JPH10510423A

JPH10510423A - フラビン蛋白質を用いる化石燃料の脱硫化方法

Info

Publication number: JPH10510423A
Application number: JP8517746A
Authority: JP
Inventors: エイチ．スクワイアーズ，チャールス; ジー，ワン; サイ，レイ; シー．オルテゴ，ビートライス; エス．ポグレビンスキー，オルガ; エイ．グレイ，ケビン; ディー．チャイルズ，ジョン
Original assignee: エナジーバイオシステムズコーポレーション
Priority date: 1994-12-08
Filing date: 1995-12-05
Publication date: 1998-10-13
Also published as: CN1169159A; WO1996017940A2; AU693633B2; AU4375596A; EP0797668A2; WO1996017940A3; CA2206987A1; US5985650A; MX9704165A; US5733773A; BR9510082A

Abstract

(57)【要約】本発明は、生体触媒にフラビン蛋白質を添加することにより、化石燃料の脱硫化の反応速度が速くなるという発見に関する。本発明は、下記工程からなる有機硫黄化合物を含む化石燃料を脱硫化する速度を速める方法に関する：ａ）炭素−硫黄結合を切断可能な生体触媒を含む水相および速度を速める量のフラビン蛋白質と化石燃料とを接触させ、そうすることによって、化石燃料と水相との混合物を形成させる工程；ｂ）生体触媒による有機硫黄分子の炭素−硫黄結合の切断に十分な条件下で、工程ａ）の混合物を維持し、そうすることによって、有機硫黄含有量の低減した化石燃料を得る工程；およびｃ）生じた水相から有機硫黄含有量の低減した化石燃料を分離する工程。また、本発明は、有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫化することが可能な生体触媒をコードする組み換えＤＮＡ分子およびフラビン蛋白質をコードする組み換えＤＮＡ分子を１以上含む組み換え微生物に関する。さらに、本発明は、（ａ）有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫化することが可能な生体触媒および（ｂ）フラビン蛋白質からなる組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】フラビン蛋白質を用いる化石燃料の脱硫化方法背景技術化石燃料の微生物による脱硫化は、５０年以上に渡る活発な研究領域である。これらの研究の目的は、バイオテクノロジーに基づく、例えば、石炭、原油および石油蒸留物等の化石燃料からの硫黄の燃焼前除去方法を開発することであった。脱硫化方法の開発のための推進力は、化石燃料中の硫黄レベルの増加と硫黄放出の厳密な規制の増加である。モンティセロ（Monticello）ら、「石油の生物脱硫化における実用的研究」、IGT's 3d Intl．Symp．on Gas，Oil，Coal and Env ．Biotech.,(Dec．3-5，1990)New Orleans，LA。参照により本願明細書に取り込まれる米国特許第５，３５６，８０１号、第５，３５８，８７０号、第５，３５８，８１３号、第５，１９８．３４１号、第５，１３２，２１９号、第５，３４４，７７８号、第５，１０４，８０１号および第５，００２，８８８号に記載のものを含む多くの生体触媒およびプロセスが、化石燃料を脱硫化させるために開発されてきた。経済的な分析により、テクノロジーの商業化における１つの限界が、例えば、脱硫化反応に含まれる細菌や酵素等の生体触媒の反応速度および特異的活性を向上させていることが示唆される。文献に報告されている反応速度および特異的活性（除去される硫黄／時間／生体触媒のグラム）は、最適商業化テクノロジーに必要とされるものよりもずっと低いものである。従って、生体触媒の寿命と特異的活性の改良が望まれている。発明の概要本発明は、生体触媒にフラビン蛋白質を添加することにより、化石燃料の微生物的脱硫化速度が速くなるという発見に関する。本発明は、下記工程からなる有機硫黄化合物を含む化石燃料を脱硫化する速度を速める方法に関する：ａ）炭素−硫黄結合を切断可能な生体触媒を含む水相および速度を速める量のフラビン蛋白質と化石燃料とを接触させ、そうすることによって、化石燃料と水相との混合物を形成させる工程；ｂ）生体触媒による有機硫黄分子の炭素−硫黄結合の切断に十分な条件下で、工程（ａ）の混合物を維持し、そうすることによって、有機硫黄含有量の低減した化石燃料を得る工程；およびｃ）生じた水相から有機硫黄含有量の低減した化石燃料を分離する工程。また、本発明は、有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫化することが可能な生体触媒をコードする組み換えＤＮＡ分子およびフラビン蛋白質をコードする組み換えＤＮＡ分子を１以上含む組み換え微生物に関する。さらに、本発明は、（ａ）有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫化することが可能な生体触媒および（ｂ）フラビン蛋白質からなる組成物に関する。図面の簡単な説明図１は、フラビン蛋白質の添加におけるロドコッカス種ＡＴＣＣ５３９６８、ＩＧＴＳ８の抽出物によるＤＢＴから２−ＨＢＰへの変換のグラフである。図２は、プラスミドｐＥＸ１６およびｐＥＸ４４の模式図であり、図中、脱硫化遺伝子クラスターは単独で存在、またはｄｓｚ遺伝子と直接連結してｄｓｚ遺伝子クラスターの一部となるフラビン蛋白質遺伝子、ｆｒｐと共に存在している。図３は、フラビン蛋白質を共発現するプラスミドを用いた場合、ＤＢＴの脱硫化速度が増加することを示すグラフである。図４は、ＡＴＣＣ５３９６８由来の内因性フラビン蛋白質の溶出プロフィールのグラフである。図５および６は、ＩＧＴＳ８の内因性フラビン蛋白質を含む画分を、ｄｓｚ遺伝子を含む大腸菌から単離されたＤＳＺ酵素調製品に添加した場合、ＤＢＴおよびＤＢＴ−スルトンの脱硫化速度が増加することを示すグラフである。発明の詳細な説明石油抽出および精製技術において、「有機硫黄」という用語は、通常、１以上の硫黄原子（ヘテロ原子という）が共有結合により結合している炭化水素骨格を有する有機分子をいうと解釈されている。これらの硫黄原子は、例えば、１以上の炭素−硫黄結合により直接炭化水素骨格に結合してもよいし、例えば、スルホニル基（炭素−酸素−硫黄共有結合を含む）のような炭化水素骨格に結合した置換基に存在してもよい。１以上の硫黄ヘテロ原子を有する有機分子の一般的なクラスは、「有機硫黄化合物」として呼ばれることもある。これらの化合物の炭化水素部分は、脂肪族、芳香族または一部が脂肪族で一部が芳香族であってもよい。芳香族炭素−硫黄結合により１以上の硫黄ヘテロ原子を炭化水素骨格中の近接した炭素原子に連結した環式または縮合多環式有機硫黄化合物を、「硫黄含有ヘテロ環」という。硫黄含有ヘテロ環の多くのタイプに存在する硫黄を、硫黄ヘテロ原子が存在する５員芳香環という観点から、「チオフェニック硫黄」という。かかる硫黄含有ヘテロ環の最も単純な形は、チオフェンであり、Ｃ₄Ｈ₄Ｓという組成を有する。硫黄含有ヘテロ環は、例えば、水素化脱硫（ＨＤＳ）等の通常の脱硫処理に対して安定であることが知られている。硫黄含有ヘテロ環は、比較的単純な化学構造を有してもよいし、比較的複雑な化学構造を有してもよい。複素ヘテロ環において、１以上のものがヘテロ環であってもよい多縮合芳香族環が存在する。脱硫化の困難さは、分子の構造上の複雑さに伴って増加する。即ち、処理しにくい性質は、ジベンゾチオフェン（ＤＢＴ、Ｃ₁₂Ｈ₈Ｓ）等の複素硫黄含有ヘテロ環において最も強調される。ＤＢＴは、５員環のチオフェン環が、２個の６員環のベンジル環を両端に隣接している縮合多芳香族環構造を有する硫黄含有ヘテロ環である。化石燃料精製中間体および可燃性産物中のＨＤＳ後の有機硫黄残留物の多くは、チオフェニック硫黄である。この残留チオフェニック硫黄の大部分は、１方または両方の隣接ベンジル環に存在する１以上の炭素原子に結合した１以上のアルキル基またはアリール基を有するＤＢＴおよびその誘導体中に存在する。ＤＢＴそれ自体は、チオフェニック硫黄を含む反応において、ＤＢＴおよびその誘導体を包含する化合物のクラスの性質を示すモデル化合物として、関連技術分野において受けいれられている。モンティセロとフィネルティ(Monticello and Finnerty)、Annual Revi ews in Microbiology 39:371-389(1985)の372-373 を参照。ＤＢＴおよびその誘導体は、特に原油、石炭およびビチューメンの全硫黄含有量の有意な割合を占めることができる。例えば、これらの硫黄含有ヘテロ環は、ウエストテキサスの原油の全硫黄含有量の７０重量％を占めることが報告されているし、いくつかの中東原油の全硫黄含有量の４０重量％まで占めることが報告されている。従って、ＤＢＴは、特に地理学的起源の原油、石炭およびビチューメン等の化石燃料、ならびにそれから製造される種々の精製中間体および燃料製品において見出されるチオフェニック硫黄型に対するモデル化合物として特に関連していると考えられる。同著者。ＤＢＴおよびその誘導体の他の特徴は、化石燃料から環境へ放出された後、これらの硫黄含有ヘテロ環は、有意な生物分解を受けることなしに、長期間存在することである。グントラック（Gundlach）ら、Science 221:122-129( 1983)。従って、最も効果のある天然由来の微生物は、硫黄含有ヘテロ環を効果的に代謝したり、破壊したりしない。本発明の脱硫処理に好適な化石燃料は、有機硫黄を含むものである。かかる化石燃料を「基質化石燃料」という。チオフェニック硫黄に富む基質化石燃料が、本明細書に記載の方法による脱硫に特に好ましい。かかる基質化石燃料の例としては、セロネグロ重原油またはオリノコ重原油；アサバスカンタールおよび他の型のビチューメン；軽サイクルオイル、重大気ガスオイルおよびＮｏ．１ディーゼルオイル；ポカホンタス＃３、ルイス−ストック、オーストラリアグレンコエまたはワイオダック石炭等の原料から製造された石炭由来の液体が含まれる。生体触媒脱硫（生体触媒またはＢＤＳ）とは、生体触媒による硫黄含有ヘテロ環等の処理しにくい有機硫黄化合物を含む有機硫黄化合物における炭素−硫黄結合の選択的、酸化的切断の結果として、該化合物から硫黄を削除（遊離または除去）することである。ＢＤＳ処理により、例えば、分別蒸留または水抽出等の公知の技術により互いに容易に分離可能な無機硫黄物質と共に、前記処理しにくい有機硫黄化合物の脱硫化可燃性炭化水素骨格が得られる。例えば、ＤＢＴをＢＤＳ処理に供すると、ヒドロキシビフェニルに変換される。単独または互いに協調して、硫黄含有ヘテロ環を含む有機硫黄化合物中の炭素−硫黄結合を選択的に切断することにより、該化合物からの硫黄の除去を支配する１以上の酵素を機能的に発現する１以上の非ヒト生物（例えば、微生物）；かかる微生物から得られる１以上の酵素；またはかかる微生物および酵素の混合物からなる生体触媒によりＢＤＳを行う。生体触媒活性を示す生物を、本明細書では、Ｄｓｚ⁺であるという。生体触媒活性を欠く生物を、本明細書では、Ｄｓｚ^-であるという。本発明は、化石燃料の脱硫化が可能な生体触媒に速度を速める量のフラビン蛋白質を添加し、触媒部位への電子輸送を容易にしたり、速めたりすることからなる有機硫黄分子を含む化石燃料からの硫黄の改良除去に関する。本明細書で用いられる化石燃料の脱硫化が可能な生体触媒は、通常、当該技術分野において公知である。微生物（生存および非生存、組み換えおよび非組み換え）および酵素調製品が含まれる。何人かの研究者は、天然の細菌のＤＢＴを代謝可能な変異株への遺伝学的修飾を報告している。キルベイン（Kilbane，J．J.）、Resour．Cons．Recycl．3:69 -79(1990)、イスビスターおよびドイル(Isbister，J．D.,and R．C．Doyle)、米国特許第４，５６２，１５６号(1985)およびハートデガン(Hartdegan，F．J.)ら、Chem．Eng．Progress 63-67(1984)。これらの変異体の大部分は、非特異的にＤＢＴを脱硫し、小さな有機硫黄破壊生成物という形で、硫黄を放出させる。従って、ＤＢＴの燃料価値の部分は、この微生物作用を通して失われる。イスビスターおよびドイルは、ＤＢＴから選択的に硫黄を遊離することが可能と思われるシュードモナスの変異株の誘導を報告したが、この反応性に応答可能なメカニズムを解明しなかった。キルベインは、酸化的経路によりＤＢＴから選択的に硫黄を遊離することが可能と思われるものを生成した細菌混合培養物の突然変異を報告している。この培養物は、下水スラッジ、石油精製汚水、庭土、コールタールで汚染した土等の天然源から得られた細菌からなり、ＤＢＴの存在下で持続的な脱硫条件下で、培養を維持した。次いで、培養物を化学突然変異誘発物質である１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジンに曝した。この突然変異体培養物によるＤＢＴ代謝の主な分解産物は、ヒドロキシビフェニルであった；硫黄は、無機水溶性硫黄として放出され、分子の炭化水素部分は、モノヒドロキシビフェニルとして本質的に無傷で残った。キルベイン（Kilbane，J．J.）、Resour．Cons．Recycl．3: 69-79(1990)の技術は、参照により本明細書に取り込まれる。また、キルベインは、この細菌混合培養物からロドコッカスの変異株を単離した。この変異株、ＩＧＴＳ８すなわちＡＴＣＣＮｏ．５３９６８は、本発明で用いられる特に好ましい生体触媒である。この変異体の単離と特徴は、キルベイン（Kilbane，J．J.）、米国特許第５，１０４，８０１号に詳細に記載され、その技術は、参照により本明細書に取り込まれる。この微生物は、ブダペスト条約の条件下で、米国２０８５２メリーランド、ロックビレ、パークローンドライブ１２３０１のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ寄託Ｎｏ．５３９６８として指定された。１つの好適なＡＴＣＣＮｏ．５３９６８生体触媒調製品は、米国特許第５，１０４，８０１号に記載されたように通常に調製された生存微生物および変異体またはその派生物の培養物である。米国特許第５，１３２，２１９号および第５，３５８，８７０号に記載されたように通常、ＡＴＣＣＮｏ．５３９６８またはその変異体から得られた無細胞系酵素調製品も使用可能である。生体触媒脱硫（ＢＤＳ）の本発明の方法では、芳香族硫黄含有ヘテロ環等のＨＤＳで処理しにくい有機硫黄分子が全有機硫黄含有量の有意な部分を占める液体石油の処理において、ＡＴＣＣＮｏ．５３９６８生体触媒剤を持続的脱硫プロセスに用いる。ＤＢＴからの特異的硫黄放出を生じる、酸化的および還元的という少なくとも２つの可能な型の経路がある。酸化的（好気的）経路を伴うことが好ましい。この酸化的経路により作用する微生物としては、キルベイン(Kilbane)、Resour．C onserv．Recycl．3:69-79に開示された微生物コンソルティウム(consortium)（数種類の微生物の混合物）、キルベインの米国特許第５，００２，８８８号（１９９１年３月２６日発行）、第５，１０４，８０１号（１９９２年４月１４日発行）、第５，３４４，７７８号、第５，１３２，２１９号、第５，１９８，３４１号、第５，３５６，８１３号、第５，３５６，８０１号、第５，３５８，８７０号［キルベイン(1990)，生物脱硫化: 石炭のクリーニングにおける将来的展望，in PROC，7TH ANN．INT'L．PITTSBURGH COAL CONF．373-382にも記載されている］および第５，１９８，３４１号（１９９３年３月３０日発行）；およびオオモリ(Omori)ら、(1992)，コリネバクテリウム種ＳＹ１株によるジベンゾチオフェンの脱硫化，58 APPL．ENV．MICROBIOL.（No.3）911-915による；およびイズミ(Izumi)ら、Applied and Environmental Microbiology 60:223-226(1994)、すべては、参照により本明細書に取り込まれる、により開示された微生物が挙げられる。前記微生物はそれぞれ、処理しにくい有機硫黄化合物から硫黄を除去する特異的化学反応を行う１以上の酵素（蛋白質生体触媒）を産生するので、本発明において生体触媒として機能することができる。レーニンジャー(Lehninger)、PRINC IPLES OF BIOCHEMISTRY(Worth Publishers，Inc.,1982),p.8-9;ゾベル(Zobell) 、米国特許第２，６４１，５６４号（１９５３年６月９日発行）およびケルン(K ern)ら、米国特許第５，０９４，６６８号（１９９２年３月１０日発行）を参照。また、前記米国特許により例示された前記微生物のいずれかの突然変異または遺伝子工学的派生物も、適当な生体触媒機能がある限り、本明細書において生体触媒として使用することが可能である。既報の脱硫プロセスにおける生体触媒または生体触媒源としての使用に好適な追加の微生物は、公知の技術により天然の微生物から誘導することができる。前述のように、これらの方法は、単独の硫黄源としての硫黄含有ヘテロ環等の処理しにくい有機硫黄化合物の存在下で微生物が生育する選択的培養条件下、下水スラッジ、石油精製汚水、庭土またはコールタールで汚染した土等の天然源から得られた微生物の調製物を培養すること、化学的または物理的突然変異誘発物質に微生物を曝すこと、またはこれらの方法の組み合わせを含む。かかる技術は、イスビスター(Isbister)およびドイル(Doyle)、米国特許第４，５６２，１５６号（１９８５年１２月３１日発行）、キルベイン(Kilbane)、Resour．Conserb．Re cycl．3:69-79(1990)、米国特許第５，００２，８８８号、第５，１０４，８０１号および第５，１９８，３４１号；オオモリおよび共同実験者、58 APPL．ENV ．MICROBIOL．(No.3)911-915(1992)により詳細に述べられ、すべては参照により取り込まれる。前記説明したように、酵素は、生存細胞により作られる蛋白質生体触媒である。酵素は、その結果として消費されるようになるそれ自体なしで、特異的化学反応または一連の反応（経路という）の発生をプロモートし、指示しまたは容易にする。酵素は、１以上の非修飾または翻訳後もしくは合成的に修飾されたポリペプチド鎖または断片またはその一部、追加の補酵素、補因子、または所望の反応もしくは一連の反応を共同で触媒する共反応体を含むことができる。本発明に関連した１つの反応または一連の反応は、硫黄含有ヘテロ環等の処理しにくい有機硫黄化合物の炭化水素骨格から硫黄を切断することになる。前記処理しにくい有機硫黄化合物の炭化水素骨格は、実質的に無傷のままである。本発明に生体触媒として用いられる微生物または酵素は、生育のための炭素源として前記処理しにくい有機硫黄化合物の炭化水素骨格を消費しない。結果として、ＢＤＳ処理に曝された基質化石燃料の燃料価値は、低下しない。生存微生物（例えば、培養物）は、本明細書で生体触媒として用いることができるけれども、このことは必須ではない。本発明において使用される生体触媒酵素調製品は、通常の方法により得られ、所望の生体触媒機能を果たすことが可能な微生物溶解物、抽出物、画分、副画分または精製産物を含む。一般に、かかる酵素調製品は、実質的に無傷の微生物細胞を含有しない。例えば、キルベイン(K ilbane)およびモンティセロ（Monticello）は、米国特許第５，１３２，２１９号（１９９２年７月２１日発行）および第５，３５８，８７０号（１９９２年６月１１日発行）に、本明細書で好適に用いられる酵素調製品を開示している。ランボセック（Rambosek）らは、ロドコッカス種ＡＴＣＣＮｏ．５３９６８から技術的に得られ、本明細書で好適に用いられる組み換え微生物および酵素調製品を、米国特許第５，３５６，８１３号に開示している。本明細書で好適に用いられる酵素生体触媒調製品は、膜、フィルター、ポリマー樹脂、ガラス球もしくはビーズ、またはセラミック球もしくはビーズ等の固体の支持体に固定しても構わない。固定した酵素調製品の使用は、処理しにくい有機硫黄化合物を枯渇させた処理済化石燃料からの生体触媒の分離を容易にする。生体触媒脱硫段階において、硫黄含有ヘテロ環を含む液体化石燃料を、生体触媒およびフラビン蛋白質と結合させる。生体触媒とフラビン蛋白質と液体化石燃料の相対量は、特定の条件に適合するように、すなわち、処理された徹底的に脱硫化された化石燃料中の残留硫黄の特定のレベルを生じるように調整することできる。一定量の液体化石燃料と結合した生体触媒調製品の量は、用いる特定の生体触媒の性質、濃度および比活性ならびに基質化石燃料に存在する無機および有機硫黄化合物の性質および相対量ならびに求められるまたは許容されると考えられる脱硫度を反映するであろう。一定の生体触媒の比活性は、質量単位当たりのその生体触媒活性の程度である。従って、特定の生体触媒の比活性は、用いられる微生物または生体触媒酵素源として用いられる微生物の性質または同一性、ならびに生体触媒調製品を調製および／または保存するために用いられる手順に依存する。特定の生体触媒の濃度は、特定の環境において使用するための要求に合うように調節することができる。例えば、生存微生物（例えば、ＡＴＣＣＮｏ．５３９６８）の培養物を生体触媒調製品として使用する場合、硫黄含有ヘテロ環以外の硫黄源を欠く好適な培地に、好適な微生物を接種し、所望の培養濃度に達するまで発酵させることができる。生じた培養物を追加の培地または別の好適な培地で希釈することが可能であり、あるいは培養物中に存在する微生物細胞を、例えば、遠心分離により回収して、最初の培養物よりも濃い濃度で再懸濁させることが可能である。同様に、微生物および酵素生体触媒の濃度も調節することができる。このようにして、予定された比活性および／または濃度を有する適当な容量の生体触媒調製品を得ることができる。本明細書で用いることができるフラビン蛋白質は、当該技術分野において通常知られるものを含む。フラビンは、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）またはフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を含む。フラビン蛋白質は、フラビン還元酵素またはＦＭＮ還元酵素を含む。フラビン還元酵素またはより好ましくはＦＭＮ還元酵素のようなフラビン蛋白質は、天然に見出されるもの（例えば、フラビン蛋白質を含む微生物画分）として直接使用することができるし、市販品を得ることができるし、組み換えにより作ることができる。例えば、ビブリオフラビン還元酵素のＤＮＡ配列が、レイ(Lei)ら、J．Bacter．176(12):3552-3558( 1994)に示され、当該技術分野で公知の、例えば、米国特許第５，３５６，８０１号で検討された好適な宿主微生物を形質転換するために用いることができる。あるいは、フラビン蛋白質は、以下に記載の無細胞画分等の脱硫生体触媒に対して内因性なものであることができる。別の態様において、フラビン蛋白質は脱硫化微生物（例えば、ＩＧＴＳ８）により過剰発現させることができる。このことは、例えば、突然変異誘発により成される。好適な突然変異誘発物質としては、例えば、紫外線等の放射線ならびにＮ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン、ヒドロキシルアミン、エチルメタンスルホネートおよび亜硝酸等の化学突然変異誘発物質が挙げられる。突然変異誘発は、当該技術分野で通常知られた方法により行うことができる。フラビン蛋白質が組み換えの場合、フラビン蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む組み換え微生物の添加等により、該蛋白質をイン・サイチュで作ることができる。特に好ましい態様において、フラビン蛋白質をコードする組み換え微生物も、化石燃料の脱硫化が可能な酵素を有する。例えば、フラビン蛋白質をコードするＤＮＡで、ＩＧＴＳ８または化石燃料を脱硫可能な他の微生物に形質転換することができる。別の例において、フラビン蛋白質をコードするＤＮＡで、脱硫化生体触媒をコードするＤＮＡともに、通常の宿主細胞に同時にまたは別々に形質転換する。例えば、フラビン蛋白質をコードするＤＮＡを、化石燃料を脱硫化させることが可能な生体触媒をコードするＤＮＡと同じまたは異なるプロモーターの制御下で存在させることができる。１つの態様において、フラビン蛋白質ＤＮＡを、脱硫化遺伝子クラスターまたはＩＧＴＳ８のオペロン内に取り込ませたり、連結させる。フラビン蛋白質を、速度を速める量で反応混合物に添加する。本明細書において定義される「速度を速める量」とは、最初に得られた生体触媒の脱硫化速度を有意に増加させる量である。例えば、生体触媒がＩＧＴＳ８、その無細胞画分またはその精製酵素調製品の場合、フラビン蛋白質の「速度を速める量」は、得られる生体触媒中に固有に存在するものに加え、脱硫化速度を有意に増加させるフラビン蛋白質の量である。脱硫化速度を、例えば、生体触媒それ自体を用いる速度と比較して、少なくとも２５％、５０％または１００％増加させることができる。前記要約すると、本明細書に記載の発明は、一面において、フラビン蛋白質および／または有機硫黄化合物を含む化石燃料を脱硫することが可能な生体触媒をコードする遺伝子または遺伝子群を含むＤＮＡ分子またはその断片に関連する。ＤＮＡ分子またはその断片は、例えば、天然源由来の精製および単離ＤＮＡであってもよいし、例えば、非ヒト宿主生物に存在する組み換え（非相同または外来性）ＤＮＡであってもよい。以下の検討は、本発明を限定するように解釈されるものではなく、明確にする目的のために存在するものであるが、好適な生体触媒活性を発現することが知られているロドコッカス種ＡＴＣＣＮｏ．５３９６８株由来の脱硫化生体触媒をコードするＤＮＡの単離について詳述する。この好ましいロドコッカス株は、その技術が参照により本明細書に取り込まれる米国特許第５，１０４，８０１号（１９９２年発行）に開示され、ＩＧＴＳ８という文字で引用されている。好適な生体触媒活性を発現することが知られ、従って本発明の好適なＤＮＡ源として考えられる他の生物としては、米国特許第５，００２，８８８号に記載され、ＡＴＣＣＮｏ．５３９６９としてアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されているバチルススファエリカス株およびオオモリ(O mori)ら、Appl．Env．Microbiol．58(3):911-915(1992)に記載のコリネバクテリウム株が挙げられる。生体触媒活性を示すＡＴＣＣＮｏ．５３９６８等のロドコッカッス株を当業者に公知または容易に確認可能な適当な条件下で突然変異誘発物質に曝すことにより、炭素−硫黄結合を切断できないロドコッカッス突然変異株（Ｄｓｚ^-）を作製する。好適な突然変異誘発物質としては、例えば、紫外線等の放射線ならびにＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、ヒドロキシルアミン、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）および亜硝酸等の化学突然変異誘発物質が挙げられる。このように生成した突然変異体を適当な培地で生育させ、炭素 −硫黄結合切断活性でスクリーニングする。炭素−硫黄結合切断活性の正確な検出が可能なスクリーニング方法は、本発明の方法において好適である。この活性をスクリーニングする好適な方法は、炭素−硫黄結合を含む分子（例えば、ＤＢＴ）に種々の突然変異体を曝して、炭素−硫黄結合切断を測定することを含む。好ましい態様において、短波長紫外線下で蛍光を発する分解産物であるヒドロキシビフェニル（ＨＢＰ）を産生するように、突然変異体をＤＢＴに曝す。また、ＨＢＰは、ギブス試薬を用いる青色反応産物を通して比色的に検出することができる。その他の方法としては、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、赤外分光測定法および核磁気共鳴分光測定法が挙げられる。コダマ（Kodama ）ら、Applied and Environmental Microbiology，pp.911-915(1992)およびキルバイン(Kilbane)とビエラガ(Bielaga)、Final Report D.O.E．Contract No．DE- AC22-88PC8891(1991)を参照。Ｄｓｚ^-突然変異体を同定し、単離すれば、そのクローンを標準的な技術を用いて増殖させ、さらなる分析に付す。前記Ｄｓｚ⁺生物、ロドコッカスの培養物の突然変異誘発と同時に、同じＤｓｚ⁺生物の第２の培養物の培養を続ける。Ｄｓｚ⁺生物ＤＮＡを、このロドコッカスの培養物から抽出する。種々のＤＮＡ抽出方法が、この生物のＤＮＡを単離するのに好適である。好適な方法としては、フェノールおよびクロロホルム抽出等を含む。マニアティス（Maniatis）ら、Molecular Cloning，A Laboratory Manu al，2d，Cold Spring Harbor Laboratory Press，pg 16.54(1989)、本明細書では、マニアティスらという。一旦、ロドコッカスからＤＮＡを抽出すれば、ＤＮＡを種々のキロベースの長さの断片に切断し、好適なプラスミドシャトルベクターにクローニングすることでまとめてＤＮＡライブラリーを作製する。本発明のＤＮＡを含むロドコッカスのＤＮＡを断片化してそこからＤＮＡを精製する種々の方法、例えば、酵素的方法および機械的方法などを用いることができる。ＴａＱＩまたはＳａｕ３Ａ等の４塩基認識制限エンドヌクレアーゼが、ＤＮＡを断片化するのに好適である。ＤＮＡを断片化する好適な方法は、マニアティスらに見出される。本発明の生体触媒をコードするＤＮＡ断片を単離する目的で、種々のＤＮＡ断片を、いくつかのロドコッカスのＤｓｚ^-突然変異体クローンに挿入する。Ｄｓｚ^-突然変異体細胞をＤｓｚ⁺形質転換細胞に前もって形質転換することにより、挿入されたＤＮＡ断片が生体触媒をコードするということが明らかとなる。該断片の取込みと発現を可能にするＤＮＡをロドコッカスに挿入する方法であればいずれも好適である。好ましい態様において、ＤＮＡ断片をロドコッカスに導入するためにエレクトロポレーションを用いる。マニアティスらを参照。形質転換し、Ｄｓｚ⁺突然変異体が産生されて同定されると、Ｄｓｚ⁺生体触媒をコードするＤＮＡ断片を同定および単離することができる。次いで、当業者に公知で容易に利用可能な種々の方法で、単離されたＤＮＡを用いてコードされる生体触媒を産生することができる。また、公知の技術により、単離されたＤＮＡを、シーケンスおよび置換することが可能であり、および／またはマニアティスらに記載の技術等を用いて、フラビン蛋白質をコードするＤＮＡと連結することができる。前に示したように、本発明のＤＮＡを単離する前記方法は、例えば、ＡＴＣＣＮｏ．５３９６８株等のロドコッカス微生物以外のＤｓｚ⁺生物に適用することが可能である。従って、本発明のＤＮＡの生物源として、バチルススファエリカスＡＴＣＣＮｏ．５３９６９またはコリネバクテリウム種ＳＹ１を使用することができる。さらに、一旦単離されると、本発明のＤＮＡをＤｓｚ^-突然変異体生物源以外の非ヒト宿主生物に形質転換することができる。従って、本発明のＤＮＡを、例えば、大腸菌の好適な株に形質転換することができる。非ヒト宿主生物の他のタイプしては、単細胞生物（酵母等）および多細胞生物由来の培養物として確立された細胞等を用いることもできる。本発明のＤＮＡを単離する他の方法は、前記理論的解釈における変法を含む。例えば、ＩＧＴＳ８遺伝子クラスター由来の配列断片をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、類似のＤＮＡ分子を同定することができる。また、本明細書に記載の技術を用いて、ＩＧＴＳ８の内因性フラビン蛋白質等のフラビン蛋白質をコードするＤＮＡを単離し、クローニングすることができる。本発明の組み換えＤＮＡ分子またはその断片は、選択的に炭素−硫黄結合を切断可能な生体触媒およびフラビン蛋白質をコードする１以上の遺伝子のその鎖への化学的または生物学的手段による挿入から生じ、該遺伝子はその鎖に最初から存在しないいかなるＤＮＡをも含むものである。組み換えＤＮＡは、制限ヌクレアーゼ、核酸ハイブリダイゼーション、ＤＮＡクローニング、ＤＮＡ合成または前記のいずれかの組み合わせを用いる手段により合成されるいかなるＤＮＡも含む。構築方法は、マニアティスらおよび当業者に公知の他の方法に見出される。本発明のＤＮＡプラスミドまたはベクターの構築手順は、マニアティスらおよび当業者に公知の他の方法に記載のものを含む。「ＤＮＡプラスミド」および「ベクター」という用語は、化学的または生物学的手段により挿入される外来性または外因性ＤＮＡを有し、次いで、適当な非ヒト宿主生物に形質転換されると、外来性または外因性ＤＮＡ挿入物産物を発現する（例えば、本発明の生体触媒およびフラビン蛋白質を発現する）ことができる複製可能ないかなるプラスミドまたはベクターをも含むものである。また、プラスミドまたはベクターは、本発明の遺伝子または遺伝子群、該遺伝子は有機硫黄化合物の炭素−硫黄結合を選択的に切断する生体触媒をコードするものである、を含むＤＮＡ分子またはその断片の挿入物に対して受容的でなければならない。ＤＮＡプラスミドベクターの構築手順は、マニアティスらおよび当業者に公知の他のものに記載の手順を含む。本発明のプラスミドは、フラビン蛋白質および／または有機硫黄化合物の炭素 −硫黄結合を選択的に切断する生体触媒をコードする遺伝子または遺伝子群を含むいかなるＤＮＡ断片をも含む。「プラスミド」という用語は、いかなるＤＮＡ断片をも含むものである。ＤＮＡ断片は、例えば、形質転換または接合により宿主微生物に伝達可能であるべきである。ＤＮＡプラスミドの構築または抽出手順は、マニアティスらおよび当業者に公知の他のものに記載の手順を含む。本発明の形質転換された非ヒト宿主生物は、当業者による種々の方法により創作することができる。例えば、マニアティスらにより説明されるエレクトロポレーションを用いることができる。「非ヒト宿主生物」という用語は、外来性、外因性または組み換えＤＮＡの取込みおよび発現が可能ないかなる非ヒト生物をも意味する。宿主生物は、好ましくは微生物、より好ましくはシュードノマド(pse udonomad)である。本発明の化石燃料を脱硫化する方法は、２つの局面を含む。第１に、宿主生物またはそれから得られた生体触媒調製品を化石燃料と接触させ、脱硫化する。これは、任意に揺動または混合装置を取り付けた適当な容器中で行なうことができる。混合物を完全に結合させて、有機硫黄化合物の炭素−硫黄結合の有意な数の切断が可能な充分な時間インキュベートさせておき、そうすることによって脱硫化化石燃料を産生する。１つの態様において、生物または酵素画分の水性培養物と化石燃料とを用いて水性エマルジョンまたはマイクロエマルジョンを産生させ、発現した生体触媒が炭素−硫黄結合を切断する間、エマルジョン中の生物を増殖させておく。温度、混合速度および脱硫速度等の変数を、用いる生物生体触媒および／またはフラビン蛋白質に従って変える。パラメーターは、単なる日常的実験を通して決定される。脱硫化の速度と程度をモニターするいくつかの好適な技術は、当業者に公知であり、容易に利用できる。ベースラインと経時的試料を、インキュベーション混合物から採取し、化石燃料中の残留有機硫黄を測定するために調製することができる。生体触媒処理に供する試料中のＤＢＴ等の有機硫黄化合物からの硫黄の消失を、例えば、Ｘ線蛍光（ＸＲＦ）または原子発光分光測定（炎光分光測定）等を用いてモニターすることができる。例えば、ガスクロマトグラフィーにより、試料の分子成分を最初に分離することが好ましい。請求の範囲に記載の発明の方法および生体触媒組成物（組み換え微生物を含む）は、比較的初期に開示された脱硫化方法以上に有意で予期せぬ改良という結果を生じる。フラビン蛋白質の使用が、フラビン蛋白質を添加しない系と比較して、反応速度において約１００倍の改良という結果を生じることが可能であることが示された。ＦＡＤが直接ＤＳＺＣに結合することを示唆する文献(Denome et a l.，J．Bacteriol.,176:6707-6716，1994)およびＮＡＤＨは系に必須の補因子でしかないという提案(Ohshiro et al.，FEMS Microbiol．Lett．118:341-344，19 94)中の最近の議論という観点から、このことは、特に予想外である。特別なメカニズムに限定されることなく、脱硫化反応の経路は以下の通りであると信じられている：特別な理論に限定されることなく、フラビン蛋白質は、短い電子輸送鎖であり、ＮＡＤＨから還元等量を酵素、ＤＳＺＣ（またはＳｏｘＣ）および／またはＤＳＺＡ（またはＳｏｘＡ）に送達すると信じられている。酵素ＤＳＺＣは、ＤＢＴからＤＢＴＯ₂への酸化反応の生体触媒に応答可能であると信じられている。酵素ＤＳＺＡは、ＤＢＴＯ₂からフェノール−フェニル亜硫酸塩（ＰＰＳ）への反応に応答可能であると信じられている。補因子ＦＭＮそれ自体を反応培地に添加することならびに電子供与体ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを添加することが、特に好ましい。例えば、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの選択は、当該技術分野で公知のように、選択されるフラビン蛋白質に依存する。下記実施例に記載のように、ビブリオフラビン蛋白質を使用する場合は、ＮＡＤＰＨを用いた。また、当該技術分野で公知の方法に従って、ＮＡＤ⁺ からＮＡＤＨの変換に対するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ再生系の添加が好ましい。本発明を下記実施例によりさらに詳細に説明する。実施例実施例１：ＦＭＮはＤＳＺのインビトロ活性を高める材料と方法基礎塩培地中、３０℃でＡ₆₀₀が約１０まで生育させた１５ｍｌのＩＧＴＳ８細菌を、遠心分離により集め、ｐＨ７．５の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液４ｍｌに再懸濁させた。１７，０００ｐｓｉでフレンチプレスセルを２回通すことにより、細胞を溶解させた。界面活性剤ＣＨＡＰＳを、０．１％の最終濃度となるように細胞溶解液に添加した。次いで、この混合物を氷上１５分間置き、そして１５，０００ｘｇで１５分間遠心分離した。上清画分を無細胞系酵素測定に使用した。酵素反応混合物は、下記成分の全部またはいくつかを含む：１．０ｍＭＤＢＴ、３．２ｍＭＮＡＤＨ、１％レシチン（この水性混合物中でＤＢＴの溶解性を高めるため）、５μＭＦＡＤもしくはＦＭＮおよび０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲の前記細胞蛋白質抽出物。全体の反応容量は、０．６ｍｌであり、反応は１時間振盪させながら３０℃でインキュベートした後、１ｍｌのアセトニトリルを添加させることにより停止させた。次いで、混合物を遠心分離し、上清の一部を、既知の標準に対する２−ＨＢＰの濃度に基づいてＨＰＬＣにより分析した。蛋白質の濃度をプロテインアッセイキット(Biorad，Hercules,CA)により決定した。結果： Ohshiro ら(FEMS Microbiol．Lett．18:341-344(1994))により示されるように、ＤＢＴから２−ＨＢＰへの変換（conversion）は、インビトロ反応混合物へのＮＡＤＨ型の還元等価物の添加に依存する（表１）。しかし、これらの著者は、この反応には他の補因子は作用しないと報告している。前記のように調製したＩＧＴＳ８の粗製蛋白質抽出物を、約０．１６ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度に希釈した場合、該抽出物は、ＮＡＤＨ単独存在下ではＤＢＴから２−ＨＢＰを産生する能力を失う。この場合、反応混合物へのＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）の添加によりこの能力を回復する。ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）の添加は、何の効果も有しない（表１）。抽出物の透析は、同様の効果を有する（脱硫化活性の喪失とＦＭＮおよびＮＡＤＨの添加による回復）。これらの結果により、ＮＡＤＨおよびＦＭＮは両方とも脱硫化に関与し、反応を進行させるためにはそれらが共存しなければならないことがわかる。実施例２：精製ヘテロＮＡＤＰＨ依存性ＦＭＮ還元酵素は、ＩＧＴＳ８抽出物のＤｓｚ活性を高める実施例１に記載の実験結果により、ＩＧＴＳ８により触媒されるＤＢＴの脱硫化におけるフラビン（例えば、ＦＭＮ）を含む還元酵素の関与が示唆される。この仮説を試験するために、精製ヘテロＦＭＮ還元酵素の存在下で、ＤＢＴ→２− ＨＢＰ反応を行った。材料と方法：ＩＧＴＳ８細胞の粗製蛋白質抽出物を、実質的には実施例１に記載のように調製した。この抽出物中の蛋白質の濃度は、１２．７ｍｇ／ｍｌであった。この抽出物の脱硫化活性を測定するために、ビブリオハルベイ（Vibrio harveyi）から精製したＮＡＤＰＨ依存性ＦＭＮ還元酵素の量を変化させて、６７μＭのＤＢＴおよび５ｍＭのＮＡＤＰＨをその３００μｌに添加した（Lei，et al.,前述）。本明細書で使用する還元酵素の１ユニットは、ＮＡＤＰＨを基質として用いて１分間当たり１μモルのＦＭＮの還元を触媒する。結果：前述のように、Ｖ．ハルベイ還元酵素の０〜０．０９０ユニットを３００μｌの反応混合物に添加した場合、還元酵素による脱硫化活性の非常に強力な刺激がある。０．０９ユニットの添加により、２倍以上活性が増加する（図１）。これらの結果により、本明細書に記載の脱硫化反応において、反応を触媒する抽出物の全ポテンシャルは、フラビンを含む還元酵素の添加により実質的に上昇することがわかる。実施例３：大腸菌におけるＤｓｚ表現型の発現は、ＦＲＰに依存する材料と方法：ｄｓｚ発現ベクターｐＥＸ１６の構築プラスミドｐＥＸ１６は、大腸菌ｔａｃプロモーター配列の転写制御下にｄｓｚＡＢＣ遺伝子を含む。このプラスミドを、下記工程により構築した：合成二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドアダプター配列を、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII で予め切断しておいたプラスミドｐＵＣ１９（Yanisch-Perron et al.，Gene 33:103-119(1985)）に連結し、プラスミドｐＥＸ１３が生じた。次いで、エンドヌクレアーゼＮｓｉ１およびＢｓｉｗ１でｐＥＸ１３を切断した。次いで、ｄｓｚＡＢＣ構造遺伝子を含むプラスミドｐＴＯＸｉ１（米国特許第５，３５６，８０１号）由来の４．５ｋｂのＮｓｉ１／Ｂｓｉｗ１制限断片を単離し、切断ｐＥＸ１３ＤＮＡと連結し、プラスミドｐＥＸ１４が生じた。ｐＥＸ１４由来の４．５ｋｂｐのＢｇ１ii／Ｓｐｅ１断片およびＢＡＭＨ１／Ｓｐｅ１切断プラスミドｐＴ３ＸＩ−２（Hale，K, テトラサイクリン耐性遺伝子およびｔａｃプロモーターを含むｐＫＫ２２３−３ (Pharmacia)由来）の混合物を、ｔａｃプロモーターがｄｓｚＡＢＣを直接転写させるような向きに連結した。このプラスミドをｐＥＸ１６と呼ぶ（図２）。ＤＳＺＡＢＣおよびｆｒｐをコードするプラスミドの構築ビブリオハルベイのｆｒｐ（フラビン還元酵素）遺伝子を含むＤＮＡの０．９ｋｂｐ断片（Lei et al．J．Bacteriology 176:3552-3558(1994)）を、下記工程を用いてプラスミドｐＥＸ１６に加えた。プラスミドｐＦＲＰＩ（Lei，et al ．(1994)）を制限エンドヌクレアーゼＥａｒ１で切断し、ｄＮＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼ大断片（Klenow）を用いて末端を平滑化した。二本鎖Ｓｐｅ１リンカー断片（N.E．Biolabs）をライゲーションによりこれらの平滑末端に加え、Ｓｐｅ１で切断した。次いで、プラスミドｐＥＸ１６をｄｓｚＡＢＣ遺伝子クラスターの３’末端に位置するユニークＳｐｅ１部位で切断し、Ｓｐｅ１末端のｆｒｐ遺伝子断片と連結した。ｔａｃプロモーターの制御下にｄｓｚＡＢＣおよびｆｒｐ遺伝子を含む生じたクローンを、ｐＥＸ４４と呼ぶ（図２）。細胞溶解液の調製およびｐＥＸ１６またはｐＥＸ４４を含む大腸菌の抽出物におけるＤｓｚ活性の測定ＹＴ培地中３７℃で生育させた大腸菌細胞の培養液（５０ｍｌ）を、０．１ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）の添加によりクローン化した遺伝子の発現を誘導させた。細胞を遠心分離により集め、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁させ、１７，０００ｐｓｉでフレンチプレスセルを２回通すことにより、溶解させた。溶解液を１５，０００Ｘｇで１５分間遠心分離し、上清画分を酵素測定のために保存した。反応混合液は、最終容量３００μｌに、０．１Ｍリン酸緩衝液、５μＭＦＭＮ、０．６７ｍＭＤＢＴ、３ｍＭＮＡＤＰＨ、蛋白質抽出物（１２ｍｇ／ｍｌ）を含んでいた。結果：単独硫黄源としてのＤＢＴに対する大腸菌の生育は、ＤＳＺＡＢＣおよびｆｒｐに依存する単独硫黄源としてのＤＢＴに対して、ＩＧＴＳ８は生育するであろう。大腸菌の野生株は生育しないであろう。さらに、ｄｓｚＡＢＣ遺伝子を発現するプラスミドｐＥＸ１６を有する大腸菌株を、単独硫黄源としてのＤＢＴを含む一定の生育培地中に置いた場合、３種の遺伝子産物を強力に発現するにも係わらず、生育しないであろう。しかし、ｄｓｚＡＢＣおよびｆｒｐを発現するプラスミドｐＥＸ４４を有する同じ大腸菌株は、これらの条件下で生育するであろう。これらの結果により、Ｄｓｚ表現型のヘテロな発現がフラビン還元酵素蛋白質により有意に高められていることがわかる。プラスミドｐＥＸ１６またはｐＥＸ４４のいずれかを含む大腸菌株の抽出物を調製し、前述のように、ＤＢＴから２−ＨＢＰへの変換を測定した。図３に示した結果は、ｆｒｐ遺伝子発現産物、すなわち、ＮＡＤＰＨ依存性ＦＭＮ還元酵素の抽出物中に存在することにより変換が高められたことが確定されたことから得られるものである。実施例４：ＩＧＴＳ８の内因性フラビン蛋白質の単離方法と材料細菌株と生育ＢＳＭ／Ｈｕｎｔｅｒｓ培地（Denome et al.，Applied and Environmental M icrobiology 59(9(:2837-2843(1993)）中、３０℃、２５０ｒｐｍで振盪させることにより、ＩＧＴＳ８を初期定常期まで生育させた（通常約８５時間）。ＤＳＺＡをコードするプラスミドｐＳＡＤ２６７−１（Denome et al.，J．Ba ct．176:6707-6716(1994)）を含む大腸菌ＭＺ１を、０．４ｍｇｍＬ^-1のビオチン、それぞれ、５０ｍｇｍＬ^-1のヒスチジン、イソロイシンおよびバリン、１００μｇｍＬ^-1のアンピシリンならびに１．５ｍＭのＮａ₂ＳＯ₄を含むＢＳＭ／Ｈｕｎｔｅｒｓ培地中で生育させた。新鮮な寒天プレート由来のシングルコロニーを用いて５０ｍＬの液体培地に接種し、３０℃で一晩振盪させた（２５０ｒｐｍ）。この培養液の１０ｍＬのアリコートを用いて５００ｍＬの同じ培地に接種し、ＯＤ₆₀₀が約０．４になるまで生育させた。この時点で、２時間、３９ ℃まで温度を上げることにより、ＤＳＺＡの発現を誘導させ、その後、ＯＤ₆₀₀ が約３に達するまで３０℃に戻した。通常、３Ｌの細胞培養液を精製に用いた。ＤＳＺＣをコードするプラスミドｐＳＡＤ２６９−２Ａ（Denome et al．(199 4)）を含む大腸菌ＭＺ１を、前記ＭＺ１：：ｐＳＡＤ２６７−１で記載のように、１００μｇｍＬ^-1のアンピシリンを添加したＬＢ培地で生育させた。カラムクロマトグラフィーすべてのクロマトグラフィー工程は、４℃または氷上で行なった。遠心分離により集めたＩＧＴＳ８細胞を、１ｍＭＥＤＴＡおよび１ｍＭＤＴＴを含む２５ｍＭＥＰＰＳｐＨ８（バッファーＡ）で１回洗浄し、２５ｍＭＥＰＰＳｐＨ８、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂および０．１５ｍＭＰＭＳＦ中に再懸濁した。ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼを固体として添加した。細胞を４０，０００ｐｓｉでＡｍｉｎｃｏフレンチプレスセル中で破壊した。細胞懸濁液を２回フレンチプレスに通し、次いで、４℃、３９，８００ｘｇで３０分間遠心分離した。ペレット（破壊されない細胞と細胞の破片からなる）を捨てる一方、２ｍＬｍｉｎ^-1の流速で５％バッファーＢ（バッファーＡ＋２ＭＮａＣｌ）を含むバッファーＡで平衡化させたＰｈａｒｍａｃｉａＱ−セファロースファストフローカラム（２．６ｃｍｘ１４ｃｍ）に、上清を負荷した。５ｍＬｍｉｎ^-1の流速で、溶離液のＯＤ₂₈₀が０に近づくまで同じバッファーでカラムを充分洗浄し、１８０分かけて５％〜３０％バッファーＢの直線グラジエント（１００ｍＭ〜６００ｍＭＮａＣｌに相当）で展開させた。約２４０ｍＭＮａＣｌで、ＮＡＤＨ：ＤＣＰＩＰ酸化還元酵素活性を示す黄色を帯びた画分が溶出された。大腸菌由来のＤＳＺＡの精製を、以下にように行なった。前述のように生育させた大腸菌細胞を、６，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離により集め、バッファーＡで２回洗浄した。１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１５ｍＭＰＭＳＦおよびＤＮアーゼおよびＲＮアーゼを含む同じバッファー（細胞の湿重量と等しい容量）中に、細胞を再懸濁させ、次いで、２０，０００ｐｓｉでフレンチプレスセル中で破壊した。溶解物を３９，８００ｘｇで３０分間遠心分離して、破壊されない細胞と細胞の破片を除去した。１ｍＬｍｉｎ^-1の流速で、ＰｈａｒｍａｃｉａＱ−セファロースファストフローカラム（２．６ｃｍｘ１４ｃｍ）に上清を負荷した。溶離液のＯＤ₂₈₀がベースラインに近づくまで、カラムを５％バッファーＢで洗浄し、５ｍＬｍｉｎ^-1の流速で、１２０分かけて５％〜２５％バッファーＢの直線グラジエントで展開させた。ＤＳＺＡを含む画分（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定）をプールし、バッファーＡに対し、４℃で一晩透析した。バッファーＡで平衡化したＰｈａｒｍａｃｉａリソースＱカラムとラインで接続したＰｈａｒｍａｃｉａブルーセファロース −６ファストフローカラムに、透析物を負荷した。安定したベースラインを達成した後、ブルーセファロースカラムを外し、リソースＱカラムを３ｍＬｍｉｎ^-1の流速で、６０分間、２．５％〜２５％バッファーＢの直線グラジエントで展開させた。ＤＳＺＡを含む画分（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判定）をプールし、グリセロールを１０％（ｗ／ｖ）添加し、−２０℃で保存した。この手順により純度が９５％のＤＳＺＡが得られる。ＤＳＺＣを以下のように精製した。この場合、バッファーＡは、１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭＢＥＳｐＨ７．０９であった。４ｍｇｍＬ^-1のリゾチームで、室温で１．５時間処理することにより、細胞を溶解させた。溶解緩衝液は、７５ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴおよび０．１ｍｇｍＬ^-1 ＰＭＳＦを含んでいた。溶解が完了後、ＭｇＣｌ₂を５ｍＭ添加し、ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼも添加した。まず、上清を６，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ペレットを捨て、再び上清を３９０００ｘｇで１．５時間遠心分離した。次に、バッファーＡ＋３％バッファーＢ（２ＭＮａＣｌを有するバッファーＡ）で平衡化したＰｈａｒｍａｃｉａリソースＱカラムに、上清を負荷し、カラム体積の１０倍の同じバッファーで洗浄した。３ｍＬｍｉｎ^-1の流速で、２３分間、６０ｍＭＮａＣｌ〜５００ｍＭＮａＣｌの直線グラジエント（３％〜２５％バッファーＢ）で展開させた。３５０ｍＭＮａＣｌ付近で溶出するＤＳＺＣを含む画分（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定）をプールし、Ａｍｉｃｏｎセントリプレップ３０（ＭＷＣＯ３０ｋＤａ）を用いて約０．７ｍＬまで濃縮した。さらに、移動相として１０ｍＭＢＥＳｐＨ７を用いるＰｈａｒｍａｃｉａスペロース１２ゲル濾過カラム（流速０．３ｍＬｍｉｎ^-1）で、濃縮画分の０．２５ｍＬをクロマトグラフィーに付した。ＤＳＺＣを含む画分をプールし、次いで凍結乾燥させ、−２０℃で保存した。酵素アッセイＮＡＤＨ依存性ＤＣＰＩＰ還元を、以下のように測定した。反応混合液（ｄ＝１ｃｍのキュベット中１ｍＬ）は、２５ｍＭＥＰＰＳ緩衝液、ｐＨ８中１００ｎｍｏｌのＤＣＰＩＰおよび５０ｎｍｏｌのＦＭＮを含んでいた。ＤＣＰＩＰの還元は、６００ｎｍにおける吸光度の低下と相関する。攪拌混合物の吸光度を、Ｂｅｃｋｍａｎ７５００ダイオードアレイ分光光度計を用いて６００ｎｍでモニターした。３００ｎｍｏｌのＮＡＤＨを添加して約３０秒後、ＤＣＰＩＰの非酵素的還元の残存量があることが観察された。さらに約３０秒後、試験対象の試料の１〜１０μＬの注入により反応が開始された。酵素活性を、−ＯＤ₆₀₀ｍｉｎ^-1またはμＭ還元ＤＣＰＩＰｍｉｎ^-1（ε₆₀₀＝２１ｍＭ^-1ｃｍ^-1を用いる）のいずれかで表した。吸光度を５５０ｎｍでモニターすることおよび混合物がＤＣＰＩＰの代わりに５０ｎｍｏｌのｃｙｔｃを含むことを除いて同様の方法で、ＮＡＤＨ依存性ｃｙｔｃの還元を測定した。フェリチトクロームｃからフェロチトクロームｃへの還元は、５５０ｎｍの吸光度の増加と相関する。ＤＢＴのＤＢＴＯ、ＤＢＴＯ₂およびＨＢＰへの変換ならびにＤＢＴ−スルトンのＢＨＢＰへの変換を、既報に従って、Ｈ₂Ｏ：アセトニトリル比が１のＳｙｎｃｈｒｏｐａｋＲＰＣ１８逆相カラム（１００ｘ４．６ｍｍ）を用いるＨＰＬＣにより測定した。１００ｍＭＮａＰ_iｐＨ７．５中の反応混合物は、１ｍＬ中に３μｍｏｌのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、２５ｎｍｏｌのＦＭＮ（またはＦＡＤ）、粗製溶解物または精製ＤＳＺＣ（Ａ）および１００ｎｍｏｌの基質を含んでいた。１０分毎に、１００μＬを取り除き、１００μＬのアセトニトリルを添加して反応を消光させ、基質と生成物を分析した。結果：ＩＧＴＳ８におけるフラビンを含む還元酵素の同定ＩＧＴＳ８の粗製溶解物を、アニオン交換クロマトグラフィーにより分離した後、いくつかの透明な着色した（黄色または茶色）画分を区別することが可能であった。図４に示されるように、ＮＡＤＨによるＤＣＰＩＰの還元は、２５番（約２４０ｍＭＮａＣｌ）付近を中心とするピークを有するこれらの画分のいくつかで起こる。通常これらの画分は、フラビン蛋白質を含んでいることを示す画分に対してかすかに黄色を有している。酸化還元酵素活性を充分得るためには、外因性のフラビンを反応混合物に添加しなければならず、単離の手順の間に内因性のフラビンが喪失してしまうことを意味する。フラビンの添加（この場合はＦＭＮ）は、ＤＣＰＩＰの還元速度と程度の両方を増進させる。また、これらの画分もＮＡＤＨの酸化と共役したｃｙｔｃの還元を触媒する。フラビン蛋白質還元酵素によるＤＳＺＡおよびＤＳＺＣの活性化ＤＳＺＡまたはＤＳＺＣのいずれかを大腸菌から精製すると、いずれも、通常の１時間測定ではそれぞれの反応を触媒しない。図５により、黄色の画分由来のフラビン蛋白質還元酵素を、ＦＭＮおよびＮＡＤＨの共存下、精製した大腸菌ＤＳＺＡと組み合わせた場合、ＤＢＴ−スルトンからＢＨＢＰへの完全な変換が起こることがわかる。黄色の画分を、ＤＳＺＣ、ＦＭＮおよびＮＡＤＨと結合させた場合（ここでは基質がＤＢＴで生成物がＤＢＴＯ₂であることを除く）、同様のパターンが観察される（図６）。これらの結果により、脱硫化を起こすためには、ＤＳＺＡ、ＤＳＺＢおよびＤＳＺＣ蛋白質が存在するばかりでなく、補因子としてフラビンを用い、ＮＡＤＨを酸化させるために反応可能な少なくとも第３の蛋白質が経路に含まれなければならないことが示唆される。均等物等業者であれば、単なる日常的実験手法により、本明細書に記載された発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができるであろう。そのようなおよび他のすべての均等物は、下記クレームの範疇に含まれるものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１０月２８日【補正内容】１７．炭素−硫黄結合を切断可能な生体触媒および組み換えフラビン還元酵素が、単一の微生物により産生されている請求項１６記載の方法。１８．有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫化することが可能な生体触媒をコードする第１のＤＮＡ配列、およびフラビン蛋白質をコードする第２のＤＮＡ配列からなるＤＮＡ分子。１９．フラビン蛋白質が、フラビン還元酵素である請求項１８記載のＤＮＡ分子。２０．フラビン還元酵素が、ＦＭＮ還元酵素である請求項１９記載のＤＮＡ分子。２１．ＤＮＡ分子が、ロドコッカス種ＡＴＣＣ５３９６８由来のＤＮＡからなる請求項２０記載のＤＮＡ分子。２２．下記をコードする組み換えＤＮＡ分子を含む微生物：（ａ）有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫化することが可能な生体触媒；および（ｂ）追加のフラビン蛋白質。２３．フラビン蛋白質が、フラビン還元酵素である請求項２２記載の微生物。２４．組み換えＤＮＡプラスミドが、ロドコッカス種ＡＴＣＣ５３９６８由来のＤＮＡからなる請求項２３記載の微生物。２５．下記からなる組成物：（ａ）有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫化することが可能な生体触媒；および（ｂ）速度を速める量のフラビン蛋白質。２６．フラビン蛋白質が、フラビン還元酵素である請求項２５記載の組成物。２７．フラビン蛋白質が、ＦＭＮ還元酵素である請求項２６記載の組成物。２８．生体触媒が、ロドコッカス種ＡＴＣＣ５３９６８またはその酵素である請求項２７記載の組成物。２９．ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨをさらに含んでなる請求項２７記載の組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者サイ，レイアメリカ合衆国テキサス 77381 ザウッドランズ，ウエストスターリングポンドサークル 159 (72)発明者オルテゴ，ビートライスシー. アメリカ合衆国テキサス 77379 スプリング，ケトルクリークドライブ 17003 (72)発明者ポグレビンスキー，オルガエス. アメリカ合衆国テキサス 77024 ヒューストン，パインロック 12611 (72)発明者グレイ，ケビンエイ. アメリカ合衆国テキサス 77381 ザウッドランズ，ナンバー．177，タングルブラッシュ 3500 (72)発明者チャイルズ，ジョンディー. アメリカ合衆国テキサス 77381 ザウッドランズ，ナンバー．1202．ホリークリークコート 33

Claims

【特許請求の範囲】１．下記工程からなる有機硫黄化合物を含む化石燃料の生物脱硫化速度を速める方法：ａ）炭素−硫黄結合を切断可能な生体触媒を含む水相および速度を速める量のフラビン蛋白質と、化石燃料とを接触させ、そうすることによって、化石燃料と水相との混合物を形成させる工程；ｂ）生体触媒による有機硫黄分子の炭素−硫黄結合の切断に十分な条件下で、工程ａ）の混合物を維持し、そうすることによって、有機硫黄含有量の低減した化石燃料を得る工程；およびｃ）生じた水相から有機硫黄含有量の低減した化石燃料を分離する工程。２．フラビン蛋白質が、フラビン還元酵素である請求項１記載の方法。３．フラビン蛋白質が、ＦＭＮ還元酵素である請求項１記載の方法。４．ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを添加する工程をさらに含んでなる請求項３記載の方法。５．化石燃料が、液体炭化水素である請求項４記載の方法。６．化石燃料が、液化炭化水素である請求項４記載の方法。７．炭素−硫黄結合を切断可能な生体触媒およびＦＭＮ還元酵素が固定されている請求項４記載の方法。８．炭素−硫黄結合の切断が、酸化的経路により行われる請求項４記載の方法。９．炭素−硫黄結合を切断可能な生体触媒が、微生物である請求項８記載の方法。１０．微生物が、炭素−硫黄結合を切断可能な１以上の酵素をコードする組み換えＤＮＡ分子を含む請求項８記載の方法。１１．組み換えＤＮＡ分子が、ロドコッカス種ＡＴＣＣ５３９６８由来である請求項１０記載の方法。１２．炭素−硫黄結合を切断可能な生体触媒が、無細胞系画分である請求項８記載の方法。１３．生体触媒が、ロドコッカス種ＡＴＣＣ５３９６８の無細胞系画分である請求項１２記載の方法。１４．生体触媒が、炭素−硫黄結合の切断可能性を有する微生物由来の１以上の酵素または酵素画分からなるものである請求項８記載の方法。１５．微生物が、ロドコッカス種ＡＴＣＣ５３９６８である請求項１４記載の方法。１６．フラビン蛋白質が、組み換えフラビン還元酵素である請求項２記載の方法。１７．炭素−硫黄結合を切断可能な生体触媒および組み換えフラビン還元酵素が、単一の微生物により産生されている請求項１６記載の方法。１８．フラビン蛋白質をコードするＤＮＡ、および有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫化することが可能な生体触媒をコードするＤＮＡからなるＤＮＡ分子。１９．フラビン蛋白質が、フラビン還元酵素である請求項１８記載のＤＮＡ分子。２０．フラビン還元酵素が、ＦＭＮ還元酵素である請求項１９記載のＤＮＡ分子。２１．ＤＮＡ分子が、ロドコッカス種ＡＴＣＣ５３９６８由来のＤＮＡからなる請求項２０記載のＤＮＡ分子。２２．下記をコードする組み換えＤＮＡ分子を含む微生物：ａ）フラビン蛋白質；およびｂ）有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫化することが可能な生体触媒。２３．フラビン蛋白質が、フラビン還元酵素である請求項２２記載の微生物。２４．組み換えＤＮＡプラスミドが、ロドコッカス種ＡＴＣＣ５３９６８由来のＤＮＡからなる請求項２３記載の微生物。２５．下記からなる組成物：ａ）フラビン蛋白質；およびｂ）有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫化することが可能な生体触媒。２６．フラビン蛋白質が、フラビン還元酵素である請求項２５記載の組成物。２７．フラビン蛋白質が、ＦＭＮ還元酵素である請求項２６記載の組成物。２８．生体触媒が、ロドコッカス種ＡＴＣＣ５３９６８またはその酵素である請求項２７記載の組成物。２９．ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨをさらに含んでなる請求項２７記載の組成物。