JPH10504725A - 糠尿病の治療におけるトランスジェニック魚 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトインスリンを分泌するように改変されたヒト化インスリン遺伝子を含有するトランスジェニック魚、および糖尿病の治療におけるその使用に関する。本発明のトランスジェニック魚において、魚インスリン遺伝子は、魚インスリン遺伝子の制御配列を完全なままにして、ヒトインスリン遺伝子をコードするように修飾されている。ランゲルハンス島移植は、糖尿病の治療に必要な綿密な血糖値の制御を可能にする。本発明のランゲルハンス島組織は、ヒトインスリン産生組織の安価でほとんど無制限の供給源を与え、従って糖尿病の治療に有用である。この点で、ランゲルハンス島組織の大量単離の改良方法が本発明により提供される。本発明はまた、魚中での成長を促進するためのヒト化インスリン遺伝子の使用を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 糖尿病の治療におけるトランスジェニック魚 技術分野 本発明は、ヒト化インスリンを分泌するように改変された修飾インスリン遺伝 子を含有するトランスジェニック魚に関する。本発明はさらに、糖尿病の治療に おけるトランスジェニックランゲルハンス島の異種移植(xenotransplantation) 、および魚のランゲルハンス島の大量単離の改良法に関する。 発明の背景 糖尿病は、罹患率と死亡率の高い疾患である。米国において糖尿病に関する直 接または間接コストの年間の合計は、９００億ドルを超える。インスリン依存性 糖尿病（ＩＤＤＭ）は、非ＩＤＤＭより若年者で発症するため、これらのコスト の比率が異常に高い。ＩＤＤＭの急性症状は、毎日インスリン注射を行うことに より防止できるが、多くの患者は最終的に、盲目、腎症、神経症、微小血管障害 、および心血管疾患などの後遺症を発症する。血糖症を綿密に制御することで、 これらの後遺症を防止または最小にできることを示唆する多くの証拠がある。 糖尿病治療のより生理学的な方法は、膵臓またはランゲルハンス島の移植であ る。ヒトで膵臓の全部または一部の移植が成功しており、いくつかの予備的な証 拠は、この技術がヒトの糖尿病の後遺症を防止することができることを示唆して いる。しかし膵臓移植というのは、大きな手術であり、外分泌物の排出の問題が あり、一生免疫抑制療法を続ける必要がある。一方ランゲルハンス島移植には、 いくつかの理論的利点がある（特に、手術が簡単であること、外来性の外分泌組 織がないこと、および単離されたランゲルハンス島が低温保存できること）。さ らに重要なことは、ランゲルハンス島はより免疫改変をし易いことである。ラッ トやマウスで、持続的な免疫抑制を引き起こすことなく同種移植片の生存期間を 引き延ばすために種々の方法が開発されている。多くの免疫抑制剤はある程度は ランゲルハンス島に対して毒性であるため、最終的にはヒトで持続的な免疫抑制 を引き起こすことなくランゲルハンス島を移植する能力が、必要となるであろう 。 ランゲルハンス島の大量単離方法の最近の改良や最近のいくつかの臨床報告は 、ランゲルハンス島移植がＩＤＤＭの現実的な治療法になろうとしていることを 示唆している。しかし、いくつかの障害もある。まず第１に、ランゲルハンス島 はヒトの膵臓のわずか２％を占めるに過ぎず、ヒトの「ランゲルハンス島単離」 方法の収率は変動が大きく、１回の移植に必要なランゲルハンス島を得るのに、 しばしば数人の供与者の膵臓が必要である。第２に、ランゲルハンス島の同種移 植片拒絶は、従来法で管理するのは困難であり、残念なことにランゲルハンス島 同種移植片の大部分はすぐ失われることである。第３に、莫大な数のＩ型糖尿病 患者を治療するのに必要なヒト供与者の膵臓が不充分であることである。従って ランゲルハンス島移植を広範に実施するには、臨床的ランゲルハンス島異種移植 技術の開発が必要であろう。 この目的のために多くの医療関連会社が、数百万ドルを使って「バイオ人工膵 臓」技術（すなわち、ランゲルハンス島組織の微小カプセル化、または巨大カプ セル化）を開発し特許を取っている。これらの方法の基本的な考え方は、免疫細 胞や抗体が移植片を傷害するのを防ぐのに充分小さいが、インスリン、酸素、グ ルコース、および栄養物質が自由に通過するには充分大きい孔径を有する膜によ り、ランゲルハンス島組織が免疫系から保護されるということである。 過去数年間いくつかの臨床的ランゲルハンス島移植センターは、大きな動物を 供与体として用いて実験的ランゲルハンス島異種移植モデルを開発するために多 大の努力をしてきた。これらの研究の多くは、ブタ、ウシ、イヌ、またはヒトで ない霊長類のランゲルハンス島を対象としてきた。しかし、これらの種の膵臓は ヒトの膵臓のように、繊維性であり、完全な生きたランゲルハンス島細胞を容易 には大量に産生しない。さらに、大きな動物からランゲルハンス島調製物を作成 するのは、高価であり、ランゲルハンス島の収率は変動する。 我々は、ランゲルハンス島供与体として、硬骨魚であるテラピア（tilapia） を用いてランゲルハンス島異種移植のためのユニークな動物モデルを開発した（ １）。ブロックマン小体（Brockmann bodies）（ＢＢｓ）と呼ばれる、ある硬骨 魚中のランゲルハンス島組織は、その膵臓外分泌組織とは解剖学的に分離してお り、肉眼で容易に識別できる。哺乳動物膵臓からランゲルハンス島組織を得る 時に必要となるような高価なランゲルハンス島単離方法は不要である。ＢＢｓは 、メスやピンセットで簡単に採取できる。我々は、テラピアランゲルハンス島を 糖尿病ヌードマウスに移植すると、長期間の正常な血糖値が得られ、哺乳動物様 のグルコース負荷曲線を示すことを証明した（２）。 硬骨魚インスリンは、ヒトの糖尿病患者の維持に使用されている（１）。しか し、硬骨魚インスリンの免疫原性が、ＢＢ異種移植の臨床応用を妨げる可能性が ある。一方そのＢＢｓがヒト化インスリンを産生するトランスジェニック魚の産 生は、この問題を避けることができるかも知れない。ヒト化インスリンを生理学 的に分泌するＢＢｓを産生するトランスジェニック魚は、バイオ人工膵臓技術や カプセル化技術の改良と組合せれば、ヒトの膵臓供与者やランゲルハンス島単離 法の必要性が排除できるであろう。 最近までＢＢｓは、層流フード内で解剖顕微鏡で見ながら顕微解剖により用手 法で採取されてきた（３）。これは、げっ歯類からランゲルハンス島を採取する 標準的方法より、はるかに容易で安価であったが、時間がかかり面倒な作業であ った。マウスで異種移植を行うのに充分なランゲルハンス島を採取することは容 易であったが、この方法は、臨床応用や大量の動物試験で必要になるような大量 のランゲルハンス島組織を採取するにはあまり適さなかった。さらに顕微解剖で は、供与体の魚のランゲルハンス島組織の５０％未満（すなわち、肉眼で容易に 見えるもののみ）しか採取することができない。従ってＢＢｓを採取するための より効率的な方法の開発は、臨床的および実験的使用のための供給源として将来 魚のランゲルハンス島を使用するために決定的に重要である。我々は最近大量採 取法を開発した（４）。 今日までトランスジェニック魚の技術は、成長が速く逆境に耐える強い魚の産 生に使用されてきた（５〜６）。これらの試みの大部分は、成長ホルモントラン ス遺伝子の挿入に向けられてきた。別の方法は、非常に低温の水に耐えることが できる種（すなわち、ウィンターフラウンダー（winter flounder ））からの抗 凍結遺伝子を他の種に挿入して、冷水中で単に生きているだけでなく活動できる ようにすることである。この方法は、より北方の地方での水産養殖を可能にし、 水産養殖種を夏の成長季節のみでなく１年中増殖させることが可能になる。 これまでのトランスジェニック魚の研究で、インスリン遺伝子を対象にしたも のはない。魚ではインスリンは成長ホルモンであるが、哺乳動物ではインスリン は主にグルコース恒常性ホルモンである（７）。従って、魚のインスリン遺伝子 の発現および／または構造を改変すれば、成長を増強する可能性が高い。その結 果改変魚インスリン遺伝子を発現するトランスジェニック魚は、成長能力の増強 を示すかも知れない。 発明の要約 本発明は、熱帯魚のランゲルハンス島細胞中で発現されることができるヒト化 インスリン遺伝子であって、熱帯魚インスリン遺伝子の制御配列の制御下のイン スリン遺伝子のコード配列よりなり、ヒト中で生物活性を有するインスリンタン パク質をコードする、ヒト化インスリン遺伝子に関する。 本発明において「ヒト化インスリン遺伝子」という用語は、ヒト化インスリン 産物を産生するのに充分なヒト化インスリンコード配列の部分を含有する、修飾 魚インスリン遺伝子を意味する。ヒト化インスリン産物は、ヒトに移植された時 生物活性を有し、ヒトの免疫系によるヒト化インスリン産物の破壊を避けるのに 充分なヒトインスリン配列を含有する。好適な態様において、ヒト化インスリン 遺伝子は、ヒトインスリンのアルファ鎖およびベータ鎖の最初の少なくとも２９ アミノ酸をコードする。 ヒト化インスリン遺伝子または修飾インスリン遺伝子はさらに、熱帯魚ランゲ ルハンス島ベータ細胞中でヒト化遺伝子を発現するために充分な、熱帯魚インス リン遺伝子の制御配列の部分を有する。 本発明はまた、そのランゲルハンス島細胞がヒト化インスリンを分泌するトラ ンスジェニック魚の調製に関する。 本発明はまた、トランスジェニック魚のランゲルハンス島、および糖尿病患者 を治療するための異種移植におけるその使用に関する。 好適な態様において、熱帯魚は、テラピア（tilapia）のような硬骨魚である 。 本発明はまた： ａ）ランゲルハンス島をコラゲナーゼとともに、脂肪組織および結合組織からラ ンゲルハンス島を放出させるのに充分な時間インキュベートする工程；および ｂ）脂肪組織や結合組織から放出されたランゲルハンス島を分離する工程、 よりなる主要なランゲルハンス島を採取する改良方法に関する。 本発明はまた、魚中での成長を促進するためのヒト化インスリン遺伝子の使用 に関する。 図面の簡単な説明 図１− 自動エドマン分解により決定されるテラピア（tilapia）インスリン のアミノ酸配列。テラピア（tilapia）Ａ鎖とＢ鎖のアミノ酸配列は、それぞれ 配列番号１および２に示す。 図２− テラピア（tilapia）インスリンの一次構造のヒトインスリンとの比 較。（−）は配列が同じであることを示す。Ａ鎖およびＢ鎖ヒトインスリン配列 のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３および４に示す。 図３− テラピア（tilapia）インスリン遺伝子のＤＮＡとその対応するアミ ノ酸配列。ＤＮＡ配列はまた、配列番号５に示す。 図４− 最初のヒト化テラピア（tilapia）インスリン遺伝子のＤＮＡとその 対応するアミノ酸配列。ＤＮＡ配列はまた、配列番号６に示す。 図５− 第２のヒト化テラピア（tilapia）インスリン遺伝子のＤＮＡとその 対応するアミノ酸配列。ＤＮＡ配列はまた、配列番号７に示す。 発明の詳細な説明適当な供与体種の選択 異種移植のために魚の供与体種を選択する時は、以下の７つの基準を考慮すべ きである。第１に、魚はその地方で容易に入手できるかまたは容易に繁殖できる こと。第２に、容易に作業ができるようにするため、充分に大きいこと。第３に 、魚種は、比較的純粋な内分泌組織よりなる、１つまたはそれ以上の分離したＢ Ｂｓを有すること。第４に、ＢＢｓは、壊死、脱顆粒、または機能の喪失を起こ すことなく、３７℃での培養に耐えることができること。第５に、その種は、絶 食時の血漿グルコースレベルを哺乳動物の範囲内に維持すること。第６に、イン スリン分泌は、グルコース依存性であること。そして最後に、ＢＢｓは、糖尿病 性ヌードマウスに移植した後、長期間正常な血中グルコースを維持できること。 本発明の好適な態様において、温水の硬骨魚が供与体種として使用される。系 統樹的には、硬骨魚は大きくて３０，０００種以上を含有する多様な下綱の硬骨 魚である。ブロックマン小体（ＢＢｓ）は、「高等」硬骨魚にのみ存在し、他の 硬骨魚は散在したランゲルハンス島を有する。テラピア（tilapia）（オレオク ロミス・ニロチカ（Oreochromis nilotica））とジャイアント・ゴラミ（オスフ ロネムス・ゴラミ（Osphronemus gorami））は、熱帯高等硬骨魚の例である。タ ンバキ（tambaqui）（コロソマ・マクロポムム（Colossoma macropomum）やパク （Pacu）（ピラクタス・メソポタミカス（Piractus mesopotamicus））のような 解剖学的に明確なランゲルハンス島組織を有する他の熱帯魚も、供与体種として 使用される。 硬骨魚インスリンの一次構造は、ヒトのインスリンとは異なる。いくつかの硬 骨魚インスリンが精製され、そのアミノ酸配列が決定されている。これらのすべ てが、Ｂ鎖のはじめに余分な残基を有し、Ｂ鎖の末端の残基３０が欠失する。置 換は、Ａ鎖（例えば、ヒトインスリンとタラインスリンの間の９つのアミノ酸置 換）とＢ鎖（６つのアミノ酸、ヒトとタラ）の両方の多くの他の残基で存在する 。多くの硬骨魚インスリンは、ヒトインスリンの生物活性の３分の１〜２分の１ の活性を示す（８）。ヒト化インスリン遺伝子の調製 テラピア（tilapia）インスリンが精製され配列決定されている（８）（図１ ）。テラピア（tilapia）インスリンは、ヒトインスリンとはＡ鎖で９つのアミ ノ酸そしてＢ鎖で８つのアミノ酸が異なる（図２）。 ヒトといくつかの硬骨魚インスリン（９〜１１）の保存されたアミノ酸に基づ きインビトロポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）クローニング法（宝酒造（Ta kara Shuzo Co．LTD））と重複縮重プライマーを用いて、１kbの５’非翻訳配列 と１．２kbの３’非翻訳領域（図３と配列番号５）を含む全テラピア（tilapia ）インスリン遺伝子がクローン化された。リーダー配列、Ｂ鎖、Ｃ−ペプチド、 およびＡ鎖を含む完全なコード領域が、配列決定されている。推定のアミノ酸配 列と、精製されたテラピア（tilapia）インスリンのアミノ酸配列決定（図１） を用いて我々が最近配列決定したタンパク質の間に１００％の同一性がある。ヒ トインスリンに比較して、テラピア（tilapia）Ａ鎖は１２／２１の 同一のアミノ酸（５７．１％）を有し、置換されたアミノ酸の５つは、保存され た変化である。Ｂ鎖は、ヒトのタンパク質と比較すると、２３／３０の同一のア ミノ酸（７６．７％）を有し、３つの保存された変化を有する。予想されるよう に、Ｃ−ペプチドは、ヒトＣ−ペプチドとほとんど同一性はない。既知のすべて インスリン遺伝子のゲノム構造は、Ｃ鎖にイントロンを有する。予想されるよう に、テラピア（tilapia）インスリン遺伝子は、Ｃ鎖の７つ目のアミノ酸の後に ３１６塩基対のイントロンを有する（フェーズ１）。このイントロンは、正しい ＧＴ／ＡＧスプライシングドナー／アクセプター配列を有する。１kbの５’上流 配列はすべての制御単位を含有し、従って遺伝子は、その未変性のものと同様に 組織特異的な方法で制御される（すなわち、グルコース応答）。 部位特異的突然変異誘発とリンカー置換を用いて、テラピア（tilapia）イン スリン遺伝子をヒト化し、その結果これはヒトインスリンをコードするエクソン を含有し、一方まだテラピア（tilapia）制御（非コード）配列のすべてを維持 している。ヒトインスリン鎖をコードするが、正しいタンパク質発現を得るため にテラピア（tilapia）優先コドンを使用する、置換されたコドンが工夫された 。テラピア（tilapia）プレインスリンリーダーとＣ鎖は変化していなかった。 この作成体は、エンドペプチダーゼのすべての類似の認識部位を維持し、従って トランスジェニック魚は、この修飾タンパク質を未変性のインスリンとして処理 する。ヒト化テラピア（tilapia）遺伝子の最初のものは、Ｂ鎖上にヒト末端ス レオニンを欠如している（すなわち、テラピア（tilapia）のように）（図４と 配列番号６）。第２の作成体は末端Ｂ鎖スレオニンを含有する（図５と配列番号 ７）。トランスジェニック魚の調製 トランスジェニック魚を作成するために、ヒト化または修飾遺伝子を、テラピ ア（tilapia）受精卵に挿入する。まず、修飾した遺伝子挿入体を、プラスミド ＤＮＡから取り出す。このＤＮＡをＮＴ緩衝液（８８mM ＮａＣｌ、１０mMトリ ス−塩酸ｐＨ７．５）に懸濁し、１０⁶−１０⁷コピーを各前核に注入する（１２ ）。線状の断片は、組み込みの確立を上げ、遺伝子の染色体外コピーも低下させ る（１２）。 １回に１０〜１５個の卵を生むマウスと異なり、魚は１回に数千個の卵を生む 。テラピア（tilapia）は特に多産であり、多くの点でトランスジェニック研究 には理想的である。１年に１回産卵する他の多くの硬骨魚と異なり、メスのテラ ピア（tilapia）は２週間毎に産卵することができる。テラピア（tilapia）は成 長は速く、５ヶ月で性的に成熟する。 テラピア（tilapia）の同腹子および子孫は、各魚をピット（pit）で標識して 電子的走査することができる。同腹子（穴のあいたプラスチックシートで分離さ れるオスとメス）は、２８℃で２０ガロンの水層で飼育される。メスが成熟した ら卵をシャーレに取り、オスの魚精（精子）を毛細管に取る。毛細管の内容物を 卵と混合し、次にシャーレに水を加える。２〜３分後、卵を洗浄して過剰の精子 を除去する。受精後５分以内に卵の微量注入を始める。受精卵を２１℃の水で維 持して分割を遅くし、注入前に受精卵を単細胞で維持する。この方法により受精 後２．５時間の間テラピア（tilapia）卵の微量注入が可能になることが報告さ れている（１３）。 硬骨魚の卵は、漿膜中の精子大の１つの穴である卵門を有する。テラピア（ti lapia）の卵の卵門の直径は、６μm である。卵門注入は、ラーマンとマクレー ン（Rahman and Maclean）の記載したように行う（１３）。卵門が見易いように 卵を置き、次に本発明者の設計した卵ホルダーに固定する。手術用顕微鏡とマイ クロマニピュレーター使用して、針先を卵門に入れ、「遺伝子プッシャー」（ge ne pusher）を用いて２５０pl〜２nlのＤＮＡ溶液を注入する。先端が３〜５μ ｍの針は、ホウ素珪酸ガラスから微小電極プラーを用いて作成される。注入後、 卵をプラスチック孵化ロートに入れ、０．７５リットル／分の速度で水を受精後 １０日間流し、この時点で稚魚を水層に移し成長させる（１３）。 微量注入によりテラピア（tilapia）に導入されると、ヒト化テラピア（tilap ia）インスリン遺伝子は充分なテラピア（tilapia）配列を有し、その結果相同 組換えは、魚のきわめて低い頻度で起きるのみである。相同組換えは現在、遺伝 子を破壊（すなわち、ノックアウト実験）して、機能していない破壊された遺伝 子のインビボの機能を決定するためにマウスで使用されている。次に、ヒト配列 を導入していて魚のゲノムを有する生成物を与えないプライマーを用い て、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）（１４）により、テラピア（tilapia ）のヒレの切り抜きをスクリーニングする。ＰＣＲの感度の高さのため、まずヒ レの切り抜きをバッチでスクリーニングすることができる。次に陽性のバッチが 得られた場合のみ、各魚をスクリーニングする。トランス遺伝子を発現する各魚 は、３ヶ月でピット（pit）で標識され、その結果電子的走査によりその生活を 介して同定できる。トランスジェニック魚のスクリーニング 品種改良計画の目的は、組織移植に使用するためのトランスジェニックテラピ ア（tilapia）の遺伝的に安定な産生株を開発することである。この株は、以下 の性質を有する：（１）インスリン座以外のヒト化テラピア（tilapia）ＤＮＡ 配列（外来ヒト化ＤＮＡ）が存在しないこと、（２）テラピア（tilapia）イン スリン座でのヒト化インスリン遺伝子のホモ接合性、（３）遺伝的および成長的 安定性と均一性、（４）良好な成長と生存特性、および（５）汚染に対する保護 性および開発者の所有権の保護が遺伝的に同定できること。 初期スクリーニング法： 品種改良は、部分的には４つのＰＣＲプライマーによるスクリーニングに基づ く：挿入体の１kbのリーディング鎖のすぐ上流のプライマー（ＡＴ）テラピア（ tilapia）配列、ヒト化コード領域の外のリーディング鎖のプライマー（ＢＴ） テラピア（tilapia）配列、インスリンコード領域中のプライマー（ＣＨ）ヒト 化テラピア（tilapia）配列、およびＣＨと相同性のプライマー（ＣＴ）テラピ ア（tilapia）配列。 ホモ接合性トランスジェニック創始者（founder）集団： ＡＴ−ＣＨ ＰＣＲ産物についての最初のスクリーニングで同定されるトラン スジェニック魚（Ｇ０世代）は、インスリン座でヘテロ接合性であり、ゲノムの 別のところに外来ヒト化挿入体も含有する。これらのＧ０魚は、できるだけ多く の野性型個体に品種改良され、５０％のトランスジェニックヘテロ接合性子孫（ Ｇ１）を含有する集団を産生させる。次にトランス遺伝子の１つのコピーを含有 する魚を、ＡＴ−ＣＨ ＰＣＲ産物についてスクリーニングする。これらのヘテ ロ接合性魚を次に、これら自身の間で交配させ、Ｇ２世代で２５％ホモ接合性 のトランスジェニック魚を産生させる。Ｇ２ホモ接合体は、ＡＴ−ＣＨとＡＴ− ＣＴ ＰＣＲ産物についての同時スクリーニングにより５０％ヘテロ接合体から 選択される。 得られたホモ接合性トランス遺伝子創始者集団は、マリーン・ジーン・プロー ブ・ラボラトリー（Marine Gene Probe Laboratory）（ＭＧＰＬ）テラピア（ti lapia）施設で、ランダム交配により拡張する。次にそのアミノ酸配列を確認す るためにトランスジェニックインスリンを精製し配列決定できるように、充分な 量の子孫を生産する。 精製されたトランスジェニック集団： 創始者集団中の外来性ヒト化挿入体（インスリン座以外）をスクリーニングし 、ヒト化テラピア（tilapia）インスリンプローブを用いて、サザンブロッティ ング制限消化により選別する。これはＧ０とＧ１世代で行う。外来性ヒト化挿入 体が少ない場合は、ヒト化テラピア（tilapia）インスリンプローブを用いて制 限消化物をスクリーニングして、創始者集団から選択する。もし多い場合は、い くつかの世代の繰り返し逆交配選択により希釈してＭＧＰＬで非トランスジェニ ックベース集団とし、次にもう一度交配させてホモ接合性を再確立する。この方 法は、ＭＧＰＬでトランス遺伝子を逆交配していくつかのテラピア（tilapia） 株を得る。外来性挿入体を取り出したら、精製されたトランスジェニック集団を ランダム交配により拡張する。 トランスジェニックテラピア（tilapia）の組織は、最終的にヒトに移植され る可能性があるため、この物質が安定で確実に予測できることが必要である。移 植および関連する支持実験に使用される魚は、遺伝的に均一でなければならない 。近交系の強すぎる魚は適応性が悪く成長の安定性が低いため、すべてのバック グランド（非インスリン）座でホモ接合性である同系のトランスジェニック株を 求めることは好ましくない。目標は、ホモ接合体株交配の同系の第１世代ハイブ リッドである。そのようなハイブリッドは遺伝的に同じであり、多くのバックグ ランド座でヘテロ接合性であるが、ヒト化テラピア（tilapia）インスリン遺伝 子についてはホモ接合性である。雌性発生ではなく同胞交配が、ホモ接合性株の 産生には好適な方法である。複数の近交系の親株は、同胞交配中の同系減少によ る 株の喪失に対する保護的方法として開発されるであろう。 トランスジェニック移植株： 同系親株の適応性（成長と繁殖性）に対する選択を、ファミリー内選択により 行う（１５、１６）。選択はまず同系減少を減らすために株内で行い、次に同系 の例えばハイブリッドで行う。適応性の選択は、ホモ接合性に対するバックグラ ンド座のアプローチを遅らせることが予想される。この方法は、ゲノム内に分布 する微小サテライト座で広範にスクリーニングすることにより制御し追跡される 。最終のトランスジェニック移植株は、同系のハイブリッドであろう。近交系の 親株は、充分に生存活性があり、この株の長期の産生により死滅して減少する危 険性はないであろう。 遺伝的同定と保護： 必要であれば（例えば、保護または所有権のために）、トランスジェニック産 生株は、株レベルのみでなく染色体レベルでも同定可能である。これはすべての 染色体の微小サテライト座でユニークな対立遺伝子プロフィールの開発により行 われる。必要であれば、移植に利用される魚は、ホルモンで不妊にすることによ り生殖能をなくすことができる。非ホモ接合性組換え 前述のように、相同組換えを試みる。しかし、ヒト化テラピア（tilapia）イ ンスリン遺伝子は、その「天然の」プロモーターと他の上流の制御配列を含有す る。従って、別の部位に組み込まれても（すなわち、非相同組換え）、機能する 。これらのトランスジェニック体からのランゲルハンス島細胞は、制御可能なレ ベルのヒトおよび魚インスリンを産生するであろう。 ヒトおよび魚インスリン遺伝子を発現する魚はまた、産生について選択するこ とができる。そのような魚のランゲルハンス島は、血中糖レベルを制御し、従っ てランゲルハンス島供与体として有用である。さらに両遺伝子（または、ヒト化 遺伝子の複数のコピー）を発現する魚は、成長能の増強を示し、従って水産養殖 に有用であるかも知れない。トランスジェニック魚からのＢＢｓの採取 II型コラゲナーゼを用いてＢＢｓを採取する新しい方法を、以下に記載する。 この方法は、特に大量単離に適用した時、はるかに簡便であり、時間がかからな い。これは魚当たりのランゲルハンス島組織の収率を倍増し、供与体の魚の必要 性を５０％以上低下させた。組織学的には、こうして採取したＢＢ調製物は、顕 微解剖により得られた調製物よりきれいである。本発明者はすでに、この新しい 方法で単離したテラピア（tilapia）からＢＢｓを、無胸腺ヌードマウスおよび 有胸腺Ｂａｌｂ／ｃマウスに移植し、得られた結果を標準的顕微解剖法により採 取した魚ランゲルハンス島を用いて得られた結果と比較した。結果は、この新し い単離法は、ヌードマウスで移植後の長期間機能を変更させず、または有胸腺マ ウスで移植後の移植片平均生存時間を変更させないことを示していた（４）。 供与体の魚を２８℃に維持し、屠殺する前に絶食させた。供与体の魚を、バケ ツの中の２−フェノジエタノール（１ml／Ｌ）、またはｐ−アミノ安息香酸エチ ル（ベンゾカイン）（２００mg／Ｌ）を含有する水に入れて麻酔をかける。次に 魚の重さを量り、識別番号を付ける。次に、各魚を解剖トレーに左を下にして置 く。次にメスで頸部脊髄を切断して、供与体の魚を屠殺する。次に肛門から心臓 周囲腔まで腹部面に沿って切断して腹腔を漏出させる。この切断を背側で尾の方 向に右のえらぶたまで延長し、次に尾の方向に腹腔の背側に沿って肛門まで延長 する。最後に、これらの３つの切断で囲まれた皮膚の筋組織の三角形のえらぶた を取り出す（４）。胆管に隣接した「ＢＢ領域」を、ｉｎ ｓｉｔｕで同定し（ ４）、切開し、２７mMのヘペス、２００U/mlのペニシリン、および２００μg/ml の硫酸ストレプトマイシン（ギブコ（Gibco ）、ニューヨーク州グランドアイラ ンド）を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を含むシャーレ（４）に入 れる。シャーレに魚の識別番号を書く。次にシャーレを層流フード内に入れ、こ れらの工程で追加の供与体の魚が処理されるまで保持する。 顕微鏡的には、これらのＢＢ領域は脂肪組織、血管、神経、胆管、および約１ ５のＢＢｓよりなる（４）。ＢＢ領域を集め、２７mMのヘペス、２００U/mlのペ ニシリン、および２００μg/mlの硫酸ストレプトマイシン（ギブコ（Gibco ）、 ニューヨーク州グランドアイランド）を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳ Ｓ）を含むシャーレ（４）に入れる。必要な数のＢＢ領域を集めた後、これらを 洗浄し、あらかじめ３７℃に暖めたコラゲナーゼ溶液（２領域／ml）を含有する ５０mlのプラスチック遠心分離管に入れる。コラゲナーゼ溶液は、II型コラゲナ ーゼ（シグマ（Sigma）、Ｃ−６８８５、ミズーリ州セントルイス）３mg/ml の 濃度でＨＢＳＳに溶解して調製する。次にＢＢ領域とコラゲナーゼ溶液を含有す る各管を、３７℃のシェーカー／水浴に入れる。約１５±５分間消化する。定期 的に消化を中止して管を光に当てて肉眼で観察することにより、最適消化時間を 判定する。小および中程度のＢＢｓの大部分が明らかに放出され、最も大きいＢ Ｂｓがまだいくつかの糸状構造に弱く結合している時に消化を停止する。冷ＨＢ ＳＳを各管に入れて消化を停止する。管を１０００rpm で１分間遠心分離して、 遊離の脂肪細胞と希釈されたコラゲナーゼ溶液を含有する上澄液を捨てる。ペレ ットを冷ＨＢＳＳで２回洗浄する。次に消化した組織をＨＢＳＳに再度懸濁して 、１００mmのプラスチック培養皿に入れる。解剖顕微鏡下（倍率１０×）でまた は肉眼＋良好な光の中で、放出されたＢＢｓは、血管、胆管および結合組織より なる残存破片から容易に区別できる。ＢＢｓは球形であり、白っぽい。これらは 結合組織より透明度が低い（４）。次にシリコナイズしたピペットを用いて、こ れらを手で取り上げる。通常各供与体の魚は、１つまたは２つの大きなＢＢｓと １０〜１５の小または中程度の大きさのＢＢｓを有する、ＢＢｓの大きさは０． ３〜最大５mmである（４）。最も大きなＢＢｓはしばしば、大きな径の血管に密 接に結合しており、これは通常消化後もまだ弱く結合している（４）。しかし、 これは微小血管ハサミおよび宝石商鉗子で容易に分離される。次にすべての集め たＢＢＳを、１０％ウシ血清、２．５mg/ml Ｄ−グルコース、１００U/mlペニシ リンおよび１００μg/ml硫酸ストレプトマイシンを含有するＣＭＲＬ−１０６６ 培地（ギブコ（Gibco）、ニューヨーク州グランドアイランド）に移す。大きい ＢＢｓはマイクロハサミで分割して均一なサイズにする（最大の大きさは＜０． ５mm）。次にすべてのＢＢ断片を、９５％空気／５％ＣＯ２中で３７℃で一晩自 由に浮遊させて培養する。ＢＢ断片を一晩培養した後、移植して傷害された細胞 からインスリンを漏れ出させ、かつＢＢ断片に結合した外分泌組織を移植前に変 性させる。すべてのシャーレがインキュベーターに入ったら、各供与体の魚の血 漿グルコースレベルを測定し、供与体の魚識別番号により記録する。一晩培養後 、ＢＢ断片は移植の準備ができる。機能的実験 臨床的使用の前に、トランスジェニックランゲルハンス島の機能的特徴を性状 解析する必要がある。これはインビトロおよびインビボで行う必要がある。第１ 段階として、トランスジェニックランゲルハンス島から分泌されたインスリンの アミノ酸配列を決定して、これがヒト化されていることを確認する。非トランス ジェニックテラピア（tilapia）ランゲルハンス島およびその分泌物質によるテ ラピア（tilapia）インスリン分泌の動力学を、インビトロで測定して、トラン スジェニックランゲルハンス島およびヒトインスリンのラジオイムノアッセイを 用いる分泌試験と比較する。魚インスリンの構造はヒト、ブタ、ウシ、およびラ ットのインスリンのアミノ酸とは異なるため、これらの種のインスリンに対して 産生される多くの抗体は、ラジオイムノアッセイに充分な親和性では交差反応を しない。硬骨魚インスリンに対していくつかの抗体が作成されてきた（１７〜２ １）が、１つの硬骨魚種のインスリンは別の硬骨魚種のインスリンとは異なる。 従って標準的ラジオイムノアッセイ法によりインスリンが測定できるように、精 製されたテラピア（tilapia）インスリンに対する抗体（８）が作成されている 。 さらに、インスリンの主要な標的の１つである哺乳動物筋肉細胞に及ぼすテラ ピア（tilapia）、ヒト化テラピア（tilapia）、およびヒトインスリンの相対的 効果を試験する。ＩＤＤＭは、グルコース輸送、グリコーゲン合成、グルコース 酸化、およびグルコーストランスポーターＧＬＵＴ−４移動および／または活性 に悪影響を与える。これらの問題は適当なインスリン治療により正常化される。 従ってグルコース輸送、グルコース代謝（グリコーゲン合成、糖分解、および酸 化）に及ぼすヒト化テラピア（tilapia）インスリンによる治療の急性および慢 性の効果が試験される。さらに、これらの慢性試験のいくつかは、ＢＢ移植によ り血糖値が正常になったストレプトゾトシン−糖尿病性無胸腺ヌードマウスにつ いて行われる。 トランスジェニックランゲルハンス島は、哺乳動物受容体において適切に機能 するであろう。これは本発明者の以前の研究のようにヌードマウスに非トランス ジェニック魚のランゲルハンス島を移植することにより行われる（１、２）。糖 尿病は、ストレプトゾトシン（１７５〜２００mg/kg）の単回静脈内注射により 移植の少なくとも１週間前に受容体マウスにおいて誘導される。すべての受容体 マウスは少なくとも２回の連続的非絶食血漿グルコース測定値が３５０〜５００ mg/dl の間にある。本発明者が試験したすべてのマウスについて、正常な血糖値 を確保し移植直後の低血糖の可能性を最小にするための最適のテラピア（tilapi a）ＢＢ断片の容量は、マウスの体重１ｇ当たり供与体の魚体重約０．００２５k gである（例えば、２４ｇのマウスは、約０．６kgの供与体テラピア（tilapia） が必要である）。供与体の魚の全体重は通常１つの大きな魚または複数の小さな 魚により与えられる。２００〜８００ｇの間のテラピア（tilapia）は、それぞ れ通常ＢＢ供与体として使用される。興味深いことは、供与体の魚体重は、ＢＢ の重さと相関せず、特定の受容体マウスへの移植に必要な組織の量を定量するた めのより適した方法は、供与体の魚の全体重のようである。 移植の少なくとも３０分前に、インキュベーターからＢＢ断片を取り、４．０ mg/ml のＤ−グルコース含有ＣＭＲＬ培地に移し、次に３０分間インキュベータ ーに戻す。この工程はランゲルハンス島をさらに脱顆粒させ、移植後の最初の２ ４〜４８時間（すなわち、死亡した細胞または死亡しかけている細胞からインス リンが最も漏れ出やすい時期）の間の急性低血糖症から受容体を保護する。この ３０分間のインキュベート後、ＢＢ断片を、２．５mg/ml Ｄ−グルコース含有完 全培地中に入れ、移植するまでインキュベーターに戻す。移植の直前に、ＢＢ断 片を不完全培地（すなわち、胎児牛血清を含有しない）中で洗浄する。 糖尿病性ヌードマウス受容体を、ペントバルビタールナトリウム５０〜５５mg /kgを腹腔内投与して麻酔をかけ、右側を下にして置いて固定する。左側の毛を 剃って、次に無菌ヨード溶液次にアルコールで洗浄する。左の腎臓を触診して脊 柱角で肋骨下に０．７５cmの切り込みを入れる。外に出した腎臓を固定し、ヘペ ス−ＨＢＳＳで湿らす。解剖顕微鏡で観察しながら、宝石商鉗子で腎皮嚢を静か に持ち上げ、２５ゲージの針の切端で０．２cmの切り込みを入れる。「ホッケー のスティック形」のガラスミクロスパテラを用いて、腎臓の表面から皮嚢を分離 する。こうして間隙を作成し、ここにＢＢ組織を移植する。マイクロスパテラで 腎皮嚢を破ることがないように、充分注意しなければならない。 曲がった宝石商鉗子で皮嚢を軽く持ち上げてＢＢ断片を腎皮嚢の下に入れ、次 に各断片を曲がったガラスミクルスパテラを用いて各断片を皮嚢の下に押し込む 。この間腎臓の表面を頻繁にヘペス−ＨＢＳＳで湿らせる。すべてのＢＢ断片が 腎皮嚢の下に入ったら、これらを均一に分散させて、ＢＢ組織の大きな塊ができ ないようにする。次に先端の細い低温眼科用焼灼器（ゾメドートレース（Xomed- Treace）、フロリダ州ジャクソンビル）を用いて、腎皮嚢の切り込みを密封する 。次に腎臓を元の位置に戻し、筋層と皮膚を個々に５−０の絹の縫糸で閉じる（ ２、２２）。移植評価 ａ．インビボ移植片機能 マウスは普通、移植数時間後に血糖値が正常になる（＜２００mg/dl）。手術 後の期間にマウスが低血糖にならないように受容体マウスを時々観察する。移植 後最初の２４−４８時間にインスリン放出がうまく制御されず、マウスは低血糖 症になることがある。低血糖マウスは直ちに、グルコース腹腔内投与で処理しな ければならない。充分な容量のＢＢ組織が移植された場合、拒絶されるまでマウ スの血糖値は正常である。テラピア（tilapia）ＢＢ断片をヌードマウスに移植 後の絶食していない平均血漿グルコースレベルは、７０−１００mg/dl の範囲で ある（２）。しかし移植後最初の１週間は、血漿中の平均グルコースレベルはい くぶん低くなりがちである。ＢＢ移植片はヌードマウス中で生理的に機能し、長 期の受容体マウスは比較的正常のグルコース負荷曲線を示す（２）。長期の受容 体マウスの絶食血漿中平均グルコースレベル（７２mg/dl）が、供与体の魚中と ほとんど同じ（７５mg/dl）であることは興味深い（２）。本発明者は、非絶食 血漿中グルコースレベルが大きく変動するなら、ＢＢ組織の移植が不十分である 可能性があることを見いだした（２３）。ｂ．組織学 各受容体マウスを屠殺する場合は、組織学的評価が必要である。まず、ベータ 細胞の再生の有無について、受容体の未変性の膵臓を組織学的に検査すべきであ る。これは、アルデヒドフクシン（２４）または免疫ペルオキシダーゼで、イン スリンについて組織学的切片を染色することにより行われる。 次にそれぞれの左の腎臓を移植片の生存活性とベータ細胞の顆粒形成の程度に ついて検査する。ベータ細胞顆粒形成は、テラピア（tilapia）インスリンに対 する本発明者の抗体を用いて、免疫ペルオキシダーゼ染色により検査される。移 植片を有する腎臓の切片を、ヘマトキシリンとソシンでも染色する。ｃ．単細胞調製物 ＢＢ断片を単細胞懸濁液に変換することは有益である。これは単細胞と小細胞 凝集物は、全ＢＢｓまたはＢＢ断片より表面積対容量比がはるかに大きく、従っ て酸素や栄養物質の拡散の制限を受けにくいことで、さらに利点を有する（２５ ）。 ＢＢｓは容易に単細胞中に分散される。ＢＢｓを１５ｃｃのプラスチック円錐 遠心分離管に入れて、カルシウム−マグネシウム−遊離ＨＢＳＳで２回洗浄する 。これを吸引し、ＢＢを室温で７分間７mlのバーゼン（ギブコ（Gibco）＃６７ ０−５０４０ＡＧ、ニューヨーク州グランドアイランド）に再懸濁する。ＢＢｓ を沈降させ、上澄液を除去する。次に４mlのトリプシン溶液（シグマ（Sigma） ＃Ｔ−０６４６、ミズーリ州セントルイス；カルシウム−マグネシウム−遊離Ｈ ＢＳＳ中１mg/ml を０．２２μｍシリンジフィルターでろ過した）を管に加え、 次に管を層流フード中の３７℃の水浴に入れる。次にトリプシン／ＢＢ溶液をピ ペットで静かに絶えず上下させる。２分後、大きな断片を底まで沈降させ、遊離 のランゲルハンス島細胞を含有する上澄液を取り、直ちに完全組織培養培地を含 有する管に移し、次に氷上に置く。さらに４mlのトリプシン溶液をペレットに加 えて、この操作を３回繰り返す。各回に上澄液をプールし完全培地で希釈する。 最後に上澄液を含有する管を６００ｇで４℃で５分間遠心分離する。上澄液を取 り、細胞を完全組織培養培地に再懸濁し計測する。トリプシンブルー排除により 評価すると生存活性は約９５％である。分散したげっ歯類またはヒトランゲルハ ンス島細胞に比較して、分散したＢＢ細胞は一晩培養すると図１０に示すように ある程度再凝集が起きるが、塊または細胞の鎖への再凝集は起こりにくい。血漿 の塊中に固定された単細胞懸濁液は、糖尿病性ヌードマウスの腎皮嚢の下に移植 された時血糖値を正常にするが、単細胞調製物はインビボではＢＢ断片のように うまくは機能しないことをデータは示唆している（これはおそらく、細胞−細胞 連絡が低下しているためであろう）（２６）。 単細胞法の代替法として哺乳動物のランゲルハンス島サイズのＢＢｓ（「ミク ロＢＢｓ」）を、セレクター組織篩い(Cellctor Tissue Sieve)(ベルコグラス（ Bellco Glass）、ニュージャージー州バインランド)で、ＢＢ断片を単に連続的 に無菌のステンレス＃６０メッシュ（開口部径２３０μｍ）フィルター、次に無 菌の＃８０メッシュ（開口部径１９０μｍ）フィルターに押し込むことにより産 生できる。両方のフィルターを、過剰の培地で注意深く洗浄する。すべての濾液 を、プラスチックのシャーレに集め、一晩培養する。ＢＢｓはほとんど純粋の内 分泌細胞よりなり、結合組織間質が少ないため、数回の洗浄後はフィルター上に 組織はほとんど残っていない。倒立顕微鏡でシャーレを観察すると「ミクロＢＢ ｓ」は最初デコボコしているが、一晩培養するとうまく「丸く」なり、培養した 哺乳動物ランゲルハンス島に非常によく似てくる。培養後、「ミクロＢＢＳ」は パスツールピペットを用いて用手法で取り上げ、層流ワークステーション中の解 剖顕微鏡で観察する。ある程度細胞−細胞連絡が完全なままなので「ミクロＢＢ Ｓ」は単細胞より良好に機能するようである。ＢＢ断片と異なり、「ミクロＢＢ Ｓ」は腎皮嚢下以外の部位に移植されるのに充分なだけ小さい。あるいは、ＢＢ ｓを顕微鏡検査用に細かく切り、次に培養すると同様の哺乳動物ランゲルハンス 島サイズのＢＢｓを産生する。我々は、非トランスジェニックテラピア（tilapi a）からこうして調製したミクロＢＢＳは、糖尿病性ヌードマウスの睾丸中にう まく移植され、長期の正常グルコース血症を誘導することをすでに証明した。ヒトへの移植 本発明のトランスジェニック魚のＢＢｓはいったん性状解析されると、採集し 、カプセル化し、そして糖尿病患者に外科的に移植される。ＢＢｓは当該分野で 公知のランゲルハンス島細胞カプセル化方法に従ってカプセル化される（２７− ２９）。我々は、非トランスジェニックテラピア（tilapia）からのマクロカプ セル化ＢＢｓは、長期の正常グルコース血症を与え、マウスで腹腔内移植後に哺 乳動物様のグルコース負荷プロフィールを与えることをすでに証明した（３０） 。 種々の人工膵臓を扱う研究者を悩ます１つの問題は、ランゲルハンス島の中心 部の低酸素症に続発性の中心部の壊死のために、最初のランゲルハンス島容量の 多くはカプセル後失われることである。魚の組織（ランゲルハンス島を含む）は より低い酸素圧に耐えるため、魚組織は哺乳動物ランゲルハンス島組織より優れ ている可能性が高い（３１）。トランスジェニック魚のランゲルハンス島による グルコース刺激インスリン分泌がヒトランゲルハンス島より効率が悪いかまたは 少し低くても、これらは、非常の多くの魚ランゲルハンス島とはるかに少ないヒ トランゲルハンス島を有する人工膵臓にははるかに有用であろう。おそらく魚ラ ンゲルハンス島は大量のインスリンを産生し、ヒトランゲルハンス島は、短期作 用性および長期作用性インスリンを混合して糖尿病患者のインスリン治療を最適 化するように、インスリン応答を「微調整」するであろう。 本発明に記載のトランスジェニック魚のランゲルハンス島は、インスリンを得 るために高価な酵素的ランゲルハンス島単離法を必要としない、ほとんど無限の ヒトインスリン産生ランゲルハンス島組織の供給源である。テラピア（tilapia ）ＢＢｓは液体窒素中で低温保存（哺乳動物ランゲルハンス島を低温保存するた めに開発された標準的方法を用いて）して、融解し、そして次に糖尿病性ヌード マウスに移植してランゲルハンス島機能を確認できることを、我々が証明したこ とで、これらのランゲルハンス島の有用性はより増加したであろう。これはトラ ンスジェニックランゲルハンス島の輸送と長期保存を促進するであろう。本発明の他の応用 詳細に前記したように、本発明のトランスジェニック魚は、糖尿病の治療のた めに大量のヒト化インスリンを提供するのに有用である。これは、ヒト化テラピ ア（tilapia）インスリン遺伝子の相同組換えにより起きる。しかしもし非相同 組換えが起きるなら、トランスジェニック魚はヒトおよび魚インスリン遺伝子を 発現するかも知れない。両方の遺伝子（またはヒト遺伝子の複数のコピー）を発 現する魚が成長能の増強を示すように、そのような魚は水産養殖において有用で あるかも知れない。 本発明の範囲と精神を逸脱することなく、種々の修飾が可能であることは当業 者には容易に理解できるであろう。本発明内の修飾としては、ヒトでのインスリ ン生成物の生物活性または免疫原性に実質的に影響を与えないヒト化インスリン 遺伝子の配列の修飾または置換がある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．熱帯魚のランゲルハンス島細胞中で発現され得るヒト化インスリン遺伝子 であって、熱帯魚インスリン遺伝子の制御配列の制御下のインスリン遺伝子のコ ード配列よりなり、ヒト中で生物活性を有するインスリンタンパク質をコードす る、上記ヒト化インスリン遺伝子。 ２．インスリン遺伝子のコード配列は、ヒトインスリンのアルファ鎖およびベ ータ鎖の最初の少なくとも２９アミノ酸をコードする、請求の範囲第１項に記載 のヒト化遺伝子。 ３．コード配列は、ヒトインスリンのアルファ鎖およびベータ鎖をコードする 、請求の範囲第１項に記載のヒト化遺伝子。 ４．ヒト化インスリン遺伝子は、配列番号６に記載のＤＮＡ配列よりなる、請 求の範囲第１項に記載のヒト化遺伝子。 ５．ヒト化インスリン遺伝子は、配列番号７に記載のＤＮＡ配列よりなる、請 求の範囲第１項に記載のヒト化遺伝子。 ６．熱帯魚インスリン遺伝子は、比較的純粋な内分泌組織よりなり、３７℃で の培養に耐える、１つまたはそれ以上の分離した主要なランゲルハンス島を有す る魚からのものである、請求の範囲第１項に記載のヒト化遺伝子。 ７．熱帯魚は硬骨魚である、請求の範囲第１項に記載のヒト化遺伝子。 ８．熱帯魚はテラピア（tilapia）である、請求の範囲第７項に記載のヒト化 遺伝子。 ９．熱帯魚はオスフロネムス・ゴラミ（Osphoronemus gorami）である、請求 の範囲第７項に記載のヒト化遺伝子。 １０．熱帯魚はコロソマ・マクロポヌム（Colossoma macroponum）である、請 求の範囲第１項に記載のヒト化遺伝子。 １１．熱帯魚はピアラクタス・メソポタミカス（Piaractus mesopotamicus） である、請求の範囲第１項に記載のヒト化遺伝子。 １２．遺伝子は魚中での成長を促進する、請求の範囲第１項に記載のヒト化遺 伝子。 １３．請求の範囲第１項から第１２項までのいずれか１項に記載の遺伝子によ りコードされるヒト化インスリンタンパク質。 １４．タンパク質はヒト中で生物活性を有する、請求の範囲第１３項に記載の ヒト化インスリンタンパク質。 １５．請求の範囲第１項から第１２項までのいずれか１項に記載のヒト化イン スリン遺伝子を含有するトランスジェニック魚。 １６．魚は硬骨魚である、請求の範囲第１５項に記載のトランスジェニック魚 。 １７．硬骨魚はテラピア（tilapia）である、請求の範囲第１６項に記載のト ランスジェニック魚。 １８．魚はオスフロネムス・ゴラミ（Osphoronemus gorami）である、請求の 範囲第１６項に記載のトランスジェニック魚。 １９．魚はコロソマ・マクロポヌム（Colossoma macroponum）である、請求の 範囲第１５項に記載のトランスジェニック魚。 ２０．魚はピラクタス・メソポタミカス（Piractus mesopotamicus）である、 請求の範囲第１５項に記載のトランスジェニック魚。 ２１．請求の範囲第１項から第１２までのいずれか１項に記載のヒト化インス リン遺伝子を含有するランゲルハンス島細胞。 ２２．請求の範囲第１５項のトランスジェニック魚から単離されるランゲルハ ンス島細胞。 ２３．糖尿病を治療するための請求の範囲第２１項記載のランゲルハンス島細 胞の使用。 ２４．ランゲルハンス島細胞はカプセル化される、請求の範囲第２３項に記載 の使用。 ２５．ランゲルハンス島細胞はグルコース依存性にインスリンを分泌する、請 求の範囲第２３項に記載の使用。 ２６．ランゲルハンス島細胞は患者の正常な血糖値を維持する、請求の範囲第 ２３項に記載の使用。 ２７．主要なランゲルハンス島の採取方法であって、 ａ）ランゲルハンス島をコラゲナーゼとともに、脂肪組織および結合組織からラ ンゲルハンス島を放出させるのに充分な時間インキュベートする工程；および ｂ）脂肪組織や結合組織から放出されたランゲルハンス島を分離する工程、 よりなる上記方法。 ２８．ランゲルハンス島は、工程（ａ）においてコラゲナーゼとともに３７℃ で約１０〜２０分間インキュベートされる、請求の範囲第２７項に記載の方法。 ２９．工程（ａ）のコラゲナーゼはII型コラゲナーゼである、請求の範囲第２ ７項に記載の方法。 ３０．魚において成長を促進する請求の範囲第１項から第１２項までのいずれ か１項に記載のヒト化遺伝子の使用。