MXPA97004165A - Metodo de desulfuracion de combustible fosil conflavoproteina - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al descubrimiento de que elíndice de reacción de la desulfurización de combustibles fósiles se incrementa con la adición de una flavoproteína al biocatalizador. La invención se refiere a un método que incrementa elíndice de desulfurización de un combustible fósil que contenga compuestos de azufre orgánico, que comprende las siguientes etapas:a) contactar el combustible fósil con una fase acuosa que contenga un blocatalizador capaz de desdoblar enlaces de azufre-carbono, y un cantidad de flavoproteína que incrementa elíndice, de donde se forma un combustible fósil y una mezcla de fase acuosa;b) mantener la mezcla de la etapa (a) bajo condiciones suficientes para el desdoblamiento de los enlaces de azufre-carbono de las moléculas de azufre orgánico por medio del biocatalizador, de ahíque resulta un combustible fósil qua tiene un contenido reducido de azufre orgánico;y c) separar de la fase acuosa resultante el combustible fósil que tiene un contenido reducido de azufre orgánico. La invención también se refiere a un microorganismo recombinante que contiene una o más moléculas de ADN recombinantes que codifican un biocatalizador capaz de desulfurizar un combustible fósil que contenga moléculas de azufre orgánico, y que codifican una flavoproteína. Asimismo, la invención se refiere a una composición que comprende:(a) un biocatalizador capaz de desulfurizar un combustible fósil que contenga moléculas de azufre orgánico, y (b) una flavoproteína.

Description

MÉTODQ DE DESULFURACIÓN DE COMBUSTIBLE FÓSIL CON FLAVOPROTEÍ A ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La desulfuración microbiana de combustibles fósiles ha sido un área de activa investigación durante más de cincuenta años. El objeto de estas investigaciones ha sido desarrollar métodos basados en la biotecnología para la eliminación pre-combustión de azufre de los combustibles fósiles, tales como carbón, aceite crudo y destilados de petróleo. Las fuerzas impulsoras para el desarrollo de métodos de desulfuración son los niveles crecientes de azufre en el combustible fósil y la regulación cada vez más estricta de las emisiones de azufre. Monticello y col., "Practical Considerations in Biodesulfurization of Petroleum", 3— Si p. ínter, de IGT sobre Gas, Aceite, Carbón y Biotecnología Ab., (3-5 Dic, 1990), New Orleans, LA. Se han desarrollado muchos biocatalizadores y procedimientos para desulfurar combustibles fósiles, incluidos los descritos en las Patentes EE.UU. N° 5.356.801, 5.358.870, 5.358.813, 5.198.341, 5.132.219, 5.344.778, 5.104.801 y 5.002.888, aqui incorporadas a modo de referencia. Los análisis económicos indican que una limitación en la comercialización de la tecnología es el perfeccionamiento de las velocidades de reacción y actividades especificas de los biocatalizadores, tales como bacterias y enzimas implicadas en las reacciones de desulfuración. Las velocidades de reacción y actividades especificas (azufre eliminado/hora/gramo de biocatalizador) que han sido citadas en la literatura son mucho menores que las necesarias para la tecnología comercial óptima. Por lo tanto, son deseables perfeccionamientos en la longevidad y actividad especifica del biocatalizador.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con el descubrimiento de que la velocidad de desulfuración microbiana de combustibles fósiles aumenta mediante la adición de una flavoproteina al biocatalizador. La invención se dirige a un método de potenciación de la velocidad de desulfuración de un combustible fósil que contiene compuestos azufrados orgánicos, consistente en las siguientes etapas: a) poner en contacto el combustible fósil con una fase acuosa que contiene un biocatalizador capaz de excindir los enlaces carbono-azufre y una cantidad poten-ciadora de la velocidad de una flavoproteina, formando de este modo una mezcla de un combustible fósil y fase acuosa; b) mantener la mezcla de la etapa (a) en condiciones suficientes para la excisión de los enlaces carbono-azufre de las moléculas de azufre orgánico por el biocatalizador, dando lugar de este modo a un combustible fósil que tiene un reducido contenido en azufre orgánico, y c) separar el combustible fósil que tiene un reducido contenido en azufre orgánico de la fase acuosa resultante. La invención se relaciona también con un microorganismo recombinante que contiene una o más moléculas de ADN recombinante que codifican para un biocataliza-dor capaz de desazufrar un combustible fósil que contiene moléculas de azufre orgánico y que codifican para una flavoproteina. La invención se relaciona también con una composición consistente en (a) un biocatalizador capaz de desazufrar un combustible fósil que contiene moléculas de azufre orgánico y (b) una flavoproteina. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una ilustración gráfica de la conversión de DBT a 2-HBP por un extracto de Rhodococcus sp. ATCC 53968, IGTS8, tras la adición de flavoproteina. La Figura 2 es una ilustración gráfica de plásmidos, pEX16 y pEX44, donde el grupo de genes de desulfuración son presentados solos o con el gen de la flavoproteina, frp, ligado directamente a los genes dsz y que son parte del grupo de genes dsz . La Figura 3 es una ilustración gráfica que representa el aumento en la velocidad de desulfuración de DBT cuando se emplea un plásmido que coexpresa una flavoproteina. La Figura 4 es una ilustración gráfica del perfil de elución de una flavoproteina endógena de ATCC 53968. Las Figuras 5 y 6 son ilustraciones gráficas que representan el aumento en la velocidad de desulfuración de DBT y DBT-sultona cuando la fracción que contiene la flavoproteina endógena de IGTS8 es añadida a las prepara-ciones enzimáticas de DSZ aisladas de E. coli portadora de los genes dsz . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En las técnicas de la extracción y la refinería del petróleo, se entiende en general que el término "azufre orgánico" hace referencia a moléculas orgánicas que tienen un marco hidrocarbonado al que se unen covalentemente uno o más átomos de azufre (llamados heteroátomos) . Estos átomos de azufre pueden estar unidos directamente al marco hidrocarbonado, por ejemplo, por uno o más enlaces carbono-azufre, o pueden estar presentes en un substituyente unido al marco hidrocarbonado de la molécula, por ejemplo un grupo sulfonilo (que contiene una unión covalente carbono-oxigeno-azufre) . A veces, se hace referencia a la clase general de moléculas orgánicas que tienen uno o más heteroátomos de azufre como "compuestos organoazufrados" . La porción hidrocarbonada de estos compuestos puede ser alifática, aromática o parcialmente alifática y parcialmente aromática. Se hace referencia a los compuestos organoazufrados multiciclicos cíclicos o condensados en los que uno o más heteroátomos de azufre están unidos a átomos de carbono adyacentes en el marco hidrocarbonado por enlaces aromáticos carbono-azufre como "heterociclos portadores de azufre". Se hace referencia al azufre que está presente en muchos tipos de heterociclos portadores de azufre como "azufre tiofénico", en vista del anillo aromático de cinco miembros en el que está presente el heteroáto o de azufre. El más simple de estos heterociclos portadores de azufre es tiofeno, que tiene la composición C4H4S. Se sabe que los heterociclos portadores de azufre son estables a los tratamientos convencionales de desulfuración, tales como la hidrodesulfuración (HDS) . Los heterociclos portadores de azufre pueden tener estructuras químicas relativamente simples o relativamente complejas. En los . heterociclos complejos, están presentes múltiples anillos aromáticos condensados, uno o más de los cuales puede ser heterociclico. La dificultad de la desulfuración aumenta con la complejidad estructural de la molécula. Es decir, el comportamiento refractario es más acentuado en los heterociclos portadores de azufre complejos, tales como dibenzotiofeno (DBT, C?2H8S) . El DBT es un heterociclo portador de azufre que tiene una estructura de anillo aromático múltiple y condensado, en la que un anillo tiofénico de cinco miembros está flanqueado por dos anillos bencílicos de seis miembros. Gran parte del azufre orgánico post-HDS residual en los intermediarios del refinado del combustible fósil y productos combustibles es azufre tiofénico. La mayoría de este azufre tiofénico residual está presente en el DBT y derivados del mismo que tienen uno o más grupos alquilo o arilo unidos a uno o más átomos de carbono presentes en uno o ambos anillos bencílicos flanqueantes. El DBT en si mismo es aceptado en las técnicas relevantes como compuesto modelo ilustrativo del comportamiento de la clase de compuestos que incluyen al DBT y a sus derivados en las reacciones en las que participa el azufre tiofénico. Monticello y Finnerty, Annual Reviews in Microbiology 39: 371-389 (1985), en 372-373. El DBT y sus derivados pueden representar un porcentaje significativo del contenido total en azufre de aceites crudos particulares, carbones y bitu en. Por ejemplo, se ha dicho que estos heterociclos portadores de azufre representan hasta un 70% en peso del contenido total en azufre del aceite crudo del Oeste de Texas y hasta un 40% en peso del contenido total en azufre de algunos aceites crudos del Oriente Medio. Asi, el DBT es considerado como particularmente importante como compuesto modelo para las formas de azufre tiofénico encontradas en los combustibles fósiles, tales como aceites crudos, carbones o bitumen de un origen geográfico particular, y varios intermediarios de refinería y productos combustibles fabricados a partir de los mismos. Id. Otra característica del DBT y sus derivados es que, después de una liberación de combustible fósil al ambiente, estos heterociclos portadores de azufre persisten durante largos períodos de tiempo sin biodegradación significativa. Gundlach y col., Science 221 : 122-129 (1983). De este modo, los microorga-nismos más prevalentes que aparecen de forma natural no metabolizan con eficacia y rompen los heterociclos portadores de azufre. Un combustible fósil adecuado para el trata-miento de desulfuración según la presente invención es uno que contiene azufre orgánico. Se hace referencia a dicho combustible fósil como "combustible fósil substrato". Los combustibles fósiles substrato que son ricos en azufre tiofénico son particularmente adecuados para desulfuración según el método aquí descrito. Como ejemplos de dichos combustibles fósiles substrato se incluyen los aceites crudos pesados de Cerro Negro u Orinoco; el alquitrán de Athabascan y otros tipos de bitumen; fracciones de la refinería del petróleo tales como aceite de ciclo ligero, gasóleo atmosférico pesado y aceite diesel N° 1, y líquidos derivados del carbón fabricados a partir de fuentes tales como carbón Pocahontas #3, Lewis-Stock, Australian Glencoe o Wyodak. La desulfuración biocatalítica (biocatálisis o DSB) es la excisión (liberación o eliminación) de azufre de compuestos organoazufrados, incluyendo compuestos órgano-azufrados refractarios tales como heterociclos portadores de azufre, como resultado de la excisión oxidativa selectiva de enlaces carbono-azufre en dichos compuestos por un biocatalizador. El tratamiento DSB da lugar al marco hidrocarbonado combustible desulfurado del primer compuesto organoazufrado refractario, junto con substancias azufradas inorgánicas que pueden ser fácilmente separadas unas de otras por técnicas conocidas, tales como la destilación fraccionada o la extracción acuosa. Por ejemplo, el DBT es convertido en hidroxibifenilo cuando es sometido a tratamiento DSB. La DSB es llevada a cabo por un biocatalizador consistente en uno o más organismos no humanos (por ejemplo, microorganismos) que expresan funcionalmente una o más enzimas que dirigen, aisladamente o en todas en conjunto, la eliminación de azufre de los compuestos organoazufrados, incluyendo heterociclos portadores de azufre, mediante la excisión selectiva de enlaces carbono-azufre en dichos compuestos; una o más enzimas obtenidas de dichos microorganismos; o una mezcla de dichos microorganismos y enzimas. Se hace aquí referencia a los organismos que exhiben actividad biocatalítica como Dsz+. Se hace aquí referencia a los organismos que carecen de actividad biocatalítica como Dsz". La invención se relaciona con la mejor eliminación de azufre de los combustibles fósiles que contienen moléculas de azufre orgánico, consistente en añadir una cantidad mejoradora de la velocidad de una flavoproteína al biocatalizador capaz de desazufrar el combustible fósil para facilitar o aumentar el transporte de electrones al sitio catalítico. Los biocatalizadores capaces de desazufrar los combustibles fósiles aquí empleados son, en general, conocidos en la técnica. Se incluyen microorganismos (viables y no viables, recombinantes y no recombinantes) y preparaciones enzimáticas. Varios investigadores han publicado la modificación genética de bacterias de origen natural en cepas mutantes capaces de catabolizar el DBT. Kilbane, J.J., Resour. Cons . Recycl . 3: 69-79 (1990); Isbister, J.D. y R.C. Doyle, Patente EE.UU. N° 4.562.156 (1985) y Hartdegan, F.J. y col., Chem. Eng. Progress 63-67 (1984) . En su mayor parte, estos mutantes desulfuran el DBT de manera inespecí-fica y liberan azufre en forma de pequeños productos de destrucción de azufre orgánico. Así, una porción del valor combustible del DBT se pierde a través de esta acción microbiana. Isbister y Doyle describieron la derivación de una cepa mutante de Pseudomonas que parecía ser capaz de liberar azufre del DBT de manera selectiva, pero no elucidaron el mecanismo responsable de esta reactividad. Kilbane ha informado sobre la mutagénesis de un cultivo bacteriano mixto, produciendo uno que parecía capaz de liberar selectivamente azufre de DBT por la ruta oxidativa. Este cultivo estaba compuesto de bacterias obtenidas de fuentes naturales tales como fangos cloacales, agua de desecho de la refinería del petróleo, suelo de jardín, suelo contaminado con alquitrán de carbón, etc. y mantenidas en cultivo en condiciones de continua depriva-ción de azufre en presencia de DBT. El cultivo fue entonces expuesto al mutágeno químico l-metil-3-nitro-l-nitrosogua-nidina. El producto catabólico principal del metabolismo del DBT por este cultivo mutante era hidroxibifenilo; el azufre era liberado como sulfato hidrosoluble inorgánico y la porción hidrocarbonada de la molécula permanecía esencialmente intacta como monohidroxibifenilo. Kilbane, J.J., Resour. Cons. Recycl. 3: 69-79 (1990), cuyas enseñanzas son aquí incorporadas a modo de referencia. Kilbane ha aislado también una cepa mutante de Rhodococcus de este cultivo bacteriano mixto. Este mutante, IGTS8 o ATCC N° 53968, es un biocatalizador particularmente preferido para uso en la presente invención. El aislamiento y las características de este mutante son descritas con detalle en J.J. Kilbane, Patente EE.UU. N° 5.104.801, cuyas enseñanzas son aquí incorporadas a modo de referencia. Este microorganismo ha sido depositado en la American Type Culture Collection (ATCC) , 12301 Park Lawn Drive, Rockvi-lie, Maryland, EE.UU. 20852, bajo los términos del Tratado de Budapest, y ha sido denominado como ATCC N° de Depósito 53968. Una preparación adecuada de biocatalizador ATCC N° 53968 es un cultivo de los microorganismos vivos, preparado en general como se describe en la Patente EE.UU. N° 5.104.801, y mutantes o derivados de los mismos. También se pueden usar preparaciones enzimáticas libres de células obtenidas de ATCC N° 53968 o mutantes del mismo, en general como se describe en las Patentes EE.UU. N° 5.132.219 y 5.358.870. En el presente método para la desulfuración biocatalítica (DSB) , se emplea el agente biocatalítico ATCC N° 53968 en un procedimiento continuo de desulfuración para el tratamiento de un líquido e petróleo en el que las moléculas de azufre orgánico refractarias a HDS, tales como los heterociclos aromáticos portadores de azufre, constituyen una porción significativa del contenido total en azufre orgánico. Existen al menos dos posibles tipos de rutas que dan lugar a la liberación específica de azufre a partir del DBT: oxidativa y reductora. Preferiblemente, se puede seguir una ruta oxidativa (aerobia) . Como ejemplos de microorganismos que actúan por esta ruta oxidativa, cuyas preparaciones son adecuadas para uso como biocatalizador de la presente invención se incluyen el consorcio microbiano (una mezcla de varios microorganismos) descrito en Kilbane (1990), 3 RESOUR. CONSERV. RECYCL. 69-79, los microorganismos descritos por Kilbane en las Patentes EE.UU. N° 5.002.888 (concedida el 26 de Marzo de 1991), 5.104.801 (concedida el 14 de Abril de 1992), 5.344.778, 5,132.219, 5.198.341, 5.356.813, 5.356.801, 5.358.870 [también descrita en Kilbane (1990), Biodesulfurization : Future Prospects in Coal Cleaning, en PROC, 7TH ANN. INT'L.

PITTSBURGH COAL CONF. 373-382] Y 5.198.341 (concedida el 30 de Marzo de 1993), y por Omori y col. (1992), Desulfuriza-tion of dibenzothiophene by Coryneba c t eri m , sp. strain SY1 , 58 APPL. ENV. MICROBIOL. (N° 3) 911-915, e Izumi y col., Applied and Environmental Microbiology 60 : 223-226 (1994), todas aquí incorporadas a modo de referencia. Cada uno de los microorganismos anteriores puede funcionar como biocatalizador en la presente invención, ya que produce una o más enzimas (biocatalizadores proteicos) que llevan a cabo la(s) reacción (es) química (s) específica (s) mediante la(s) cual (es) el azufre es separado de los compuestos organoazufrados refractarios. Lehninger, PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY ( orth Publishers, Inc., 1982), p. 8-9; cf. Zobell, en la Patente EE.UU. 2.641.564 (conce-dida el 9 de Junio de 1953) y Kern y col., en la Patente EE.UU. N° 5.094.668 (concedida el 10 de Marzo de 1992). También se pueden usar derivados mutacionales o de ingeniería genética de cualquiera de los microorganismos precedentes, como queda ejemplificado por las patentes EE.UU. citadas anteriormente, como el biocatalizador aquí empleado, siempre que se mantenga la función biocatalítica apropiada. Microorganismos adicionales adecuados para uso como biocatalizador o fuente de biocatalizador en el procedimiento de desulfuración ahora descrito pueden derivar de microorganismos naturales mediante técnicas conocidas. Como se ha indicado antes, estos métodos implican el cultivo de preparaciones de microorganismos obtenidos de fuentes naturales tales como fangos cloacales, agua de desecho de la refinería del petróleo, suelo de jardín o suelo contaminado con alquitrán de carbón en condiciones de cultivo selectivo en las cuales crecen los microorganismos en presencia de compuestos organoazufrados refractarios tales como heterociclos portadores de azufre como única fuente de azufre; la exposición de la preparación microbiana a mutágenos químicos o físicos; o una combinación de estos métodos. Dichas técnicas son descritas por Isbister y Doyle en la Patente EE.UU. N° 4.562.156 (concedida el 31 de Diciembre de 1985) ; por Kilbane en 3 RESOUR. CONSERV. RECYCL . 69-79 (1990), en las Patentes EE.UU. N° 5.002.888, 5.104.801 y 5.198.341, y por Omori y colaboradores en 58 APPL. ENV. MICROBIOL. (N° 3) 911-915 (1992), todas incorporadas a modo de referencia. Tal como se ha explicado anteriormente, las enzimas son biocatalizadores proteicos fabricados por las células vivas. Las enzimas promueven, dirigen o facilitan la aparición de una reacción química específica o de una serie de reacciones (a las que se hace referencia como ruta) sin consumirse ellas mismas como resultado de éstas. Las enzimas pueden incluir una o más cadenas polipeptídicas no modificadas o modificadas post-traducción o sintética-mente o fragmentos o porciones de las mismas, coenzimas adicionales, cofactores o correactivos que catalizan de manera colectiva la reacción o serie de reacciones deseada. La reacción o serie de reacciones relevante para la presente invención culmina en la excisión de azufre del marco hidrocarbonado de un compuesto organoazufrado refractario, tal como un heterociclo portador de azufre. El marco hidrocarbonado del primer compuesto organoazufrado refractario permanece substancialmente intacto. Los microorganismos o enzimas empleados como biocatalizadores en la presente invención no consumen, ventajosamente, el marco hidrocarbonado del primer compuesto organoazufrado refractario como fuente de carbono para el crecimiento.

Como resultado de ello, el valor combustible de los combustibles fósiles substrato expuestos a tratamiento DSB no resulta deteriorado. Aunque se pueden usar microorganismos vivos (por ejemplo, un cultivo) como biocatalizador aquí, no es necesario. Las preparaciones enzimáticas biocatalíticas que resultan útiles en la presente invención incluyen lisados, extractos, fracciones, subfracciones o productos purificados microbianos obtenidos por medios convencionales y capaces de llevar a cabo la función biocatalítica deseada. En general, dichas preparaciones enzimáticas están substancialmente libres de células microbianas intactas. Kilbane y Monticello describen preparaciones enzimáticas que son adecuadas para uso aquí en la Patente EE.UU. N° 5.132.219 (concedida el 21 de Julio de 1992) y 5.358.870 (presentada el 11 de Junio de 1992), por ejemplo. Rambosek y col. describen microorganismos recombinantes y preparaciones enzimáticas, obtenidos por ingeniería a partir de Rhodococcus sp. ATCC N° 53968 y adecuados para uso aquí en la Patente EE.UU. 5.356.813. Las preparaciones biocatalíticas enzimáticas adecuadas para uso aquí pueden ser eventualmen-te fijadas a un soporte sólido, por ejemplo una membrana, un filtro, una resina polimérica, partículas o perlas de vidrio o partículas o perlas de cerámica. El uso de preparaciones enzimáticas inmovilizadas facilita la separación del biocatalizador del combustible fósil tratado que ha sido liberado de compuestos organoazufrados refractarios . En la etapa de desulfuración biocatalítica, el combustible fósil líquido que contiene heterociclos portadores de azufre es combinado con el biocatalizador y flavoproteína. Las cantidades relativas de biocatalizador y flavoproteína y combustible fósil líquido pueden ser ajustadas para que se adapten a condiciones particulares o para producir un nivel particular de azufre residual en el combustible fósil tratado profundamente desulfurado. La cantidad de preparación biocatalizadora que ha de ser combinada con una cantidad dada de combustible fósil líquido reflejará la naturaleza, concentración y actividad específica del biocatalizador en particular utilizado, así como la naturaleza y abundancia relativa de compuestos de azufre inorgánicos y orgánicos presentes en el combustible fósil substrato y el grado de desulfuración profundo buscado o considerado como aceptable. La actividad específica de un biocatalizador dado es una medida de su actividad biocatalítica por unidad de masa. Así, la actividad específica de un biocatalizador en particular depende de la naturaleza o identidad del microorganismo utilizado o empleado como fuente e enzimas biocatalíticas, así como los procedimientos usados para la preparación y/o almacenamiento de la preparación biocatali-zadora. La concentración de un biocatalizador concreto puede ser ajustada como se desee para uso en circunstancias particulares. Por ejemplo, cuando se utiliza un cultivo de microorganismos vivos (por ejemplo, ATCC N° 53968) como preparación biocatalizadora, se puede inocular un medio de cultivo adecuado que carezca de una fuente de azufre distinta de heterociclos portadores de azufre con microorganismos adecuados y fermentarlo hasta alcanzar una densidad de cultivo deseada. El cultivo resultante puede ser diluido con medio adicional u otro tampón adecuado, o las células microbianas presentes en el cultivo pueden ser retiradas, por ejemplo, por centrifugación y resuspendidas a una concentración mayor que la del cultivo original. Las concentraciones de microorganismo y biocatalizador enzimá-tico pueden ser ajustadas de forma similar. De este modo, se pueden obtener volúmenes apropiados de preparaciones biocatalizadoras que tengan actividades específicas y/o concentraciones predeterminadas. Las flavoproteínas que pueden ser aquí empleadas incluyen las generalmente conocidas en la técnica. Las flavinas incluyen flavina mononucleótido (FMN) o flavina adenina dinucleótido (FAD) . Las flavoproteínas incluyen flavina reductasa o FMN reductasa. Las flavoproteínas, tales como la flavina reductasa o, más preferiblemente, la FMN reductasa, pueden ser usadas directamente tal como se encuentran en la naturaleza (por ejemplo, una fracción microbiana que contenga la flavoproteína) , pueden ser obtenidas comercialmente o pueden ser preparadas recombi-nantemente. Por ejemplo, se da la secuencia de ADN de la flavina reductasa de Vibrio en Lei y col., J. Bacter. 1 76 (12) : 3552-3558 (1994) y puede ser usada para transformar un microorganismo hospedador adecuado, tal como se conoce en la técnica y se discute en la Patente EE.UU. N° 5.356.801, por ejemplo. Alternativamente, la flavoproteína puede ser la endógena al biocatalizador de desulfuración, tal como la fracción libre de células descrita a continuación. En otra realización, la flavoproteína puede ser sobreexpresada por el microorganismo de desulfuración (tal como IGTS8) . Esto puede ser llevado a cabo, por ejemplo, por mutagénesis. Como mutágenos adecuados se incluyen la radiación, por ejemplo radiación ultravioleta, y los mutágenos químicos, tales como N-metil-N' -nitrosoguanidina, hidroxilamina, metanosulfonato de etilo y ácido nitroso. La mutagénesis puede ser realizada según los métodos general-mente conocidos en la técnica. Cuando la flavoproteína es recombinante, la proteína puede ser hecha in si tu, tal como mediante adición de un microorganismo recombinante que contenga una secuen-cia de ADN que codifique para la flavoproteína. En una realización particularmente preferida, el microorganismo recombinante codificante de la flavoproteína posee también las enzimas capaces de desazufrar el combustible fósil. Por ejemplo, el ADN codificante de la flavoproteína puede ser transformado en IGTS8 u otro microorganismo capaz de desazufrar un combustible fósil. En otro ejemplo, el ADN codificante de la flavoproteína es simultánea o independientemente transformado en una célula huésped común con el ADN codificante del biocatalizador de desulfuración. El ADN codificante de la flavoproteína puede estar, por ejemplo, bajo el control del mismo o de diferente promotor que el ADN codificante del biocatalizador capaz de desazufrar el combustible fósil. En una realización, el ADN de la flavoproteína es incorporado o ligado al grupo de genes de desulfuración u operón de IGTS8. La flavoproteína es añadida a la mezcla de reacción en una cantidad potenciadora de la velocidad. Tal como se define aquí, "una cantidad potenciadora de la velocidad" es una cantidad que aumenta significativamente la velocidad de desulfuración del biocatalizador, como se obtiene originalmente. Por ejemplo, cuando el biocatalizador es IGTS8, una fracción libre de células o preparación enzimática purificada del mismo, una "cantidad potenciadora de la velocidad" de flavoproteína es una cantidad de flavoproteína que, además de la inherentemente presente en el biocatalizador tal como es obtenido, aumentará significativamente la velocidad de desulfuración. La velocidad de desulfuración puede ser aumentada, por ejemplo, en al menos un 25%, un 50% o un 100% en comparación con la velocidad empleando el catalizador per se. Tal como se ha resumido anteriormente, la invención aquí descrita se relaciona en un aspecto con una molécula de ADN o fragmento de la misma que contiene un gen o genes que codifican para una flavoproteína y/o un biocatalizador capaz de desazufrar un combustible fósil que contiene compuestos organoazufrados. La molécula de ADN o fragmento de la misma puede ser ADN purificado y aislado obtenido de, por ejemplo, una fuente natural, o puede ser ADN recombinante (heterólogo o extraño) , que está presente, por ejemplo, en un organismo hospedador no humano. La siguiente descripción, que no ha de ser interpretada como limitante de la invención en modo alguno, pero que se presenta con fines ilustrativos, narra el aislamiento del ADN codificante de un biocatalizador desulfurante a partir de una cepa de Rhodococcus sp. ATCC N° 53968, que se sabe expresa una actividad biocatalítica adecuada. Esta cepa preferida de Rhodococcus está descrita en la Patente EE.UU. N° 5.104.801 (concedida en 1992), cuyas enseñanzas son aquí incorporadas a modo de referencia, y se ha hecho referencia a ella en la literatura como IGTS8. Otros organismos que se sabe expresan una actividad biocatalítica adecuada y que, por lo tanto son vistos como fuentes adecuadas del ADN de la presente invención incluyen la cepa de Bacill us sphaeri -cus descrita en la Patente EE.UU. 5.002.888 y depositada en la American Type Culture Collection como ATCC N° 53969 y la cepa de Corynebacteri um descrita en Omori y col., Appl . Env. Microbiol . 58 (3) : 911-915 (1992). Cepas mutantes de Rhodococcus que son incapaces de excindir enlaces carbono-azufre (Dsz") son producidas exponiendo a una cepa de Rhodococcus, por ejemplo, ATCC N° 53968, que exhibe actividad biocatalítica, a un mutágeno en condiciones apropiadas, que son conocidas o fácilmente asimilables por los expertos en la técnica. Como mutágenos adecuados se incluyen la radiación, por ejemplo radiación ultravioleta, y los mutágenos químicos, por ejemplo N-metil-N'-nitronitrosoguanidina (NTG) , hidroxilamina, metanosulfonato de etilo (MSE) y ácido nitroso. Se deja que los mutantes así formados crezcan en un medio apropiado y se les estudia en cuanto a actividad de excisión de enlaces carbono-azufre. Un método de estudio que permite una detección exacta de actividad de excisión de enlaces carbono-azufre es adecuado en el método de la presente invención. Como métodos adecuados de estudio de esta actividad se incluyen la exposición de los diferentes mutantes a moléculas que contienen enlaces carbono-azufre (por ejemplo, DBT) y la medición de la excisión de enlaces carbono-azufre. En una realización preferida, los mutantes son expuestos a DBT, de tal manera que se produce el producto de desintegración, el hidroxibifenilo (HBF) , que emite fluorescencia en luz ultravioleta de onda corta. El HBF puede ser también detectado colorimétricamente a través de su producto de reacción azul con reactivo de Gibbs. Otros métodos incluyen la cromatografía gaseosa y líquida, la espectrometría de infrarrojos y de resonancia magnética nuclear. Véase Kodama y col., Applied and Environmental Microbiology, pp. 911-915 (1992) y Kilbane y Bielaga, Final Report D.O.E. Contract N° DE-AC22-88PC8891 (1991) . Una vez son identificados y aislados los mutantes Dsz", sus clones son propagados usando técnicas standard y sometidos a posterior análisis. De forma concurrente con la mutagénesis del cultivo anteriormente descrito del organismo Dsz+, Rhodococcus, se mantiene un segundo cultivo del mismo organismo Dsz+ en cultivo. El ADN del organismo Dsz+ es extraído de este cultivo de Rhodococcus . Son adecuados diversos métodos de extracción del ADN para aislar el ADN de este organismo. Como métodos adecuados se incluyen la extracción con fenol y cloroformo. Véase Maniatis y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual , 2", Cold Spring Harbor Laboratory Press, pg. 16.54 (1989), a la que en adelante se hace referencia aquí como Maniatis y col. Una vez se extrae el ADN de Rhodococcus, el ADN es cortado en fragmentos de varias longitudes de kilobases, que, tras el clonaje en un vector lanzadera plasmídico adecuado constituyen de forma colectiva una librería de ADN. Se pueden usar varios métodos de fragmentación del ADN de Rhodococcus para purificar el ADN del mismo, incluyendo el ADN de la presente invención, por ejemplo métodos enzimáticos y mecánicos. Cualquier endonucleasa de restricción de reconocimiento de cuatro bases, tal como TaQI o Sau 3A, es adecuada para fragmentar el ADN. Se pueden encontrar métodos adecuados de fragmentación de ADN en Maniatis y col . Los diversos fragmentos de ADN son insertados en varios clones mutantes Dsz" de Rhodococcus, con el fin de aislar el fragmento de ADN que codifica para el biocatalizador de la presente invención. La transformación de una célula previamente mutante Dsz" en una célula transformada Dsz+ es evidencia de que el fragmento de ADN insertado codifica para un biocatalizador. Cualquier método de inserción de ADN en Rhodococcus que permita la captación y expresión de dicho fragmento es adecuado. En una realización preferida, la electroporación es utilizada para introducir el fragmento de ADN en Rhodococcus . Véase Maniatis y col. Una vez que el mutante Dsz+ transformado ha sido producido e identificado, el fragmento de ADN que codifica para el biocatalizador Dsz+ puede ser identificado y aislado. El biocatalizador codificado puede ser entonces producido usando el ADN aislado en diversos métodos que son bien conocidos y fácilmente disponibles para los expertos en la técnica. Además, el ADN aislado puede ser secuenciado y replicado por técnicas conocidas y/o ligado a ADN codificante de una flavoproteína que emplea, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis y col. Tal como se ha observado previamente, el método anteriormente descrito para aislar el ADN de la presente invención puede ser aplicado a organismos Dsz+ distintos de microorganismos Rhodococcus, por ejemplo, de la cepa ATCC N° 53968. Así, se puede usar Bacill us sphaericus ATCC N° 53969 o Corynejacteriuip sp. Se puede usar SY1 como la fuente de organismos para el ADN de la presente invención. Más aún, una vez aislado, el ADN de la presente invención puede ser transformado en un organismo hospedador no humano distinto de un mutante Dsz" de la fuente de organismos. De este modo, el ADN de la" presente invención puede ser transformado en, por ejemplo, una cepa adecuada de bacte-rias Escherichia coli . Otros tipos de organismo hospedador no humano pueden ser también utilizados, incluyendo organismos unicelulares (por ejemplo, levaduras) y células establecidas en cultivo a partir de organismos multicelulares. Otros métodos de aislamiento del ADN de la presente invención incluyen variaciones del estudio descrito anteriormente. Por ejemplo, se pueden usar fragmentos de secuencias del grupo de genes IGTS8 como sondas de hibridación para identificar moléculas de ADN similares. Las técnicas aquí descritas pueden ser también utilizadas para aislar y clonar ADN que codifica para una flavoproteína, tal como la flavoproteína endógena de IGTS8. La molécula de ADN recombinante o fragmento de la misma de la presente invención pretende incluir cualquier ADN que resulte de la inserción en su cadena, por medios químicos o biológicos, de uno o más genes codificantes de un biocatalizador capaz de excindir selectivamente los enlaces carbono-azufre y una flavoproteína, no estando dicho gen originalmente presente en esa cadena. El ADN recombinante incluye cualquier ADN sintetizado por procedimientos que utilizan nucleasas de restricción, hibridación de ácidos nucleicos, clonaje de ADN, síntesis de ADN o cualquier combinación de los anteriores. Se pueden encontrar métodos de construcción en Maniatis y col. y en otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los procedimientos para la construcción de los plásmidos de ADN o vectores de la presente invención incluyen los descritos en Maniatis y col. y otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los términos "plásmido de ADN" y "vector" pretenden incluir cualquier plásmido o vector competente en replicación capaz de tener ADN extraño o exógeno insertado en él por medios químicos o biológicos y, posteriormente, cuando se transforman en un organismo hospedador no humano apropiado, capaz de expresar el producto del inserto de ADN extraño o exógeno (es decir, de expresar el biocatalizador y la flavoproteína de la presente invención) . Además, el plásmido o vector debe ser receptivo a la inserción de una molécula de ADN o fragmento de la misma que contiene el gen o genes de la presente invención, codificando dicho gen o genes para un biocatalizador que excinde de manera selectiva los enlaces carbono-azufre en compuestos organoazufrados. Los procedimientos para la construcción de vectores plasmídicos de ADN incluyen los descritos en Maniatis y col. y otros conocidos por los expertos en la técnica. Los plásmidos de la presente invención incluyen cualquier fragmento de ADN que contenga un gen o genes codificantes de una flavoproteína y/o un biocatalizador que excinde de manera selectiva los enlaces carbono-azufre en compuestos organoazufrados. El término "plásmido" pretende abarcar cualquier fragmento de ADN. El fragmento de ADN debe ser transmisible, por ejemplo, a un microorganismo hospedador por transformación o conjugación. Los procedimientos para la construcción o extracción de plásmidos de ADN incluyen los descritos en Maniatis y col y otros conocidos por los expertos en la técnica. Los organismos hospedadores no humanos trans-formados de la presente invención pueden ser creados por diversos métodos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar la electroporación, según explican Maniatis y col. Mediante el término "organismo hospedador no humano" se entiende cualquier organismo no humano capaz de la captación y expresión de ADN extraño, exógeno o recombinante. Preferiblemente, el organismo hospedador es una bacteria, más preferiblemente un pseudo-monas . El método de desulfuración de un combustible fósil de la presente invención implica dos aspectos. En primer lugar, un organismo hospedador o preparación biocatalítica obtenida del mismo es puesto en contacto con un combustible fósil que ha de ser desulfurado. Esto puede ser realizado en cualquier recipiente apropiado, eventual-mente equipado con un dispositivo de agitación o mezcla. La mezcla es combinada por completo y se la deja incubar durante un tiempo suficiente como para permitir la excisión de un número significativo de enlaces carbono-azufre en compuestos organoazufrados, produciendo de este modo un combustible fósil desulfurado. En una realización, se produce una emulsión o microemulsión acuosa con un cultivo acuoso del organismo o fracción enzimática y el combustible fósil, dejando que el organismo se propague en la emulsión mientras que el biocatalizador expresado excinde los enlaces carbono-azufre. Las variables, tales como la temperatura, la velocidad de mezcla y la velocidad de desulfuración variarán según el biocatalizador del organismo y/o de la flavoproteína utilizados. Los parámetros pueden ser determinados a través de no más que una experimentación rutinaria. Se conocen bien varias técnicas adecuadas para la monitorización de la velocidad y el grado de desulfuración y son de fácil adquisición para los expertos en la técnica. Se pueden recoger muestras para línea base y curso temporal de la mezcla de incubación y se las puede preparar para una determinación del azufre orgánico residual en el combustible fósil. La desaparición del azufre de compuestos organoazufrados, tales como DBT, en la muestra que está siendo sometida a tratamiento biocatalítico puede ser monitorizada usando, por ejemplo, fluorescencia de rayos X (FRX) o espectrometría de emisión atómica (espectrometría de llama) . Preferiblemente, los componentes moleculares de la muestra son primeramente separados, por ejemplo, por cromatografía de gases. El procedimiento y las composiciones biocatalíticas (incluyendo los microorganismos recombinantes) de la invención reivindicada dan lugar a un perfeccionamiento significativo e inesperado sobre los precedimientos de desulfuración previamente descritos. Se ha visto que el uso de la flavoproteína puede dar lugar a un perfeccionamiento de aproximadamente 100 veces en la velocidad de reacción en comparación con un sistema en el que no se añade flavopro-teína adicional. Esto es particularmente inesperado en vista de las recientes descripciones en la literatura, que sugieren que el FAD se une directamente a DSZC (Denome y col., J. Bacteriol., 176: 6707-6716, 1994) y la sugerencia de que el NADH es el único cofactor necesario para el sistema (Ohshiro y col., FEMS Microbiol. Lett. 118:341-344, 1994) . Sin limitarse a ningún mecanismo concreto, se cree que la ruta de la reacción de desulfuración es como se indica a continuación: HBPSi Sin limitarse a ninguna teoría en particular, se cree que la flavoproteína es una corta cadena de transporte de electrones para pasar los equivalentes reductores del NADH (u otro donante de electrones) a las enzimas, DSZC (o Sox C) y/o DSZA (o Sox A) . Se cree que la enzima DSZC es responsable de la biocatálisis de la reacción de oxidación de DBT a DBT02. Se cree que la enzima DSZA es responsable de la reacción de DBT02 a fenol-fenilsulfito (FFS) . Como tal, es particularmente preferido añadir el cofactor, FMN, al medio de reacción, así como un donante de electrones, NADH o NADPH. La elección de NADH o NADPH, por ejemplo, --depende de la flavoproteína seleccionada, tal como se conoce en la técnica. En los ejemplos siguientes, se empleó NADPH cuando se utilizó la flavoproteína de Vijrio. También se prefiere la adición de un sistema de regeneración de NADH o NADPH para convertir el NAD+ en NADH, según métodos conocidos en la técnica. La invención será ahora ilustrada por medio de los siguientes ejemplos. EJEMPLOS Ejemplo 1: FMN aumenta la actividad in vitro de DSZ Materiales y métodos: Se recogieron 15 mi de bacterias de IGTS8 crecidas en un medio de sales básales a 30°C a una A6oo de aproximadamente 10 por centrifugación y se las resuspendió en 4 mi de tampón fosfato de sodio 0,1 M a pH 7,5. Las células fueron usadas por dos pasajes a través de una célula de presión Francesa a 17.000 psi. Se añadió el detergente CHAPS al usado celular a una concentración final del 0,1%. Se puso entonces esta mezcla sobre hielo durante 15 minutos y se centrifugó a 15.000 xg durante 15 minutos. Se utilizó la fracción de sobrenadante en ensayos enzimáticos libres de células. Las mezclas de reacción enzimática contienen todos o algunos de los siguientes componentes: DBT 1,0 mM, NADH 3,2 mM, lecitina 1% (para aumentar la solubilidad de DBT en esta mezcla acuosa) , FAD o FMN 5 µM y el extracto proteico celular descrito anteriormente en concentraciones que varían entre 0,1 y 1,0 mg/ml. El volumen total de reacción era de 0,6 mi y las reacciones fueron incubadas a 30°C con agitación durante 1 hora antes de ser detenidas por adición de 1 mi de acetonitrilo. Se centrifugó entonces la mezcla y se analizó una porción del sobrenadante por CLAR para una concentración de 2-HBP frente a patrones conocidos. Se determinó la concentración de proteína por medio del kit de ensayo para proteínas de Biorad (Hercules, CA) . Resultados: Según muestran Ohshiro y col. {FEMS Microbiol . Lett . 18 : 341-344 (1994)), la conversión de DBT a 2-HBP depende de la adición de equivalentes reductores en forma de NADH a una mezcla de reacción in vi tro (Tabla 1) . Estos autores, sin embargo, dijeron que ningún otro cofactor era activo en esta reacción. Tabla 1. Requerimiento de mononucleótido de flavina (FMN) - Desulfuración de DBT por IGTS8 Productos a Las condiciones de reacción son como se ha expuesto antes, excepto en que la concentración de proteína era de 1, 6 mg/ml . Si se diluye un extracto bruto de proteína de IGTS8 preparado como antes a aproximadamente 0,16 mg/ml de concentración de proteína, el extracto pierde su capacidad para producir 2-HBP a partir de DBT en presencia de NADH solo. En este caso, la adición de FMN (mononucleótido de flavina) a la mezcla de reacción restaura su capacidad. La adición de FAD (dinucleótido de flavina y adenina) no tiene efecto (Tabla 1) . La diálisis del extracto tiene el mismo efecto (pérdida de actividad de desulfuración y con restauración mediante la adición de FMN y NADH) . Estos resultados muestran que tanto el NADH como el FMN partici-pan en la desulfuración y que pueden estar presentes juntos para que proceda la reacción. Ejemplo 2: Una FMN reductasa dependiente de NADPH heterólo-ga purificada aumenta la actividad Dsz de extractos de IGTS8 Los resultados de los experimentos descritos en el Ejemplo 1 sugieren la participación de una reductasa que contiene flavina (tal como FMN) en la desulfuración de DBT catalizada por IGTS8. Con objeto de estudiar esta hipótesis hicimos la reacción DBT -» 2-HBP en presencia de una FMN reductasa heteróloga purificada. Materiales y métodos: Se preparó un usado proteico bruto de células IGTS8 esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. La concentración de proteína en este extracto era de 12,7 mg/ml. Con objeto de medir la actividad de desulfuración de este extracto, se añadieron DBT 67 µM y NADPH 5 mM a 300 µl de éste, junto con cantidades variables de una FMN reductasa NADPH-dependiente purificada a partir de Vibrio harveyi (Lei y col., anteriormente citado). Una unidad de la reductasa tal como se usa aquí catalizará la reducción de 1 µmol de FMN por minuto usando NADPH como substrato. Resultados: Cuando se añaden 0 a 0,090 unidades de la reductasa de V. harveyi a 300 µl de mezcla de reacción según se ha descrito anteriormente, existe una estimulación muy fuerte de actividad de desulfuración por la reductasa.

La adición de 0,09 unidades aumenta la actividad más de dos veces (Figura 1) . Estos resultados muestran que, en la reacción de desulfuración descrita aquí, el potencial global del extracto para catalizar la reacción es substan-cialmente mejorado mediante la adición de una reductasa que contenga flavina. Ejemplo 3: La expresión del fenotipo Dsz en E. coli es dependiente de FRP Materiales y métodos: Construcción del vector de expresión dsz pEXld El plásmido pEX16 contiene los genes szABC bajo el control transcripcional de la secuencia promotora tac de E. coli . Este plásmido fue construido a través de Las siguientes etapas: se ligó la secuencia adaptadora oligonucleotídica de ADN dúplex sintético ^ 5 ' b , en el plásmido pUC19 (Yanisch-Perron y col., Gene 33 : 103-119 (1985)), que había sido digerido con las endonucleasas EcoRI y Hind III, dando lugar al plásmido pEX13. pEX13 fue digerido entonces con endonucleasas Nsil y Bsiwl. Se aisló entonces un fragmento de restricción Nsil/Bsiwl de 4,5 kb del plásmido pTOXil (Patente EE.UU. N° 5.356.801) que contenía los genes estructurales dszABC y se ligó al ADN pEX13 digerido, dando lugar al plásmido pEX14. Se ligó una mezcla de un fragmento Bglii/Spel de 4,5 kpb de pEX14 y un plásmido de corte BAMHl/Spel pT3XI-2 (Hale, K., un derivado pKK223-3 (Pharmacia) que contenía un gen de resistencia a tetraciclina y un promotor tac) , de tal modo que el promotor tac fue orientado para dirigir la transcripción de dszABC. Este plásmido es denominado pEX16 (Figura 2) . Construcción de un plásmido codificante de DSZABC y frp Se añadió un fragmento de 0,9 kpb de ADN que contenía el gen frp (flavoreductasa) de ViJrio harveyi (Lei y col., J. Bacteriology 176: 3552-3558 (1994)) al plásmido pEX16 usando las siguientes etapas. Se digirió el plásmido pFRPI (Lei y col., (1994)) con endonucleasa de restricción Earl y los extremos fueron hechos romos con dNTP y fragmento grande de ADN polimerasa (Klenow) . Se añadió n fragmento ligante Spel de doble hebra (N.E. Biolabs) a estos extremos romos por ligadura, seguido de digestión con Spel. Se digirió entonces el plásmido pEX16 en un sitio Spel único que estaba en el extremo 3 ' del grupo de genes dszABC y se ligó con el fragmento génico frp terminado en Spel. El clon resultante que contenía los genes dszABC y frp bajo control del promotor tac es denominado pEX44 (Figura 2) . Preparación de usado celular y ensayo de actividad Dsz en extractos de E. coli portadora de pEX16 o pEX44. Se indujo a cultivos de células de E. coli (50 mi) que habían crecido a 37°C en medio YT para la expresión génica clonada mediante adición de IPTG 0,1 mM (concentra-ción final) . Las células fueron recogidas por centrifugación, resuspendidas en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,5) y lisadas por 2 pasajes a través de una célula francesa de presión a 17.000 psi. El usado fue centrifugado a 15.000 xg durante 15 minutos y la fracción de sobrenadante fue retenida para el ensayo enzimático. La mezcla de reacción contenía tampón fosfato 0,1 M, FMN 5 µM, DBT 0,67 mM, NADPH 3 mM, extracto proteico (12 mg/ml) , con un volumen final de 300 µl. Resultados : El crecimiento de E. coli en DBT como única fuente de azufre es dependiente de DSZABC y frp. IGTS8 crecerá en DBT como única fuente de azufre. Las cepas de tipo salvaje de Escherichia coli no. Más aún, cuando una cepa de E. coli portadora del plásmido pEX16, que expresa los genes dszABC, es puesta en medio de crecimiento definido que contiene DBT como única fuente de azufre, no crecerá a pesar de la fuerte expresión de todos los tres productos génicos. Sin embargo, la misma cepa de E. coli portadora del plásmido pEX 4, que expresa dszABC y frp crecerá en estas condiciones. Estos resultados muestran que la expresión heteróloga del fenotipo Dsz resulta significativamente aumentada por una proteína flavoreducta-sa. Se prepararon extractos de cepas de E. coli que contenían plásmido pEX16 o pEX 4 y se estudiaron en cuanto a la conversión de DBT a 2-HBP según se ha descrito anteriormente. Los resultados mostrados en la Figura 3 son obtenidos estableciendo que la conversión es potenciada por la presencia en el extracto del producto de expresión del gen frp, la FMN reductasa dependiente de NADPH. Ejemplo 4: Aislamiento de flavoproteina endógena de IGTS8 Métodos y materiales Cepas bacterianas y crecimiento Se hizo crecer IGTS8 hasta la fase estacionaria temprana en medio BSM/Hunters (Denome y col., Applied and Environmental Microbiology 59 (9 ( : 2837-2843 (1993)) agitando a 250 rpm a 30°C (típicamente, aproximadamente 85 horas) . Se hizo crecer E. coli MZl que contenía el plásmido pSAD267-l codificante de DSZA (Denome y col., J. Bact . 1 76: 6707-6716 (1994)) en medio BSM/Hunters suplementado con 0,4 mg mi"1 de bioti,na, 50 mg mi"1 de cada de histidina, isoleucina y valina, 100 µg mi"1 de ampicilina y Na2S04 1,5 mM. Se utilizó una única colonia de una placa de agar reciente para inocular 50 mi de cultivo líquido, que fue agitado (250 rpm) durante la noche a 30°C. Se utilizó una alícuota de 10 mi de este cultivo para inocular 500 mi del mismo medio y se hizo crecer a una D06oo de aproximadamente 0,4. En este punto, la expresión de DSZA fue inducida aumentando la temperatura a 39°C durante 2 horas y se volvió luego a 30°C hasta alcanzar una D06oo de aproximadamente 3. Típicamente, se utilizaron 3 L de cultivo celular para la purificación. Se hizo crecer E. coli MZl que contenía el plásmido pSAD269-2A codificante de DSZC (Denome y col. (1994) ) en medio LB suplementado con 100 µg mi"1 de ampicilina según se ha descrito anteriormente para MZl: :pSAD267-1. Cromatografía en columna Todas las etapas de cromatografía fueron llevadas a cabo a 4°C o sobre hielo. Se lavaron células IGTS8, cosechadas por centrifugación, una vez con EPPS 25 mM, pH 8 (tampón A) que contenía EDTA 1 mM y DTT 1 mM y se resuspendieron en EPPS 25 M, pH 8, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM y PMSF 0,15 mM. Se añadieron ADNasa y ARNasa como sólidos. Se rompieron las células en una célula Francesa de presión A #minco a 40.000 psi. Se pasó la suspensión celular a través de la prensa Francesa dos veces y se centrifugó luego a 39.800 xg durante 30 minutos a 4°C. Se desechó el "pellet" (consistente en células sin romper y restos celulares), mientras que se cargaba el sobrenadante en una columna Fast Flow de Q-Sepharose de Pharmacia (2,6 cm x 14 cm) equilibrada con tampón A que contenía un 5% de tampón B (tampón A + NaCl 2 M) a una velocidad de flujo de 2 mi min"1. La columna fue lavada extensamente con el mismo tampón a una velocidad de flujo de 5 mi min"1 hasta que la D02ßo del eluato estaba próxima a 0 y desarrolló un gradiente lineal de desde un 5% hasta un 30% de tampón B (correspondiente a NaCl 100 mM a 600 mM) a lo largo de 180 minutos. A NaCl aproximadamente 240 mM, eluyeron varias fracciones amarillentas, que exhibían actividad NADH:DCPIP oxidoreductasa. La purificación de DSZA a partir de E. coli fue llevada a cabo como sigue. Se recogieron células de E. coli crecidas como se ha descrito anteriormente por centrifugación a 6.000 rpm durante 10 minutos y se lavaron dos veces en tampón A. Las células fueron resuspendidas en el mismo tampón (volumen igual al peso húmedo de las células) , que incluía NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM, PMSF 0,15 mM y ADNasa y ARNasa y luego se rompieron en una célula Francesa de presión a 20.000 psi. Se centrifugó el lisado a 39.800 xg durante 30 minutos para eliminar las células intactas y los restos celulares. Se cargó el sobrenadante en una columna Fast Flow de Q-Sepharose de Pharmacia (2,6 cm x 14 cm) a una velocidad de flujo de 1 mi min"1. Se lavó la columna con 5% de tampón B hasta que la D028o del eluyente estaba próxima a la línea base y desarrolló un gradiente lineal de un 5% a un 25% de tampón B a lo largo de 120 minutos, a una velocidad de flujo de 5 mi min"1. Las fracciones que contenían DSZA (según se determina por DSS-EGPA) fueron reunidas y dializadas durante la noche frente a tampón A a 4°C. El dializado fue cargado en una columna Fast Flow de Blue Sepharose-6 de Pharmacia conectada en línea con una columna Resource Q de Pharmacia equilibrada con tampón A. Después de haber alcanzado una línea base estable, la columna Blue Sepharose fue desconectada y la columna Resource Q fue revelada con un gradiente lineal de desde un 2,5% hasta un 25% de tampón B durante 60 minutos, a una velocidad de flujo de 3 mi min"1. Las fracciones que contenían DSZA (según se juzgó por DSS-EGPA) fueron reunidas, se añadió glicerol a un 10% (p/v) y se guardaron a -20°C. Este procedimiento da lugar a DSZA de una pureza del 95%. Se purificó DSZC como sigue. El tampón A en este caso era BES 10 mM, pH 7,09, que contenía EDTA 1 mM. Las células fueron usadas por tratamiento con 4 mg mi-1 de lisozima a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Este tampón de lisis incluía NaCl 75 mM, DTT 1 mM y 0, 1 mg i"1 de PMSF. Después de completarse la lisis, se añadió MgCl2 hasta 5 mM y se añadieron también ADNasa y ARNasa. Se centrifugó primeramente el sobrenadante a 6.000 rpm durante 15 minutos, se desechó el pellet y se centrifugó de nuevo el sobrenadante a 39000 xg durante 1,5 horas. A continuación, se cargó el sobrenadante en una columna Resource Q de Pharmacia equilibrada con tampón A más un 3% de tampón B (tampón A con NaCl 2 M) y se lavó con diez volúmenes de columna del mismo tampón. La columna fue revelada con un gradiente lineal de desde NaCl 60 mM hasta NaCl 500 mM (3 a 25% de tampón B) durante 23 minutos, a una velocidad de flujo de 3 mi min"1. Las fracciones que contenían DSZC (según se determina por DSS-EGPA), que eluían a alrededor de NaCl 350 mM, fueron reunidas y concentradas usando Amicon Centriprep 30 (MWCO 30 kDa) a aproximadamente 0,7 mi. Se volvieron a cromatografiar 0,25 mi de las fracciones concentradas en una columna de filtración por gel Superóse 12 de Pharmacia (velocidad de flujo de 0,3 mi min"1) usando BES 10 mM, pH 7, como fase móvil. Las fracciones que contenían DSZC fueron reunidas y luego liofilizadas y guardadas a -20°C. Ensayos enzimáticos La reducción de DCPIP NADH-dependiente fue estudiada como sigue. La mezcla de reacción (1 mi en una cubeta de d = 1 cm) contenía 100 nmol de DCPIP y 50 nmol de FMN en tampón EPPS 25 mM, pH 8. La reducción de DCPIP se correlaciona con la pérdida de absorbancia a 600 n . La absorbancia de la mezcla agitada fue monitorizada a 600 nm en un espectrofotómetro Beckman de una disposición de 7500 diodos. Después de aproximadamente 30 seg, se añadieron 300 nmol de NADH y se observó que había una cantidad residual de reducción no enzimática de DCPIP. Después de aproximadamente otros 30 seg, la reacción fue iniciada por inyección de entre 1 y 10 µl de la muestra que había de ser estudiada. La actividad enzimática fue expresada en -DOeoo min-1 o µM DCPIP reducido min"1 (usando e6oo = 21 mM"1 cm"1) . La reducción de cit c NADH-dependiente fue estudiada de forma similar, excepto porque la absorbancia fue monitorizada a 550 nm y la mezcla contenía 50 nmol de cit c en lugar de DCPIP. La reducción de ferricitocromo c a ferrocitocromo c se correlaciona con el aumento de absorbancia a 550 nm. La conversión de DBT a DBTO, DBT02 y HBP, y de DBT-sultona a BHBP fue estudiada por CLAR según se ha descrito previamente usando una columna de fase inversa C18 Synchropak RP (100 x 4,6 mm) con H20: acetonitrilo de 1. Las mezclas de reacción, en NaPi 100 mM, pH 7,5, contenían, en 1 mi, 3 µmol de NAD(P)H, 25 nmol de FMN (o FAD), usado bruto o DSZC (A) purificado y 100 nmol de substrato. En puntos temporales (cada 10 minutos) , se retiraron 100 µl, se añadieron a 100 µl de acetonitrilo para detener la reacción y se analizaron en cuanto a substrato y producto. Resultados : Identificación de una reductasa que contiene flavina en IGTS8 Después de la separación del usado bruto de IGTS8 por cromatografía de intercambio aniónico, fue posible distinguir varias fracciones claramente pigmentadas (amarillentas y amarronadas) . Como puede verse en la Figura 4, se produce en varias de estas fracciones la reducción de DCPIP por NADH, con un pico centrado alrededor del número 25 (aproximadamente NaCl 240 mM) . Estas fracciones tienen típicamente un ligero tinte amarillento, que indica que contienen una flavoproteína. Con objeto de obtener una actividad oxidoreductasa total hay que añadir flavina exógena a la mezcla de reacción, lo que indica que, durante el procedimiento de aislamiento, se había perdido la flavina endógena. La adición de flavina (en este caso FMN) aumenta tanto la velocidad como el grado de reducción de DCPIP. Estas fracciones también catalizan la reducción de cit c acoplada a la oxidación de NADH. Activación de DSZA y C por la flavoproteína reductasa Cuando se purifica DSZA o C a partir de E. coli , ninguno cataliza sus respectivas fracciones en un ensayo típico de una hora. La Figura 5 muestra que, cuando se combina la flavoproteína oxidoreductasa de las fracciones amarillas con DSZA purificado de E. coli en presencia de FMN y de NADH, se produce una conversión completa de DBT-sultona a BHBP. Se observa el mismo patrón (Figura 6) cuando la fracción amarilla es combinada con DSZC, FMN y NADH (excepto que, aquí, el substrato era DBT y el producto DBT02) . Estos datos sugieren que, para que se produzca la desulfuración, no sólo deben estar presentes las proteínas DSZA, B y C, sino que debe incluirse al menos una tercera proteína en la ruta que utiliza flavina como cofactor y es responsable de la oxidación de NADH. EQUIVALENTES Los expertos en la técnica conocerán, o podrán determinar, usando no más que la experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención aquí descrita. Éstos y cualquier otro equivalente pretender ser abarcados por las siguientes reivindicaciones.

LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Energy BioSystems Corporation (B) CALLE: 4200 Research Forest Drive (C) CIUDAD: The Woodlands (D) ESTADO/PROVINCIA: Texas (E) PAÍS: EE.UU. (F) CÓDIGO POSTAL/ZIP: 77381 (G) TELÉFONO: (713) 364-6100 (I) TELEFAX: (713) 364-6110 (i) SOLICITANTE/INVENTOR: (A) NOMBRE: Charles H. Squires (B) CALLE: 66 Lazy Lañe (C) CIUDAD: The Woodlands (D) ESTADO/PROVINCIA: Texas (E) PAÍS: EE.UU. (F) CÓDIGO POSTAL/ZIP: 77381 (i) SOLICITANTE/INVENTOR: (A) NOMBRE: Wan Ji (B) CALLE: 2 Townsend Place (C) CIUDAD: The Woodlands (D) ESTADO/PROVINCIA: Texas (E) PAÍS: EE.UU. (F) CÓDIGO POSTAL/ZIP: 77381 (i) SOLICITANTE/INVENTOR: (A) NOMBRE: Lei Xi (B) CALLE: 159 West Sterling Pond Circle (C) CIUDAD: The Woodlands (D) ESTADO/PROVINCIA: Texas (E) PAÍS: EE.UU. (F) CÓDIGO POSTAL/ZIP: 77381 (i) SOLICITANTE/ INVENTOR: (A) NOMBRE: Beatrice C. Ortego (B) CALLE: 17003 Kettle Creek Drive (C) CIUDAD: Spring 5 (D) ESTADO/PROVINCIA: Texas (E) PAÍS: EE.UU. (F) CÓDIGO POSTAL/ZIP: 77379 (i) SOLICITANTE/INVENTOR: (A) NOMBRE: Olga S. Pogrebinsky 10 (B) CALLE: 12611 Pinerock (C) CIUDAD: Houston (D) ESTADO/PROVINCIA: Texas (E) PAÍS: EE.UU. (F) CÓDIGO POSTAL/ZIP: 77024 15 (i) SOLICITANTE/ INVENTOR: (A) NOMBRE: Kevin A. Gray (B) CALLE: 3500 Tanglebrush, No. 177 (C) CIUDAD: The Woodlands (D) ESTADO/PROVINCIA: Texas 20 (E) PAÍS: EE.UU. (F) CÓDIGO POSTAL/ZIP: 77381 (i) SOLICITANTE/ INVENTOR: (A) NOMBRE: John D. Childs (B) CALLE: 33 Holly Creek Court, No. 1202 25 (C) CIUDAD: The Woodlands (D) ESTADO/BROVINCIA: Texas (E) PAÍS: EE.UU. (F) CÓDIGO POSTAL/ZIP: 77381 (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Método de desulfu 30 ramiento de combustible fósil con flavoproteína (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 2 (iv) DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Hamilton, Brook, Smith & Reynolds, P.C. (B) CALLE: Two Militia Drive (C) CIUDAD: Lexington (D) ESTADO: Massachusetts (E) PAÍS: EE.UU. (F) ZIP: 02173 (v) FORMA DE LECTURA DEL ORDENADOR: (A) TIPO MEDIO: Disco flotante (B) ORDENADOR: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/351.754 (B) FECHA DE SOLICITUD: 8-DIC-1994 (C) CLASIFICACIÓN: (Viii) INFORMACIÓN SOBRE EL APODERADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Brook, David E. (B) NÚMERO DE REGISTRO: 22.592 (C) NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: EBC94- 08 PCT (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES: (A) TELÉFONO: (617) 861-6240 (B) TELEFAX: (617) 861-9540 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 77 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 31..54 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 1: AATTCAGATC TGATCGAGGA GGATGATTAA ATG ACT CAÁ CAÁ CGA CAÁ ATG CAT 54 Met Thr Gln Gln Arg Gln Met His 1 5 CTGATACGTA CGACTAGTAA GCT 77 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 2: Met Thr Gln Gln Arg Gln Met His 1 5

Claims (29)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para aumentar la velocidad de biodesulfuración de un combustible fósil que contiene compuestos de azufre orgánico, consistente en las siguientes etapas: a) poner en contacto el combustible fósil con una fase acuosa que contiene un biocatalizador capaz de excindir los enlaces carbono-azufre y una cantidad incrementadora de la velocidad de una flavoproteína, formando así una mezcla de combustible fósil y fase acuosa; b) mantener la mezcla de la etapa a) en condiciones suficientes para la excisión de los enlaces carbono-azufre de las moléculas de azufre orgánico por el biocatalizador, dando así lugar a un combustible fósil que tiene un reducido contenido en azufre orgánico, y c) separar el combustible fósil que tiene un reducido contenido en azufre orgánico de la fase acuosa resultante.
2. 2. El método de la Reivindicación 1, donde la flavoproteína es flavina reductasa.
3. 3. El método de la Reivindicación 1, donde la flavoproteína es FMN reductasa.
4. 4. El método de la Reivindicación 3, que además consiste en añadir NADH o NADPH.
5. 5. El método de la Reivindicación 4, donde el combustible fósil es un hidrocarburo líquido.
6. 6. El método de la Reivindicación 4, donde el combustible fósil es un hidrocarburo licuado.
7. 7. El método de la Reivindicación 4, donde el biocatalizador capaz de excindir los enlaces carbono-azufre y la FMN reductasa están inmovilizados.
8. 8. El método de la Reivindicación 4, donde la excisión de los enlaces carbono-azufre es realizada por una ruta oxidativa.
9. 9. El método de la Reivindicación 8, donde el biocatalizador capaz de excindir los enlaces carbono-azufre es un microorganismo.
10. 10. El método de la Reivindicación 8, donde el microorganismo contiene una molécula de ADN recombinante que codifica para una o más enzimas capaces de excindir enlaces carbono-azufre .
11. 11. El método de la Reivindicación 10, donde la molécula de ADN recombinante deriva de Rhodococcus sp. ATCC 53968.
12. 12. El método de la Reivindicación 8, donde el biocatalizador capaz de excindir enlaces carbono-azufre es una fracción libre de células.
13. 13. El método de la Reivindicación 12, donde el biocatalizador es una fracción libre de células de Rhodo-coccus sp. ATCC 53968.
14. 14. El método de la Reivindicación 8, donde el biocatalizador consiste en una o más enzimas o fracciones enzimáticas derivadas de un microorganismo que tiene la capacidad de excindir enlaces carbono-azufre.
15. 15. El método de la Reivindicación 14, donde el microorganismo es Rhodococcus sp. ATCC 53968.
16. 16. El método de la Reivindicación 2, donde la flavoproteína es flavina reductasa recombinante.
17. 17. El método de la Reivindicación 16, donde el biocatalizador capaz de excindir enlaces carbono-azufre y la flavina reductasa recombinante son producidos por un solo microorganismo .
18. 18. Una molécula de ADN consistente en una primera secuencia de ADN que codifica para un biocatalizador capaz de desazufrar un combustible fósil que contiene moléculas de azufre orgánico y una segunda secuencia de ADN que codifica para una flavoproteína.
19. 19. La molécula de ADN de la Reivindicación 18, donde la flavoproteína es flavina reductasa.
20. 20. La molécula de ADN de la Reivindicación 19, donde la flavina reductasa es FMN reductasa.
21. 21. La molécula de ADN de la Reivindicación 20, donde la molécula de ADN consiste en ADN derivado de Rhodococcus sp. ATCC 53968.
22. 22. Un microorganismo que contiene una molécula de ADN recombinante que codifica para: (a) un biocatalizador capaz de desazufrar un combustible fósil que contiene moléculas de azufre orgánico y (b) una flavoproteína adicional.
23. 23. El microorganismo de la Reivindicación 22, donde la flavoproteína es flavina reductasa.
24. 24. El microorganismo de la Reivindicación 23, donde el plásmido de ADN recombinante consiste en ADN derivado de Rhodococcus sp. ATCC 53968.
25. 25. Una composición consistente en: (a) un biocatalizador capaz de desazufrar un combustible fósil que contiene moléculas de azufre orgánico y (b) .una cantidad incrementadora de la velocidad de flavoproteína.
26. 26. La composición de la Reivindicación 25, donde la flavoproteína es flavina reductasa.
27. 27. La composición de la Reivindicación 26, donde la flavoproteína es FMtJ reductasa.
28. 28. La composición de la Reivindicación 27, donde el biocatalizador es Rhodococcus sp. ATCC 53968 o enzimas del mismo .
29. 29. La composición de la Reivindicación 27, que además consiste en NADH o NADPH.