JP4447705B2 - 糖尿病発症モデル哺乳動物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖尿病発症性トランスジェニックマウス等の糖尿病発症モデル非ヒト哺乳動物や、これを用いた糖尿病治療薬のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インスリン作用の相対的あるいは絶対的な不足によって引き起こされる糖質代謝異常を中心とする種々の代謝異常である糖尿病は、大きくインスリン依存性糖尿病（Ｉ型：ＩＤＤＭ）とインスリン非依存性糖尿病（II型：ＮＩＤＤＭ）との２つに分類され、インスリン依存性糖尿病は自己免疫的な機序により膵島β細胞の破壊が進行し、インスリン分泌低下をきたすことにより発症し、一方、インスリン非依存性糖尿病は遺伝的なインスリン分泌低下と骨格筋でのインスリン抵抗性の素因に、肥満によるインスリン抵抗性が加わり発症に至り、このインスリン非依存性糖尿病は全糖尿病の９５％以上を占めている。
【０００３】
現在、遺伝子レベルで原因がわかっている糖尿病としては、インスリン異常症、インスリン受容体異常症、グルコキナーゼ遺伝子異常症（ＭＯＤＹ２）、ミトコンドリアＤＮＡ異常による糖尿病があり、また、連鎖解析によりＭＯＤＹ１、ＭＯＤＹ３、ＮＩＤＤＭ１、ＮＩＤＤＭ２の遺伝子の染色体上の位置がマッピングされている。一方、糖尿病モデル動物としては、従来、ＮＯＤ（non-obese diabetic）マウスや、ヒトインスリン遺伝子プロモーターと、かかるプロモーターの下部に付着される熱衝撃蛋白質７０遺伝子が融合された糖尿病発生遺伝子をマウスに導入した糖尿病発生トランスジェニックマウス（特開平９−２８３８４号公報）や、ヒトインスリンを分泌するように改変されたヒト化インスリン遺伝子を含有するトランスジェニック魚（特表平１０−５０４７２５号公報）や、II型真性糖尿病のトランスジェニック動物モデル（特表平１０−５０７０８４号公報）等が提案されている。
【０００４】
他方、ゲノムインプリンティングは、高等脊椎動物では哺乳類だけに見られる遺伝子発現様式であり、哺乳類の個体発生、成長、行動などに重要な役割を果たしており、ヒトにおいてはある種の遺伝病や発ガンとも関係していることがわかってきている。このゲノムインプリンティングは、父親由来と母親由来のゲノムが個体発生に関して機能的に異なる役割を果たす現象として知られている（Cell 45, 127, 1986、Cell 37, 179, 1984、Nature 315, 496, 1985）。
【０００５】
上記インプリンティング遺伝子は、１９９１年に最初に発見され（Cell 64, 849, 1991）、父性発現と母性発現を示す遺伝子群が存在することが明らかとなり、ヒト及びマウスにおいて３０を越えるこのような遺伝子の存在が既に報告されている。また、哺乳類の個体発生や成長、行動に関係するゲノムインプリンティングの分子機構的理解は、特定のインプリンティング遺伝子（群）の発現の欠除又は過剰による胎児期致死、新生児致死、成長過剰、成育不良、行動異常［Nature 315, 496, 1985、Frontiers in Molecular Biology, p118,（IRL Press, Oxford, 1997）］や、いくつかのヒト遺伝病（Trends Genet 5, 331, 1989、Semin Cancer Biol 3, 151, 1992、Hum Mol Genet 4, 1757, 1995、Trends Genet 13, 436, 1997）を直接又は間接的に引き起こす原因の解明を可能なものとしている。
【０００６】
かかるゲノムインプリンティング遺伝子の分離方法としては、従来、ゲノムＤＮＡにおけるメチル化の雄雌差を利用した方法（ＲＬＧＳ法；restriction landmark genomic scanning）や、雄雌のゲノムからの遺伝子（ｃＤＮＡ）発現の差を利用した方法（ディファレンシャル・ディスプレー法、アレリック・メッセージ・ディスプレー法、ユニクロモゾーマル・トランスファー法、サブトラクション・ハイブリダイゼーション法）等が知られている。本発明者らにより開発されたサブトラクション・ハイブリダイゼーション法は、母親由来のゲノムのみをもつ単為発生胚又は父親由来のゲノムのみをもつ雄生発生胚と正常受精胚とにおける遺伝子発現の差を利用して、Ｐｅｇ（父親由来のゲノムからのみ発現する遺伝子群）やＭｅｇ（母親由来のゲノムからのみ発現する遺伝子群）を分離する方法であり、かかるサブトラクション・ハイブリダイゼーション法により、本発明者らはＭｅｇ１遺伝子を分離し、このインプリンティングがかかっているＭｅｇ１遺伝子の塩基配列を決定し、公知のＧｒｂ１０遺伝子（Oncogene 10, 1621-1630, 1995）と機能的に同一遺伝子であることを、既に明らかにしている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 1102-1107, 1998）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
インスリンやインスリン様成長因子（ＩＧＦ）は、それぞれインスリン受容体、ＩＧＦ１受容体に結合した後、これらの受容体自身のチロシン残基がリン酸化され、このリン酸化が下流のタンパク質（ＩＲＳ−１〜４等）に伝達されることにより、細胞増殖や糖代謝の調節を行っている。本発明の課題は、インスリンからのシグナル伝達が阻害された場合に引き起こされる糖尿病の発症機構の解明及びかかる糖尿病の治療薬の開発に有用である糖尿病発症モデル哺乳動物や、かかる糖尿病の治療薬をスクリーニングする方法等を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、母性発現を示すインプリンティング遺伝子のスクリーニングにより分離したＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子をベクターに組み込み導入遺伝子を調製し、該導入遺伝子をマイクロインジェクション法により受精卵の雄生前核に注入して培養した後、偽妊娠マウスの輸卵管に戻すことによってトランスジェニックマウスを作製し、かかるトランスジェニックマウスでのＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子の過剰発現により糖尿病発症が引き起こされることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を糖尿病発症モデル動物として使用する方法（請求項１）や、ヒトＧＲＢ１０遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を糖尿病発症モデル動物として使用する方法（請求項２）に関する。
【００１０】
また本発明は、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子が導入された細胞を用いることを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項３）や、ヒトＧＲＢ１０遺伝子が導入された細胞を用いることを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項４）や、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子及び被検物質が導入された細胞を培養し、該培養細胞でＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子を発現させ、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質の活性を測定することを特徴とする請求項３記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項５）や、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子の発現が安定発現であることを特徴とする請求項５記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項６）や、ヒトＧＲＢ１０遺伝子及び被検物質が導入された細胞を培養し、該培養細胞でヒトＧＲＢ１０遺伝子を発現させ、ヒトＧＲＢ１０タンパク質の活性を測定することを特徴とする請求項４記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項７）や、ヒトＧＲＢ１０遺伝子の発現が安定発現であることを特徴とする請求項７記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項８）や、被検物質がタンパク質であり、該タンパク質をコードするＤＮＡとして被検物質が細胞へ導入されることを特徴とする請求項５〜８のいずれか記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項９）や、細胞がヒト由来の細胞であることを特徴とする請求項５〜９のいずれか記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項１０）に関する。
【００１１】
さらに本発明は、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項１１）や、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子が、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１１記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項１２）や、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が、配列表の配列番号１記載のＤＮＡ配列からなるマウスＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子であることを特徴とする請求項１２記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項１３）や、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子として、チキンβ−アクチンプロモーター、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子、ラビットβ−グロビンポリＡシグナルの順に配列されたものを含有する導入遺伝子を用いることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項１４）、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子として、チキンβ−アクチンプロモーター、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子、ラビットβ−グロビンポリＡシグナルの順に配列されたものを含有する導入遺伝子が、配列表の配列番号３記載のＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項１４記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項１５）、ヒトＧＲＢ１０遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項１６）や、ヒトＧＲＢ１０遺伝子として、チキンβ−アクチンプロモーター、ヒトＧＲＢ１０遺伝子、ラビットβ−グロビンポリＡシグナルの順に配列されたものを含有する導入遺伝子を用いることを特徴とする請求項１６記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項１７）や、トランスジェニック非ヒト哺乳動物に被検物質を投与し、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られた尿の尿糖値及び／又は血液の血糖値を測定することを特徴とする請求項１１〜１７のいずれか記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項１８）や、非ヒト哺乳動物がマウスであることを特徴とする請求項１１〜１８のいずれか記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項１９）や、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質と被検物質を液相下で接触せしめ、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質の活性を測定することを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項２０）や、ヒトＧＲＢ１０タンパク質と被検物質を液相下で接触せしめ、ヒトＧＲＢ１０タンパク質の活性を測定することを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項２１）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子とは、哺乳動物のＭｅｇ１遺伝子やＧｒｂ１０遺伝子の他、これら遺伝子と同じ機能を有する変異体遺伝子等も含まれる。ここでＧｒｂ１０遺伝子とは、インシュリン及び／又はインシュリン様成長因子（ＩＧＦ）の情報伝達経路の負の調節因子である成長因子受容体結合タンパク１０をコードする遺伝子をいい、Ｇｒｂ１０遺伝子の具体例が前記のように大井らにより報告（Oncogene 10, 1621-1630, 1995）されている。また、Ｍｅｇ１遺伝子とは、雄生発生胚と正常受精胚における遺伝子発現の差を利用するサブトラクション・ハイブリダイゼーション法で分離することができる、前記Ｇｒｂ１０遺伝子と同一の機能を有する遺伝子をいい、マウスＭｅｇ１遺伝子がマウスＧｒｂ１０遺伝子のスプライシング変異体であることが、本発明者らにより報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 1102-1107, 1998）されている。
【００１３】
本発明におけるＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子としては、マウスＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子と相同性を有する、ラット、ウサギ等の非ヒト哺乳動物の遺伝子であればどのようなものでもよく、例えば、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパクをコードする遺伝子、特に配列表の配列番号１記載のＤＮＡ配列からなるマウスＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子を具体的に挙げることができる。また本発明におけるヒトＧＲＢ１０遺伝子としては、配列表の配列番号５記載のアミノ酸配列からなるタンパクをコードする遺伝子、特に配列表の配列番号４記載のＤＮＡ配列からなるヒトＧＲＢ１０遺伝子を具体的に例示することができる。ヒトＧＲＢ１０遺伝子はヒト染色体７ｑ１１．２−１２に存在し（Genomics 40, 215-216, 1997）、ラッセル・シルバー症候群の候補遺伝子として知られている。また、ヒトＧＲＢ１０遺伝子は、上記マウスＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子ｃＤＮＡとの相同性を利用して、常法により単離することができる。
【００１４】
また、本発明における導入遺伝子としては、上記Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子が、適当な哺乳動物用プロモーターの下流に、かつポリＡシグナルの上流に連結された組換え遺伝子とし構築されたもの等を例示することができるが、かかる哺乳動物用プロモーターやポリＡシグナルの種類は特に制限されるものではなく、またこれらの他にエンハンサーやターミネーターを有するものであってもよい。かかる導入遺伝子としては、例えばチキンβ−アクチンプロモーター、かかるＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子、ラビットβ−グロビンポリＡシグナルの順に配列されたものを含有する導入遺伝子、特に具体的には配列表の配列番号３記載のＤＮＡ配列からなる導入遺伝子を例示することができる。
【００１５】
上記導入遺伝子に組み込まれたＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子が受精卵等の細胞内で発現すると、細胞内にＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質又はヒトＧＲＢ１０タンパク質が産生されることになる。そして、マウスＭｅｇ１タンパク質のアミノ酸配列は、前記のように配列表の配列番号２に記載されている。また、公知のヒトＧＲＢ１０タンパク質のアミノ酸配列についても前記のように配列表の配列番号５に記載されている。
【００１６】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、例えばマウス等の非ヒト哺乳動物の受精卵にＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子を導入し、当該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物に移植し、当該非ヒト哺乳動物からＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物を分娩させることにより創製することができる。非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギ等の哺乳動物を例示することができるが、創製、育成、使用の簡便さ等からしてマウスが好ましい。また、受精卵への遺伝子の導入方法は特に限定されるものではなく、マイクロインジェクション法やエレクトロポレーション法等を例示することができる。
【００１７】
トランスジェニック非ヒト哺乳動物がトランスジェニックマウスの場合を例に挙げてより具体的に説明すると、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子の発現産物をコードするｃＤＮＡを、チキンβ−アクチンプロモーターの下流に、かつラビットβ−グロビンポリＡの上流に含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の雄性前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、偽妊娠雌性マウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することによりトランスジェニックマウスを創製することができる。上記マウスの受精卵としては、例えば、１２９／ｓｖ、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ、ＳＪＬ／Ｗｔ等に由来するマウスの交配により得られるものならばどのようなものでもよいが、前核段階で細胞質内において雄性前核と雌性前核が独立したとき識別が可能な点で、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）系マウスとＣ３Ｈ系マウスとの交配によって得られるＢ６Ｃ３Ｈ系マウス同士の受精卵を用いることが好ましい。また、注入する導入遺伝子の数は受精卵１個当たり１００〜３０００分子が適当である。そしてまた、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入したＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
【００１８】
本発明の糖尿病治療薬のスクリーニング方法は、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子を用いることを特徴とする。とりわけＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子は、前記のように、インプリンティング遺伝子であることが明らかにされており、正常では片親性の発現を示し、発現が過剰又は欠損する場合に種々の影響が現れる。母親性のインプリンティング遺伝子であるＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子が導入され、その発現が過剰となった本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物においては、この遺伝子が伝わった雄のみが糖尿病を発症することになり、雌では発症率が極めて低いか、あるいは症状が極めて軽微である。したがって、本発明の糖尿病治療薬のスクリーニング方法には、通常、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物のうち雄が用いられるが、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の雌も、糖尿病治療薬のスクリーニングにおける同腹のコントロールとして、あるいはインスリンからのシグナル伝達が阻害された場合に引き起こされる糖尿病の発症機構の解明に使用することができる。
【００１９】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いる本発明の糖尿病治療薬のスクリーニング方法には、主として糖尿病発症性のトランスジェニック非ヒト哺乳動物が用いられ、具体的には、糖尿病発症性のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、例えば雄のトランスジェニックマウスに、被検物質を投与し、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られた尿の尿糖値や、眼球の付け根部分や尻尾などから採血した血液の血糖値等を測定したり、生存率等を検討することにより、該被検物質の糖尿病治療効果を評価することができる。
【００２０】
Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子を用いる本発明の糖尿病治療薬のスクリーニング方法としては、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いる上記インビボでスクリーニングする方法の他に、インビトロでスクリーニングする方法も挙げることができる。かかるインビトロでの糖尿病治療薬のスクリーニング方法としては、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子と被検物質を細胞に導入した後培養し、該培養細胞内でＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子を発現させ、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質又はヒトＧＲＢ１０タンパク質の活性を測定するスクリーニング方法、例えば、かかるＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質又はヒトＧＲＢ１０タンパク質の活性を指標として被検物質を導入していないコントロールとの対比によりスクリーニングする方法を挙げることができる。
【００２１】
Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子の細胞内への導入は、該遺伝子をレトロウイルスＬＴＲプロモーターやアデノウイルス主要後期プロモーター等を備えた発現ベクター等に組み込んでトランスフェクションする方法や前記導入遺伝子をマイクロインジェクションする方法等公知のＤＮＡ導入方法を用いることができるが、該遺伝子の細胞内での発現は安定発現（stable expression）の方が一時的発現（transient expression）よりも好ましいことから、トランスフェクション法等の安定発現系を構築することができる導入方法が好ましい。他方、被検物質の細胞内への導入方法としては被検物質の溶液を細胞内へマイクロインジェクションする方法等を例示することができるが、被検物質がタンパク質の場合は、該タンパク質をコードするＤＮＡをベクター等に組み込んでトランスフェクションすることもできる。
【００２２】
また、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子や被検物質が導入される細胞としては、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子を発現することができる細胞であればどのような細胞でもよいが、例えば、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子やヒトＧＲＢ１０遺伝子を発現させる細胞としては、ＢＨＫ２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）、ＣＯＳ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）の他、Ｃａｐａｎ−１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−７９）、Ｃａｐａｎ−２（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８０）、ＣＯＬＯ ５８７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０００）、ＨＰＡＦ−II（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９９７）、Ｈｓ ７６６Ｔ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１３４）等のヒト膵臓由来の細胞やＤＡＫＩＫＩ（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−２０６）、Ｃ５／ＭＪ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８２９３）等のヒトリンパ球由来の細胞などのヒト細胞を挙げることができる。
【００２３】
また、本発明のインビトロでの糖尿病治療薬のスクリーニング方法としては、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質又はヒトＧＲＢ１０タンパク質と被検物質を液相下、例えば緩衝液中で接触せしめ、かかるＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質又はヒトＧＲＢ１０タンパク質の活性を測定するスクリーニング方法を挙げることもできる。またＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質又はヒトＧＲＢ１０タンパク質の活性の測定方法としては、これらＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質又はヒトＧＲＢ１０タンパク質の作用・機能を利用する方法であればどのような方法でもよく、例えば、かかるタンパク質とインスリン受容体との結合の阻害の程度を検出する方法を挙げることができ、より具体的には、放射性物質又は蛍光ラベルしたＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質の全部又はＳＨ２ドメイン（配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列のうち５６８番目から５９６番目までの領域）と被検物質とを、インスリン受容体の細胞質部分（配列表の配列番号６記載のアミノ酸配列のうち９６８番目から１３７２番目までの領域）と接触せしめ、インスリン受容体に対する抗体で沈澱させる方法（免疫抗体沈澱法）や、センサーチップ上にかかるインスリン受容体の細胞質部分を結合させ、被検物質とＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質の全部又はＳＨ２ドメインとを含む溶液に該センサーチップを浸漬して、結合した分子数を検出する表面プラズモン共鳴バイオセンサ法等を挙げることができる。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例により何ら制限されるものではない。
実施例１［Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子の調製］
（雄核発生胚及び正常受精胚の単離）
文献（Manipulations of Genetic Constitution by Nuclear Transplantation, Vol.225, 732-744, 1993）記載の方法で前核移植を行い、１２９／ｓｖ系の母親由来のゲノムのみをもつように未受精卵を人工的に発生させた雄核発生胚（マウスの初期胚；９．５日）を作製し単離した。また、１２９／ｓｖ系の父親（精子）及び母親（卵子）の両方から由来するゲノムをもつ正常受精胚を常法により単離した。
【００２５】
（ｃＤＮＡライブラリーの作製）
上記正常受精胚及び雄性発生胚のそれぞれから、マイクロＦＡＳＴ ＴＲＡＣＫ（インビトロゲン社製）を用いたオリゴ（ｄＴ）−セルロース法によりｍＲＮＡを精製し、グリコーゲンを加えてエタノール沈殿法により沈殿させ、これらｍＲＮＡを回収した。次にλＺＡＰIIｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーン社製）の指示に基づき、Superscript II逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社製）とｄＴプライマー（ベーリンガーマンハイム社製）とを用いて、前記回収された各５００ｎｇのｍＲＮＡを逆転写することによりｃＤＮＡを合成し、次いでその末端の平滑化を行った。正常受精胚から得られたｃＤＮＡの両端には図１で示されるＦ−リンカーを、雄性発生胚から得られたｃＤＮＡの両端には図２で示されるＡ−リンカーをそれぞれ結合させた。これら、Ｆ−リンカー及びＡ−リンカー共に、相補的な１７ｍｅｒと２０ｍｅｒのオリゴＤＮＡから作製されており、１７ｍｅｒの５′末端はリン酸化されている。なお、Ｆ−リンカー及びＡ−リンカーの塩基配列は配列表の配列番号７〜１０にそれぞれ示されている。
【００２６】
（ＰＣＲによる増幅）
上記リンカーに用いた１７ｍｅｒと２０ｍｅｒのオリゴＤＮＡに相補的なプライマーを用いてＰＣＲ法によりｃＤＮＡライブラリーを増幅させた。１００μｌの反応溶液［最終濃度で２０ｍＭのトリスＨＣｌ、１０ｍＭのＫＣｌ、６ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、３．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１％のトライトンＸ−１００、１０ｍＭのウシ血清アルブミン、４種類全ての ｄＮＴＰ（各１２０μＭ）、８０ｐｍｏｌの各リンカーに相補的なプライマー及び２．５ｕｎｉｔのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）を含有する溶液；ｐＨ８．２］にｃＤＮＡを添加し、Perkin-Elmer GeneAmp PCR system 9600を用いて、９６℃で５秒間熱変性させ、６５℃で１分間アニーリングし、７２℃で１０分間伸長反応を行うというサイクルを３０回繰り返すという増幅反応を行った。増幅後、文献（Nat. Genet. 11, 52-59, 1995）記載の方法によりサブトラクション・ハイブリダイゼーション法を行った。
【００２７】
（サブトラクション・ハイブリダイゼーション法）
１０ｎｇの正常受精胚ｃＤＮＡと、１μｇのビオチン化した雄性発生胚ｃＤＮＡと、磁気ビーズを用いて３回サブトラクションを繰り返し行い、濃縮されたｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡをプローブとして、正常受精胚のｃＤＮＡライブラリーとハイブリダイゼーションすることにより、母親由来のゲノムからのみ発現する長さの異なるいくつかのＭｅｇ１ｃＤＮＡクローンを単離した。かかるＭｅｇ１ｃＤＮＡのうち最長のものは５．４ｋｂであり、このｃＤＮＡの決定された塩基配列からして、Ｍｅｇ１はＧｒｂ１０であると同定されたが、前記大井らにより報告されているシークエンスと比較して７５ｂｐ（２５アミノ酸）の欠損があることがわかった。
【００２８】
実施例２［トランスジェニックマウスの創製］
（導入遺伝子の構築）
大阪大学医学部の宮崎純一博士から分与をうけた、ＣＭＶ−ＩＥエンハンサーとチキンβ−アクチンプロモーターとラビットβ−グロビンポリＡシグナルとを含むベクターｐＣＡＧＧＳ（Gene 108,193-200,1991）のＸｈｏＩサイトに上記得られたＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子ｃＤＮＡを挿入した後、ＳｓｐＩとＨｉｎｄIIIの制限酵素により切断し、図３に示される５′末端側からＣＭＶ−ＩＥエンハンサーとチキンβ−アクチンプロモーターと１．７９ｋｂのＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０ｃＤＮＡとラビットβ−グロビンポリＡシグナルを含む４．２ｋｂの導入遺伝子を構築した。
【００２９】
（トランスジェニックマウスの作製）
上記導入遺伝子をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に１０００コピー／ｐｌとなるように溶解し、このＤＮＡ溶液２ｐｌをマイクロインジェクション法により、Ｂ６Ｃ３Ｈ系マウス同士の交配により得られた受精卵（初期胚０．５日）の雄性前核に注入した。これを２細胞期までＭ１６培地中にて３７℃で培養し、偽妊娠マウス（ＩＣＲ系）の輸卵管に戻して個体へと発生させ、帝王切開によりトランスジェニックマウスを取り出した。この得られたトランスジェニックマウスをすぐに仮親（同時期に出産した雌マウス）につけ、離乳期まで育てた。出生後１〜３週間の間に、かかるトランスジェニックマウスマウスの尻尾を５ｍｍほど切り取り、ゲノムＤＮＡを抽出した。トランスジーンの確認は導入したＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０ｃＤＮＡを特異的に検出するプライマーを用いて、ＰＣＲ法により行った。
【００３０】
（糖尿病発症性トランスジェニックマウス）
作製したトランスジェニックマウス５系統のうち、４系統には出生後の成長不良が、１系統には出生前後の成長不良や新生児致死性がみられた。５系統のうちの２系統（１０ｌ、１８Ｌ）につき、糖尿病の発症率について調べてみた。糖尿病の判定は、ヒトの尿糖測定用の検査紙ヘマコンビスティック（バイエル・三共株式会社製）にマウスの尿をつけ、発色の程度により判定する尿糖値の検査により行った。判定は発色の程度により、−（陰性），＋（擬陽性），++（陽性），++++（陽性）の４段階で行った。糖尿病と判定されたものの殆どは判定（++++）であった。また、糖尿病の判定を、眼球の付け根部分又は尻尾から採血し、グルテストエース（株式会社三和科学研究所社製）を用いて血液中のグルコースを測定する血糖値の検査により行い、２００ｍｇ／ｄｌ以上のものを糖尿病と判定した。糖尿病と判定されたものの殆どは４００ｍｇ／ｄｌ以上の値を示していた。
【００３１】
上記２系統のトランスジェニックマウスにおいて生後３ヶ月を過ぎる頃から糖尿が検出されるようになった。１系統（１８Ｌ）のマウスでは、８ヶ月までにトランスジーンをヘテロにもつ雄の７０％以上に糖尿及び高血糖がみられ、発症の早かったものについては症状は非常に激しく、発症後２ヶ月くらいで死亡するマウスも多かった。発症の遅かったマウスにおいても尿糖、血糖とも非常に高い値を示したが、外見上元気に育っていた。雌マウスでは、擬陽性と判断されるマウス２匹（表１中＊印）いただけで、糖尿病と判定されるマウスはいなかった。他の１系統（１０ｌ）の雄マウスのうち、トランスジーンをヘテロにもつマウスでは尿糖、血糖の異常は軽い症状であったが、トランスジーンをホモにもつマウスでは早期発症の激症型糖尿病が現出していた。これら２系統のトランスジェニックマウスにおける糖尿病の発症率を表１に示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【発明の効果】
本発明によると、マウスＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子を用いることにより、新規糖尿病治療薬をスクリーニングすることができ、また、本発明のＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０トランスジェニックマウス又はＧＲＢ１０トランスジェニックマウス等のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、インスリンからのシグナル伝達が阻害された場合に引き起こされる糖尿病発症モデル動物として、発症機構の解明、新規糖尿病治療薬の開発に有用である。
【００３４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に用いたＦ−リンカーを示す図である。
【図２】本発明に用いたＡ−リンカーを示す図である。
【図３】本発明のＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０トランスジェニックマウスの導入遺伝子構造を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖尿病発症性トランスジェニックマウス等の糖尿病発症モデル非ヒト哺乳動物や、これを用いた糖尿病治療薬のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インスリン作用の相対的あるいは絶対的な不足によって引き起こされる糖質代謝異常を中心とする種々の代謝異常である糖尿病は、大きくインスリン依存性糖尿病（Ｉ型：ＩＤＤＭ）とインスリン非依存性糖尿病（II型：ＮＩＤＤＭ）との２つに分類され、インスリン依存性糖尿病は自己免疫的な機序により膵島β細胞の破壊が進行し、インスリン分泌低下をきたすことにより発症し、一方、インスリン非依存性糖尿病は遺伝的なインスリン分泌低下と骨格筋でのインスリン抵抗性の素因に、肥満によるインスリン抵抗性が加わり発症に至り、このインスリン非依存性糖尿病は全糖尿病の９５％以上を占めている。
【０００３】
現在、遺伝子レベルで原因がわかっている糖尿病としては、インスリン異常症、インスリン受容体異常症、グルコキナーゼ遺伝子異常症（ＭＯＤＹ２）、ミトコンドリアＤＮＡ異常による糖尿病があり、また、連鎖解析によりＭＯＤＹ１、ＭＯＤＹ３、ＮＩＤＤＭ１、ＮＩＤＤＭ２の遺伝子の染色体上の位置がマッピングされている。一方、糖尿病モデル動物としては、従来、ＮＯＤ（non-obese diabetic）マウスや、ヒトインスリン遺伝子プロモーターと、かかるプロモーターの下部に付着される熱衝撃蛋白質７０遺伝子が融合された糖尿病発生遺伝子をマウスに導入した糖尿病発生トランスジェニックマウス（特開平９−２８３８４号公報）や、ヒトインスリンを分泌するように改変されたヒト化インスリン遺伝子を含有するトランスジェニック魚（特表平１０−５０４７２５号公報）や、II型真性糖尿病のトランスジェニック動物モデル（特表平１０−５０７０８４号公報）等が提案されている。
【０００４】
他方、ゲノムインプリンティングは、高等脊椎動物では哺乳類だけに見られる遺伝子発現様式であり、哺乳類の個体発生、成長、行動などに重要な役割を果たしており、ヒトにおいてはある種の遺伝病や発ガンとも関係していることがわかってきている。このゲノムインプリンティングは、父親由来と母親由来のゲノムが個体発生に関して機能的に異なる役割を果たす現象として知られている（Cell 45, 127, 1986、Cell 37, 179, 1984、Nature 315, 496, 1985）。
【０００５】
上記インプリンティング遺伝子は、１９９１年に最初に発見され（Cell 64, 849, 1991）、父性発現と母性発現を示す遺伝子群が存在することが明らかとなり、ヒト及びマウスにおいて３０を越えるこのような遺伝子の存在が既に報告されている。また、哺乳類の個体発生や成長、行動に関係するゲノムインプリンティングの分子機構的理解は、特定のインプリンティング遺伝子（群）の発現の欠除又は過剰による胎児期致死、新生児致死、成長過剰、成育不良、行動異常［Nature 315, 496, 1985、Frontiers in Molecular Biology, p118,（IRL Press, Oxford, 1997）］や、いくつかのヒト遺伝病（Trends Genet 5, 331, 1989、Semin Cancer Biol 3, 151, 1992、Hum Mol Genet 4, 1757, 1995、Trends Genet 13, 436, 1997）を直接又は間接的に引き起こす原因の解明を可能なものとしている。
【０００６】
かかるゲノムインプリンティング遺伝子の分離方法としては、従来、ゲノムＤＮＡにおけるメチル化の雄雌差を利用した方法（ＲＬＧＳ法；restriction landmark genomic scanning）や、雄雌のゲノムからの遺伝子（ｃＤＮＡ）発現の差を利用した方法（ディファレンシャル・ディスプレー法、アレリック・メッセージ・ディスプレー法、ユニクロモゾーマル・トランスファー法、サブトラクション・ハイブリダイゼーション法）等が知られている。本発明者らにより開発されたサブトラクション・ハイブリダイゼーション法は、母親由来のゲノムのみをもつ単為発生胚又は父親由来のゲノムのみをもつ雄生発生胚と正常受精胚とにおける遺伝子発現の差を利用して、Ｐｅｇ（父親由来のゲノムからのみ発現する遺伝子群）やＭｅｇ（母親由来のゲノムからのみ発現する遺伝子群）を分離する方法であり、かかるサブトラクション・ハイブリダイゼーション法により、本発明者らはＭｅｇ１遺伝子を分離し、このインプリンティングがかかっているＭｅｇ１遺伝子の塩基配列を決定し、公知のＧｒｂ１０遺伝子（Oncogene 10, 1621-1630, 1995）と機能的に同一遺伝子であることを、既に明らかにしている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 1102-1107, 1998）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
インスリンやインスリン様成長因子（ＩＧＦ）は、それぞれインスリン受容体、ＩＧＦ１受容体に結合した後、これらの受容体自身のチロシン残基がリン酸化され、このリン酸化が下流のタンパク質（ＩＲＳ−１〜４等）に伝達されることにより、細胞増殖や糖代謝の調節を行っている。本発明の課題は、インスリンからのシグナル伝達が阻害された場合に引き起こされる糖尿病の発症機構の解明及びかかる糖尿病の治療薬の開発に有用である糖尿病発症モデル哺乳動物や、かかる糖尿病の治療薬をスクリーニングする方法等を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、母性発現を示すインプリンティング遺伝子のスクリーニングにより分離したＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子をベクターに組み込み導入遺伝子を調製し、該導入遺伝子をマイクロインジェクション法により受精卵の雄生前核に注入して培養した後、偽妊娠マウスの輸卵管に戻すことによってトランスジェニックマウスを作製し、かかるトランスジェニックマウスでのＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子の過剰発現により糖尿病発症が引き起こされることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を糖尿病発症モデル動物として使用する方法（請求項１）や、ヒトＧＲＢ１０遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を糖尿病発症モデル動物として使用する方法（請求項２）に関する。
【００１０】
また本発明は、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子が導入された細胞を用いることを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項３）や、ヒトＧＲＢ１０遺伝子が導入された細胞を用いることを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項４）や、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子及び被検物質が導入された細胞を培養し、該培養細胞でＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子を発現させ、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質の活性を測定することを特徴とする請求項３記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項５）や、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子の発現が安定発現であることを特徴とする請求項５記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項６）や、ヒトＧＲＢ１０遺伝子及び被検物質が導入された細胞を培養し、該培養細胞でヒトＧＲＢ１０遺伝子を発現させ、ヒトＧＲＢ１０タンパク質の活性を測定することを特徴とする請求項４記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項７）や、ヒトＧＲＢ１０遺伝子の発現が安定発現であることを特徴とする請求項７記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項８）や、被検物質がタンパク質であり、該タンパク質をコードするＤＮＡとして被検物質が細胞へ導入されることを特徴とする請求項５〜８のいずれか記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項９）や、細胞がヒト由来の細胞であることを特徴とする請求項５〜９のいずれか記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項１０）に関する。
【００１１】
さらに本発明は、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項１１）や、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子が、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１１記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項１２）や、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が、配列表の配列番号１記載のＤＮＡ配列からなるマウスＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子であることを特徴とする請求項１２記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項１３）や、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子として、チキンβ−アクチンプロモーター、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子、ラビットβ−グロビンポリＡシグナルの順に配列されたものを含有する導入遺伝子を用いることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項１４）、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子として、チキンβ−アクチンプロモーター、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子、ラビットβ−グロビンポリＡシグナルの順に配列されたものを含有する導入遺伝子が、配列表の配列番号３記載のＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項１４記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項１５）、ヒトＧＲＢ１０遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項１６）や、ヒトＧＲＢ１０遺伝子として、チキンβ−アクチンプロモーター、ヒトＧＲＢ１０遺伝子、ラビットβ−グロビンポリＡシグナルの順に配列されたものを含有する導入遺伝子を用いることを特徴とする請求項１６記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項１７）や、トランスジェニック非ヒト哺乳動物に被検物質を投与し、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られた尿の尿糖値及び／又は血液の血糖値を測定することを特徴とする請求項１１〜１７のいずれか記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項１８）や、非ヒト哺乳動物がマウスであることを特徴とする請求項１１〜１８のいずれか記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項１９）や、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質と被検物質を液相下で接触せしめ、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質の活性を測定することを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項２０）や、ヒトＧＲＢ１０タンパク質と被検物質を液相下で接触せしめ、ヒトＧＲＢ１０タンパク質の活性を測定することを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法（請求項２１）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子とは、哺乳動物のＭｅｇ１遺伝子やＧｒｂ１０遺伝子の他、これら遺伝子と同じ機能を有する変異体遺伝子等も含まれる。ここでＧｒｂ１０遺伝子とは、インシュリン及び／又はインシュリン様成長因子（ＩＧＦ）の情報伝達経路の負の調節因子である成長因子受容体結合タンパク１０をコードする遺伝子をいい、Ｇｒｂ１０遺伝子の具体例が前記のように大井らにより報告（Oncogene 10, 1621-1630, 1995）されている。また、Ｍｅｇ１遺伝子とは、雄生発生胚と正常受精胚における遺伝子発現の差を利用するサブトラクション・ハイブリダイゼーション法で分離することができる、前記Ｇｒｂ１０遺伝子と同一の機能を有する遺伝子をいい、マウスＭｅｇ１遺伝子がマウスＧｒｂ１０遺伝子のスプライシング変異体であることが、本発明者らにより報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 1102-1107, 1998）されている。
【００１３】
本発明におけるＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子としては、マウスＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子と相同性を有する、ラット、ウサギ等の非ヒト哺乳動物の遺伝子であればどのようなものでもよく、例えば、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパクをコードする遺伝子、特に配列表の配列番号１記載のＤＮＡ配列からなるマウスＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子を具体的に挙げることができる。また本発明におけるヒトＧＲＢ１０遺伝子としては、配列表の配列番号５記載のアミノ酸配列からなるタンパクをコードする遺伝子、特に配列表の配列番号４記載のＤＮＡ配列からなるヒトＧＲＢ１０遺伝子を具体的に例示することができる。ヒトＧＲＢ１０遺伝子はヒト染色体７ｑ１１．２−１２に存在し（Genomics 40, 215-216, 1997）、ラッセル・シルバー症候群の候補遺伝子として知られている。また、ヒトＧＲＢ１０遺伝子は、上記マウスＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子ｃＤＮＡとの相同性を利用して、常法により単離することができる。
【００１４】
また、本発明における導入遺伝子としては、上記Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子が、適当な哺乳動物用プロモーターの下流に、かつポリＡシグナルの上流に連結された組換え遺伝子とし構築されたもの等を例示することができるが、かかる哺乳動物用プロモーターやポリＡシグナルの種類は特に制限されるものではなく、またこれらの他にエンハンサーやターミネーターを有するものであってもよい。かかる導入遺伝子としては、例えばチキンβ−アクチンプロモーター、かかるＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子、ラビットβ−グロビンポリＡシグナルの順に配列されたものを含有する導入遺伝子、特に具体的には配列表の配列番号３記載のＤＮＡ配列からなる導入遺伝子を例示することができる。
【００１５】
上記導入遺伝子に組み込まれたＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子が受精卵等の細胞内で発現すると、細胞内にＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質又はヒトＧＲＢ１０タンパク質が産生されることになる。そして、マウスＭｅｇ１タンパク質のアミノ酸配列は、前記のように配列表の配列番号２に記載されている。また、公知のヒトＧＲＢ１０タンパク質のアミノ酸配列についても前記のように配列表の配列番号５に記載されている。
【００１６】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、例えばマウス等の非ヒト哺乳動物の受精卵にＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子を導入し、当該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物に移植し、当該非ヒト哺乳動物からＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物を分娩させることにより創製することができる。非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギ等の哺乳動物を例示することができるが、創製、育成、使用の簡便さ等からしてマウスが好ましい。また、受精卵への遺伝子の導入方法は特に限定されるものではなく、マイクロインジェクション法やエレクトロポレーション法等を例示することができる。
【００１７】
トランスジェニック非ヒト哺乳動物がトランスジェニックマウスの場合を例に挙げてより具体的に説明すると、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子の発現産物をコードするｃＤＮＡを、チキンβ−アクチンプロモーターの下流に、かつラビットβ−グロビンポリＡの上流に含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の雄性前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、偽妊娠雌性マウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することによりトランスジェニックマウスを創製することができる。上記マウスの受精卵としては、例えば、１２９／ｓｖ、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ、ＳＪＬ／Ｗｔ等に由来するマウスの交配により得られるものならばどのようなものでもよいが、前核段階で細胞質内において雄性前核と雌性前核が独立したとき識別が可能な点で、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）系マウスとＣ３Ｈ系マウスとの交配によって得られるＢ６Ｃ３Ｈ系マウス同士の受精卵を用いることが好ましい。また、注入する導入遺伝子の数は受精卵１個当たり１００〜３０００分子が適当である。そしてまた、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入したＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
【００１８】
本発明の糖尿病治療薬のスクリーニング方法は、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子を用いることを特徴とする。とりわけＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子は、前記のように、インプリンティング遺伝子であることが明らかにされており、正常では片親性の発現を示し、発現が過剰又は欠損する場合に種々の影響が現れる。母親性のインプリンティング遺伝子であるＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子が導入され、その発現が過剰となった本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物においては、この遺伝子が伝わった雄のみが糖尿病を発症することになり、雌では発症率が極めて低いか、あるいは症状が極めて軽微である。したがって、本発明の糖尿病治療薬のスクリーニング方法には、通常、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物のうち雄が用いられるが、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の雌も、糖尿病治療薬のスクリーニングにおける同腹のコントロールとして、あるいはインスリンからのシグナル伝達が阻害された場合に引き起こされる糖尿病の発症機構の解明に使用することができる。
【００１９】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いる本発明の糖尿病治療薬のスクリーニング方法には、主として糖尿病発症性のトランスジェニック非ヒト哺乳動物が用いられ、具体的には、糖尿病発症性のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、例えば雄のトランスジェニックマウスに、被検物質を投与し、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られた尿の尿糖値や、眼球の付け根部分や尻尾などから採血した血液の血糖値等を測定したり、生存率等を検討することにより、該被検物質の糖尿病治療効果を評価することができる。
【００２０】
Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子を用いる本発明の糖尿病治療薬のスクリーニング方法としては、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いる上記インビボでスクリーニングする方法の他に、インビトロでスクリーニングする方法も挙げることができる。かかるインビトロでの糖尿病治療薬のスクリーニング方法としては、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子と被検物質を細胞に導入した後培養し、該培養細胞内でＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子を発現させ、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質又はヒトＧＲＢ１０タンパク質の活性を測定するスクリーニング方法、例えば、かかるＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質又はヒトＧＲＢ１０タンパク質の活性を指標として被検物質を導入していないコントロールとの対比によりスクリーニングする方法を挙げることができる。
【００２１】
Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子の細胞内への導入は、該遺伝子をレトロウイルスＬＴＲプロモーターやアデノウイルス主要後期プロモーター等を備えた発現ベクター等に組み込んでトランスフェクションする方法や前記導入遺伝子をマイクロインジェクションする方法等公知のＤＮＡ導入方法を用いることができるが、該遺伝子の細胞内での発現は安定発現（stable expression）の方が一時的発現（transient expression）よりも好ましいことから、トランスフェクション法等の安定発現系を構築することができる導入方法が好ましい。他方、被検物質の細胞内への導入方法としては被検物質の溶液を細胞内へマイクロインジェクションする方法等を例示することができるが、被検物質がタンパク質の場合は、該タンパク質をコードするＤＮＡをベクター等に組み込んでトランスフェクションすることもできる。
【００２２】
また、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子や被検物質が導入される細胞としては、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子を発現することができる細胞であればどのような細胞でもよいが、例えば、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子やヒトＧＲＢ１０遺伝子を発現させる細胞としては、ＢＨＫ２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）、ＣＯＳ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）の他、Ｃａｐａｎ−１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−７９）、Ｃａｐａｎ−２（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８０）、ＣＯＬＯ ５８７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０００）、ＨＰＡＦ−II（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９９７）、Ｈｓ ７６６Ｔ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１３４）等のヒト膵臓由来の細胞やＤＡＫＩＫＩ（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−２０６）、Ｃ５／ＭＪ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８２９３）等のヒトリンパ球由来の細胞などのヒト細胞を挙げることができる。
【００２３】
また、本発明のインビトロでの糖尿病治療薬のスクリーニング方法としては、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質又はヒトＧＲＢ１０タンパク質と被検物質を液相下、例えば緩衝液中で接触せしめ、かかるＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質又はヒトＧＲＢ１０タンパク質の活性を測定するスクリーニング方法を挙げることもできる。またＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質又はヒトＧＲＢ１０タンパク質の活性の測定方法としては、これらＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質又はヒトＧＲＢ１０タンパク質の作用・機能を利用する方法であればどのような方法でもよく、例えば、かかるタンパク質とインスリン受容体との結合の阻害の程度を検出する方法を挙げることができ、より具体的には、放射性物質又は蛍光ラベルしたＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質の全部又はＳＨ２ドメイン（配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列のうち５６８番目から５９６番目までの領域）と被検物質とを、インスリン受容体の細胞質部分（配列表の配列番号６記載のアミノ酸配列のうち９６８番目から１３７２番目までの領域）と接触せしめ、インスリン受容体に対する抗体で沈澱させる方法（免疫抗体沈澱法）や、センサーチップ上にかかるインスリン受容体の細胞質部分を結合させ、被検物質とＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質の全部又はＳＨ２ドメインとを含む溶液に該センサーチップを浸漬して、結合した分子数を検出する表面プラズモン共鳴バイオセンサ法等を挙げることができる。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例により何ら制限されるものではない。
実施例１［Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子の調製］
（雄核発生胚及び正常受精胚の単離）
文献（Manipulations of Genetic Constitution by Nuclear Transplantation, Vol.225, 732-744, 1993）記載の方法で前核移植を行い、１２９／ｓｖ系の母親由来のゲノムのみをもつように未受精卵を人工的に発生させた雄核発生胚（マウスの初期胚；９．５日）を作製し単離した。また、１２９／ｓｖ系の父親（精子）及び母親（卵子）の両方から由来するゲノムをもつ正常受精胚を常法により単離した。
【００２５】
（ｃＤＮＡライブラリーの作製）
上記正常受精胚及び雄性発生胚のそれぞれから、マイクロＦＡＳＴ ＴＲＡＣＫ（インビトロゲン社製）を用いたオリゴ（ｄＴ）−セルロース法によりｍＲＮＡを精製し、グリコーゲンを加えてエタノール沈殿法により沈殿させ、これらｍＲＮＡを回収した。次にλＺＡＰIIｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーン社製）の指示に基づき、Superscript II逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社製）とｄＴプライマー（ベーリンガーマンハイム社製）とを用いて、前記回収された各５００ｎｇのｍＲＮＡを逆転写することによりｃＤＮＡを合成し、次いでその末端の平滑化を行った。正常受精胚から得られたｃＤＮＡの両端には図１で示されるＦ−リンカーを、雄性発生胚から得られたｃＤＮＡの両端には図２で示されるＡ−リンカーをそれぞれ結合させた。これら、Ｆ−リンカー及びＡ−リンカー共に、相補的な１７ｍｅｒと２０ｍｅｒのオリゴＤＮＡから作製されており、１７ｍｅｒの５′末端はリン酸化されている。なお、Ｆ−リンカー及びＡ−リンカーの塩基配列は配列表の配列番号７〜１０にそれぞれ示されている。
【００２６】
（ＰＣＲによる増幅）
上記リンカーに用いた１７ｍｅｒと２０ｍｅｒのオリゴＤＮＡに相補的なプライマーを用いてＰＣＲ法によりｃＤＮＡライブラリーを増幅させた。１００μｌの反応溶液［最終濃度で２０ｍＭのトリスＨＣｌ、１０ｍＭのＫＣｌ、６ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、３．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１％のトライトンＸ−１００、１０ｍＭのウシ血清アルブミン、４種類全ての ｄＮＴＰ（各１２０μＭ）、８０ｐｍｏｌの各リンカーに相補的なプライマー及び２．５ｕｎｉｔのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）を含有する溶液；ｐＨ８．２］にｃＤＮＡを添加し、Perkin-Elmer GeneAmp PCR system 9600を用いて、９６℃で５秒間熱変性させ、６５℃で１分間アニーリングし、７２℃で１０分間伸長反応を行うというサイクルを３０回繰り返すという増幅反応を行った。増幅後、文献（Nat. Genet. 11, 52-59, 1995）記載の方法によりサブトラクション・ハイブリダイゼーション法を行った。
【００２７】
（サブトラクション・ハイブリダイゼーション法）
１０ｎｇの正常受精胚ｃＤＮＡと、１μｇのビオチン化した雄性発生胚ｃＤＮＡと、磁気ビーズを用いて３回サブトラクションを繰り返し行い、濃縮されたｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡをプローブとして、正常受精胚のｃＤＮＡライブラリーとハイブリダイゼーションすることにより、母親由来のゲノムからのみ発現する長さの異なるいくつかのＭｅｇ１ｃＤＮＡクローンを単離した。かかるＭｅｇ１ｃＤＮＡのうち最長のものは５．４ｋｂであり、このｃＤＮＡの決定された塩基配列からして、Ｍｅｇ１はＧｒｂ１０であると同定されたが、前記大井らにより報告されているシークエンスと比較して７５ｂｐ（２５アミノ酸）の欠損があることがわかった。
【００２８】
実施例２［トランスジェニックマウスの創製］
（導入遺伝子の構築）
大阪大学医学部の宮崎純一博士から分与をうけた、ＣＭＶ−ＩＥエンハンサーとチキンβ−アクチンプロモーターとラビットβ−グロビンポリＡシグナルとを含むベクターｐＣＡＧＧＳ（Gene 108,193-200,1991）のＸｈｏＩサイトに上記得られたＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子ｃＤＮＡを挿入した後、ＳｓｐＩとＨｉｎｄIIIの制限酵素により切断し、図３に示される５′末端側からＣＭＶ−ＩＥエンハンサーとチキンβ−アクチンプロモーターと１．７９ｋｂのＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０ｃＤＮＡとラビットβ−グロビンポリＡシグナルを含む４．２ｋｂの導入遺伝子を構築した。
【００２９】
（トランスジェニックマウスの作製）
上記導入遺伝子をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に１０００コピー／ｐｌとなるように溶解し、このＤＮＡ溶液２ｐｌをマイクロインジェクション法により、Ｂ６Ｃ３Ｈ系マウス同士の交配により得られた受精卵（初期胚０．５日）の雄性前核に注入した。これを２細胞期までＭ１６培地中にて３７℃で培養し、偽妊娠マウス（ＩＣＲ系）の輸卵管に戻して個体へと発生させ、帝王切開によりトランスジェニックマウスを取り出した。この得られたトランスジェニックマウスをすぐに仮親（同時期に出産した雌マウス）につけ、離乳期まで育てた。出生後１〜３週間の間に、かかるトランスジェニックマウスマウスの尻尾を５ｍｍほど切り取り、ゲノムＤＮＡを抽出した。トランスジーンの確認は導入したＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０ｃＤＮＡを特異的に検出するプライマーを用いて、ＰＣＲ法により行った。
【００３０】
（糖尿病発症性トランスジェニックマウス）
作製したトランスジェニックマウス５系統のうち、４系統には出生後の成長不良が、１系統には出生前後の成長不良や新生児致死性がみられた。５系統のうちの２系統（１０ｌ、１８Ｌ）につき、糖尿病の発症率について調べてみた。糖尿病の判定は、ヒトの尿糖測定用の検査紙ヘマコンビスティック（バイエル・三共株式会社製）にマウスの尿をつけ、発色の程度により判定する尿糖値の検査により行った。判定は発色の程度により、−（陰性），＋（擬陽性），++（陽性），++++（陽性）の４段階で行った。糖尿病と判定されたものの殆どは判定（++++）であった。また、糖尿病の判定を、眼球の付け根部分又は尻尾から採血し、グルテストエース（株式会社三和科学研究所社製）を用いて血液中のグルコースを測定する血糖値の検査により行い、２００ｍｇ／ｄｌ以上のものを糖尿病と判定した。糖尿病と判定されたものの殆どは４００ｍｇ／ｄｌ以上の値を示していた。
【００３１】
上記２系統のトランスジェニックマウスにおいて生後３ヶ月を過ぎる頃から糖尿が検出されるようになった。１系統（１８Ｌ）のマウスでは、８ヶ月までにトランスジーンをヘテロにもつ雄の７０％以上に糖尿及び高血糖がみられ、発症の早かったものについては症状は非常に激しく、発症後２ヶ月くらいで死亡するマウスも多かった。発症の遅かったマウスにおいても尿糖、血糖とも非常に高い値を示したが、外見上元気に育っていた。雌マウスでは、擬陽性と判断されるマウス２匹（表１中＊印）いただけで、糖尿病と判定されるマウスはいなかった。他の１系統（１０ｌ）の雄マウスのうち、トランスジーンをヘテロにもつマウスでは尿糖、血糖の異常は軽い症状であったが、トランスジーンをホモにもつマウスでは早期発症の激症型糖尿病が現出していた。これら２系統のトランスジェニックマウスにおける糖尿病の発症率を表１に示す。
【００３２】
【表１】
【発明の効果】
本発明によると、マウスＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子又はヒトＧＲＢ１０遺伝子を用いることにより、新規糖尿病治療薬をスクリーニングすることができ、また、本発明のＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０トランスジェニックマウス又はＧＲＢ１０トランスジェニックマウス等のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、インスリンからのシグナル伝達が阻害された場合に引き起こされる糖尿病発症モデル動物として、発症機構の解明、新規糖尿病治療薬の開発に有用である。
【００３４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に用いたＦ−リンカーを示す図である。
【図２】本発明に用いたＡ−リンカーを示す図である。
【図３】本発明のＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０トランスジェニックマウスの導入遺伝子構造を示す図である。
Claims (21)
- Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を糖尿病発症モデル動物として使用する方法。
- ヒトＧＲＢ１０遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を糖尿病発症モデル動物として使用する方法。
- Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子が導入された細胞を用いることを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
- ヒトＧＲＢ１０遺伝子が導入された細胞を用いることを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
- Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子及び被検物質が導入された細胞を培養し、該培養細胞でＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子を発現させ、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質の活性を測定することを特徴とする請求項３記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
- Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子の発現が安定発現であることを特徴とする請求項５記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
- ヒトＧＲＢ１０遺伝子及び被検物質が導入された細胞を培養し、該培養細胞でヒトＧＲＢ１０遺伝子を発現させ、ヒトＧＲＢ１０タンパク質の活性を測定することを特徴とする請求項４記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
- ヒトＧＲＢ１０遺伝子の発現が安定発現であることを特徴とする請求項７記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
- 被検物質がタンパク質であり、該タンパク質をコードするＤＮＡとして被検物質が細胞へ導入されることを特徴とする請求項５〜８のいずれか記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
- 細胞がヒト由来の細胞であることを特徴とする請求項５〜９のいずれか記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
- Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
- Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子が、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１１記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
- 配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が、配列表の配列番号１記載のＤＮＡ配列からなるマウスＭｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子であることを特徴とする請求項１２記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
- Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子として、チキンβ−アクチンプロモーター、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子、ラビットβ−グロビンポリＡシグナルの順に配列されたものを含有する導入遺伝子を用いることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
- Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子として、チキンβ−アクチンプロモーター、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０遺伝子、ラビットβ−グロビンポリＡシグナルの順に配列されたものを含有する導入遺伝子が、配列表の配列番号３記載のＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項１４記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
- ヒトＧＲＢ１０遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
- ヒトＧＲＢ１０遺伝子として、チキンβ−アクチンプロモーター、ヒトＧＲＢ１０遺伝子、ラビットβ−グロビンポリＡシグナルの順に配列されたものを含有する導入遺伝子を用いることを特徴とする請求項１６記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
- トランスジェニック非ヒト哺乳動物に被検物質を投与し、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られた尿の尿糖値及び／又は血液の血糖値を測定することを特徴とする請求項１１〜１７のいずれか記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
- 非ヒト哺乳動物がマウスであることを特徴とする請求項１１〜１８のいずれか記載の糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
- Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質と被検物質を液相下で接触せしめ、Ｍｅｇ１／Ｇｒｂ１０タンパク質の活性を測定することを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
- ヒトＧＲＢ１０タンパク質と被検物質を液相下で接触せしめ、ヒトＧＲＢ１０タンパク質の活性を測定することを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
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