のための好ましいシグナル配列などを包含する。目的の遺伝子をコードするDNA配列はまた、操作されて潜在的な阻害配列を除去し得るか、または不必要な２次構造の形成を最少にし得る。組換えモルフォゲンレセプターはまた、融合タンパク質として発現され得る。翻訳後、タンパク質は、細胞自体から精製され得るかまたは培地から回収され得る。DNAはまた、組換えタンパク質の発現および／または精製を援助する配列を含み得る。有用な配列の１つは、例えば、ヘキサHis（His₆）配列である。この配列は、ヒスチジン尾部を添加し、IMA C Cu2+カラムでのタンパク質のアフィニティー精製を可能にする（以下を参照のこと）。例えば、細胞外ドメインをコードするDNAは、E.coliまたはB.subtilisのような原核細胞宿主への形質転換のための適切な発現ベクターに挿入され、可溶性のモルフォゲン結合フラグメントを生成し得る。DNAは、直接発現され得るか、または容易に切断し得る融合連結部を有する融合タンパク質の一部として発現され得る。MR-1 DNAを用いる原核生物での発現のためのプロトコルの例を以下に提供する。組換えタンパク質は、インクルージョンボディーで発現され、そして例えば、米国特許第5、013、653号に記載の技術を用いてインクルージョンボディーから精製され得る。 DNAはまた、適切な哺乳動物宿主において発現され得る。有用な宿主は、線維芽細胞3T3細胞（例えば、CRL1658由来のNIH 3T3）、COS（サル腎臓ATCC、CRL-16 50）、またはCHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞（例えば、Lawrence Chas in、Proc.Nat'l.Acad.Sci. (1980)77(7)：4216-4222のCHO-DXB11）、ミンク肺上皮細胞(MVlLu)、ヒト包皮線維芽細胞、ヒト神経膠芽細胞腫細胞、およびテラトカルシノーマ細胞を包含する。他の有用な真核細胞系は、酵母細胞、昆虫／バキュロウイルス系、またはミエローマ細胞を包含する。 OP-1特異細胞表面レセプターを発現するために、DNAを適切な市販のベクターの挿入部位に、適切なプロモーター／エンハンサー配列および３’末端配列と一緒にサブクローン化する。有用なプロモーター／エンハンサー配列の組み合わせは、例えば、pCDM8に存在するCMVプロモーター（ヒトサイトメガロウイルス(MIE )プロモーター）、ならびにラウス肉腫ウイルスLTRエンハンサー配列(例えば、C lontech、Inc.、Palo Altoより)により高められた哺乳動物腫瘍ウイルスプロモーター(MMTV)を包含する。有用な誘導性プロモーターは、例えば、Zn²⁺メタロチオネインプロモーター(Wranaら、(1992)Cell 71 ：1003-1014)のようなZn²⁺誘導性プロモーターを包含する。他の誘導性プロモーターは、当該分野で周知であり、そして同様に成功裏に用いられ得る。発現はまた、トランスアクティベイティングエンハンサー配列を用いてさらに増強され得る。プラスミドはまた、好ましくは増幅可能なマーカー（例えば、SV40初期プロモーター(ATCC #37148)のような適切なプロモーターの制御下でのDHFR）を含有する。トランスフェクション、細胞培養、遺伝子増幅、およびタンパク質発現の条件は、当該分野で周知の標準的な条件である。このような条件は、例えば、Ausubelら編、Current Protocols i n Molecular Biology 、 John Wiley & Sons、NY(1989)に記載されている。簡略に述べれば、トランスフェクトした細胞を、５〜10％の透析ウシ胎児血清(FCS)を含有する培地で培養し、そして安定的にトランスフェクトした高発現細胞株を増幅およびサブクローニングにより得て、そして標準的なウェスタンブロット分析およびノーザンブロット分析により評価した。サザンブロットはまた、組み込まれたレセプター配列の状態およびそれらの増幅のコピー数の程度を評価するために用いられ得る。次いで、発現されたタンパク質を標準的な手順を用いて精製する。現在、好ましい方法論は、アフィニティーカラム（例えば、リガンドアフィニティーカラム、または抗体アフィニティーカラム）を使用し、次いで結合した物質を洗浄し、そしてレセプター分子をイオン強度の増加する勾配、pHの変化、または穏やかな変性剤の添加により選択的に溶出する。あるいは、有用なアンカー配列（例えば、(His)₆配列）がDNAに付加されている場合、カラムはCu²⁺IMACカラムのような標準的なアフィニティーカラムであり得る。ここで、例えば、組換えタンパク質を含有する細胞培養培地を、Cu²⁺IMACカラム（例えば、25mMイミダゾールで調製する）に通す。次いで、結合したタンパク質を適合可能な溶液で洗浄し、そして EDTAで溶出する。アンカー配列は、標準的な化学的手順または酵素的手順により除去され得る。細胞表面でのモルフォゲンレセプター発現が所望の場合、哺乳動物細胞の発現が好ましい。例えば、細胞表面発現は、インビボ条件下での細胞表面レセプターに対するモルフォゲンまたはモルフォゲンアナログの結合特異性を試験するために所望され得る。細胞表面発現はまた、以下に記載のような中程度のフラックス細胞スクリーニングアッセイに最も有効であり得る。Ｂ.1 代表的な哺乳動物細胞培養以下の実施例８および９で試験したレセプターを、(1)COS-1細胞；(2)ミンク肺上皮細胞(MvlLu)；(3)AG1518ヒト包皮線維芽細胞；(4)MG-63ヒト骨肉腫細胞； (5)PC12ラットクロム親和性細胞腫（これらは全てAmerican Type Culture Colle ction、Rockville、MDから入手した）；(6)U-1240MGヒト神経膠芽細胞腫細胞(Be ngt Westermarkら(1988)Cancer Research 48：3910-3918)；(7)Tera-2奇形ガン細胞（クローン13、Thompsonら(1984)J Cell Sci 72：37-64）；(8)MC3T3-E1細胞(Sudoら(1983)J．Cell Biol. 96：191-198)、および(9)ROS 17/2.8ラット骨肉腫細胞(Majeskaら(1985)Endocrinology 116：70-179)において発現させた。ROS 細胞を、14mM HEPES緩衝液、2.5mM L-グルタミン、1.1mM CaCl₂、５％ウシ胎児血清および抗生物質を含有するHam F12培地で培養した；MC3T3-E1細胞を10％ウシ胎児血清および抗生物質を有するa-MEM培地で培養し、そしてTera-2細胞を５％CO₂雰囲気において37℃にて、10％ウシ胎児血清、100単位／mlのペニシリン、および50mg/mlのストレプトマイシンを含有するa-MEMにおいて、リン酸緩衝化生理食塩水中0.1％ブタ皮膚ゼラチン(Sigma)で前処理した組織培養シャーレを用いて培養した。特に示さない限り、細胞を10％ウシ胎児血清および抗生物質を含む DMEMにおいて培養した。Ｂ.2 cDNA のトランスフェクション実施例8.1において試験したレセプター(ALK1〜6、daf-4)を、以下のようにトランスフェクトした。ALK-1−ALK-6およびdaf-4の一過性発現プラスミドを、発現ベクター(pSV7d、Truettら(1985)DNA 4：333-349)またはpcDNAI発現ベクター( Invitrogen、San Diego)にサブクローン化することにより生成した。一過性トランスフェクションのために、リン酸カルシウム沈澱法により、COS-1細胞を10mg の各プラスミドでトランスフェクトした。ここでは、哺乳動物トランスフェクションキット(Stratagene、La Jolla)を製造者のプロトコルに従って用いた。トランスフェクションの１日後、細胞をアフィニティー標識および架橋実験のために用いた。実施例３．抗体生成Ａ．一般的考察レセプター分子、リガンド分子、またはリガンドレセプター複合体自身に特異に結合し得る抗体、アナログとして有用な抗体、およびイムノアッセイおよび記載されたモルフォゲンレセプターの免疫精製に有用な抗体を、以下のように得た。 OP-1特異的レセプターに特異な抗体が所望であるが、これがリガンド結合と相互作用しない場合、抗原性の配列は、膜近接配列を含むことが好ましい。リガンド結合に競合し得る抗体が所望の場合、リガンド結合ドメインが、抗原供給源として用いられ得る。複合体に対する抗体が所望の場合、複合体自体が、抗原性配列として好ましく用いられ、次いで候補の抗体は、非複合リガンドおよびレセプター対リガンド−レセプター複合体の交差反応性について試験される。最終的に、二重特異性抗体は、細胞表面レセプター（Ｉ型またはII型）に対するリガンドを複合体化するために、および／またはＩ型またはII型モルフォゲン特異的レセプターを発現する細胞または組織に対する因子またはリガンドを標的化するために使用され得る。好ましい二重特異性抗体由来分子は、米国特許第5、091、513号および同第5、132、405号に記載の単鎖結合部位である。この開示は、本明細書中に参考として援用される。 OP1レセプター結合アナログとして有用な抗体は、免疫原供給源としてレセプターリガンド結合ドメインを用いる工程、およびレセプター結合アナログを競合結合アッセイにおいてOP1と競合するその能力について試験する工程により得られ得る。同様に、OP1特異的レセプターアナログとして有用な抗体が所望の場合、OP1が免疫原供給源であり、そして抗体候補は、レセプタータンパク質を用いて競合アッセイにおいて試験される。目的のモルフォゲンレセプターに特異的なポリクローナル抗体は、一般に以下の記載のように調製され得る。各ウサギに、500mlの完全フロイントアジュバントと混合した0.1％SDS中の抗原の１次免疫感作（例えば、500mg）を行う。抗原を、動物の背中および腹側部の多数の部位に皮内注入する。ウサギを、１ヶ月後、500mgの抗原で、同じ様式で、不完全フロイントアジュバントを用いて追加免疫する。試験採血を７日後に耳の静脈から行う。さらに２回の追加免疫および試験採血を、抗原性配列に対する抗体が標準的なウェスタンブロットを用いて血清中に検出されるまで１ヶ月間隔で行う。次いで、ウサギを毎月、100mg/mlの抗原で追加免疫し、そして追加免疫の７日後および10日後に採血（採血１回あたり15ml ）する。同様に、目的の所定のモルフォゲンレセプター分子に対して特異的なモノクローナル抗体を、以下の記載のように調製し得る。マウスは、抗原性配列の注入を２回受ける。タンパク質は、好ましくは組換えにより生成される。抗体が、レセプターのモルフォゲン結合表面のエピトープを認識することが所望の場合、好ましくは細胞外ドメイン由来の抗原フラグメントが提供される。最初の注入には、完全フロイントアジュバント中100mgの抗原が含有され、そして皮下的に与えられる。２回目の注入は、不完全アジュバント中50mgの抗原が含有され、そして腹腔内に与えられる。次いで、マウスは、８ヶ月間の間の種々の時期に４回の腹腔内注射により合計230mgの抗原を受ける。融合１週間前、マウスを抗原（例えば、100mg）で腹腔内に追加免疫し、そしてさらに、適切な架橋剤でウシ血清アルブミンと結合した抗原特異的ペプチドで追加免疫し得る。この追加免疫を、融合５日前（腹腔内）、４日前（腹腔内）、３日前（腹腔内）、および１日前（静脈内）に反復し得る。次いで、マウス脾臓細胞を、PEG 1500(Boehringer Mannheim、 Germany)を用いて、市販の骨髄腫細胞と１：１の比で融合する。そして融合細胞をプレートし、そしてALK-特異抗体について、例えば、ALK-2、ALK-3、または ALK-6を抗原として用いてスクリーニングした。細胞融合およびモノクローナルスクリーニング工程は、当該分野で広範に入手可能な標準的教本に良く記載された標準的な手順に従って容易に行われる。（例えば、Guide to Protein Purific ation Murray P.Deutscher編、Academic Press、San Diego、1990を参照のこと）。Ｂ．代表的なALK-特異抗血清実施例８のアッセイに用いられる抗体を、以下のように得た。ALK-1〜ALK-6に対するウサギ抗血清を外に広がった(divergent)細胞内膜近接部に対応する合成ペプチドに対して作製した。(ALK-1：残基119〜141；ALK-2：残基151〜172；ALK -3：残基181〜202；ALK-6：残基151〜168。)ペプチドを、t-ブトキシカルボニル化学を用いてApplied Biosystems 430 Aペプチド合成機で合成し、そして逆相 HPLCにより精製した。合成ペプチドを、Gullikら（1985）EMBO J 4: 2869-2877 に記載のように、グルタルアルデヒドを用いてキーホールリンペット(keyhole l impet)ヘモシアニン(Calbiochem-Behring)に結合した。次いで、連結ペプチドを、フロイントアジュバントと混合し、そしてこれを使用して標準的方法論を用いてウサギを免疫感作した。実施例４． OP1レセプター結合アッセイリガンド結合特異性を、レセプター分子が特異的なリガンドに結合する能力ならびに自分自身およびレセプターを結合する他の分子に対して競合するそのリガンドの能力を評価することにより測定する。有用なリガンドは、解離定数(Kd)が約10^-6Ｍ未満、好ましくは5×10^-7Ｍ未満であるような可溶性モルフォゲンレセプターの細胞外ドメインに対する結合親和性を有する。より強い結合相互作用が望ましい場合、好ましい親和性は10^-8〜10^-9ＭのKdにより定義される。OP1関連タンパク質は、親和性は変わるようだが、多数の異なるレセプター分子に対する特異的に結合し得ると予想される。リガンド結合特異性は、以下のように、本質的には当該分野において十分に記載され、そして開示された標準的プロトコルに従って、アッセイされ得る（例えば、Legerskiら(1992)Biochem ．Biophys．Res．Comm． 183：672-679およびFrak arら、(1978)Biochem ．Biophys．Res．Comm. 80：849-857）。リガンド結合アッセイにおいて、問題のモルフォゲンレセプター分子に対する既知の定量可能な親和性を有するリガンドは、代表的には放射ヨード化(¹²⁵I)により、例えば発色性の標識化または蛍光性の標識化により、または代謝物標識化(例えば³⁵S)により標識され、そしてレセプターをその表面上に発現する細胞のアリコートを、標識したリガンドと、種々の濃度の非標識の可能な競合物リガンドの存在下でインキュベートする。下記の実施例８および９に記載されたアッセイにおいて、この競合物は代表的には候補のモルフォゲンアナログであるか、あるいは候補のモルフォゲンアナログを含むと予測される培養液または抽出物由来のアリコートである。あるいは、架橋剤を用いてリガンドを結合レセプターへ共有結合させ得、次いで架橋された複合体をリガンド、レセプター、または複合体に特異的な抗体で免疫沈降させ得る。(実施例８を参照のこと) 結合親和性を測定する標準的な例示プロトコルを、以下に提供する。簡単に述べると、細胞表面上にレセプターを発現する細胞を35mMディッシュにプレートし、そして48時間、10%ウシ胎児血清を加えたDMEM(ダルベッコの改変イーグル培地 )中でインキュベートする。精製したモルフォゲン(ここでは、例えばOP-1または OP1アナログ)を、本質的にはFrolikら(1984)J.Biol.Chem. 595：10995-11000のプロトコルに従って、クロラミンＴ酸化によりNa¹²⁵Iでヨード化し、好ましくは約50-100mCi/mgの比活性を有する。次いで、標識したモルフォゲンを標準的手順 (例えばクロマトグラフィー的に)を用いて精製する。次いで、プレートに撒いた細胞を生理的緩衝化食塩水で0.1% BSAの存在下２回洗浄し、そして22℃でBSA、緩衝液、および標識したモルフォゲン(１ng)および種々の濃度(例えば、０-10mg /ml)の非標識の競合物(例えば、非標識モルフォゲンまたは候補のリガンドアナログ)の存在下でインキュベートする。結合後、細胞を冷緩衝液で３回洗浄し、0 .5mlの0.5N NaOHに可溶化し、ディッシュから取り出し、放射能をガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターで測定する。次いで、データを阻害率( パーセント)として示す（ここで、特異結合の100%阻害は、競合物の非存在下での結合と100倍モル過剰の非標識モルフォゲンの存在下での結合との間の差である）。結合パラメータを、好ましくはLIGAND(Munsunら(1980)Anal.Biochem. 107 ：220-259)のようなコンピュータプログラムを用いて決定する。レセプターの細胞表面の結合ドメインが可溶性タンパク質として提供される場合、アッセイは溶液中で行い得、もっとも容易であるのは免疫沈降アッセイである。現在好ましいアッセイでは、モルフォゲン分子は標識され、そして非標識レセプターおよび候補のモルフォゲンアナログとともにインキュベートされる。次いで、レセプター特異抗体を溶液中に与え、レセプター-モルフォゲン複合体を沈降させ、そして沈降複合体中の標識モルフォゲン量を標準的な検出手段を用いて測定する。レセプターまたはリガンドがアフィニティ単離プロトコルに用いられる場合、分子は、好ましくは表面、好ましくはサンプル液をそそぐマトリックス表面に固定化し、問題のリガンドを結合させ、流出液として非結合成分を素通りさせる。次いで、複合体はそのまま取り出され得るか、またはリガンドは所望の溶出液で選択的に取り出され得る。 4.1 スクリーニングアッセイ考察以下の実施例９に記載のアナログのスクリーニングアッセイにおいて、リガンド-レセプター結合をアッセイする好ましいプロトコルは、標準的な競合アッセイまたはラジオイムノアッセイ(RIA)である。ここでは、OP1が標識され、そしてサンプル中の候補のOP1アナログリガンドの相対的な結合親和性を、候補物(非標識リガンドアナログ)がレセプターによって、標識リガンド(競合物モルフォゲン )の結合を阻害する能力を定量することにより測定する。アッセイの遂行において、固定した濃度のレセプターおよび標識モルフォゲンを、候補のリガンドを含む未知のサンプルの非存在下および存在下でインキュベートする。標識したモルフォゲンを加える前に、候補のリガンドとレセプターとをプレインキュベートすることにより感度が増加し得る。標識した競合物を加えた後、十分な時間が競合物の十分な結合を可能にし、次いで遊離の標識モルフォゲンと結合した標識モルフォゲンとを分離し、そして１方または他方を測定する。有用なモルフォゲン標識は、放射能標識、発色性標識または蛍光発色性の標識、および西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはb-ガラクトシダーゼのような、化学発光性基質または蛍光発光性基質と組み合わせて用いる、高ターンオーバー (turn over)数を有する結合酵素を含む。同様に、OP1特異的レセプターアナログを、標識したOP1特異的レセプターを用いる競合アッセイにおいてOP1に対する親和性についてアッセイし得る。候補のOP1レセプター結合アナログが膜横断シグナル伝達においてOP-1を模倣する能力を評価するためのアッセイを、下記の実施例９.２に詳細に例示する。簡単に述べると、アッセイは、(1)OP-1-特異的レセプターを発現すると知られている細胞；または(2)OP-1-特異的レセプターを発現するように改変され得る細胞、および／または(3)OP-1仲介細胞応答を誘導し得る細胞の使用を含む。アッセイでは、候補のアナログがOP-1-特異細胞応答を誘導する能力をモニターする。多数のOP-1応答細胞ならびにOP-1-仲介誘導細胞マーカーおよび生化学マーカーが公知であり、当該分野において記載されている。あるいは下記に例示するように、OP-1誘導性レセプター遺伝子系を構築し得、そして本アッセイにおいて有利に使用し得る。 4.2 診断アッセイ考察溶液中のモルフォゲンを検出する能力は、診断アッセイのために価値のある道具(tool)を提供し、体内で(例えば、血清および他の体液において)遊離のモルフォゲンレベルをモニターし得る。例えば、OP-1は、血清および脊髄溶液(脳脊髄液、唾液、乳汁、および他の乳房浸出液を含む)を含む多くの異なる体液中で検出された。(例えば、PCT US92/07432号、PCT US93/07231号、WO94/06449号を参照のこと)。１例として、OP-1は、正常な骨成長および骨吸収における密接な関係物である。従って、可溶性OP-1は高い骨形成を経験している個体(例えば、子供)においてより高い濃度で、そして骨形成速度の異常に低い個体(例えば、骨粗鬆症、形成不能性骨疾患、または骨減少症の患者)において実質的に低レベルで検出されると予想される。従って、血清中のOP-1レベルをモニターすることは、個体における骨組織および骨恒常性の状態を評価する方法、ならびに損傷を受けたかまたは失われた骨組織を再生する処置効果をモニターする方法を提供する。あるいは、骨組織中のOP-1レベルを骨組織バイオプシーで評価し得る。同様に、OP-1および他のモルフォゲンが脳組織で同定されている。特に、OP-1 は、成長期または成人のラットの脳および脊髄組織中、海馬、黒質、およびアデンデーマ(adendema)グリア細胞中に発現および／または局在し、樹状突起および神経細胞体をとりまく細胞外マトリックスに結合している。(PCT US93/07331を参照のこと)。従って、脊髄溶液中の、または神経組織バイオプシーと結合しているOP-1レベルをモニターすることで、個体における神経組織の状態を評価する方法、ならびに神経再生療法または修復療法の効果をモニターする方法を提供し得る。血清アッセイのために、まず血清を、好ましくは部分精製し、過剰の夾雑血清タンパク質(例えば、血清アルブミン)を除去する。好ましくは、血清を、複合体が沈降するような硫酸アンモニウム(例えば、45%)中で沈殿させることにより抽出する。さらなる精製は、血清中に存在する他のタンパク質の溶解度に比較して、可溶性モルフォゲン複合体または成熟モルフォゲンの異なる溶解度を利用する精製戦略を用いて達成され得る。さらなる精製はまた、当該分野で周知のクロマトグラフィ技術により達成され得る。次いで、サンプル溶液を、OP-1-特異的レセプターおよび本明細書中に記載の結合アッセイを用いてOP1についてアッセイし得る。組織バイオプシーのために、細胞を集め、標識したOP-1特異抗体またはレセプター分子で染色し得る。あるいは、OP-1タンパク質を選択的に抽出し得、そして上記のように定量し得る。本明細書中で意図された結合／スクリーニングアッセイにおいて有用なモルフォゲンは、可溶型タンパク質を含む。例えば、１つまたは２つのコピーのプロドメインと複合体化する成熟２量体種、成熟２量体種のみ、およびＣ-末端活性ドメインを本質的にまさに含有する短縮型が挙げられる。実施例５．膜貫通シグナル誘導アッセイ／OP1模倣物 OP-1特異的レセプターの細胞内ドメインのキナーゼ活性を、Mathewsら(PCT/US 92/03825、1992年11月26日に公開)に記載された自己リン酸化アッセイで試験し得る。簡単に述べると、少なくともOP-1特異的レセプターの細胞内キナーゼドメインをコードするDNAフラグメントを、pGEX-2T(Smithら(1988)Gene 67：31-40) 中にサブクローン化し、推定キナーゼドメインとグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との間の融合タンパク質を作出する。プラスミドをE.coliに導入し、そして発現した融合タンパク質をグルタチオンアフィニティクロマトグラフィを用いて精製する。次いで、約100〜200ngの融合タンパク質または精製したGSTを、50mM Tris、10mM MgCl₂緩衝液中で25mCi(gp³²P)ATPと30分間37℃でインキュベートする。次いで、生成物をゲル電気泳動およびオートラジオグラフィにより分析する。融合タンパク質(GSTのみではなく)がリン酸化され、キナーゼドメインが機能することを示す。次いで、ホスホアミノ酸分析を行い、リン酸化される主要アミノ酸を決定し得る。同様のアッセイを、哺乳動物細胞中で発現した類似の融合構築物を用いて行い得る。種々のシグナル伝達アッセイを下記の実施例９に提供する。アッセイはまた、リガンド結合におけるキナーゼ活性変換を試験することために、当該分野で公知のリガンド誘導キナーゼ活性アッセイを用いて開発され得る。本明細書中では、レセプターへの結合に際してリン酸化を誘導するOP-1アナログの能力を試験する。例えば、Acciliら、(1991)J.Biol.Chem．266：434-439およびNakamuraら(1992 )J.Biol.Chem．267：18924-18928に記載されたリガンド誘導キナーゼ活性を測定するための種々のアッセイを参照のこと。例えば、リガンド誘導キナーゼ活性( 例えば、レセプター自己リン酸化)を、精製レセプターをリガンド(ここでは、OP 1またはOP1アナログ、例えば10^-7M)の存在下および非存在下、リガンドのレセプターへの結合を可能にするに十分な条件下、インキュベートすることによりインビトロで測定し得、次いで³²P-ATP(例えば、10mM Tris-HCl(pH7.6)、10mM MgCl₂ 、10mM MnCl₂、1mMジチオスレイトール、0.15M NaCl、0.1％Triton X-100および３％グリセロールの存在下で100mCi)に曝し得、そしてリン酸化の量を、例えば、抗ホスホセリン、抗ホスホトレオニンまたは抗ホスホチロシン抗体(例えば、市販または標準的な抗体方法を用いて作製)を用いる免疫沈降後のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィにより、測定し得る。低レベルの自己リン酸化はリガンドの非存在下で検出し得るが、リガンドとのインキュベーションは、検出されたリン酸化量を有為に増加すること(例えば、5〜20倍増 )が予想される。リガンド-誘導レセプター自己リン酸化(インタクトな(intact)細胞を含む)を検出する他のアッセイにおいて、レセプターDNAを適切な宿主細胞(例えば、線維芽細胞)にトランスフェクトし、次いでこれを標準的条件下で増殖させ、細胞表面上にレセプターを発現する細胞のコンフルエントの単層を生じさせる。実験当日に、細胞をリガンド(例えばOP1またはOP1アナログ、例えば10^-7M)の存在下または非存在下37℃でインキュベートし、次いで、ATPを含む「停止溶液」(例えば、0.1M NaF、４mM EDTA、10mM ATP、10mMオルトバナジウム酸ナトリウム、４mM ピロリン酸ナトリウム)ですばやく洗浄する。次いで、細胞をドライアイス／エタノール浴中で凍結し、可溶化し、そしてレセプターを、例えば本明細書中に記載したように抗レセプター抗体で免疫沈降させる。次いで、免疫複合体を分離し、洗浄し、標準的手順を用いるゲル電気泳動で分離し、標準的手順を用いるウエスタンブロッティング分析用の膜にトランスファーする。次いでレセプターのリン酸化を、上記のように、適切な抗体(例えば、抗ホスホセリン、抗ホスホトレオニンまたは抗ホスホチロシン)での免疫検出により可視化し得る。次いで、結合抗体(例えば、結合した抗ホスホセリン、抗ホスホトレオニンまたは抗ホスホチロシン)を¹²⁵I標識したプロテインAで検出し得、次いでオートラジオグラフィを行い得る。検出されたリン酸化レセプターの量は、リガンド非存在下でATPに曝露したレセプターより、リガンドと一緒にインキュベートしたレセプターにおいて有意に多い(5-20倍増)ことが予想される。外来性基質のリガンド-誘導レセプターリン酸化は、本質的に本明細書中に記載された方法を用いて同様にアッセイされ得る。本明細書中では、適切な基質( 例えば、セリン、トレオニンまたはチロシンアミノ酸を含有する合成ポリペプチド)が、リガンドに曝露した後およびATPとインキュベートする前にレセプターに提供される。続いて、基質は、基質に特異的な抗体を用いる免疫沈降により分離され得、上記のようにリン酸化を検出し得る。自己リン酸化については、リガンドインキュベーションに続いて検出されたリン酸化基質の量は、リガンドの非存在下でレセプターに曝された基質について検出された基質の量より多いことが予想される。あるいは、レポーター遺伝子構築物を作出して、膜貫通シグナル誘導をアッセイし得る。本明細書中では、OP-1誘導性タンパク質マーカーのための発現制御エレメントを、任意のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム配列に融合し、次いでレポーター遺伝子発現の誘導をアッセイする。有用なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子またはGAL4および他の容易に特徴付けられるマーカーを含む。実施例６．キメラレセプター分子キメラレセプター分子(例えばALKまたはALKアナログの細胞外および膜貫通領域、ならびに例えば別の異なるレセプター由来の細胞内ドメインまたは異なる細胞表面分子由来の細胞内ドメインの一部または全部を含む)は、標準的な組換えD NA技術および／または所望の配列を構築するための自動化DNA合成機を用いて構築され得る。当業者により適用されるように、有用な連結は、膜貫通領域内の配列ならびに／または細胞内もしくは細胞外ドメインのいずれかの連結での配列を含む。また、細胞外ドメインまたは細胞内ドメインがそれ自身キメラ配列である場合、キメラが予見される。キメラ配列は、候補の結合リガンド(例えば、OP1アナログ、下記参照)を測定するためのスクリーニングアッセイにおいて特に有用であると予見され、この場合、レセプターでない細胞内ドメインは、検出が容易である適切なセカンドメッセンジャー応答系を提供する。有用であり得る他のセカンドメッセンジャー応答系には、活性化された場合、ホスホイノシチド加水分解、アデニル酸シクラーゼ、グアニル酸シクラーゼ、またはイオンチャンネルを誘導する系が含まれる。キメラレセプター分子は、遺伝子療法プロトコルにおいて特に有用性を有する。例えば、キメラモルフォゲンレセプター分子を自己の細胞表面上に発現する細胞群および所望の表現型を発現するための能力を有する細胞群を、特定の組織座 (locus)で哺乳動物に移植し得る。これらのレセプターにおいて用いられるリガンド結合ドメインを注意深く選択することにより、医師は、以下のことを可能にするモルフォゲンアゴニストを個体に投与し得る：(1)キメラレセプターのみへの結合、および(2)移植された細胞の増殖および／または分化の内在性細胞群に影響することのない刺激。実施例７．核酸ライブラリー中の他のOP1特異的レセプターの同定についての考察 OP-1を結合し得るALK Ｉ型レセプターの同定は、異なる種、ならびに異なる組織における他のモルフォゲンレセプター配列の同定を可能にする。OP-1結合ALK 配列自身は、プローブとして用い得る、またはこの配列は、他の可能性のあるコドン使用法(例えば、ヒトのコドン偏り(bias))により改変され得る。現在好ましいプローブ配列は、レセプターの細胞外ドメインをコードする配列である。配列番号１、３、５または７の核酸配列に基づくプローブを、市販のDNA合成機(例えば、Applied Biosystems model 381A)で標準的技術(例えば、Gait、Olig onucleotide Synthesis: A Practical Approach 、(IRL Press、Washington D.C.、 1984))を用いて合成し得る。プローブは、少なくとも8-50塩基長、さらに好ましくは18-30塩基長であることが好ましい。プローブは、当該技術分野で標準的な種々の方法、例えば、放射能標識、酵素的標識、または比色的標識を用いて( 例えば、Berentら、(May/June 1985)Biotechniques: 208-220; およびJablonski ら(1986)Nucleic Acids Research 14: 6115-6128に記載されたように)標識され得る。好ましくは、OP1-結合レセプター由来のプローブを用いてモルフォゲンレセプター配列についてライブラリーをスクリーニングする場合、低いストリンジェンシー(stringency)の条件が用いられる。好ましいALK特異プローブは、細胞外ドメイン(「ECD」)をコードするか、または細胞質ドメイン内の独特の(非相同の) 配列をコードする塩基に対応するプローブである。例えば、有用なプローブを膜近接(juxtamembrane)領域をコードする塩基から設計し得る。プローブは、好ましい種のコドン偏りを用いてさらに改変され得る。あるいは、セリン／トレオニンキナーゼドメイン由来のプローブを用いてレセプターキナーゼファミリー(OP- 1結合について実施例８に記載された方法を用いてスクリーニングされ得る)の新しいメンバーを同定し得る。例えば、約20-40塩基のプローブについて、典型的なプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄プロトコルは以下である：(1)プレハイブリダイゼーション：変性した標的DNAを含むニトロセルロースフィルターを３〜４時間、55℃で５×デンハルト溶液、６×SSC(20×SSCは800mlの水中に17 5g NaCl、88.2gクエン酸ナトリウムからなり、10N NaOHてpH7.0に調整する)、0. 1% SDS、および100mg/mlの変性したサケ精子DNA中でインキュベートし、(2)ハイブリダイゼーション：プローブを足したプレハイブリダイゼーション溶液中でフィルターを42℃、14〜48時間インキュベートし、(3)洗浄：６×SSCおよび0.1% S DS中、室温で３回15分間の洗浄、次いで６×SSCおよび0.1％SDS中、55℃で最終の１〜1.5分間洗浄する。他の同等の手順が（例えば、ホルムアミドのような有機溶媒を用いる）当該分野で周知である。あるいは、モルフォゲンレセプター特異DNAを、本明細書中に開示されるような標準的なPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)方法論を用いて増幅して、およそ500塩基対フラグメントを増幅し得る。上記のハイブリダイゼーションスクリーニングプローブと同様に、プライマー配列は、好ましくはセリン／トレオニンキナーゼドメイン中の保存配列由来である。本明細書中に配列番号12〜15に開示されたプライマーは、特に組み合わせにおいて、特に有用であると予見される。有用なPCR増幅の例は、本明細書中に引用されたプライマーの利用を含み、ten Dijkeら(1993)Oncogene 8：2879-2887および(1994)Science 264：101-104に開示され、そしてこれはまたALK-1、ALK-2、ALK-3およびALK-6の単離プロトコルを記載する。 7.1 モルフォゲンレセプターの組織分布 OP-1特異的レセプターの組織分布の測定することによって、これらのレセプターを発現する組織および細胞源を同定し、新しい関連OP-1特異的レセプター分子を同定し、ならびに自然に起こる条件下でOP-1-レセプター相互作用について標的組織を同定し得る。OP-1特異的レセプター分子(またはそれらのmRNA転写物)は、異なる組織中で標準的方法を用いて、そして発現が低くあり得る組織中ではそれらの小さな改変を用いて容易に同定される。例えば、タンパク質分布を、標準的なウェスタンブロット分析または免疫組織学的検出技術、および目的のモルフォゲンレセプター分子に対する特異抗体を用いて測定し得る。同様に、モルフォゲンレセプター転写物の分布が、標準的なノーザンハイブリダイゼーションプロトコルおよび転写物特異プローブを用いて、またはインサイチュハイブリダイゼーションにより測定し得る。転写物に特異的にハイブリダイズし、そして他の関連転写物から目的の転写物を区別し得る任意のプローブを用い得る。本明細書中に記載のモルフォゲンレセプターはその細胞内ドメイン中に高い配列相同性を共有するため、特異モルフォゲンレセプター転写物の組織分布が、分子の細胞外ドメインについて特異プローブを用いて十分に測定し得る。例えば、特に有用なALK-特異プローブ配列は、5' コード配列、膜近接領域に対応する配列、または5'もしくは3'非コード配列の独特の部分由来の配列である。次いで、選択したフラグメントを周知の、ならびに当該分野および本明細書中で記載された標準的な方法を用いて標識する。これらのレセプター特異プローブ(合成的に操作され得るか、またはクローン化配列から得られ得る)を用いて、レセプター転写物が当業者に周知の標準的な方法論を用いて、種々の生物の種々の組織中で同定され、そして局在し得る。適切なハイブリダイゼーションプロトコルの詳細な記載が、Ozkaynakら、(1991)Bi ochem.Biophys.Res.Commn ．179：116-123、およびOzkaynakら、(1992)J.Biol.Ch em. 267：5220-25227に記載されている。簡単に述べると、全RNAを種々の組織( 例えば、マウスの胎児および発達中および成人の肝臓、腎臓、睾丸、心臓、脳、胸腺、胃)から、Chomczynskiら((1987)Anal.Biochem. 162：156-159)および下記の方法によるような標準的な方法論により調製する。ポリ(A)+ RNAを、オリゴ(d T)-セルロースクロマトグラフィ(例えば、Type 7、Pharmacia LKB Biotechnolog y，Inc.由来)を用いて調製する。各組織由来のポリ(A)+ RNA(一般的には15mg)を１％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで分画し、Nytran膜(Schleicher & Schu ell)上にトランスファーする。トランスファー後、膜を80℃でベークし、そして RNAをUV光(一般的には、１mW/cm²で30秒)下で架橋させる。ハイブリダイゼーション前に、適切なプローブを加熱して変性させる。ハイブリダイゼーションを40 ％ホルムアミド、５×デンハルト、５×SSPE、および0.1％SDSのハイブリダイゼーション混合液を用いて37℃でおよそ15時間、およそ1rev/minでローラー瓶装置中で回転させるルーサイト(lucite)のシリンダー中で行う。ハイブリダイゼーションに続いて、非特異的カウントを0.1×SSPE、0.1％SDS中、50℃でフィルターから洗い流す。実施例８． ALK-2 、ALK-3、およびALK-6がOP-1結合レセプターであることの証明組織モルフォゲンタンパク質OP-1およびBMP4を、レセプタートランスフェクト細胞(レセプターが過剰に発現される)および非トランスフェクト細胞においてAL Kレセプターとの特異結合相互作用について試験した。ALK-5がTGFβ1と特異的に相互作用すること、そしてALK-2およびALK-4がアクチビンと特異的に相互作用することがすでに知られていた。実験で、複合体を架橋し、下記のようにALK-特異抗体と免疫沈降した。現在まで、このプロトコルの条件下でのALK-1との結合は検出されていない。スベリン酸ジスクシンイミジル(Pierce Chemical Co.)を用いる結合および親和性架橋を標準的な方法(例えば、Franzenら、(1993)Cell 75：681-692およびIc hijoら、(1990)Exp.Cell.Res. 187：10995-11000)を用いて行った。代表的なプロトコルを下記に示す。個々の実験についてのこのプロトコルからの改変は、引用された手順と同じ結果が生じると予想される標準的な変更であった。簡単に述べると、マルチウェルプレート中の細胞を、結合緩衝液(例えば、0.9mM CaCl₂、 0.49mM MgCl₂および１mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)を含むリン酸緩衝化生理食塩水)で洗浄し、氷上で標識リガンドを含む同緩衝液中、過剰の非標識リガンドの存在下および非存在下で反応が平衡するに十分な時間(例えば、３時間)インキュベートした。細胞を洗浄し、架橋を、BSAを含まず、0.28mMスベリン酸ジスクシンイミジルをともなう結合緩衝液中、氷上で15分間行った。細胞を１mlの剥離緩衝液(10mM Tris-HCl、pH7.4、１mM EDTA、10%グリセロール、0.3mM PMSF)を加えて集めた。次いで、細胞を遠心分離でペレット化し、次いで50mlの可溶化緩衝液(125mM NaCl、10mM Tris-HCl、pH7.4、1mM EDTA、１％Triton X-100、0.3mM P MSF、１％Trasylol)中に懸濁し、そして40分間氷上でインキュベートした。細胞を再び遠心分離し、上清を４％-15％ポリアクリルアミドゲルを用いる標準的SDS -ゲル電気泳動による分析に供し、次いでオートラジオグラフィを行った。上記の一般的プロトコルを介するアフィニティ架橋の後に得られた細胞溶解物を、ALKに対する抗血清(例えば、ALK膜近接領域に対して惹起された)を用いて免疫沈降した、または5-12％または5-10％のポリアクリルアミドからなる勾配ゲルを用いてSDS-ゲル電気泳動により直接分析した。ゲルを固定化し、そして乾燥し、次いでオートラジオグラフィまたはPhosphorImager(Molecular Dynamics)を用いる分析に供した。 8.1 トランスフェクト細胞中のOP-1および／またはBMP-4のALKへの結合 ALK cDNAでトランスフェクトされたCOS-1細胞を、¹²⁵I-OP-1および¹²⁵I-BMP-4 の結合について、共トランスフェクトしたII型レセプターDNAの存在下または非存在下で試験した：daf-4 cDNAまたはActRII(Estevezら(1993)Nature 365:644-6 49およびAttisanoら、(1992)Cell 68：97-108、これらのII型レセプターのDNA配列を開示しており、本明細書中に参考として援用されている開示である)。架橋した複合体は高バックグラウンドのために可視化がときどき困難であったため、サンプルを各ALKに対する抗血清により免疫沈降した。結果を下記の表１に示す。表において、「N/T」は「試験せず」を意味する。結合は、標準的な競合アッセイにより測定したように特異的であった。「+/-」、「+」、「++」、「+++」、および「-」により示された値は、架橋した分子をゲル電気泳動し、そしてオートラジオグラフィに供した場合に、測定した放射能の相対量の全定性的記載である。測定した放射能が多いほど、検出された結合相互作用が強いことを示す。表では、結合相互作用の強度は、次の通りである：+++〉++〉+＞+/-＞-。 daf-4の非存在下で、OP-1はALK-6に結合したが、BMP-4はALK-3およびALK-6に結合した。OP-1のALK-2へのより弱い結合も観察された。他のALKは、daf-4の非存在下でOP-1またはBMP-4と結合しなかった。ALK cDNAをdaf-4 cDNAと共トランスフェクトした場合、OP-1のALK-2およびALK-6への結合の増加が見られた。さらに、ALK-3もまた、共トランスフェクトされた細胞中でOP-1に結合することが見出された。同様に、BMP-4のALK-3およびALK-6への結合の増加が観察され得た。２つの異なるタイプのALKの共トランスフェクションは、OP-1またはBMP-4の結合をさらに増加しなかった。ActRIIおよびALK-2、ALK-3、またはALK-6についてDNA で共トランスフェクトされた細胞において、OP-1レセプター結合が増強された。架橋複合体のサイズは、ALK-2およびALK-6よりもALK-3の方が少し高く、その少し大きいサイズと一致した。約95kDaの複合体ならびに140〜250kDaの複数の成分も特定のALKと共免疫沈降した。 II型レセプターの存在下および非存在下、Ｉ型レセプターで行った標準的競合アッセイにおいて、OP-1およびBMP-4の結合は、過剰量の非標識OP-1で競合し得、生じる場合には、これらの相互作用の結合特異性を確認する。これらの結果は、ALK-2、ALK-3およびALK-6がOP-1に対するＩ型レセプターとして作用し得ることを示す。特に、リガンド結合は、明らかにII型レセプターの存在下で増強され得る。さらに、OP-1は、「骨モルフォゲン」II型レセプター(d af 4)および「アクチビン」II型レセプター(ActRII)の両方と相互作用し得る。しかし、例えば、アクチビンはActRII II型レセプターとのみ相互作用する。データは、OP-1が、他の組織形成タンパク質、またはTGF-βファミリーの他のメンバーよりも広いレセプター(Ｉ型およびII型)結合親和性スペクトルを持つことを示す。OP-1は、他の「アクチビン結合」または「骨モルフォゲン結合」II型レセプターと特異的結合相互作用を有すると予想される。アクチビンまたはBMP4に結合特異性を有するが、TGF-βには結合特異性を有さないＩ型、II型レセプターに結合するOP-1の能力は、OP-1およびOP-1アナログは、細胞表面レセプターに対するアクチビンまたはBMP4結合の競合物として有用であることを示す。特に、OP-1およびOP-1アナログは、アクチビン-ALK-2結合および／またはアクチビン-ALK-2/ActRII(または他のII型)レセプター結合と競合するために有用てある；そしてBMP4(またはBMP2)-ALK-6結合、および／またはBMP2 /4-ALK-6/daf 4(または他のII型)結合と競合するために有用である。OP-1競合物は、アンタゴニスト(例えば、結合におけるシグナル伝達カスケードを誘導し得ない結合競合物)またはアゴニスト(例えば、シグナル伝達カスケードの結合および誘導の両方をなし得る)として作用し得る。 8.2 非トランスフェクト細胞中のOP-1特異的レセプターの同定 ALK-5はTGF-β1に結合することが示され、そしてALK2、4はアクチビンAと非トランスフェクト細胞中で高親和性で結合する(ten Dijke、Oncogene、(1993)；Sc ience 、(1994)上記本明細書中に参照される)。本実験において、OP-1および／またはBMP4の非トランスフェクト細胞中のレセプターへの結合親和性を次に示す。結果はトランスフェクト細胞のデータを確証し、OP-1は、ALK-2、ALK-3およびAL K-6と特異的に相互作用するが、ALK-4またはALK-5とは特異的に相互作用しないことを確認する。 MC3T3-E1造骨細胞は、アルカリホスファターゼ活性の誘導において、OP-1およびBMP-4に応答すると知られた十分に特徴付けられた細胞である(Paralkar（1991 ）PNAS 8：3397-3401)。これらの細胞は、¹²⁵I-OP-1を用いて上記本明細書中に記載されたようにアフィニティ標識され、そして約75kDaの架橋複合体が見られ、これはALK-2抗血清でのみ免疫沈降した。Tera-2奇形ガン細胞およびMvlLu細胞は、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-1(PAI-1)の産生により測定されるようにOP-1に応答した。MC3T3-E1細胞と同様に、Tera-2奇形ガン中において¹²⁵I-OP-1を用いて架橋複合体がALK-2抗血清によってのみ免疫沈降された。他方、¹²⁵I-OP-1を用いてMvlLu細胞に架橋した複合体を、ALK-2ならびにALK-3 およびALK-6抗血清により免疫沈降した。MvlLu細胞は、ALK-4およびALK-5を発現すると知られている(Ebner(1993)Science 260：1344-1348)が、¹²⁵I-OP-1と架橋した複合体は、これらのレセプターに対する抗血清により沈殿しなかった。同様に、U-1240MG神経膠芽腫中の架橋複合体が、ALK-2およびALK-6抗血清により免疫沈降し、そしてALK-3抗血清により弱く免疫沈降した。それに比較して、¹²⁵I-OP -1のAG1518ヒト包皮線維腫への架橋は、ALK-3抗血清によってのみ弱い免疫沈降成分を生じた。約95kDaならびに140〜250kDaの高分子量複合体のII型レセプター様成分が、Tera-2細胞、MvlLu細胞およびU-1240MG細胞における特定のALKと共免疫沈降した。 BMP-4に対するレセプターもまた、非トランスフェクト細胞を用いて研究した。¹²⁵I-BMP-4を用いてMC3T3-E1細胞およびAG1518ヒト包皮繊維腫に架橋した複合体は、ALK-3によってのみ免疫沈降した。他方、¹²⁵I-BMP-4のTera-2細胞への架橋は、ALKに対する抗血清によっていかなる免疫沈降成分も生じなかった。 ¹²⁵I-OP-1および／または¹²⁵I-BMP-4もまた、他のBMP応答性細胞(例えば、MG- 63 骨肉腫細胞およびPC12クロム親和性細胞腫細胞)中のレセプターに特異的に相互作用することが親和性架橋により証明された。異なる細胞タイプにおけるALKのO P-1またはBMP-4への結合のまとめを、下記の表IIに示す。表では、「N/T」は試験せずを意味し、そして括弧内に示したレセプターは、検出された放射能複合体の比較的低量を示す。実施例９． jOP-1、OP-1特異的レセプターアナログのスクリーニングアッセイ本発明はリガンド（例えば、既知のまたは推定の薬剤）が、本明細書中に記載のようにOP-1-特異的細胞表面レセプターに結合し得る、および／または活性化し得るかどうかを測定するに有用である。得られたOP-1-特異的レセプター(例えば、ALK-2、ALK-3、ALK-6)との特異的結合相互作用を可能にするリガンドは、OP -1アナログとして本明細書に示され、そして治療適用および診断適用に用いられ得る。いくつかのアナログは、細胞中の形態形成活性を刺激する能力を有し、OP -1のレセプター結合活性およびシグナル伝達活性の両方を模倣する。これらは、 OP-1アゴニストまたは模倣体(mimetics)と言われる。他は、強い結合親和性を有するが、形態形成を刺激せず、これらはOP-1アンタゴニストである。このアナログはアミノ酸ベースであり得る、または非タンパク質性の化学構造から構成され得る。下記に示す方法およびキットは、同様にOP-1についてALK-2、ALK-3またはALK- 6の結合親和性を模倣し得るOP-1特異的レセプターアナログを同定するために用いられ得る。このアナログを、哺乳動物に投与して、血清溶解性OP-1と相互作用し得る。そしてタンパク質を有効に分離し、細胞表面相互作用についてのその有用性を調節する。上記のモルフォゲンレセプターをコードする単離クローンの細胞系へのトランスフェクションは、単離DNA分子によりコードされたレセプターに結合する、および／または活性化するリガンドの能力についてのアッセイ系を提供する。上記の様なトランスフェクション系は、レセプターに結合し、既知のモルフォゲン( これは放射能薬剤、酵素薬剤、分光性薬剤、または他の薬剤により標識される) の結合と競合する、既知のまたは候補の薬剤とリガンドとの間の競合結合アッセイのための生細胞培養として有用である。レセプターを含み、トランスフェクトされた細胞から単離された膜調製物もまた、これらの競合結合アッセイにおいて有用である。あるいは、そして現在好ましいのは、精製レセプター分子またはそのリガンド結合細胞外ドメインは、上記のサンドイッチアッセイ(例えば、RIAのような競合アッセイ)の改変において、マイクロタイターウェル表面上に置かれ得る。最後に、上記のように、溶液アッセイ、そしてレセプター細胞外ドメインのみを用いるアッセイもまた、これらのアッセイにおいて有利に用いられ得る。セカンドメッセンジャー系の機能性アッセイ、またはそれらのトランスフェクション系における結果は、結合親和性およびレセプター機能の活性化における効果またはレセプター機能の拮抗作用における効果についてのアッセイとして作用する。このようなトランスフェクション系は「薬剤発見系(drug discovery system )」を構成し、これは単離されたDNA分子によりコードされたレセプター本来の機能を活性化または阻害する治療化合物として、さらに改良され得るか、または直接用いられ得る、薬剤開発の可能性のある天然のまたは合成の化合物の同定に有用である。一度このような候補の薬剤(例えば、OP-1またはそのレセプター結合アナログ) が同定されると、これらは当該分野で公知の標準的方法を用いて合理的に有用な量で生産され得る。アミノ酸ベースの分子は、合成核酸分子によりコードされ得、そして上記の本明細書中にまたは当該分野で記載されたような組換え発現系において発現され得る。あるいは、このような分子は、例えば、自動化ペプチド合成機のような手段により化学的に合成され得る。非アミノ酸ベースの分子は、標準的な有機化学合成手順により生産され得る。候補の分子の構造または組成が未確定である場合、その組成は、例えば質量分析法により容易に測定され得る。アナログを同定するための２つのアプローチが、代表的に当該分野において実践される：リガンド模倣体の高フラックススクリーニングおよび合理的な設計。高フラックススクリーニングは、代表的に、目的のタンパク質（ここでは、例えばレセプター)を結合する能力について、自然界に起源の材料または化学バンクをスクリーニングする。代表的には、化合物は、例えば化学バンク、微生物培養液、植物および動物の抽出物などを起源とする範囲から得られる。高フラックススクリーニングにおいて、代表的には、精製レセプター、好ましくは可溶性のリガンド結合細胞外ドメインを、マイクロタイターウェル表面上に置き、次いで標準的容量の試験すべきサンプル溶液を加える。また特異的にレセプターを結合すると知られている既知量の精製リガンドを含む標準的容量を加える。好ましくは、リガンドを、自動化方法により容易に検出可能である基質で標識する(例えば、放射標識、発色団標識、蛍光標識、酵素標識、または比色標識)。次いでウェルを洗浄し、次いで洗浄後に残っている標識量またはレセプターと会合して残っている標識量を検出する。陽性スコアを、レセプターと標識リガンドとの相互作用を阻害する試験基質の能力により同定する。スクリーニングアッセイは、過度の実験なしに、当該分野で通常用いられる標準的な分子生物学または細胞生物学道具(t ool)を用いて実施し得る。例えば、スクリーニングアッセイは、標準的96ウェルプレート中で実施し得る。15個のこのようなプレートが、並行して複数のスクリーニングアッセイを実施するために同時に合理的にセットし得る。従って、スクリーニングアッセイのたった10-11の繰り返しで、15,625(5⁶)個の化合物を、それらの結合親和性についてスクリーニングし得る。２時間の最大インキュベーション時間を考慮しても、15,625個の化合物がおよそ一日で合理的にアッセイされ得る。高フラックススクリーニングは、そのレセプターに対する標識リガンドの高度な特異性、ならびにコンピュータ操作されたロボットおよびデータのコンピュータ処理の高い処理能力の両方を活用する。次いで、このように同定された候補のアナログを、構造的に分析し得、そしてこの情報を用いて、強化された能力を強化し、作用の持続期間を増加させ、選択性を増加させ、そして副作用を減少させたアナログを設計し、そして合成する。候補物はまた、下記のように合理的に設計されたプログラムで用いられ得る。最後に、候補のアナログもまた、下記のように形態形成効果を(もしあれば)測定するために試験され得る。アナログの同定への第二のアプローチにより、合理的な設計アプローチを用いてOP-1-特異的レセプターとのOP-1の結合効果を模倣し得る分子を作出する。本明細書中で、レセプター結合に関連する構造を分析して、結合活性に必要な決定的な配列および構造を同定し、そしてこの情報を用いて、最小サイズのモルフォゲンアナログが設計され、そして合成され得る。高フラックスアッセイにおける候補の化合物と同様に、設計された候補物は、上記のようにレセプター結合活性について試験され得る。上記のように、候補物の配列は、例えば標準的な生物学的変異技術または化学的変異技術によってさらに改変されて、例えば増強された結合活性または他の好ましい性質を有する候補の誘導体を創造し得る。レセプターと特異的に相互作用し、そしてOP-1結合と競合し得る抗体もまた、アナログとして用いられ得る。抗体は、上記のように作製され得る。 OP-1アナログを、OP-1を模倣するかまたはOP-1結合を阻害する能力(例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト)について、OP-1特異的レセプター(例えば、AL K-2、ALK-3またはALK-6)を生じる細胞におけるアナログの効果をモニターすることにより評価し得る。OP-1アゴニストは、例えば、機械的損傷または化学的損傷、変性疾患、慢性炎症・硬変症・炎症性疾患・ガンなどに帰因する組織破壊により損傷した組織の再生ならびに組織、臓器および肢の再生において、組織形態形成が所望される場合、任意の適用において有用性を有することが予想される。OP -1アンタゴニストは、組織形態形成が、例えば骨肉腫およびページェット病を含むが、これらに限定されない悪性腫瘍の処置に限定され得る適用において有用性を有すると予見される。候補のアナログの、細胞膜横断のOP-1特異的シグナルを変換する能力をアッセイするためのいくつかの例示的な系を、以下に記載する。 9.1 造骨細胞分化マーカーの誘導例えば、OP-1は、胚の間葉細胞および初期の造骨細胞を含む始原細胞(progeni tor)の分化を優先的に誘導することが知られている(例えば、PCT出願第US92/074 32号を参照のこと)。１例として、OP-1アナログを、アルカリホスファターゼ、P TH-仲介cAMPおよびオステオカルシン(その全ては、初期の造骨細胞をOP-1、60A、またはDPPに曝した場合に誘導される)の産生を誘導するこれらのアナログの能力を測定することにより、初期の造骨細胞の分化を誘導する能力について試験し得る。簡単に述べると、アッセイを次のように行い得る。造骨細胞培養を包含するこの実施例および全ての実施例において、ラット造骨細胞を富化した初代培養の使用が好ましい。これらの培養は、個々の細胞が分化の異なる段階にあることにおいて異質であるが、これらの培養は、樹立した細胞株から得られた造骨細胞培養より、インビボでの造骨細胞の代謝および機能をより正確に反映していると考えられる。別に示されない限り、言及した全ての化学薬品は、標準的な市販の試薬であり、Sigma Chemical，Co.、St. Louis；Calbiochem, Corp.、San DiegoおよびAldrich Chemical Co.、Milwaukeeを含む多くの供給源から容易に入手可能である。ラット造骨細胞-富化初代培養物を、例えばWongら、(1975)PNAS 72:3167-3171 に記載されたような標準的な手順に従って、新生ラットの縫合のない頭蓋冠(例えば、1-2日齢動物、Long-Evans株、Charles River Laboratories、Wilmington、 MA)の一連のコラゲナーゼ消化により、調製する。次いで、ラット造骨細胞の単一細胞懸濁物を、マルチウェルプレート(例えば、24ウェルプレート)上に10% FB S(ウシ胎児血清)、L-グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含む αMEM(改変イーグル培地、Gibco，Inc.、Long Island)中、１ウェルあたり50,00 0個の造骨細胞の濃度で播種する。細胞を24時間37℃でインキュベートし、そのときに増殖培地を、１% FBSを含むαMEMに置き換え、そして細胞が実験時に血清由来の増殖培地中にあるように、細胞をさらに24時間インキュベートする。造骨細胞のアルカリホスファターゼ誘導血清を含まない培地中で培養された細胞を、OP-1、OP-1アナログまたはネガティブコントロールと一緒にある濃度範囲を用いてインキュベートする。例えば、代表的には、0.1、1.0、10.0、40.0、または80.0ng OP-1/mlの培地を用いる。インキュベーション期間の72時間後、細胞層を0.5mlの１％Triton X-100で抽出する。次いで、得られた細胞抽出物を遠心分離し、そして100mlの抽出物を90mlのパラニトロソフェニルホスフェート(PNPP)/グリセリン混合物に加え、30分間37 ℃の水浴でインキュベートして、反応を100mlのNaOHで停止する。次いで、サンプルをプレートリーダー(例えば、Dynatech MR700プレートリーダー、および標準としてp-ニトロフェノールを用いる400nmで測定する吸光度)に通して、アルカリホスフェート活性の存在および量を測定する。タンパク質濃度を、Biorad法により測定する。アルカリホスファターゼ活性を、unit/mgタンパク質で計算する。ここで、１unit＝１nmolの遊離p-ニトロフェノール/30分（37℃にて）である。OP-1は、この方法によりアルカリホスフェートの特異的活性において５倍増を誘導する。アゴニストは、同様の誘導効果を有すると予想される。アンタゴニストは、OP-1結合で阻害されるか、またはそうでなければ妨害されるはずであり、そしてアッセイが限定された量のOP-1の存在下アンタゴニストを用いて行われる場合、減少したアルカリホスファターゼ誘導の結果が得られるはずである。 PTH 仲介cAMPの誘導ラット造骨細胞におけるインビトロでの甲状腺ホルモン仲介cAMP産生におけるモルフォゲンアナログの効果を、次に示す。ラット造骨細胞を調製し、そして上記のようにマルチウェルプレート中で培養する。次いで、培養細胞を３つの群に分割する：(1)例えば、1.0、10.0、および 40.0ng OP-1/ml培地を入れたウェル；(2)種々の濃度範囲で候補のアナログを入れたウェル；および(3)追加の因子を含まないコントロール群。次いで、プレートをさらに72時間インキュベートする。72時間の終わりに、細胞を、0.5％ウシ血清アルブミン(BSA)および１mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチンを含む培地で20分間処理し、次いでウェル半分にヒト組換え甲状腺ホルモン(hPTH、Sigma、 St．Louis)を200ng/mlの濃度で加えて10分間処理した。次いで、細胞層を、各ウェルから0.5mlの１% Triton X-100で抽出する。次いで、cAMPレベルをラジオイムノアッセイキット(例えば、Amersham、Arlington Heights、Illinois)を用いて測定する。OP-1は、cAMP産生をPTHの存在下で倍増する。アゴニストは、同様の誘導効果を有すると予測される。アンタゴニストは、OP1結合で阻害するかまたはそうでなければ妨害すると予測され、アッセイが限定された量のOP1の存在下でアンタゴニストを用いて行われる場合、減少したcAMP産生の結果が得られる。オステオカルシン産生の誘導オステオカルシンは、造骨細胞により合成される骨特異的タンパク質であり、インビボで骨の無機質化(mineralization)の速度に必須の役割を演じる。血清中のオステオカルシンの循環レベルは、造骨細胞活性およびインビボでの骨形成のマーカーとして用いられる。造骨細胞富化培養におけるオステオカルシン合成の誘導を、インビトロでの形態形成効力を示すために用い得る。ラット造骨細胞を調製し、そして上記のようにマルチウェルプレート中で培養する。本実験において、培地に10％FBSを補充し、そして２日目に細胞を、新たに調製した10mM b-グリセロホスフェート(Sigma，Inc.)を補充した新たに調製した培地を加えた。５日目をはじめに、そしてその後１週間に２回、細胞を、新たに調製したL(+)-アスコルビン酸塩を50mg/ml培地の最終濃度で足した全ての上記の成分を含む完全無機質化培地を与えた。次いで、OP1またはOP1アナログを、例えば、0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)を含む50％アセトニトリル(または50％エタノール)中で、ウェルに直接、わずか５ml OP1/ml培地で加えた。コントロールウェルは溶媒媒体のみを入れる。次いで細胞を再培養し、そしてした馴化した培地サンプルを、標準的プロテアーゼインヒビターを含む標準的ラジオイムノアッセイ緩衝液で１：１に希釈し、そしてオステオカルシンについてアッセイするまで -20℃で保存する。オステオカルシン合成を、市販のオステオカルシン特異抗体を用いる標準的ラジオイムノアッセイにより測定し、そしてノーザンブロッティング分析により確認して、OP-1またはOP1アナログの存在下または非存在下で産生されたオステオカルシンmRNA量を計算し得る。OP-1は、オステオカルシン産生において用量依存的増加を誘導し(25ngのOP-1タンパク質/mlを用いて５倍増)、そしてオステオカルシンmRNAで20倍増加を誘導する。アゴニストは同様の誘導効果を有すると予想される；アンタゴニストはOP1結合を阻害するかまたはそうでなければ妨害すると予測され、それにより、限定される量のOP1の存在下でオステオカルシン誘導を実質的に妨害する。無機質化を長期間の培養(13日)で、固定化した細胞層について改変von Kossa 染色技術を用いて測定する：細胞を新たに調製した4% パラホルムアルデヒド中で23℃10分間固定化し、次いで冷0.9％Naclですすぐ。次いで、固定化した細胞を、市販のキット(Sigma，Inc.)を用いて、内在性のアルカリホスファターゼについてpH9.5で10分間染色する。次いで、紫色に染色した細胞をメタノールで脱水して、風乾する。暗所で３％AgNO₃中30分インキュベートした後、H₂Oですすぎをしたサンプルを30秒間254nmのUV光に曝して、黒銀染色したホスフェート結節を呈色させる。個々の無機質化した部分(foci)(少なくとも20mmの大きさ)を解剖顕微鏡下でカウントし、結節／培養として表す。OP-1は、初期の無機質化速度において20倍の増加を誘導する。アゴニストは同様の誘導効果を有すると予想される；アンタゴニストはOP1結合を阻害するかまたはそうでなければ妨害すると予測され、それにより、限定された量のOP1の存在下で無機質化誘導を阻害する。 9.2 構築したレポーター遺伝子の誘導あるいは、レポーター遺伝子構築物を用いて、レセプター結合に続く、膜横断シグナル伝達を誘導する候補の分子の能力を測定し得る。例えば、PAI-1タンパク質(プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-1)発現が、MvlLu細胞中のO P-1により誘導され得る(上記参照)。また、上記のように、これらの細胞は、ALK -2、-3および-6の表面レセプターを発現する。さらに、予備研究は、これらの細胞の化学的に変異させた誘導体中に過剰発現された場合、ALK-1もまた、OP1の存在下でPAI-1誘導を明らかに仲介することを示す。従って、PAI-1プロモーター因子を、レポーター遺伝子に融合し得、そしてレポーター遺伝子の誘導は、候補のアナログとのトランスフェクト細胞のインキュベーションに続いてモニターされ得る。１例では、ルシフェラーゼレポーター遺伝子が、例えばWranaら(1992)Cell 71：1003-1014およびAttisanoら(1993)Cel l 74：671-680により記載された構築物p3TP-Lux中で用いられ得る。このレポーター遺伝子構築物は、ヒトPAI-1遺伝子プロモーター領域を、ルシフェラーゼのオープンリーディングフレームの上流の３組のテトラデカノイルホルボールアセテート応答性因子と組み合わせて含む。代表的なアッセイでは、トランスフェクトされた細胞を、0.1％ウシ胎児血清および抗生物質(例えば、100unit/mlペニシリンおよび50μg/mlストレプトマイシン)を含むDMEM中で６時間飢餓状態にし、次いで24時間リガンドに曝した。次いで、細胞溶解液中のルシフェラーゼ活性を、製造者のプロトコル(Promega)に従って、ルシフェラーゼアッセイ系でルミノメーターを用いて測定する。MvlLu 変異細胞(ALK-2およびAct RIIと共トランスフェクトした「R変異」細胞)において、OP1は、ルシフェラーゼ活性の誘導を仲介した。 9.3 上皮細胞増殖の阻害 OP1は上皮細胞を阻害することが知られている。従って、候補のアナログの細胞増殖を阻害する能力は、上皮細胞による³H-チミジン取り込みにより測定されるように、候補物のシグナル伝達活性を評価するためのアッセイにおいて用いられ得る。上皮細胞増殖を阻害するためのアナログ成分は、増殖する細胞群の限定が所望される治療適用において特別な有用性を有すると考えられる。このような適用は、化学療法および放射線療法を含み、ここで正常に増殖する細胞群の増殖を制限することが、これらのガン治療の細胞毒性効果からこれらの細胞を保護し得る。(例えば、WO94/06420を参照のこと)。さらに、良性のおよび悪性の新生物を含む制御されない細胞増殖の結果生じる乾癬および他の組織異常は、OP1アナログの使用により調節され得る。例えば、ミンクの肺上皮細胞増殖はOP-1により阻害される。(PCT US93/08885 ；WO94/06420を参照のこと)。上記のように、これらの細胞の誘導体(例えば、「 R-4変異体」、クローン4-2、Laihoら、(1990)J.Biol.Chem. 265：18518-18524) を、OP1-特異的レセプターをコードするDNAでトランスフェクトし得、そしてこれらのレセプターの発現を誘導し得る。次いで、トランスフェクトされた細胞を、候補のアナログの細胞増殖を阻止する能力についてアッセイし得る。１例では、R-4細胞が、Zn²⁺-誘導性プロモーター下のALK-3でトランスフェクトされ、そしてZnCl₂での誘導後のレセプター発現を誘導させられた場合、細胞増殖はOP- 1の存在下、容量依存的に阻害され得る。ALK-1での予備実験は、このレセプターもまた、このOP-1特異効果を仲介し得ることを示す。代表的なアッセイでは、細胞を24ウェル細胞培養プレート中に10％FBSを含むD MEM中１ウェルあたり10⁴細胞の密度で播き、そして一晩インキュベートする。培地を0.2% FBSおよび100uM ZnCl₂を含むDMEMで置き換え、そして細胞を５時間インキュベートし、その後、培地を0.2％FBS、100uM ZnCl₂、および種々の濃度のO P1または候補のアナログを含む新たに調製したDMEMで置き換える。16時間のインキュベーション後、0.25ciの[³H]チミジン(Amersham)を加え、そして細胞をさらに２時間インキュベートする。その後、細胞を10％トリクロロ酢酸中氷上で15分以上固定し、そして1M NaOHで可溶化する。細胞抽出物を1M HClで中和し、そして³H 放射能を液体シンチレーションカウンターで測定する。実施例10．内在性OP-1レセプター発現レベルを変える化合物のスクリーニングアッセイ所定の内在性OP-1レセプターのレベルに影響するように投与され得る１つまたは複数の候補の化合物は、次のスクリーニングアッセイを用いて見出し得る。ここで、細胞における化合物の効果を評価するために、測定可能レベルのレセプターを生じる細胞タイプによるOP-1レセプター産生レベルを、候補化合物のあるかまたはない培養物中で細胞をインキュベートすることにより測定する。これも、ウエスタンブロットまたは免疫局在(immunolocalization)によるタンパク質レベルあるいはノーザンブロッティングまたはインサイチュハイブリダイゼーションによるRNAレベルのいずれかでのOP-1レセプターの検出により達成され得る。このプロトコルは、OP-1発現の内在性レベルを変える化合物を同定するための手順に基づき、詳細な記載はまたPCT US92/07359に見られ得、本明細書中に参考として援用されている。例えば骨、脳、腸、肺、心臓、眼、乳房、性腺、腎臓、副腎、膀胱、脳、または他の器官の細胞培養物は、文献に広く記載されているように調製され得る。例えば、腎臓は、分娩後28日までの新生児(neonatal)のまたは新生児(new born)のまたは幼若のまたは成熟の齧歯類(マウスまたはラット)から移植され得、全体的なまたはスライスした(1〜4mm)組織として器官培養に用いられ得る。腎臓、副腎、膀胱、脳、乳房または他の組織由来の初期組織培養物および樹立した細胞株も、マルチウェルプレート(6ウェルまたは24ウェル)中で従来の細胞培養技術に従って樹立され得、一定期間の間(1〜7日)血清の存在下または非存在下で培養される。細胞は、例えば、血清(例えば、ウシ胎児血清を1％〜10％で、Gibco)を含むダルベッコの改変イーグル培地(Gibco、Long Island、NY)中または血清由来培地中で、あるいは所望に応じて所定の培地(例えば、インスリン、トランスフェリン、グルコース、アルブミン、または他の増殖因子を含む)中で培養され得る。 OP-1レセプター産生のレベルを試験するための細胞サンプルを定期的に集め、レセプター産生についてイムノブロット分析(Sambrookら編、1989、Molecular C loning、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NY)により評価し、あるいは一部の細胞培養物自身を定期的に集め得、ノーザンブロット分析による mRNA分析用のpolyA+ RNAを調製するために用い得る。新規のレセプター合成をモニターするために、いくつかの培養物を従来の手順に従って³⁵S-メチオニン／³⁵ S-システイン混合物で6〜24時間標識し、次いで従来のイムノアッセイ法によりレセプター合成を定量するために評価する。あるいは、抗レセプター抗体を標識し得、細胞または細胞溶解物とインキュベートし得、そして結合した複合体を検出し得、これまでに記載されたような従来の方法により定量し得る。ノーザンブロットを、ハイブリダイゼーションプローブを生成するOP-1レセプターコード配列の一部を用いて行い得、本明細書中に記載されたRNAハイブリダイゼーションプロトコルに続く。実施例11．一般の処方／投与の考察本明細書中に記載したアナログおよび構築物は、治療の一部として個体に与えられて、OP-1と１つまたはそれ以上のOP-1特異細胞表面レセプターとの間のインビボでの結合相互作用を強化、阻害、またはそうでなければ調節し得る。次いで、この分子は本明細書の以下に記載のような薬学的組成物の一部を含有し、あらゆる適切な手段により、好ましくは直接または全身的(例えば、非経口的または経口的)に投与され得る。治療分子が直接(例えば、所望の組織部位への注入によるような局所的に)、あるいは、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、眼窩内投与、眼内投与、心室内投与、頭蓋内投与、襄内投与、脊髄内投与、クモ膜下槽内投与、腹腔内投与、頬(buccal)投与、直腸投与、膣投与、鼻腔内投与によるまたはエアロゾル投与によるような非経口的に与えられる場合、治療物は好ましくは水性溶液の部分を含有する。この溶液は、好ましくは、生理学的に受容可能であり、そのため患者への所望のモルフォゲンの送達に加えて、溶液がその他の点で患者の電解質および容量バランスに不利に影響しない。従って、治療分子用の水性培地は、通常の生理食塩水(0.9％Nacl、0.15M)、pH7〜7.4または他の薬学的に受容可能なその塩を含有し得る。経口投与または非経口投与のために有用な溶液を、薬学分野において周知の任意の方法(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences 、(Gennaro,A.編)、Ma ck Pub.、1990に記載された)により調製し得る。処方物は、例えば、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、植物由来の油、水素化ナフタレンなどを含有し得る。直接投与用の処方物は、特に、グリセロールおよび高粘度の他の組成物を含み得る。生体適合性、好ましくは生体再吸収性ポリマーは、例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、トリカルシウムホスフェート、ポリブチレート、ポリラクチド、ポリグリコリド、およびラクチド／グリコリドコポリマーを含み、インビボでのモルフォゲンの遊離を制御するための有用な賦形剤であり得る。これらの治療分子のための他の可能性のある有用な非経口送達系は、エチレン -ビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システム、およびリポソームを含む。吸入投与用の処方物は、賦形剤として、例えばラクトースを含み得、あるいは、例えば、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、グリココール酸およびデオキシコール酸を含む水性溶液、あるいは点鼻薬の形態でまたは鼻腔内に適用するためのゲルとして投与するための油性溶液であり得る。あるいは、本明細書中に記載のモルフォゲンを経口で投与し得る。治療分子はまた、所望の組織へ治療物を標的化する手段と組み合せ得る。例えば、テトラサイクリンおよびジホスホネート(ビスホスホネート)は、哺乳類において全身的に与えられる場合、骨無機質に、特に骨再造形帯で結合することが知られている。従って、これらの分子は骨組織への治療物の標的化のための有用な薬剤として含まれ得る。あるいは、所望の標的組織細胞上の表面分子と特異的に相互作用する抗体または他の結合タンパク質もまた用いられ得る。このような標的分子はさらに、例えば、化学架橋により、または標準的遺伝子工学の手段を用いることにより治療分子に共有結合され得、例えば、Asp-Pro架橋のような酸不安定性結合を生成する。有用な標的分子は、例えば米国特許第5,091,513号に開示された例えば一本鎖結合部位技術を用いて設計され得る。結局、治療分子は、単独で、あるいは組織修復および再生および／または炎症を阻害し得る分子を含む組織形態形成において有利な効果を有することが知られている他の分子と組み合わせて投与され得る。例えば、骨粗鬆症の個体の骨組織増殖を刺激するための有用なコファクターの例は、ビタミンD₃、カルシトニン、プロスタグランジン、上皮小体甲状腺ホルモン、デキサメタゾン、エストロゲン、およびIGF-IまたはIGF-IIを含むがこれらに限定されない。神経組織の修復および再生に有用なコファクターは神経増殖因子を含み得る。他の有用なコファクターは、防腐剤、抗生物質、抗ウイルス剤および抗菌剤、ならびに鎮痛薬および麻酔薬を含む、症状を緩和するコファクターを含む。治療分子は、さらに、薬学的に受容可能な非毒性の賦形剤とキャリアとの混合により、薬学組成物中に処方され得る。上記のように、このような組成物は、非経口投与用に、特に液体の溶液または懸濁液の形態で；経口投与用に、特に錠剤またはカプセル剤の形態で；あるいは鼻腔内投与用に、特に粉剤、点鼻薬、またはエアロゾルの形態で調製され得る。組織表面への接着が所望である場合、組成物は、例えばPCT US91/09275(その開示は、本明細書中に参考として援用されている)に開示されるようなフィブリノーゲン-トロンビン組成物または他の生体接着物中に分散されたモルフォゲンを含み得る。次いで、組成物を所望の組織表面に塗布、スプレーまたはそうでなければ貼り得る。組成物は、ヒトまたは他の哺乳類に治療に有効な量(例えば、所望の効果を誘導するに十分な時間、標的組織に適切な濃度のアナログを与える量)で非経口投与または経口投与用に処方され得る。アナログが移植手順の一部として用いられるべき場合、ドナーからの組織または臓器の除去の前に移植されるべき生きている組織または臓器に提供され得る。アナログは、アナログを含む処方物の組織への注入によるようにドナー宿主に直接的に、あるいは、例えば、上記の手段のいずれかを用いる経口投与または非経口投与により間接的に提供され得る。あるいはまたはさらに、一度ドナーから移動された場合、臓器または生きている組織は、治療用分子を含む保存溶液中に入れられ得る。さらに、レシピエントも好ましくは移植の直前または同時にアナログを提供される。全ての場合、アナログは、組織への注入によるように直接危険に瀕した組織に投与され得るか、あるいは本明細書中に記載のおよび／または当該技術分野において公知の任意の方法および処方物を用いる経口投与または非経口投与のいずれかにより全身的に提供され得る。治療分子が組織または臓器保存溶液の一部を含む場合、あらゆる市販の保存溶液が有利に用いられ得る。例えば、当該技術分野で公知の有用な溶液は、Collin s溶液、Wisconsin溶液、Belzer溶液、Eurocollins溶液、および乳酸Ringer溶液を含む。一般的に、臓器保存溶液は通常１つまたはそれ以上の次の特質を有する：(a)哺乳類細胞の内部の浸透圧に実質的に等しい浸透圧(溶液は、代表的には、高浸透圧であり、哺乳類細胞の内部より少し高い浸透圧を生じるに十分な量で存在するK+および／またはMg++イオンを有する)；(b)この溶液は、代表的には、細胞中の実質的に正常のATPレベルを維持し得る；および(c)溶液は、通常、細胞中におけるグルコース代謝の至適な維持を可能にする。臓器保存溶液はまた、抗凝固剤、グルコース、フルクトース、および他の糖のようなエネルギーソース、代謝物、重金属キレート剤、グリセロールおよび低温度での生存を増強する他の高粘度の物質、遊離酸素ラジカルの阻害剤および／または補集剤、ならびにpH指示薬を含み得る。保存溶液の詳細な記載および有用な成分は、例えば、米国特許第 5,002,965号（その開示は本明細書中に参考として援用されている）に見られ得る。当業者により認識されているように、治療組成物中のに記載された化合物の濃度は、投与される薬剤の用量、用いられた化合物の化学的特徴(例えば、疎水性) 、および投与経路を含む多くのファクターによって変化する。投与される薬剤の好ましい用量はまた、組織の損失または欠損のタイプと程度、特定の患者の全体的な健康状態、選択した化合物の相対的な生物学的直効性、化合物の処方、処方物中の賦形剤の存在とタイプ、および投与経路のような変化するものによるようである。一般的な期間では、本発明の治療分子は個体に与えられ得る。ここで代表的な用量範囲は１日あたり約10ng/kg体重から約1g/kg体重であり；好ましい用量範囲は約0.1mg/kg体重から100mg/kg体重である。成熟したモルフォゲン(例えば、OP-1、20mg)が正常に成長しているラットに毎日連続21日間投与される場合、明らかなモルフォゲン誘導された病理学的病変は誘導されない。さらに、正常な新生児マウスに10日間毎日注入した10mgのモルフォゲン(例えば、OP-1)の全身注入は、いかなる著しい異常も生じない。他の実施態様本発明は、その主旨または本質的な特徴から逸脱することのない他の特定の形態で実施され得る。従って、本実施態様は全ての点で限定的ではなく例示として考えられ得、本発明の範囲は前述の記載によるよりむしろ添付の請求の範囲により示され、従って請求の範囲の同等性の意味および範囲内にある全ての変更は、その中に包含されることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ミヤザノ，コウヘイスウェーデン国エス−751 23 ウプサラ，フザールガータン３ (72)発明者サンパス，クバーティー. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02053，メッドウェイ，シックススプリングストリート（番地なし) (72)発明者ハールディン，カール−ヘンリックスウェーデン国エス−751 23 ウプサラ，フザールガータン３

Claims

【特許請求の範囲】１．OP-1アナログを同定するための方法であって、該アナログが細胞表面レセプターに対してOP-1と実質的に同様の結合親和性を有することを特徴とし、該方法が以下の工程を包含する、方法：（ａ）以下からなる群より選択されるレセプタータンパク質を含有するサンプルを提供する工程：（ｉ）配列番号３（ALK-2）の残基16〜123によって定義されるアミノ酸配列、またはそのOP-1特異的レセプターアナログを含むポリペプチド鎖；（ii）配列番号５（ALK-3）の残基24〜152によって定義されるアミノ酸配列、またはそのOP-1特異的レセプターアナログを含むポリペプチド鎖；（iii）配列番号７（ALK-6）の残基23〜122によって定義されるアミノ酸配列、またはそのOP-1特異的レセプターアナログを含むポリペプチド鎖；（iv） OP-1に対する結合親和性を有し、そして配列番号７（ALK-6）の残基23〜122と少なくとも40%のアミノ酸同一性を共有するポリペプチド鎖；（ｖ） OP-1に対する結合親和性を有し、そして配列番号12〜15によって定義される１つ以上のプライマー配列での増幅により得られ得る核酸によってコードされるポリペプチド鎖；または（vi） OP-1に対する結合親和性を有し、そして配列番号７（ALK-6）のヌクレオチド256〜552によって定義される配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチド鎖；（ｂ）該工程（ａ）のサンプルと候補OP-1アナログとを接触させる工程；および（ｃ）該候補OP-1アナログと該工程（ａ）のタンパク質との間の特異的結合を検出する工程。２．OP-1アナログを同定するための方法であって、該アナログが細胞表面レセプターに対してOP-1と実質的に同様の結合親和性を有することを特徴とし、該方法が以下の工程を包含する、方法：（ａ）以下からなる群より選択されるOP-1に対する結合特異性を有する表面レセプタータンパク質を発現する細胞を含有するサンプルを提供する工程：（ｉ）配列番号３（ALK-2）の残基16〜123によって定義されるアミノ酸配列、またはそのOP-1特異的レセプターアナログを含むポリペプチド鎖；（ii）配列番号５（ALK-3）の残基24〜152によって定義されるアミノ酸配列、またはそのOP-1特異的レセプターアナログを含むポリペプチド鎖；（iii）配列番号７（ALK-6）の残基23〜122によって定義されるアミノ酸配列、またはそのOP-1特異的レセプターアナログを含むポリペプチド鎖；（iv） OP-1に対する結合親和性を有し、そして配列番号７（ALK-6）の残基23〜122と少なくとも40%のアミノ酸同一性を共有するポリペプチド鎖；（ｖ） OP-1に対する結合親和性を有し、そして配列番号12〜15によって定義される１つ以上のプライマー配列での増幅により得られ得る核酸によってコードされるポリペプチド鎖；または（vi） OP-1に対する結合親和性を有し、そして配列番号７（ALK-6）のヌクレオチド256〜552によって定義される配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチド鎖；（ｂ）該サンプルと候補OP-1アナログとを接触させる工程；および（ｃ） OP-1仲介細胞応答の誘導を検出する工程。３．工程（ｃ）で検出される前記OP-1仲介細胞応答が、キナーゼ活性の誘導、上皮細胞増殖の阻害、または細胞分化のマーカーの誘導である、請求項２に記載の方法。４．前記細胞が、OP-1誘導性タンパク質由来のコントロールエレメントと作動的に関連してリポーター遺伝子を含むトランスフェクトされた核酸を含む、請求項２または３に記載の方法。５．前記サンプルが、OP-1、アクチビン、またはBMP-4に対する結合親和性を有するII型セリン/トレオニンキナーゼレセプタータンパク質の一部または全部をさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。６．サンプル中のOP-1または候補OP-1アナログを同定するためのキットであって、（ａ）サンプルを受容するために適合され、そして以下からなる群より選択されるレセプタータンパク質を含む、容器：（ｉ）配列番号３（ALK-2）の残基16〜123によって定義されるアミノ酸配列、またはそのOP-1特異的レセプターアナログを含むポリペプチド鎖；（ii）配列番号５（ALK-3）の残基24〜152によって定義されるアミノ酸配列、またはそのOP-1特異的レセプターアナログを含むポリペプチド鎖；（iii）配列番号７（ALK-6）の残基23〜122によって定義されるアミノ酸配列、またはそのOP-1特異的レセプターアナログを含むポリペプチド鎖；（iv） OP-1に対する結合親和性を有し、そして配列番号７（ALK-6）の残基23〜122と少なくとも40%のアミノ酸同一性を共有するポリペプチド鎖；（v） OP-1に対する結合親和性を有し、そして配列番号12〜15によって定義される１つ以上のプライマー配列での増幅により得られ得る核酸によってコードされるポリペプチド鎖；または（vi） OP-1に対する結合親和性を有し、そして配列番号７（ALK-6）のヌクレオチド256〜552によって定義される配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチド鎖；および（ｂ） OP-1または候補OP-1アナログと、（ａ）部の該レセプタータンパク質との相互作用を検出するための手段であって、該OP-1または候補OP-1アナログが該容器に提供される該サンプルの一部を構成する、手段を含む、キット。７．前記（ｂ）部の手段が、以下の（ｉ）または（ii）のいずれかを含む、請求項６に記載のキット：（ｉ） OP-1または前記候補OP-1アナログと前記レセプタータンパク質との特異的結合相互作用を検出するための手段；または（ii） OP-1仲介細胞応答の誘導を検出するための手段。８．OP-1、アクチビン、またはBMP-4に対する結合特異性を有するセリン/トレオニンII型レセプターをさらに含む、請求項６または７に記載のキット。９．２つの分子を含む単離されたリガンド-レセプター複合体であって、第１の該分子が該リガンドを定義し、そしてOP-1の少なくともＣ末端の96個のアミノ酸（配列番号９の残基335〜431）またはそのレセプター結合アナログを含み、そして第２の該分子が該レセプターを定義し、そして以下からなる群より選択される複合体：（ｉ）配列番号３（ALK-2）の残基16〜123によって定義されるアミノ酸配列、またはそのOP-1特異的レセプターアナログを含むポリペプチド鎖；（ii）配列番号５（ALK-3）の残基24〜152によって定義されるアミノ酸配列、またはそのOP-1特異的レセプターアナログを含むポリペプチド鎖；（iii）配列番号７（ALK-6）の残基23〜122によって定義されるアミノ酸配列、またはそのOP-1特異的レセプターアナログを含むポリペプチド鎖；（iv） OP-1に対する結合親和性を有し、そして配列番号７（ALK-6）の残基23〜122と少なくとも40%のアミノ酸同一性を共有するポリペプチド鎖；（ｖ） OP-1に対する結合親和性を有し、そして配列番号12〜15によって定義される１つ以上のプライマー配列での増幅により得られ得る核酸によってコードされるポリペプチド鎖；または（vi） OP-1に対する結合親和性を有し、そして配列番号７（ALK-6）のヌクレオチド256〜552によって定義される配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチド鎖。１０．II型セリン/トレオニンキナーゼレセプターの一部または全部をさらに含む、請求項９に記載の複合体。１１．前記II型レセプターがまた、アクチビンまたはBMP-4に対する結合親和性を有する、請求項１０に記載の複合体。１２．前記リガンドを定義する前記第１の分子が、60A、BMP-5、BMP-6、Vgr-1、 OP2、OP3、およびレセプター結合アミノ酸配列変異体またはその異種ホモログからなる群より選択されるタンパク質の一部または全部を含むOP-1アナログである、請求項９〜１１のいずれかに記載の複合体。１３．リガンド-レセプター複合体においてエピトープに対する特異的結合親和性を有する単離された結合パートナーであって、該複合体が配列番号３（ALK-2 ）、５、または７により定義される細胞表面レセプター、あるいはそのOP-1-特異的レセプターアナログのリガンド結合ドメインとの特異的結合相互作用において、OP-1タンパク質またはそのアナログを含むことを特徴とし；該結合パートナーが、該OP-1タンパク質またはOP-1アナログの非複合形態に対して実質的に結合親和性を有さない、結合パートナー。１４．前記結合パートナーが、前記細胞表面レセプタータンパク質または前記そのレセプターアナログの非複合形態に対して実質的に結合親和性を有さないことをさらに特徴とする、請求項１３に記載の単離された結合パートナー。１５．前記結合パートナーがモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項１３に記載の結合パートナー。１６．請求項１〜５のいずれかに記載の方法に従って得られるOP-1アナログの使用、または（ｉ）細胞表面レセプターへのOP-1の結合を拮抗する；または（ii） OP-1仲介細胞応答の誘導を拮抗する方法における、請求項６〜８に記載のキットの使用。１７．前記OP-1アナログが、以下の（ｉ）または（ii）に対する結合特異性を有する抗体を含む、請求項１６に記載の使用：（ｉ）配列番号３、５、または７により定義される細胞表面レセプター、あるいはそのOP-1特異的レセプターアナログのリガンド結合ドメイン；または（ii）配列番号９によって示されるOP-1のレセプター結合ドメイン、またはそのレセプター結合アナログ。１８．（ｉ）細胞表面レセプターへのOP-1の結合；または（ii） OP-1仲介細胞応答の誘導を拮抗する方法における、以下からなる群より選択される、レセプタータンパク質の使用：（ｉ）配列番号３（ALK-2）の残基16〜123によって定義されるアミノ酸配列、またはそのOP-1特異的レセプターアナログを含むポリペプチド鎖；（ii）配列番号５（ALK-3）の残基24〜152によって定義されるアミノ酸配列、またはそのOP-1特異的レセプターアナログを含むポリペプチド鎖；（iii）配列番号７（ALK-6）の残基23〜122によって定義されるアミノ酸配列、またはそのOP-1特異的レセプターアナログを含むポリペプチド鎖；（iv） OP-1に対する結合親和性を有し、そして配列番号７（ALK-6）の残基23〜122と少なくとも40%のアミノ酸同一性を共有するポリペプチド鎖；（ｖ） OP-1に対する結合親和性を有し、そして配列番号12〜15によって定義される１つ以上のプライマー配列での増幅により得られ得る核酸によってコードされるポリペプチド鎖；または（vi） OP-1に対する結合親和性を有し、そして配列番号７（ALK-6）のヌクレオチド256〜552によって定義される配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチド鎖。１９．細胞表面レセプターへのアクチビンの結合を拮抗する方法であって、該方法が以下の工程を包含する、方法：配列番号３の残基16〜123によって定義されるアミノ酸配列に対する結合特異性を有するタンパク質またはそのOP-1レセプター結合配列変異体を提供する工程であって、該タンパク質が配列番号９によって定義される配列の残基335〜431と少なくとも60%のアミノ酸同一性を共有し、そのため、該タンパク質が、該細胞表面レセプターを発現する細胞に提供される場合、該レセプターと特異的に相互作用し得、それによって、実質的に該レセプターへのアクチビンの結合を阻害する、工程。２０．細胞表面レセプターへのBMP-4の結合を拮抗する方法であって、該方法が以下の工程を包含する、方法：配列番号５（ALK-3）の残基24〜152または配列番号７（ALK-6）の残基23〜122 によって定義されるリガンド結合ドメインに対する結合特異性を有するタンパク質、あるいはそのOP-1レセプター結合配列変異体を提供する工程であって、該タンパク質が配列番号９によって定義される配列の残基335〜431と少なくとも60% のアミノ酸同一性を共有し、そのため、該タンパク質が、該細胞表面レセプターを発現する細胞に提供される場合、該レセプターと特異的に相互作用し得、それによって、実質的に該レセプターへのBMP-4の結合を阻害する、工程。２１．請求項１〜５のいずれかに記載の方法に従って得られるOP-1アナログの使用、または、請求項１９または２０に記載の方法における、請求項６〜８に記載のキットの使用。