JPH10505896A

JPH10505896A - 変化した免疫状態を有する患者を同定する方法

Info

Publication number: JPH10505896A
Application number: JP8505745A
Authority: JP
Inventors: オチョア，アウグスト・シー; ヤング，ハワード・エイ; ロンゴ，ダン・エル; ゴーシュ，パリトシュ; ロブ，リチャード; ネヴィル，メアリ
Original assignee: US Department of Health and Human Services; Biormia USA Inc
Current assignee: US Department of Health and Human Services; Biormia USA Inc
Priority date: 1994-07-22
Filing date: 1995-07-07
Publication date: 1998-06-09
Also published as: US5965366A; AU705820B2; US5658744A; AU2999795A

Abstract

(57)【要約】免疫状態の変化した患者を同定する方法は、患者の免疫状態指数を決め、それを健康な個体の免疫状態指数と比較することを含む。通常、免疫状態指数は、免疫状態の変化した患者において大きく変化するタンパク質の量の、健康な個体および免疫状態の変化した個体の両方において実質的に変化しないもう一つのタンパク質の量に対する比である。変化するタンパク質は、ＴＣＲサブユニットタンパク質、Ｔリンパ球シグナル伝達経路タンパク質、ポリヌクレオチド結合タンパク質または生体応答調節剤（ＢＲＭ）である。さらに、Ｔｈ２タイプＢＲＭに対するＴｈ１タイプＢＲＭの比、ポリヌクレオチド結合タンパク質の核濃度に対する細胞質濃度の比、ＢＲＭのための遺伝子のタンパク質結合領域を含むオリゴヌクレオチドプローブへのタンパク質結合パターン、または密度勾配遠心分離後の密度勾配におけるＴリンパ球の分布パターンも免疫状態指数として好適である。この方法は、免疫抑制、過剰免疫および自己免疫を示す患者の同定、ならびに臓器移植を受ける患者の免疫状態を評価するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】変化した免疫状態を有する患者を同定する方法発明の背景本発明は、通常状態と比較して変化した免疫状態を有する患者を同定する方法に関する。この方法は、患者についての免疫状態指数を決めること、およびその免疫状態指数の値を健康な個体の免疫状態指数と比較することを含む。患者の免疫状態指数と健康な個体の免疫状態指数との間の変動が大きいことは、患者の免疫状態が変化していることを示す。本発明は、免疫抑制、過敏症または自己免疫を有する患者を同定するため、ならびに一般に医学的治療を容易に行うように免疫応答をモニターするために用いられる。免疫状態指数は、化学療法、免疫療法または手術を含む癌治療の進行を段階づけたり、または評価するために用いられる。免疫状態指数は、臓器移植を受けている患者を評価するために、および自己免疫疾患またはアレルギーのために行われている治療の効果を評価するために用いられる。免疫系は、正確に制御された細胞タイプやこれらの細胞が分泌する可溶性分子が複雑にも整然と並んで構成される。健康な個体における免疫応答は、病原体、他の異物または腫瘍細胞の認識、それに続いて生体から病原体または他の異物を除去することを含む。広義において、免疫応答は二つの範疇、すなわち先天的反応と獲得的反応に分けることができる。しかしながら、免疫系の成分間の相互反応の結果として、大部分の免疫応答は種々の先天的および獲得的機構を含む。先天的反応は、通常、単球、マクロファージおよび多形核好中球を含む食細胞として知られている重要な群の白血球により媒介される。一般的に、これらの細胞タイプは、非特異的認識系を利用して微生物を拘束、吸収および破壊するので、感染に対する防護の第１ラインとして作用する。免疫系の獲得的反応の中心的なものは、リンパ球である。リンパ球は、血液または組織液中の宿主細胞の内側に存在しても、宿主細胞の外側に存在しても、特異的に個々の病原体を認識する。リンパ球は、通常、二つの群、すなわちＴリンパ球（Ｔ細胞とも呼ばれる）とＢリンパ球（Ｂ細胞とも呼ばれる）とに分けられる。Ｂ細胞は、特異的な標的分子に結合することにより、細胞外病原体およびその生成物と戦う特異的抗体を放出する。一方、Ｔ細胞は広範囲の反応性を有する。特定のＴ細胞は、食細胞と相互作用して、食細胞が貪食した病原体を破壊するのを助ける。他のＴ細胞は、異常細胞またはウイルスに感染された細胞を認識し、それらを破壊する。さらに他のＴ細胞は、Ｂ細胞の発生および抗体産生を制御する。明確なＴ細胞マーカーは、ＴＣＲと呼ばれるＴ細胞抗原レセプターである。血液内のＴ細胞中、通常、95％を越えるものがＴＣＲ−２と分類され、残りのものがＴＣＲ−１と分類される。ＴＣＲ−１とＴＣＲ−２とはＴｉサブユニットを基準に区別される。ＴＣＲ−２のＴｉサブユニットは、αおよびβとして知られているジスルフィド結合で結合した二つのポリペプチドである。ＴＣＲ−１は構造的にＴＣＲ−２に類似しているが、ＴＣＲ−１のＴｉサブユニットはγおよびδ ポリペプチドである。ＴＣＲ−１とＴＣＲ−２の両方共、ＣＤ３複合体を含むポリペプチドの複合体に関係する。全てのＴ細胞の表面上で見つけられるＴＣＲは、三つの異なるサブグループのタンパク質に分けることのできる少なくとも六つの異なるサブユニットからなる Klausner(1990)を参照。レセプター複合体内のヘテロダイマーαβまたはγδがリガンドの結合に寄与する。ＴＣＲを含むもう一つのサブグループのタンパク質は、少なくとも四つの異なる、しかし密接に関係するサブユニットを包含するＣＤ３鎖である。これらのサブユニットは、γ、δ、εおよびζである。Koning (1990)、Blumberg(1990)を参照。レセプタータイプの多様化は、ＴＣＲ複合体の鎖が複数のサブユニットに分離した結果である。不完全に組み立てられた複合体は分解し、その結果、完全に組み立てられたレセプターのみが表面に発現する。ＴＣＲ−２であるＴ細胞は、ＣＤ４マーカーを有する細胞とＣＤ８マーカーを有するもう一つの細胞のサブセットに細分される。ＣＤ４⁺サブセット（Ｔｈ）は主に免疫応答を誘導し、ＣＤ８⁺サブセット（ＴＣ）は主として細胞障害性細胞とサプレッサー細胞からなる。ＣＤ４⁺サブセットは、Ｔ細胞とＢ細胞の反応に促進的影響を与える細胞に細分される。もう一つの細胞のＣＤ４⁺サブセットは、ＣＤ８⁺細胞のサプレッサー機能と細胞障害性機能を誘導する。ＣＤ４⁺サブセットは、さらにＴｈ１タイプ細胞およびＴｈ２タイプ細胞に細分される。Ｔｈ１タイプ細胞およびＴｈ２タイプ細胞は、それらが分泌するリンフォカインのスペクトルに基づいて区別される。Ｔｈ１細胞は、インターロイキン２（ＩＬ−２）およびＩＦＮ−γを分泌することがわかり、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０を分泌することがわかっている。Ｔｈ１およびＴｈ２細胞タイプは、Ｔｈ０細胞と呼ばれる共通の前駆体集団に由来すると考えられる。全てまたは大部分のＴｈ１およびＴｈ２細胞が相互排他的にサイトカインを生成するのに対して、Ｔｈ０細胞は、全てまたは大部分のこれらリンフォカインを生成する。Ｔｈ０細胞をＩＬ−１２で処理すると、Ｔｈ１タイプ細胞が生成される。ＩＬ−１２は、マクロファージおよびＢ細胞により生成される。Ｔｈ細胞は、免疫応答の進行を制御および調整するようである。Ｔｈ細胞は、どのエピトープが免疫応答の標的になるかを決定し、エフェクター機構を選択するのに重要な役割を果たす。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、加工された抗原を特定のエピトープを認識するＴｈ細胞に提示し、関連するエフェクター機能のための標的として作用するものを選択する。Ｔｈ細胞は、次に、抗体を生成し、他のエフェクター細胞、Ｔｃ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、顆粒球および抗体依存細胞障害性（Ｋ）細胞の作用を調整するＢ細胞を含む適当なエフェクター細胞を選択し、活性化する。Ｔｈ細胞による異なるサイトカインの放出は、エフェクター機構および細胞障害性細胞の選択に役割を果たし得る。Ｔｈ１細胞は、マクロファージおよび細胞障害性細胞を活性化するＩＬ−２およびＩＦＮ−γを分泌する。一方、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０を分泌し、そして好酸球およびマスト細胞の生成を増加させたり、ＩｇＥを含む抗体の産生を高め、細胞障害性細胞の機能を低下させる。Ｔｈ１またはＴｈ２パターンは、一旦確立されると、他のサブセットの生成を抑制するサイトカインの生成を介して維持される。Ｔｈ１細胞により生成されたＩＦＮ−γは、ＩＬ−４、ＩＬ−１０のようなＴｈ２タイプのサイトカインの生成を抑制し、Ｔｈ２細胞により生成されたＩＬ− １０は、ＩＬ−２およびγＩＦＮのようなＴｈ１タイプのサイトカインの生成を抑制する。どのエピトープが免疫系の標的となるかを決めることに加えて、免疫系は、各感染のための適当なエフェクター機構の選択もしなければならない。選択され得るエフェクター機構は、１）細胞障害性Ｔ細胞、２）抗体付着マスト細胞および好酸球、または３）マクロファージ活性化および遅延型過敏症を含む。不適当なエフェクター機構の活性化は、保護ではなく向上した過敏性を導きうる。ｃＡＭＰまたは不安定な調整タンパク質がＴｈ２細胞のＩＬ−２の発現を抑制し得ることが報告されているが、Ｔ細胞クローンが限定的に特定のリンフォカイン遺伝子のみを発現するようになる分子機構は不明瞭なままである。Novak(1990 )、Munoz(1989)を参照。ヒトＢ細胞系は、内因性γＩＦＮを生成することができ、この遺伝子発現は、ヒトγＩＦＮプロモーターにおけるＣＡＡＡＴボックスとＴＡＴＡボックスとの間に存在するＳｎａＢ１制限酵素部位（ＴＡＣＧＴＡ）のメチル化状態に少なくとも部分的に関係する。Pang(1992)を参照。ＳｎａＢ１酵素は、Ｃが５位においてメチル化されている場合はＤＮＡを開裂せず、Ｃがメチル化されていない場合はＤＮＡを開裂するので、メチル化感受性である。Yang (1990)を参照。γＩＦＮを自発的に発現するヒトＢ細胞系において、およびヒト γＩＦＮゲノムＤＮＡを安定にトランスフェクションされているマウスＴ細胞系において、この部位は、全体的に低レベルにメチル化(hypomethylation)されていて、ＳｎａＢ１により完全に開裂された。Pang(1992)を参照。キラーＴ細胞としても知られているＴｃ細胞は、感染標的細胞を溶解することにより、細胞内寄生生物およびウイルスに対する免疫応答において重要な役割を果たすエフェクター細胞である。細胞障害性Ｔ細胞は、免疫監視機構を介する癌の進行から体を防ぐことにも関わっている。特定の条件下において、ＣＤ８⁺Ｔ細胞が、免疫活性を抑制することのできる細胞として機能することも示された。これは、Ｔｈ２細胞により生成される原料因子、すなわちＩＬ−４、ＩＬ−１０の生成により媒介される。サプレッサーＴ細胞は、ヘルパーＴ細胞の誘導および／または活性を遮断する。Ｔ細胞は、通常、遊離抗原を認識しないが、他の細胞の表面上の抗原を認識する。これらの他の細胞は、Ｔ細胞分裂を刺激することのできる抗原提示細胞、または、細胞障害性Ｔ細胞の標的となる体内のウイルス感染細胞である。Ｔｃ細胞及びＴｓ細胞は、通常、全ての有核細胞上に発現されるクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）生成物に関して抗原を認識する。ヘルパーＴ細胞、およびin vitroで抗原に反応して増殖する大部分のＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ生成物に関して抗原を認識する。クラスＩＩ生成物は、大部分が、特殊化した抗原提示細胞上および一部のリンパ球上に発現される。要約すると、免疫応答の体液性免疫（抗体および補体）または細胞性免疫の活性化の方法、およびそのような反応の制御が、Ｔ細胞および単球によるサイトカインの生成により支配されるようである。したがって、この制御における変化によって、免疫応答の機能が異常になり得るようである。この異常機能は、免疫抑制につながる免疫応答の低下、または自己免疫として知られている自身の正常組織に対する異常に増加した反応となり得る。免疫応答の状態の決定は、主に臨床的手段により行われてきた。「日和見感染」、すなわち通常病原性でない微生物による感染の存在は、免疫抑制状態を示唆する。また、リューマチ性関節炎の存在は、自己免疫プロセスを示唆する。臨床的発見が行われると、特定の実験室的試験によりこれらの発見を確かめることができる。これらの実験室的試験は、主に、変化した免疫系が存在すること、例えば、抗核抗体試験が狼瘡患者の血清中の自己抗体の存在を示したり、または日和見微生物の単離が免疫抑制プロセスの存在を確認する。しかしながら、免疫系の機能をモニターする適当な試験はない。現在の免疫機能についての免疫試験は、（１）細胞数：白血球数計測、ＣＤ４⁺／ＣＤ８⁺比（２）細胞反応：破傷風トキソイドに対する増殖指数（３）血清中の抗体濃度（４）リンフォカイン生成：血清中のリンフォカインの試験的絶対濃度これらの試験のいずれも、免疫応答はＴｈ１反応とＴｈ２反応との間の均衡であることを考慮していない。免疫系を有する異なる特殊化した細胞タイプの複雑な数、およびこれら細胞タイプ中に存在する微妙な制御ネットワークを考慮すると、免疫系における小さい混乱でさえ患者の重い病気につながり得ることは驚くべきことではない。多くの病気は、損傷または変化した免疫応答の発生により特徴付けられる。後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、敗血症、らい病、サイトメガロウイルス感染、マラリアおよび癌等を有する患者において、進行性免疫抑制が観察されている。しかしながら、免疫応答のダウンレギュレーションに寄与する機構をなお解明すべきである。Ｔ細胞機能の欠損が、癌患者および腫瘍を有するマウスにおいて見られる免疫障害において重要な意味があることが提案されている。Mizoguchi(1992)は、これら変化がこれら動物から単離された脾臓Ｔ細胞中に観察される機能障害のための分子的基本理論を表すＭＣＡ−３８腫瘍マウスからのＴ細胞中のシグナル伝達分子における変化を記載している。免疫系における不均衡が、自己抗体および自己反応性Ｔ細胞の生成により特徴付けられる自己免疫において明らかである。自己免疫疾患は、甲状腺中毒または悪性貧血の場合は器官特異的であり、強皮症、全身性紅斑性狼瘡またはリューマチ性関節炎の場合は器官非特異的であり得る。自己免疫応答の発生から生じる他の病気は、狼瘡および自己免疫甲状腺炎を含む。一方、組織損傷を引き起こす過度なまたは不適当な形態で免疫応答が起こるときに、過敏症が生じる。過敏症反応は、不適当に作用し、それにより炎症および組織損傷を生じさせる有益な免疫応答にすぎない。特定のタイプの過敏症反応は抗体に媒介され、他のものは主にＴ細胞およびマクロファージにより媒介される。タイプＩ過敏症において、ＩｇＥ反応は、花粉または動物のふけのような無害の環境抗原に対するものである。喘息や鼻炎のような症状を有する急性炎症性反応は、ＩｇＥで感作されたマスト細胞による薬理的媒介物の放出により起こる。抗体依存細胞障害性過敏症またはタイプＩＩ過敏症は、抗体が細胞上の自己抗原または他の抗原に結合したときに生じる。タイプＩＩＩ過敏症は、免疫複合体が大量に形成されたとき、または網膜内皮細胞系により充分に除くことができないときに生じる。タイプＩＶ過敏症は、抗原がマクロファージ中に捕らわれ取り去ることができないときに最も強度に示される。Ｔ細胞は、次に、刺激されて、一連の炎症反応を媒介するリンフォカインを合成する。Ｔ細胞の認識は、明らかに、細胞反応を支配するシグナル伝達および適当な生化学シグナルを誘導する。複数の生化学カスケードにシグナルを変換するＴＣＲの性能は、免疫細胞活性化の主要事項である。しかしながら、このシグナル伝達経路の詳細はあまり理解されていない。一またはそれ以上のチロシン（Ｔｙｒ）キナーゼは、Ｔ細胞活性化において必須の役割を果たすようである。Klausner(1 991)を参照。ＣＤ３またはαβヘテロダイマーに対するモノクローナル抗体によりまたは抗原によりＴＣＲが刺激されたときに、少なくとも二つのシグナル伝達経路が活性化される。ＴＣＲの刺激により、チロシンキナーゼが活性化される。Samelson(1986)、Pa tel(1987)、Hsi(1989)を参照。チロシン残基による幾つかのタンパク質のリン酸化は、ＴＣＲの刺激から数秒以内に誘導される。June(1990)を参照。いずれのＴＣＲ鎖も、内因性キナーゼ活性を有していない。しかしながら、Ｆｙｎと示されるチロシンキナーゼのＳｒｃファミリーのメンバーは、ＣＤ３複合体と共沈する。Samelson(1990)を参照。チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーのＴ細胞特異的なメンバーであるＬｃｋは、ＣＤ４またはＣＤ８分子の細胞質ドメインと強く、しかし非共有的に結合する。ＣＤ４およびCＤ８の細胞外ドメインは、ＭＨＣクラスＩＩおよびクラスＩ分子にそれぞれ結合する。提示細胞上の抗原−ＭＨＣ複合体にＴＣＲが結合する時に、ＴＣＲは、適当なＭＨＣ分子に独立して結合することのできるＣＤ４またはＣＤ８分子に近接されるものと考えられている。ＴＣＲは、また、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェートの加水分解を導くホスファチジルイノシトールに特異的なホスホリパーゼＣを活性化する。Weiss(1984)、Imboden(1985)を参照。これにより二つの二次メッセンジャー、つまり、１）一時的なＣａ²⁺動員に寄与するイノシトール−１，４，５− トリスホスフェートおよび２）タンパク質キナーゼの有効な活性化剤であるジアシルグリセロールの遊離が引き起こされる。Berridge(1989)を参照。シグナル伝達に関するもう一つの組のタンパク質は、Ｒｅｌ関連タンパク質ファミリーとしても知られているＮＦ−κＢ／ｒｅｌ転写因子である。Ｒｅｌ関連タンパク質ファミリーのメンバーは全て、類似した一次アミノ酸配列を有しており、相同なデカヌクレオチド配列からなる配列に様々な親和性で結合する。ＮＦ −κＢ転写活性化剤は、複数タンパク質複合体である。ＮＦ−κＢ転写活性化剤は、生物体中において特殊化されていて、サイトカイン、二本鎖ＲＮＡ、Ｔ細胞分裂促進剤、ＤＮＡ損傷剤、タンパク質合成抑制剤、寄生生物、ウイルスおよびウイルストランス活性化剤を含む広範囲な種々の物質に細胞を晒したときに、防護およびシグナルタンパク質の合成を迅速に誘導する。ＮＦ−κＢを活性化するこれらの物質の共通の特徴は、細胞および生物体に兆候を示すか、またはシグナル化することである。ＮＦ−κＢは、以下の点から、遺伝子発現を迅速に活性化するのに特に適している。（ｉ）新たなタンパク質合成を必要としない、（ｉｉ）簡単な分離反応が活性化を誘導する、（ｉｉｉ）ＮＦ−κＢが活動的に細胞質−核シグナル化に参加する、および（ｉｖ）有効なトランス活性化剤である。ＮＦ−κＢは、Ｔ細胞成長因子ＩＬ−２の誘導的発現、およびＩＬ−２高親和性レセプターの成分の誘導的発現に関与し、それはＮＦ−κＢが成長制御剤であることを示唆している。実際に、Ｔ細胞の増殖状態とＮＦ−κＢ活性の状態との間に良好な関係がある。三つのタンパク質サブユニット、Ｉ_kＢ、ｐ５０およびｐ６５は、ＮＦ−κＢの生物学的機能を制御する。Ｉk_Bタンパク質ファミリーのメンバーは、特異的にＮＦ−κＢ／Ｒｅｌタンパク質と相互反応する複数の相同なアミノ酸伸長部（アンキリン繰返）を示す。Ｉ_kＢは、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合を抑制し、刺激をうけていない細胞の細胞質においてＮＦ−κＢを誘導状態に維持するのに役立つ３５〜４３ｋＤａのサブユニットを含む。細胞の刺激時に、Ｉk_Bはｐ６５とｐ５０の不活性複合体から分離する。放たれたＰ５０−ｐ６５複合体ヘテロダイマーは、次に、核内に移動し、遺伝子をトランス活性化する。Ｔ細胞とミエローマ細胞系とのハイブリッドにおけるＩＬ−２レセプターα遺伝子の構成的発現は、ヘテロダイマーの存在のみに依存する。ｐ６５のみがＩk_Bを結合するようである。細胞内において、Ｉk_Bは、Ｉk_B、ｐ６５または両者の修飾により放出される。Ｒｅｌタンパク質は、κＢモチーフを認識することができる。Ｉk_BファミリーおよびＲｅｌファミリーは、従って、細胞質／核シグナルに含まれることが知られている関連するタンパク質を含む。ＮＦ−κＢ転写活性化剤およびそのｒｅｌタンパク質への関係についての他の情報をBaeuerle(1991)に見いだすことができる。本発明は、哺乳動物の免疫状態を検出およびモニターし、また適当な治療様式を同定するための技術に制限を加えるものである。本発明は、患者の免疫系の状態を評価するための改良された方法を提供するものである。特に、本発明は、患者の免疫抑制、過剰免疫または自己免疫の程度を同定、モニターおよび評価するための改良された方法を提供するものである。免疫抑制患者において免疫系を高める試みが効果的に調節されるように、免疫抑制の進行を測定する効果的方法が必要とされている。患者の免疫抑制水準を評価し、患者の治療への反応の可能性を正確に予想するために用いられる方法も必要とされている。自己免疫を有する患者の免疫応答をどの程度抑制するか決める方法が必要とされている。そこで患者の治療を系統的に進めることができる。患者のＴリンパ球が活性化することができるかどうか、および従って自己養子免疫治療が有効であり得るかどうかを臨床医が決めることのできる方法が必要とされている。免疫抑制剤および免疫抑制を禁止または反作用する薬剤をスクリーニングする方法への要求も残っている。治療効率を向上させるために腫瘍を検出する、特に腫瘍の進行の初期において検出する必要がある。また、癌の進行段階を決める改良された方法は、最も適切な治療様式の選択を容易にする。臨床試験の前におよび臨床試験に付加して治療様式の効率を試験する必要もある。患者の過剰免疫または自己免疫の程度を検出および測定する方法が要求されている。さらに、過剰免疫または自己免疫の進行段階を決定するための改良された方法は、最も適切な治療様式の選択を容易にし、治療様式の有効性をモニターする。骨髄または組織移植を受ける患者の免疫状態をモニターおよび評価する方法が要求されている。移植を受ける者の手術前および他の組織を受け取った後の免疫状態をモニターおよび評価する方法は、いつ免疫抑制剤を投与すべきかを効果的に決める必要がある。本発明は、患者の免疫系の状態を評価、モニターおよび予想するための技術に制限を付与し、それにより免疫状態が変化した患者をより効果的に診断および治療する手段を提供するものである。発明の概要本発明は、免疫状態の変化した患者を同定およびモニターする方法に関する。この方法は、患者の免疫状態指数を決め、それを健康な（対照）個体の免疫状態指数と比較することを含む。患者の免疫状態指数と健康な（対照）個体の免疫状態指数との間の大きな変動は、患者の免疫状態が変化していることを示す。本明細書において「健康な患者」とは、変化した免疫状態に関する症状または病気を有することが知られていない人と定義される。免疫状態指数は、免疫抑制、過剰免疫または自己免疫を有する患者を同定するために用いられる。免疫状態指数は、化学療法、免疫療法または手術を含む癌治療の進行を評価または進行段階を決めるために用いられる。免疫状態指数は、患者の受けている臓器移植を評価するために用いられる。通常、免疫状態指数は、免疫状態が変化している患者において大きく変化するＴＣＲサブユニットタンパク質、Ｔリンパ球シグナル伝達経路タンパク質、ポリヌクレオチド結合タンパク質またはＢＲＭの量の、健康な個体と免疫が変化している個体とで実質的に変化のない別のタンパク質の量に対する比である。また、Ｔｈ１タイプＢＲＭのＴｈ２タイプＢＲＭに対する比、特定のポリヌクレオチド結合タンパク質の細胞質濃度の核濃度に対する比、ＢＲＭのための遺伝子のタンパク質結合領域を含むオリゴヌクレオチドプローブへのタンパク質結合パターン、ＢＲＭ遺伝子の制御要素内のヌクレオチドのメチル化状態、リンパ球試料の遠心分離に続く密度勾配におけるＴリンパ球の分布パターンが免疫状態指数である。これらの方法は、免疫抑制、過剰免疫および自己免疫を示す患者の同定、および骨髄、組織または臓器移植を受ける患者の免疫状態を調べるのに有用である。これらの方法は、患者の免疫状態を変えることのできる化合物の同定、すなわち免疫抑制を誘導または反作用することのできる化合物の同定において有用である。対照患者および変化した免疫状態の条件を有することが予め知られている患者のサンプルにおける各比の分布がなされる。「正常な」免疫状態を「変化した」免疫状態から分離するためのしきい値は、特別のアッセイのために望まれる感受性−特異性に依存して決められる。本発明の基本的概念は、正常な個体において維持されている免疫系に関する機能の均衡のとれた比が存在すること、およびその比が免疫系の病気および疾患において変化することである。例えば、腫瘍の成長中に、腫瘍の性質および程度ならびにどれだけ宿主中に存在していたかに依存して多くの変化が生じ得る。免疫応答性の状態および免疫応答への腫瘍増殖の影響を理解し分類する最も有益な方法は、異なるマーカーの比、例えば、Ｔｈ１リンフォカイン／Ｔｈ２リンフォカイン、（ＩＬ−２／ＩＬ−４、γＩＦＮ／ＩＬ−４、またはＩＬ−２／ＩＬ−１０等）、ＣＤ３ζ鎖／ＣＤ３ε鎖、および／または細胞質ＮＦ−κＢ／核ＮＦ− κＢを評価することである。一つの比または比の組み合わせは、どの比が意図する特定の病気または症状を識別するかによって決めることができる。さらに、γＩＦＮ遺伝子のような生体応答調節剤（ＢＲＭ）遺伝子のタンパク質結合領域を含むオリゴヌクレオチドプローブにタンパク質が結合するパターンは、Ｔｈ１免疫応答とＴｈ２免疫応答とを識別するのに適している。なぜなら、このタンパク質結合のパターンは二つの細胞タイプにおいて異なるである。したがって、タンパク質結合のこれらのパターンは、個体の反応がＴｈ１モードであるかまたはＴｈ２モードであるかを決める方法である。また、γＩＦＮのようなＢＲＭ遺伝子の制御要素内のヌクレオチドのメチル化状態は、ＤＮＡメチル化のパターンが二つの細胞タイプにおいて異なるので、Ｔｈ１免疫応答とＴｈ２免疫応答とを識別するのに適している。ＢＲＭ遺伝子の制御要素内のメチル化状態を決めることにより、個体の反応がＴｈ１モードであるかまたはＴｈ２モードであるかを決めることができる。さらに、抹消血液細胞の遠心分離後の密度勾配におけるＴリンパ球の分布のパターンも、免疫状態指数として用いることができる。本明細書において用いられる「変化した免疫状態」という表現は、対照値のしきい値または分布により決められる逸脱を示す。逸脱は、免疫抑制、自己免疫または過剰免疫あるいは免疫系の不調により特徴付けられる任意の他の病気により引き起こされ得る。変化した免疫状態は、患者についての免疫状態指数を決め、それを健康な個体の免疫状態指数と比較することにより評価される。患者の免疫状態指数と健康な個体の免疫状態指数との間の大きな変動は、患者の免疫状態が変化していることを示す。「実質的にまたは大きく変化」という表現は、対照分布の統計的限界の外側の値を示す。「異常に多いまたは少ない」という表現は、対照分布の統計的限界の外側の比の値を示す。本明細書において用いられる「Ｔリンパ球」または「Ｔ細胞」という語は、Ｔ細胞抗原レセプターを有するリンパ球の全てのサブセットを含む。これらのサブセットは、例えば、ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺（αβ⁺）、ＣＤ３⁺ＣＤ８⁺（αβ⁺）、ＣＤ３⁺ＣＤ４^-ＣＤ８^-（γδ⁺）、およびＣＤ３⁺ＣＤ５６⁺であるリンパ球を含む。本明細書において用いられる「免疫療法」という語は、癌のまたは病気の組織の削減または制御のような個体への有益な免疫的効果を提供する目的で免疫的に活性な（免疫応答性）細胞を個体に投与することを含む「細胞養子免疫療法」を含む「養子免疫療法」を含む。免疫療法は、また、サイトカイン療法、ワクチン、抗体の注入および化学免疫療法も含む。本明細書において用いられる「免疫治療活性」または「免疫応答」あるいは「免疫活性」または「免疫反応性」という語は、白血球の抗腫瘍活性、抗感染細胞活性、抗疾患薬活性およびキラー活性を含む。本明細書において用いられる「シグナル伝達経路」という語は、リガンドまたは抗体が任意のＴ細胞表面レセプターに結合することによって、その発現が誘導、結び付けまたは制御される任意のタンパク質を含む。これらのタンパク質は、Ｊｕｎ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、ＧＡＰ、Ｒａｆ１、ｃ−ｒｅｌ、Ｐｌｃγ、Ｇタンパク質、イノシトールリン酸、タンパク質キナーゼＣ、Ｍａｐ１−キナーゼ、ＣＤ４５ホスフェートおよび、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、ＹｅｓおよびＬｙｎを含むキナーゼのＳｒｃファミリーを含むが、これらに限定されない。シグナル伝達タンパク質は、ＮＦ−κＢ、ＮＦＡＴ等のようなＤＮＡ結合タンパク質を含む。本明細書において用いられる「抗体」という表現は、抗原の適当なエピトープに特異的に結合する任意のタンパク質またはタンパク質類似物を含む。「抗体」という表現は、刺激性のＴ細胞レセプターの適当なエピトープに特異的に結合する任意のタンパク質またはタンパク質類似物を含む。「抗体」という表現は、また、ＴＣＲサブユニットタンパク質、Ｔリンパ球シグナル伝達経路におけるタンパク質、ポリヌクレオチド結合タンパク質またはＢＲＭに特異的に結合する任意のタンパク質またはタンパク質類似物を含む。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはそれらのフラグメントを含む従来の方法によりつくられた抗体、および遺伝子工学的に操作された分子または合成分子、例えば、結合特異性において抗体の機能的等価物である結合領域を含む単鎖抗体を含む。ＢＲＭ遺伝子のタンパク質結合領域の「診断的に重要な部分」は、検出すべき状態を対照値から区別するのに充分な領域と定義される。本明細書で用いられる「生体応答調整剤」（biological response modifier、ＢＲＭ）は、種々の外部刺激に対する集約的反応に必要な細胞内シグナル化の多くを媒介する可溶性タンパク質を含む。ＢＲＭは、細胞表面の特異的高親和性レセプターと相互反応する有効な媒介物であるサイトカインを含む。サイトカインは、免疫応答に含まれる全ての細胞タイプの機能に影響を与え、リンパ球産生および造血に関与することが示されている。それらは、多くの病気の病態生理学に関係している。リンフォカインは、本請求の発明において好ましいサイトカインである。本発明において用いられる「転写因子のＮＦ−κＢ／Ｒｅｌファミリー」という表現は、遺伝子の転写を活性化する複数のタンパク質複合体である。ＩK_B、ｐ１０５（ｐ５０の前駆体）、ｐ５０およびｐ６５を含む幾つかのタンパク質は、ＮＦ−κＢの生物学的機能を制御する。ＮＦ−κＢは、全てが類似の一次アミノ酸配列を有し、相同なデカヌクレオチド配列からなる配列に種々の親和性で結合する「Ｒｅｌ関連タンパク質」ファミリーのメンバーである。Ｒｅｌ関連タンパク質は、大部分のホモダイマーおよびヘテロダイマーの組み合わせが可能なので、多数の異なるκＢ結合ダイマー複合体を形成することができる。Ｒｅｌタンパク質ファミリーは、ｐ５０、ｐ５２、ｐ６５、ｖ−Ｒｅｌおよびｃ−Ｒｅｌを含む。本明細書において用いられる「ポリヌクレオチド結合タンパク質」は、ＤＮＡと結合し、それによりｍＲＮＡの生成を活性化または抑制して遺伝子の転写活性を制御するタンパク質または複数タンパク質複合体である。本明細書において用いられる「オリゴヌクレオチドプローブ」は、厳密な条件下でヌクレオチドの配列にハイブリッドするヌクレオチドのセグメントを意味する。本明細書において用いられる「遺伝子のタンパク質結合領域」または「遺伝子の制御要素」は、タンパク質または複数タンパク質複合体と結合し、それによりｍＲＮＡの生成を活性化または抑制することにより遺伝子の転写活性を制御するＤＮＡの領域を意味する。本発明のさらなる目的、特徴および利点は、以下の本発明の詳細な説明から明白である。詳細な説明癌における免疫応答の変化のプロセスは、ＴＣＲの構造の変化、およびＮＦ− κＢのような核転写因子の変化を含む。全てのこれらの変化は、腫瘍の存在下のＴヘルパー細胞が細胞性応答を促進するＴｈ１反応から体液性応答を促進するＴｈ２反応にシフトするという解釈を支持する。Ｔｈ０、Ｔｈ１またはＴｈ２細胞により生み出される免疫応答は、矯正することが要求される病気の状態になることがあり得る。しかしながら、腫瘍を有する動物または癌患者に存在するＴｈ０、Ｔｈ１またはＴｈ２細胞のタイプが正常でなく、ＴＣＲで見られる主要な変化が与えられることもあり得る。従って、これらの細胞は、本明細書においてＴｈ２’と示される。腫瘍を有するマウスの血清は、Ｔｈ２反応を示す正常なマウスと比較してＩＬ −４およびＩＬ−１０濃度の増加を示す。さらに、ＢＲＭのための遺伝子のタンパク質結合領域を含むオリゴヌクレオチドプローブに結合するタンパク質の独自のパターンが、Ｔｈ１およびＴｈ２クローンにおいて生じる。例えば、γＩＦＮのプロモーター領域からの３２塩基対プローブを用いて結合パターンが決められた。このパターンを、正常マウス、１８日間腫瘍を有するマウスおよび長期間腫瘍を有するマウス（ＭＣＡ−３８結腸癌）からのＣＤ４⁺ヘルパー細胞および娘Ｔ細胞において試験した。正常状態において見られたパターンは、Ｔｈ１クローンのものあっていた。対照的に、腫瘍を有するマウスのパターンは、Ｔｈ２細胞のものにあっていないが、それにもかかわらず正常なＴｈ１タイプのパターンのものと完全に異なっていた。腫瘍を有するマウスからのＴｈ２細胞（すなわちＴｈ２’細胞）は、２通り以上に変化し得る。ＤＮＡに結合するタンパク質のパターンは、Ｔｈ１からＴｈ２へのシフトを同定するのに有用である。さらに、Ｔｈ１からＴｈ２へのシフトの概念は、プロセスをＴｈ１応答に逆戻しし得る新しい治療手段を開拓する。すなわち、長期間腫瘍を有する患者またはマウスからの細胞を誘導してＴｈ１パターンに逆戻しする in vitroまたはin vivoでの操作または薬剤の性能が、有効な治療薬を選択するためのふるいとして用いられる。同様に、必要な治療結果に依存して、Ｔリンパ球中のＤＮＡのタンパク質結合パターンをＴｈ１またはＴｈ２応答にシフトする療法（化学療法、放射、手術、免疫療法または遺伝子療法）の性能を示すことにより効果的であるかどうかを決めるために、その療法をモニターすることができる。これらの変化は、腫瘍の減少が明確になる前でも生じ得る。このアッセイは、Ｔｈ１／Ｔｈ２の転換のモニター、または免疫応答が重要である他の病気におけるＴｈ０状態の検出に好適である。癌の進行した患者における抗体反応の増加に伴う細胞性免疫応答の損失のプロセスが１９６０年台に記載された。免疫学の最近の知識に基づけば、この変化は、Ｔｈ１応答（ＩＬ−２およびγＩＦＮ）からＴｈ２応答（ＩＬ−４、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）への大いに変化することで説明される。腫瘍を有するマウスの血清において、正常マウスの血清では検出されないＩＬ−４およびＩＬ−１０の量が増加する。同様に正常マウスおよび腫瘍を短期間または長期間有するマウスからの脾臓細胞の培養物は、正常マウスの群が主にＩＬ−２およびγＩＦＮ（Ｔｈ１）を生成することを示している。腫瘍を有するマウスからのＴ細胞は、ＩＬ −２およびγＩＦＮを生成する能力が次第に失われ、その代わりにＩＬ−４を生成する。これらの観察についての同様の説明は、ＮＦ−κＢ分子において大きな変化を誘導する因子または「シグナル」を腫瘍が生成するということである。腫瘍を有するマウスのモデルにおいて、細胞質のｐ５０、ｐ６５およびｒｅｌは正常なままである。しかしながら、核中で見つかるはずの同じ因子は見られず、ｐ５０はｐ４８に取って代わられている。これらタンパク質の核への移動が何らかの手段により遮断される、またはそれらが核のプロテアーゼにより開裂されることがあり得る。ヒトにおいては、主要な変化は、核ｐ５０の濃度の低下を伴う核ｐ６５およびｒｅｌの損失である。通常、ｐ６５／ｐ５０ヘテロダイマーは、ＩＬ−２の生成の刺激剤で、ｐ５０／ｐ５０ホモダイマーは抑制剤であると考えられる。分解、移動の遮断または適当な移動シグナルの欠如の結果として核中にｐ６５が存在しない場合、ｐ５０／ｐ５０ダイマーが好ましく形成される。これは、従って、ＩＬ−２遺伝子を抑制し、ＩＬ−２の生成を低下させる。ＩＬ−２（Ｔｈ１）−ＩＬ−４（Ｔｈ２）の生成が正常に均衡されている場合、ＩＬ−２の生成の減少は、たとえＩＬ−４活性の絶対量が変化しなくともＩＬ−４活性が相対的に増加して、反応が効果的にＴｈ２パターンに変えられることを示す。免疫状態指数の一つの基準は、変化した免疫状態を有する患者において大きく変化するＴリンパ球シグナル伝達経路タンパク質またはＴＣＲサブユニットタンパク質の量の、健康個体および免疫の変化した個体において実質的に変化しないもう一つのタンパク質の量に対する比である。現在は米国特許第5,296,353号である米国特許出願第07/863,262号および米国特許出願第08/034,832号において、正常なマウスおよび２１日より短い期間腫瘍を有していたマウス（初期含腫瘍マウスすなわち初期ＴＢＭ）と比較して、３０日より長い期間ＭＣＡ−３８腫瘍を有していたマウス宿主（後期含腫瘍マウスすなわち後期ＴＢＭ）からの養子転移Ｔリンパ球の治療効果が極めて減少していることが開示された。上記出願を本明細書で引用することによって、その内容を本出願明細書にそのまま組み込むこととする。後期ＴＢＭからのＴリンパ球は、ＣＤ３ζおよびＣＤ３γ鎖のＴＣＲ内への発現を失う。ＣＤ３ζ鎖は、ＴＣＲ中において、鎖のζファミリーのメンバーであるＦｃεγ鎖により取って代わられる。これらリンパ球は、また、Ｓｒｃファミリーのチロシンキナーゼ、特にＬｃＫおよびＦｙｎ、ならびにタンパク質ＰＬＣ γおよびＧＡＰのようなＴリンパ球シグナル伝達経路タンパク質の顕著な減少も示す。一方、ＣＤ３εのＴＣＲ内への組み込みは実質的に変化しない。タンパク質のＴＣＲ内への取り込みのパターンおよびシグナル伝達経路におけるタンパク質の発現における同様の変化が、ヒト癌患者において観察された。従って、免疫状態指数は、既知の量の細胞からＴＣＲ複合体を免疫沈降させることにより決められる。ＣＤ３ζ、ＣＤ３γまたはＦｃεγのような免疫状態の変化した患者において大きく変化するＴＣＲ複合体内に取り込まれたＴＣＲサブユニットタンパク質の量の、ＣＤ３εまたはＴＣＲαβのような健康な個体および免疫の変化した個体において実質的に変化のないもう一つのＴＣＲタンパク質の量に対する比が、免疫状態指数を構成する。もう一つの説明的態様において、免疫状態指数は、ＬｃＫ、ＦｙｎまたはＰＬＣγのような免疫状態の変化した患者において大きく変化するＴリンパ球シグナル伝達経路タンパク質の量の、ＣＤ３εまたはＴＣＲαβのような健康な個体および免疫の変化した個体において実質的に変化のないもう一つのＴＣＲタンパク質の量に対する比をなす。もう一つの免疫状態指数は、免疫状態の変化した患者において大きく変化するＢＲＭの量の、健康な個体および免疫の変化した個体において実質的に変化のないもう一つのタンパク質の量に対する比である。このタイプの免疫状態指数は、例えば、Ｔｈ１タイプのＢＲＭの量のＴｈ２タイプのＢＲＭの量に対する比である。例えば、免疫状態指数は、Ｔｈ１リンフォカイン／Ｔｈ２リンフォカインの比である。さらに具体的には、免疫状態指数は、ＩＬ−２／ＩＬ−４、γＩＦＮ／ＩＬ−４またはＩＬ−２／ＩＬ−１０等の比である。もう一つの免疫状態指数は、特定のＮＦ−κＢ／ｒｅｌタンパク質の細胞質の量の核の量に対する比、または、免疫状態の変化した患者において大きく変化する特定のＮＦ−κＢ／ｒｅｌタンパク質の量の、健康な個体および免疫の変化した個体において実質的に変化のないもう一つのタンパク質の量に対する比である。米国特許出願第08/034,832号おいて、一部の異常状態では、ｃ−Ｒｅｌ、ｐ６５およびｐ５０が存在しないことが開示されている。上記出願の内容を引用することによって本明細書にそのまま組み込むこととする。別の状態において、一つまたは二つが存在しない、またはタンパク質が核に存在しないが細胞質では存在する。さらに別の異常状態において、新しい形態のタンパク質が、正常状態に存在する形態のタンパク質に取って代わる。例えば、マウスにおけるＲＥＮＣＡ腫瘍およびＭＣＡ−３８結腸腫瘍の存在下に、腫瘍を有さない哺乳動物からのＴリンパ球試料の核の成分であるｐ５０タンパク質が消失し、ｐ４８およびｐ４６（ウエスタンブロットにより決められる推定分子量がそれぞれ４８ｋＤおよび４６ｋＤであるタンパク質）によって取って代わられる。新しいタンパク質の形態の一部は、より大きい形態のＮ末端が切断されたものによって取って代わられる、より大きい分子量の形態に関係するようである。黒色腫患者におけるＮＦ−κＢ／ｒｅｌタンパク質のパターンの分析により、非癌状態からの変化が明らかにされた。ｃ−Ｒｅｌおよびｐ−６５は核試料中には存在しなかった。すなわち、免疫状態指数は、ｐ６５およびｃ−Ｒｅｌの細胞質の量の核の量に対する比である。例えば、ｐ６５およびｃ−Ｒｅｌの細胞質の量の核の量に対する比の決定のためのＥＬＩＳＡ法は、Ｔリンパ球を含む血液のような体液または組織のサンプルの調製を含む。ヒトＴリンパ球の場合、ｐ６５の核への移動を検出するために、抗ＣＤ３抗体と１時間以上恒温に保つなどして、細胞を刺激しなくてはならない。Ｔリンパ球試料中の細胞を、続いて核が完全な状態であるように穏やかに溶解する。完全な核を、例えば低速遠心分離により細胞質成分から穏やかに分離する。例えば、完全な核を含む細胞溶解液を微量プレートウェルに入れ、それらのプレートを低速で、例えば２０００ｒｐｍで５分間遠心分離して完全な核を沈降させる。細胞質の成分を含む上澄みを除去し、別々のウェルに入れる。核を溶解し、核および細胞質画分の各々におけるｐ６５およびｃ−Ｒｅｌの量を定量する。免疫状態指数は、ｐ６５およびｃ−Ｒｅｌの細胞質の量の核の量に対する比である。また、免疫状態指数は、ｐ６５およびｃ−Ｒｅｌの核の量の、もう一つのタンパク質、例えば、健康な個体および免疫の変化した個体において実質的に変化のない核ＭＡＰキナーゼの量に対する比である。核ｐ６５および／またはｃ−ＲｅｌおよびＭＡＰキナーゼの量は、完全な核の精製に続いて決められ、免疫状態指数は、核ｐ６５およびｃ−Ｒｅｌの量の、実質的に変化のないタンパク質の量に対する比として表される。ＴＣＲサブユニットタンパク質、Ｔリンパ球シグナル伝達経路タンパク質、ＮＦ−κＢ／ｒｅｌタンパク質、ＢＲＭ、またはポリヌクレオチド結合タンパク質の量は、多くの異なる従来の良く知られたアッセイ法により決めることができる。血液のような体液または組織のサンプルが患者から単離され、選択されたタンパク質の量が決められる。これらのサンプルは、腫瘍組織、脾臓またはリンパ組織、抹消血液細胞、脳脊髄液、胸膜溢出液および腹水を含む種々の組織から採取される。タンパク質の量を決めるために組織または細胞サンプルのタンパク質抽出液を直接分析する。また、選択されたタンパク質の量を決める前に、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、核細胞画分または細胞質細胞画分を精製する。Ｔ細胞またはＴ細胞サブセットは、ロゼット法とその後のフィコール−ハイペイク（Ficoll^R-Hypaqu e^R）勾配遠心分離、間接パンニング、抗体／補体媒介細胞障害、免疫磁気精製、フローサイトメトリーおよび類似の技術のような種々の従来の任意の技術により精製される。さらに、ＴＣＲは、抗ＣＤ３εのような抗体を用いて免疫沈降される。ＴＣＲを含むサブユニットタンパク質は、当業者に知られた方法によりウエスタンブロットで分析される。タンパク質の量は、免疫蛍光法、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット分析および類似の技術を用いて決められる。任意のこれらの良く知られた技術によるタンパク質の分析のための抽出液は、組織もしくは体液サンプル、またはこれらのサンプルから調製されたＴ細胞もしくはＴ細胞サブセットから従来法により生成される。選択されたタンパク質を特異的に検出し、既知の標識に複合している抗体は、当業者に知られた方法により調製される。患者の免疫状態を決めるキットは、ＴＣＲサブユニット、シグナル伝達経路タンパク質、ＢＲＭ、ポリヌクレオチド結合タンパク質およびＮＦ−κＢ／ｒｅｌファミリータンパク質を含む群からのタンパク質に対する抗体を含む。別々の容器において、それぞれが本発明の個々のタンパク質に対するものである一またはそれ以上の抗体が存在する。このキットは、特定のタンパク質の存在が推測され定量される、抗原−抗体複合体の形成を検出するための手段も含む。前述の免疫状態指数は、検出された各タンパク質の量に基づいて計算される。リンパ球試料のようなサンプルにおいてタンパク質の存在または量を検出するために、ＥＬＩＳＡで本発明の免疫アッセイ系診断キットが典型的に用いられる。ＥＬＩＳＡは、サンプル中に存在する抗原の量を検出および定量するために、固相に結合している抗体または抗原、および酵素−抗原または酵素−抗体複合物を典型的に用いる酵素結合イムノソルベント検定法を意味する。ＥＬＩＳＡ技術の記載は、Sites et al．(1982)の文献および米国特許第3,654,090号、米国特許第 3,850,752 号および米国特許第4,016,043 号に見つけられる。これらの文献は、引用することによって本明細書にそのまま組み込むこととする。別々の容器内のキット中の適当な試薬は、１．ａ．Ｂ細胞、顆粒球および単球を除去するためのカラムを含む細胞分離のためのキット、ｂ．溶解試薬を含む細胞溶解キット、ｃ．結合した抗体を有するＥＬＩＳＡプレート、またはポリクローナル抗ＣＤ３捕捉Ｉｇ、プローブとしてＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＦｃεγまたはＣＤ３εに対するモノクローナル抗体、アルカリホスファターゼ複合ヤギ抗マウスＩｇの個々のバイアルと、２．ａ．Ｂ細胞、顆粒球および単球を除去するためのカラムを含む細胞分離のためのキット、ｂ．溶解試薬を含む細胞溶解キット、ｃ．遠心分離により核および細胞質画分を分離するためのＥＬＩＳＡプレートへの溶解物の転移、ｄ．結合した抗体を有するＥＬＩＳＡプレート、または、ｐ６５またはｃ− Ｒｅｌに対するマウスモノクローナル抗体およびアルカリホスファターゼ複合ヤギ抗マウスＩｇのようなプローブまたは当業者に良く知られている他の等価プローブの個々のバイアルとを含む。 γＩＦＮ遺伝子のようなＢＲＭ遺伝子のタンパク質結合領域を含むオリゴヌクレオチドプローブへのタンパク質結合パターンを用いて、もう一つのタイプの免疫状態指数を得ることができる。ＢＲＭ遺伝子のタンパク質結合領域を含むオリゴヌクレオチドプローブへのタンパク質結合パターンは、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）のような当業者に良く知られた方法により決められる。No rihisa(1994)を参照。ＢＲＭ遺伝子のタンパク質結合領域を含むオリゴヌクレオチドプローブは、κＢ配列を含まないヌクレオチド配列であり得る。ＢＲＭ遺伝子のタンパク質結合領域を含むオリゴヌクレオチドプローブへのタンパク質結合パターンである免疫状態指数は、Ｔｈ２免疫応答とＴｈ１免疫応答とを区別すること、またはＴｈ２’免疫応答を検出することに好適である。それは、タンパク質結合パターンがこれらの細胞タイプにおいて異なるからである。すなわち、タンパク質結合のこれらのパターンは、個々の反応がＴｈ１、Ｔｈ２またはＴｈ２ ’のいずれのモードであるかを決める方法である。免疫状態指数は、ＢＲＭ遺伝子の制御要素内のヌクレオチドのメチル化状態である。ＢＲＭの制御要素内のヌクレオチドのメチル化状態は、当業者に良く知られた方法により決められる。例えば、制限酵素の標的配列のメチル化状態に感受性のある制限酵素が選択される。標的配列がメチル化されているか否かによって、特定の制限酵素が標的を開裂または開裂し得ず、制限酵素の標的配列を含むヌクレオチド配列を含むハイブリダイゼーションプローブを用いるサザンブロット分析により生成物が検出される。ＢＲＭ遺伝子の制御要素内のヌクレオチドのメチル化状態は、個々の反応がＴｈ１モードであるかＴｈ２モードであるかを決める方法を提供する。より具体的には、γＩＦＮプロモーターのＴＡＴＡ近傍の制御要素内に含まれるＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態は、γＩＦＮ遺伝子の転写に関係する。 γＩＦＮおよびＩＬ−２を生成する二つのヒトＣＤ４⁺クローンおよびマウスＴｈ１クローンにおいて、この部位は完全または部分的に低レベルにメチル化される。これに対して、ＩＬ−４およびＩＬ−５を生成するがγＩＦＮまたはＩＬ−２を生成しないマウスＴｈ２クローンにおいて、この部位は９８％を越えてメチル化される。マウスＴｈ２細胞系を、ＤＮＡのメチル化を抑制する薬剤である５−アザチジンで処理することにより、これらの細胞がγＩＦＮ生成するように転換される。顕著に魅力的な簡便タイプの免疫状態指数は、健康な固体から得られ、密度勾配遠心分離にかけられるＴリンパ球の密度勾配における分布パターンと比較される、患者から得られ、密度勾配遠心分離にかけられるＴリンパ球の密度勾配における分布パターンから導くことができる。免疫状態の変化した個体から得られたＴリンパ球の密度勾配における分布パターンは、健康な個体から得られたＴリンパ球の密度勾配の分布パターンとは大いに異なる。変化した免疫状態の性質次第で、患者はわずかの、またはより多くのＴリンパ球を密度勾配における一またはそれ以上のバンドに有し得る。患者からのＴリンパ球の密度勾配における分布パターンが健康な対照と比較して変化していることは、Ｔリンパ球の寸法および生理学における変化を明示し、患者の免疫状態における変化を診断するものである。密度勾配におけるＴリンパ球の分布パターンにおける変化は、病気のタイプおよび深刻さと関係する。密度勾配におけるＴリンパ球の分布パターンは、患者の回復、すなわち正常免疫状態の回復をモニターするためにも用いることができる。密度勾配におけるＴリンパ球の分布パターンは、免疫抑制を誘導または反作用する化合物のような個体の免疫状態を変化させる化合物を同定するために用いることができる。細胞に穏やかな任意の物質、すなわち細胞を破壊しないまたは膜透過性を大きく変化させる物質を用いて密度勾配を形成することができる。例えば、パーコール（Percoll^R）（ポリビニルピロリドン）、フィコール（Ficoll^R）（スクロースポリマー）、ハイペイク（Hypaque^R）（３，５−ビスアセトアミド−２，４，６− トリヨード安息香酸ナトリウム）、スクロース、デキストランまたは他の糖ポリマーが密度勾配を形成する適当な物質である。密度勾配は連続的または不連続的でよい。その勾配における密度の範囲は、細胞が診断的に意味のある様式で分離する限りにおいて変化させることができる。ヒト抹消血液リンパ球のパーコール(Percoll^R)密度勾配遠心分離により、寸法が密度に関係することが示された。最も密な画分６において健康な個体からのＴリンパ球の大部分が見つかり、密度のより低い画分３において少量のＴリンパ球が見つかった。画分６中の細胞は画分３中のものより大きさが小さい。一方、癌患者において、Ｔリンパ球の大部分が、より大きさが大きく密度の小さい画分３において見つかった。従って、細胞は、蛍光活性化細胞ソート（fluorescence-a ctivated cell sorting、ＦＡＣＳ）のように密度または寸法に基づき分離することができる。免疫状態指数は、密度勾配におけるＴリンパ球の分布パターンにおける変化して表すことができる。また、免疫状態指数は、患者および対照から同じ方法により細胞が単離され、同じ数の細胞が各勾配に適用される限り、特定の密度勾配画分において、細胞の数またはタンパク質の量の比として定量的に表すことができる。さらに、免疫状態指数は、特定の密度勾配画分からのＴリンパ球中におけるＴＣＲサブユニットタンパク質、Ｔリンパ球シグナル伝達経路タンパク質、ポリヌクレオチド結合タンパク質またはＢＲＭの相対量として表すことができる。また、免疫状態指数は、Ｔｈ２タイプのＢＲＭに対するＴｈ１タイプのＢＲＭの比、特定のポリヌクレオチド結合タンパク質の核の量に対する細胞質の量の比、ＢＲＭのための遺伝子のタンパク質結合領域を含むオリゴヌクレオチドプローブへのタンパク質結合パターン、および一またはそれ以上の密度勾配画分からのＴリンパ球中のＢＲＭ遺伝子の制御要素内におけるヌクレオチドのメチル化状態である。患者の免疫状態指数と健康な（対照）個体の免疫状態指数との間の大きな変動は、患者の免疫状態指数が変化していることを示す。滅菌状態における密度勾配遠心分離によるＴリンパ球画分の迅速かつ再現性の高い分離のために必要な材料、および画分中の細胞の免疫状態を決めるための試薬を含む例示的キットが提供される。患者の免疫状態指数を決めるためのキットは、典型的に遠心分離管と、一般に種々の密度を示すパーコール（Percoll^R）の滅菌溶液のような密度勾配の調製のための材料とを含む。キットは、細胞溶解試薬を含む細胞溶解キットを含むことができる。また、キットは、Ｂ細胞、顆粒細胞または単球を除去するためのカラムのような細胞分離のための材料を含む。キットは、密度勾配遠心分離に続いて細胞画分を除去するためのピペットを含んでもよい。キットは、抗ＣＤ３抗体および細胞培養培地のような分離されたＴ細胞画分を刺激するための試薬を含んでもよい。キットは、密度勾配画分中の一またはそれ以上の診断タンパク質の量を決めるための試薬も含むことができる。キットは、結合している抗体を有する一またはそれ以上のＥＬＩＳＡプレート、またはＩＬ−２、ＩＬ−４等のＢＲＭ、ｐ６５、ｃ−Ｒｅｌ、またはｐ５０に対する抗体を含む個々のバイアルを含むことができる。キットは、アルカリホスファターゼ複合ヤギ抗マウスＩｇ、または当業者に良く知られている任意の他のプローブを含むことができる。密度勾配画分中の一またはそれ以上の診断タンパク質の量を決めるための試薬の代わりに、またはそれに加えて、キットは、ＢＲＭ遺伝子のタンパク質結合領域を含むオリゴヌクレオチドプローブへのタンパク質結合パターン、またはＢＲＭ遺伝子の制御要素内におけるヌクレオチドのメチル化状態を決めるための試薬を含むことができる。これらの試薬は、細胞画分から調製された核抽出物のＥＭＳＡ分析において用いるためのオリゴヌクレオチドプローブを含む。また、試薬は、ＢＲＭ遺伝子の制御要素内におけるヌクレオチドのメチル化状態を決めるために一またはそれ以上の制限酵素、およびＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを含むことができる。Ｔリンパ球試料は、脾臓、抹消血液、腫瘍、リンパ節、胸腺等のような任意のＴリンパ球源から得られる。例えば、抹消血液リンパ球は、通常法により得られ、赤血球は溶解により除去される。完全な生細胞が、遠心分離により細胞破片および死細胞から分離される。次に、Ｔ細胞が密度勾配遠心分離、例えばパーコール（Percoll^R）、フィコール(Ficoll^R)またはスクロース中の密度勾配遠心分離にかけられる。健康対照および免疫状態が変化している疑いのある患者からのＴ細胞試料から得られたＴ細胞の分布パターンを、密度勾配遠心分離に従って比較する。免疫状態指数は、先に概説した任意の方法により決められる任意の免疫状態指数の、先に概説した任意の他の方法により決められる任意の免疫状態指数に対する比または他の関係としても表される。免疫状態指数は、前記個々の比の組み合わせでもあり得る。先に概説した任意の方法により決められる患者の免疫状態指数と、同じ方法により決められる健康な個体の免疫指数との間の大きな変動は、患者の免疫状態が変化していることを示す。免疫状態指数は、一般に癌に関する免疫抑制のような免疫抑制を検出しモニターするために使用されると考えられる。免疫状態指数は、患者の治療プランを決めるために使用される。例えば、医師は、患者自身のＴリンパ球の免疫抑制水準を評価するため、およびこれらの細胞を刺激して有効な自己養子免疫治療を行うことのできる成功の可能性を決めるために免疫状態指数を決める。現在は米国特許第5,316,763号である米国特許出願第07/910,835号は、養子免疫治療の方法を開示している。同様に、免疫抑制患者を免疫刺激薬、抗菌薬等で医師がいつ治療すべきかを決めるための補助として免疫状態指数を用いることができる。進行性免疫抑制につながる病気は、白血病、ホジキン病、肺癌、結腸癌、グリオーム、腎細胞癌等を含む多くの異なる組織の癌を含む。進行性免疫抑制は、例えば、らい病、結核、リーシュマニアなど細胞内の感染、例えば敗血症など細胞外の感染、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス等により引き起こされるようなウイルス病因の病気、住血吸虫、マラリア等の寄生中感染を含む非常に多種の感染において観察される。化学療法、放射療法、手術、投薬、免疫療法または他の治療様式あるいは治療様式の組み合わせが、腫瘍または免疫抑制の他の原因の除去に有効である場合、免疫状態指数は正常に戻るはずである。これらの向上は、本発明の方法によりモニターされる。免疫状態指数は、自己免疫の検出およびモニターに好適であると考えられる。例えば、免疫状態指数は、患者の治療プランの決定に好適である。自己免疫応答の形成につながる病気は、狼瘡、自己免疫甲状腺炎、強皮症、リューマチ性関節炎のようなリューマチ性疾患等を含む。免疫状態指数は過剰免疫の検出およびモニターに好適であると考えられる。例えば、免疫状態指数は患者の治療プランの決定に用いられる。以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様の代表例として挙げる。これらの実施例は、発明の範囲をいかなる方法でも限定しないものとされる。本発明の意図および範囲内に留まる限り多くの変更および修正が可能であると解される。例１ ζタンパク質に対する抗体ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が、２つの異なるカギアナカサガイヘモシアニン（Keyhole Limpet Hemocyanin: KLH）と複合させた、ヒトζタンパク質の配列に基づくアミノ酸配列を有するタンパク質に対して作られた。抗体は、現在、カイロンミモトープペプチドシステム（Chiron Mimotopes Peptide Systems）と呼ばれる複ペプチドシステムにより調製された。ペプチド１のアミノ酸配列は、ＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＣ−ＮＨ２（配列番号１）であった。ペプチド１に対する抗体を以下に示す。ポリクローナル抗体：ＡＢ７０〜９２Ａモノクローナル抗体：ＭＡＢ３〜９２Ａ。ペプチド２のアミノ酸配列は、ＤＴＹＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲＣ−ＮＨ２（配列番号２）であった。ペプチド２に対する抗体を以下に示す。ポリクローナル抗体：ＡＢ７０〜９２ＢまたはＯｎｃｏζ１モノクローナル抗体：ＭＡＢ１２〜９２。以下のプロトコールによりポリクローナル抗体を調製した。ヘテロ二官能架橋剤ＭＢＳ（マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を用いて、ペプチド１部に対してＫＬＨＩ部(w/w)の割合で、5mgの精製ペプチドを末端システインチオールを介してＫＬＨに結合した。宿主は、６〜12月齢のニュージーランド白ウサギであった。ペプチドをＰＢＳ緩衝液（3.1mg/ml）に懸濁させ、等体積のフロイントアジュバントと混合して乳化し、免疫処置当たり合計0. 6ml（複合物1.0mg、ペプチド0.50mg）となるように5〜6箇所の背側皮下投与部位に注射した。動物を耳の静脈から出血させ、血液を37℃で1 時間加熱し、0 ℃で 15時間冷却し、遠心分離した。血清を -20℃で貯蔵した。１、46、49および53日目に、それぞれ、免疫前の血液、第１血液、第２血液および第３血液をつくった。免疫処置の効果のコントロールとして、免疫前の血清および第１血液を、ＫＬＨでコートしたＥＬＩＳＡにより試験した。全ての血清について、遊離ペプチドをコートした（100ピコモル/ウェル）ＥＬＩＳＡにより抗ペプチド抗体力価を決めた。使用前に、当業者に良く知られている方法を用いて合成精製ペプチドが付着したカラムでポリクローナル抗体を親和精製した。モノクローナル抗体を、米国特許第5,246,831に記載されているように調製した。本引用文献は引用することによって本明細書にそのまま組み込むものとする。抗 ζモノクローナル抗体の選択のために用いた基準は、以下の如くである。第１の融合において、抗原に対する検出できる抗体を生成する全てのハイブリドーマを選択した。この試験目的のために、ペプチド抗原をＥＬＩＳＡプレートのマイクロリッターウェルに吸収させた。全ての陽性の融合培養物の体積を増やし、同じ方法で再試験した。モノクローナル性を確実にするためのサブクローニングのために、ＥＬＩＳＡにより最も高いＯＤ値を有する約５個の培養物を選択した。続いて、得られたサブクローンを、最初のスクリーンと同じ方法で試験し、全ての陽性サブクローンを検出した。陽性のサブクローンを再度増殖させ、再試験し、ＥＬＩＳＡにより最も高いＯＤ値を有する培養物を選択した。最後に、最も高いＯＤ値を有する５つの増殖したサブカルチャーを、腹水形成のためにマウスに注入するために増殖させた。従って、ＭＡＢ３〜９２ＡおよびＭＡＢ１２〜９２と同じ抗原結合特性を有する他のモノクローナル抗体を調製することは、過度の実験をすることなく、充分に当業者の技術水準内のことである。例２ＣＤ３εおよびζタンパク質のためのＥＬＩＳＡアッセイ抹消血液細胞（ＰＢＬ）またはヒトＴ細胞系の界面活性剤溶解物中に含まれるＣＤ３ε鎖を、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにより決めた。0.5%トリトンＸ −１００（TritonX-100 Sigma）または1.0％ジギトニン(Wako BioProducts)を含む溶解緩衝液（50mMのHepes pH7.4，150mMのNaCl，1mMのオルトバナジン酸ナトリウム,1mMのEDTA，10μg/mlのロイペプチン，10μg/mlのアプロチニン）の10μ lに対して1 ×10⁶の／濃度で細胞を再懸濁させることにより、細胞の界面活性剤溶解物を調製した。氷上で30分間保った後、懸濁液を14,000rpm で5 分間遠心分離した(Eppendorf Microcentrifuge Model 5415C)。最初に、親和精製したウサギポリクローナル抗ＣＤ３ε抗体（dako，カタログ＃ A452）をコートした96ウェルプレート(Nunc MaxiSorp)上にＣＤ３ε複合体が捕捉された。次に、別のエピトープを認識するマウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体(Coulter，ＯＫＴ３)を用いて、抗体結合複合体を検出した。マウス抗体の結合を、アルカリホスファターゼと複合したヤギ抗マウスＩｇ試薬(Southern Biot ech，カタログ＃ 1010 〜04)を用い、続いてアルカリホスファターゼの基質であるリン酸ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰＰ，Sigma，カタログ＃ 2765）を添加して検出した。 100 μl/ウェルのウサギ抗ＣＤ３εとリン酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）中5 μg/ml の濃度で4 ℃で一晩保温することにより、96ウェルプレートを一次抗体でコートした。プレートの内容物を払い落とすことにより抗体溶液を除去し、2%w/v 乾燥脱脂ミルクを含む200 μl/ウェルのＰＢＳでプレートを4 ℃で2 時間保温して吸収部位をブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、プレートを150 μl/ウェルのＰＢＳで2 回洗った。細胞溶解物を適当なウェルに添加し、4 ℃で1 時間保温した。プレートを150 μlのＰＢＳで5 回洗い、続いて、100 μl/ウェルの二次マウス抗ＣＤ３試薬（ミルク0.2%を含むＰＢＳ中5 μg/ml）を添加した。4 ℃で30分間保温した後、プレートを再度、150 μlのＰＢＳで５回洗った。アルカリホスファターゼ複合ヤギ抗マウスＩｇ試薬（100μl/ウェルのミルク0.2%を含むＰＢＳ中1:500に希釈した希釈液）を添加し、プレートを4 ℃でさらに30分間保温した。5 回洗浄後、ｎＮＰＰ基質(10%ジエタノールアミン中1mg/mlのものを100 μl，240μMのMgCl₂， pH9.8）を各ウェルに添加した。プレートを37℃で30〜60分間保温した。バイオ−テック・モデルＥＬ３１２ｅマイクロプレートスペクトロフォトメーター（Bio-Tek Model EL 312e microplate spectrophotometer）で405nm における吸収を読み取った。上記プロトコールにおいて、一次抗体、溶解物または第２の抗体をＰＢＳに置き換えてバックグラウンドとした。免疫蛍光検査に基づきＣＤ３εおよびζの発現に対して陰性のＢ細胞系の界面活性剤溶解液を、さらなる対照として用いた。二つの異なるプロトコールを用いてζタンパク質を測定した。プロトコール１においては、ＣＤ３εおよびζタンパク質を含む界面活性剤可溶化複合体を捕捉するためにプレート上にウサギ抗ＣＤ３ε（dako，＃ A452）を用いた。次に、マウスモノクローナル抗ζ試薬(Coulter，ＴＣＲ−ζ，カタログ＃ 6604592）およびアルカリホスファターゼ複合ヤギ抗マウスＩｇを用いて、抗体結合ζタンパク質の量を測定した。プトロコール２においては、マウスモノクローナル抗ζ抗体(Coulter，ＣＤ３ ζ）を用いて、界面活性剤可溶化ζタンパク質を直接捕捉し、続いて、ウサギポリクローナル抗ζ抗体およびアルカリホスファターゼ複合ヤギ抗ウサギポリクローナル抗体(Southern Biotech，カタログ＃ 4010 〜04）を用いて結合ζを検出した。ウサギポリクローナル抗ζ抗体は、担体タンパク質ＫＬＨに複合したＯｎｃｏζ１であった。このアッセイは、プレートをコートするために一次抗体を5 μg/mlで用い二次抗体(Coulter，ＴＣＲ−ζ)を5 μg/mlまたは粗血清の1:300 希釈で用いて前記ＣＤ３εの場合のように行った。ＣＤ３のＥＬＩＳＡアッセイおよび二つの方法のζに対するＥＬＩＳＡアッセイを用いた典型的結果を表１に示す。三つの全てのアッセイにおいて、正常なヒト抹消血液Ｔ細胞またはＴ細胞系から調製した界面活性剤溶解物は、一次抗体が排除された対照またはζ陰性Ｂ細胞系からの溶解物を用いて得られた値よりはるかに高い吸収値を呈した。ジギトニン溶解緩衝液は、捕捉試薬として抗ＣＤ３を用い検出のために抗ζを用いるＣＤ３−ζ結合の測定についてトリトンＸ−１００より明らかに優れており（ζプロトコール＃１）、一方トリトンＸ−１００溶解物は、捕捉および検出のために二つの抗ζ抗体の組み合わせを用いるζ抗原の測定（ζプロトコール＃２）について僅かに優れているようである。ジギトニンおよびトリトン溶解物緩衝液の両方がＣＤ３アッセイにおいて優れている。二つのζアッセイプロトコール間の相違のための同様の説明は、ジギトニンはζとＣＤ３εとの非共有結合を保存し、トリトンＸ−１００はその解離を引き起し得るということである。二つのζアッセイプロトコールを用いる再に考慮するもう一つの点は、抗ＣＤ３ ε／抗ζプロトコールは、ＣＤ３陽性Ｔ細胞の表面上でζ鎖がＣＤ３と結合する ζ鎖の濃度に注目するが、抗ζ／抗ζプロトコールは、ＣＤ３との結合またはＴ細胞もしくは他のタイプのζ陽性細胞（すなわち、ナチュラルキラー細胞）中での配置にかかわらずζ含量を測定することである。免疫状態指数の目的のために、ＣＤ３に実際に組み込まれたζを測定することが必要である。 ζおよびＣＤ３εアッセイにおける吸収値の比も表１に示す。抹消血液中のＣＤ３陽性Ｔ細胞の割合および細胞当たりのＣＤ３εの量は変化し得るので、この比は、サンプルからのＴ細胞の精製を必要とすることなく、ＣＤ３含量に対して ζ水準を正常化させる都合の良い方法を提供する。大きな割合（10%）で多形核細胞（ＰＭＮ）を含む混合細胞集団へのＣＤ３ε およびζ捕捉ＥＬＩＳＡアッセイの適用は、界面活性剤溶解ステップ中にそのような細胞からプロテアーゼが放たれるために特別の注意が必要である。そのような場合、さらなるプロテアーゼ抑制剤を含む変更した溶解緩衝液が用いられる。そのような抑制剤の例は、大豆トリプシン／キモトリプシン抑制剤（200 μg/ml Sigma）、キモスタチン２００(7μg/ml，Boehringer Mannheim)およびフェニルメチルスルホニルフルオライド(2mM)を含む。表２に示されるように、高い割合でＰＭＮを含む混合物細胞集団（ＲＣ−ＰＢＬサンプル）において、これらの三つのプロテアーゼ抑制剤が、測定可能なζ鎖の量を劇的に増加させ、そのことは、（ＣＤ３鎖と比較して）ζ鎖がタンパク質分解に特に感受性を有することを示している。混合細胞集団（ＲＣ−Ｔサンプル）からのＴリンパ球の精製は、匹敵する効果を有する。例３ＣＤ３εおよびζタンパク質の細胞系免疫アッセイこのプロトコールにおいては、完全な固定細胞を用いる96ウェルマイクロリッタープレートを用いて、ＣＤ３εおよびζタンパク質を測定する。パラホルムアルデヒド、メタノール等の試薬を用い、続いて界面活性剤（ジギトニンまたはトリトンＸＩ００等）で透過処理することにより、マイクロリッタープレートのウェルにリンパ球または他の細胞を固定する。ＣＤ３εまたは興味ある他のタンパク質に対する一次抗体を適当なウェルに添加し、それらの結合をビオチン化された二次抗体試薬、および酵素（アルカリ性ホスファターゼ等）、蛍光分子（ユーロピウム等）または放射性同位体（１２５等）で標識したアビジンプローブを用いて検出する。細胞系免疫アッセイにおいて、各ウェルに50μlのＴ細胞(5×10⁴)を添加し、液体を蒸発させた。細胞を固定し、同時にＰＢＳ中に1%パラホルムアルデヒドおよび0.1%のトリトンＸ１００を含む冷たい溶液で3 分間透過処理した。プレートを振ることにより溶媒を除去し、ブロッキング溶液をプレートに10分間添加した。プレートを振ることによりブロッキング溶液を除去し、適当なウェルに一次抗体（ウサギ抗ＣＤ３ε，DAKO）および1:500 に希釈された親和精製されたウサギ抗ζ（Ｏｎｃｏζ１）を添加し、4 ℃で1 時間保温した。プレートを振って、自動マイクロプレート洗浄器を用いてプレートをＰＢＳで 3 回洗浄することにより非結合抗体を除去した。ウェルに二次抗体（ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ，1:1000）を添加し、4 ℃で30分間保温した。非結合二次抗体を、マイクロプレート洗浄器を用いてプレートをＰＢＳで3 回洗浄することにより除去した。各ウェルにストレプトアビジン−ＥｕＣｌ（Wallac，#1244 〜36 0，1:1000 希釈）を添加し、4 ℃で10分間保温した。非結合ストレプトアビジン −ＥｕＣｌを、マイクロプレート洗浄器を用いてプレートをＰＢＳで3 回洗浄することにより除去した。蛍光性を上げるために、100μlの増強溶液(enhance sol ution，Wallac)，#1244 〜105)を各ウェルに添加し、室温で5 分間保温した。各ウェルの蛍光性を、時間式蛍光測定器(time resolved fluorimeter，Wallac，モデル#1232)で読みとった。表３は、幾つかのＴ細胞集団のＣＤ３εに対するＣＤ３ζの比（時間式蛍光測定器を用いて細胞系免疫アッセイにより決定）が、捕捉ＥＬＩＳＡアッセイ（例２参照）により検出された比に匹敵していたことを示している。例４癌におけるＴｈ１からＴｈ２への転換健康個体、初期ＴＢＭおよび後期ＴＢＭの血清中に存在するＴｈ１タイプおよびＴｈ２タイプのリンフォカインの量を比較した。0.5mlのＨＢＳＳ中に約1×10⁶ のＭＣＡ−３８細胞を含む溶液を、30ゲージ針を用いて6 〜8 週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。腫瘍が次第に増殖し、腫瘍の増殖から１４ないし２６日でマウスは死んだ。血清と刺激された脾臓リンパ球を集めた。健康な非処理対照およびＭＣＡ−３８処理マウスの血清中に存在するＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の量をＥＬＩＳＡにより決定した。腫瘍を有するマウスは、ＩＬ−２およびγＩＦＮを製造する能力を次第に損失し、同時にＩＬ−４およびＩＬ−１０をより多く生成することを示す。ＭＣＡ− ３８処理マウスの血清中のＩＬ−４およびＩＬ−１０の量が増加し、それは正常な健康対照マウスにおいては検出されない（表４）。ＭＣＡ−３８処理マウスにおいて癌が進行するにしたがって、免疫系においてＴｈ１状態からＴｈ２状態へのシフトが生じる。例５ＢＲＭ遺伝子のＤＮＡ結合領域を含むオリゴヌクレオチドプローブへのタンパク質結合パターン電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を用いて、Ｔｈ１（ＡＥ．７）およびＴｈ２（Ｄ１０．Ｇ４１）マウスクローンの核抽出物中に見られるＤＮＡ結合パターンを、ＭＣＡ−３８細胞を投与してから11、18および32日後のＭＣＡ− ３８を有するマウスおよび正常マウスの脾臓ＣＤ４⁺Ｔ細胞の核抽出物中に見られるＤＮＡパターンと比較した。核抽出物は、細胞を1200rpm で5 分間の遠心操作でペレット化し、冷たいリン酸塩緩衝塩水で一度洗い、1mMのＰＭＳＦ、1μg/ml のロイペプチン、プロテアーゼ抑制剤としてアプロチニンＡを含む溶解緩衝液(2 5mMのHepes，pH7.8、50mMのKCl、0.5%のNP40(v/v)、0.1mMのジチオトレイトール )中に再懸濁させて調製した。細胞を、氷上で5 分間培養することにより溶解した。溶解液を2000rpm で5 分間遠心分離し、上澄みを細胞質抽出物として収集し、ペレットを、ＮＰ４０を含まない溶解緩衝液で一度洗った。ペレットを、1mMのP MSFおよび1μg/mlのロイペプチンならびにアプロチニンＡを含む溶離緩衝液(25m MのHepes，pH7.8、500mMのKCl、10%のグリセロール(v/v)、0.1mMのジチオトレイトール)中に再懸濁させた。再懸濁したペレットを、両端を突き合わせた(end-to -end)ミキサーで4 ℃で20分間用いて穏やかに混合した。14000rpmで30分間遠心分離した後、上澄みを収集し、透析緩衝液(25mMのHepes，pH7.8、50mMのKCl、10 %のグリセロール、0.1mMのDDTおよび1mMのPMSF)で2 時間透析した。アリコートをドライアイス／エタノール中で急速凍結し−７０℃で貯蔵した。プローブとして、ヒトγＩＦＮ遺伝子プロモーター領域の配列に対応する³²Ｐ −標識オリゴヌクレオチドを用いた。使用したオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列は以下の通りであった（配列番号３）。５’ＡＡＡＡＣＴＴＧＴＧＡＡＡＡＴＡＣＧＴＡＡＴＣＣＴＣＡＧＧＡＧＡ３’ 20mMのＴｒｉｓ(pH7.5)、60mMのＫＣｌ、4%のフィコール、2mMのＥＤＴＡ、0. 5mMのＤＴＴ、1μgのポリｄＩｄＣおよび非標識競合剤を含む反応緩衝液または上記非標識競合剤のみを含まない上記反応緩衝液(合計体積10μl)中で、核抽出物(タンパク質2 μg)を室温で10分間予め保温することによりアッセイを行った。次に、反応混合物に標識オリゴヌクレオチドプローブを添加し、保温を20分間続けた。44.5mMのトリスボレート(pH8.3)および1mM ＥＤＴＡ緩衝液を用いて4% ポリアクリルアミドゲルにより複合体を分離した。電気泳動後、ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーに晒した。Ｔｈ１およびTｈ２クローンからの核抽出物(タンパク質2 μg)をアッセイに用いた。競合剤(100倍モル過剰)は、非標識オリゴヌクレオチドから構成されたものであった。正常マウスおよびＭＣＡ−３８を18および32日間有するマウスの脾臓ＣＤ４⁺Ｔ細胞からの核抽出物(タンパク質2 μg)を、Ｔｈ１およびＴｈ２核抽出物と同じ方法で検査した。使用した競合剤(100倍モル過剰)は、非標識特異的および非特異的オリゴヌクレオチドであった。Ｔｈ１細胞からの核抽出物を用いるＤＮＡ結合アッセイにおいて、二つの特異的ＤＮＡタンパク質複合体を得た（バンド１および２）。バンド１および２は、Ｔｈ２細胞の核抽出では大きく減少した。さらに、Ｔｈ２核抽出物中においてＴｈ１中には見られない新らしいＤＮＡタンパク質複合体が観察された（バンド３）。正常マウスおよびＭＣＡ−３８を11、18および32日間有するマウスの脾臓ＣＤ４⁺Ｔ細胞からの核抽出物(タンパク質2 μg)を、Ｔｈ１およびＴｈ２核抽出物と同じ方法で検査した。Ｔｈ１細胞のバンド１および２に対応する正常対照マウスからの核抽出物中に二つのＤＮＡタンパク質複合体が観察された。11、18および 32日間ＭＣＡ−３８腫瘍を有するマウスにおいてバンド１および２は次第に減少した。11日間腫瘍を有するマウスでは、Ｔｈ２細胞中のバンド３に対応する第３のＤＮＡタンパク質複合体が観察された。しかしながら、バンド３は、18および 32日間腫瘍を有するマウスにでは、次第に減少した。ＭＣＡ−３８腫瘍を有するマウスにおけるγＩＦＮ遺伝子のタンパク質結合領域の診断的に重要な部分を含むオリゴヌクレオチドプローブへのタンパク質結合パターンは、正常対照マウスにおいて観察されるタンパク質結合のＴｈ１タイプのパターンにも等しくないし、Ｔｈ２細胞のＴｈ２タイプのパターンにも等しくないので、従って、Ｔｈ２’ と表現される。従って、ＢＲＭのための遺伝子のタンパク質結合領域の全てまたは診断的に重要な部分を含むオリゴヌクレオチドプローブへのタンパク質結合パターンを用いて、免疫状態の変化した患者を同定することができる。例６ＢＲＭ遺伝子の制御要素内のヌクレオチドのメチル化状態マウスＴｈ１クローンＤ１．１およびマウスＴｈ２クローンＣＤＣ２５は、Ab ul Abbas博士（ハーバード医科大学）およびDavid Parker博士（マサチューセッツ大学）から提供され、これはＩＡ^dに関してウサギγグロブリンに特異的である。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection，Rockville，MD）から得られるＴｈ２細胞系Ｄ１０．Ｇ４１の派生過程が記載されている。Kaye(1983)を参照。マウスＴｈ１クローンであるクローンＡ．Ｅ７は、Ronald Schwartz博士(国立衛生研究所：ＮＩＨ)から提供され、ハトのチトクロームｃ，Ｈ−２^dに特異的である。クローンＬＶ３Ｍ（Ｔｈ１）はLouis Rizzo博士(国立眼科協会：ＮＥＩ)から提供され、ＫＬＨ，Ｈ−２^dに特異的である。クローンＢ１０（Ｔｈ１）、２Ａ１１（Ｔｈ２）、およびＡ１０９．１（Ｔｈ２）は、それぞれスタフェンテロトキシンＢ（ＳＥＢ），Ｈ−２ｂ、ＳＥＢ／ＫＬＨ，Ｈ−２^d、およびＳＥＢ，Ｈ−２^dに特異的である。全てのマウスＴ細胞クローンを２週間毎に刺激し、使用前には刺激後7 〜10日間休ませた。健康成人ドナーからの抹消血液ＣＤ４Ｔ細胞の直接限界希釈クローニングによりヒトＣＤ４クローンＡＤ−１４およびＡＤ−２０を単離した。抹消血液からＣＤ４Ｔ細胞を単離した。Lewis(1988)を参照。3.1μg/mlのＣｏｎＡ（Pharmaci a，Piscataway，NJ）、0.5ng/mlのＰＭＡ（Sigma，St．Louis，MO）、5U/mlの精製ヒトＩＬ−２(Boehringer Mannheim)、およびKen Grabstein博士（Immunex Co rP）から提供された5ng/ml組換えヒトＩＬ−２が補われているＣＴ．４Ｓ培地(H u-Li(1989)を参照)中の10×10⁵の照射成人抹消血液単球（3000rad）を含む96ウェルの丸底プレートに、ＣＤ４Ｔ細胞をウェル当たり細胞1 〜5 個の濃度で接種した。上部の培地（0.1ml）を、3 〜5 日毎に、培地を含む等体積の新しいＩＬ−２（5U/ml，Boehringer Mannheim）で置き換えた。成長が陽性であるウェルを３週間目に目視で評点し、2 〜3 週間毎にＣｏｎＡ、ＩＬ−２およびフィーダー細胞で刺激することにより12ウェル組織培養プレート内で増殖させた。 γＩＦＮ生成分析のために、2 mMのＬ−グルタミンおよび10%のＦＣＳが補われたＲＰＭＩ培地中1 ×10⁶/ml の濃度で、細胞を培養し、25μlのＣｏｎＡ（Ph armacia）で24時間刺激した。上澄みを収集し、ＥＬＩＳＡによりサイトカイン含量を検査するまで-80 ℃で凍結した。胸腺細胞を、心臓手術を行っている乳児からフィコールハイペイク(Ficoll^R-Hypaque^R)遠心分離により単離した。Lewis( 1991)参照。マウス細胞からのＤＮＡを、グアニジニウムイソチオチアネートを用いて抽出した。Pange(1992)参照。プロテアーゼＫ（200 μg/ml）による消化およびその後のフェノール−クロロホルム抽出により、ＤＮＡをヒト細胞から抽出した。マウスゲノムＤＮＡ(5 または7.5 μg)を50単位のＢａｍＨ１のおよび25単位のＳｎａＢ１で消化するか、または50単位のＢａｍＨ１で消化して、続いてイソプロパノールで沈殿させ、ＭｓｐｌまたはＨｐａＩＩで一晩消化した。ヒトゲノムＤＮＡ（10μg）を50単位のＰｖｕＩＩのおよび25単位のＳｎａＢ１（いずれもBoe hringer Mannheimから得られる制限酵素である）で消化した。ベーリンガーマンハイムＭ緩衝液中、37℃で一晩消化した後、ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけて、マグナグラフ（Magnagraph）ナイロン薄膜（MSI，Westboro，MA）に移し、ＵＶで架橋し、80℃で1 時間焼成した。マウスおよびヒトＤＮＡブロットを、製造者の指示に従って、ニロハイベ（Nylohybe）ハイブリダイゼーション緩衝液（Digene，Inc.，Silver Spring，MD）でハイブリダイゼーションを行った。マウスＤＮＡのサザンブロッドのために、プローブはマウスγＩＦＮ全長ｃＤＮＡからなっていた。ヒトＤＮＡブロットについては、プローブは、第１のエキソンセグメントを含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｕＩヒトγＩＦＮゲノムフラグメントからなっていた。Gray(1982)参照。ＥＭＳＡを標準的条件下に行った。Norihisa(1994)参照。メチル化研究のために、³²Ｐ−標識オリゴヌクレオチドを、製造社が指示するようにＣｐＧメチラーゼー（New English Biolabs）とともに保温した。マウスＴｈ１クローンＡ．Ｅ７およびＴｈ２クローンＤ１０．Ｇ４１を、270 ボルト、960 マイクロファラッドでバイオラッド（BioRad）エレクトロポレーション装置を使用して、エレクトロポレーションによりトランスフェクトした。20 ×10⁶の細胞に40μgのＤＮＡを利用した。エレクトロポレイション後、細胞を一晩放置し、次にプレート結合した抗ＣＤ３で24時間刺激した。48時間後、液体シンチレーションＣＡＴアッセイによりＣＡＴ活性を測定した。Lederer(1994)参照。臨床免疫学サービス（ＰＲＩ／ＤｙｎＣｏｒｐ，ＮＣＩ−ＦＣＲＤＧ）により市販のＥＬＩＳＡ（Endogen，Minneapolis，MN）を利用して、マウスγＩＦＮについて細胞培養上澄みを分析した。ＥＬＩＳＡによるヒトγＩＦＮの測定のため、プレートを、0.05炭酸塩緩衝液（pH9.6）中の5 μg /mlのマウス抗ヒトγＩＦＮｍＡｂ２０Ｂ８（Genetech，South San Francisco，CA）により4 ℃で12 〜24時間コートし、0.5%ＢＳＡおよび0.05% Ｔｗｅｅｎ−２０（ＥＩＡ緩衝液）を用いてＰＢＳでブロッキングした。サンプルを室温で2 時間ウェルに適用した。プレートを、続いて、ウサギ抗ｒｈγＩＦＮ血清（ＥＩＡ緩衝液中1:10000に希釈）（Genetech，South San Francisco，CA）で１時間、およびホースラデイッシュペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ウサギＩｇ（ＥＩＡ緩衝液中1:5000に希釈、 TAGO，Burlingame，CA）とともに保温した。ウエルを、製造者（Kirkegaard and Perry，Gaithersburg，MD）に指示されるようにＴＢＭ基質溶液の添加により発色させ、30〜60分後、プレートリーダーを用いてＯ．Ｄ．650 を決めた。Ｔｈ１クローンはγＩＦＮおよびＩＬ−２を選択的に生成したが、Ｔｈ２クローンはＩＬ−４およびＩＬ−５を選択的に生成した。マウスＴヘルパークローンのサザンブロット分析は以下のことを示した。ＳｎａＢ１部位はγＩＦＮ遺伝子の第１エキソンに丁度近接して位置し、ＤＮＡがＢａｍＨ１およびＳｎａＢ１により切断される場合、ハイブリダイゼーションプローブとしてγＩＦＮのｃＤＮＡを用いるサザンブロット分析により5 kbのＤＮＡフラグメントが示されるはずである。Ｔｈ１およびＴｈ２クローンの各々からのＤＮＡをＢａｍＨ１のみで切断すると、期待される10 kbのγＩＦＮゲノムＤＮＡが示された。Gray(1982)参照。Ｔｈ１クローンＤ１．１およびＡ．Ｅ７からＤＮＡを抽出し、ＳｎａＢ１により完全に切断した。ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、５−プライムフランクにハイブリダイゼーションしないマウス γＩＦＮのｃＤＮＡであるので、単一バンドのみが存在した。ＤＮＡをＴｈ２クローンＤ１０およびＣＤＣ２５から単離し、ＳｎａＢ１で切断されないが、それはＴｈ２クローンにおいて酵素部位がメチル化していないことを示す。二つの更なる独立して単離されたＴｈ１クローン（Ｂ１０およびＬＶ３Ｍ）の制限酵素分析は、Ｔｈ１クローンＤ１．１およびＡ．Ｅ７と同じ制限タパーンを形成した。二つの更なる独立して単離されたＴｈ２クローン（Ａ１０９．１および２Ａ１１）の制限酵素分析は、Ｔｈ２クローンＤ１０．Ｇ４１およびＣＤＣ２５と正確に同じ制限タパーンを形成した。従って、サザンブロット分析は、ＳｎａＢ１部位の低レベルのメチル化とγＩＦＮ発現との関係を示した。 γＩＦＮゲノムＤＮＡ内の他の部位もＴｈ１細胞内において低レベルにメチル化されているか決める場合、二つのＴｈ１クローンおよび二つのＴｈ２クローンからのＤＮＡをＢａｍＨ１およびＭｓｐ１またはＨｐａＩＩ（ＣＣＧＧ認識部位）で消化する。これらの部位はイントロン内に位置せず、５’ＨｐａＩＩ部位は、転写開始部位の約1200bpおよび2600bp上流にある。Ｔｈ１クローンＤ１．１およびＡＥ７からのＤＮＡを、Ｔｈ２クローンＤ１０．Ｇ４１およびＣＤＧ２５からのＤＮＡとは異なってＨｐａＩＩにより消化した。バンドパターンは、Ｔｈ１細胞内ではなくＴｈ２細胞内においてプロモーターから遠い上流部位（最も確からしくは-2600）が低レベルのメチル化を受けたことを示している。さらに、Ｔｈ２ＤＮＡではなくＴｈ１ＤＮＡのＨｐａＩＩ消化物中に存在する0.5kbのバンドは、遺伝子の３’末端における少なくとも2 または3 の部位がＴｈ２細胞ではなくＴｈ１内において低レベルにメチル化された。消化による2 〜3kbのバンドの存在は容易に説明することができないが、ゲノムＤＮＡクローン内に存在するまたは公表されたマウスＩＦＮ−γゲノム配列から予想されない第３イントロン中のＭｓｐ／ＨｐａＩＩ部位の存在に反映され得る。すなわち、全γＩＮＦゲノムＤＮＡの低レベルメチル化はＴｈ１細胞内で起こらず、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞系は特異的なメチル化の差異を示す。ＳｎａＢ１部位の低レベルのメチル化が二つの成人ＣＤ４⁺ヒトＴ細胞クローンＡＤ−１４およびＡＤ−２０におけるγＩＦＮ遺伝子発現にも関係するかどうか決めるために、ヒトＴリンパ球クローンのサザンブロット分析を行った。全ゲノムＤＮＡを、ＣＤ４⁺クローンおよびヒト胸腺細胞から単離した。ＰｖｕＩＩおよびＳｎａＢ１、またはＰｖｕＩＩのうちいずれかで消化した胸腺細胞ＤＮＡは、第１エキソンセグメントを含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｕＩヒトγＩＦＮゲノムフラグメントでプローブしたときに6.7kb の単一バンドを形成した。ＰｖｕＩＩおよびＳｎａＢ１によるＡＤ−１４のＤＮＡの消化により、2.6kb の単一バンドが形成された。ＰｖｕＩＩおよびＳｎａＢ１によりＡＤ−２０のＤＮＡを消化し、続いてＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｕＩフラグメントでハイブリダイゼーションすることにより、2.6 および6.7kb の二つのバンドが形成された。従って、ＣＤ４⁺ ヒトＴ細胞クローンをＳｎａＢ１で切断したが、それはこれらの細胞がγＩＦＮのｍＲＮＡを生成する能力に一致する。抗ＣＤ３抗体で24時間刺激した後のタンパク質分析により、クローンＡＤ−１４およびＡＤ−２０から3890pg/ml および69pg /ml のγＩＦＮが得られたが、全胸腺細胞からは20pg/ml 以下であり、それは生成されたγＩＦＮの濃度とＳｎａＢ１による切断の程度との大まかな関係を示している。これらの結果に基づき、次に、このメチル化部位を含むオリゴヌクレオチドを用いて特定のＤＮＡタンパク質複合体を形成し得るかどうか、およびγＩＦＮプロモーター中のこの部位と相互反応するＤＮＡ結合タンパク質の能力にin vitro でのメチル化が影響を与えるかどうか決めた。マウスＴｈ１クローンＤ１．１からの核抽出物を用いてＥＭＳＡアッセイを実施した。 γＩＦＮ遺伝子プロモーターの配列に対応する³²Ｐ−標識オリゴヌクレオチドをプローブとして使用した。使用したオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列は以下の通りである（配列番号３）。５’ＡＡＡＡＣＴＴＧＴＧＡＡＡＡＴＡＣＧＴＡＡＴＣＣＴＣＡＧＧＡＧＡ３’ これはヒトγＩＦＮプロモーターの-71 〜-40の領域である。この領域は、一つの重要な違いを有するマウスプロモーター（-69 〜-40）の領域に一致する。マウスプロモーターは、-48 および-47 の位置にさらなるＣｐＧジヌクレオチドを含むが、ヒトプロモーターはこの位置にＴＣを含む。すなわち、ヒトプロモーターを使用することにより、オリゴヌクレオチド中のＣＧジヌクレオチドのみがＳｎａＢ１部位に存在する。Ｄ１．１核抽出物中にγＩＦＮのＳｎａＢ１部位を含むオリゴマーにより、少なくとも5 つの特異的複合体が観察された。競合剤として放射性同位元素を含まないオリゴヌクレオチドを添加したときに結合の損失が観察され、Ｓｐ１部位を含むオチゴヌクレオチドを競合剤として添加したときには観察されなかったので、これらの複合体は特異的であるらしい。プレートに結合した抗ＣＤ３で細胞を 18時間処理したとき、複合体の数のいかなる増加も得られなかった。さらに、ＣからＴへの変異は、３つの複合体の低下を招き、それはＣがこれら複合体の形成に役割を果していることを示している。Ｄ１．１細胞のバンド２および３はＡＥ．７およびＤ１０．Ｇ４１細胞のバンド２のダブレットであるようなので、Ｄ１．１細胞の核抽出物において観察されるバンド１〜４は、Ｔｈ１（ＡＥ．７）およびＴｈ２（Ｄ１０．Ｇ４１）において観察されるバンド１〜３に明らかに対応する。Ｔｈ１クローンＤ１．１とＡＥ．７との間のタンパク質結合パターンの相違は細胞培養の結果かも知れない。ＣｐＧのメチル化がタンパク質複合体に影響を与えるか決めるために、市販のＣｐＧメチラーゼを利用してin vitroでオリゴヌクレオチドをメチル化した。５つの複合体のうちの３つの特異的結合がメチル化後に失われた。しかしながら、すべての複合体が失われたのではないことは、この特異的メチル化が、オチゴヌクレオチドとの全てのタンパク質相互作用を全体的に遮断したのではなかったことを示している。Ｓ−アデノシルメチオニンが省略された擬反応においてＤＮＡタンパク質複合体形成の損失が観察されなったので、この抑制はＤＮＡへのメチラーゼ結合の結果ではない。これらの結果は、非メチル化γＩＦＮプロモーターのＴｈ２細胞系への導入が転写活性につながり得ることを示しているので、ＣＡＴ遺伝子に結合している全長γＩＦＮプロモーターは一時的にＴｈ１クローンＡ．Ｅ７およびＴｈ２クローンＤ１０．Ｇ４１内にトランスフェクトされた。Ａ．Ｅ７内へのトランスフェクションは、ｐＣＡＴベクターのみで見られるものより殆ど３倍高いＣＡＴ活性を生じさせ、この活性は細胞の抗ＣＤ３処理により増加しなかった。この同じプラスミドは非常に活性が弱く、Ｔｈ２クローンＤ１０．Ｇ４１内へのトランスフェクション時にも誘導されない。このＤＮＡは一時的トランスフェクションアッセイにおいてメチル化されにくいので、これらの結果は、メチル化の相違に加えて、Ｔｈ２細胞はＴｈ１細胞と比較して特異的ＤＮＡ結合タンパク質における定量的および／または定性的相違を有し得る、および誘導可能なγＩＦＮ遺伝子発現にさらなるタンパク質および制御領域が必要とされるという仮説に一致する。マウスＴ細胞系およびＨｕｔ７８細胞を５−アザシチジンで処理するとこれらの細胞がγＩＦＮを生成する性能を再び得ることになるということが以前に示された。Farrar(1985)、Hardy(1985)参照。Ｔｈ２細胞におけるＤＮＡメチル化の阻害がγＩＦＮ遺伝子発現の活性化につながり得るか否か決めるために、５−アザシチジンで処理する前または後に二つのＴｈ２クローンを抗ＣＤ３で処理し、培養上澄をγＩＦＮについてＥＬＩＳＡで分析した。５−アザシチジン処理は、 48時間後にクローンによるγＩＦＮの抗ＣＤ３に誘導された発現につながり、それはゲノムＤＮＡの特定領域のメチル化がγＩＦＮｍＲＮＡ発現の制御に関与するという仮説に一致する。クローンの一つによるγＩＦＮの生成は、抗ＣＤ３で処理したＴｈ１について観察されるものに匹敵した。ＤＮＡの特定領域のメチル化は、Ｔリンパ球におけるγＩＦＮ遺伝子発現の制御のための重要な機構である。実際に、γＩＦＮを発現するＴｈ−Ｏ細胞がＴｈ −１およびＴｈ２細胞の前駆体であるなら、データは、γＩＦＮ遺伝子のプロモーターの再メチル化が、Ｔｈ２表現型への分化プロセス中の未だ知られていない機構により誘発されることを示している。これらの発見は、γＩＦＮ遺伝子中のＳｎａＢ１部位および／または他の部位におけるＤＮＡのメチル化またはメチル化の欠如が、Ｔ細胞中のγＩＦＮ発現の潜在能力が制御される唯一の機構であることを意味しない。組織特異性および活性化特異性発現の制御に寄与するγＩＦＮ遺伝子の第１イントロンおよびプロモーター中に複数の領域がある。抗ＣＤ３処理の後にＴｈ１クローンであるＡ．Ｅ７においてＣＡＴ活性の増加が観察されないことは、充分なプロモーター活性のためにおそらくイントロン性である他の領域も必要とされることを強く示唆している。遺伝子の特異的領域の脱メチル化は、基本的制御タンパク質の利用性を生み出し、Ｔ細胞の活性化により更なるＤＮＡ結合タンパク質が誘導された後に遺伝子発現を向上させる必要な事項である。さらに、脱メチル化は、γＩＦＮ遺伝子の最大の発現に必要なγＩＦＮ遺伝子座の外側にコードされる転写因子の発現を活性化し得る。Ｔｈ２細胞が、Ｔｈ１細胞において観察されるより高い濃度のタンパク質複合体の一つを含むという観察は、転写リプレッサーを含むおそらく更なるまたは修飾されたタンパク質がプロモーターの特異的領域に結合し、転写を抑制し得ることを示している。従って、免疫状態が変化している患者を確認する方法は、評価すべき患者からのリンパ球試料において、ＢＲＭ遺伝子の制御要素中のヌクレオチドのメチル化状態を決めること、および、一またはそれ以上の健康な個体からのリンパ球試料において、ＢＲＭ遺伝子の前記制御要素中のヌクレオチドのメチル化状態を決めることを含む。患者のリンパ球試料中のメチル化状態が、健康な抗体のリンパ球試料中の前記メチル化状態と比較され、その大きな変動はその患者の免疫状態の変化を示す。例７密度勾配アッセイ当業者に良く知られた方法によりヒト抹消血液リンパ球を得た。抹消血液のサンプル中の赤血球をＳＣＫ緩衝液中で溶解させ、遠心分離により細胞破片を除去した。残っている細胞を、以下の方法により調製した不連続パーコール（Percol l^R）勾配に置いた。2%ウシ胎児血清、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび5mMのＨｅｐｅｓを補ったＲＰＭＩ１６４０中に、勾配の各画分を調製する。培地の浸透圧を280 〜285mOsm/kg H₂Oに調節する。パーコール（Percol l^R）の浸透圧を10倍濃縮ＰＢＳで285mOsm/kg H₂Oに調節する。以下のように、ファルコン（Falcon）２０９５の15ml円錐試験管中で勾配を調製する。画分１、２、３、４、５、６および７の25℃における屈折率は、それぞれ、1. 3432、1.3436、1.3440、1.3443、1.3446、1.3450および1.3470である。 50×10⁶の細胞を勾配の頂上部に混合を避けるように注意深くのせ、管をベックマン（Bechman）ＴＪ−６テーブル遠心分離機において室温にて550gで30分間遠心分離した。遠心分離後、６本の分離したバンドが観察された。画分３（Ｆ３）に少量のＴリンパ球が見られたが、画分６（Ｆ６）に健康個体からのＴリンパ球が多く見られた。画分１（Ｆ１）において単球が多く見られ、画分２（Ｆ２）においてＮＫ細胞およびＬＧＬが多く見られた。Ｆ６細胞を抗ＣＤ３抗体で１時間刺激し、刺激された細胞中の核タンパク質を分析した。刺激されたＦ６細胞の核にはタンパク質ｐ６５およびｃ−Ｒｅｌが検出されたが、刺激されていないＦ６細胞では検出されなかった。刺激されていなＦ６細胞と比べて、刺激されたＦ６細胞の核中にＰ５０タンパク質の量が増加していることが検出された。対照的に、同じ条件下でパーコール(Percoll^R)の密度勾配遠心分離を行った後、ヒト黒色腫および腎細胞癌患者からのＴリンパ球がＦ３に多く見つかった。Ｆ６Ｔリンパ球を抗ＣＤ３で１時間刺激した。これらの患者からの刺激されたＦ６細胞の核では、タンパク質Ｐ６５およびｃ−Ｒｅｌは検出されなかった。同様に、その患者からの刺激されたＦ６細胞の核では、Ｐ５０の量は増加しなかった。従って、免疫状態指数は、密度勾配中のＴリンパ球の分布パターンである。より具体的には、免疫状態指数は、細胞数または全タンパク質により測定されたＦ３中のＴリンパ球のＦ６中のＴリンパ球に対する比である。健康な対照と比較して、患者の密度勾配中のＴリンパ球の分布パターンの変化、またはＦ３／Ｆ６比の変化は、患者の免疫状態指数の変化の診断となる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/564 Ｇ０１Ｎ 33/564 Ｚ 33/68 33/68 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者オチョア，アウグスト・シーアメリカ合衆国、21702 メリーランド、フレデリック、アレッサンドラ・コート 103、＃180 (72)発明者ヤング，ハワード・エイアメリカ合衆国、20878 メリーランド、ゲイザーズバーグ、ストーンブリッジ・ヴュー・ドライヴ 14520 (72)発明者ロンゴ，ダン・エルアメリカ合衆国、21702 メリーランド、ケンジントン、バロル・レイン 9610 (72)発明者ゴーシュ，パリトシュアメリカ合衆国、21702 メリーランド、フレデリック、アシュフォード・コート 200 (72)発明者ロブ，リチャードアメリカ合衆国、08550 ニュー・ジャージー、プリンストン・ジャンクション、ハンティントン・ドライヴ 24 (72)発明者ネヴィル，メアリアメリカ合衆国、08831 ニュー・ジャージー、ジェイムズバーグ、ストーリー・ヒル・ロード 19

Claims

【特許請求の範囲】１．免疫状態の変化した患者を同定する方法であって、ａ．評価すべき患者からのリンパ球試料において、免疫状態が変化した患者のＴＣＲサブユニットにおける組み込みが実質的に変化していないＴＣＲサブユニットタンパク質の量に対する、免疫状態が変化した患者のＴＣＲサブユニットにおける組み込みが異常に多いまたは少ないＴＣＲサブユニットタンパク質の量の比である患者の免疫状態指数を決めるステップと、ｂ．一またはそれ以上の健康個体からのリンパ球試料において、免疫状態が変化した患者のＴＣＲサブユニットにおける組み込みが実質的に変化していない前記ＴＣＲサブユニットタンパク質の量に対する、免疫状態が変化した患者の前記ＴＣＲサブユニットにおける組み込みが異常に多いまたは少ないＴＣＲサブユニットタンパク質の量の比である免疫状態指数を決めるステップと、ｃ．前記患者の免疫状態指数と前記健康な個体の免疫状態指数とを比較し、それらの大きな変動は前記患者の免疫状態の変化を示すものであるステップとを含む方法。２．前記の免疫状態が変化した患者のＴＣＲサブユニットにおける組み込みが異常に多いまたは少ない前記ＴＣＲサブユニットタンパク質がＣＤ３ζまたはＦｃεγである請求項１に記載の方法。３．免疫状態が変化した患者のＴＣＲサブユニットにおける組み込みが実質的に変化していない前記ＴＣＲサブユニットタンパク質がＣＤ３εまたはＴＣＲα βである請求項１に記載の方法。４．免疫状態の変化した患者を同定する方法であって、ａ．評価すべき患者からのリンパ球試料において、免疫状態が変化した患者の実質的に変化していないタンパク質の量に対する、免疫状態が変化した患者の異常に多いまたは少ないＴリンパ球シグナル伝達経路タンパク質の量の比である患者の免疫状態指数を決めるステップと、ｂ．一またはそれ以上の健康個体からのリンパ球試料において、免疫状態が変化した患者の実質的に変化していない前記Ｔリンパ球シグナル伝達経路タンパク質の量に対する、免疫状態が変化した患者の異常に多いまたは少ない前記Ｔリンパ球シグナル伝達経路タンパク質の量の比である免疫状態指数を決めるステップと、ｃ．前記患者の免疫状態指数と前記健康な個体の免疫状態指数とを比較し、それらの大きな変動は前記患者の免疫状態の変化を示すものであるステップとを含む方法。５．免疫状態が変化した患者の異常に多いまたは少ない前記Ｔリンパ球シグナル伝達経路タンパク質がＬｃｋまたはＰＬＣγである請求項４に記載の方法。６．免疫状態が変化した患者の実質的に変化していない前記タンパク質が、免疫状態が変化した患者のＴＣＲサブユニットにおける組み込みが実質的に変化していないＴＣＲサブユニットタンパク質である請求項４に記載の方法。７．免疫状態が変化した患者のＴＣＲサブユニットにおける組み込みが実質的に変化していない前記ＴＣＲサブユニットタンパク質が、ＣＤ３εまたはＴＣＲ αβである請求項６に記載の方法。８．免疫状態の変化した患者を同定する方法であって、ａ．評価すべき患者からのリンパ球試料において、免疫状態が変化した患者の実質的に変化していないタンパク質の量に対する、免疫状態が変化した前記患者の異常に多いまたは少ない生体応答調節剤（ＢＲＭ）の量の比である前記患者の免疫状態指数を決めるステップと、ｂ．一またはそれ以上の健康個体からのリンパ球試料において、免疫状態が変化した患者の実質的に変化していない前記タンパク質の量に対する、免疫状態が変化した患者の異常に多いまたは少ない前記ＢＲＭの量の比である免疫状態指数を決めるステップと、ｃ．前記患者の免疫状態指数と前記健康な個体の免疫状態指数とを比較し、それらの大きな変動は前記患者の免疫状態の変化を示すものであるステップとを含む方法。９．免疫状態が変化した患者の異常に多いまたは少ない前記ＢＲＭが、ＩＬ− ２、γＩＦＮ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２からなる群より選択される請求項８に記載の方法。１０．免疫状態が変化した患者の実質的に変化していない前記タンパク質が、免疫状態が変化した患者のＴＣＲサブユニットにおける組み込みが実質的に変化していないＴＣＲサブユニットタンパク質である請求項９に記載の方法。１１．免疫状態が変化した患者のＴＣＲサブユニットにおける組み込みが実質的に変化していない前記ＴＣＲサブユニットタンパク質が、ＣＤ３εまたはＴＣＲαβである請求項１０に記載の方法。１２．免疫状態の変化した患者を同定する方法であって、ａ．評価すべき患者からのリンパ球試料において、Ｔｈ２タイプＢＲＭの量に対するＴｈ１タイプＢＲＭの量の比である前記患者の免疫状態指数を決めるステップと、ｂ．一またはそれ以上の健康個体からのリンパ球試料において、Ｔｈ２タイプＢＲＭの量に対するＴｈ１タイプＢＲＭの量の比である免疫状態指数を決めるステップと、ｃ．前記患者の免疫状態指数と前記健康な個体の免疫状態指数とを比較し、それらの大きな変動は前記患者の免疫状態の変化を示すものであるステップとを含む方法。１３．前記Ｔｈ１タイプＢＲＭがＩＬ−２またはγＩＦＮであり、Ｔｈ２タイプＢＲＭがＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０からなる群より選択される請求項１２に記載の方法。１４．免疫状態の変化した患者を同定する方法であって、ａ．評価すべき患者からのリンパ球試料において、免疫状態が変化した患者の実質的に変化していないタンパク質の量に対する、免疫状態が変化した患者の異常に多いまたは少ないＤＮＡ結合タンパク質の量の比である患者の免疫状態指数を決めるステップと、ｂ．一またはそれ以上の健康個体からのリンパ球試料において、免疫状態が変化した患者の実質的に変化していない前記タンパク質の量に対する、免疫状態が変化した患者の異常に多いまたは少ない前記ＤＮＡ結合タンパク質の量の比である免疫状態指数を決めるステップと、ｃ．前記患者の免疫状態指数と前記健康な個体の免疫状態指数とを比較し、それらの大きな変動は前記患者の免疫状態の変化を示すものであるステップとを含む方法。１５．前記の免疫状態が変化した患者の異常に多いまたは少ないＤＮＡ結合タンパク質の前記量が、前記リンパ球試料における細胞の核または細胞質画分について決められる請求項１４に記載の方法。１６．免疫状態が変化した患者の異常に多いまたは少ない前記ＤＮＡ結合タンパク質がＮＦ−κＢまたはｒｅｌである請求項１４に記載の方法。１７．免疫状態が変化した患者の実質的に変化していない前記タンパク質が、免疫状態が変化した患者のＴＣＲサブユニットにおける組み込みが実質的に変化していないＴＣＲサブユニットタンパク質である請求項１４に記載の方法。１８．免疫状態が変化した患者のＴＣＲサブユニットにおける組み込みが実質的に変化していない前記ＴＣＲサブユニットタンパク質が、ＣＤ３εまたはＴＣＲαβである請求項１７に記載の方法。１９．免疫状態の変化した患者を同定する方法であって、ａ．評価すべき患者からのリンパ球試料において、前記リンパ球試料における細胞の核におけるＤＮＡ結合タンパク質の量に対する前記リンパ球試料における細胞の細胞質における前記ＤＮＡ結合タンパク質の量の比である前記患者の免疫状態指数を決めるステップと、ｂ．一またはそれ以上の健康個体からのリンパ球試料において、前記リンパ球試料における細胞の核における前記ＤＮＡ結合タンパク質の量に対する前記リンパ球試料における細胞の細胞質における前記ＤＮＡ結合タンパク質の量の比である免疫状態指数を決めるステップと、ｃ．前記患者の免疫状態指数と前記健康な個体の免疫状態指数とを比較し、それらの大きな変動は前記患者の免疫状態の変化を示すものであるステップとを含む方法。２０．前記ＤＮＡ結合タンパク質がＮＦ−κＢまたはｃ−ｒｅｌである請求項１９に記載の方法。２１．免疫状態の変化した患者を同定する方法であって、ａ．評価すべき患者からのリンパ球試料において、ＢＲＭのための遺伝子のタンパク質結合領域の全てまたは診断的に意味のある部分を含むオリゴヌクレオチドプローブへのタンパク質結合パターンを決めるステップと、ｂ．一またはそれ以上の健康個体からのリンパ球試料において、ＢＲＭのための前記遺伝子のタンパク質結合領域の全てまたは診断的に意味のある部分を含むオリゴヌクレオチドプローブへのタンパク質結合パターンを決めるステップと、ｃ．患者のリンパ球試料における前記オリゴヌクレオチドプローブへの前記タンパク質結合パターンと、健康な個体のリンパ球試料における前記オリゴヌクレオチドプローブへの前記タンパク質結合パターンとを比較し、それらの大きな変動は前記患者の免疫状態の変化を示すものであるステップとを含む方法。２２．前記ＢＲＭが、γＩＦＮＮ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２からなる群より選択される請求項２１に記載の方法。２３．前記リンパ球試料が、脾臓組織、抹消血液、腫瘍組織、リンパ腺組織、脳脊髄液、胸膜溢出液および腹水からなる群より選択される組織または体液から調製される請求項２１に記載の方法。２４．前記オリゴヌクレオチドプローブが下記のＤＮＡ配列、５’ＡＡＡＡＣＴＴＧＴＧＡＡＡＡＴＡＣＧＴＡＡＴＣＣＴＣＡＧＧＡＧＡ３’ を有する請求項２２に記載の方法。２５．免疫状態の変化した患者を同定する方法であって、ａ．評価すべき患者からのリンパ球試料において、ＢＲＭ遺伝子の制御要素内のヌクレオチドのメチル化状態を決めるステップと、ｂ．一またはそれ以上の健康個体からのリンパ球試料において、前記ＢＲＭ遺伝子の制御要素内のヌクレオチドのメチル化状態を決めるステップと、ｃ．患者のリンパ球試料における前記メチル化状態と健康な個体のリンパ球試料における前記メチル化状態とを比較し、それらの大きな変動は前記患者の免疫状態の変化を示すものであるステップとを含む方法。２６．ＢＲＭ遺伝子の前記制御要素内の前記ヌクレオチドが、ヒトγＩＦＮ遺伝子のＴＡＴＡ近傍の制御要素内に含まれるＣｐＧジヌクレオチドである請求項２５に記載の方法。２７．免疫状態の変化した患者を同定する方法であって、ａ．評価すべき患者からのリンパ球試料において、密度勾配遠心分離後の密度勾配におけるＴリンパ球の分布パターンを決めるステップと、ｂ．一またはそれ以上の健康個体からのリンパ球試料において、密度勾配遠心分離後の密度勾配におけるＴリンパ球の分布パターンを決めるステップと、ｃ．前記患者のＴリンパ球分布パターンと前記健康な個体のＴリンパ分布パターンとを比較し、それらの大きな変動は前記患者の免疫状態の変化を示すものであるステップとを含む方法。２８．前記分布パターンが、画分６におけるＴリンパ球の合計数に対する画分３におけるＴリンパ球の合計数の比である請求項２７に記載の方法。２９．前記分布パターンが、画分６における全タンパク質に対する画分３における全タンパク質の比である請求項２７に記載の方法。