JPH10327885A

JPH10327885A - シトクロムｃおよびその遺伝子

Info

Publication number: JPH10327885A
Application number: JP10092113A
Authority: JP
Inventors: Akira Asakura; 明朝倉; Tatsuo Hoshino; 達雄星野; Masako Shinjoh; 雅子新城; Noribumi Tomiyama; 哲史富山
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1997-04-04
Filing date: 1998-04-03
Publication date: 1998-12-15
Anticipated expiration: 2018-04-03
Also published as: ES2362981T3; CA2226906A1; DE69842160D1; JP4221075B2; NO981220D0; CN1220314A; ID20139A; AU6063998A; KR19980081041A; BR9801228A; KR100633603B1; NO981220L; HK1020757A1; US6037147A; MX9802646A; CN1180083C

Abstract

(57)【要約】【課題】電子受容体としての機能を有する蛋白質ファミ
リーに属する新規なシトクロムcを提供することを課題
とする。【解決手段】脱水素酵素から電子を受容するシトクロム
cを生産することができる微生物から種々の精製手段を
用いて、新規なシトクロムc活性を有するポリペプチド
を精製した。また、精製したポリペプチドのアミノ酸配
列の情報に基づいてプライマーを調製し、ポリメラーゼ
連鎖反応により該ポリペプチドをコードするDNAを単離
した。さらに、該DNAを含む発現ベクターを調製し、こ
れを宿主細胞に導入して、得られた形質転換体内で該ポ
リペプチドを発現させた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、シトクロムc活性
を有するポリぺプチドをコードするDNAおよび該DNAがコ
ードするポリぺプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】シトクロムcは、初発脱水素酵素と分子
状酸素をH₂Oに還元することによって基質の酸化を完了
させる末端酸化酵素との間の電子伝達を媒介する、必須
の成分の1つであることが知られている。この電子伝達
反応はヘム鉄の酸化還元に基づいている。最近では、例
えばヒドロジェノバクター・サーモフィリス（Hydrogen
obacter thermophilus）のシトクロムc552を用いること
によって（Kodamaら、米国特許第5459046号明細書）、
シトクロムcの電子伝達反応を生物の材料または要素を
模倣する新たな材料であるバイオチップとして使用しよ
うとの試みがなされている。グルコノバクター（Glucon
obacter）およびアセトバクター（Acetobacter）を含む
酢酸菌は、極めて効率的な糖および糖アルコール酸化能
を有し、酢、およびビタミンCの中間生成物として用い
られるL-ソルボースを製造するために工業的に用いられ
ている。シトクロムcは、酸化的発酵に際して、酸化を
完了させるために重要な役割を果たす。シトクロムc蛋
白質は、グルコノバクターなどの多くの生物体から精製
され、特徴分析がなされており、例えば松下（Matsushi
ta）らはグルコノバクター・サブオキシダンス（Glucon
obacter suboxydans）からのCO結合性シトクロムc553
（CO）（分子量48kDa）の精製を報告しているが（FEMS
Microbiol. Lett.、10:267〜270、1981）、後にシトク
ロムc553(CO)はグルコノバクターのアルコール脱水素酵
素の第2サブユニットと同一であることが判明した。ア
ルコール脱水素酵素の第2サブユニットが欠損したグル
コノバクターにおけるシトクロムc553（CO）の増幅は、
J. Ferment. Bioeng.、74:209〜213、1992（Y. Takeda
ら）に開示されているように、比生産速度（g細胞・時
間当たりのg産物）において生じるD-ソルビトールから
のL-ソルボースの生産がやや向上した。シトクロムc553
のほかに、シトクロムc551（AL）（分子量55KDa）およ
びシトクロムc551(CO)（分子量72kDa）もグルコノバク
ターから単離されている［Ameyamaら、Agri. Biol. Che
m. 51:2943〜2950（1987）］。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、電子
受容体としての機能を有する蛋白質ファミリーに属する
新規なシトクロムcを提供することである。より具体的
には、本発明の新規なシトクロムcは、アルコールおよ
びアルデヒド脱水素酵素などの脱水素酵素の電子受容体
として有用である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究を行った結果、脱水素酵素
から電子を受容するシトクロムcを生産することができ
る微生物から、新規なシトクロムcを単離することに成
功した。より具体的には、グルコノバクター属に属する
微生物から種々の精製手段を用いて、新規なシトクロム
c活性を有するポリペプチドを精製した。また、精製し
たポリペプチドのアミノ酸配列の情報に基づいてプライ
マーを調製し、ポリメラーゼ連鎖反応により該ポリペプ
チドをコードするDNAを単離した。さらに、該DNAを含む
発現ベクターを調製し、これを宿主細胞に導入して、得
られた形質転換体内で該ポリペプチドを発現させること
に成功し、本発明を完成した。

【０００５】すなわち、本発明は、電子受容体としての
機能を有する蛋白質ファミリーに属する新規なシトクロ
ムc活性を有するポリペプチドに関する。

【０００６】また、本発明は、該ポリペプチドの機能的
誘導体をも含む。このような機能的誘導体は、当技術分
野で周知または本明細書に記載されるアッセイによって
測定されるシトクロムc活性を保持するように、本発明
のアミノ酸配列に基づいて、この配列の1つまたはそれ
以上のアミノ酸残基が付加、挿入、欠失および／または
置換されたものと定義される。このような機能的誘導体
は、当技術分野で周知のペプチドの化学合成、または当
技術分野で周知であって例えばサムブルックら（分子ク
ローニング（Molecular Cloning）、Cold Spring Harbo
ur LaboratoryPress、New York、USA、第2版、1989）に
開示されている方法による、本明細書で開示されたDNA
を基礎とする組換え技術によって作製することができ
る。このような分子の活性を概ね変化させない蛋白質お
よびペプチドにおけるアミノ酸の置換は当技術分野では
知られており、例えばニューラス（H. Neurath）および
ヒル（R. L. Hill）の「蛋白質（The Protein）」（Aca
demic Press、New York、1979。特に14ページの図6を参
照のこと）において記載されている。最も多く生じる置
換は以下の通りである：Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、T
hr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gl
y、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Le
u/Val、Ala/Glu、Asp/Gly、およびこれらの逆も同様で
ある。

【０００７】さらに本発明は、原核生物または真核生物
の宿主細胞において発現される少なくともシトクロムc5
51の一次構造の一部および生物学的特性の1つを有する
ポリペプチドをコードするDNA、例えば配列表に開示さ
れたもののほかにそれらの相補鎖またはこれらの配列を
含むDNA配列を含むDNA、好ましくは標準的な条件下にお
いてこのような配列またはそれらの断片とハイブリダイ
ズするDNA、および遺伝的コードの縮退のために標準的
な条件下ではこのような配列とハイブリダイズしない
が、完全に同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするDNA、を含む。

【０００８】ハイブリダイゼーションのための「標準的
な条件」とは、ここでは、例えばサムブルック（Sambro
ok）ら、「分子クローニング（Molecular Cloning）」
第2版、Cold Spring Harbour Laboratory Press、198
9、New Yorkに開示された、特定のハイブリダイゼーシ
ョン信号を検出するために当業者が一般に用いる条件、
または好ましくは当業者が周知の、例えばサムブルック
ら（前記）に記載されている、いわゆるストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件およびストリンジェン
トでない洗浄条件、より好ましくはいわゆる中程度にス
トリンジェントな条件、さらにより好ましくはいわゆる
ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよびスト
リンジェントな洗浄条件を意味する。

【０００９】さらに本発明の別の目的は、シトクロムc
活性を有し、上記のように定義されたDNAによってコー
ドされるポリペプチド、またはシトクロムc活性を有
し、以下の物理化学的特性をそれぞれ示すシトクロムc5
51 IおよびIIからなる群から選択されるグルコノバクタ
ー（Gluconobacter）属に属する微生物から得られるま
たは得られたポリペプチドを提供することである： (a)シトクロムc551 I： (a)分子量：ゲル濾過では約19±1 kDa、SDS-PAGE分析で
は約18.0±1.0 kDa、 (b)吸収スペクトル：還元型は、それぞれα、βおよび
γピークとして551nm、522nmおよび417nmで最大吸収を
示す、 (c)ヘム含量：ヘム約1モル／蛋白質1モル、 (d)等電点：約3.95、および (b)シトクロムc551 II： (a)分子量：ゲル濾過では約19±1 kDa、SDS-PAGE分析で
は約16.8±1.0 kDa、 (b)吸収スペクトル：還元型はそれぞれα、βおよびγ
ピークとして551nm、522nmおよび417nmで最大吸収を示
す、 (c)ヘム含量：ヘム約1モル／蛋白質1モル、 (d)等電点：約3.75。

【００１０】さらに本発明の別の目的は、アルコール／
アルデヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコー
ドするDNA配列をさらに含む、上記のように特定したDNA
を提供することである。このような構築物は、例えば実
施例6に記載したようにして調製することができる。

【００１１】さらに本発明の別の目的は、上記のように
定義したDNAを含む、原核生物または真核生物の宿主細
胞における発現に適したベクター、およびこのようなベ
クターで形質転換された宿主細胞、より具体的にはその
ゲノム中に上記のように定義したDNA配列が組み込まれ
た宿主細胞、さらに好ましくは真核生物、好ましくは哺
乳動物もしくは植物細胞由来のこのような宿主細胞、ま
たは、原核生物由来の、特に大腸菌、シュードモナス・
プチダ（Pseudomonas putida）、アセトバクター・キシ
リナム（Acetobacter xylinum）、アセトバクター・パ
ストゥリアヌス（Acetobacter pasteurianus）、アセト
バクター・アセチ（Acetobacter aceti）、アセトバク
ター・ハンセニイ（Acetobacter hansenii）およびグル
コノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydan
s）、例えばグルコノバクター・オキシダンス（Glucono
bacter oxydans）DSM No.4025、のような細菌からなる
群から選択される、このような宿主細胞を提供すること
である。

【００１２】さらに、本発明は、上記のように定義した
宿主細胞を適当な培地で培養し、この培養物からのシト
クロムc551を回収することを含む、シトクロムc551の製
造方法を提供することを目的とする。

【００１３】また、本発明のシトクロムcは、L-ソルボ
ースまたはD-ソルビトールからの2KGAの製造の改善に適
用可能であり、さらに、インビボまたはインビトロにお
けるアルコールおよびアルデヒドの脱水素酵素の存在下
での対応する基質からのアルデヒド、カルボン酸および
ケトンの製造にも適用可能である。

【００１４】化合物2KGAは、アスコルビン酸（ビタミン
C）を製造するために重要な中間体であり、前者は周知
のライヒスタイン（Reichstein）法に従って後者に変換
することができる。L-ソルボースまたはD-ソルビトール
からの発酵による2KGAの製造は周知である。グルコノバ
クター（Gluconobacter）菌株は、Agric. Biol. Che
m.、54(5)、1211〜1218、1990（T. Hoshinoら）および
欧州特許公報第606621号に開示されているソルボースお
よびソルボソン脱水素酵素によって触媒される反応を介
して2KGAを生産することが知られている。

【００１５】したがって、本発明のシトクロムcを用い
てビタミンCを製造することも、本発明の目的である。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明をさらに詳しく説明する前
に、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter
oxydans）から取得可能な、精製されたアイソフォームI
およびIIからなるシトクロムc551の物理化学的特性を以
下に示す。 (1)分子量精製段階のゲル濾過において、シトクロムc551 Iおよび
IIの見かけの分子量は約19+/-1kDaであった。また、SDS
-PAGE分析では、シトクロムc551 IおよびIIの分子量は
それぞれ18.0+/-1.0および16.8+/-1.0kDaであった。し
たがって、シトクロムc551には近似した分子量を示す2
種類があり、シトクロムc551 IおよびIIは両方とも単量
体の蛋白質であった。 (2)吸収スペクトルおよびヘム含量ジチオナイトナトリウムの添加によって完全に還元され
たシトクロムc551 IおよびIIの吸収スペクトルを図1に
示した。シトクロムc551 IおよびIIの吸収スペクトルは
互いに区別不能であった。還元された各シトクロムには
α、βおよびγピークとして、それぞれ551nm、522nmお
よび417nmに最大吸収が認められた。また、酸化型シト
クロムにはγピークとして411nmに最大吸収が認められ
た。シトクロムc551 IおよびIIのヘム含量は、ドラブキ
ン（Drabkin）のピリジンヘモクロム法（J. Biol.、14
6：605、1942）によってヘム単量体にして約1モル／蛋
白質1モルと測定された。 (3)等電点 LKB社（ストックホルム, スウェーデン）の等電点電気
泳動システムにより、シトクロムc551 IおよびIIの等電
点（pI）は、それぞれ3.95および3.75と測定された。 (4)シトクロムc551 IおよびIIのペプチドマッピングに
よる比較シトクロムc551 IおよびIIをV8プロテアーゼまたはサー
モリシンによって同一条件下で消化し、逆相HPLC分析に
よってペプチド断片化パターンを比較した。シトクロム
c551 IおよびIIのそれぞれ数個のわずかなペプチド断片
のピークがさらに認められたことを除き、シトクロムc5
51 IおよびIIの主要なペプチド断片化パターン（約30の
ペプチド断片のピーク）は一致していた。この結果か
ら、シトクロムc551 IおよびIIの間のアミノ酸配列相同
性は高いことが示された。 (5)シトクロムc551 IIのアミノ酸配列シトクロムc551 IおよびIIのN末端アミノ酸は未知の修
飾によってブロックされていた。したがって、内部のア
ミノ酸配列をペプチド断片によって決定した。V8プロテ
アーゼおよびサーモリシンで消化したペプチド断片に加
えて、シトクロムc551 II（ヘムが除去され、S-カルボ
キシメチル化されたもの）をリジルエンドペプチダーゼ
で消化して、さらにペプチド断片を作製した。続いて、
得られたいくつかのペプチド断片を用いて内部のアミノ
酸配列を決定した。 No.1（配列表の配列番号：3） AlaAspThrAlaAlaThrGluGluAlaProAlaAlaAlaAlaGlyAlaAl
aThrSerIleTyrAspGlyValTyrThrAlaAlaGlnAlaGluAlaGlyG
lnAlaAlaTrpMetThrSerXaaAlaSerXaaHisGlyProThrAlaArg
GlySer、 No.2（配列表の配列番号：4） GlyProArgValIleGlyProValIleAsnAsnLysTyrAlaAspLysPr
oLeuLeuAspTyrPheAsnTyrThrArgAspAsnMetProMetGlyAlaP
roHisSerLeuSerAspAspThrTyrValGlu、 No.3（配列表の配列番号：5）：IleLeuGlnSerHisGlyAla
GluProGlyGluThrGlu 本発明のシトクロムcは、適当な微生物を培養し、菌体
を破壊して、破壊された菌体の無細胞抽出物から、好ま
しくは微生物の可溶性画分から単離および精製すること
によって調製することができる。

【００１７】本発明のシトクロムcの単離のために本発
明において用いられる微生物は、好ましくはシトクロム
cを生産する能力を持つグルコノバクター（Gluconobact
er）属に属する。また、本発明において、上記の微生物
の機能的等価物、継代培養物、突然変異体および変異体
を用いることも可能である。好ましい菌株はグルコノバ
クター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）であ
る。特定および好ましいグルコノバクター・オキシダン
ス（Gluconobacter oxydans）菌株は、Goettingen（ド
イツ）のDeutsche Sammlung von MikroorganismenにDSM
第4025号として1987年3月17日に寄託されている。さら
に、この菌株の継代培養物も、ブダペスト条約の規定に
基づき、寄託番号：グルコノバクター・オキシダンス
（Gluconobacter oxydans)DSM No.4025 FERM BP-3812
（寄託日：1992年3月30日）として通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託されている。さらに、
欧州特許第0278 477号明細書に本菌株の特徴が開示され
ている。

【００１８】この微生物は、適当な栄養分を添加した液
体培地にて好気性条件下で培養することができる。培養
はpH約4.0から9.0、好ましくは約6.0から8.0で実施する
ことができる。培養期間はpH、温度および用いた栄養培
地によって異なるが、通常は2〜6日で好ましい結果が得
られる。好ましい培養温度は約13℃から36℃であり、好
ましくは約18℃から33℃である。

【００１９】培地には通常、同化可能な炭素源、消化可
能な窒素源、ならびに無機物質、ビタミン、微量元素お
よび他の成長促進因子などの栄養分が含まれることが必
要である。同化可能な炭素源としては、グリセリン、D-
グルコース、D-マンニトール、D-フルクトース、D-アラ
ビトール、L-ソルボース、D-ソルビトールなどを用いる
ことができる。

【００２０】また、窒素源として、酵母エキス、肉エキ
ス、ペプトン、カゼイン、コーンスチープリカー、アミ
ノ酸、硝酸塩、アンモニウム塩などのさまざまな無機ま
たは有機物質を用いることができる。無機物質として
は、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、塩化第一鉄お
よび第二鉄、炭酸カルシウムなどを用いることができ
る。

【００２１】以下に、培養後における微生物からのシト
クロムcの単離および精製、ならびに遺伝子／DNA配列の
クローニングのための態様を説明する。 (1)細胞を発酵培養物から遠心処理または濾過によって
回収する。 (2)細胞を緩衝液中に懸濁し、ホモジナイザー、超音波
処理器またはリゾチーム処理などの手段によって破壊し
て、破壊された細胞の溶液を得る。 (3)破壊された細胞の無細胞抽出物、好ましくは微生物
の可溶性画分から、硫酸アンモニア沈殿、透析、イオン
交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、およびアフィニティクロマトグラフィーなどの通常
の蛋白質精製法によってシトクロムcを単離および精製
する。

【００２２】本発明によって提供されるシトクロムc
は、アルコールおよびアルデヒドからアルデヒド、カル
ボン酸およびケトンを生産するための、特にL-ソルボー
スまたはD-ソルビトールからL-ソルボソンを介して2-KG
Aを産生するための脱水素酵素に属する酵素の電子受容
体として有用である。

【００２３】簡潔に示せば、本発明において用いられ
る、シトクロムcの遺伝子、DNA、組換え発現ベクター、
および組換え生物体、すなわち形質転換宿主細胞、は下
記の工程によって得ることができる。 (1)脱水素酵素から電子を受容するシトクロムcを提供す
ることができる微生物から染色体DNAを単離し、大腸菌
においてその染色体DNAの遺伝子ライブラリーを構築す
る工程。 (2)コロニー、プラークまたはサザンハイブリダイゼー
ション、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング、
ウエスタンブロット分析などにより、染色体DNAからシ
トクロムc遺伝子をクローニングする工程。 (3)上記のシトクロムc遺伝子を含むDNA分子を選択する
ために通常の方法によって、シトクロムc遺伝子の塩基
配列を決定し、シトクロムc遺伝子を効率的に発現させ
ることができる組換え発現ベクターを構築する工程。 (4)形質転換、形質導入、接合伝達（transconjugatio
n）および電気穿孔による、シトクロムc遺伝子を有する
組換え生物体を構築する工程。

【００２４】本発明の上記の形態において用いられる材
料および技術を以下に詳細に例示する。

【００２５】全染色体DNAは当技術分野で周知の手順に
よって精製することができる。全染色体DNAからシトク
ロムcをコードする遺伝子を、以下の方法によってプラ
スミドまたはファージベクターのいずれかにクローニン
グする。

【００２６】(i)SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
後のゲルから全蛋白質またはペプチダーゼ処理によって
得られたペプチド断片を単離して、それらをアプライド
バイオシステムズ社製自動気相シークエンサー470A（パ
ーキンエルマー社、米国コネチカット州ノーウォーク）
などの蛋白質シーケンサーに付し、精製されたシトクロ
ムcの部分的アミノ酸配列を決定し、上記のようにして
得られたアミノ酸配列に基づいて、アプライドバイオシ
ステムズ社製自動DNAシークエンサー381A（パーキンエ
ルマー社）などのDNA合成装置によってオリゴヌクレオ
チドプローブを合成し、そのオリゴヌクレオチドプロー
ブを用いてサザン、コロニーまたはプラークハイブリダ
イゼーションにより、目的の遺伝子を有する菌株の遺伝
子ライブラリーから目的の遺伝子を有するクローンを単
離する方法、(ii)抗シトクロムc抗体を用いて免疫学的
方法により、遺伝子ライブラリーからシトクロムcを発
現しているクローンを選択する方法、または(iii)上記
のように決定されたアミノ酸配列に従って合成された2
種類のオリゴヌクレオチドを用いるPCR法によって、全
染色体DNAからDNAを増幅し、上記のようにして得られた
PCR産物をプローブとして用いるサザン、コロニーまた
はプラークハイブリダイゼーションによって、大腸菌内
に構築された遺伝子ライブラリーから全シトクロムc遺
伝子を有するクローンを単離する方法。上記の本シトク
ロムcに対して反応する抗体は、Methodsin Enzymolog
y、第73巻、p.46、1981に記載された方法などによっ
て、精製されたシトクロムc蛋白質またはそのペプチド
断片を用いて調製することができる。

【００２７】シトクロムc遺伝子の塩基配列は、M13ファ
ージを用いるジデオキシチェーンターミネーション法
（dideoxy chain termination method）（Sanger. F.
ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、74:5463〜5467、197
7）などの公知の方法によって決定することができる。

【００２８】シトクロムc遺伝子または一般にシトクロ
ムc活性をコードするDNAを効率的に発現させるために
は、種々のプロモーター、例えば上記のシトクロムc遺
伝子の上流に存在する本来のプロモーター、Tn5のカナ
マイシン耐性遺伝子（Berg, D.E.およびC.M.Berg、198
3、Bio/Technology 1:417〜435）およびpBR322のアンピ
シリン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子のプロモー
ター、大腸菌のβガラクトシダーゼ（lac）、trp-、tac
-、trc-プロモーター、λファージのプロモーター、な
らびに大腸菌、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas
putida）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter
xylinum）、アセトバクター・パストゥリアヌス（Aceto
bacter pasteurianus）、アセトバクター・アセチ（Ace
tobacter aceti）、アセトバクター・ハンセニイ（Acet
obacter hansenii）およびグルコノバクター・オキシダ
ンス（Gluconobacter oxydans）などの細菌を含む微生
物ならびに哺乳動物細胞および植物細胞からなる宿主内
で機能しうる任意のプロモーターを用いることができ
る。

【００２９】上記の目的のために、コーディングシーク
エンスを導入される宿主細胞内で作用しうるシャイン・
ダルガルノ（SD）配列（例えばAGGAGGなど、宿主細胞内
で作用しうる天然および合成配列を含む）および転写終
結因子（宿主細胞内で作用しうる任意の天然または合成
配列を含む逆方向反復）などのその他の調節要素が上記
のプロモーターとともに用いられる。

【００３０】ペリプラズムポリペプチドである、シトク
ロムc蛋白質の発現のためには、通常15〜50アミノ酸残
基を含み、全体として疎水性であるシグナルペプチドが
必要不可欠でる。シグナルペプチドをコードするDNA
は、所望の宿主細胞内で作用しうる任意の天然および合
成配列から選択することができる。

【００３１】2本鎖DNAのクローニングには、広範な種々
の宿主／クローニングベクターの組み合わせを用いるこ
とができる。クローニングベクターは一般に、複製開始
点、調節配列、マルチクローニング部位を含むクローニ
ング部位、およびアンピシリン、テトラサイクリン、カ
ナマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ス
ペクチノマイシンなどに対する耐性遺伝子を含む抗生物
質耐性遺伝子のような選択マーカーを含むプラスミドま
たはファージである。

【００３２】大腸菌内での目的遺伝子の発現のために適
したベクターは、pBR322またはpUC18およびpBluescript
IIを含むその誘導体、pACYC177およびpACYC184（J. Ba
cteriol.、134:1141〜1156、1978）ならびにその誘導体
などの大腸菌内で通常用いられる任意のベクター、なら
びにRK2およびRSF1010などの広宿主域プラスミドに由来
するベクターから選択される。G. オキシダンス（oxyda
ns）DSM第4025号を含むグルコノバクター（Gluconobact
er）およびP. プチダ（putida）における目的遺伝子の
発現のために好ましいベクターは、大腸菌などの好まし
いクローニング生物体においてと同様、グルコノバクタ
ー（Gluconobacter）および／またはP.プチダ（putid
a）において複製可能なあらゆるベクターから選択され
る。好ましいベクターは、pVK102およびその誘導物のよ
うなコスミドベクター、RSF1010およびその誘導物、な
らびにGluconobacter内で機能しうる複製開始点および
大腸菌内で機能しうる別の開始点を有するベクターから
選択される、広宿主域ベクターである。ベクターのコピ
ー数および安定性は、クローニングされる遺伝子の安定
的および効率的な発現のため、ならびにクローニングさ
れる遺伝子を有する宿主細胞の効率的な培養のためにも
慎重に考慮する必要がある。また、Tn5などの転移因子
を含むDNAを、好ましい宿主内、特に染色体に目的遺伝
子を導入するためのベクターとして用いることもでき
る。好ましい宿主から単離される任意のDNAおよび目的
遺伝子を一緒に含むDNAも、所望のDNAを好ましい宿主
内、特に染色体に導入するために有用である。このよう
なDNAは、形質転換、形質導入、接合伝達または電気穿
孔によって好ましい宿主に導入することができる。

【００３３】有用な宿主は、真核生物または原核生物由
来であり、微生物、哺乳動物細胞および植物細胞を含
む。好ましい微生物としては、大腸菌、P. プチダ（put
ida）、A. キシリナム（xylinum）、A. パストゥリアヌ
ス（pasteurianus）、A.アセチ（aceti）、A. ハンセニ
イ（hansenii）およびG. オキシダンス（oxydans）など
の細菌、および組換えシトクロムcを生産することがで
きるいかなるグラム陰性菌も挙げられる。上記の微生物
の機能的等価物、継代培養物、突然変異体および変異体
を本発明において用いることも可能である。好ましい菌
株は、大腸菌K12およびその誘導物、P. プチダ（putid
a）またはG. オキシダンス（oxydans）DSM第4025号であ
る。

【００３４】本発明のシトクロムcをコードするDNAは、
発現ベクターを作製するための当技術分野で周知の方法
によって、宿主細胞内で作用しうるプロモーターならび
にリボソーム結合部位および上記の転写終結因子などの
調節領域を含む適切なベクター中に連結される。

【００３５】発現ベクターを有する宿主細胞を作製する
ためには、形質転換、形質導入、接合交配（一般的およ
び分子的細菌学のための方法（Methods for general an
d molecular bacteriology）第14および15章、Philipp
Gerhardtら編、American Society for Microbiology、1
994）および電気穿孔を含むさまざまなDNA導入法を用い
ることができる。形質転換された宿主細胞を作製する方
法は分子生物学の分野で周知の方法から選択される。大
腸菌、シュードモナスおよびアセトバクターに関しては
通常の形質転換系を用いることができる。また、大腸菌
の形質導入系を用いることもできる。接合交配系は、グ
ラム陽性菌および大腸菌、P. プチダ（putida）および
G. オキシダンス（oxydans）を含むグラム陰性菌に広く
用いることができる。好ましい接合交配法は、基本的に
発明者によって国際公開第89/06688号パンフレットに開
示されている。接合は、液体培地中または固体表面上で
行うことができる。シトクロムc産生のために好ましい
受容菌は、大腸菌、P. プチダ（putida）およびG. オキ
シダンス（oxydans）から選択される。2KGA生産のため
に好ましい受容菌は、適切な組換え発現ベクターによっ
て活性型AADHを生産する能力を持つ大腸菌、P. プチダ
（putida）およびG. オキシダンス（oxydans）から選択
される。2KGA産生のために好ましい受容菌はG. オキシ
ダンス（oxydans）DSM第4025号である。接合交配のため
の受容菌に対して、通常は選択的マーカーが添加され
る。例えば、ナリジクス酸またはリファンピシンに対す
る耐性が通常選択される。

【００３６】したがって、本発明の好ましい実施態様は
以下のとおりである。 (1)原核生物または真核生物の宿主細胞において発現さ
れる少なくともシトクロムc551の一次構造の一部および
生物学的特性の1つを有するポリペプチドをコードするD
NA配列を含むDNAであって、該DNAが、(a)配列番号：1ま
たはその相補鎖によって同定されるDNA、(b)(a)で定義
されたDNAまたはその断片とハイブリダイズするDNA、お
よび(c)遺伝的コードの縮退がなければ、(a)または(b)
で定義されたDNAとハイブリダイズし、同一のアミノ酸
配列を有するポリペプチドをコードするDNA配列、の中
から選択される本発明のDNAは、さらに、アルコール／
アルデヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコー
ドするDNAを含む。 (2)配列番号：２によって特定されるシトクロムc551ポ
リペプチド、または１個以上のアミノ酸残基の付加、挿
入、削除および／または置換を含む機能的誘導体であっ
て、シトクロムｃとしての機能を有するポリペプチドを
コードする本発明のDNAは、さらに、アルコール／アル
デヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードす
るDNAを含む。。 (3)本発明のDNAを含むベクターによって形質転換された
宿主細胞において、該DNAは宿主細胞のゲノムに組み込
まれていてもよい。 (4)前記宿主細胞は、真核生物起源、好ましくは哺乳動
物細胞または植物細胞であってよい。 (5)また、前記宿主細胞は、原核生物起源、好ましくは
細菌であってよい。 (6)前記宿主において細菌は、大腸菌、シュードモナス
・プチダ(Pseudomonas putida）、アセトバクター・キ
シリナム（Acetobacter xylinum）、アセトバクター・
パストゥリアヌス（Acetobacter pasteurianus）、アセ
トバクター・アセチ（Acetobacter aceti）、アセトバ
クター・ハンセニイ（Acetobacter hansenii）およびグ
ルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydan
s）からなる群から選択することができる。 (7)グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter o
xydans）の好適な菌株としては、DSM第4025号として寄
託されている菌株が挙げられる。

【００３７】本発明のシトクロムc551は、下記に例示す
るように、電子伝達の全体的効率を改善するために、AA
DHをコードするDNA配列を用いて構築されたAADH-シトク
ロムc551複合体などの蛋白質-蛋白質複合体の材料とし
て用いることもできる。

【００３８】

【実施例】実施例1 シトクロムc551 IおよびIIの調製別に特記しない限り、すべての操作は4℃で実施した。 (1)G. オキシダンス（oxydans）DSM第4025号の培養 8％L-ソルボース（別滅菌）、0.05％グリセリン、0.25
％MgSO₄・7H₂O、1.75％コーンスチープリカー、5.0％パ
ン酵母、0.5％CaCO₃および0.5％尿素（別滅菌）を含むp
H7.0の種培地を試験管に分注した（各5ml）。試験管内
の種培地に、5.0％D-マンニトール、0.25％MgSO₄・7H
₂O、1.75％コーンスチープリカー、5％パン酵母（オリ
エンタル酵母）、0.5％CaCO₃、0.5％尿素（別滅菌）お
よび2.0％寒天を含むpH7.0（滅菌前）のNS2寒天培地上
で4日間27℃で増殖させたG. オキシダンス（oxydans）D
SM第4025号を1白金耳接種し、30℃で24時間振盪培養し
た。得られた種培養を、容量500mlの三角フラスコに入
れた上記と同一の種培地100mlに移し、280rpmで回転さ
せながら30℃で24時間培養した。上記のようにして調製
した種培養の各25mlを、容量2000mlの三角フラスコに入
れた10％L-ソルボース（別滅菌）、0.05％グリセリン、
1.6％尿素（別滅菌）、0.25％MgSO₄・7H₂O、6.25％パン
酵母、1.5％CaCO₃（製造等級、ナカライテスク）および
3％コーンスチープリカーを含むpH7.5（滅菌前）の生産
培地500mlに移し、180rpmで回転させながら30℃で35〜4
0時間培養した。培養後、パン酵母細胞およびCaCO₃など
の固形物を2回の低速遠心処理（500×g、15分間）によ
って除去した。続いて、G. オキシダンス（oxydans）DS
M第4025号の菌体を10,000×g、15分間の遠心処理によっ
て回収した。菌体を、25mM Tris-HCl、0.9％NaCl、0.09
％KCl、10mM CaCl₂、5mM MgCl₂、5％ショ糖および1mM
フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、pH8.0
中に再懸濁し、細胞懸濁液に500×g、15分間の遠心処理
を施して固形物を除去し、続いて10,000×g、15分間の
遠心処理によって菌体を回収し、使用時まで-20℃で保
存した。 (2)可溶性画分の調製培養物10リットルから得た菌体（湿重量40g）を、60ml
の25mM Tris、5mM CaCl₂、pH8.0に懸濁し、フレンチプ
レス（1500 kg／cm²）による通過処理を2回行うことに
よって破壊した。溶液にDNaseおよびMgCl₂を最終濃度が
それぞれ0.01mg／mlおよび1mMとなるように添加し、600
0×g、10分間の遠心処理によって細胞片を除去した。上
記のようにして調製した無細胞抽出物（総蛋白8,800m
g）から、100,000×g、90分間の超遠心処理によってシ
トクロムを含む可溶性画分を分離し、25mM Tris、5mM C
aCl₂、pH8.0に対して透析した。 (3)DEAE-トヨパール650Mカラムクロマトグラフィーこの可溶性画分を、25mM Tris、5mM CaCl₂、pH8.0によ
って平衡化したDEAE-トヨパール650M（東ソー；2.5ID.
×45cm）のカラムにかけた。同緩衝液400mlでカラムを
洗浄した後、0〜0.5M NaClの直線濃度勾配を有する緩衝
液2000mlによって溶出させた。NaCl濃度0.13Mの近傍で
認められる、412nmと480nmの吸収の差においてピークを
示す濃赤色のバンドを主要なシトクロム画分として回収
した。 (4)ブチル-トヨパール650Sカラムクロマトグラフィー上記の主要なシトクロム画分を、同容量の25mM Tris、8
0％飽和(NH₄)₂SO₄、pH8.0をゆっくりと攪拌しながら添
加して希釈し、10,000×g、15分間の遠心処理によって
不溶物を除去した後に、25mM Tris、40％飽和(NH4)₂S
O₄、pH8.0によって平衡化したブチル-トヨパール650S
（東ソー； 2.5ID.×20cm）のカラムにかけた。同緩衝
液200mlでカラムを洗浄した後、40〜0％飽和(NH4)₂SO₄
の直線濃度勾配を有する緩衝液1000mlによって溶出させ
た。20％飽和(NH4)₂SO₄の濃度の近傍で溶出されるシト
クロムのバンドを回収し、窒素ガス下でPM-10限外濾過
器を用いて2.5mlに濃縮した。 (5)セファクリルS-100HRゲル濾過上記のシトクロム画分を、25mMリン酸ナトリウム、0.2M
NaCl、pH7.2によって平衡化したセファクリルS-100HR
（ファーマシアバイオテク、Uppsala、スウェーデン；
2.5ID.×90cm）のカラムに載せた。同緩衝液によってカ
ラムを展開し、約19kDaの分子量を示すシトクロムcのバ
ンドを回収した。 (6)ヒドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィー上記の主要シトクロム画分を、0.2mMリン酸ナトリウム
／pH6.8に対して十分に透析した後に、0.2Mリン酸ナト
リウム（pH6.8）によって平衡化したヒドロキシルアパ
タイトのカラム：HCA-100S（3.3×20cm；三井東圧化
学）にかけた。同緩衝液200mlでカラムを洗浄後、直線
濃度勾配を有する0.2〜18mMリン酸ナトリウム2000ml（p
H6.8）によって溶出させた。勾配処理の間にシトクロム
は2つの赤色バンドに分かれて溶出された。このため、
早い方のピークおよび遅い方のピークをそれぞれシトク
ロムc551 IおよびIIと命名した。それぞれのシトクロム
を25mM MOPS、0.2M NaCl／pH7.5に対して透析し、窒素
ガス下でPM-10限外濾過器（ミリポア、米国マサチュー
セッツ州ベッドフォード）を用いて2.0mlに濃縮し、-80
℃で保存した。最終的に、総細胞蛋白質8800mgからシト
クロムc551 Iが37.4mg、シトクロムc551 IIが42.6mg得
られた。 (7)シトクロムc551 IおよびIIの純度ヒドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィー（最
終精製段階）では、各シトクロムは280／410nm間で一定
の吸収比を有する単一のピークとして溶出された。SDS-
および未変性PAGE分析では、各シトクロムは染色すると
単一の蛋白質バンド、染色しない場合には1つの可視性
の赤色バンドを示した。シトクロムc551IおよびIIの分
子量は、SDS-PAGE分析ではそれぞれ18.0+/-1.0および1
6.8+/-1.0kDaと測定された。 (8)精製されたシトクロムc551 IおよびIIのG. オキシダ
ンス（oxydans）DSM第4025号のAADHからの電子受容能以下に定義および精製される蛋白質を含む2-KGA生産系
を再構築した。本システムは、12μM AADH（欧州特許第
606621号明細書においてA. AsakuraおよびT. Hoshinoに
よって記載された方法によってG. オキシダンス（oxyda
ns）DSM第4025号から精製されたもの）、14.4μMシトク
ロムc551 IおよびII（1：1混合物）、250μMウマ心臓タ
イプVIシトクロムc（シグマ社、米国ミズーリ州セント
ルイスから購入）、12.5 単位／ml aa3型ウシ心臓シト
クロムcオキシダーゼ（シグマ社から購入）ならびに50m
g／ml L-ソルボース、5mg／mlウシ血清アルブミン（フ
ラクションV、シグマ社から購入）および0.2M NaClを含
む50mM MOPS緩衝液、pH7.5からなる。この2-KGA生産系
では、ウマ心臓タイプVIシトクロムcおよびaa3型ウシ心
臓シトクロムcオキシダーゼが、細菌のシトクロムc、す
なわちシトクロムc551IおよびIIの再酸化を酸素還元を
伴って触媒した。好気性インキュベーションによる25
℃、15時間の反応の後には約8mMの2-KGAが蓄積した。し
かし、シトクロムc551 IおよびIIの非存在下では、2-KG
Aの蓄積量は0.2mM未満であった。このシトクロムc551 I
およびII依存性2-KGA生産は、シトクロムc551 IおよびI
IがAADHの2-KGA生産触媒系において有効な電子受容体で
あることを示している。実施例2 シトクロムc551遺伝子のクローニング (1)PCR法による部分的シトクロムc551遺伝子の増幅精製されたシトクロムc551蛋白質のアミノ酸配列に従
い、アプライド・バイオシステムズ社製381A DNA合成装
置（米国）を用いて合成された、図2に示したプライマ
ーc1、c5、c6およびそれらのアンチセンス配列（c1R、c
5R、c6R）を用いてPCRを実施した。PCR反応は、ジーン
アンプ（GeneAmp）（登録商標）DNA増幅試薬キット（宝
酒造）をパーキンエルマーシータスインスツルメンツ
（Perkin-Elmer Cetus Instruments）社製サーマルサイ
クラー（Thermal Cycler）とともに製造者の推奨に従っ
て用いることによって実施した。反応は、1)94℃での1
分間の変性段階、2)48℃または40℃での2分間のアニー
リング段階、および3)72℃での3分間の合成段階、の30
回のサイクルで行った。この反応混合物（50μl）は、
緩衝液中に、200μMのdNTP、6.4μMの各プライマー（32
縮退）、G. オキシダンス（oxydans）DSM第4025号の染
色体DNA 250ng、およびTaqポリメラーゼ2.5単位を含
む。このPCR産物を³²Pによって標識する際には、反応混
合物に200μMのdCTPの代わりに0.74MBeqの[a-³²P]dCTP
および40μMのdCTPを添加した。プライマーc5およびc1R
を用いるPCRでは50bpのDNAが生じたが、その他のプライ
マーの組み合わせでは全くDNAのバンドが生じないか、
多数のDNAバンドが生じた。 (2)PCRで増幅された50bp DNA断片のクローニングおよび
塩基配列決定 PCRによって増幅された50bpのDNA断片をpUC18のSmaI部
位にクローニングし、ジデオキシチェーンターミネーシ
ョン法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74:5463〜546
7、1977）によって塩基配列を決定した。決定されたこ
の50bp断片の塩基配列は、 5'-ATCAACAACAAGTATGCTGACAAGCCGCTGCTGGACTACTTCAACTACAC-3' （配列表の配列番号：6）であった。

【００３９】この塩基配列の第1フレームから演繹され
るアミノ酸配列（IleAsnAsnLysTyrAlaAspLysProLeuLeuA
spTyrPheAsnTyrThr）は、プライマーの調製のために用
いたアミノ酸配列（IleAsnAsnLysTyrAla、AspTyrPheAsn
TyrThr）を含む。 (3)50塩基オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて
の、G. オキシダンス（oxydans）DSM第4025号の染色体D
NAのサザンブロット分析 EcoRIなどの種々の制限酵素によって消化したG. オキシ
ダンス（oxydans）DSM第4025号の染色体DNAを用いて調
製したサザンブロットを、上記の50塩基に関する配列情
報に基づいてDNA合成装置で合成して³²Pによって標識し
た50塩基長オリゴヌクレオチドによるプローブ処理を行
った。このプローブは2.5kbのEcoRI断片のみとハイブリ
ダイズした。この結果は、シトクロムc551が染色体DNA
上の1つの遺伝子のみから産生されることを示す。 (4)完全長シトクロムc551遺伝子を含む2.5kbのEcoRI断
片のクローニング G. オキシダンス（oxydans）DSM第4025号の染色体DNAを
EcoRIによって完全に消化し、得られた断片をアガロー
スゲル電気泳動にかけた。長さが2.5kb付近（2〜3.5k
b）のDNA断片を切り取ってゲルから溶出させた。回収し
たDNA断片をEcoRIで消化したpUC18ベクターと連結さ
せ、大腸菌JM109を形質転換させた。約1000種の形質転
換株が得られ、³²Pで標識した50塩基長のオリゴヌクレ
オチドをプローブとして用いるコロニーハイブリダイゼ
ーションによってこれらをスクリーニングした。その結
果、強いシグナルを示す1つのコロニーが得られた。こ
のコロニーからプラスミドDNAを抽出し、EcoRIによって
消化したところ、2.5kbのEcoRI断片が強いシグナルを示
した。このプラスミドをpGOC201と命名した。この2.5kb
のEcoRI断片もベクターpVK100（Knauf, V.C.ら、Plasmi
d 8:45〜54、1982）にクローニングし、それぞれ反対方
向に2.5kbのEcoRI断片を有するプラスミドpGOC101およ
びpGOC101Rを作製した。 (5)完全長シトクロムc551遺伝子の塩基配列決定ジデオキシチェーンターミネーション法によってシトク
ロムc551遺伝子の塩基配列を決定した。1.7kbのEcoRI-S
maI断片の塩基配列を決定したところ、断片中に1つのオ
ープンリーディングフレーム（配列表の配列番号：1に
示した配列中に存在する507bpのORF）が認められた。こ
のORFは、シトクロムc551の消化物に由来するペプチド
断片のアミノ酸配列に一致する3つの配列（配列表の配
列番号：3〜5）を含む、168アミノ酸からなる蛋白質
（配列表の配列番号：2）をコードしていた。また、こ
のORFは典型的なシグナル配列も含んでいた。このシグ
ナル配列はおそらくALA残基の後方で切断されて、25残
基からなるMetLysAsnLysThrThrLeuGlyGlyAlaLeuAlaLeuA
laAlaLeuLeuAlaGlyThrThrGlyAlaLeuAlaおよび143残基か
らなる成熟配列が生じると思われる。この配列から算出
された成熟シトクロムc551の分子量は14,836であった。
この値は、SDS-PAGEによって推定されたシトクロムc551
IおよびIIの見かけの分子量（18,000および16,800）よ
りも幾分小さかった。成熟型蛋白質の中央部（残基51か
ら55まで）には、ヘム結合性コンセンサス配列CysXaaXa
aCysHisの1つとしてCysAlaSerCysHisが認められた。 (6)PCR法によるシトクロムc551遺伝子のサブクローニン
グ上記のORF（507bp）の117bpの5'隣接配列および120bpの
3'隣接配列を含む744bpの断片を、EcoRI部位をタグ付加
したプライマーを用いるPCRによって増幅した。増幅さ
れた断片をベクターpVK100にクローニングすることによ
って、それぞれ反対方向に744bpの断片を有するプラス
ミドpGOC102およびpGOC102Rを作製した。この744bp断片
のpMMB22（Bagdasarian, M.ら、Gene 26:273〜282、198
3）へのクローニングによって、プラスミドpGOC402を作
製した。実施例3 大腸菌、P. プチダ（putida）およびG. オキ
シダンス（oxydans）DSM第4025号におけるシトクロムc5
51遺伝子の発現 (1)大腸菌におけるシトクロムc551遺伝子の発現 pGOC402またはpMMB22を有する大腸菌JM109の無細胞抽出
物を、ウエスタンブロット分析にかけた。大腸菌菌体は
50μg／mlのアンピシリンを加えたLB中で一晩増殖さ
せ、続いてその1％を新鮮培地5mlに接種した。4時間培
養した後、培養物にイソプロピル-β-D-チオガラクトピ
ラノシド（IPTG）を最終濃度1mMとなるように添加する
か、または添加せずに、それぞれをさらに1時間培養し
た。細胞を回収し、水に懸濁させた。蛋白質濃度を決定
した後、その細胞懸濁液を濃度が2mg蛋白質／mlとなる
ように、62.5mM Tris-HCl（pH6.5）、10％グリセリン、
2％SDSおよび5％ β-メルカプトエタノールを含むレム
リ（Laemmli）緩衝液で希釈し、3分間煮沸した。無細胞
抽出物30μgをSDS-ポリアクリルアミドゲル（15％）電
気泳動にかけた。ゲル上に得られた蛋白質バンドを、半
乾燥式エレクトロブロッティング装置（Trans-blot SD,
バイオラッド、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）
を25Vで1時間、20％メタノールを含む2.5mM Tris-19.2m
Mグリシン緩衝液、pH8.6中で、ニトロセルロースフィル
ターにブロットした。シトクロムc551蛋白質を、抗シト
クロムc551抗血清、ヤギ抗ウサギIgG-西洋ワサビペルオ
キシダーゼ複合体、過酸化水素、および発色剤で、製造
者（コニカ）の推奨に従って処理することによって可視
化した。IPTG誘導または非誘導下で調製したpGOC402を
有する細胞は、2つの陽性バンド（無細胞抽出物30μg中
にそれぞれ合計で約30ngまたは10ngのシトクロムc551）
を示したが、pMMB22を有する細胞はそれらを発現しなか
った。これらのバンドのRf値は精製されたシトクロムc5
51 IおよびIIのそれと一致しており、このことからシト
クロムc551 IおよびIIが1つの遺伝子から発現され、翻
訳後または転写後に修飾されることが示された。 (2)P. プチダ（putida）におけるシトクロムc551の発現まず、三親（triparental）接合交配法によって、pGOC4
02およびpMMB22をナリジクス酸耐性（Nal^r）のP. プチ
ダ（putida）ATCC 21812に以下のようにして導入した。
Nal^rのP. プチダ（putida）ATCC 21812の菌体を、2.5％
マンニトール、0.5％酵母エキス（Difco Laboratories,
米国ミシガン州デトロイト）および0.3％バクトトリプ
トン（Difco）を含むMB培地5ml中にて30℃で培養した。
供与菌株である、pGOC402（ストレプトマイシン耐性：S
m^r）またはpMMB22（Sm^r）を有する大腸菌JM109、および
ヘルパー菌株である、pRK2013（Km^r, Figurski, D.H.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1648〜1652、1979）を
有する大腸菌HB101を、適切な抗生物質を含むLB培地中
にて37℃で一晩増殖させた。これらの培養物（各2ml）
を別々に遠心処理し、細胞ペレットを別々にMB培地2ml
中に懸濁した。細胞懸濁液の各100μlを混合し、混合さ
れた細胞懸濁液50μlを、5％フルクトース、1％酵母エ
キス（Difco）、1％ポリペプトン（和光純薬工業株式会
社）および1.8％寒天からなるFB寒天培地の表面に配置
したニトロセルロースフィルター上に滴下した。このプ
レートを27℃で一晩インキュベートした。得られた細胞
を50μg／mlナリジクス酸および50μg／mlストレプトマ
イシンを含むMB寒天培地（MNS寒天平板培地）上に播い
た。このようにして得られた接合体（transconjugant）
をMNS寒天平板培地にすじ状に接種して精製し、大腸菌
およびプラスミドを含まないP. プチダ（putida）の細
胞を除去した。

【００４０】50μg／mlストレプトマイシンを含み、10m
M IPTGを添加、または添加していないMB培地中で一晩増
殖させた細胞から、pGOC402またはpMMB22を有するP. プ
チダ（putida）の接合体の無細胞抽出物を調製し、実施
例3-1に記載したようにウエスタンブロットを行った。I
PTG誘導下または非誘導下で調製したpGOC402を有する細
胞は、2つの陽性バンド（無細胞抽出物20μg中にそれぞ
れ合計で約30ngまたは10ngのシトクロムc551）を示した
が、pMMB22を有する細胞はそれらを発現しなかった。 (3)GOS2RおよびGORS6-35におけるシトクロムc551の発現 pVK100中にシトクロムc551遺伝子をそれぞれ別の方向に
含むプラスミド（pGOC101およびpGOC101R）を、三親接
合交配法によって、G. オキシダンス（oxydans）DSM第4
025号のリファンピシン耐性誘導株であるGOS2R（T. Hos
hinoら、欧州特許出願第9611500.8号明細書）に導入し
た。GOS2R細胞を、3％トリプチケースダイズブロス（ベ
クトン・ディッキンソン、米国メリーランド州コッキス
ビル）および0.3％酵母エキス（Difco Laboratories、
米国ミシガン州デトロイト）を含み、100μg／mlリファ
ンピシンを添加したT培地10ml中にて30℃で培養した。
供与菌株である、pGOC101（Tc^r）、pGOC101R（Tc^r）ま
たはpVK102（Km^r）を有する大腸菌HB101、およびヘルパ
ー菌株である、pRK2013（Km^r）を有する大腸菌HB101
を、適切な抗生物質を含むLB培地中にて37℃で一晩増殖
させた。得られたこれらの培養物（GOS2R培養物10mlお
よび大腸菌培養物2ml）を別々に遠心処理し、細胞ペレ
ットを別々にT培地2ml中に懸濁した。細胞懸濁液の各10
0μlを混合し、混合された細胞懸濁液50μlを、実施例1
-(1)に記載したNS2寒天培地の表面上に配置したニトロ
セルロースフィルター上に滴下した。このプレートを27
℃で一晩インキュベートした。得られた細胞を、100μg
／mlリファンピシンおよび3μg／mlテトラサイクリンを
含むT寒天培地（TRT寒天平板培地）上に播いた。このよ
うにして得られた接合体をTRT寒天平板培地上にすじ状
に接種して精製し、大腸菌およびプラスミドを含まない
GOS2Rを除去した。NS2寒天平板培地上で増殖させた接合
体を、実施例3-(1)のようにウエスタンブロット分析に
かけた。図3は、pGOC101またはpGOC101Rを有するGOS2R
が、pVK102を有するGOS2Rよりもより多くの免疫学的に
陽性な蛋白質を産生したことを示している。増幅比は約
2倍であると思われた。

【００４１】プラスミドpGOC101およびpGOC102を、上記
の三親接合交配法によって、G. オキシダンス（oxydan
s）DSM第4025号のリファンピシン耐性誘導株であるGORS
6-35（L-ソルボースから2KGAの高産生株、T. Hoshino
ら、欧州特許出願第9611500.8号明細書）に導入した。
プラスミドpGOC101は低率（1受容菌当たり＜10^-8の接合
体）でしか導入されなかったが、プラスミドpGOC102は
より高率に導入された（1受容菌当たり約10^-4接合
体）。pGOC101を有する典型的な接合体の1つであるGORS
6-35（pGOC101)-1は、表1に示すように、その増殖性お
よびプラスミド安定性（50％）が極めて低く、このこと
から、シトクロムc551遺伝子の存在または発現はこの宿
主の増殖に対して抑制効果を有し、この結果として増殖
中にプラスミドを含まない細胞が増幅されたことが示唆
された。もう1つの接合体であるGORS6-35（pGOC101)-2
は、30μg／mlテトラサイクリンを含むNS寒天培地上へ
の移行を複数回行った後に、良好な増殖性および極めて
高いプラスミド安定性（＞99％）を示すように変化し
た。増殖性におけるこの自然変化は、シトクロムc551の
過剰発現によるストレスに対する宿主の適応に起因する
ものと考えられた。これとは対照的に、pGOC102を有す
る接合体は良好な増殖性および高いプラスミド安定性
（88％）を示した。

【００４２】10％L-ソルボースを含む生産培地中で増殖
した菌株におけるシトクロムc551の含量を、還元条件と
酸化条件との差のスペクトルによって定量的に測定し
た。シトクロムc551の定量分析は島津製UV-2200分光光
度計を用いて以下の通りに実施した。GORS6-35の誘導菌
株を、実施例1に記載したパン酵母細胞を含む生産培地
中にて4日間培養した。CaCO₃およびパン酵母細胞を1,00
0rpm、10分間の遠心処理を2回行うことで除去し、8,000
rpm、10分間の遠心処理によって細胞を回収した。回収
した細胞を、5mM MgCl₂を含む50mM Tris-HCl（pH7.5）
で洗浄し、同緩衝液5ml中に再懸濁させた。この細胞懸
濁液をフレンチプレッシャー細胞破砕器（French press
ure cell disruptor）（1500kg／cm²）に2回通過させた
後、5,000rpm、10分間の遠心処理によって細胞片を除去
した。得られた粗抽出物に45,000rpm、1時間の超遠心処
理を行った。この上清を、還元条件と酸化条件との差の
スペクトルによるシトクロムc551含量の決定に用いた。
シトクロムを酸化するためには、2mMフェリシアン化カ
リウムを含む100mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）に
よって試料を処理し、還元のためには、フェリシアン化
物の代わりに0.1％水素化ホウ素ナトリウムによってそ
れを処理した。上清におけるシトクロムc551（C）の濃
度は以下の式によって得られる： C＝E((A₅₅₁−A₅₄₁)_red−(A₅₅₁−A₅₄₁)_ox) E＝(モル吸光係数)＝19.1mM^-1cm^-1 GORS6-35（pGOC101)-1、GORS6-35（pGOC101)-2、GORS6-
35（pGOC102）またはGORS6-35（pVK102）におけるシト
クロムc551の発現レベルを表1に示した。GORS6-35（pGO
C101)-2およびGORS6-35（pGOC102）のシトクロムc551の
発現量は、GORS6-35（pVK102）のそれぞれ1.6倍および
1.3倍であった。

【００４３】

【表１】 *含量はシトクロムc551 IおよびIIの両方を含む。

【００４４】pGOC102を有するGORS6-35におけるシトク
ロムc551の含量の増加から、シトクロムc551遺伝子の本
来のプロモーターはおそらくその構造遺伝子の117bp上
流以内に存在すると思われた。実施例4 シトクロムc551増幅GORS6-35におけるL-ソル
ボースからの2KGAの産生 B. メガテリウム（megaterium）DSM第4026号（欧州特許
第0278477号明細書）を、SCM寒天傾斜培地（表2）からS
CM150mlに接種した。同じSCM種培地に対して、30μg／m
lテトラサイクリンを含むNS2寒天培地で培養したGORS6-
35（pGOC101)-2もしくはGORS6-35（pVK102）細胞、また
はNS2寒天培地で培養したGORS6-35もしくはG. oxydans
DSM第4025号を接種した。培養液のpHが6.5と6.0との間
となるまで30℃で種培養を続けた。これには通常15〜24
時間を要した。種培養液の一部（7.5ml）を、容量500ml
の三角フラスコに入れた生産培地（表3）50mlに接種し
た。これらの主発酵は、回転振盪器によって180rpmで回
転させながら30℃で5日間実施した。表4に示すように、
GORS6-35（pGOC101)-2を用いた混合発酵では、G. オキ
シダンス（oxydans）DSM第4025号、GORS6-35およびGORS
6-35（pVK102）の場合よりも良好な2KGA生産性が得ら
れ、11％L-ソルボースからの2KGA産生はより迅速であ
り、14％L-ソルボースからはより迅速な産生およびより
高い収率が得られた。この組換え菌株は11％L-ソルボー
スから3日間で105.1g／lの2KGAを産生し、14％L-ソルボ
ースからは4日間および5日間でそれぞれ130.8g／lおよ
び133.3g／lを産生したが、一方、対照ベクターであるG
ORS6-35（pVK100）は11％L-ソルボースから3日間で96.3
g／lの2KGAを産生し、14％の場合には4日間および5日間
でそれぞれ99.9g／lおよび112.6g／lを産生した。

【００４５】

【表２】種培地（ＳＣＭ） *：CaCO₃はpH調整後に添加した。 500mlの三角フラスコ中培地150ml。SCM寒天傾斜培地の
場合には、SCM培地に寒天2％を添加した

【００４６】

【表３】生産培地 *：L-ソルボースおよび尿素は別々にオートクレーブ処
理にかけた。 **：CaCO₃はpH調整後に添加した。 500mlの三角フラスコ中培地100ml。

【００４７】

【表４】実施例5 シトクロムc551遺伝子およびG. オキシダンス
（oxydans）DSM第4025号のAADH遺伝子を有するP. プチ
ダ（putida）の接合体による2KGAの産生 Nal^rP. プチダ（putida）ATCC 21812の４種類の接合
体、すなわちpSSA102R（G. オキシダンス（oxydans）DS
M第4025号からクローニングされた、L-ソルボースを2KG
Aに変換するAADHをコードする遺伝子である酵素A遺伝子
を含む2.7kbのDNA断片を有するベクターpVK100；T. Hos
hinoら、欧州特許出願第9611500.8号）およびpGOC402を
有するP. プチダ（putida）、pVK102およびpGOC402を有
するP. プチダ（putida）、pSSA102RおよびpMMB22を有
するP. プチダ（putida）、ならびにpVK102およびpMMB2
2を有するP. プチダ（putida）を、実施例3-(2)のよう
に三親接合交配によって作製した。10μg／mlテトラサ
イクリンおよび50μg／mlストレプトマイシンを含むMB
寒天培地上で維持したこれらの4種類の接合体の細胞
を、10μg／mlテトラサイクリン、50μg／mlストレプト
マイシンおよび10mM IPTGを添加したMB培地10mlに接種
し、30℃で18時間インキュベートした。得られた細胞を
遠心処理し、0.9％NaClで洗浄した。20 OD₆₀₀単位の細
胞、4％L-ソルボース、0.3％NaCl、1％CaCO₃、1μg／ml
ピロロキノリンキノン（PQQ）からなる休止細胞反応混
合物を30℃で振盪しながら48時間インキュベートした。
pSSA102RおよびpGOC402を有するP. プチダ（putida）に
よって産生された2KGAの量は36.4g／lであり、一方、他
の3種の菌株では0.5g／lを下回った。シトクロムc551の
発現により、G. オキシダンス（oxydans）DSM第4025号
のAADHからP. プチダ（putida）の電子伝達系への生理
的連関が提供された。実施例6 AADH-シトクロムc551複合体 AADH-シトクロムc551複合体をコードする遺伝子を有す
るプラスミドを図4に示すように構築した。ここでは、
酵素A／B3および酵素Bの遺伝子（T. Hoshinoら、欧州特
許出願第9611500.8号）をAADH遺伝子として用いた。AAD
Hとシトクロムc551との間のリンカーは、A. アセチ（ac
eti）のADH（Inoueら、J. Bacteriol. 171:3115〜312
2、1989）を模して作製した。このプラスミドをNal^rP.
プチダ（putida）ATCC 21812に導入し、得られた接合
体を、AADHまたはシトクロムc551に対して調製した抗体
を用いるウエスタンブロット分析に供した。分析の結
果、作製された複合体は1分子中にAADHおよびシトクロ
ムポリペプチドの両方を含むことが示された。酵素A／B
3-シトクロムc551複合体の遺伝子、および酵素B-シトク
ロムc551複合体の遺伝子を有する接合体を、実施例5の
ように休止細胞反応に用いた。その結果、40時間で、前
者の接合体は40g／lのL-ソルボースから7.8g／lの2KGA
を産生し、後者は40g／lのD-ソルビトールから9.0g／l
のL-ソルボースを産生した。

【００４８】

【発明の効果】本発明により、電子受容体としての機能
を有する蛋白質ファミリーに属する新規なシトクロムｃ
およびその遺伝子が提供された。本発明の新規なシトク
ロムｃは、アルコ−ルおよびアルデヒド脱水素酵素など
の脱水素酵素の電子受容体として有用である。

【００４９】

【配列表】

（１）出願人氏名：エフ．ホフマン−ラロシュアー
ゲー（２）発明の名称：シトクロムcおよびその遺伝子（３）整理番号：ＲＣ−００２（４）出願番号：（５）出願日：（６）優先権のもととなった出願をした国名および出願
番号：欧州、特許出願番号第97105583.4号（７）優先日：平成９年４月４日（８）配列の数：６配列番号：１配列の長さ：７４４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列 CAAGGCGGAG TTGTCCGGCA AAGACTGACA TTTCTGTTTG CGGCCGTTAT ATAGGGGCTG 60 CTCGCAGATG TCGGCACCTT GTCCGGCCTG CGACGCAGCA AGGTAAAGGA AGCTAAAATG 120 AAAAACAAAA CCACTCTGGG CGGCGCGCTT GCACTTGCAG CACTGCTGGC CGGAACGACC 180 GGGGCACTGG CGTTCAGCAA CATCGAACGT CCCGCACCGG CCGCTGATAC TGCAGCTACC 240 GAAGAAGCAC CTGCTGCCGC TGCTGGCGCC GCCACTTCGA TCTACGACGG CGTTTACACT 300 GCAGCCCAGG CCGAAGCTGG CCAGGCTGCA TGGATGACCA GCTGCGCAAG CTGCCACGGC 360 CCGACCGCTC GCGGCTCGTC GGGTGGTCCG CGCGTTATCG GCCCTGTCAT CAACAACAAG 420 TATGCTGACA AGCCGCTGCT GGACTACTTC AACTACACCC GCGACAACAT GCCGATGGGC 480 GCGCCTCACT CGTTGAGCGA CGATACCTAT GTTGAAATCG TTGCGTTCAT TCTGCAATCG 540 CACGGCGCAG AGCCGGGCGA GACGGAACTG ACCTCGGACG AAGCGCTGCT CGGCAGCCTG 600 ATGATGGGCC GTAACCCCAA CTAAACGCAG GGTCGCCAAC CGCTTGACGG TAAGCAACCT 660 ACCAGATTGG CCGGCTACGG TCGGCCAATC CTCCTTTACC AACCCTCCAT CCCAAACAAG 720 GTAAAACCTG ATGAAGACGT CGTC 744 配列番号：２配列の長さ：１６８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列 Met Lys Asn Lys Thr Thr Leu Gly Gly Ala Leu Ala Leu Ala Ala -25 -20 -15 Leu Leu Ala Gly Thr Thr Gly Ala Leu Ala Phe Ser Asn Ile Glu -10 -5 1 5 Arg Pro Ala Pro Ala Ala Asp Thr Ala Ala Thr Glu Glu Ala Pro 10 15 20 Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ser Ile Tyr Asp Gly Val Tyr 25 30 35 Thr Ala Ala Gln Ala Glu Ala Gly Gln Ala Ala Trp Met Thr Ser 40 45 50 Cys Ala Ser Cys His Gly Pro Thr Ala Arg Gly Ser Ser Gly Gly 55 60 65 Pro Arg Val Ile Gly Pro Val Ile Asn Asn Lys Tyr Ala Asp Lys 70 75 80 Pro Leu Leu Asp Tyr Phe Asn Tyr Thr Arg Asp Asn Met Pro Met 85 90 95 Gly Ala Pro His Ser Leu Ser Asp Asp Thr Tyr Val Glu Ile Val 100 105 110 Ala Phe Ile Leu Gln Ser His Gly Ala Glu Pro Gly Glu Thr Glu 115 120 125 Leu Thr Ser Asp Glu Ala Leu Leu Gly Ser Leu Met Met Gly Arg 130 135 140 Asn Pro Asn 143 配列番号：３配列の長さ：５２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列 Ala Asp Thr Ala Ala Thr Glu Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Gly 1 5 10 15 Ala Ala Thr Ser Ile Tyr Asp Gly Val Tyr Thr Ala Ala Gln Ala 20 25 30 Glu Ala Gly Gln Ala Ala Trp Met Thr Ser Xaa Ala Ser Xaa His 35 40 45 Gly Pro Thr Ala Arg Gly Ser 50 52 配列番号：４配列の長さ：４４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列 Gly Pro Arg Val Ile Gly Pro Val Ile Asn Asn Lys Tyr Ala Asp 1 5 10 15 Lys Pro Leu Leu Asp Tyr Phe Asn Tyr Thr Arg Asp Asn Met Pro 20 25 30 Met Gly Ala Pro His Ser Leu Ser Asp Asp Thr Tyr Val Glu 35 40 44 配列番号：５配列の長さ：１３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列 Ile Leu Gln Ser His Gly Ala Glu Pro Gly Glu Thr Glu 1 5 10 13 配列番号：６配列の長さ：５０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列 ATCAACAACA AGTATGCTGA CAAGCCGCTG CTGGACTACT TCAACTACAC 50

【図面の簡単な説明】

【図１】シトクロムc551 IおよびIIの吸収スペクトル
を示す図である。試料の蛋白質濃度はいずれも0.4mg/ml
であった。実線および破線はそれぞれ還元型および酸化
型のスペクトルである。

【図２】天然型シトクロムc551 IIから単離されたペ
プチドおよび合成されたオリゴヌクレオチドの配列を示
す図である。図中、Ａは、それぞれ天然型シトクロムc5
51 IIのペプチド配列を示す。下線を施した配列c1、c5
およびc6はオリゴヌクレオチドの調製のために用いた。
後にペプチドIIIはペプチドIの頭部にある配列であるこ
とが判明した。図中、Ｂはプローブおよびプライマーと
して合成したオリゴヌクレオチドを示す。

【図３】シトクロムc551遺伝子を含むプラスミドを有
するGOS2Rのウエスタンブロット分析の結果を示す図で
ある。各レーンにおいて、無細胞抽出物5μgを用いた。
レーン１はGOS2R (pGOC101R)、レーン２はGOS2R (pGOC1
01)、レーン３はGOS2R (pVK102)、およびレーンCは精製
シトクロムc551 IおよびII（各50ng）を示す。

【図４】 C末端にシトクロムc様配列を有するアセトバ
クター・アセチ（A.aceti）のアルコール脱水素酵素（A
DH）を模して作製したアルコール／アルデヒド脱水素酵
素（AADH）-シトクロムc551接合蛋白質の発現に用いた
プラスミドの調製を示す図である。図中、*1において、
ADHの脱水素酵素ドメインとシトクロムドメインとの間
の配列（成熟型ADHのアミノ酸582から595までに対応す
るPALNNRGFLPVKPP）を、AADHドメインとシトクロムc551
ドメインとを連結させるためのリンカーとして用いた。
また、*2において、3つの部分（AADH、リンカーおよび
シトクロムc551）を連結させるために制限部位NheIおよ
びBamHIを導入した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者新城雅子神奈川県鎌倉市台５−５−30 (72)発明者富山哲史神奈川県藤沢市川名１−１−27−305

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】原核生物または真核生物の宿主細胞にお
いて発現される少なくともシトクロムc551の一次構造の
一部および生物学的特性の1つを有するポリペプチドを
コードするDNA配列を含むDNAであって、該DNAが、 (a)配列番号：1またはその相補鎖によって同定されるDN
A、 (b)(a)で定義されたDNAまたはその断片とハイブリダイ
ズするDNA、および (c)遺伝的コードの縮退がなければ、(a)または(b)で定
義されたDNAとハイブリダイズし、同一のアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードするDNA、の中から選択
されるDNA。
【請求項２】配列番号：２によって特定されるシトク
ロムc551ポリペプチド、または１個以上のアミノ酸残基
の付加、挿入、削除および／または置換を含む機能性の
誘導体であって、シトクロムｃとしての機能を有するポ
リペプチドをコードするDNA。
【請求項３】シトクロムc活性を有し、請求項1または
2に記載のDNAによってコードされるポリペプチド。
【請求項４】それぞれ以下の物理化学的特性を示すシ
トクロムc551 IおよびIIからなる群から選択され、グル
コノバクター属に属する微生物から得られるまたは得ら
れたシトクロムc活性を有するポリペプチド： (a)シトクロムc551 I： (a)分子量：ゲル濾過では約19±1 kDa、SDS-PAGE分析で
は約18.0±1.0 kDa、 (b)吸収スペクトル：還元型はそれぞれα、βおよびγ
ピークとして551nm、522nmおよび417nmで最大吸収を示
す、 (c)ヘム含量：ヘム約1モル／蛋白質1モル、 (d)等電点：約3.95、および (b)シトクロムc551 II： (a)分子量：ゲル濾過では約19±1 kDa、SDS-PAGE分析で
は約16.8±1.0 kDa、 (b)吸収スペクトル：還元型はそれぞれα、βおよびγ
ピークとして551nm、522nmおよび417nmで最大吸収を示
す、 (c)ヘム含量：ヘム約1モル／蛋白質1モル、 (d)等電点：約3.75。
【請求項５】請求項1または2に記載のDNAを含む原核
生物または真核生物宿主細胞における発現に適したベク
ター。
【請求項６】請求項5に記載のベクターによって形質
転換された宿主細胞。
【請求項７】請求項6に記載の宿主細胞を適当な培地
で培養し、その培養物からシトクロムc551を回収するこ
とを含む、シトクロムc551の製造方法。
【請求項８】請求項3または4に記載のシトクロムc551
を用いることを特徴とする、ビタミンCの製造方法。