KR19980081041A - 사이토크롬 씨 및 그의 유전자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현될때 사이토크롬 c551의 적어도 일부의 일차 구조 및 생물학적 성질중 하나를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열, 이 DNA 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드, DNA 서열을 포함하는 발현 벡터, 이 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포, 이 숙주세포를 사용한 사이토크롬 c의 생산 공정 및 사이토크롬 c를 비타민 C 생산에 사용하기 위한 용도에 관한 것이다.

Description

사이토크롬 씨 및 그의 유전자
사이토크롬 c는 산소 분자가 H2O로 환원됨과 동시에 기질이 산화되는 반응에 있어서 선두의 탈수소효소와 말단의 산화제 사이에서의 전자전달을 매개하는 필수적인 성분중 하나로 알려져 있다. 이 전자전달 반응은 헴(heme) 철의 산화-환원반응을 기본으로 한다. 근래에는 예를 들면 하이드로제노박터 써모필루스(Hydrogenobacter thermophilus)의 사이토크롬 c552를 사용하여 사이토크롬 c의 전자전달 반응을 생물학적 물질 또는 요소를 닮은 새로운 물질, 즉 바이오칩(biochip)에 적용하는 시도가 이루어졌다(코다마(Kodama) 등의 미국 특허 제 5459046 호). 글루코노박터(Gluconobacter) 및 아세토박터(Acetobacter)를 포함하는 아세트산 박테리아는 당- 및 당 알콜-산화에 대한 높은 효능을 지니며, 이들은 초(醋, vinegar) 및 비타민 C 생성에서 중간체로서 사용되는 L-소보스(sorbose)를 제조하는데 산업적으로 사용된다. 산화적 발효의 경우, 사이토크롬 c는 산화반응을 완결시키는데 중요한 역할을 한다. 사이토크롬 c 단백질은 글루코박터를 포함하는 많은 생물들에 의해 정제되고 그 특징이 규정되어졌는데, 예를 들면 마쯔시타(Matsushita) 등은 글루코노박터 서브옥시단스(Gluconobacter suboxydans)(FEMS Microbiol. Lett., 10:267-270, 1981)로부터 CO-결합 사이토크롬 c553(CO)(분자량 48kDa)을 정제하고 이후에 사이토크롬 c553(CO)은 글루코노박터의 알콜 탈수소효소의 두번째 서브유닛(subunit)과 동일함을 발견하였다고 보고한 바 있다. 와이.다케다(Y.Takeda) 등의 문헌[J.Ferment.Bioeng., 74, 209-213, 1992]에 기술된 바와 같이, 알콜 탈수소효소의 두번째 서브유닛이 결핍된 글루코노박터에서 사이토크롬 c553(CO)을 증폭시키면 특정 속도(g-생성물/g-세포·시간)로 D-소비톨로부터 L-소보스의 생성이 개선된다. 사이토크롬 c553외에도, 사이토크롬 c551(AL)(분자량 55kDa) 및 사이토크롬 c551(CO)(분자량 72kDa)(아메이아마(Ameyama) 등의 문헌[Agri.Biol.Chem. 51, 2943-2950(1987)]을 참조)이 글루코노박터로부터 단리되었다.
본 발명의 목적은 전자 수용체로서 작용하는 단백질군에 속하는 신규한 사이토크롬 c를 제공하는 것이다. 더욱 특히는 본 발명의 신규한 사이토크롬 c는 알콜 및 알데히드 탈수소효소와 같은 탈수소효소의 전자 수용체로서도 유용하다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드의 작용성 유도체에 관한 것이다. 이러한 작용성 유도체는 본 발명의 아미노산 서열중 하나이상의 아미노산의 부가, 삽입, 삭제 및/또는 치환에 의해 정해지며, 이러한 유도체는 당해 분야에 공지되거나 본원에 구체적으로 기술된 분석 방법에 의해 측정될때 여전히 사이토크롬 c 활성을 갖는다. 이러한 작용성 유도체는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법 또는 본원에서 개시된 바와 같이 당해 분야에 공지되고 예를 들면 삼브룩(Sambrook) 등에 의해 기술된 방법(문헌[Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989]을 참조)에 의해 DNA 서열을 기본으로 하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는, 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있고 예를 들면 에이치.뉴라쓰(H.Neurath) 및 알.엘.힐(R.L.Hill)의 문헌[The Proteins, Academic Press, New York, 1979, 특히 14페이지 도 6을 참조]에 기술되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 및 이 반대의 경우들이다.
본 발명은 또한, 원핵 또는 진핵 숙주세포에서 발현될때 기술된 바와 같은 사이토크롬 c551의 적어도 일부의 일차 구조 및 생물학적 성질중 하나를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열, 예를 들면 본원에 열거된 바와 같은 서열 뿐만 아니라 그의 상보적인 스트랜드, 이러한 서열을 포함하는 서열, 바람직하게는 표준 조건하에서 서열 또는 그의 절편과 하이브리드를 형성하는 DNA 서열, 및 유전 코드의 디제너레이션 때문에 표준 조건하에서 상기 서열과는 하이브리드를 형성하지 않지만 똑같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 관한 것이다.
본원에서 하이브리드 형성과 관련해 사용된 용어인 표준 조건이란 일반적으로 특정 하이브리드 형성 신호를 감지하기 위해 당해 분야의 숙련자들이 사용하는 조건을 말하며, 예를 들면 삼부룩 등의 문헌[Molecular Cloning, 2판, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989, New York]에 기술되어 있고, 바람직하게는 당해 분야의 숙련자들이 잘 알고 있고 삼부룩 등의 문헌에 기술되어 있는 엄중한 하이브리드 형성 조건 또는 엄중하지 않은 세척 조건이고, 더욱 바람직하게는 약간 엄중한 조건 또는 더욱더 바람직하게는 엄중한 하이브리드 형성 조건 및 엄중한 세척 조건이다.
본 발명의 목적은 또한 알콜/알데히드 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함하는 상기와 같은 DNA 서열을 제공하는 것이다. 이러한 구조물을 예를 들면 실시예 6에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 정의된 DNA 서열에 의해 코딩되는, 사이토크롬 c 활성을 갖는 폴리펩티드, 또는 각각 하기 물리화학적 성질을 나타내는 사이토크롬 c551 I 및 II로 이루어진 그룹으로부터 선택된 글루코노박터속에 속하는 미생물로부터 수득되거나 수득가능한, 사이토크롬 c 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 것이다:
(a) 사이토크롬 c551 I:
(a) 분자량: 겔 여과에 의해 측정시 약 19±1 kDa, SDS-PAGE 분석법에 의해 측정시 약 18.0±1.0kDa,
(b) 흡광 스펙트럼: 환원형은 551nm, 522nm 및 417nm에서 각각 α, β, 및 γ 피크로서 최대 흡광도를 나타냄,
(c) 헴 함량: 단백질 1mol당 약 1mol의 헴
(d) 등전점: 약 3.95;
(b) 사이토크롬 c551 II:
(a) 분자량: 겔 여과에 의해 측정시 약 19±1 kDa, SDS-PAGE 분석법에 의해 측정시 약 16.8±1.0kDa,
(b) 흡광 스펙트럼: 환원형은 551nm, 522nm 및 417nm에서 각각 α, β, 및 γ 피크로서 최대 흡광도를 나타냄,
(c) 헴 함량: 단백질 1mol당 약 1mol의 헴
(d) 등전점: 약 3.75.
본 발명의 목적은 또한 알콜/알데히드 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함하는 상기 DNA 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 정의된 DNA 서열을 포함하는, 원핵 또는 진핵 숙주 세포내에서 발현시키기에 적합한 벡터 및 이러한 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포, 더욱 구체적으로는 상기 정의된 DNA 서열이 그의 게놈으로 합체되는 숙주 세포, 더욱이 근원은 진핵생물이지만 바람직하게는 포유동물 또는 식물 세포인 숙주 세포, 또는 대장균(Escherichia coli), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 아세토박터 크실리늄(Acetobacter xylinum), 아세토박터 파스퇴리아누스(Acetobacter pasteurianus), 아세토박터 아세티, 아세토박터 한세니(Acetobacter hansenii) 및 글루코노박터 옥시단스(예를 들면 글루코노박터 옥시단스 DSM No.4025)와 같은 박테리아로 이루어진 군으로부터 선택되는, 근원이 원핵생물인 숙주세포를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 적당한 배지에서 상기 정의된 바와 같은 숙주 세포를 배양시키고 사이토크롬 c551을 이 배지로부터 수득함을 포함하는, 사이토크롬 c551을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 사이토크롬 c는 또한 L-소보스 또는 D-소비톨로부터의 2KGA 생성, 더욱이 생체내에서 및 시험관내에서 알콜 및 알데히드 탈수소효소의 존재하에 상응하는 기질로부터 알데히드, 카복실산, 및 케톤의 생성을 개선시키기에 적합하다.
2KGA 화합물은 잘 공지된 라이히스타인(Reichstein) 방법에 따라 아스코르브산(비타민 C)로 전환될 수 있기 때문에 아스코르브산의 생성에 있어 중요한 중간체이다. 발효에 의한 L-소보스 또는 D-소비톨로부터의 2KGA의 생성은 공지되어 있다. 티.호시노(T.Hoshino) 등의 문헌[Agric.Biol.Chem., 54(5), 1211-1218, 1990] 및 유럽특허공고공보 제 606621 호에 개시되어 있는 바와 같이, 글루코노박터 균주는 소보스 및 소보손 탈수소효소에 의해 촉진되는 반응에 의해 2KGA를 생성시키는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 목적은 또한 본 발명의 사이토크롬 c을 비타민 C의 생성에 사용하는 용도이다.
본 발명은 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현될때 사이토크롬 c551의 적어도 일부의 일차 구조 및 생물학적 성질중 하나를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열, 이 DNA 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드, DNA 서열을 포함하는 발현 벡터, 이 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포, 이 숙주세포를 사용한 사이토크롬 c의 생산 공정 및 사이토크롬 c를 비타민 C 생산에 사용하기 위한 용도를 제공하기 위한 것이다.
도 1은 사이토크롬 c551 I 및 II의 흡광 스펙트럼을 보여준다. 샘플의 단백질 농도는 각각 0.4g/㎖이다. 단선 및 점선은 각각 환원형과 산화형의 스펙트럼이다.
도 2는 천연 사이토크롬 c551 II 및 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 단리된 펩티드의 서열을 보여준다.
도 3은 사이토크롬 c551 유전자를 갖는 플라스미드를 운반하는 GOS2R을 웨스턴-블롯팅(Western-blotting) 분석한 결과를 보여준다.
도 4는 C-말단에 사이토크롬 c와 유사한 서열을 갖는 아세토박터 아세티(Aceobacter aceti)의 알콜 탈수소효소(ADH)를 모방하여 구축된 알콜/알데히드 탈수소효소(AADH)-사이토크롬 c551 콘쥬게이트의 발현에 사용되는 플라스미드의 제조방법을 제조한다. ADH의 탈수소효소 도메인과 사이토크롬 c 도메인 사이의 서열(성숙한 ADH의 아미노산 582 내지 595에 상응하는 PALNNRGFLPVKPP)이 AADH 도메인을 사이토크롬 C551 도메인에 연결시키는 링커로서 사용되었다. 제한 부위인 Nhe I 및 Bam HI를 도입하여 세 부분(AADH, 링커 및 사이토크롬 c551)을 연결하도록 하였다.
본 발명을 보다 상세하게 기술하기 전에, 글루코노박터 옥시단스로부터 수득가능한 이소형(isoform)인 I 및 II으로 이루어진 정제된 사이토크롬 c551의 물리화학적 성질을 다음에 나타내었다:
(1) 분자량
정제 단계에서 겔 여과시, 사이토크롬 c551 I 및 II는 약 19±1.0kDa의 겉보기 분자량을 나타내었다. SDS-PAGE에 의해 분석된 사이토크롬 c551 I 및 II의 분자량은 각각 18.0±1.0kDa 및 16.8±1.0kDa이었다. 따라서, 두 사이토크롬 c551 제제는 유사한 분자량을 나타내었으며 사이토크롬 c551 I 및 II 모두 단량체 단백질이다.
(2) 흡광 스펙트럼 및 헴 함량
소디움 디티오나이트가 첨가되면 완전히 환원되는 사이토크롬 c551 I 및 II의 흡광 스펙트럼이 도 1에 나타나 있다. 사이토크롬 c551 I 및 II의 스펙트럼은 서로 구별이 되지 않는다. 환원된 사이토크롬은 551nm, 522nm 및 417nm에서 각각 α, β 및 γ 피크로서 최대 흡광도를 나타내었다. 또한, 산화된 사이토크롬은 411nm에서 γ피크로서 최대의 흡광도를 나타내었다. 사이토크롬 c551 I 및 II의 헴 함량은 드랍킨(Drabkin)의 피리딘 헤모크롬 방법(문헌[J.Biol.Chem., 146:605,1942]을 참조)에 의해 측정될때 단백질 1mol당 약 1mol이었다.
(3) 등전점
사이토크롬 c551 I 및 II의 등전점(pI)은 LKB(스웨덴 스톡홀름) 등전점 전기영동시스템에 의해 측정될때 각각 3.95 및 3.75였다.
(4) 사이토크롬 c551 I 및 II의 펩티드 맵 비교
동일한 조건하에서 V8 프로테아제 또는 써모리신(thermolysin)를 사용하여 사이토크롬 c551 I 및 II를 분해시키고, 펩티드 절편 패턴을 역상 HPLC 분석법에 의해 비교하였다. 수개의 부 펩티드 절편 피크가 추가로 각각 사이토크롬 c551 I 및 II에서 관찰되었다는 것을 제외하고는, 사이토크롬 c551 I 및 II의 주요 펩티드 절편 패턴들(약 30개의 펩티드 절편 피크)은 동일하였다. 이 결과는 사이토크롬 c551 I 및 II의 아미노산 서열이 서로 매우 유사함을 나타내는 것이다.
(5) 사이토크롬 c551 II의 아미노산 서열
사이토크롬 c551 I 및 II의 N-말단 아미노산을 공지되지 않은 변형방법에 의해 블로킹하였다. 따라서, 내부 아미노산 서열을 펩티드 절편으로부터 결정하였다. V8 프로테아제 및 써모리신에 의해 분해된 펩티드 절편외에도, 사이토크롬 c551 II(헴이 제거되고 S-카복실메틸화됨)을 리실-엔도펩티다제(lysyl-endopeptidase)에 의해 분해시켜 추가의 펩티드 절편을 만들었다. 이렇게 수득된 수개의 펩티드 절편을 사용하여 하기 내부 아미노산 서열을 결정하였다:
적당한 미생물을 배양시키고, 세포를 파쇄하고, 파쇄된 세포의 무세포 추출물, 바람직하게는 미생물의 가용성 분획으로부터 사이토크롬 c를 단리 및 정제시킴으로써 본 발명에 따른 사이토크롬 c을 제조할 수 있다.
본 발명에서 본 발명의 사이토크롬 c를 단리시키는데 사용되는 미생물은 바람직하게는 사이토크롬 c를 생성할 수 있는 글루코노박터속에 속한다. 상기 미생물과 기능적으로 동일한 것들, 계대배양체, 돌연변이체 및 변형체도 본 발명에 사용될 수 있다. 바람직한 균주는 글루코노박터 옥시단스이다. 특정의 바람직한 글루코노박터 옥시단스 균주가 1987년 3월 17일자로 DSM No.4025로서 독일 괴팅겐(Gottingen) 소재의 도이치 잠룽 본 미크로오르가니스멘(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)에 기탁되었다. 더욱이, 이 균주의 계대배양체가 또한 부다페스트 조약에 따라 1992년 3월 30일자로 일본의 발효연구소 산업과학기술원(Agency of Industrial Science and Technology, Fermentation Research Institute)에 글루코노박터 옥시단스 DSM No.4025 FERM BP-3812로서 기탁되었다. 더욱이 유럽특허공고공보 제 0278 477 호는 이 균주의 특성을 개시한다.
호기성 조건하에서 적당한 영양분으로 보충된 수성 매질중에서 미생물을 배양할 수 있다. 약 4.0 내지 9.0, 바람직하게는 약 6.0 내지 8.0의 pH에서 배양을 수행할 수 있다. 배양 기간은 사용된 pH, 온도 및 영양 배지에 따라 달라지지만 통상적으로 2 내지 6일인 것이 유리하다. 배양을 수행하는데 바람직한 온도 범위는 약 13℃ 내지 36℃, 바람직하게는 약 18℃ 내지 33℃이다.
통상적으로 배지는 동화성 탄소 공급원, 분해성 질소 공급원 및 무기 물질, 비타민, 미량의 원소 및 기타 성장촉진인자와 같은 영양분을 함유할 것이 요구된다. 동화성 탄소 공급원으로서는 글리세롤, D-글루코스, D-만니톨, D-프럭토스, D-아라비톨, D-소보스, D-소비톨 등이 사용될 수 있다.
질소 공급원으로서는 이스트 추출물, 육수, 펩톤, 카제인, 옥수수 우려낸 액, 요소, 아미노산, 질산염, 암모늄염 등과 같은 다양한 유기 또는 무기 물질을 사용할 수 있다. 무기 물질로서는 황산마그네슘, 인산칼륨, 염화제일철, 염화제이철, 탄산칼슘 등을 사용할 수도 있다.
다음에는 배양후 미생물로부터 사이토크롬 c의 단리 및 정제에 대한 실시태양 및 유전자/DNA 서열의 클로닝에 대한 실시태양이 기술된다:
(1) 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 발효 브로쓰로부터 수확한다.
(2) 세포를 완충용액에 현탁시키고 균질기, 소니케이터(sonicator) 또는 리소짐 등으로 처리하여 파쇄시킴으로써 파쇄된 세포 용액을 만든다.
(3) 사이토크롬 c를 파쇄된 세포의 무세포 추출물로부터, 바람직하게는 미생물의 가용성 분획으로부터, 황산암모늄 침전법, 투석, 이온교환 크로마토크래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 친화성(affinity) 크로마토그래피와 같은 통상적인 단백질 정제 방법에 단리 및 정제한다.
본 발명에 의해 제공된 사이토크롬 c는 알데히드, 카복실산 및 케톤의 생성에 있어서, 특히 L-소보스 또는 D-소비톨로부터 L-소보손을 거쳐 2-KGA의 생성에 있어서, 탈수소효소에 속하는 효소로부터 전자를 수용하는 전자 수용체로서 유용하다.
요약하면, 본 발명에서 사용되는 사이토크롬 c 유전자, DNA 서열, 재조합 발현 벡터 및 형질전환된 숙주세포라고도 불리는 재조합 생물을 다음 단계에 의해 수득할 수 있다:
(1) 탈수소효소로부터 전자를 수용하는 사이토크롬 c를 제공할 수 있는 염색체 DNA를 미생물로부터 단리시키고 대장균내에서 이 염색체 DNA로 유전자 라이브러리를 구축하는 단계;
(2) 콜로니(colony)-, 플라크(plaque)- 또는 써던(Southern)-하이브리드 형성법, PCR(폴리머라제 연쇄 반응) 클로닝, 웨스턴-블롯팅 분석법 등에 의해 염색체 DNA로부터 사이토크롬 c 유전자를 클로닝시키는 단계;
(3) 사이토크롬 c 유전자를 함유하는 DNA 분자를 선별하는 통상적인 방법에 의해, 상기와 같이 수득된 사이토크롬 c 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 사이토크롬 c 유전자가 효율적으로 발현될 수 있는 재조합 발현 벡터를 구축하는 단계;
(4) 형질전환, 형질도입, 트랜스콘쥬게이션(transconjugation) 및 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 사이토크롬 c 유전자를 갖는 재조합 생물을 구축하는 단계.
본 발명의 상기 양태에서 사용된 물질 및 기법을 하기에 상세하게 예시해보겠다.
전체 염색체 DNA를 당해 분야에 잘 공지된 방법에 의해 정제할 수 있다. 하기 방법에 의해 전체 염색체 DNA로부터 사이토크롬 c를 코딩하는 유전자를 플라스미드 또는 파지 벡터에 클로닝시킨다:
(i) SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시킨 겔을 펩티드-처리시켜 수득한 전체 단백질 또는 펩티드 절편을 단리시키고, 이를 어플라이드 바이오시스템즈 자동 기상 씨퀀서 470A(Applied Biosystems automatic gas-phase sequencer 470A)(미국 코넥티컷주 노르웍 소재의 퍼킨 엘머 코포레이션(Perkin Elmer Corp.))와 같은 단백질 씨퀀서에 적용하여 정제된 사이토크롬 c로부터 부분적인 아미노산 서열을 결정하고, 이렇게 수득된 아미노산 서열에 따라 어플라이드 바이오시스템즈 자동 DNA 씨퀀서 381A(퍼킨 엘머)와 같은 DNA 합성기로 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하고, 이 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 써던-, 콜로니- 또는 플라크-하이브리드 형성법에 의해서, 목적하는 유전자를 갖는 균주의 유전자 라이브러리로부터 목적하는 유전자를 갖는 클론을 단리시키고; (ii) 안티-사이토크롬 c 항체를 사용하여 면역학적 방법에 의해 유전자 라이브러리로부터 사이토크롬 c를 발현하는 클론을 선별하거나; (iii) 위에서 결정된 아미노산 서열에 따라 합성된 두개의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 방법에 의해 전체 염색체 DNA로부터 DNA를 증폭시키고, 프로브로서 수득된 PCR 생성물을 사용하여 써던-, 콜로니- 또는 플라크-하이브리드 형성법에 의해, 대장균내에서 구축된 유전자 라이브러리로부터 전체 사이토크롬 c 유전자를 갖는 클론을 단리시킴. 여기서 언급된, 상기 사이토크롬 c에 반해 반응하는 항체를, 정제된 사이토크롬 c 단백질 또는 그의 펩티드 절편을 사용하여 문헌[Methods in Enzymology, vol.73, p46, 1981]에 기술된 방법에 따라서 제조할 수 있다.
M13 파지를 사용하여 디데옥시 쇄 종결 방법과 같은 공지된 방법에 의해 사이토크롬 c 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다(상거 에프(Sanger F.)등의 문헌[Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74:5463-5467, 1977]을 참조).
사이토크롬 c 유전자 또는 일반적으로 말하자면 사이토크롬 c 활성을 코딩하는 DNA 서열을 효율적으로 발현시키는데에는 다양한 프로모터가 사용될 수 있는데, 예를 들면 상기 사이토크롬 c의 앞부분에 위치하는 원래의 프로모터, Tn5의 카나마이신 내성 유전자(디.이.베르그(D.E.Berg) 및 씨.엠.베르그(C.M.Berg)의 문헌[Bio/Technology 1:417-435, 1983]을 참조), pBR322의 암피실린 내성 유전자 및 대장균(lac)의 b-갈락토시다제와 같은 항생제 내성 유전자의 프로모터, trp-, tac-, trc-프로모터, 람다 파지의 프로모터, 및 대장균, 슈도모나스 푸티다, 아세토박터 크실리늄, 아세토박터 파스퇴리아누스, 아세토박터 아세티, 아세토박터 한세니 및 글루코노박터 옥시단스, 포유동물 세포 및 식물 세포를 포함하는 미생물로 이루어진 숙주에서 작용성일 수 있는 임의의 프로모터이다.
상기 목적을 위해서는 코딩 서열이 도입될 숙주세포에서 작용가능한, 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno: SD) 서열(예를 들면 숙주 세포에서 작용할 수 있는 천연 및 합성 서열을 포함하는 AGGAGG 등) 및 전사 종결자(숙주 세포에서 작용할 수 있는 임의의 천연 및 합성 서열을 포함하는 역반복 구조)와 같은 기타 조절 요소를 전술된 프로모터와 함께 사용할 수 있다.
사이토크롬 c 단백질인 페리플라즘 폴리펩티드를 발현시키기 위해서는, 통상적으로 15개 내지 50개의 아미노산 잔기를 함유하고 전체적으로는 소수성인 신호 단백질이 필수적이다. 신호 단백질을 코딩하는 DNA는 목적하는 숙주 세포에서 작용할 수 있는 임의의 천연 및 합성 서열로부터 선택될 수 있다.
이중쇄 DNA를 클로닝하는데 광범위한 숙주/클로닝 벡터 조합을 사용할 수 있다. 클로닝 벡터는 일반적으로는 복제 근원, 조절 요소, 다중-클로닝 부위를 포함하는 클로닝 부위, 및 암피실린, 테트라사이클린, 카나마이신, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 스펙티노마이신 등에 대한 내성 유전자를 포함하는 항생제 내성 유전자와 같은 선별 마커(selection marker)를 함유하는 플라스미드 또는 파지이다.
목적하는 유전자를 대장균에서 발현시키기에 바람직한 벡터는 pUC18 및 pBluescript II, pACYC177 및 pACYC184(문헌[J.Bacteriol., 134:1141-1156, 1978] 및 그의 유도체를 포함하는 pBR322 또는 그의 유도체와 같은, 대장균에서 통상적으로 사용되는 임의의 벡터 및 RK2 및 RSF1010과 같은 광범위한 숙주의 플라스미드로부터 유도된 벡터로부터 선택된다. 글루코노박터 옥시단스 DSM No.4025를 포함하는 글루코노박터 및 슈도모나스 푸티다에서 목적하는 유전자를 발현시키기에 바람직한 벡터는 대장균과 같은 바람직한 클로닝 생물에서 뿐만 아니라 글루코노박터 및/또는 슈도모나스 푸티다에서도 복제할 수 있는 임의의 벡터로부터 선택된다. 바람직한 벡터는 pVK102 및 그의 유도체 및 RSF1010 및 그의 유도체와 같은 코스미드 벡터와 같은 광범위한 숙주의 벡터이고, 글루코노박터에서 작용성인 복제 근원 뿐만 아니라 대장균에서 작용성인 다른 근원을 갖는 벡터이다. 클로닝된 유전자의 안정하고 효율적인 발현 및 클로닝된 유전자를 갖는 숙주 세포의 효율적인 배양을 위해서 벡터의 복제수 및 안정성을 신중하게 고려해야 한다. Tn5와 같은 전위(transposable) 요소를 함유하는 DNA 서열을 벡터로서 사용하여 목적하는 유전자를 바람직한 숙주, 특히 염색체상에 도입시킬 수 있다. 바람직한 숙주로부터 단리된 임의의 DNA와 목적하는 유전자를 함유하는 DNA 서열은 또한 목적하는 DNA 서열을 바람직한 숙주, 특히 염색체상에 도입시키기에 유용하다. 이러한 DNA 서열은 형질전환, 형질도입, 트랜스콘쥬게이션 및 일렉트로포레이션에 의해 바람직한 숙주로 전달될 수 있다.
유용한 숙주들은 근원이 원핵 또는 진핵 생물이고 미생물, 포유동물 세포 및 식물 세포를 포함할 수 있다. 바람직한 미생물로서는 대장균, 슈도모나스 푸티다, 아세토박터 크실리늄, 아세토박터 파스퇴리아누스, 아세토박터 아세티, 아세토박터 한세니 및 글루코노박터 옥시단스와 같은 박테리아 및 재조합 사이토크롬 c를 생성할 수 있는 임의의 그람-음성 박테리아일 수 있다. 상기 미생물과 기능적으로 동일한 것들, 상기 미생물들의 계대배양체, 돌연변이체 및 변형체도 본 발명에서 사용할 수 있다. 바람직한 균주는 대장균 K12 및 그의 유도체, 슈도모나스 푸티다 또는 글루코노박터 옥시단스 DSM No.4025이다.
본 발명의 사이토크롬 c를 코딩하는 DNA 서열을, 프로모터 및 리보좀 결합 부위 및 전술된 숙주 세포에서 작용할 수 있는 전자 종결자와 같은 조절 영역을 함유하는 적합한 벡터내로, 발현 벡터를 생성시키는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 리게이션(ligation)시킬 수 있다.
발현 벡터를 갖는 숙주 세포를 구축하기 위해서는, 형질전환, 형질도입, 접합 교배(conjugal mating)(필립 게르하르트(Philipp Gerhardt) 등의 문헌[Methods for general and molecular bacteriology, 제 14 및 15 장, American Society for Microbiology, 1994]을 참조), 및 일렉트로포레이션과 같은 다양한 DNA 전달 방법을 사용할 수 있다. 형질전환된 숙주세포를 구축하는 방법은 분자생물학 분야에 공지된 방법으로부터 선택될 수 있다. 대장균, 슈도모나스 및 아세토박터에 대해서는 통상적인 형질전환 시스템을 사용할 수있다. 대장균에 대해서는 형질도입 시스템을 사용할 수 있다. 대장균, 슈도모나스 푸티다 및 글리코노박터 옥시단스를 포함하는 그람-양성 및 그람-음성 박테리아에 대해서는 접합 교배 시스템을 광범위하게 사용할 수 있다. 바람직한 접합 교배 방법은 기본적으로는 본 발명의 발명자에 의해 PCT 공개공보 제 WO89/06688 호에 개시되어 있다. 접합은 액체 매질 또는 고체 표면상에서 일어날 수 있다. 사이토크롬 c 생성을 위한 바람직한 수용자는 대장균, 슈도모나스 푸티다 및 글루코노박터 옥시단스로부터 선택된다. 2KGA의 생성을 위한 바람직한 수용자는 적합한 재조합 발현 벡터와 함께 활성 AADH를 생성할 수 있는 대장균, 슈도모나스 푸티다 및 글루코노박터 옥시단스로부터 선택된다. 2KGA 생성을 위한 바람직한 수용자는 글루코노박터 옥시단스 DSM No.4025이다. 접합 교배를 위한 수용자에게는 선별 마커를 통상적으로 첨가하며, 예를 들면 날리딕스산 또는 리팜피신에 대한 내성을 통상적으로 선택한다.
본 발명의 사이토크롬 c551은, 하기에 예시된 바와 같이 총 전자 전달 효율을 개선시키기 위해 AADH 코딩 DNA 서열로 구축된 AADH-사이토크롬 c551 콘쥬게이트와 같은 단백질-단백질 콘쥬게이트의 공급원으로서 사용될 수 있다.
실시예 1 사이토크롬 c551 I 및 II의 제조
달리 언급이 없는 한, 모든 조작을 4℃에서 수행하였다.
(1) 글루코노박터 옥시단스 DMS No.4025의 배양
8% L-소보스(별도로 살균됨), 0.05%의 글리세롤, 0.25%의 MgSO4·7H2O, 1.75%의 옥수수 우려낸 액, 5.0%의 제빵용 이스트, 0.5%의 CaCO3및 0.5%의 요소(별도로 살균됨)을 함유하는 pH 7.0의 씨드(seed) 배지를 시험관(각각 5㎖)에 분배하였다. 27℃에서 4일간 pH 7.0(살균전)의 5.0%의 D-만니톨, 0.25%의 MgSO4·7H2O, 1.75%의 옥수수 우려낸 액, 5%의 제빵용 이스트(일본 도쿄 소재의 오리엔탈 이스트 캄파니(Oriental Yeast Co.)), 0.5%의 CaCO3, 0.5%의 요소(별도로 살균됨) 및 2.0%의 아가(agar)를 함유하는 NS2 플레이트 아가 배지에서 성장한 글루코노박터 옥시단스 DSM No. 4025 세포 한 루프를 시험관내 씨드 배지에 접종하고 교반시키면서 24시간동안 30℃에서 배양시켰다. 그 결과 수득된 씨드 배지를 500㎖의 엘렌메이어(Erlenmeyer) 플라스크에 담긴, 전술된 바와 같은 것과 동일한 씨드 배지 100㎖에 옮기고 280rpm으로 회전시키면서 24시간동안 30℃에서 배양시켰다. 이렇게 제조된 씨드 배지 25㎖씩을 2000㎖ 엘렌메이어 플라스크에 담긴 pH 7.5(살균전)의 10% L-소보스(별도로 살균됨), 0.05% 글리세롤, 1.6% 요소(별도로 살균됨), 0.25%의 MgSO4·7H2O, 6.25%의 제빵용 이스트 세포, 1.5%의 CaCO3(일본 교토 나카라이테스쿠(Nacaraitesque), 생산 등급), 및 3.0%의 옥수수 우려낸 액을 함유하는 생산 배지 500㎖에 옮기고 180rpm으로 회전시키면서 35 내지 40시간동안 30℃에서 배양시켰다. 배양시킨 후, 제빵용 이스트 세포 및 CaCO3와 같은 고체 물질을 2회 저속 원심분리(500×g, 15분)시켜 제거하였다. 이어서, 15분동안 10,000×g으로 원심분리하여 글루코노박터 옥시단스 DSM No.4025 세포를 수확하였다. 세포를 pH 8.0의 25mM Tris-HCl, 0.9%의 NaCl, 0.09%의 KCl, 10mM의 CaCl2, 5mM의 MgCl2, 5%의 수크로스 및 1mM의 페닐메틸설파닐 플루오라이드(PMSF)에 재현탁시키고 세포 현탁액을 500×g으로 15분동안 원심분리시켜 고체 물질을 제거한 후, 10,000×g으로 15분동안 원심분리시켜 세포를 수거하고 사용전까지 -20℃에서 보관하였다.
(2) 가용성 분획의 제조
10ℓ의 배지로부터 수득된 세포(습윤 중량 40g)를 pH 8.0의 60㎖의 25mM Tris 및 5mM CaCl2로 현탁시키고 프렌치 프레스(French press)(1500㎏/㎠)에 2회 통과시켜 파쇄시켰다. DNase 및 MgCl2를 최종 농도가 0.01㎎/㎖ 및 1mM인 용액에 각각 첨가하고, 10분동안 6000×0.01g으로 원심분리시켜 세포 잔해를 제거하였다. 이렇게 제조된 무세포 추출물(총 단백질 8,800㎎)로부터 사이토크롬을 함유하는 가용성 분획을 90분간의 100,000×g 초원심분리에 의해 분리시키고 pH 8.0의 25mM Tris 및 5mM CaCl2에 대해 투석하였다.
(3) DEAE-토요펄(Toyopearl) 650M 칼럼 크로마토그래피
pH 8.0의 25mM Tris 및 5mM CaCl2로 평형화된 DEAE-토요펄 650M(일본 도쿄 소재의 도소(TOSOH) 코포레이션: 2.5ID×45㎝)의 칼럼에 가용성 분획을 가하였다. 이 칼럼을 400㎖의 동일한 완충액으로 세척한 후, 0 내지 0.5M의 NaCl 선형 농도구배를 갖는 완충액 2000㎖로 용출시켰다. NaCl의 농도가 약 0.13M일때 412㎚-480nm 흡광 피크 차를 나타내는 짙은 적색 밴드를 주요 사이토크롬 분획으로서 수거하였다.
(4) 부틸-토요펄 650S 칼럼 크로마토그래피
주요 사이토크롬 분획을 천천히 교반시키면서 동량의 pH 8.0의 25mM Tris 및 80% 포화 (NH4)2SO4로 희석하고, 15분동안 10,000×g으로 원심분리시켜 불용성 물질을 제거하고 pH 8.0의 25mM Tris 및 40% 포화 (NH4)2SO4으로 평형화된 부틸-토요펄 650S(도소; 2.5ID.×20㎝) 칼럼에 적용하였다. 200㎖의 동일한 완충액으로 세척한 후, 40 내지 0%의 포화 (NH4)2SO4선형 농도 구배를 갖는 완충액 1000㎖로 용출시켰다. 약 20% 포화 (NH4)2SO4농도에서 사이토크롬 밴드를 수거하고 N2기체하에서 PM-10 울트라필터를 사용하여 2.5㎖로 농축시켰다.
(5) 세파크릴 S-100HR 겔 여과
사이토크롬 분획을, pH 7.2의 25mM 인산나트륨 및 0.2M NaCl로 평형화된 세파크릴 S-100HR(스웨덴 웁살라, 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech); 2.5ID., 90㎝) 칼럼상에 놓았다. 칼럼을 동일한 완충액으로 전개시키고 분자량이 약 19kDa인 사이토크롬 밴드를 수거하였다.
(6) 하이드록실아파타이트 칼럼 크로마토그래피
주요 사이토크롬 분획을 pH 6.8의 0.2mM 인산나트륨에 대해 투석시키고, pH 6.8의 0.2mM 인산나트륨으로 평형화된 하이드록실아파타이트: HCA-100S(3.3×20㎝; 일본 도쿄 소재의 미쓰이 토아쓰 케미칼스 인코포레이티드(Mitsui Toatsu chemicals Inc.))에 적용하였다. 칼럼을 200㎖의 동일한 완충액으로 세척한 후, 0.2 내지 18mM 인산나트륨(pH 6.8) 선형 구배를 갖는 용액 2000㎖로 용출하였다. 구배 동안에, 사이토크롬을 두개의 적색 밴드로 분리시키고 용출시킨다. 따라서, 보다 먼저 얻어진 피크를 사이토크롬 c551 I라 하였고 나중에 얻어진 피크를 사이토크롬 c551 II라 하였다. 각 사이토크롬을 pH 7.5의 25mM MOPS 및 0.2M NaCl에 대해 투석시키고, N2기체하에서 PM-10 울트라필터(미국 매사츄세츠 베드포드 소재의 밀리포어 코포레이션(Millipore Corp.))를 사용하여 2.0㎖로 농축시키고 -80℃에서 저장하였다. 마지막으로, 37.4㎎의 사이토크롬 c551 I 및 42.6㎎의 사이토크롬 c551 II을 8800㎎의 전체 세포 단백질로부터 수득하였다.
(7) 사이토크롬 c551 I 및 II의 순도
하이드록실아파타이트 칼럼 크로마토그래피(최종 정제 단계)에서, 각 사이토크롬을 일정 흡광비인 280/410nm을 갖는 단일 피크로서 용출하였다. SDS- 및 네이티브(Native)-PAGE 분석에서, 각 사이토크롬은 염색되었을때는 단일 단백질 밴드를 나타내었고 염색되지 않았을때에는 가시 적색 밴드를 나타내었다. 사이토크롬 c551 I 및 II의 분자량은 SDS-PAGE 분석에 의해 측정시 각각 18.0±1.0 및 16.8±1.0kDa였다.
(8) 글리코노박터 옥시단스 DSM No.4025의 AADH로부터 정제된 사이토크롬 c551 I 및 II의 전자 수용능
하기 정의되고 정제된 단백질을 함유하는 2-KGA 생산시스템을 재구성하였다. 시스템은 12μM AADH(에이.아사쿠라(A.Asakura) 및 티.호시노(T.Hoshino)의 유럽특허공고공보 제 606621에 기술된 방법에 의해 글루코노박터 옥시단스 DSM No.4025로부터 정제됨), 14.4μM 사이토크롬 c551 I 및 II(1:1 혼합물), 250μM 말 심장 VI형 사이토크롬 c(미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마 인코포레이티드(Sigma Inc.)로부터 구입됨), 12.5단위/㎖ 소 심장 사이토크롬 c 옥시다제 aa3형(시그마로부터 구입됨), 및 50㎎/㎖ L-소보스, 5㎎/㎖ 소 혈청 알부민(시그마로부터 구입됨, 분획 V) 및 0.2M NaCl을 함유하는 pH 7.5의 50mM MOPS 완충액으로 이루어졌다. 2-KGA 생산 시스템에서, 말 심장 VI형 사이토크롬 c 및 소 심장 사이토크롬 c 옥시다제 aa3형은 박테리아 사이토크롬 c인 사이토크롬 c551 I 및 II의 재산화를 산소 환원에 의해 촉진한다. 25℃에서 15시간동안 호기성 배양시켜 반응시킨 후, 약 8mM의 2-KGA가 누적되었다. 그러나, 사이토크롬 c551 I 및 II가 없을때에는 2-KGA 누적은 0.2mM 미만이었다. 2-KGA 생성이 사이토크롬 c551 I 및 II에 의존한다는 사실은 사이토크롬 c551 I 및 II이 AADH의 2-KGA 생성 촉진 사이클에 있어서 효과적인 전자 수용체임을 보여주는 것이다.
실시예 2 사이토크롬 c551 유전자의 클로닝
(1) PCR 방법에 의한 부분적 사이토크롬 c551 유전자의 증폭
프라이머 c1, c5, c6 및 이들의 안티센스 서열(도 2에 도시된 것과 같이 어플라이드 바이오시스템즈 381A DNA 합성기(미국)을 사용하여 정제된 사이토크롬 c551 단백질의 아미노산 서열에 따라 합성됨)을 사용하여 PCR을 수행하였다. 공급자의 추천에 따라서 퍼킨-엘머 세투스 인스트루먼트 써멀 사이클러(Perkin-Elmer Cetus Instruments Thermal Cycler)와 젠엠프 DNA 앰플리케이션 리젠트 키트(GeneAmp DNA Amplication Reagent Kit)(일본 교토 소재의 다카라 스조(Takara Shuzo))를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 반응은 30 사이클의 (1) 94℃에서 1분동안의 변성 단계; (2) 48 또는 40℃에서 2분동안의 어닐링 단계; (3) 72℃에서 3분동안의 합성 단계로 이루어졌다. 반응 혼합물(50㎕)은 완충액중 200μM의 dNTPs, 6.4μM의 각 프라이머(32 디제너러시), 250ng의 글리코노박터 옥시단스 DSM No.4025의 염색체 DNA 및 2.5u의 Taq 폴리머라제를 함유하였다. PCR 생성물이32P로 표지되었을 경우에는 200μM의 dNTP 대신에 0.74MBeq의 [a-32P]dCTP 및 40μM의 dCTP를 반응 혼합물에 첨가하였다. 프라이머 c5 및 c1R로 PCR시켰더니 50bp의 DNA가 생성된 반면 다른 조합의 프라이머로 PCR시켰더니 DNA 밴드가 생기지 않거나 이보다 많이 생겼다.
(2) PCR에 의해 증폭된 50bp DNA 절편의 클로닝 및 뉴클레오티드 서열결정
PCR에 의해 증폭된 50bp DNA 절편을 pUC18의 Sma I 부위에 클로닝시키고 디데옥시 쇄 종결 방법에 의해 서열결정하였다(문헌[Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 74:5463-5467, 1977]을 참조). 이 50bp 절편의 결정된 뉴클레오티드 서열은 5'-ATCAACAACAAGTATGCTGACAAGCCGCTGCTGGACTACTTCAACTACAC-3'(서열 6)였다. 첫번째 프레임에서 이 뉴클레오티드 서열로부터 유추된 아미노산 서열(IleAsnAsnLysTyrAlaAspLysProLeuLeuAspTyrPheAsnTyrThr)은 프라이머를 제조하는데 사용된 아미노산 서열(IleAsnAsnLysTyrAla, AspTyrPheAsnTyrThr)을 포함한다.
(3) 프로브로서 50개 염기-올리고뉴클레오티드를 사용한 글루코노박터 옥시단스 DSM No.4025 염색체 DNA의 써던-블롯 분석
EcoRI를 포함하는 다양한 제한효소에 의해 분해된 글루코노박터 옥시단스 DSM No.4025 염색체 DNA로부터 제조된 써던-블롯은, 위에서 언급된 50개 염기의 서열 정보를 바탕으로 DNA 합성기에 의해 합성되고32P로 표지된 50-mer 올리고뉴클레오티드를 프로브로 하였다. 이 프로브는 2.5kb EcoRI 절편에만 하이브리드를 형성하였다. 이 결과는 사이토크롬 c551가 염색체 DNA상의 단지 하나의 유전자로부터 생성된다는 것을 보여준다.
(4) 완전한 사이토크롬 c551-유전자를 함유하는 2.5kb EcoRI 절편의 클로닝
글루코노박터 옥시단스 DSM No.4025의 염색체 DNA를 EcoRI로 완전히 분해시키고 그 결과 수득된 절편을 아가로스 겔 전기영동시켰다. 크기가 약 2.5kb(2 내지 3.5kb)인 DNA 절편을 잘라내고 겔로부터 용출시켰다. 회수된 DNA 절편을 EcoRI에 의해 분해된 pUC18 벡터로 리게이션시켜 대장균 JM109를 형질전환시켰다. 약 1,000개의 형질전환체를 수득하고 프로브로서32P-표지된 50-mer-올리고뉴클레오티드를 사용하여 콜로니 하이브리드 형성에 의해 스크리닝시켰다. 결과적으로, 강한 신호를 나타내는 콜로니를 수득하였다. 플라스미드 DNA를 콜로니로부터 추출하고 EcoRI로 분해시켰다. 2.5kb EcoRI 절편은 강한 신호를 나타내었다. 플라스미드는 pGOC201로서 표시되었다. 2.5kb EcoRI 절편을 또한 벡터 pVK100내에 클로닝시켜(브이.씨.크나우프(V.C.Knauf)등의 문헌[Plasmid 8:45-54, 1982]을 참조), 반대 방향으로 2.5kb EcoRI 절편을 갖는 플라스미드 pGOC101 및 pGOC101R를 생성하였다.
(5) 완전한 사이토크롬 c551 유전자의 뉴클레오티드 서열결정
디데옥시 쇄 종결 방법에 의해 사이토크롬 c551 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 1.7kb의 EcoRI-Smal 절편을 서열결정하였고, 한 개방된 판독 프레임에 나타내어진 서열(서열 1)에 존재하는 507bp의 ORF)이 절편에서 발견되었다. 이 ORF는 사이토크롬 c551 분해물로부터 유도된 펩티드 절편의 아미노산 서열과 일치하는 세개의 연속된 서열(서열 3 내지 서열 5)을 함유하는 168개 아미노산(서열 2)의 단백질을 코딩한다. ORF는 또한 전형적인 신호 서열을 함유하였다. 이 신호 서열은 ALA 잔기 다음에 절단되어 25개 잔기(MetLysAsnLysThrThrLeuGlyGly AlaLeuAlaLeuAlaAlaLeu LeuAlaGlyThrThrGlyAlaLeuAla) 및 성숙한 서열의 143개 잔기를 생성시킬 수 있다. 이 서열로부터 계산된 성숙한 사이토크롬 c551의 분자량은 14,836이었다. 이 값은 SDS-PAGE로 측정된 사이토크롬 c551 I 및 II의 겉보기 분자량(18,000 및 16,800)보다 약간 작은 값이다. 성숙한 단백질의 중간에서(51번 내지 55번 잔기) 헴 결합 서열(CysXaaXaaCysHis)로서 CysAlaSerCysHis이 발견되었다.
(6) PCR 방법에 의한 사이토크롬 c551 유전자의 서브클로닝
EcoRI 부위를 타겟으로 하는 프라이머를 사용하여, ORF의 117bp-5'- 및 120bp-3'-측부 서열(507bp)을 함유하는 744bp 절편을 PCR에 의해 증폭시켰다. 증폭된 절편을 벡터 pVK100내로 클로닝시켜 반대 방향으로 744kb 절편을 갖는 플라스미드 pGOC102 및 pGOC102R를 생성하였다. 744bp 절편을 pMMB22내로 클로닝시켜(엠.바그다사리안(M.Bagdasarian)등의 문헌[Gene 26:273-282, 1983]을 참조) 플라스미드 pGOC402를 생성하였다.
실시예 3 대장균, 슈도모나스 푸티다 및 글루코노박터 옥시단스 DSM No. 4025에서 사이토크롬 c551 유전자의 발현
(1) 대장균에서 사이토크롬 c551 유전자의 발현
pGOC402 또는 pMMB22를 갖는 대장균 JM109의 무세포 추출물을 웨스턴-블롯팅 분석하였다. LB중에서 대장균 세포를 50μg/㎖의 암피실린과 함께 밤새 양육시키고 1% 액적을 5㎖의 신선한 배지에 접종하였다. 4시간동안 배양시킨 후, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 최종 농도가 1mM이 되게 첨가하거나 첨가하지 않고 1시간이상동안 배양을 계속하였다. 세포를 수확하고 물에 현탁시켰다. 단백질 농도를 결정한 후, 세포 현탁액을 62.5mM Tris-HCl(pH 6.5), 10% 글리세롤, 2% SDS 및 5%의 b-머캅토에탄올을 포함하는 라에믈리(Laemmli) 완충액에 농도가 2㎎ 단백질/㎖가 되게 희석시키고 3분동안 끓였다. 30μg의 무세포 추출물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔(15%) 전기영동시켰다. 그 결과 수득된 겔상의 단백질 밴드를, 20% 메탄올을 함유하는 pH 8.6의 2.5mM Tris-19.2mM 글리신 완충액중에서 1시간동안 25V에서 작동되는 반-건조 전기블롯팅(electroblotting) 장치(미국 캘리포니아주 소재의 바이오-라드, 헤르큘레스(Bio-Rad, Hercules)의 트랜스-블롯 에스디(Trans-blot SD))를 사용하여 니트로셀룰로스 필터에 블롯팅시켰다. 사이토크롬 c551 단백질을 안티-사이토크롬 c551 안티세럼, 염소 안티-래빗 IgG-양고추냉이 퍼옥시다제 콘쥬게이트, 과산화수소 및 공급자(일본 도쿄 소재의 코니카 캄파니(KONICA Co.))에 의해 추천된 발색제로 처리하여 가시화시켰다. pGOC402를 갖는 세포는 IPTG에 의해 유도될때 및 유도되지 않을때 두개의 포지티브(positive) 밴드(각각 30㎍의 무세포 추출물당 총 약 30ng 또는 10ng의 사이토크롬 c551)를 발현시킨 반면 pMMB22를 갖는 세포는 이들을 발현시키지 않았다. 이들 밴드의 Rf값은 정제된 사이토크롬 c551 I 및 II의 것과 동일하였고, 이는 사이토크롬 c551 I 및 II이 한 유전자로부터 발현되고 번역후 또는 전사후에 변형된다는 것을 보여준다.
(2) 슈도모나스 푸티다에서 사이토크롬 c551 유전자의 발현
우선 하기와 같이 수행된 3-모체 접합 교배 방법에 의해 pGOC402 및 pMMB22를 날리딕스산 내성(NaIr) 슈도모나스 푸티다 ATCC 21812로 도입시켰다. NaIr슈도모나스 푸티다 ATCC 21812의 세포를, 2.5% 만니톨, 0.5%의 이스트 추출물(미시간주 디트로이트 소재 디프코 래보러토리즈(Difco Laboratories)) 및 0.3%의 박토트립톤(Bactotrypton)(Difco)으로 이루어진 5㎖의 MB 배지중에서 30℃에서 배양시켰다. 공여(Donor) 균주인, pGOC402(스트렙토마이신 내성: Smr) 또는 pMMB22(Smr)를 갖는 대장균 JM109 및 헬퍼(helper) 균주인, pRK2013(Kmr, 디.에이치.피구스키(D.H.Figurski)의 문헌[Proc, Natl.Acad.Sci. USA 76:1648-1652, 1979]을 참조)을 갖는 대장균 HB101을 적당한 항생제를 함유하는 LB 배지에서 37℃에서 밤새 양육시켰다. 이렇게 밤새 양육시킨 배지(2㎖씩)를 개별적으로 원심분리시키고 세포 펠릿을 개별적으로 2㎖의 MB 배지에 현탁시켰다. 100㎕씩의 세포 현탁액을 혼합하고, 5% 프럭토스, 1%의 이스트 추출물(디프코), 1%의 폴리펩톤(Polypepton)(일본 오사카 소재의 와코 퓨어 케미칼 인더스트리즈 리미티드(Wako Pure Chemical Industries Ltd.)) 및 1.8%의 아가로 이루어진 FB 아가 배지 표면에 놓인 니트로셀룰로스 필터상에 50㎕의 혼합 세포 현탁액을 떨어뜨렸다. 플레이트를 27℃에서 밤새 배양시켰다. 그 결과 수득된 세포를 50㎍/㎖ 날리딕스산 및 50㎍/㎖의 스트렙토마이신을 함유하는 MB 아가 배지(MNS 아가 플레이트)상에 펴발랐다. 이렇게 수득된 트랜스콘쥬게이션체를 MNS 아가 플레이트상에 스트리킹시켜 정제함으로써 대장균 및 플라스미드 없는 슈도모나스 푸티다의 세포를 제거하였다.
pGOC402 또는 pMMB22를 갖는 슈도모나스 푸티다 트랜스콘쥬게이션체의 무세포 추출물을 10mM IPTG를 포함하거나 포함하지 않는, 50㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 MB 배지에서 밤새 양육시키고 실시예 1 내지 3에 기술된 바와 같이 웨스턴-블롯팅 분석하였다. pGOC402를 갖는 세포는 IPTG에 의해 유도될때 및 유도되지 않을때 두개의 포지티브 밴드(각각 20㎍의 무세포 추출물당 총 약 30ng 또는 10ng의 사이토크롬 c551)를 발현시킨 반면 pMMB22를 갖는 세포는 이들을 발현시키지 않았다.
(3) GOS2R 및 GORS6-35에서 사이토크롬 c551 유전자의 발현
3-모체 접합 교배 방법에 의해, pVK100내에 양방향으로 사이토크롬 c551 유전자를 갖는 플라스미드(pGOC101 및 pGOC101R)를 글루코노박터 옥시단스 DSM No.4025의 리팜피신 내성 유도체인 GOS2R(티.호시노 등의 유럽특허공개공보 제 9611500.8 호를 참조)내로 도입시켰다. GOS2R의 세포를, 100㎍/㎖의 리팜피신을 포함하거나 포함하지 않고 3% 트립티카제 소이 브로쓰(Trypticase Soy Broth)(미국 매릴랜드주 콕키스빌 소재의 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)) 및 0.3% 이스트 추출물(미시간주 디트로이트 소재의 디프코 래보러토리즈)로 이루어진 T 매질 10㎖중에서 30℃에서 배양시켰다. 공여 균주인, pGOC101(Tcr), pGOC101R(Tcr) 또는 pVK102(Kmr)를 갖는 대장균 HB101 및 헬퍼 균주인, pRK2013(Kmr)를 갖는 대장균 HB101을 적당한 항생제를 함유하는 LB 배지에서 37℃에서 밤새 양육시켰다. 이렇게 밤새 양육시킨 배양물(10㎖의 GOS2R 배양물 및 2㎖의 대장균 배양물)를 개별적으로 원심분리시키고 세포 펠릿을 개별적으로 2㎖의 T 배지에 현탁시켰다. 100㎕씩의 세포 현탁액을 혼합하고, 실시예 1-(1)에 기술된 NS2 아가 배지 표면에 놓인 니트로셀룰로스 필터상에 50㎕씩의 혼합 세포 현탁액을 떨어뜨렸다. 이 플레이트를 27℃에서 밤새 배양시켰다. 그 결과 수득된 세포를 100㎍/㎖ 리팜피신 및 3㎍/㎖의 테트라사이클린을 함유하는 T 아가 배지(TRT 아가 플레이트)상에 펴발랐다. 이렇게 수득된 트랜스콘쥬게이션체를 TRT 아가 플레이트상에 스트리킹시켜 대장균 및 플라스미드 없는 GOS2R의 세포를 제거하였다. NS2 아가 플레이트상에서 성장하는 트랜스콘쥬게이션체의 세포를 실시예 3-(1)에 기술된 바와 같이 웨스턴-블롯팅시켰다. 도 3은 pGOC101 또는 pGOC101R을 갖는 GOS2R은 pVK102를 갖는 GOS2R보다 더 면역 양성인 단백질을 생성함을 보여준다. 증폭 비율도 약 2배인 것처럼 나타났다.
전술된 바와 같은 3-모체 접합 교배 방법에 의해, 플라스미드 pGOC101 및 pGOC102를 글루코노박터 옥시단스 DSM No.4025의 리팜피신 내성 유도체인 GORS6-35(L-소보스로부터의 고 2KGA 생산자, 티 호시노 등의 유럽특허공개공보 제 9611500.8 호를 참조)내로 도입시켰다. 플라스미드 pGOC101을 저주파수(수용자당 10-8미만의 트랜스콘쥬게이션체)에서 도입시킨 반면, 플라스미드 pGOC102를 보다 높은 주파수(수용자당 약 10-4트랜스콘쥬게이션체)로 도입시켰다. 표 1에 나타내어진 바와 같이, pGOC101, GORS6-35(pGOC101)-1을 갖는 전형적인 트랜스콘쥬게이션체중 하나는 매우 나쁜 성장률 및 낮은 플라스미드 안정성(50%)을 나타내었고, 이는 사이토크롬 c551 유전자의 존재 또는 발현은 숙주 성장을 저해하며, 그 결과 성장 동안에 플라스미드가 없는 세포가 증폭된다는 것을 보여준다. 다른 트랜스콘쥬게이션체인 GORS6-35(pGOC101)-2는 30㎍/㎖의 테트라사이클린을 함유하는 NS2 아가 배지에 수회 옮겨진후 높은 성장률과 매우 높은 플라스미드 안정성(99% 이상)을 나타낸다. 이러한 성장률의 자발적인 변화는 숙주가 사이토크롬 c551의 과발현에 의한 스트레스에 적응한 결과라고 생각된다. 반대로, pGOC102를 갖는 트랜스콘쥬게이션체는 우수한 성장률 및 높은 플라스미드 안정성(88%)을 나타내었다.
10% L-소보스를 함유하는 생산 배지에서 성장한 균주내의 사이토크롬 c551의 함량을, 환원형의 스펙트럼에서 산화형의 스펙트럼을 뺀 차로서 정량 분석하였다. 사이토크롬 c551의 정량 분석을 다음과 같이 시마쯔(Shimadzu)(일본 교토) UV-2200 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 사용하여 수행하였다. GORS6-35 유도체 균주를 실시예 1에 기술된 제빵용 이스트 세포를 함유하는 생산 배지에서 1 내지 4일동안 배양하였다. 1,000rpm에서 10분동안 2회 원심분리시켜 CaCO3및 제빵용 이스트 세포를 제거한 후, 8,000rpm에서 10분동안 원심분리시켜 세포를 수확하였다. 수확된 세포를 5mM MgCl2를 함유하는 50mM Tris-HCl(pH 7.5)로 세척하고 5㎖의 동일한 완충액에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 프렌치 프레스 세포 파쇄기(1,500㎏/㎠)에 2회 통과시키고 5,000rpm에서 10분동안 원심분리시켜 세포 잔해를 제거하였다. 그 결과 수득된 조 추출물을 45,000rpm에서 1시간동안 초원심분리시켰다. 환원형의 스펙트럼에서 산화형의 스펙트럼을 뺀 차로서 사이토크롬 c551 함량을 결정하는데 상층액을 사용하였다. 사이토크롬을 산화시키기 위해서, 샘플을 100mM 인산나트륨 완충액중 2mM 시안화제이철칼륨(pH 7.0)으로 처리하고, 사이토크롬을 환원시키기 위해서는, 샘플을 시안화제이철 대신에 0.1% 붕수소화나트륨으로 처리하였다. 상층액중 사이토크롬 c551의 농도(C)는 다음과 같은 수학식 1에 의해 주어진다:
C=E((A551-A541)환원-(A551-A541)산화)
상기 식에서 E(몰 흡광계수)는 19.1mM-1㎝-1이다. GORS6-35(pCOC101), GORS6-35(pCOC101)-2, GORS6-35(pCOC102) 또는 GORS6-35(pVK102)중 사이토크롬 c551의 발현 수준이 표 1에 도시되어 있다. GORS6-35(pCOC101)-2 및 GORS6-35(pCOC102)는 GORS6-35(pVK102)보다 사이토크롬 c551을 1.6 내지 1.3배 더 많이 발현하였다.
균주 플라스미드 안정성(%) 사이토크롬 c551 함량*(n mol/㎎ 가용성 단백질)
GORS6-35(pVK102) 91 0.807
GORS6-35(pGOC101)-1 50 0.733
GORS6-35(pGOC101)-2 99 이상 1.297
GORS6-35(pGOC102) 88 1.070
*: 함량은 사이토크롬 c551 I와 II 둘다의 함량을 포함한다.
pGOC102를 갖는 GORS6-35내의 사이토크롬 c551의 함량이 증가한다는 사실은 사이토크롬 c551 유전자의 원래 프로모터가 구조 유전자 앞부분에 117bp 이내에 존재할 수 있다는 것을 말해준다.
실시예 4 사이토크롬 c551-증폭된 GORS6-35에 의한, L-소브스로부터 2KGA의 생성
비.메가테리움(B.megaterium) DSM No.4026(유럽특허공고공보 제 0278477 호)를 SCM 아가 슬랜트(표 2)로부터 150㎖의 SCM에 접종하였다. 동일한 SCM 씨드 배지에, 30㎍/㎖의 테트라사이클린을 함유하는 NS2배지상의 아가 배지로부터의 GORS6-35(pGOC101)-2 또는 GORS6-35(pVK102) 세포, 또는 이 NS2배지상의 아가 배지로부터의 GOR6-35 또는 글루코노박터 옥시단스 DSM No.4025 세포를 접종하였다. 30℃에서 브로쓰의 pH가 6.5 내지 6.0이 될때까지 씨드 배양을 계속하였다. 통상적으로 15 내지 24 시간이 소요되었다. 씨드 브로쓰의 일부(7.5㎖)를 500㎖ 엘렌메이어 플라스크중 50㎖의 생산 배지(표 3)에 접종하였다. 이 주요 발효를 30℃에서 180rpm 회전 교반기상에서 5일동안 수행하였다. 표 4에 도시된 바와 같이, GORS6-35(pGOC101)-2를 사용하여 혼합 발효시킨 결과 그의 2KGA 생산성이 글루코노박터 옥시단스 DSM No.4025, GORS6-35 및 GORS6(pVK102)에 의한 2KGA 생산성보다 더 높았고, 11% L-소보스로부터는 2KGA 생산이 더 빨랐고 14% L-소보스로부터는 생산성 및 수율이 더 빠르고 높았다. 이 재조합 균주는 3일에 걸쳐 11% L-소보스로부터 2KGA를 105.1g/ℓ, 및 4일 및 5일에 걸쳐 14% L-소보스로부터는 각각 130.8g/ℓ 및 133.8g/ℓ를 생성하였고, 반면에 대조 벡터인 GORS6-35(pVK100)은 3일에 걸쳐 11% L-소보스로부터 2KGA를 96.3g/ℓ, 및 4일 및 5일에 걸쳐 14% L-소보스로부터는 각각 99.9g/ℓ 및 112.6g/ℓ를 생성하였다.
씨드 배지(SCM)
성분 농도(%)
이스트 추출물 0.3
육수 0.3
옥수수 우려낸 물 0.3
펩톤 1.0
요소 0.1
KH2PO4 0.1
MgSO4·7H2O 0.02
CaCO3 * 0.1
L-소보스 2.0
pH 7.1
* : pH를 조절한 후 CaCO3를 첨가하였다
500㎖의 엘렌메이어 플라스크중 150㎖의 배지를 사용하였다. SCM 아가 슬랜트에 대해서는 2% 아가를 SCM 배지에 첨가하였다.
생산 배지
성분 농도(%) 농도(%)
L-소보스* 11 14
우레아* 2.4 3.1
CSL 1.6 2.0
MgSO4·7H2O 0.016 0.02
KH2PO4 0.16 0.2
CaCO3 ** 0.8 1.0
pH 6.7
*: L-소보즈 및 요소를 개별적으로 오토클레이빙시켰다. **: pH를 조절한 후 CaCO3를 첨가하였다.
500㎖의 엘렌메이어 플라스크중 100㎖의 배지를 사용하였다.
균주 소보즈 농도(w/v%) 2KGA의 생산량(g/ℓ)
3일 4일 5일
GORS6-35(pGOC101)-2 11 105.1 106.2
14 103.1 130.8 133.3
GORS6-35(pVK102) 11 96.3 106.9
14 84.1 99.9 112.6
GORS6-35 11 95.5 104.7
14 90.6 104.7 104.8
DSM No.4025 11 102.2 106.4
14 81.8 95.6 107.7
실시예 5-글루코노박터 옥시단스 DSM No.4025의 AADH 유전자와 사이토크롬 c551 유전자를 갖는 슈도모나스 푸티다 트랜스콘쥬게이션체에 의한 2KGA의 생산
pSSA102R(글루코노박터 옥시단스 DSM 4025로부터 클로닝된 효소 A 유전자를 포함하는 2.7kb DNA 절편을 갖는 벡터 pVK100; L-소보스를 2KGA로 전환시키는 AADH를 위한 유전자 코드; 티.호시노등의 유럽특허공개공보 제 9611500.8 호를 참조) 및 pGOC402를 갖는 Nalr슈도모나스 푸티다 ATCC 21812, pKV102 및 pGOC402를 갖는 슈도모나스 푸티다, pSSA102R 및 pMMB22를 갖는 슈도모나스 푸티다, 및 pVK102 및 pMMB22를 갖는 슈도모나스 푸티다의 네가지 트랜스콘쥬게이트체를 실시예 3-(2)에 기술된 3-모체 접합 교배 방법에 의해 구축하였다. 10㎍/㎖의 테트라사이클린 및 50㎍/㎖의 스트렙토마이신을 함유하는 MB 아가 배지상에 유지된 이들 네가지의 트랜스콘쥬게이션체의 세포를, 10㎍/㎖의 테트라사이클린, 50㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 10mM IPTG로 보충되고 MB 배지 10㎖에 접종하고, 30℃에서 18시간동안 배양시켰다. 그 결과의 세포를 원심분리시키고 0.9%의 NaCl로 세척하였다. 그 결과 수득된, 20 OD600단위의 세포, 4% L-소보스, 0.3%의 NaCl, 1%의 CaCO3, 1㎍/㎖의 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ)으로 이루어진 휴면 세포 반응 혼합물을 교반시키면서 30℃에서 48시간동안 배양시켰다. pSSA102R 및 pGOC402를 갖는 슈도모나스 푸티다에 의해 생산된 2KGA의 양은 36.4g/ℓ인 반면에, 다른 세가지의 균주들에 의한 2KGA의 생산량은 0.5g/ℓ 미만이었다. 사이토크롬 c551의 발현에 의해 글리코노박터 옥시단스 DSM No.4025의 AADH와 슈도모나스 푸티다의 전자 전달쇄가 생리학적으로 결합되었다.
실시예 6 AADH-사이토크롬 c551 콘쥬게이트
AADH-사이토크롬 c551 콘쥬게이트를 코딩하는 유전자를 갖는 플라스미드를 도 4에 도시된 바와 같이 구축하였다. 여기서, 효소 A/B3 및 효소 B 유전자(티.호시노 등의 유럽특허공개공보 제 9611500.8 호)를 AADH 유전자로서 사용하였다. AADH와 사이토크롬 c551 사이의 링커를 아세토박터 아세티의 ADH를 모방하여 구축하였다(티.이노우에(T.Inoue) 등의 문헌[J.Bacteriol, 171:3115-3122, 1989]을 참조). 플라스미드를 Nalr슈도모나스 푸티다 ATCC 21812에 도입시키고, 그 결과 수득된 트랜스콘쥬게이션체를 AADH 또는 사이토크롬 c551에 대해 제조된 항체로 웨스턴-블롯팅시켰다. 이 분석 결과 구축된 콘쥬게이트는 한 분자내에 AADH와 사이토크롬 폴리펩티드 둘다를 함유함이 밝혀졌다. 효소 A/B3-사이토크롬 c551 콘쥬게이트 유전자 및 효소 B-사이토크롬 c551 콘쥬게이트 유전자를 갖는 트랜스콘쥬게이션체를 실시예 5에 기술된 바와 같은 휴면 세포 반응에 사용하였다. 그 결과, 전자의 트랜스콘쥬게이션체는 40시간 동안 40g/ℓ의 L-소보스로부터 7.8g/ℓ의 2KGA를 생성한 반면 후자의 트랜스콘쥬게이션체는 40시간 동안 40g/ℓ의 D-소비톨로부터 9.0g/ℓ의 L-소보스를 생성하였다.
본 발명에 의해 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현될때 사이토크롬 c551의 적어도 일부의 일차 구조 및 생물학적 성질중 하나를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열, 이 DNA 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드, DNA 서열을 포함하는 발현 벡터, 이 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포, 이 숙주세포를 사용한 사이토크롬 c의 생산 공정 및 사이토크롬 c를 비타민 C 생산에 사용하기 위한 용도가 제공된다.
서열 목록
(1) 일반정보:
(i) 출원인
성명: 에프 호프만-라 롯슈 아크티엔게젤샤프트
가: 그렌짜헤르스트라세 124
시: 바즐
국가: 스위스
우편번호: 체하-4070
전화번호: 061-688 25 05
팩스: 061-688 13 95
텔렉스: 962292/965542 hlr c
(ii) 발명의 명칭: 신규한 사이토크롬 c
(iii) 서열의 갯수: 6
(iv) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 타입: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: 매킨토시
(C) 운영체계: 매킨토시
(D) 소프트웨어: 마이크로소프트 워드 5.1a
(2) 서열인식번호 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 744 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄형: 이본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: 서열인식번호 1:
(3) 서열인식번호 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 168 잔기
(B) 유형: 아미노산
(C) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: 서열인식번호 2:
(4) 서열인식번호 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 52 잔기
(B) 유형: 아미노산
(C) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: 서열인식번호 3:
서열 3
(5) 서열인식번호 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 44 잔기
(B) 유형: 아미노산
(C) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: 서열인식번호 4:
서열 4
(6) 서열인식번호 5에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 13 잔기
(B) 유형: 아미노산
(C) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: 서열인식번호 5:
서열 5
(7) 서열인식번호 6에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 50 잔기
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄형: 이본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: 서열인식번호 6:

Claims (8)

  1. (a) 서열 1에 의해 정의된 DNA 서열 또는 그의 상보적 스트랜드;
    (b) (a)에서 정의된 DNA 서열 또는 그의 상보적 스트랜드에 하이브리드를 형성하는 DNA 서열;
    (c) 유전 코드의 디제너러시(degeneracy) 때문에 (a) 또는 (b)에서 정의된 DNA 서열에 하이브리드를 형성하고 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열
    중에서 선택된, 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현될때 사이토크롬 c551의 적어도 일부의 일차 구조 및 생물학적 성질중 하나를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열.
  2. 사이토크롬 c 활성을 갖고 제 1 항에서 청구된 DNA 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드.
  3. 각각 하기 물리화학적 성질을 나타내는 사이토크롬 c551 I 및 II로 이루어진 그룹으로부터 선택된 글루코노박터속에 속하는 미생물로부터 수득되거나 수득가능한, 사이토크롬 c 활성을 갖는 폴리펩티드:
    (a) 사이토크롬 c551 I:
    (a) 분자량: 겔 여과에 의해 측정시 약 19±1 kDa, SDS-PAGE 분석법에 의해 측정시 약 18.0±1.0kDa,
    (b) 흡광 스펙트럼: 환원형은 551nm, 522nm 및 417nm에서 각각 α, β, 및 γ 피크로서 최대 흡광도를 나타냄,
    (c) 헴(heme) 함량: 단백질 1mol당 약 1mol의 헴
    (d) 등전점: 약 3.95;
    (b) 사이토크롬 c551 II:
    (a) 분자량: 겔 여과에 의해 측정시 약 19±1 kDa, SDS-PAGE 분석법에 의해 측정시 약 16.8±1.0kDa,
    (b) 흡광 스펙트럼: 환원형은 551nm, 522nm 및 417nm에서 각각 α, β, 및 γ 피크로서 최대 흡광도를 나타냄,
    (c) 헴 함량: 단백질 1mol당 약 1mol의 헴
    (d) 등전점: 약 3.75.
  4. 제 1 항에서 청구된 DNA 서열을 포함하는, 원핵 또는 진핵 숙주세포에서 발현시키기에 적합한 벡터.
  5. 제 4 항에서 청구된 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포.
  6. 적당한 배지에서 제 3 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에서 정의된 숙주세포를 배양시키고 이 배지로부터 사이토크롬 c551을 회수함을 포함하는, 사이토크롬 c551의 제조방법.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에서 청구된 사이토크롬 c551의, 비타민 C의 생산에서의 용도.
  8. 본원에서 기술된 발명.
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