JP2000245477A

JP2000245477A - 脱硫酵素をコードする遺伝子

Info

Publication number: JP2000245477A
Application number: JP11057446A
Authority: JP
Inventors: Nobuo Kato; 暢夫加藤; Eiji Yanase; 英司簗瀬
Original assignee: Petroleum Energy Center PEC
Current assignee: Japan Petroleum Energy Center JPEC
Priority date: 1999-03-04
Filing date: 1999-03-04
Publication date: 2000-09-12

Abstract

(57)【要約】【解決手段】チオフェン系化合物を水溶性化合物に変
換する反応を触媒する脱硫酵素をコードする遺伝子。【効果】化石燃料中に含まれる硫黄成分を容易に除去
できるようになる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、チオフェン系化合
物、すなわちベンゾチオフェン、ジベンゾチオフェン
（以下「DBT 」という）およびこれらの置換体を、その
ベンゼン環を開裂し極性基を付加し水溶性化合物に変換
する酵素、すなわちDBT環開裂分解を触媒すると推定さ
れる一連の酵素をコードする遺伝子に関するものであ
る。本発明の遺伝子を利用することにより、石油または
石油製品に含まれるベンゾチオフェンやDBT およびこれ
らの置換体、又はそれらの誘導体を水溶性化合物に変換
することができる。これにより、石油または石油製品に
含まれるこれらの化合物を容易に除去できるようにな
る。

【０００２】

【従来の技術】（１）水素化脱硫技術石油のような炭化水素燃料から硫黄を除去する脱硫のた
めの方法としては、アルカリ洗浄や溶剤脱硫などの方法
も知られているが、現在では水素化脱硫が主流となって
いる。水素化脱硫は、石油留分中の硫黄化合物を触媒の
存在下で水素と反応させ、硫化水素として除去して製品
の低硫黄化を図る方法である。触媒としては、アルミナ
を担体としてコバルト、モリブデン、ニッケル、タング
ステン、などの金属触媒が使用される。モリブデン担持
アルミナ触媒の場合には、触媒性能を向上させるため
に、通常コバルトやニッケルが助触媒として加えられ
る。金属触媒を用いた水素化脱硫は、現在世界中で広く
使用されているきわめて完成度の高いプロセスであるこ
とは疑いのないことである。しかし、より厳しい環境規
制に対応した石油製品を作るためのプロセスという観点
からは、いくつかの問題点がある。以下にその例を簡単
に記載する。

【０００３】金属触媒は、一般にその基質特異性が低
く、このため多様な種類の硫黄化合物を分解し、化石燃
料全体の硫黄含量を低下させる目的には適しているが、
特定のグループの硫黄化合物、すなわちベンゾチオフェ
ンやDBT のような複素環硫黄化合物類およびそれらのア
ルキル誘導体類に対してはその脱硫効果が不十分となる
ことがあると考えられる。たとえば、脱硫後の軽油中に
はなおも種々の複素環式有機硫黄化合物が残存してい
る。このように金属触媒による脱硫効果が不十分となる
原因の一つは、これらの有機硫黄化合物中の硫黄原子の
周囲に存在する置換基による立体障害が考えられる。こ
れらの置換基のうち、メチル置換基の存在が水素化脱硫
における金属触媒の反応性に及ぼす影響は、チオフェ
ン、ベンゾチオフェン、DBT などについて検討されてい
る。それらの結果によると、一般的には置換基の数が増
すほど脱硫反応は減少するが、置換基の位置が反応性に
及ぼす影響もきわめて大きいことが明らかである。メチ
ルDBT 類の脱硫反応性を比較し、置換基による立体障害
が金属触媒の反応性に及ぼす影響が非常に大きいことを
示した報告は、たとえば、Houalla, M., Broderick, D.
H., Sapre, A.V., Nag, N.K., de Beer, V.H., Gates,
B.C., Kwart, H.J., Catalt., 61, 523-527(1980)に見
られる。実際、これらのでDBT の種々のアルキル化誘導
体が軽油中にかなりの量存在することが知られている
（たとえば、Kabe, T., Ishihara, A. and Tajima, H.
lnd. Eng. Chem. Res., 31, 1577-1580(1992))。

【０００４】上記のように水素化脱硫に抵抗性を示す有
機硫黄化合物を脱硫するためには、現在用いられている
よりも高い反応温度や圧力が必要とされ、また、添加す
る水素の量も非常に増大すると考えられている。さらに
炭酸ガスの発生量も多く、このような水素化脱硫プロセ
スの改良は、ばく大な設備投資と運転コストを必要とす
ることが予想される。このような水素化脱硫に抵抗性を
示す有機硫黄化合物を主たる硫黄化合物種として含むも
のとしては、たとえば、軽油があり、軽油のより高度な
脱硫（超深度脱硫）を行う場合には上記のような水素化
脱硫プロセスの大幅な改良が要求される。

【０００５】（２）生物脱硫技術一方、生物が行う酵素反応は比較的穏和な条件下で進行
し、しかも酵素反応の速度自体は、化学触媒を用いた反
応の速度と遜色のないという特徴を有している。さら
に、生体内で起こる多種多様の生物反応に適切に対応す
る必要があるため、非常に多くの種類の酵素が存在し、
それらの酵素は一般的に非常に高い基質特異性を示すこ
とが知られている。このような特徴は、微生物を用いて
化石燃料中に含まれる硫黄化合物中の硫黄の除去を行う
いわゆるバイオ脱硫反応においても活かされるものと期
待されている（Monticello, D.J., Hydrocarbon Proces
sing39-45(1994)) 。

【０００６】一方、細菌を用いて石油の成分である複素
環硫黄化合物から硫黄を除去する方法については、多数
の報告があるが、それらは複素環のC-S 結合切断型反応
と複素環のC-C 結合切断型反応に大別される。C-S 結合
切断型のDBT 分解反応を行う微生物は、いくつかの属の
細菌で知られている。たとえば、Rhodococcus sp.のATC
C53968 はよく調べられたDBT 分解菌株であり、DBT の
硫黄原子に酸素原子を付加し、DBT スルホキシド（以下
「DBTO」という）からDBT スルホン（以下「DBTO₂」と
いう）を生成し、ついで2-(2'-ヒドロキシフェニル) ベ
ンゼンスルフィン酸塩を経て2-ヒドロキシビフェニル
（以下「2-HBP 」という）を生成する反応を行う。

【０００７】C-S 結合切断型の脱硫反応を起こすことが
知られている細菌で、そのDBT 分解反応に関与する酵素
活性をコードする遺伝子が同定され、その塩基配列が決
定されているのは、本発明者らの知る限りでは、Rhodoc
occus sp. IGTS8株のdsz遺伝子のみである（Denome,
S., Oldfleld., C., Nash, L.J. and Young, K.D. J.Ba
cteriol., 176:6707-6716, 1994; Piddington, C.S., K
ovacevich, B.R. and Rambosek, J. Appl. Environ. Mi
crobiol., 61:468-475, 1995) 。IGTS8 株によるDBT 分
解反応は、DBT からDBTOを経てDBTO₂への変換を触媒す
るDszC、DBTO₂から2-(2'-ヒドロキシフェニル）ベンゼ
ンスルフィン酸への変換を触媒するDszAおよび2-(2'-ヒ
ドロキシフェニル）ベンゼンスルフィン酸から2-HBP へ
の変換を触媒するDszBの３つの酵素により触媒される
（Denome, S., Oldfield., C., Nash,L.J. and Young,
K.D. J.Bacteriol., 176:6707-6716, 1994; Gray, K.
A., Pogrebinshy, O.S., Mrachko, G.T., Xi, L. Monti
cello, D.J. and Squires, C.H.Nat Biotechnol., 14:1
705-1709, 1996; Oldfield, C., Pogrebinsky, O., Sim
monds, J., Olson, E.S. and Kulpa, C.F., Microbiolo
gy, 143:2961-2973, 1997)。それぞれ対応する遺伝子は
dszA, dszB, dszCと呼ばれている。DszCとDszAはモノオ
キシゲナーゼで、両者ともその酸素添加反応にはNADH:F
MNオキシドレダクターゼ活性の共存を必要とすることが
知られている（Gray, K.A., Pogrebinsky,O.S., Mrachk
o, G.T., Xi, L. Monticello, D.J. and Squires, C.H.
Nat Biotechnol., 14:1705-1709, 1996; Xi, L. Squir
es, C.H., Monticello, D.J. andChilds, J.D. Bioche
m. Biophys. Res Commun., 230:73-76, 1997)。このNAD
H-FMNオキシドレダクターゼ活性を有する酵素はDszDと
呼ばれ、その遺伝子配列がGray, K.A.らにより報告され
ている（US Pat. No.5,804,433）。

【０００８】これらモノオキシゲナーゼやオキシドレダ
クターゼは補酵素の再生が必要であるのでエネルギー源
を必要とするが、概して炭化水素が利用できないので、
グルコースなどの炭水化物や、エタノール、グリセロー
ルなどのアルコールを補給する必要がある。C-C 結合攻
撃型脱硫活性を有する細菌としては、例えば、Pseudomo
nas sp., Pseudomonas aeruginosa, Beijerinckia sp.,
Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas stutzeri, Ps
eudomonas putida, Brevibacterium sp., Burkholderia
sp.などが知られている。これらの細菌は、DBT で代表
される複素環式硫黄化合物中のC-C 結合の切断を行い、
ベンゼン環を分解し、その後の酸化反応カスケードによ
り、硫黄塩を放出するというタイプの代謝を行うもので
ある。これらの炭素骨格攻撃型経路の反応機構は芳香環
の水酸化（DBT →→1,2-ジヒドロキシDBT)、環の解裂、
水溶性産物への酸化（1,2-ジヒドロキシDBT →→トラン
ス-4［２-(3-ヒドロキシ）チアンナフテニル］-2- オキ
ソ- ブテノイン酸、3-ヒドロキシ-2- ホルミルベンゾチ
オフェン）といったものであり、Kodama経路と呼ばれて
いる。このタイプの反応により、DBT のベンゼン環中の
C-C 結合が攻撃を受け、油から抽出可能な種々の水溶性
物質を生じる。

【０００９】この反応により、油中の他の芳香族分子が
攻撃を受け、その結果かなりの量の炭化水素が液相に移
動することになる（Hartdegen, F.J., Coburn, J.M. an
d Roberts, R.L. Chem. Eng. Progress, 80, 63-67(198
4))が、このタイプのDBT 酸化分解菌は、児玉らが報告
しているように酸化産物として水溶性のチオフェン化合
物（主として3-ヒドロキシ-2- ホルミルベンゾチオフェ
ン）を与えるので、水相から除去するのが容易であると
ともに、 DBTジオキシゲナーゼ、ジヒドロジオール脱水
素酵素、環開裂ジオキシゲナーゼに必要な補酵素の供給
に対して必要なエネルギーを安価な炭化水素から得られ
ることになりC-S結合切断酵素を利用する方法に比べて
簡単なプロセスを使用することができる。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、チオ
フェン系化合物、すなわちベンゾチオフェン、DBTおよ
びこれらの置換体を、そのベンゼン環を解裂し極性基を
付加し水溶性化合物に変換する酵素をコードする遺伝子
を提供することである。また、このような遺伝子を持つ
微生物を実際にベンゾチオフェン、DBT およびそれらの
アルキル誘導体に作用させて、これらの化合物のC-C 結
合を切断することにより、硫黄を遊離させる方法を確立
することである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意検討を重ねた結果、脱硫細菌 Burkh
olderia sp.から脱硫反応に関与する遺伝子群の単離に
成功し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明の第
一は、脱硫反応に関与する酵素をコードする遺伝子に関
する。本発明の第二は、上記遺伝子を含むベクターに関
する。本発明の第三は、上記ベクターを含有する形質転
換体に関する。本発明の第四は、脱硫反応に関与する酵
素に関する。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。（１）脱硫反応に関与する酵素をコードする遺伝子脱硫反応に関与する酵素をコードする本発明の遺伝子に
は、以下の第一の遺伝子から第五の遺伝子が含まれる。
以下、各遺伝子ごとに説明する。

【００１３】第一の遺伝子第一の遺伝子は、配列番号２記載のアミノ酸配列により
表されるタンパク質、または、配列番号２記載のアミノ
酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置
換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつ
DBTジオキシゲナーゼのフェレドキシンリダクターゼサ
ブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードす
る遺伝子である。

【００１４】第一の遺伝子のうち、配列番号２記載のア
ミノ酸配列により表されるタンパク質をコードする遺伝
子は、本明細書の実施例に記載された方法により得るこ
とができる。また、この遺伝子の塩基配列は、配列番号
１に示すように、既に決定されているので、これらの配
列を基に適当なプライマーを合成し、たとえば、Burkho
lderia sp.株から調製されたDNA を鋳型としてPCR を行
うことによっても得ることができる。

【００１５】配列番号２記載のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列をコードする遺伝子は、本願の出願時
において常用される技術、例えば、部位特異的変異誘発
法（Zoller et al., NucleicAcids Res. 10 6487-6500,
1982）により配列番号２記載のアミノ酸配列をコード
する遺伝子を改変することにより得ることができる。第
一の遺伝子は、DBT の分解に関与する酵素をコードする
ので、石油の脱硫に利用することができる。

【００１６】第二の遺伝子第二の遺伝子は、配列番号３記載のアミノ酸配列により
表されるタンパク質、または、配列番号３記載のアミノ
酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置
換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつ
ジヒドロジオールDBTデヒドロゲナーゼ活性を有するタ
ンパク質をコードする遺伝子である。第二の遺伝子は、
第一の遺伝子と同様の方法で生産することができ、ま
た、同様の用途に利用することができる。

【００１７】第三の遺伝子第三の遺伝子は、配列番号４記載のアミノ酸配列により
表されるタンパク質、または、配列番号４記載のアミノ
酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置
換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつ
DBTジオキシゲナーゼの鉄−硫黄αサブユニットとして
の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
第三の遺伝子は、第一の遺伝子と同様の方法で生産する
ことができ、また、同様の用途に利用することができ
る。

【００１８】第四の遺伝子第四の遺伝子は、配列番号５記載のアミノ酸配列により
表されるタンパク質、または、配列番号５記載のアミノ
酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置
換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつ
DBTジオキシゲナーゼの鉄−硫黄βサブユニットとして
の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
第四の遺伝子は、第一の遺伝子と同様の方法で生産する
ことができ、また、同様の用途に利用することができ
る。

【００１９】第五の遺伝子第五の遺伝子は、配列番号６記載のアミノ酸配列をN末
端側に含むタンパク質、又は配列番号６記載のアミノ酸
配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換
若しくは付加されたアミノ酸配列をN末端側に含み、か
つシス3-ヒドロキシ-チアナフェニル 2-オキソ-3-ブテ
ン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする
遺伝子である。

【００２０】第五の遺伝子の一部の塩基配列は、すでに
決定されているので（配列番号１）、この配列に基づき
適当なプローブを作製し、Burkhoderia sp. C1株の全DN
Aライブラリーのスクリーニングを行うことにより、第
五の遺伝子の全長を得ることができる。第五の遺伝子
は、第一の遺伝子と同様の用途に利用することができ
る。なお、第一の遺伝子から第四の遺伝子の全長及び第
五の遺伝子の一部を含む大腸菌は工業技術院生命工学工
業技術研究所に受託番号FERM P-17270として寄託されて
いる（寄託日：平成11年2月26日）。

【００２１】（２）脱硫反応に関与する酵素をコードす
る遺伝子を含むベクター本発明のベクターは、上記の遺伝子を含む。このような
ベクターは、本発明の遺伝子を含むDNA 断片を、公知の
ベクターに挿入することにより作製することができる。
DNA 断片を挿入するベクターは、形質転換する宿主に応
じて決めればよく、宿主として大腸菌を使用するのであ
れば、以下のようなベクターを使用するのが好ましい。
強力なプロモーターとして、例えば、lac、lacUV5、tr
p、tac、trc、λpL、T7、rrnB、などを含むpUR 系、pGE
X系、pUC 系、pET 系、pT7 系、pBluescript 系、pKK
系、pBS 系、pBC 系、pCAL系などのベクターを使用する
のが好ましい。

【００２２】（３）脱硫反応に関与する酵素をコードす
る遺伝子を含むベクターを含有する形質転換体本発明の形質転換体は、上記ベクターを含有する。形質
転換体の宿主とする細胞は、植物細胞や動物細胞などで
あってもよいが、大腸菌などの微生物が好ましい。代表
的な菌株としては、Sambrook等の成書Molecular Clonin
g Laboratory Mannual 2nd ed.に記載されている、71/1
8 、BB4 、BHB2668 、BHB2690 、BL21(DE3) 、BNNl02(C
600hflA)、C-1a、C600(BNN93) 、CES200、CES201、CJ23
6 、CSH18 、DH1 、DH5 、DH5 α、DP50supF、ED8654、
ED8767、HB101 、HMS174、JM101、JM105 、JM107 、JM1
09 、JM110 、K802、KK2186、LE392 、LG90、M5219 、M
BM7014.5 、MC1061、MM294 、MV1184、MV1193、MZ-1、N
M531 、NM538 、NM539 、Q358、Q359、R594、RB791 、R
R1 、SMR10 、TAP90 、TG1 、TG2 、XL1-Blue、XS101
、XS127 、Y1089 、Y1090hsdR 、YK537 などが挙げら
れる。

【００２３】（４）脱硫反応に関与する酵素脱硫反応に関与する本発明の酵素には、以下の５種類の
タンパク質が含まれる。第一のタンパク質は、配列番号
２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質、及び
配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数
個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸
配列により表され、かつDBTジオキシゲナーゼのフェレ
ドキシンリダクターゼサブユニットとしての機能を有す
るタンパク質を包含する。

【００２４】第二のタンパク質は、配列番号３記載のア
ミノ酸配列により表されるタンパク質、及び配列番号３
記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ
酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により
表され、かつジヒドロジオールDBTデヒドロゲナーゼ活
性を有するタンパク質を包含する。第三のタンパク質
は、配列番号４記載のアミノ酸配列により表されるタン
パク質，及び配列番号４記載のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列により表され、かつDBTジオキシゲナ
ーゼの鉄−硫黄αサブユニットとしての機能を有するタ
ンパク質を包含する。

【００２５】第四のタンパク質は、配列番号５記載のア
ミノ酸配列により表されるタンパク質、及び配列番号５
記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ
酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により
表され、かつDBTジオキシゲナーゼの鉄−硫黄βサブユ
ニットとしての機能を有するタンパク質を包含する。第
五のタンパク質は、配列番号６記載のアミノ酸配列をN
末端側に含むタンパク質、及び配列番号６記載のアミノ
酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置
換若しくは付加されたアミノ酸配列をN末端側に含み、
かつシス3-ヒドロキシ-チアナフェニル 2-オキソ-3-ブ
テン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質を包含す
る。

【００２６】上記のタンパク質を利用することにより、
石油または石油製品に含まれるベンゾチオフェンやDBT
およびこれらの置換体、又はそれらの誘導体を水溶性化
合物に変換することができる。これにより、石油または
石油製品に含まれるこれらの化合物を容易に除去できる
ようになる。上記のタンパク質は、上述の遺伝子を利用
して製造することができる。また、配列番号２、３、
４、５に記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
及び配列番号６記載のアミノ酸配列をN末端側に含むタ
ンパク質は、Burkholderia sp.C1株から常法に従って調
製することも可能である。

【００２７】

【実施例】［実施例1］ DBT環開裂酵素群をコードする
全DNA調製 Burkholderia sp. C1株をDBT含有（500 ppm）プレート
に画線した後、単一コロニーを5mlのAC培地[0.24% (N
H₄)₂SO₄, 0.04% KH₂PO₄, 0.1% Na₂HPO₄, 0.05% NaCl,
0.0015% CaCl₂・2H₂O, 0.0025% MgSO₄・7H₂O, 0.01% Ye
ast extract, 1.0%Metal solution, 0.1% Vitamin solu
tion, pH 7.0]に植菌し、30°Cで一晩振盪培養した。50
0 mlの AC培地に5 mlの前記培養液を移し、30°Cで48時
間振盪培養した。培養液を遠心分離し（0°C, 5000 rp
m, 10 分）、上澄み液を捨てて沈殿菌体を50mlのSE[0.1
5 M NaCl, 0.01 M EDTA, HClでpH8.0に調製]に懸濁し
た。遠心分離およびSEへの懸濁を再度繰り返した後、10
mgのLysozymeを加えて37°Cで60分間インキュベートし
た後、凍結-再融解を繰り返して細胞を破壊した。次
に、2mlの25% SDSを、最終濃度が1%となるように穏やか
に振盪しながら加え、60°Cで10分間加熱した。260μl
のRNAase溶液を最終濃度が50μg/mlとなるように加え、
37°Cで3〜4 h間静置した。更に、260 μlの proteinas
e K (シグマ社製）を終濃度50μg/mlなるように加えて3
7°Cで一晩インキュベートした。次ぎに、等量のTE飽和
フェノール[核酸抽出用フェノール 500 g, 8-ヒドキシ
キノリン 0.5 g, TE(10 mM Tris, 1 mM EDTA, HClでpH
8.0に調製), 300 ml]を加えて穏やかに混合し、遠心分
離（20°C、7000 rpm、20 min）した後、等量のイソ[ク
ロロホルム 480 mlにイソアミルアルコール 20 mlを加
えて調製）を加えて穏やかに混合し、遠心分離（20°
C、7000 rpm、20 min）した。上層をとり、TNE [TE + 1
0mM NaCl]で一晩透析して（4°C）、全DNAを回収した。

【００２８】［実施例2］全DNAライブラリーの作製上記実施例1で得られた100 μlの全DNA、20μl の10xH
緩衝液[10倍濃度のH Buffer: 50 mM Tris-HCl (pH7.5),
10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 mM NaCl]および80mlの滅
菌蒸留水からなる溶液を調製し、エッペンドルフチュウ
ブに分注し、制限酵素Sau3AIの1μl（5 units/ml）を加
えて穏やかに混合した。37°Cで1時間程度静置した後、
1μl の0.5 M EDTA (pH8.0)を加えてよく混合し、反応
を停止させた。TBE[0.89 M Tris, 0.89 M ホウ酸, 0.02
M EDTA]で電気泳動を行い、約23〜25 kb付近のDNAバン
ドが最も濃い全DNA部分消化断片を用いて、ショ糖密度
勾配遠心法によるDNAの分画により23〜25 kbサイズのDN
A断片を調製した。

【００２９】一方、コスミドベクターpLAFR3（Friedman
A.M.等、Gene, 18, 289 (1982)）を制限酵素EcoRIまた
はHindIIIでそれぞれ消化し、CIP（Calf Intestine Pho
sphatase）処理を行った。さらに、この2つの断片をBam
HIで消化した。次ぎにTakara Ligation Kit（宝酒造
製）を用いて、23〜25 kbの全DNA断片とコスミドベクタ
ーpLAFR3を連結した。続いて、Gigapack TMI plus Kit
(Stratagene社製）を用いてin vitro packagingを行
い、これをEscherichia coli S17-1株に感染させた。テ
トラサイクリンを12.5μg/ml含有するLB Plate[1% Bac
to-Tripton, 0.5% Bact-Yeast Extract, 1% NaCl, 1.5%
Agar]に塗布し、約50,000個の全DNAライブラリーを構
築した。

【００３０】［実施例3］ DBT分解活性を指標としたDB
T環開裂酵素群をコードする遺伝子の選択上記実施例2で構築した大腸菌細胞内で作製したBurkhol
deria sp. C1株の全DNAライブラリーからのDBT環開裂酵
素群をコードする遺伝子の選択は、組換えコスミドを大
腸菌S17-1株からPseudomonas putida KT2440株に接合伝
達法を用いて再度導入した後、P. putida KT2440接合伝
達株のDBT 環開裂活性発現を指標として行った。接合伝
達のための供与菌として大腸菌ライブラリーをテトラサ
イクリンを12.5μg/ml含有する5 mlのLB medium[1% Ba
cto-Tripton, 0.5% Bact-Yeast Extract, 1% NaCl]に植
菌して、37°Cで一晩振盪培養した後、菌体を含むLB me
dium(0.5 ml)を別のLB medium(5 ml)に移し、37°Cで3
時間、静置培養を行った。受容菌としたP. putida KY24
40株は5 mlのACG培地[0.2% Glycerol, 0.24% (NH4) ₂S
O₄, 0.04% KH₂PO₄, 0.1% Na₂HPO₄, 0.05% NaCl, 0.0015
% CaCl₂・2H₂O, 0.0025% MgSO₄・7H₂O, 0.01% Yeast ex
tract, 1.0% Metal solution, 0.1% Vitamin solution,
pH 7.0]に植菌し、30°Cで一晩培養した。供与菌培養
液の1 ml（1 x 10⁹cells）と受容菌の1 ml（1 x10⁹ce
lls）を混合して、孔経0.45μmのニトロセルロースフィ
ルター上に集めた後、このフィルターの集菌面を上にし
てLB Plateに置き、37°Cで6 時間インキュベートして
接合伝達を行った。フィルター上の接合菌体を生理食塩
水の1 mlに懸濁し、12.5μg/mlのテトラサイクリンを含
むACG plate[ ACG medium+1.5％寒天]に塗布して、30°
C で3日間、培養した。次に，ACG plate上にコロニー形
成を確認した後、0.4 M DBTのアセトン溶液をコロニー
表面がDBT微結晶で白色になるまで噴霧し、30°Cで培養
を継続した。DBT開裂酵素群をコードする遺伝子が発現
した場合、噴霧したDBTは環開裂し、有色の代謝産物が
生成するので、DBT環開裂酵素をコードする遺伝子を有
するクローン株の選択は、コロニーの着色（オレンジ
色、茶褐色）を指標として行った。約50,000個の大腸菌
ライブラリーから2個の黒色を呈するP. putida KT2440
接合伝達株（DBT1株とDBT6株）を単離した。

【００３１】２個の接合伝達株から、アルカリSDS法に
より組換えコスミドを抽出して常法により制限酵素解析
を行ったところ、約20 kbの挿入断片を有するpDBT1と約
15 kbの挿入断片を有するpDBT6を確認した。DBT1株（P.
putida KT2440[pDBT1] )とDBT6株（P.putida KT2440[pD
BT6] )のDBT環開裂活性の確認は、両菌株を12.5μg/ml
のテトラサイクリンと500 ppmのDBTを添加したACG培地
の5 mlに植菌し、30°Cで振盪培養を行い、24時間毎に
サンプリングし、培養液中の残存DBT を GC を用いて分
析した。図1に示すように、いずれのクローン株も6日間
の培養で約200 ppmのDBT を分解するとともに、DBT環開
裂反応生成物の蓄積と推定される黒褐色の培養液の着色
が認められた。以上の結果から、pDBT1とpDBT6には DBT
環開裂酵素群をコードする遺伝子を含むことが明らかに
なった。

【００３２】［実施例4］ DBT環開裂酵素群をコードす
る遺伝子のサブクローニング pDBT1とpDBT6がともにDBT環開裂活性を示すことから、
これらクローン化されたDNA断片上での共通した断片に
着目した。pDBT1とpDBT6に共通したDNA断片を検索する
ために、それぞれを様々な6塩基配列認識酵素により常
法に従い消化した。図2に示すように、PstI切断では5.8
kbの共通な断片が、EcoRI切断では2.4 kbと1.9 kbの共
通断片が、BamHI切断では3.7 kbと1.8 kbの共通断片
が、HindIII切断では2.85 kbと1.3 kbと0.75 kbの共通
断片が存在した。次に、塩基配列決定に適当なサイズの
HindIII切断による共通断片（2.85 kbと1.3 kbと0.75 k
b）をプローブとして用い、pDBT1とpDBT6の上記３種の
制限酵素切断片に対してサザンブロティング解析を行っ
た。 pDBT1とpDBT6をHindIII,PstI,EcoRIにて制限酵素
消化してアガロースゲル電気泳動後、ゲル上のDNA 断片
をHybond N⁺ナイロンメンブレン（アマシャム社製）に
トランスファーし、プローブには3種のHindIII断片(1.
3, 2.85, 0.75 kb)を用いた。DNAプローブの標識とハ
イブリダイズ物の検出にはECL Kit（アマシャム社製）
を用い、実験操作は添付マニュアルに従った。

【００３３】図3に示すように、プローブとした3種のHi
n dIII断片はpDBT1とpDBT6の5.8 kbのPstI断片にハイブ
リダイズしたことから、5.8 kb PstI断片中に3種のHind
III断片が含まれていることが明らかになり、DBT環開裂
酵素群をコードする遺伝子がpDBT1と pDBT6の5.8 kbPst
I断片上にコードされていることが示唆された。次に、p
DBT1のPstI消化物をアガロースゲル電気泳動後、アガロ
ースゲルから切り出して抽出した5.8 kbPstI断片を、Ps
tI 消化したpBluescriptSK+にTakaraLigation Kit （宝
酒造製）を用いて連結して、組換えプラスミドpPstIを
作製した。pPst1を各種制限酵素を用いて消化後、常法
に従い制限酵素切断点地図を作製した。図4に示すよう
に、5.8 kbPstI断片上には共通した３種のHindIII断片
に加え0.7 kb断片を有していた。

【００３４】［実施例５］5.8 kbPstI断片の塩基配列の
決定 5.8 kb断片の塩基配列を、組換えプラスミドpPst1およ
びそれから調製したデリーションクローンを用いて、Dy
e Terminator Sequencing Kit （ABI社製）により決定
した。決定した塩基配列を、配列表の配列番号1に示
す。PstI断片には5種のORF（1〜5)が含まれていた。こ
の6種の塩基配列をデータベースに対しFAST解析を行
い、DBT環開裂酵素群をコードする遺伝子を推定した。O
RF1は、配列番号１における78〜80番目のATGを開始コド
ンとし、1104〜1106番目のTGAを終止コドンとする。こ
のORF1がコードするアミノ酸配列は、配列番号２に示す
とおりであり、アミノ酸数342残基よりなり、その推定
分子量は3734.97 Daであった。この推定一次構造は、石
油系単環式および多環式芳香族化合物の環水酸化酵素の
アミノ酸配列と高い相同性（Naphthalene reductaseと3
2.1%、Xylene monooxigenaseと31.7%、Nitrotoluene re
ductaseと32.4%）を示し、ORF1がマルチコンポーネント
タイプのDBTジオキシゲナーゼ（DBT dioxygenase）のフ
ェレドキシンリダクターゼサブユニットをコードしてい
ることが示唆された。

【００３５】ORF2は、配列番号１における2499〜2501番
目のATGを開始コドンとし、3330〜3332番目のTGAを終止
コドンとする。このORF2がコードするアミノ酸配列は、
配列番号３に示すとおりであり、アミノ酸数277残基よ
りなり、その推定分子量は28565.96 Daであった。この
推定一次構造は、石油系単環式および多環式芳香族化合
物の環水酸化反応に生成するジヒドロジオール（dihyro
diol）誘導体のデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と高い
相同性（Biphenyl-dihydrodiol dehydrogenaseと57.7%
、Toluene dihydrodiol dehydrogenaseと53.7%、Benze
ne dihydrodiol dehydrogenaseと53.7%）を示し、ORF2
がジヒドロジオールDBTデヒドロゲナーゼ（Dihydrodiol
DBT dehydrogenase）をコードしていることが示唆され
た。

【００３６】ORF3は、配列番号１における3389〜3391番
目のATGを開始コドンとし、4745〜4747番目のTAAを終止
コドンとする。このORF3がコードするアミノ酸配列は、
配列番号４に示すとおりであり、アミノ酸数452残基よ
りなり、その推定分子量は50141.06 Daであった。この
推定一次構造は、石油系単環式および多環式芳香族化合
物の環水酸化酵素のアミノ酸配列と高い相同性（Naphth
alene dioxygenase iron-sulfur α subunitと49.1% 、
Biphenyl dioxygenase iron-sulfurα subunitと37.1
%、Toluene dioxygenase iron-sulfur α subunitと35.
8%）を示し、ORF3がマルチコンポーネントタイプのDBT
ジオキシゲナーゼの鉄−硫黄αサブユニットをコードし
ていることが示唆された。

【００３７】ORF4は、配列番号１における4777〜4779番
目のATGを開始コドンとし、5272〜5274番目のTAAを終止
コドンとする。このORF4がコードするアミノ酸配列は、
配列番号５に示すとおりであり、アミノ酸数165残基よ
りなり、その推定分子量は20095.70 Daであった。この
推定一次構造は、石油系単環式および多環式芳香族化合
物の環水酸化酵素のアミノ酸配列と高い相同性（Naphth
alene dioxygenase iron-sulfur β subunitと29.8% 、
Biphenyl dioxygenase iron-sulfurβ subunitと26.4
%、Toluene dioxygenase iron-sulfur β subunitと26.
4%）を示し、ORF4がマルチオンポーネントタイプのDBT
ジオキシゲナーゼの鉄−硫黄βサブユニットをコードし
ていることが示唆された。

【００３８】不完全なORF5は、配列番号1における5455
〜5457番目のATGを開始コドンとし、5473番目のAを含
み、構造遺伝子の一部をコードしていると推定した。ま
た、このORF5がコードするアミノ酸配列は、配列番号6
に示すとおりである。この推定一次構造は、石油系単環
式および多環式芳香族化合物の環開裂反応より生成する
cis体環開裂物のtrans体への異性化反応を触媒するイソ
メラーゼのアミノ酸配列のN末領域と高い相同性（2-hyd
roxychromen-2carboxylate isomeraseと60.0％、Probab
le isomerasedoxJと58.9%）を示し、ORF5がDBTの環水酸
化と環開裂反応により生成するシス3-ヒドロキシ-チア
ナフェニル 2-オキソ-3-ブテン酸（cis 3-hydroxy-thia
naphenyl 2-oxo-3-butenoic acid）のイソメラーゼのN
末領域をコードしていることが示唆された。

【００３９】以上の結果から、図5に示すように、pDBT1
およびpDBT6が有する5.8 kbPstI断片上にはORF1、ORF3
およびORF4からなるマルチコンポーネントタイプのDBT
ジオキシゲナーゼとORF2がコードするジヒドロジオール
DBTデヒドロゲナーゼとORF5がコードするシス3-ヒドロ
キシ-チアナフェニル 2-オキソ-3-ブテン酸イソメラー
ゼがクラスターを形成しているが推定された。既に、De
nomeらによりPseudomonas sp. C18株よりDBT環開裂酵素
群をコードする遺伝子(doxABDEFGHIJ、約10-kb）がクロ
ーン化され、DBTジオキシゲナーゼ（doxABD）とジヒド
ロキシDBTジオキシゲナーゼ（doxG）が、P. putida由来
ナフタレンジオキシゲナーゼ（nodABC）と1,2-ジヒドロ
キシナフタレンジオキシゲナーゼ（napC）とそれぞれ10
0％に近い相同性を示すことを報告している。しかし、B
urkholderia sp. C1株からクローン化したDBT環開裂酵
素群をコードする遺伝子は既報のDox遺伝子やNap遺伝子
との相同性は50％程度であり、DBT環開裂系酵素遺伝子
群の構成は類似しているもののDox遺伝子やNap遺伝子と
は異なるDBT環開裂酵素系遺伝子ことが推定された。

【００４０】

【発明の効果】本発明は、チオフェン系化合物のベンゼ
ン環を開裂し、極性基を付加し、水溶性化合物に変換す
る一連の酵素をコードする遺伝子を提供する。この遺伝
子を利用することにより、化石燃料中に含まれる硫黄成
分を容易に除去できるようになる。

【００４１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>PETROLEUM ENERGY CENTER <120> DATSURYU KOUSO WO KOHDOSURU IDENSHI <130> P99-0030 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 5743 <212> DNA <213> Burkholderia sp. <220> <221> CDS <222> (78)..(1103) <220> <221> CDS <222> (2499)..(3329) <220> <221> CDS <222> (3389)..(4744) <220> <221> CDS <222> (4777)..(5271) <220> <221> CDS <222> (5455)..(5742) <400> 1 ctgcaggttt tttctgtggt cgtcaaagat ggccaggtgt ttgtcgaaat ctgatgcgcc 60 ctcaagcaaa gacggct atg agt cca caa agc ttt caa gtc aga att ggc 110 Met Ser Pro Gln Ser Phe Gln Val Arg Ile Gly 1 5 10 gcc ggt gac acg ccc gtc ttt cag tgt tcc act gat gaa acg cta ctc 158 Ala Gly Asp Thr Pro Val Phe Gln Cys Ser Thr Asp Glu Thr Leu Leu 15 20 25 gct gcg gcg ctc aag gct ggg ctt gga ttt ccc tat gaa tgt caa tcc 206 Ala Ala Ala Leu Lys Ala Gly Leu Gly Phe Pro Tyr Glu Cys Gln Ser 30 35 40 gga tcg tgc agc agt tgc cgc ttt cag ttg ctg gag ggc gat gtc aag 254 Gly Ser Cys Ser Ser Cys Arg Phe Gln Leu Leu Glu Gly Asp Val Lys 45 50 55 gat ttg tgg tcg aat gcg ccg ggt ttg aat gcc gaa gct cgt gaa tgc 302 Asp Leu Trp Ser Asn Ala Pro Gly Leu Asn Ala Glu Ala Arg Glu Cys 60 65 70 75 ggc atg cac ctc ggc tgc cag agc aca cca ggt agt gac tgt cga atc 350 Gly Met His Leu Gly Cys Gln Ser Thr Pro Gly Ser Asp Cys Arg Ile 80 85 90 aag ctg cgc ttg aag ccg ggc tat gtc ccg cag gtg atg ccg acg cgt 398 Lys Leu Arg Leu Lys Pro Gly Tyr Val Pro Gln Val Met Pro Thr Arg 95 100 105 cag cat gcg gcg ttg gtc gat gtc gtg cca ctg acg caa gac atg ttc 446 Gln His Ala Ala Leu Val Asp Val Val Pro Leu Thr Gln Asp Met Phe 110 115 120 gag ttc cag ttt cgt acg gag gct cca gct gag ttt ttg cct ggc cag 494 Glu Phe Gln Phe Arg Thr Glu Ala Pro Ala Glu Phe Leu Pro Gly Gln 125 130 135 tat gcg ctg ctt cgc ttg cct ggc gtg gtc ggc aca agg gcg tac tcg 542 Tyr Ala Leu Leu Arg Leu Pro Gly Val Val Gly Thr Arg Ala Tyr Ser 140 145 150 155 atg agc aac ctg ccc aat ggc att ggc gaa tgg cat ttc atc gtc aaa 590 Met Ser Asn Leu Pro Asn Gly Ile Gly Glu Trp His Phe Ile Val Lys 160 165 170 cgc aaa ccg ggt ggt tgt gga acc gcg gtg ctt ttc gat gtc ctg aag 638 Arg Lys Pro Gly Gly Cys Gly Thr Ala Val Leu Phe Asp Val Leu Lys 175 180 185 cga ggt gat gct att gag ttg gag ggt cct tac ggg acg gct tat ctg 686 Arg Gly Asp Ala Ile Glu Leu Glu Gly Pro Tyr Gly Thr Ala Tyr Leu 190 195 200 cgt acc gaa acc ggt aga ggt gtc gtc tgc att ggt ggc ggc tcc gga 734 Arg Thr Glu Thr Gly Arg Gly Val Val Cys Ile Gly Gly Gly Ser Gly ２０５２１０
２１５ｃｔｔｔｃｔｃｃｇａｔｇｔｔｇｔｃａａｔｃｃｔｇｃｇｃ
ｇｇｃｇｃａｇｔｇｔｇｃａａｔｃｃｇｇｃａ７８２ＬｅｕＳｅｒＰｒｏＭｅｔＬｅｕＳｅｒＩｌｅＬｅｕＡｒｇ
ＧｌｙＡｌａＶａｌＣｙｓＡｓｎＰｒｏＡｌａ２２０２２５
２３０２３５ａｔｇａｃｃｇａａｃｇｇｃｇｃｃｔｇｃｔｇａｔｇｔｔｃ
ｔａｔｇｇｔｇｇｃｃｇａａｃｇｃｃｇｃｔｇ８３０ＭｅｔＴｈｒＧｌｕＡｒｇＡｒｇＬｅｕＬｅｕＭｅｔＰｈｅ
ＴｙｒＧｌｙＧｌｙＡｒｇＴｈｒＰｒｏＬｅｕ２４０
２４５２５０ｇａｔｃａｔｔｇｃｇｔｔｇｃａｇａｃｇｔｇｔｔｔｇｃｇ
ｇｇｔｇａｇｃｃｔｇａｇｔｔｇａａｇｃｇａ８７８ＡｓｐＨｉｓＣｙｓＶａｌＡｌａＡｓｐＶａｌＰｈｅＡｌａ
ＧｌｙＧｌｕＰｒｏＧｌｕＬｅｕＬｙｓＡｒｇ２５５２６０
２６５ｃｇｔｇｔｃｇａａｔｔａｔｔｔａｇｃｇｃｇａｔｃｔｃｃ
ｇａｔｇｔａａａｃｇｃｔｇａｇａｔｇｇｃｃ９２６ＡｒｇＶａｌＧｌｕＬｅｕＰｈｅＳｅｒＡｌａＩｌｅＳｅｒ
ＡｓｐＶａｌＡｓｎＡｌａＧｌｕＭｅｔＡｌａ２７０２７５
２８０ａａｔｔｇｇｇａｔｇｇｔｇａｇｃｇｃｇｇａｔｔｇａｔｃ
ｃａｔｇａｇｇｔｇｃｔａｇｃｇａａｇｃａｃ９７４ＡｓｎＴｒｐＡｓｐＧｌｙＧｌｕＡｒｇＧｌｙＬｅｕＩｌｅ
ＨｉｓＧｌｕＶａｌＬｅｕＡｌａＬｙｓＨｉｓ２８５２９０
２９５ａｔｃｇｇｃｃｃｇａａｃｃｃａｇｇｇｃａａｔａｃｇａｃ
ｔｔｔｔａｔｔｔｃｔｇｃｇｇｃｃｃｇｃｃａ１０２２ＩｌｅＧｌｙＰｒｏＡｓｎＰｒｏＧｌｙＧｌｎＴｙｒＡｓｐ
ＰｈｅＴｙｒＰｈｅＣｙｓＧｌｙＰｒｏＰｒｏ３００３０５
３１０３１５ｃｃｔａｔｇａｃｇｇａｔｇｃｇｇｔｇｃａｃａａｇｃｔｇ
ｔｔｇｇｔｔｃｔａａａｔｔａｃｃｇｔｇｔｇ１０７０ＰｒｏＭｅｔＴｈｒＡｓｐＡｌａＶａｌＨｉｓＬｙｓＬｅｕ
ＬｅｕＶａｌＬｅｕＡｓｎＴｙｒＡｒｇＶａｌ cca tct gaa caa cta cat ttc gat cgc ttt gtt tgagtcgtat gtttttcgcc 1123 Pro Ser Glu Gln Leu His Phe Asp Arg Phe Val 335 340 gaaataaatc tagtaggtaa tcccccggtt ttgccgggga ggcaaaccgc aatttaattt 1183 ttgagcttcc ctcggttttt cgccttccag aggccccgag ttatgcagcc gtatcctttg 1243 tccgctgagc cgcaagccag tcttgcatga actgagttgg tgacatgaag ccgagcgatg 1303 aatgacgacg actgcggtta taaaacactt cgatgtattc gaacaagtcc gcaacggcat 1363 cgcgatgcgt gcgataacgg gtgccgtgca cccgctcgtt cttcaggcta ttgaagaagc 1423 tttccgtcgg cgcgttgtcc cagcagctgc ctttgcgact catcgagcag cgcatcccgt 1483 acgaggccag cttgcgctgg aagtcgtggc tggcgtattg actgcctcta tcggaatgat 1543 gcagcgcgcc gggcgccggc cggcggcgga accacgccat tgtcagcgcg tcagtgacga 1603 gctccgtcgt catgcgcggc ttgacggacc aacccacgac ctcccgattg aacaggtcga 1663 gcgtgaccgc cagatacagc cagccctcgt ctgtccagat gtacgtgatg tccgaggtga 1723 acacctgatt gggctcggcc ggcgtgaagt tgcggttcaa cacattcggt gcgaccggca 1783 gcttgtgccg agaatcggtt gtcacgcgat aacggcgctt gtggcgggcc cgaatgccat 1843 tggcgctcat cagccgctcc acacgtgctt tgctagccgg aaagccgcga gaacgcacct 1903 cttcggtcat gcgcggcgag ccgtaagcgc ctttgaactt ggcatgaatc gttcgaatca 1963 acgtcagcag ttgcgcatcg gtcagccgct gccgctcagg cgtgccgccg cgcttccagg 2023 cacgatagcc gttcacgctc acaccaagga cctcgcacag cgccgccagc ggatagtgcc 2083 ggcactgcgt gtcaatccag gcgaacttca caggaggtcc ttcgcgaaga acgccgccgc 2143 tttttttgcg atttccagct ccatctgcaa gcgcttgttt tccgctcgca ggcgcgagag 2203 ttccatctgc tctgccgtga cgaccttcgc cccggggccg ttcagcttgc cagcttcgca 2263 agccttgagc cagttgcgca aagtctgcat cgacatgcct agctcgcggg ccacggcgct 2323 tatgccttgc ccgtccttga ctcgttgcac ggcggcttcc ttgaactccg ccgtgtacac 2383 ctggtgcggt accttgaaca tttcttcttt ccttcctttc ggtcgagttt atacgcgacc 2443 tgctggaagg cgaaatttca ggggaagctc atttttaact aaaggaggaa cgaac atg 2501 Met gca tgg ctt gaa gga caa agc gtt ttt ttg acg ggt ggt gtt gca ggt 2549 Ala Trp Leu Glu Gly Gln Ser Val Phe Leu Thr Gly Gly Val Ala Gly 345 350 355 ctc ggt cga gcg ctc gta aaa aga ctt gta gaa gaa ggt gcc aac gtc 2597 Leu Gly Arg Ala Leu Val Lys Arg Leu Val Glu Glu Gly Ala Asn Val 360 365 370 375 act gtg ttg gat cga aat gca cgg ggg ctt gat gag ctc gtt gaa agt 2645 Thr Val Leu Asp Arg Asn Ala Arg Gly Leu Asp Glu Leu Val Glu Ser 380 385 390 ttt aag gga cgg gtc gcg ggc tcg ccc ggc gat gtg cgc aac ttg gcc 2693 Phe Lys Gly Arg Val Ala Gly Ser Pro Gly Asp Val Arg Asn Leu Ala 395 400 405 gat aac cgc aag gcc gtc gaa ctg gct gtg gag cgt ttc ggc aag ctg 2741 Asp Asn Arg Lys Ala Val Glu Leu Ala Val Glu Arg Phe Gly Lys Leu 410 415 420 gat act ttc atc ggc aac gcc ggc atc tgg gac tat tct gtg ccc ctt 2789 Asp Thr Phe Ile Gly Asn Ala Gly Ile Trp Asp Tyr Ser Val Pro Leu 425 430 435 gtc gac ctg ccg gac gat gcc atc agc gaa gcc ttt gat gag gtc att 2837 Val Asp Leu Pro Asp Asp Ala Ile Ser Glu Ala Phe Asp Glu Val Ile 440 445 450 455 gga atc aat cta atg ggc tac gtg atg ggc atc aaa gcc gca gcg ccg 2885 Gly Ile Asn Leu Met Gly Tyr Val Met Gly Ile Lys Ala Ala Ala Pro 460 465 470 gcg ttg gtg cgc tcc cga ggg tca gtt atc ttg acc ctg tca aac tcc 2933 Ala Leu Val Arg Ser Arg Gly Ser Val Ile Leu Thr Leu Ser Asn Ser 475 480 485 gct ttc tat gca ggt ggc ggc ggc gtg ctc tac acc gca gcc aag cac 2981 Ala Phe Tyr Ala Gly Gly Gly Gly Val Leu Tyr Thr Ala Ala Lys His 490 495 500 gcg gca gtg gga ctg att aag cag gcg gcg cat gag ttg gcc ccc tat 3029 Ala Ala Val Gly Leu Ile Lys Gln Ala Ala His Glu Leu Ala Pro Tyr 505 510 515 gtg cgc gtc aac ggt gtg gca cct ggc gcg att gct tct gat ctg cgt 3077 Val Arg Val Asn Gly Val Ala Pro Gly Ala Ile Ala Ser Asp Leu Arg 520 525 530 535 gga ccg aag tcg ctt ggg atg ggt gag cag tcg tta acc tct gta ccc 3125 Gly Pro Lys Ser Leu Gly Met Gly Glu Gln Ser Leu Thr Ser Val Pro 540 545 550 ttg gcc gac ctc gtc aaa gac att gcc ccg atc ggc agg ctg tct gac 3173 Leu Ala Asp Leu Val Lys Asp Ile Ala Pro Ile Gly Arg Leu Ser Asp 555 560 565 aca gag gag tac acc ggt aac tat gtc tac ctg gct tct gcc cgc aac 3221 Thr Glu Glu Tyr Thr Gly Asn Tyr Val Tyr Leu Ala Ser Ala Arg Asn 570 575 580 tca gca cca gca acc ggc gtg atc atc aac tgc gat ggt ggc ttg ggt 3269 Ser Ala Pro Ala Thr Gly Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Gly Leu Gly 585 590 595 gtg cga agc gtc ctt ggc cct gcc agc ggt ggc aag ggc tta cta gaa 3317 Val Arg Ser Val Leu Gly Pro Ala Ser Gly Gly Lys Gly Leu Leu Glu 600 605 610 615 aaa ttc ggc ggc tgagggacaa cttctcggca tgccagtgtt aagtggttga 3369 Lys Phe Gly Gly cttattacag gagaagcag atg agt acc aat cgt acc cag gtc gac gtg gaa 3421 Met Ser Thr Asn Arg Thr Gln Val Asp Val Glu 620 625 630 tct ctc gtt gac gtt aaa aac ggc ata caa gcc aag aga att ttt tgg 3469 Ser Leu Val Asp Val Lys Asn Gly Ile Gln Ala Lys Arg Ile Phe Trp 635 640 645 gat caa cag atc tac gat ctt gaa att gaa cag att ttt gga aag tgc 3517 Asp Gln Gln Ile Tyr Asp Leu Glu Ile Glu Gln Ile Phe Gly Lys Cys 650 655 660 tgg caa ttc ctc acg cat gac agc ttg att ccg aat cct ggc gat ttc 3565 Trp Gln Phe Leu Thr His Asp Ser Leu Ile Pro Asn Pro Gly Asp Phe 665 670 675 acc act ggc tac atg gcc gaa gat gaa gtg ata gtc acg cgg caa gac 3613 Thr Thr Gly Tyr Met Ala Glu Asp Glu Val Ile Val Thr Arg Gln Asp 680 685 690 gat gga tcc gta aag gcc ttt ctg aat gtt tgc act cac cgt ggc gct 3661 Asp Gly Ser Val Lys Ala Phe Leu Asn Val Cys Thr His Arg Gly Ala 695 700 705 710 cgg ctt gtc gcg gcg gaa gcc ggc aat gcg cgt gcg ttc agt tgc acc 3709 Arg Leu Val Ala Ala Glu Ala Gly Asn Ala Arg Ala Phe Ser Cys Thr 715 720 725 tat cac ggc tgg tgt ttc ggc atg gat ggc gcc ttg aag gtg gtg ccg 3757 Tyr His Gly Trp Cys Phe Gly Met Asp Gly Ala Leu Lys Val Val Pro 730 735 740 atg gaa gaa gag ctc tat cgt ggg tct ttg gat aaa tcg aaa ttc ggc 3805 Met Glu Glu Glu Leu Tyr Arg Gly Ser Leu Asp Lys Ser Lys Phe Gly 745 750 755 ctt cgg gaa atc cgc gtt gaa agc tac aga ggt ctt tat tac ggc aac 3853 Leu Arg Glu Ile Arg Val Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Tyr Tyr Gly Asn 760 765 770 ttc gac gct caa gcg ccc agc ttg aat gac tat ctt ggt gac gtg aag 3901 Phe Asp Ala Gln Ala Pro Ser Leu Asn Asp Tyr Leu Gly Asp Val Lys 775 780 785 790 ttc tac ctg gat att tgg atg gat atc aat ggc ggc att gag ttg gtc 3949 Phe Tyr Leu Asp Ile Trp Met Asp Ile Asn Gly Gly Ile Glu Leu Val 795 800 805 ggg ccg cca agt cga tca tta ttg aac tgc aac tgg aag act ccc gcc 3997 Gly Pro Pro Ser Arg Ser Leu Leu Asn Cys Asn Trp Lys Thr Pro Ala 810 815 820 gaa aat ttc gta ggc gat gcc tac cac gtg ggg tgg act cac ctc gca 4045 Glu Asn Phe Val Gly Asp Ala Tyr His Val Gly Trp Thr His Leu Ala 825 830 835 tcc ctg atg gct ctt ggc ggc gaa ctt gcg gca att ggt gga aat gag 4093 Ser Leu Met Ala Leu Gly Gly Glu Leu Ala Ala Ile Gly Gly Asn Glu 840 845 850 gcc ccg ccc aac gaa ggt ctt ggt atg cag gtg aca tcg cga ttt ggg 4141 Ala Pro Pro Asn Glu Gly Leu Gly Met Gln Val Thr Ser Arg Phe Gly 855 860 865 870 cat ggc ttt ggc gtc ctt tgg gat agt gcc cca gcg gta cat gct att 4189 His Gly Phe Gly Val Leu Trp Asp Ser Ala Pro Ala Val His Ala Ile 875 880 885 aat tcc aag gcg ggc act ctc tac cgg gag tgg ttt gcc agc agg aag 4237 Asn Ser Lys Ala Gly Thr Leu Tyr Arg Glu Trp Phe Ala Ser Arg Lys 890 895 900 ccc aag atg gtg gag aag ctt gga gcg aaa gtc ggt cgc att tat ggc 4285 Pro Lys Met Val Glu Lys Leu Gly Ala Lys Val Gly Arg Ile Tyr Gly 905 910 915 tcg cat atc aat ggc acg gtt ttt ccg aat aat tcc tac ctt tta ggt 4333 Ser His Ile Asn Gly Thr Val Phe Pro Asn Asn Ser Tyr Leu Leu Gly 920 925 930 acc aac acg tcc aag ttg tgg gtg cca cgt ggt cct cac caa att gag 4381 Thr Asn Thr Ser Lys Leu Trp Val Pro Arg Gly Pro His Gln Ile Glu 935 940 945 950 gtc ttc acg tgg gcg ata gtg gaa aaa gag atg cca gcc gaa ctg aaa 4429 Val Phe Thr Trp Ala Ile Val Glu Lys Glu Met Pro Ala Glu Leu Lys 955 960 965 aat gcc gtg gta tca ggc atg aat tcg acg ttc gga agt gct ggc atg 4477 Asn Ala Val Val Ser Gly Met Asn Ser Thr Phe Gly Ser Ala Gly Met 970 975 980 ctt gaa gcc gac gac act gac aac atg gaa acc atg acg caa aac aac 4525 Leu Glu Ala Asp Asp Thr Asp Asn Met Glu Thr Met Thr Gln Asn Asn 985 990 995 cgg ggg cga atg acc cgt gaa ggg aag ttg aac tca caa ctg ggg ctc 4573 Arg Gly Arg Met Thr Arg Glu Gly Lys Leu Asn Ser Gln Leu Gly Leu 1000 1005 1010 ggt ttc gac aag ttg gat cct gac ttt cct ggg gtg atc ggg caa tct 4621 Gly Phe Asp Lys Leu Asp Pro Asp Phe Pro Gly Val Ile Gly Gln Ser 1015 1020 1025 1030 gcc att ggt gaa acc tct tac aga ggg ttt tac cgg gcc tat aag gaa 4669 Ala Ile Gly Glu Thr Ser Tyr Arg Gly Phe Tyr Arg Ala Tyr Lys Glu 1035 1040 1045 att atg ggc gcc gac aac tgg aag gcg atc ttg aaa tta gat ccg gat 4717 Ile Met Gly Ala Asp Asn Trp Lys Ala Ile Leu Lys Leu Asp Pro Asp 1050 1055 1060 gcc tgg aag cat gaa ctc ata ggt caa taacaggtaa atcagcaatc 4764 Ala Trp Lys His Glu Leu Ile Gly Gln 1065 1070 taggagatga at atg aac gaa ctc ata cca gtg cgt gga tct gaa agc gaa 4815 Met Asn Glu Leu Ile Pro Val Arg Gly Ser Glu Ser Glu 1075 1080 gaa gtc gtc agc acg ctg tat cga gaa gct cgg ctg ctc gac cat gaa 4863 Glu Val Val Ser Thr Leu Tyr Arg Glu Ala Arg Leu Leu Asp His Glu 1085 1090 1095 1100 gaa tat cga gag tgg atg aaa atg gtt cat cca gat atc caa tac caa 4911 Glu Tyr Arg Glu Trp Met Lys Met Val His Pro Asp Ile Gln Tyr Gln 1105 1110 1115 gcg tac ttt caa caa ctt cgg tac cga aag gac aaa aga tac aag ctt 4959 Ala Tyr Phe Gln Gln Leu Arg Tyr Arg Lys Asp Lys Arg Tyr Lys Leu 1120 1125 1130 cct gac aaa gtt tat acg att gat gag cgc cat gat ttt ttg gat gcg 5007 Pro Asp Lys Val Tyr Thr Ile Asp Glu Arg His Asp Phe Leu Asp Ala 1135 1140 1145 cgc atc agg caa ttt gaa acg ggc atg caa tgg tcc gtt gac cca ccg 5055 Arg Ile Arg Gln Phe Glu Thr Gly Met Gln Trp Ser Val Asp Pro Pro 1150 1155 1160 gag cgg att cgg agg tcc ttg tca aac atc gag gtt ttc aag gcc tca 5103 Glu Arg Ile Arg Arg Ser Leu Ser Asn Ile Glu Val Phe Lys Ala Ser 1165 1170 1175 1180 agt act ggc aac tat cag gtt ttc ctc aat gtc ttc gtt gtg cgt aac 5151 Ser Thr Gly Asn Tyr Gln Val Phe Leu Asn Val Phe Val Val Arg Asn 1185 1190 1195 cgc cgt gtt cat gat gaa acc acc tat tcc tat ggt cgt gag gaa gaa 5199 Arg Arg Val His Asp Glu Thr Thr Tyr Ser Tyr Gly Arg Glu Glu Glu 1200 1205 1210 tgg gtc aga ggc gaa gca gga ttg cag tta ctc aag aga gtc gtg agt 5247 Trp Val Arg Gly Glu Ala Gly Leu Gln Leu Leu Lys Arg Val Val Ser 1215 1220 1225 ctc gat gag cgg ttt ctt cct tgg taagaatgtg aacttcttct tgtgatcaat 5301 Leu Asp Glu Arg Phe Leu Pro Trp 1230 1235 tgaagacact gaaagcatga acagcttttt aacttcgtaa gaaaagcgga cggtctaccg 5361 tcaacctccg ctggttcctg gctgaccttc atttactcaa aatgcattat ggcagcttgt 5421 ggcatggccg ttttacttcc aggaaatcct tct atg ctt tcc ttc tat ttt gac 5475 Met Leu Ser Phe Tyr Phe Asp 1240 ttt gtg agt ccg ttc tcc tat ctc gcc agc att cgg ttg cct gag att 5523 Phe Val Ser Pro Phe Ser Tyr Leu Ala Ser Ile Arg Leu Pro Glu Ile 1245 1250 1255 gtg caa cgc tat ggc att tcg gtt tct tac aag ccg att gat att gca 5571 Val Gln Arg Tyr Gly Ile Ser Val Ser Tyr Lys Pro Ile Asp Ile Ala 1260 1265 1270 1275 tgt gcc aag cgt gcg att ggc aac gtg ggg ccg tct aac cgg gat atg 5619 Cys Ala Lys Arg Ala Ile Gly Asn Val Gly Pro Ser Asn Arg Asp Met 1280 1285 1290 ccg gtc aag ctc acc cac ctt tcc agg gat ctg caa cgc tgg gcg caa 5667 Pro Val Lys Leu Thr His Leu Ser Arg Asp Leu Gln Arg Trp Ala Gln 1295 1300 1305 cga tat ggc aca ccg ctg aag ttc cct cca agc ttc gac tcc cga cgt 5715 Arg Tyr Gly Thr Pro Leu Lys Phe Pro Pro Ser Phe Asp Ser Arg Arg 1310 1315 1320 ttg aat aca ggt ttc ttc tat gct gca g 5743 Leu Asn Thr Gly Phe Phe Tyr Ala Ala 1325 1330 <210> 2 <211> 342 <212> PRT <213> Burkholderia sp. <400> 2 Met Ser Pro Gln Ser Phe Gln Val Arg Ile Gly Ala Gly Asp Thr Pro 1 5 10 15 Val Phe Gln Cys Ser Thr Asp Glu Thr Leu Leu Ala Ala Ala Leu Lys 20 25 30 Ala Gly Leu Gly Phe Pro Tyr Glu Cys Gln Ser Gly Ser Cys Ser Ser 35 40 45 Cys Arg Phe Gln Leu Leu Glu Gly Asp Val Lys Asp Leu Trp Ser Asn 50 55 60 Ala Pro Gly Leu Asn Ala Glu Ala Arg Glu Cys Gly Met His Leu Gly 65 70 75 80 Cys Gln Ser Thr Pro Gly Ser Asp Cys Arg Ile Lys Leu Arg Leu Lys 85 90 95 Pro Gly Tyr Val Pro Gln Val Met Pro Thr Arg Gln His Ala Ala Leu 100 105 110 Val Asp Val Val Pro Leu Thr Gln Asp Met Phe Glu Phe Gln Phe Arg 115 120 125 Thr Glu Ala Pro Ala Glu Phe Leu Pro Gly Gln Tyr Ala Leu Leu Arg 130 135 140 Leu Pro Gly Val Val Gly Thr Arg Ala Tyr Ser Met Ser Asn Leu Pro 145 150 155 160 Asn Gly Ile Gly Glu Trp His Phe Ile Val Lys Arg Lys Pro Gly Gly 165 170 175 Cys Gly Thr Ala Val Leu Phe Asp Val Leu Lys Arg Gly Asp Ala Ile 180 185 190 Glu Leu Glu Gly Pro Tyr Gly Thr Ala Tyr Leu Arg Thr Glu Thr Gly 195 200 205 Arg Gly Val Val Cys Ile Gly Gly Gly Ser Gly Leu Ser Pro Met Leu 210 215 220 Ser Ile Leu Arg Gly Ala Val Cys Asn Pro Ala Met Thr Glu Arg Arg 225 230 235 240 Leu Leu Met Phe Tyr Gly Gly Arg Thr Pro Leu Asp His Cys Val Ala 245 250 255 Asp Val Phe Ala Gly Glu Pro Glu Leu Lys Arg Arg Val Glu Leu Phe 260 265 270 Ser Ala Ile Ser Asp Val Asn Ala Glu Met Ala Asn Trp Asp Gly Glu 275 280 285 Arg Gly Leu Ile His Glu Val Leu Ala Lys His Ile Gly Pro Asn Pro 290 295 300 Gly Gln Tyr Asp Phe Tyr Phe Cys Gly Pro Pro Pro Met Thr Asp Ala 305 310 315 320 Val His Lys Leu Leu Val Leu Asn Tyr Arg Val Pro Ser Glu Gln Leu 325 330 335 His Phe Asp Arg Phe Val 340 <210> 3 <211> 277 <212> PRT <213> Burkholderia sp. <400> 3 Met Ala Trp Leu Glu Gly Gln Ser Val Phe Leu Thr Gly Gly Val Ala 1 5 10 15 Gly Leu Gly Arg Ala Leu Val Lys Arg Leu Val Glu Glu Gly Ala Asn 20 25 30 Val Thr Val Leu Asp Arg Asn Ala Arg Gly Leu Asp Glu Leu Val Glu 35 40 45 Ser Phe Lys Gly Arg Val Ala Gly Ser Pro Gly Asp Val Arg Asn Leu 50 55 60 Ala Asp Asn Arg Lys Ala Val Glu Leu Ala Val Glu Arg Phe Gly Lys 65 70 75 80 Leu Asp Thr Phe Ile Gly Asn Ala Gly Ile Trp Asp Tyr Ser Val Pro 85 90 95 Leu Val Asp Leu Pro Asp Asp Ala Ile Ser Glu Ala Phe Asp Glu Val 100 105 110 Ile Gly Ile Asn Leu Met Gly Tyr Val Met Gly Ile Lys Ala Ala Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Val Arg Ser Arg Gly Ser Val Ile Leu Thr Leu Ser Asn 130 135 140 Ser Ala Phe Tyr Ala Gly Gly Gly Gly Val Leu Tyr Thr Ala Ala Lys 145 150 155 160 His Ala Ala Val Gly Leu Ile Lys Gln Ala Ala His Glu Leu Ala Pro 165 170 175 Tyr Val Arg Val Asn Gly Val Ala Pro Gly Ala Ile Ala Ser Asp Leu 180 185 190 Arg Gly Pro Lys Ser Leu Gly Met Gly Glu Gln Ser Leu Thr Ser Val 195 200 205 Pro Leu Ala Asp Leu Val Lys Asp Ile Ala Pro Ile Gly Arg Leu Ser 210 215 220 Asp Thr Glu Glu Tyr Thr Gly Asn Tyr Val Tyr Leu Ala Ser Ala Arg 225 230 235 240 Asn Ser Ala Pro Ala Thr Gly Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Gly Leu 245 250 255 Gly Val Arg Ser Val Leu Gly Pro Ala Ser Gly Gly Lys Gly Leu Leu 260 265 270 Glu Lys Phe Gly Gly 275 <210> 4 <211> 452 <212> PRT <213> Burkholderia sp. <400> 4 Met Ser Thr Asn Arg Thr Gln Val Asp Val Glu Ser Leu Val Asp Val 1 5 10 15 Lys Asn Gly Ile Gln Ala Lys Arg Ile Phe Trp Asp Gln Gln Ile Tyr 20 25 30 Asp Leu Glu Ile Glu Gln Ile Phe Gly Lys Cys Trp Gln Phe Leu Thr 35 40 45 His Asp Ser Leu Ile Pro Asn Pro Gly Asp Phe Thr Thr Gly Tyr Met 50 55 60 Ala Glu Asp Glu Val Ile Val Thr Arg Gln Asp Asp Gly Ser Val Lys 65 70 75 80 Ala Phe Leu Asn Val Cys Thr His Arg Gly Ala Arg Leu Val Ala Ala 85 90 95 Glu Ala Gly Asn Ala Arg Ala Phe Ser Cys Thr Tyr His Gly Trp Cys 100 105 110 Phe Gly Met Asp Gly Ala Leu Lys Val Val Pro Met Glu Glu Glu Leu 115 120 125 Tyr Arg Gly Ser Leu Asp Lys Ser Lys Phe Gly Leu Arg Glu Ile Arg 130 135 140 Val Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Tyr Tyr Gly Asn Phe Asp Ala Gln Ala 145 150 155 160 Pro Ser Leu Asn Asp Tyr Leu Gly Asp Val Lys Phe Tyr Leu Asp Ile 165 170 175 Trp Met Asp Ile Asn Gly Gly Ile Glu Leu Val Gly Pro Pro Ser Arg 180 185 190 Ser Leu Leu Asn Cys Asn Trp Lys Thr Pro Ala Glu Asn Phe Val Gly 195 200 205 Asp Ala Tyr His Val Gly Trp Thr His Leu Ala Ser Leu Met Ala Leu 210 215 220 Gly Gly Glu Leu Ala Ala Ile Gly Gly Asn Glu Ala Pro Pro Asn Glu 225 230 235 240 Gly Leu Gly Met Gln Val Thr Ser Arg Phe Gly His Gly Phe Gly Val 245 250 255 Leu Trp Asp Ser Ala Pro Ala Val His Ala Ile Asn Ser Lys Ala Gly 260 265 270 Thr Leu Tyr Arg Glu Trp Phe Ala Ser Arg Lys Pro Lys Met Val Glu 275 280 285 Lys Leu Gly Ala Lys Val Gly Arg Ile Tyr Gly Ser His Ile Asn Gly 290 295 300 Thr Val Phe Pro Asn Asn Ser Tyr Leu Leu Gly Thr Asn Thr Ser Lys 305 310 315 320 Leu Trp Val Pro Arg Gly Pro His Gln Ile Glu Val Phe Thr Trp Ala 325 330 335 Ile Val Glu Lys Glu Met Pro Ala Glu Leu Lys Asn Ala Val Val Ser 340 345 350 Gly Met Asn Ser Thr Phe Gly Ser Ala Gly Met Leu Glu Ala Asp Asp 355 360 365 Thr Asp Asn Met Glu Thr Met Thr Gln Asn Asn Arg Gly Arg Met Thr 370 375 380 Arg Glu Gly Lys Leu Asn Ser Gln Leu Gly Leu Gly Phe Asp Lys Leu 385 390 395 400 Asp Pro Asp Phe Pro Gly Val Ile Gly Gln Ser Ala Ile Gly Glu Thr 405 410 415 Ser Tyr Arg Gly Phe Tyr Arg Ala Tyr Lys Glu Ile Met Gly Ala Asp 420 425 430 Asn Trp Lys Ala Ile Leu Lys Leu Asp Pro Asp Ala Trp Lys His Glu 435 440 445 Leu Ile Gly Gln 450 <210> 5 <211> 165 <212> PRT <213> Burkholderia sp. <400> 5 Met Asn Glu Leu Ile Pro Val Arg Gly Ser Glu Ser Glu Glu Val Val 1 5 10 15 Ser Thr Leu Tyr Arg Glu Ala Arg Leu Leu Asp His Glu Glu Tyr Arg 20 25 30 Glu Trp Met Lys Met Val His Pro Asp Ile Gln Tyr Gln Ala Tyr Phe 35 40 45 Gln Gln Leu Arg Tyr Arg Lys Asp Lys Arg Tyr Lys Leu Pro Asp Lys 50 55 60 Val Tyr Thr Ile Asp Glu Arg His Asp Phe Leu Asp Ala Arg Ile Arg 65 70 75 80 Gln Phe Glu Thr Gly Met Gln Trp Ser Val Asp Pro Pro Glu Arg Ile 85 90 95 Arg Arg Ser Leu Ser Asn Ile Glu Val Phe Lys Ala Ser Ser Thr Gly 100 105 110 Asn Tyr Gln Val Phe Leu Asn Val Phe Val Val Arg Asn Arg Arg Val 115 120 125 His Asp Glu Thr Thr Tyr Ser Tyr Gly Arg Glu Glu Glu Trp Val Arg 130 135 140 Gly Glu Ala Gly Leu Gln Leu Leu Lys Arg Val Val Ser Leu Asp Glu 145 150 155 160 Arg Phe Leu Pro Trp 165 <210> 6 <211> 96 <212> PRT <213> Burkholderia sp. <400> 6 Met Leu Ser Phe Tyr Phe Asp Phe Val Ser Pro Phe Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 15 Ser Ile Arg Leu Pro Glu Ile Val Gln Arg Tyr Gly Ile Ser Val Ser 20 25 30 Tyr Lys Pro Ile Asp Ile Ala Cys Ala Lys Arg Ala Ile Gly Asn Val 35 40 45 Gly Pro Ser Asn Arg Asp Met Pro Val Lys Leu Thr His Leu Ser Arg 50 55 60 Asp Leu Gln Arg Trp Ala Gln Arg Tyr Gly Thr Pro Leu Lys Phe Pro 65 70 75 80 Pro Ser Phe Asp Ser Arg Arg Leu Asn Thr Gly Phe Phe Tyr Ala Ala 85 90 95

【図面の簡単な説明】

【図１】pDBT1及びpDBT6を有する菌株のDBT分解率と生
育菌数の経時的変化を示す図である。

【図２】pDBT1及びpDBT6を各種制限酵素で消化した場合
の電気泳動の結果を示す図である。

【図３】pDBT1及びpDBT6を各種制限酵素で消化した場合
のサザンブロッテイングの結果を示す図である。

【図４】pPstI断片の制限酵素地図である。

【図５】pPstI断片上のDBT環開裂酵素をコードする遺伝
子の推定配置を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の(a)又は(b)のタンパク質をコード
する遺伝子。 (a) 配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタン
パク質 (b) 配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは
複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列により表され、かつDBTジオキシゲナーゼのフ
ェレドキシンリダクターゼサブユニットとしての機能を
有するタンパク質
【請求項２】以下の(a)又は(b)のタンパク質をコード
する遺伝子。 (a) 配列番号３記載のアミノ酸配列により表されるタン
パク質 (b) 配列番号３記載のアミノ酸配列において１若しくは
複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列により表され、かつジヒドロジオールDBTデヒ
ドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項３】以下の(a)又は(b)のタンパク質をコード
する遺伝子。 (a) 配列番号４記載のアミノ酸配列により表されるタン
パク質 (b) 配列番号４記載のアミノ酸配列において１若しくは
複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列により表され、かつDBTジオキシゲナーゼの鉄
−硫黄αサブユニットとしての機能を有するタンパク質
【請求項４】以下の(a)又は(b)のタンパク質をコード
する遺伝子。 (a) 配列番号５記載のアミノ酸配列により表されるタン
パク質 (b) 配列番号５記載のアミノ酸配列において１若しくは
複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列により表され、かつDBTジオキシゲナーゼの鉄
−硫黄βサブユニットとしての機能を有するタンパク質
【請求項５】以下の(a)又は(b)のタンパク質をコード
する遺伝子。 (a) 配列番号６記載のアミノ酸配列をN末端側に含むタ
ンパク質 (b) 配列番号６記載のアミノ酸配列において１若しくは
複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列をN末端側に含み、かつシス3-ヒドロキシ-チア
ナフェニル 2-オキソ-3-ブテン酸イソメラーゼ活性を有
するタンパク質
【請求項６】請求項１、２、３、４、又は５記載の遺
伝子を含むベクター。
【請求項７】請求項６記載のベクターを含有する形質
転換体。
【請求項８】以下の(a)又は(b)に示すタンパク質。 (a) 配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタン
パク質 (b) 配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは
複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列により表され、かつDBTジオキシゲナーゼのフ
ェレドキシンリダクターゼサブユニットとしての機能を
有するタンパク質
【請求項９】以下の(a)又は(b)に示すタンパク質。 (a) 配列番号３記載のアミノ酸配列により表されるタン
パク質 (b) 配列番号３記載のアミノ酸配列において１若しくは
複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列により表され、かつジヒドロジオールDBTデヒ
ドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項１０】以下の(a)又は(b)に示すタンパク質。 (a) 配列番号４記載のアミノ酸配列により表されるタン
パク質 (b) 配列番号４記載のアミノ酸配列において１若しくは
複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列により表され、かつDBTジオキシゲナーゼの鉄
−硫黄αサブユニットとしての機能を有するタンパク質
【請求項１１】以下の(a)又は(b)に示すタンパク質。 (a) 配列番号５記載のアミノ酸配列により表されるタン
パク質 (b) 配列番号５記載のアミノ酸配列において１若しくは
複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列により表され、かつDBTジオキシゲナーゼの鉄
−硫黄βサブユニットとしての機能を有するタンパク質
【請求項１２】以下の(a)又は(b)に示すタンパク質。 (a) 配列番号６記載のアミノ酸配列をN末端側に含むタ
ンパク質 (b) 配列番号６記載のアミノ酸配列において１若しくは
複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列をN末端側に含み、かつシス3-ヒドロキシ-チア
ナフェニル 2-オキソ-3-ブテン酸イソメラーゼ活性を有
するタンパク質