CN1169159A - 用黄素蛋白给化石燃料脱硫的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一个新发现，即通过在生物催化剂中添加黄素蛋白可提高化石燃料脱硫反应速率。本发明涉及提高含有机硫化合物的化石燃料脱硫速率的方法，包括以下步骤：a)将化石燃料与含有能够裂解碳-硫键的生物催化剂和能够提高反应速率量的黄素蛋白的水相接触，进而形成化石燃料和水相的混合物；b)将步骤a)的混合物保持在用生物催化剂足以裂解有机硫分子中碳-硫键的条件下，进而得到有机硫含量减少的化石燃料；及c)将有机硫含量减少了的化石燃料从所得水相中分离出来。本发明还涉及含有一或多个重组DNA分子的重组微生物，该DNA分子给能够将含有机硫分子的化石燃料脱硫的生物催化剂编码，并给黄素蛋白编码。本发明还涉及含有下列物质的组合物：(a)能够将含有机硫分子的化石燃料脱硫的生物催化剂，和(b)黄素蛋白。

Description

用黄素蛋白给化石燃料脱硫的方法
本发明的背景技术
化石燃料的微生物脱硫方法成为活跃的研究领域已经超过50年。这些研究的目的已经被发展成基于从化石燃料如煤，原油和石油产物中在燃烧前除硫方法的生物技术。促进脱硫方法发展的动力是化石燃料中含硫量的增加和硫排出物控制力度的增加。Monticello等人，“‘石油生物脱硫方法的实际研究’，IGT第三届‘天然气，石油，煤和环境生物技术’方面的国际研讨会”(Monticello et al.，“Practical Consideration in Biodesulfurization ofPetroleum”，IGT’s 3d Intl.Symp.on Gas，Oil，Coal and Env.Biotech.，(Dec.3-5，1990))，New Orleans，LA。
许多生物催化剂和方法已被开发用于化石燃料的脱硫，包括下列文献所述的那些：美国专利5,356,801、5,358,870、5,358,813、5,198,341、5,132,219、5,344,778、5,104,801、和5,002,888，这些文献均在此引作参考。经济分析表明，对此项技术商业化的一个限制是改进反应率和生物催化剂如脱硫反应所涉及的细菌和酶的特定活性。文献中已经报道的反应率和特定活性(除去的硫/小时/生物催化剂(克))比最优的商业技术所需的要低得多。因此，需要改进生物催化剂的寿命和特定活性。
本发明概述
本发明涉及一个新发现，即通过在生物催化剂中添加黄素蛋白可提高化石燃料脱硫反应速率。本发明涉及提高含有机硫化合物化石燃料脱硫速率的方法，包括以下步骤：
a)将化石燃料与含有能够裂解碳-硫键的生物催化剂和能够提高反应速率量的黄素蛋白的水相接触，进而形成化石燃料和水相的混合物；
b)将步骤a)的混合物保持在用生物催化剂足以裂解有机硫分子中碳-硫键的条件下，进而得到有机硫含量减少的化石燃料；以及
c)将有机硫含量减少了的化石燃料从所得水相中分离出来。
本发明还涉及含有一或多个重组DNA分子的重组微生物，该DNA分子编码能够将含有机硫分子的化石燃料脱硫的生物催化剂，及编码黄素蛋白。
本发明还涉及含有下列物质的组合物：(a)能够将含有机硫分子的化石燃料脱硫的生物催化剂，和(b)黄素蛋白。
附图的简要说明
图1是添加黄素蛋白后通过红球菌属ATCC 53968，IGTS8的提取物实现DBT到2-HBP的转化的图示说明。
图2是质粒pEX16和pEX44的图示说明，其中脱硫基因簇单独存在或与黄素蛋白基因frp一起存在，或直接连接到dsz基因上，成为dsz基因簇之一部分。
图3说明当使用质粒共表达黄素蛋白时DBT的脱硫率增加。
图4是ATCC 53968内生黄素蛋白的洗脱曲线。
图5和图6说明当含有内生黄素蛋白IGTS8的组分被加到从聚集dsz基因的大肠埃希氏杆菌分离的DSZ酶制剂中时DBT和DBT-磺内酯的脱硫率的增加。
本发明的详细描述
在石油的提取和精炼技术中术语“有机硫”通常被理解为指由一或多个硫原子(称为杂原子)共价连接到烃骨架结构的有机分子。这些硫原子可以直接连接到烃骨架上，例如通过一或多个碳-硫键，或以取代基形式连接到分子的烃骨架上，例如磺酰基(它含有碳-氧-硫共价键)。含有一或多个硫杂原子的有机分子的大类有时被称作“有机硫化合物”。这些化合物的烃部分可以是脂肪族，芳香族或部分脂肪族和部分芳香族的化合物。
通过芳香族碳-硫键将烃骨架中一或多个硫杂原子连接到邻近的碳原子的环状或稠合多环有机硫化合物被称为“含硫杂环类”。对于其中含有硫杂原子的5-员芳香环，以多种含硫杂环形式存在的硫被称作“噻吩硫”。最简单的含硫杂环是噻吩，其分子式为C4H4S。
已知，含硫杂环对常规脱硫处理如加氢脱硫法(HDS)是稳定的。含硫杂环既可以有相对简单也可以有相对复杂的化学结构。在复杂杂环中可以存在多稠合芳香环，其中一个或多个可以是杂环。脱硫的难度随分子结构的复杂性而增加，即耐火性是对复杂含硫杂环如二苯并噻吩(DBT，C12H8S)最着重强调的性质。
DBT是一种有稠合多芳香环结构的含硫杂环，在该芳香环结构中有两个6-员苄基环位于5-员噻吩环的侧面。在精炼中间体和可燃烧产物中，HDS过后残留在化石燃料中的大部分有机硫是噻吩硫。这些残余的噻吩硫主要在DBT及其含有一或多个烷基或芳基的衍生物中存在，所说烷基或芳基连到一个或两个侧苄基环中的一或多个碳原子上。DBT本身在相关技术中作为这类包括DBT的模型化合物说明是被接受的，其衍生物在涉及噻吩硫的反应方面有时是可接受的。见Monticello和Finnerty，微生物学年报(Annual Reviews inMicrobiology)39：371-389(1985)，第372-373页。可以认为DBT及其衍生物在特定原油，煤和沥青的全部硫含量中占有相当大比例。例如，已有报道，这些含硫杂环在德克萨斯西部(West Texas)原油的全部硫含量中占至少70wt％，在某些中东(Middle East)原油的全部硫含量中可达40wt％。因此，DBT被认为是特定地域的化石燃料如原油，煤或沥青，以及各种精炼的中间体和由它们所制造出的燃料产物中发现的作为噻吩硫形式模型化合物的具体代表。同前(Id.)，DBT及其衍生物的另一个特性是化石燃料释放到环境中去之后，这些含硫杂环仍然保持很长时间而没有明显的生物降解。Gundlach等人，科学(Science)221：122-129(1983)。因此，最普遍的自然产生的微生物并不能有效地代谢和破坏含硫杂环。
适于本发明脱硫处理的化石燃料是含有有机硫的化石燃料。这样的化石燃料被称为“底物化石燃料”。富含噻吩硫的底物化石燃料尤其适用于本发明脱硫方法。这些底物化石燃料的实例包括CerroNegro或Orinoco重原油；Athabascan焦油和其它类型的沥青；石油精炼组份如轻环油，重大气汽油和1号柴油；以及由如Pocahontas#3，Lewis-Stock，Australian Glencoe或Wyodak煤源制造的煤衍生液体。
生物催化脱硫(生物催化法或BDS)是从有机硫化合物耐火有机硫化合物如含硫杂环中切除(放出或除去)硫的方法，是用生物催化剂有选择地将所说化合物中碳-硫键氧化裂解的结果。BDS方法从耐火有机硫化合物产生出脱硫的可燃烧烃骨架，以及同时可以用已知技术如馏分蒸馏法或水提取法彼此分离的无机硫物质。例如，如果采用BDS方法，DBT被转化成羟基联苯基。BDS采用一种或多种非人类生物体(如微生物)，该生物体能表达出可以直接、单独、或彼此相互协同地有选择地裂解有机硫化合物中的碳-硫键，从含有含硫杂环的所说化合物中除去硫一种或多种；还可以使用从这种微生物得到的一种或多种酶；或这种微生物和酶的混合物来完成该BDS。表现有生物催化活性的生物体在此称为Dsz+。缺乏生物催化活性的生物体在此称为Dsz-。
本发明涉及改进的从含有机硫化合物的化石燃料中除硫的方法，包括在能够使化石燃料脱硫的生物催化剂中添加提高速率量的黄素蛋白，以促进或提高向催化部位的电子转移。
这里所用能够将化石燃料脱硫的生物催化剂一般是本领域已知的，包括微生物(生存的和非生存的，重组的和非重组的)和酶制剂。
一些研究者已经对将自然产生的细菌经基因修饰成为能够分解代谢DBT的突变株进行了报导。Kilbane，J.J.，Resour.Cons.Recycl.3：69-79(1990)，Isbister，J.D.和R.C.Doyle，美国专利4,562,156(1985)，和Hartdegan，F.J.等人，Chem.Eng.Progress 63-67(1984)。对于这些突变株的绝大部分它们并非特异性地进行DBT脱硫，而是以小有机硫破碎产物的形式释放硫。因此，经过这种微生物作用DBT的燃烧价值有部分损失。Isbister和Doyle报告称表现出能够有选择地从DBT放出硫的Pseudomonas突变株发生演变，但并没有阐述其产生这种反应活性的机理。
Kilbane报告了混合细菌培养物的诱变，产生通过氧化途径能够从DBT有选择地放出硫的一种突变株。这种培养物包括：从天然物源如污水处理后的污泥、石油精炼后的废水、花园土壤、煤焦油污染的土壤等得到的细菌、并维持在从存在的DBT中持续失去硫的培养条件下。然后将该培养物暴露于化学诱变剂l-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍。这种突变株培养物对DBT代谢的主要降解产物是羟基联苯基；释放出的硫为无机水溶性硫酸盐形式，以及保持基本完整的烃部分是一羟基联苯基。Kilbane，J.J.，Resour.Cons.Recvcl.3：69-79(1990)，其中的论述在此一并引作参考。
Kilbane还从这种混合细菌培养物中分离出了红球菌突变株。这种突变株IGTS8或ATCC No.53968是本发明特别优选的生物催化剂。该突变株的分离和特性在J.J.Kilbane的美国专利5,104,801中有所描述，其教导在此引作参考。根据布达佩斯条约，这种微生物保存在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)，12301 Park Lawn Drive，Rockville，Maryland，U.S.A.20852)，并被命名为ATCC Deposit No.53968。一种适宜的ATCCNo.53968生物催化制剂是活的微生物培养物及其突变株或衍生物，其制备一般按美国专利5,104,801所述方法进行。一般按美国专利5,132,219和5,358,870所述从ATCC No.53968或其突变株得到的无细胞酶制剂也可以使用。在生物催化脱硫(BDS)的常规方法中，ATCC No.53968生物催化剂是用于连续的脱硫过程以处理石油液体，在该液体中HDS-耐火有机硫分子如芳香族含硫杂环占整个有机硫含量的绝大部分。
至少有两种可能的途径使DBT释放硫：氧化和还原。优选使用氧化(有氧)方法。在氧化方法中，被作用的微生物并且其制剂适合作为本发明生物催化剂的实例包括在Kilbane(1990)，3 RESOUR.CONSERV.RECYCL.69-79中公开的微生物联合体(几种微生物的混合物)，由Kilbane在美国专利5,002,888(授权于1991年3月26日)，5,104,801(授权于1992年4月14日)，5,344,778，5,132,219，5,198,341，5,356,813，5,356,801，5,358,870[在Kilbane(1990)的Biodesulfurization：Future Prospects in CoalCleaning(PROC，7TH ANN.INT’L.PITTSBURGH COAL CONF.373-382)一文中有所描述]和5,198,341(授权于1 993年3月30日)中，以及Omori等人(1992)在Desulfurization of dibenzothiophene byCorynebacterium sp.strain SY1，58 APPL.ENV.MICROBIOL.(No.3)911-915中和Izumi等人在Applied and Environmental Microbiology60：223-226(1994)中公开的微生物，上述文献均在此引作参考。
上述各微生物在本发明中均可用作生物催化剂，因为它们均产生一种或多种酶(蛋白生物催化剂)进行指定的化学反应，使硫从耐火有机硫化合物中分离出来。Lehninger，PRINCIPLES OFBIOCHEMISTRY(Worth Publishers，Inc.，1982)，p.8-9；同时参考Zobell的美国专利2,641,564(授权于1953年6月9日)和Kern等人的美国专利5,094,668(授权于1992年3月10日)。上面美国专利所例举的任何上述微生物的突变体或遗传工程衍生物在此也可用作生物催化剂，条件是它们仍保留适当的生物催化功能。
其它适于用作此处所述脱硫方法的生物催化剂或生物催化剂源的微生物可以用已知技术从天然产物微生物衍生。如上所述，这些方法包括从天然源如污泥，石油精炼产生的废水，花园土壤，或煤焦油污染的土壤中得到的微生物，在选择的培养条件下培养制备，在此条件下微生物在耐火有机硫化合物如作为单一硫源的含硫杂环存在下生长；将微生物制剂暴露于化学或物理诱变剂；或将这些方法结合。这些技术在下列文献中有详细描述：Isbister和Doyle的美国专利4,562,156(授权于1985年12月31日)；Kilbane的3RESOUR.CONSERV.RECYCL.69-79(1990)，美国专利5,002,888，5,104,801和5,198,341；及Omori和合作者们的58 Appl.ENV.MICROBIOL.(No.3)911-915(1992)，所有文献在此引作参考。
如上所述，酶是由活细胞制备的蛋白生物催化剂。酶促进，引导或加速特定化学反应或一系列反应(称作反应途径)的发生，而其自身并不作为产物而被损耗。酶可以包括其一种或多种非改性或者翻译后的或合成改性的多肽链或片段或部分，其它辅酶，辅因子，或共同催化所需的反应或一系列反应的共反应物。本发明这些反应或一系列反应终止于从耐火有机硫化合物如含硫杂环的烃骨架中分离出硫。前述耐火有机硫化合物的烃骨架保持基本完整。在本发明中用作生物催化剂的微生物或酶的好处是不将前述耐火有机硫化合物的烃骨架作为生长碳源来消耗。结果，在BDS处理中的底物化石燃料的燃烧值没有降低。
尽管可以用活的微生物(如培养物)作为生物催化剂，但在本发明中不是必须的。用于本发明的生物催化酶制剂包括能够起到所需催化作用的微生物溶解产物、提取物、组分、亚组分、或用常规方法得到的纯化产物。一般而言，这些酶制剂基本无完整微生物细胞。例如，Kilbane和Monticello在美国专利5,132,219(授权于1992年7月21日)和5,358,870(申请日为1992年6月11日)公开的酶制剂就适用于本发明。Rambosek等人公开的重组微生物和酶制剂，通过基因工程由红球菌属ATCC No.53968得到并公开于美国专利5,356,813的微生物，也适用于本发明。适用于本发明的酶生物催化剂可以任意与固体载体如膜，滤膜，聚合树脂，玻璃颗粒或珠，或者陶瓷颗粒或珠结合使用。使用固定化酶制剂利于从处理过的已经耗尽耐火有机硫化合物的化石燃料中分离生物催化剂。
在生物催化脱硫阶段含有含硫杂环的液体化石燃料与生物催化剂和黄素蛋白结合。调节生物催化剂和黄素蛋白与液体化石燃料的相对用量以适宜具体条件，或使处理后的深度脱硫的化石燃料中残余的硫达到指定水平。要与给定量的液体化石燃料结合的生物催化剂的用量将受到所用具体生物催化剂的性质，浓度和特定活性的影响，并且受到底物化石燃料中无机和有机硫化合物性质和相对含量以及所要达到或可以接受的脱硫程度的影响。
所给生物催化剂的具体活性是用每单位质量生物催化活性衡量的。因此，特定生物催化剂的特定活性取决于所用微生物或用作生物催化酶源的性质或本性，以及用来制备和/或存储生物催化剂的方法。具体生物催化剂的浓度可调至具体使用环境所要求的浓度。例如，如果用活的微生物培养物(如ATCC No.53968)作生物催化剂，缺少硫源而不是缺少含硫杂环的适当的培养基可以用适当的微生物接种和发酵直至达到所需的培养物密度。所得培养物可以用另外的培养基或其它适当的缓冲剂稀释，或者，培养物中的微生物细胞例如可通过离心被取出，并以比原来的培养物更大的浓度重悬浮。可用相似的方法调节微生物和酶生物催化剂的浓度。用该方法可以得到合适体积的有预定特定活性和/或浓度的生物催化剂。
可用于本发明的黄素蛋白包括一般现有技术中已知的。黄素类包括黄素一核苷酸(FMN)或黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。黄素蛋白类包括黄素还原酶或FMN还原酶。对于黄素蛋白如黄素还原酶或更优选的FMN还原酶，可以直接使用天然物质(如含有黄素蛋白的微生物部分)，或其商业化产品，或两者结合使用。例如，Lei等人在J.Bacter.176(12)：3552-3558(1994)中所述的Vibrio黄素还原酶的DNA序列可用于转化适当的宿主微生物，因为这是现有技术中已知的，并且，例如在美国专利5,356,801中讨论过。或者，黄素蛋白可以是生物催化脱硫反应内生的，如以下所述的无细胞组分。
在另一个实例中，黄素蛋白可用脱硫微生物(如IGTS8)过度表达(overexpress)。例如，这可以通过诱变完成。适合的诱变剂包括辐射如紫外线辐射，和化学诱变剂如N-甲基-N’-亚硝基胍，羟胺，甲磺酸乙酯和亚硝酸。诱变反应可以根据现有技术中通常已知的方法进行。
如果黄素蛋白是重组体，则该蛋白可以现场制备，例如，通过添加含有将黄素蛋白编码的DNA序列的重组微生物完成。在特别优选的实例中，编码黄素蛋白的重组微生物也具有能够将化石燃料脱硫的酶。例如，编码黄素蛋白DNA可被转变成IGTS8或另一种能够将化石燃料脱硫的微生物。在另一个实例中，编码黄素蛋白DNA被同时或分开转化到具有编码脱硫生物催化剂的DNA的常规宿主细胞。例如，编码黄素蛋白的DNA可以在相同或不同启动子的控制之下进行对能够将化石燃料脱硫的生物催化剂的编码。在一个实例中，这种黄素蛋白DNA被掺入或连接到脱硫基因群或IGTS8的操纵子上。
将提高效率量的黄素蛋白加到反应混合物中。本发明将“提高效率量”定义为相对于最初所得可显著增加生物催化剂脱硫效率的量。例如，如果生物催化剂是IGTS8、无细胞组分或纯化的酶制剂，“提高效率量”的黄素蛋白是除了生物催化剂本身固有量之外还显著增加了脱硫效率的黄素蛋白的量。例如，与只使用生物催化剂本身相比脱硫效率可能至少增加25％，50％或100％。
综上所述，一方面本发明描述涉及含有编码黄素蛋白基因或基因簇的DNA分子或其片段，该基因能够编码黄素蛋白和/或能够将含有有机硫化合物的化石燃料脱硫的生物催化剂。该DNA分子或其片段可以是从例如天然源中被纯化和分离得到的DNA，或者也可以是重组(杂交的或外来)的例如存在于非人体宿主生物体中的DNA。下面的讨论，不以任何方式构成对本发明的限制，而只是为了解释目的，详细描述了从红球菌属ATCC No.53968菌株分离编码脱硫生物催化剂的DNA的方法，已知该菌株表达适当生物催化活性。这种优选的红球菌菌株由美国专利5,104,801(授权于1992年)公开，并已在该文献中被称作IGTS8，有关论述在此引作参考。其它已知用于表达适当生物催化活性并因此被认为是本发明适合的DNA源的生物体包括美国专利5,002,888所述并在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)中称作ATCC No.53969的Bacillus sphaericus菌株，和Omori等人在Appl.Env.Microbiol.58(3)：911-915(1992)中所说的Corynebacterium菌株。
不能裂解碳-硫键(Dsz-)的突变株红球菌是通过在本领域普通技术人员已知的或已经确定的适当条件下将表现有生物催化活性的红球菌菌株如ATCC No.53968暴露于诱变剂来制备的。合适的诱变剂包括辐射如紫外线辐射，及化学诱变剂如N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(NTG)，羟胺，甲磺酸乙酯(EMS)和亚硝酸。如此形成的突变株允许在适当培养基中生长，并筛选出有碳-硫键裂解活性的。允许准确检测碳-硫键裂解活性的筛选方法适合于本发明方法。为此，合适的筛选方法包括将不同的突变株暴露于含碳-硫键的分子(如DBT)，并测量碳-硫键裂解情况。在优选实例中将突变株暴露于DBT，因而产生破碎产物羟基联苯(HBP)，它在短波长紫外光下产生荧光。也可以通过HBP与吉布斯试剂作用的蓝色反应产物用比色法检测HBP。其它方法包括气体和液体色谱，红外线和核磁共振谱法。参见Kodama等人的Applied and EnvironmentalMicrobiology，pp.911-915(1992)和Kilbane和Bielaga，Final Report D.O.E.Contract No.DE-AC22-88PC8891(1991)。一旦Dsz-突变株被识别和分离出来，就可以用标准技术繁殖它们的克隆并对其进一步分析。
在与上述培养物Dsz+生物体红球菌的诱变同时，第二种同样的Dsz+生物体培养物保留在培养物中。Dsz+生物体DNA是从红球菌的培养物中提取出来的。各种DNA提取方法都适用于从这种生物体中分离DNA。适合的方法包括苯酚和氯仿萃取。参见Maniatis等人的Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d，Cold SpringHarbor Laboratory Press，pg 16.54(1989)，这里称作Maniatis等人的论述。
一旦DNA从红球菌中提取出来，就将该DNA切割成不同千碱基长度的片段，经过克隆到适当质粒穿梭载体后收集制成DNA库。可以使用将红球菌DNA分割成纯DNA包括本发明的DNA的各种方法，例如酶化和机械方法。所有四-碱识别限制核酸内切酶如TaQI或Sau 3A适用于分割DNA。分割DNA的适当方法可以在Maniatis等人的论述中找到。
将多个DNA片段插到几个红球菌Dsz-突变株克隆中为的是分离出能给本发明生物催化剂编码的DNA片段。从前述Dsz-突变株细胞到Dsz+转化细胞的转化证明插入的DNA片段给生物催化剂编码了。任何为了摄取和表达所说片段而将DNA插入红球菌的方法都是适合的。在优选实例中是用电穿孔法将DNA片段引入红球菌的。参见Maniatis等人的论述。
一旦转化之后，即产生Dsz+突变株并被识别，编码Dsz+生物催化剂的DNA片段就可以被识别和分离。这样，就可以用本领域普通技术人员已知的和便于使用的各种方法以被分离的DNA制备被编码的生物催化剂。此外，分离的DNA可用已知技术排序和复制和/或，例如，用Maniatis等人所述技术连接到编码黄素蛋白的DNA上。
如上所述，上述分离本发明DNA的方法可用于而非红球菌微生物Dsz+生物体，例如ATCC No.53068。因此，Bacillus sphaericuATCC No.53969或Corynebacterium sp.SY1也可以用作本发明DNA的生物体源。而且一旦分离后，本发明DNA就可以被转化到非人体宿主生物体的非Dsz-突变株的生物体中。因此，本发明DNA可以被转化到，例如，合适的大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)中。其它类型的非人体宿主生物体也可以使用，包括单细胞生物体(如酵母)和来自多细胞生物体的培养物上生长的细胞。
其它分离本发明DNA的方法包括在上述基本原理基础上的变化方法。例如，从IGTS8基因簇得到的序列片段就可用作杂交探针以识别类似的DNA分子。
本发明所述技术也可以被用来分离和克隆给黄素蛋白如IGTS8内生黄素蛋白编码的DNA。
本发明中所述的重组DNA分子或其片段将包括所有用化学或生物方法插入一个或多个给能够有选择地裂解碳-硫键和黄素蛋白的生物催化剂编码的基因链中的DNA，所说基因原本并不存在于该链中。重组DNA包括所有用限制核酸酶，核酸杂交，DNA克隆，DNA合成或任何前述方法的结合方法而合成的DNA。构建方法可以在Maniatis等人的论述中查到，也可以是本领域普通技术人员已知的其它方法。
构建本发明DNA质粒或载体的方法包括Maniatis等人所述的和本领域普通技术人员已知的其它方法。术语“DNA质粒”和“载体”是要包括所有能够将外来或外源DNA用化学或生物方法插入其中，并在转化成适当的非人体宿主生物体后，表达插入的外来或外源DNA的产物(即，表达本发明生物催化剂和黄素蛋白)的复制感受态质粒或载体。此外，所说质粒或载体必须易于接受含有本发明基因或多种基因的DNA分子或其片段的插入，所说基因或多种基因给选择性地裂解有机硫化合物中的碳-硫键的生物催化剂编码。构建DNA质粒载体的方法包括Maniatis等人所述的和本领域普通技术人员已知的其它方法。
本发明质粒包括所有含有给黄素蛋白和/或选择性地裂解有机硫化合物中的碳-硫键的生物催化剂编码的基因或多种基因的任何DNA片段。术语“质粒”包括所有DNA片段。该DNA片段应该是可传送的，例如，通过转化或接合传送到宿主微生物。构建或提取DNA质粒的方法包括Maniatis等人所述的和本领域普通技术人员已知的其它方法。
本发明的转化的非人体宿主生物体可通过本领域普通技术人员已知的各种方法进行。例如，可用Maniatis等人所述的电穿孔法。由术语“非人体宿主生物体”表示能够摄取和表达外来、外源、或重组DNA的所有非人体宿主生物体。优选的宿主生物体是细菌，尤其优选假单胞菌(pseudonomad)。
本发明化石燃料脱硫方法包括两方面。第一，由此得到的宿主生物体或生物催化剂与要脱硫的化石燃料接触。这项工作可以在任何适当容器中进行，可任意安装搅拌或混合装置。将混合物充分混合，并允许培养充分长时间以使有机硫化合物中足够数量的碳-硫键裂解，进而产生脱硫的化石燃料。在一个实例中水乳液或微乳液由生物体或酶部分的水性培养物产生，而且，在表达的生物催化剂裂解碳-硫键时化石燃料允许生物体扩散到乳液中。
各种变量如温度、混合速度、和脱硫效率将根据所用生物体生物催化剂和/或黄素蛋白变化。这些参数只需通过常规实验途径即可测定。
监测脱硫效率和程度的几种恰当技术是众所周知的，并且是本领域普通技术人员易于采用的。基线和时间过程样品可以从培养的混合物中收集，并用以测定化石燃料中的残余有机硫。要进行生物催化处理的样品中的有机硫化合物如DBT中消失的硫的监测可用，例如，X射线荧光(XRF)或原子发射谱(火焰谱)法。优选地，样品的分子部分首先用，例如气体色谱法分离。
本发明的方法和生物催化组合物(包括重组微生物)显著地和意外地改进了早期公开的脱硫方法。已经表明，应用黄素蛋白比未添加黄素蛋白的体系使反应效率改善近100倍。这一点是近期文献中讨论的观点尤其没有预料到的，所说文献认为FAD直接连接到DSZC上(Denome等人，J.Bacteriol.，176：6707-6716，1994)，并认为NADH是该体系仅需的辅因子(Ohshiro等人，FEMSMicrobiol.Lett.118：341-344，1994)。
在不受任何特殊机理限制的条件下，脱硫反应的途径被认为如下：
在不受任何特殊理论限制的条件下，黄素蛋白被认为是从NADH(或其它电子供体)传递还原等价物到酶，DSZC(或Sox.C)和/或DSZA(或Sox.A)的短电子传输链。酶DSZC被认为负责DBT到DBTO2氧化反应的生物催化作用。酶DSZA被认为负责DBTO2到苯酚-苯基亚硫酸酯(PPS)的反应。
因此，特别优选将辅因子FMN以及电子供体，DADH或NADPH加到反应介质中。例如，本领域技术人员都知道NADH或NADPH的选择取决于黄素蛋白的选取。在下面实施例中，当使用Vibrio黄素蛋白时就用NADPH。另外，根据本领域技术人员已知的方法添加NADH或NADPH再生系统以将NAD+转化成NADH是优选的。
现在，我们将用下列实施例进一步解释本发明。本发明的最佳实施例
        实施例1：FMN提高DSZ体外活性材料和方法
将15ml生长在30℃到约10A600的碱性盐培养基中的IGTS8细菌用离心方法收集，并重新悬浮于pH7.5的4ml 0.1M磷酸钠缓冲液中。两次通过17,000psi的弗氏压碎器裂解这些细胞。在细胞裂解液中加入去垢剂CHAPS使最终浓度达到0.1％。然后将混合物放于冰上15分钟，以15,000xg离心15分钟。上清液用于无细胞酶分析。
酶反应混合物含有下列全部或部分成分：1.0mM DBT，3.2mMNADH，1％卵磷脂(以增加DBT在水性混合物中的溶解性)，5μMFAD或FMN，和上述浓度为0.1-1.0mg/ml的细胞蛋白提取物。反应物总体积为0.6ml。将反应物在30℃培养同时摇动1小时，停止前加入1ml乙腈。将混合物离心，并用HPLC对一部分上清液进行分析，对比已知的2-HBP标准。蛋白质浓度用Biorad(Hercules，CA)的蛋白分析试剂盒测定。结果：
如Ohshrio等人(FEMS Microbiol.Lett.18：341-344(1994))所示，DBT到2-HBP的转化取决于在NADH体外反应混合物过程中以NADH形式添加的还原等价物(表1)。然而，这些作者报告说没有任何其它辅因子在该反应中起作用。
               表1
用IGTS8进行黄素单核苷酸(FMN)DBT脱硫的要求
                            产  物
添加的化学物质 DBT亚砜(μg)   DBT砜(μg)     2-HBP(μg)
    NADHa     0     0     17.0
    NADH     0     0.4     0
  NADH+FAD     0     0     0
    FMN     0     0     0
  NADH+FMN     0     0     2.5
a除了蛋白质浓度为1.6mg/ml以外其它反应条件如上所述。
如果将上述制备的IGTS8蛋白质粗提取物稀释到约0.16mg/ml蛋白质浓度，则该提取物将损失其从只有NADH化学物质中的DBT产生2-HBP的能力。在这种情况下向反应混合物中添加FMN(黄素单核苷酸)可恢复这种能力。添加FAD(黄素二核苷酸)无用(表1)。透析提取物有相同的作用(损失脱硫活性，添加FMN和NADH可以恢复)。这些结果表明NADH和FMN均参与了脱硫过程，而且表明为使反应进行它们必须同时存在。
     实施例2：纯的异源NADPH依赖的FMN还原酶
           提高IGTS8提取物的Dsz活性
实施例1所述实验结果说明，含有还原酶的黄素(如FMN)参与了由IGTS8催化的脱硫反应。为了验证这一点，我们在有纯异种FMN还原酶存在下进行了DBT至2-HBP的反应。材料和方法：
基本上按照实施例1所述制备IGTS8细胞的粗蛋白溶胞液。在该提取物中蛋白质的浓度为12.7mg/ml。为了测量提取物的脱硫活性，将67μM DBT和5mM NADPH与不同量的从Vibrio harveyi(Lei等人，Supra)纯化的NADPH依赖的FMN还原酶加到300μl该提取物中。这里所用的一单位还原酶将催化每分钟1微摩尔用NADPH作为底物的还原反应。结果：
如果在300μl上述反应混合物中加入0-0.090单位V.harveyi还原酶，则还原酶对脱硫活性有很强的刺激作用。加入0.09单位将增加活性2倍以上(图1)。这些结果表明，在此处所说的脱硫反应中提取物对催化反应的总体能力主要通过添加含有还原酶的黄素来加以改善。
    实施例3：Dsz表型在大肠埃希氏杆菌中
               的表达依赖于FRP材料和方法：
           dsz表达载体pEX16的构建
质粒pEX16包含在大肠埃希氏杆菌tac启动子序列的转录控制下的dszABC基因。该质粒经过下列步骤构建：合成的双螺旋DNA低聚核苷酸衔接头序列
Figure A9519671000231
被连接到已经被核酸内切酶EcoRI和Hind III消化的质粒pUC19(Yanisch-Perron等人，Gene 33：103-119(1985))上，得到质粒pEX13。然后将pEX13用核酸内切酶Nsil和Bsiwl消化。将从含有dszABC结构基因的质粒pTOXil(美国专利5,356,801)得到的4.5kbNsil/Bsiwl限制片段分离，再连接到消化后的pEX13 DNA上，形成质粒pEX14。将得自pEX14的4.5kbp Bglii/Spel片段和BAMHl/Spel切断的质粒pT3XI-2[Hale，K.含有四环素抵抗基因和tac启动子的pKK223-3(Pharmacia)衍生物]的混合物连接，使得tac启动子取向为直接转录dszABC。该质粒称为pEX16(图2)。
           编码DSZABC和frp的质粒的构建
用下列步骤将含有frp(黄素还原酶)基因Vibrio harveyi(Lei等人，J.Bacteriology 176：3552-3558(1994))的0.9kbp DNA片段加到质粒pEX16中。用限制核酸内切酶Earl消化质粒pFRPI(Lei等人，(1994))，并用dNTP和DNA聚合酶大片段(Klenow)做成平端。将双链Spel接头片段(N.E.Biolabs)通过连接加到上述平端上；接着用Spel消化。然后将质粒pEX16在位于dszABC基因簇3’端的独特Spel处消化，并与以Spel为端点的frp基因片段连接。所形成的含有受tac启动子控制的含有frp基因和dszABC的克隆被称作pEX44(图2)。
细胞溶胞液的制备和载有pEX16或pEX44的
大肠埃希氏杆菌提取物中Dsz活性的测定
通过加入0.1mM(最终浓度)IPTG诱发已经在37℃YT培养基中生长了的大肠埃希氏杆菌细胞培养物(50ml)进行克隆基因表达诱导。离心收集细胞，并重新悬浮于0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.5)中。两次通过17,000psi的弗氏压碎器使细胞裂解。将细胞溶胞液以15,000xg离心15分钟，留下上清液部分进行酶分析。反应混合物含有0.1M磷酸盐缓冲液、5μM FMN、0.67mM DBT、3mM NADPH、蛋白提取物(12mg/ml)，最终体积为300μl。结果：
在以DBT为唯一硫源的大肠埃希氏杆菌的
生长依赖于DSZABC和frp
IGTS8将在DBT作为唯一硫源的条件下生长。野生型大肠埃希氏杆菌将不能在该条件下生长。而且，当载有质粒pEX16和表达dszABC基因的E.coli菌株被置于如上定义的含有DBT作为唯一硫源的生长培养基中时，尽管全部三种基因产物强烈表达该菌株也不生长，但是，载有质粒pEX44并表达dszABC和frp的同样菌株却会在该条件下生长。这些结果表明黄素还原酶蛋白显著提高了Dsz表型的异种表达。
按照上述说明来制备含有质粒pEX16或pEX44的大肠埃希氏杆菌菌株提取物，并测定DBT到2-HBP的转化。示于图3的结果表明frp基因和NADPH依赖的FMN还原酶的表达产物的提取物的存在使转化有所提高。
          实施例4：IGTS8内生黄素蛋白的分离方法与材料
                 细菌菌株和生长
30℃温度下IGTS8在以250rpm摇震的BSM/Hunter培养基[Denome等人，Applied and Environmental Microbiology 59(9)：2837-2843(1993)]中生长到出现早期稳定期(典型的约85小时)。
将含有编码DSZA的质粒pSAD267-1(Denome等人，J.Bact.176：6707-6716(1994))的大肠埃希氏杆菌MZ1在补充下列物质的BSM/Hunter培养基中生长：0.4mg/ml生物素，组氨酸、异亮氨酸和缬氨酸各50mg/ml，100μg/ml氨苄青霉素和1.5mM Na2SO4。将从新鲜琼脂平板上取下的单个菌落接种到50ml已在30℃摇震(250rpm)过夜的液体培养物中。将10ml培养物的等份试样接种到500ml相同培养基上，并生长达到OD600约为0.4。这时，通过将温度增至39℃2小时诱发DSZA表达，然后回到30℃直到OD600达到约3。典型的是将3L细胞培养物用于纯化。
将含有编码DSZC的质粒pSAD269-2A(Denome等人，(1994))的大肠埃希氏杆菌MZ1按照上面对MZ1∷pSAD267-1所述的方法在补充100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中生长。
                柱色谱
整个色谱分析过程在4℃或在冰上进行。将离心收集的IGTS8细胞用含有1mM EDTA和1mM DTT的25mM EPPS pH8(缓冲液A)洗涤一次，然后重新悬浮于25mM EPPS pH8、1mM EDTA、1mM DTT、100mM NaCl、10mM MgCl2和0.15mM PMSF的混合物中。加入DNase和RNase固体。通过40,000psi Aminco弗氏压碎器破碎细胞。将细胞悬浮液通过弗氏压碎器两次，然后在4℃以39,800xg离心30分钟。将未破碎的细胞和细胞碎片构成的细胞粒丢弃，同时将上清液装入Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow柱(2.6cm×14cm)，用5％含有缓冲液B(缓冲液A+2M NaCl)的缓冲液A以2ml/min流速平衡。用相同缓冲液以5ml/min流速彻底洗涤该柱，直到洗脱液的OD280接近于0，再用线性梯度从5％到30％的缓冲液B(相当于100mM-600mM NaCl)洗涤180分钟。洗脱出的约240mM NaCl有些黄的流出液显示NADH∶DCPIP氧化还原酶活性。
从大肠埃希氏杆菌纯化DSZA按下述步骤完成。将如上所述生长的大肠埃希氏杆菌细胞通过以6,000rpm离心10分钟来收集，然后在缓冲液A中洗涤两次。将细胞重新悬浮于包括100mM NaCl，10mM MgCl2，0.15mM PMSF和DNase及RNase在内的同一缓冲液(体积等于细胞的湿重量)，然后在20,000psi弗氏压碎器中破碎。在39,800xg速度下离心溶胞物以除去未破碎细胞和细胞碎片。以1ml/min流速将上清液装入Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow柱(2.6cm×14cm)，用5％缓冲液B洗涤该柱，直到洗脱液的OD280接近于基线，再用线性梯度从5％到25％的缓冲液B以5ml/min流速洗涤120分钟。将含有DSZA的流出液(用SDS-PAGE测定)合并，并在4℃对缓冲液A渗析过夜。将渗析液装入通过导管连到Pharmacia Resourse Q柱上的Pharmacia Blue Sepharose-6 Fast Flow柱内，用缓冲液A平衡。在达到稳定基线后断开与Blue Sepharose柱的连接，并用线性梯度2.5-25％的缓冲液B以3ml/min流速洗涤60分钟。将含有DSZA的流出液(用SDS-PAGE判定)合并，加入甘油至10％(w/v)，并贮存于-20℃。该方法的结果得到95％纯的DSZA。
DSZC的纯化过程如下。在该例中，缓冲液A为含有1mM EDTA的10mM BES(pH 7.09)。在室温下用4mg/ml溶菌酶处理细胞1.5小时使其溶解。溶胞缓冲液包括75mM NaCl，1mM DTT和0.1mg/ml PMSF。溶胞完成后加入MgCl2至5mM，并加入DNase和RNase。上清液首先以6,000rpm离心15分钟，弃去离心沉淀，然后再将上清液以39,000xg离心1.5小时。接着将上清液倒入，用缓冲液A+3％缓冲液B(缓冲液A+2M NaCl)平衡过的PharmaciaResourse Q柱，再用10倍柱容积的相同缓冲液洗涤。然后用线性梯度60-500mM的NaCl(相当于3-25％缓冲液B)以3ml/min流速洗涤23分钟。将含有DSZC的流出液(用SDS-PAGE测定，约350mMNaCl洗脱)合并，并用Amicon Centriprep 30(MWCO 30 kDa)浓缩至约0.7ml。将0.25ml浓缩部分在Pharmacia Superose 12凝胶过滤柱上进一步色谱分离，用10mM BES pH7作为流动相(流速为0.3ml/min)。将含DSZC部分合并，然后冻干并贮存于-20℃。
                   酶分析
依赖于NADH的DCPIP还原反应的测定如下所述。反应混合物(1ml，在一个直径为1cm的试管中)为含有100 nmol DCPIP和50nmol FMN的25mM EPPS缓冲液(pH8)。DCPIP的还原与600nm处的吸收减少相关。搅拌的混合物的吸收用Beckman 7500二极管阵列分光光度计于600nm处监测。约30秒后加入300 nmolNADH，观察到有还未有进行酶还原反应的DCPIP。再30秒后注射1-10μL需要试验的样品引起反应。酶化活性表示为-OD600/min或μM还原的DCPIP/min(用ε600＝21mM-1cm-1表示)。依赖NADH的cyt c还原反应可用类似方法测定，除了吸收在550nm处监测和混合物中用50nmol cyt c代替DCPIP之外。铁细胞铬(ferricytochrome)c到亚铁细胞铬(ferrocytochrome)c的还原与550nm处的吸收增加相关。
DBT到DBTO、DBTO2、和HBP，以及DBT-磺内酯到BHBP的转化可用上述HPLC进行分析，用Synchropak RP C18反向柱(100×4.6mm)和H2O∶乙腈为1。在pH7.5的100mM NaPi中的反应混合物含有1ml 3μmol NAD(P)H，25nmol FMN(或FAD)，粗溶胞物或纯DSZC(A)和100nmol底物。在每个时间点(每10分钟)除去100μL，加入100μL乙腈以淬灭反应，并对底物和产物进行分析。结果：
           在IGTS8中含还原酶的黄素的识别
用阴离子交换色谱分离IGTS8粗溶胞物后就可以分辨出几种清晰的色素(黄素和棕色)部分。正如图4所示，NADH还原DCPIP的反应发生在以25号峰(约240mM NaCl)为中心的周围几部分。典型地，这些部分的颜色稍微有些黄，表明它们含有黄素蛋白。为了得到全部氧化还原酶活性必须将外源黄素加到该反应混合物中，以便在分离过程中指出是否已经失去外源黄素。添加黄素(在此为FMN)可以提高DCPIP还原反应的效率和反应程度。这些部分还催化偶联到氧化NADH的cyt c还原反应。
           用黄素蛋白还原酶活化DSZA和C
当DSZA或C从大肠埃希氏杆菌纯化时，在典型的1小时分析中二者均不催化它们各自的反应。图5表示如果来自黄色部分的黄素蛋白氧化还原酶与纯的大肠埃希氏杆菌DSZA在FMN和NADH存在下结合，则发生DBT-磺内酯向BHBP的完全转化。当黄色部分与DSZC、FMN和NADH结合时(只是底物改为DBT，且产物是DBTO2)可以看到相同的图形(图6)。这些数据将说明为了使脱硫反应进行，不仅必须存在DSZA、B、和C蛋白，至少还要有第三种蛋白包括在反应过程中，该蛋白使用黄素作为辅因子并且负责氧化NADH。等价物
不必采用超出常规的实验途径，本领域技术人员都将知道或能够确定可用于本发明所述的具体实例的很多等价物。这些及所有其它等价物都将包括在下列权利要求中。
                  序列表(1)一般信息：(i)申请人：
(A)名称： Energy BioSystems Corporation
(B)街道： 4200 Research Forest Drive
(C)城市： The Woodlands
(D)州/省：Texas
(E)国家： USA
(F)邮政编码：77381
(G)电话：(713)364-6100
(H)传真：(713)364-6110(i)申请人/发明人：
(A)名称 Charles H.Squires
(B)街道：66 Lazy Lane
(C)城市：The Woodlands
(D)州/省：Texas
(E)国家： USA
(F)邮政编码：77381(i)申请人/发明人：
(A)名称： Wan Ji
(B)街道： 2 Townsend Place
(C)城市： The Woodlands
(D)州/省：Texas
(E)国家： USA
(F)邮政编码：77381(i)申请人/发明人：(A)名称： Lei Xi(B)街道： 159 West Sterling Pond Circle(C)城市： The Woodlands(D)州/省：Texas(E)国家： USA(F)邮政编码：77381(i)申请人/发明人：
(A)名称： Beatrice C.Ortego
(B)街道： 17003 Kettle Creek DriVe
(C)城市： Spring
(D)州/省：Texas
(E)国家： USA
(F)邮政编码：77379(i)申请人/发明人：(A)名称： Olga S.Pogrebinsky(B)街道： 12611 Pinerock(C)城市： Houston(D)州/省：Texas(E)国家： USA(F)邮政编码：77024(i)申请人/发明人：(A)名称： KeVin A.Gray(B)街道： 3500 Tanglebrush，No.177(C)城市： The Woodlands(D)州/省：Texas  (E)国家： USA(F)邮政编码：77381(i)申请人/发明人：(A)名称：J ohn D.Childs(B)街道： 33 Holly Creek Court，No.1202(C)城市： The Woodlands(D)州/省：Texas(E)国家： USA(F)邮政编码：77381(ii)发明题目：用黄素蛋白给化石燃料脱硫的方法(iii)序列号：2(iv)通讯地址：(A)地址： Hamilton，Brook，Smith & Reynolds，P.C.(B)街道： Two Militia Drive(C)城市： Lexington(D)州/省：Massachusetts(E)国家： USA(F)邮政编码：02173(v)计算机可读方式：(A)介质类型：软盘(B)计算机：  IBM PC兼容机(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS(D)软件：PatentIn Release #1.0，#1.30版  (vi)以前申请情况：
(A)申请号：US 08/351,754
(B)递交日：1994年12月8日
(C)分类：(viii)律师/代理人情况：
(A)名称：Brook，David E.
(B)注册号：22，592
(C)参考/摘要号：EBC94-08 PCT(ix)电讯信息：
(A)电话：(617)861-6240
(B)传真：(617)861-9540(2)序列识别编号信息：1(i)序列特征：
  (A)长度：77个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)绞链情况：双股
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(ix)特性：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：31..54
(xi)序列的描述：    序列识别号：1：AATTCAGATC TGATCGAGGA GGATGATTAA ATG ACT CAA CAA CGA CAA ATG CAT    54
                             Met Thr Gln Gln Arg Gln Met His
                               1               5CTGATACGTA CGACTAGTAA GCT                                           77(2)序列识别编号信息：2：(i)序列特征：
  (A)长度：8个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列的描述：序列识别号：2：Met  Thr  Gln  Gln  Arg  Gln  Met  His1                   5

Claims (29)

1.一种提高含有机硫化合物的化石燃料的脱硫速率的方法，包括
以下步骤：
a)将化石燃料与含有能够裂解碳-硫键的生物催化剂和能够提
高反应速率量的黄素蛋白的水相接触，进而形成化石燃料
和水相的混合物；
b)将步骤a)的混合物保持在用生物催化剂足以裂解有机硫分
子中碳-硫键的条件下，进而得到有机硫含量减少的化石燃
料；以及
c)将有机硫含量减少了的化石燃料从所得水相中分离出来。
2.根据权利要求1所述的方法，其中黄素蛋白是黄素还原酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其中黄素蛋白是FMN还原酶。
4.根据权利要求3所述的方法，还包括添加NADH或NADPH。
5.根据权利要求4所述的方法，其中化石燃料是液体烃。
6.根据权利要求4所述的方法，其中化石燃料是液化烃。
7.根据权利要求4所述的方法，其中能够裂解碳-硫键的生物催化
剂和FMN还原酶是固定化的。
8.根据权利要求4所述的方法，其中碳-硫键的裂解是通过氧化途
径完成。
9.根据权利要求8所述的方法，其中能够裂解碳-硫键的生物催化
剂是微生物。
10.根据权利要求8所述的方法，其中微生物含有给能够裂解碳-
硫键的一种或多种酶编码的重组DNA分子。
11.根据权利要求10所述的方法，其中重组DNA分子从红球菌属
ATCC 53968衍生。
12.根据权利要求8所述的方法，其中能够裂解碳-硫键的生物催化剂是无细胞组分。
13.根据权利要求12所述的方法，其中生物催化剂是红球菌属ATCC 53968无细胞组分。
14.根据权利要求8所述的方法，其中的生物催化剂包括从能够裂
解碳-硫键的微生物衍生出来的一种或多种酶或酶组分。
15.根据权利要求14所述的方法，其中微生物是红球菌属ATCC
53968。
16.根据权利要求2所述的方法，其中黄素蛋白是重组黄素还原酶。
17.根据权利要求16所述的方法，其中能够裂解碳-硫键的生物催
化剂和重组黄素还原酶由单一微生物产生。
18.一种DNA分子，它含有给黄素蛋白编码的DNA和给能将含有
机硫分子的化石燃料脱硫的生物催化剂编码的DNA。
19.根据权利要求18所述的DNA分子，其中黄素蛋白是黄素还原
酶。
20.根据权利要求19所述的DNA分子，其中黄素还原酶是FMN
还原酶。
21.根据权利要求20所述的DNA分子，其中DNA分子含有从红球菌属ATCC 53968衍生的DNA。
22.一种含有重组DNA分子的微生物，它编码
a)黄素蛋白；以及
b)能够将含有机硫分子的化石燃料脱硫的生物催化剂。
23.根据权利要求22所述的微生物，其中黄素蛋白是黄素还原酶。
24.根据权利要求23所述的微生物，其中重组DNA质粒含有从红球菌属ATCC 53968衍生的DNA。
25.一种组合物，它包括
a)黄素蛋白；以及
b)能够将含有机硫分子的化石燃料脱硫的生物催化剂。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中黄素蛋白是黄素还原酶。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中黄素蛋白是FMN还原酶。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中生物催化剂是红球菌属
ATCC 53968或其酶。
29.根据权利要求27所述的组合物，还含有NADH或NADPH。
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