JPH10504443A

JPH10504443A - 線維芽細胞活性化タンパク質αをコードする単離核酸分子とその利用方法

Info

Publication number: JPH10504443A
Application number: JP7527758A
Authority: JP
Inventors: レティッヒ，ヴォルフガング，ジェイ; スキャンラン，マシュー，ジェイ; ギャリン−チェサ，ピラー; オールド，ロイド，ジェイ
Original assignee: スローン−ケッタリング・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1994-04-20
Filing date: 1995-04-19
Publication date: 1998-05-06
Also published as: DE69532033T2; US5587299A; EP0763105A4; ATE253113T1; AU2359495A; AU685273B2; DE69532033D1; EP0763105A1; EP0763105B1; WO1995029233A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、線維芽細胞活性化タンパク質α，又は”ＦＡＰα”をコードする核酸分子の同定と単離とを記載するものである。これらの単離された分子の様々な適用例も記載される。

Description

【発明の詳細な説明】線維芽細胞活性化タンパク質αをコードする単離核酸分子とその利用方法発明の分野本発明は、癌細胞に関連し、腫瘍ストローマ細胞と反応する或る種の分子に関する。詳しくは、本発明は、線維芽細胞活性化タンパク質α（以下、”ＦＡＰα ”という）に関する。この分子は既に免疫学的に同定されているが、これをコードする核酸分子は、まだ単離、あるいはクローン化されていない。これが、とりわけ本発明の課題である。前記タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定により、約８８〜約９５キロダルトンの分子量を有する。この分子は、膜結合酵素に共通で固有の数多くの特徴および特性を有し、これは、この分子も又、膜結合酵素であることを強く示唆している。本発明の重要部分である前記核酸分子は、ＦＡＰα を発現する細胞のためのプローブとして、更に、前記タンパク質の組換え産生のための開始物質としても有用である。次に、この組換えタンパク質を使用して、前記タンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体を産生することができ、従って、これら自身が診断用剤として有用である。背景および従来技術上皮細胞癌の侵襲性成長は、支持ストローマ中における特徴的な細胞および分子的変化と関連している。例えば、上皮細胞癌は、腫瘍血管の形成、反応性腫瘍ストローマ線維芽細胞、リンパ及び食細胞の浸潤物の補充（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）、ペプチド規定能およびタンパク質分解酵素の放出、及び変性細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の産生を引き起こす。フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ），Ａｄｖ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４３：１７５〜２０３（１９８５）；バセット（Ｂａｓｓｅｔ）等、Ｎａｔｕｒｅ３４８：６９９〜７０４（１９９０）；デネカンプ（Ｄｅｎｅｋａｍｐ）等，ＣａｎｃｅｒＭａｔａｓｔａｓｉｓＲｅｖ．９：２６７〜２８２（１９９０）；カレン（Ｃｕｌｌｅｎ）等、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５１：４９７８〜４９８５（１９９１）；ドボラック（Ｄｖｏｒａｋ）等，ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌｓ３：７７〜８５（１９９１）；リオッタ（Ｌｉｏｔｔａ）等，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５１：５０５４ｓ〜５０５９ｓ（１９９１）；ギャリン‐チェサ（Ｇａｒｉｎ‐Ｃｈｅｓａ）等、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３７：１７６７〜１７７６（１９８９）参照。いくつかの一般的な組織タイプの上皮細胞癌のストローマにおける非常に一貫した分子の特徴は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰα）の誘発であり、これは、元々、モノクローナル抗体ｍＡｂＦ１９を増殖培養線維芽細胞に対して生育させることによって発見された実測Ｍ_rが９５，０００の細胞表面糖タンパク質である。レティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）等，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４６：６４０６〜６４１２（１９８６）；レティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：３１１０〜３１１４（１９８８）；ギャリン‐チェサ（Ｇａｒｉｎ ‐Ｃｈｅｓａ）等，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ，ＵＳＡ８７：７２３５〜７２３９（１９９０）；レティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）等，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５３：３３２７〜３３３５（１９９３）参照。これら４つの論文のそれぞれの全体をここに参考文献として挙げる。上述したような免疫組織化学的研究は、ＦＡＰαは、ある種の正常な胎児間充織組織において一時的に発現するが、正常な成人組織は一般にＦＡＰα^-であることを示した。同様に、悪性上皮細胞神経および造血細胞はＦＡＰα^-である。しかしながら、＞９０％の乳、肺、皮膚、膵臓、および結腸直腸悪性腫瘍を含む一般的なタイプの上皮細胞癌の大半は、多量のＦＡＰα⁺反応性ストローマ線維芽細胞を含有している。ギャリン‐チェサ（Ｇａｒｉｎ‐Ｃｈｅｓａ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：７２３５〜７２３９（１９９０）。ＦＡＰα⁺は、ほとんど必ず、新たに形成された腫瘍血管に付随し、腫瘍毛細管内皮細胞と、悪性上皮細胞クラスタの基質との間に、はっきりとして細胞コンパートメントを形成する。ＦＡＰα⁺ストローマ線維芽細胞は、一次癌腫と転移癌腫との両方に見られるが、乳および結腸直腸アデノーマのフィブロアデノーマ等の良性で前悪性（ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ）の上皮病変が、ＦＡＰα⁺ストローマ細胞を含有することは希である。上皮ネオプラズマにおいては、ストローマ特異性のＦＡＰαは部分集中するのに対して、ＦＡＰαは、骨および軟質組織サルコーマの大きな部分の悪性細胞中で発現する。レティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：３１１０〜３１１４（１９８８）。最後に、ＦＡＰα⁺線維芽細胞が、治癒中の傷の肉芽組織において検出された（前述のギャリン‐チェサ（Ｇａｒｉｎ‐Ｃｈｅｓａ）等）。ＦＡＰαが正常な組織においては、制限された分布パターンを示すのに対して、多くの上皮細胞癌の支持ストローマにおいては、均一に発現することに基づき、¹³¹Ｉ− ラベル化ｍＡｂＦ１９による臨床実験を、転移性結腸癌を有する患者において（ウェルト（Ｗｅｌｔ）等、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．３３：３１９（１９９２））、上皮細胞癌の免疫検出および免疫療法のための”腫瘍スロトーマ標的化”の概念を探求するべく開始した。胎児の成長、組織の修復、および腫瘍発生中における組織再編成中の複数の時期と箇所とにおいて、ＦＡＰα⁺線維芽細胞が誘発されることは、この分子の正常な線維芽細胞状態における基本的役割と一致している。従って、この分子をコードする核酸分子を単離しクローン化することは興味深い。これが、以下の開示においてその他の特徴構成とともに詳述する本発明の一態様である。図面の簡単な説明図１は、Ｔｒａｎｓ ³⁵Ｓ−ラベル化細胞の洗浄剤抽出物に対して行った免疫沈降研究から得られた結果を示す。この研究は、ＦＡＰαとＣＤ２６とを免疫沈降することを目的とした。細胞タイプは、ヒトサクローマ細胞系であるＳＷ８７２と、ＦＡＰαをコードするベクターでトランスフェクションされた細胞系、即ち本出願に記載されているｐＦＡＰ−３８、であるＣＯＳ−ＦＡＰと、ＣＤ２６コード・プラスミドによってトランスフェクションされたＣＯＳ細胞系であるＣＯＳ−ＣＤ２６とであった。抽出物は、抗−ＦＡＰαモノクローナル抗体Ｆ１９、抗−ＣＤ２６ｍＡｂＥＦ−１又は、陰性コントロールマウスＩｇと沈降させた。図２Ａは、ＦＡＰα^-／ＣＤ２６⁺表現型を有する１つの細胞系（卵巣癌ＳＫ− ＯＶ６）と、ＦＡＰα⁺／ＣＤ２６⁺表現型を有する２つの細胞系（線維芽細胞ＷＩ−３８及びＧＭ０５３８９）中におけるＦＡＰαの発現のノザンブロット分析を示す。図２Ｂは、図２Ａの諸細胞系のγ−アクチン発現を示す。図３は、ＦＡＰαの推定アミノ酸配列と、ＣＤ２６の公知の配列とを比較している。アラインメントは最適化されている。図４は、ＣＯＳ−１トランスフェクタント中におけるＦＡＰアミノ酸とＣＤ２６との間のヘテロダイマー形成を示す。図５Ａ−５Ｈは、種々の癌におけるＦＡＰαとＣＤ２６との免疫組織化学的検出を示している。図５Ａと５Ｂとにおいては、それぞれ、ＦＡＰα（図５Ａ）と、ＣＤ２６（図５Ｂ）とに対する乳癌が研究されている。図５Ｃと５Ｄとにおいては、それぞれ、ＦＡＰα（図５Ｃ）と、ＣＤ２６（図５Ｄ）との悪性線維状組織球腫とが研究されている。図５Ｅ（ＦＡＰα）と５Ｆ（ＣＤ２６）とでは、皮膚かさぶた組織が研究されている。図５Ｇ（ＦＡＰα）と５Ｈ（ＣＤ２６）とでは腎細胞癌が研究されている。好適実施例の詳細な説明例１線維芽細胞系ＷＩ−３８が、ｍＡｂＦ１９に反応することが前に観察されている（レティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）等、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４６：６４０６〜６４１２（１９８６）；レティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ８５：３１１０〜３１１４（１９８８）；ギャリン‐チェサ（Ｇａｒｉｎ‐Ｃｈｅｓａ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：７２３５〜７２３９（１９９０）；レティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）等、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５３：３３２７〜３３３５（１９９３））。これを以下の実験に使用した。周知技術と市販材料とを使用してｃＤＮＡライブラリを作った。具体的には、このライブラリは、ｔｈｅＦａｓｔＴｒａｃｋｍＲＮＡ単離キットと、ＬｉｂｒａｒｉｕｍｃＤＮＡｐｈａｇｅｍｉｄシステムを使用して、発現ベクターｐＣＤＮＡＩ中で構成した。このライブラリの製造後、前記ベクターを、細胞系Ｅ．ｃｏｌｉＭＣ１０６１／Ｐ３中に電気穿孔法によって注入した。前記ｐＣＤＮＡＩ発現ベクターは、抗生物質抵抗性遺伝子を有するので、前記Ｅ．ｃｏｌｉは抗生物質抵抗によって選択した。次に、抵抗性を有する前記コロニーを更なる実験に使用した。前記コロニーからのプラスミドＤＮＡは、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２ｄＥｄ．１９８９）に従って、アルカリ溶解とＣｓＣｌ₂上での純化によって得た。この技術は当該技術において周知ではあるが、ここに参考文献として挙げる。前記プラスミドＤＮＡの単離後、これを使用して、ＣＯＳ−１細胞をトランスフェクションし、次に、これらを４８時間培養し、その後、これらを抗生物質によってコーティングした皿でテストした。使用した前記ｍＡｂｓは、ここにその全部を参考文献として挙げる前述のレティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）等、（１９８６）に記載されているように、Ｆ１９を含んでいた。ＣＯＳ−１細胞は、正常にはＦＡＰ α^-であるので、陽性の結果がでれば、それは、前記コード配列の存在を示していることになる。この免疫選択プロトコルは、ここに参考文献として挙げるアルフォ（Ａｒｕｆｆｏ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ８４：３３６５〜３３６９（１９８７）のプロトコルであった。陽性のクローンからのプラスミドＤＮＡを、ハート（Ｈｉｒｔ），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：３６５〜３６９（１９６７）に従って、回収し、これをＥ．ｃｏｌｉに再導入し、ＣＯＳ−１細胞に再選択した。ここに提示したプロトコルを、４ラウンド行った。この後、Ｑｉａｇｅｎプラスミドキットを使用して、５０の単離バクテリア・コロニーのプラスミドＤＮＡを純化した。ＥｃｏＲＩ制限酵素マッピングによって、前記コロニーの内、２７のコロニーが、同じ２．８ｋｂの挿入断片を有していることが判った。これらの内のいくつかは、ＣＯＳ−１細胞における一時的発現と、直接免疫蛍光染色法によって、ＦＡＰα−特異性ｃＤＮＡを有していることがわかった。これらのクローンの内の１つ、即ち、”ｐＦＡＰ．３８”を、選択してこれを以下に詳述する更なる研究に使用した。例２ｐＦＡＰ．３８を同定後、これを、公知の細胞表面マーカＣＤ２６（”ｐＣＤ２６”）と、更に、コントロール・ベクターｐＣＤＮＡＩとともにテストした。これらの実験において、ＣＯＳ−１細胞を、ｐＦＡＰ．３８、ｐＣＤ２６又はｐＣＤＮＩのいずれか１つとトランスフェクションさせた。４８時間後、そのトランスフェクタントを、細胞表面抗原発現のための周知のＭＨＡロゼット化アッセイを使用してテストした。これらの実験において、ＦＡＰα特異性であるｍＡｂＦ１９を、ＣＤ２６特異性のｍＡｂＥＦ−１と共に使用した。更に、他の４つのＦＡＰα特異性ｍＡｂ、即ち、ＦＢ２３，ＦＢ５２，ＦＢ５８及びＣ４８をも使用した。又、ｍＡｂＦ１９（ＳＷ８７２脂肪肉腫）、又はＥＦ−１（ＳＫ−ＯＶ６卵巣癌）と反応することが知られている２つの癌細胞系もテストした。これらの結果を、次の表１に示す。例３次に、前記抗体によって標的化される抗原を同定するために免疫沈降研究を行った。細胞を、Ｔｒａｎｓ ³⁵Ｓ−ラベル、（ＩＣＮ）で代謝的にラベル化し、溶解バッファ（０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ／０．０１５ＭＮａＣｌ／０．０１ＭＭｇＣｌ₂／０．５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０／アプロチニン（２０ｕｇ／ｍｌ）／２ｍＭフェニールメチルースルフォニルフロライド）で抽出し、次に、免疫沈降させた。ここで使用したプロトコルは、ここのその全部の全体を参考文献として挙げるレティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）等，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５３：３３２７〜３３３５（１９９３）；及びフェリンガー（Ｆｅｌｌｉｎｇｅｒ）等、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５１：３３６〜３４０（１９９１）とを参照することによって理解されるように、すべて周知である。免疫沈降化ｍＡｂｓは、陰性コントロール・マウスＩｇ，ｍＡｂＦ１９又はＥＦ−１であった。コントロールテストを、疑似トランスフェクションＣＯＳ−１細胞によって行った。免疫沈降後、その免疫沈降物を、還元化条件下においてＮａＤＯｄＳＯ₄／ＰＡＧＥ上で分離した。いくつかの実験において、前記免疫沈降物質が、グリコシル化するか否かを判断するための追加テストを行った。これらの実験において、細胞抽出物を、免疫沈降前に、ＣｏｎＡ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥによって分画した。免疫沈降後で、かつ、ＮａＤＯｄＳＯ₄／ＰＡＧＥ上での分画の前に、これらの免疫沈降物をＮ−グリカネーゼで消化した。その結果は、図１に示されている。ＣＯＳ−１細胞において、ｐＦＡＰ．３８が、８８ｋｄのタンパク質種（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定）の発現を指示し、この種は、ＳＷ８７２によって産生される９５ｋｄのＦＡＰα又は培養線維芽細胞よりも僅かに小さい。Ｎ−グリカナーゼによる消化によって、類似サイズのペプチド（即ち、７５ｋｄに対して７４ｋｄ）が産生され、ＣＯＳ−１細胞中におけるＦＡＢαタンパク質のグリコシル化は、ヒトの細胞系中におけるものと異なっていることを示している。例４次に、ＦＡＰα⁺線維芽細胞細胞系ＷＩ−３８とＧＭ０５３８９と、ＦＡＰα 一卵巣癌細胞系ＳＫ−ＯＶ６とからのｍＲＮＡを使用して、古典的ノザンブロット分析を行った。前述したサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等の手順を使用して、各細胞系からの５マイクログラムのｍＲＮＡをテストした。使用したプローブは、³²Ｐラベル化され、ｐＦＡＰ．３８の２．３ｋｂのＥＣＯＩ断片と、ＣＤ２６の２．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片と、γ−アクチンｃＤＮＡの１．８ｋｂのＢａｍＨＩ断片とから作られた。これらの断片は、予め１％のアガロースゲルから純化されたものであった。図２は、これらの結果を示す。ＦＡＰα⁺線維芽細胞染色の抽出物は、２．８ｋｂのｍＲＮＡ種を示しているが、ＳＫ−０Ｖ６の抽出物はこれを示していない。すべての種において、γ−アクチンｍＲＮＡ種（１．８ｋｂ）が見られる。例５ＦＡＰαをコードすることが同定された前記ｃＤＮＡを、先ず配列化から初めて、更に詳しく研究した。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３〜５４６７（１９７７）に記載されているような古典的なサンガー法を使用して、前記ｃＤＮＡの療法のストランドを配列化した。これが得られた後、そこからアミノ酸配列を推定した。この情報が配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１に提示されている。次に、この配列を、ＣＤ２６の公知のアミノ酸配列（モリモト（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ）等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３４３０〜３４３７（１９８９））と比較した。図３は、最適化配列アラインメントを使用した、この比較結果を示している。この比較におけるすべての空白は、星印で示され、これに対して、同じアミノ酸は、前記ＣＤ２６配列中においてダッシュによって示されている。疎水性推定経膜配列は二重下線で示され、潜在的Ｎ−グリコシル化サイトは、１本の下線で示されている。前記配列分析は、２８１２塩基対の挿入断片を示しており、ここで、２２７７の塩基対が、前記オープンリーディングフレームを構成している。これは、ヌクレオチド２０９の開始コドンＡＴＧから、２４８６の終止コドンＴＡＡにまで延出している。前記推定ペプチドは、７５９アミノ酸長であり、その分子量は、８８，２３３である。これに対して、Ｎ−グリカナーゼ消化、免疫純化ＦＡＰαは、ＮａＤＯｄＳＯ₄／ＰＡＧＥ上において７５，０００の推定Ｍ_rを有していると報告された（レティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）等、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５３：３３２７〜３３３５（１９９３））。１つのＴＡＴＡボックスが、前記開始コドンの８３塩基対上流に見られる。前記挿入断片の５’−未翻訳化領域において、１つのポリアデニル化信号と、ポリ−Ａ尾とが見つかった。次に、ＧｅｎＢａｎｋデータサーチを行った。見つけられた最も密接に関連した遺伝子は、ヒトＤＰＰＩＶ（Ｔ細胞活性化抗原ＣＤ２６としても知られている）を備えた、ジペプチジル・ペプチダーゼＩＶ同族体（ＤＰＰＩＶ；ＥＣ３．４．１４．５）をコードする遺伝子であり、これは６１％のヌクレオチド配列同一性と、４８％のアミノ酸配列同一性とを示している。関連遺伝子の第２組は、脳やその他の正常組織中において広く発現し、未知の作用を有する遺伝子である、ＤＰＰＸのヒト、ラット及びウシ同族体である。予想ヒトＤＰＰＸ遺伝子産生物は、ＦＡＰαとＣＤ２６とに対する約３０％のアミノ酸同一性を示している。前記ＦＡＰα分子は、大きなＣＯＯＨ−末端細胞外ドメイン、１つの疎水性経膜断片および短い細胞膜尾を含む、タイプＩＩインテグラル膜タンパク質に典型的な構造的特徴を示している。前記推定細胞外ドメインは、６つの潜在的Ｎ−グリコシル化サイトと、１３のシステイン残基（その内、８つがＦＡＰαとＣＤ２６との間で保存される）と、ＤＰＰＩＶ等の、セリンプロテアーゼにおいて特徴的な高度に保存された細胞触媒性ドメインに対応する３つの断片とを有している。これらの保存された配列を、次の表２に示す。ＤＰＰＩＶとＤＰＰＸとに対する比較は、前述のモリモト（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ）等，ワダ（Ｗａｄａ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１９７〜２０１（１９９２）；ヨコタニ（Ｙｏｋｏｔａｎｉ）等、ＨｕｍａｎＭｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２．１０３７〜１０３９（１９９３））に従って行った。例６ＦＡＰα関連配列がヒト以外の種においても存在するか否かを調べるため、別組の実験を行った。これを行うために、ヒト、マウス、チャイニーズ・ハムスタのゲノムＤＮＡを、制限酵素を使用して消化し、上述した³²Ｐでラベル化した２．３ｋｂ断片を使用した、サザンブロッチングでテストした。緊縮洗浄条件（０．１ｘＳＳＣ，０．１％ＮａＤｏｄＳＯ₄，６８℃）を使用してハイブリダイゼーションを行った。前記マウスのＤＮＡとハムスタのＤＮＡとの両方において、クロスハイブリダイゼーションが容易に観察され、これは高度に保存されたＦＡＰα同族体の存在を示唆した。前述のＣＤ２６ｃＤＮＡ断片を使用したコントロール実験においては、クロスハイブリダイゼーションは観察されなかった。例７前記ＣＤ２６分子は、１０５ｋｂの分子量を有する前述したＦＡＰαに関連する分子であり、培養線維芽細胞とメラノサイトとにおいて見られるＦＡＰβと共通した数多くの生化学的および血清学的特徴を有している（レティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）等、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５３：３３２７〜３３３５（１９９３））。ＦＡＰβがＣＤ２６の産生物であるか否かを調べるためにコトランスフェクションを行った。これをテストするために、上述したｐＦＡＰ．３８又はｐＣＤ２６によるトランスフェクションに使用したものと同じで、但し、２つのベクターを使用したプロトコルを使用した。前に提示した結果は、各ベクターにおいてコトランスフェクション効率は約４０％であり、従って、約１０〜２０％の細胞がコトランスフェクションするはずであることを示した。コトランスフェクション後、前記ＣＯＳ−１細胞を、前述したように、Ｔｒａｎｓ ³⁵Ｓ−ラベル化し、その後、前述したように、溶解した。その結果得られた細胞抽出物を、ＣｏｎＡＳＥＰＨＡＲＯＳＥ上で分離し、抗原（ＦＡＰα及び／又はＣＤ２６）を前記ＣｏｎＡ−結合フラクション中で回収した。前記結合フラクションを、０．２５Ｍ α−Ｄ−マノピラノサイドで溶出した。次に、前述したようにして、免疫沈降を行い、その沈降物を、これも前述した方法で、ＮａＤｏｄＳＯ₄／ＰＡＧＥ上で分離した。図４は、これらの結果を、１回のトランスフェクション実験の結果とともに示す。ｐＦＡＰ．３８のみでトランスフェクションした細胞は、ＦＡＰαを産生したが、ＦＡＰβは産生しなかった（ｍＡｂＦ１９免疫沈降物から判定）。これらは、又、ＣＤ２６抗原を産生しなかった（ＥＦ−１でテスト）。ｐＣＤ２６のみでトランスフェクションした細胞は、ＣＤ２６を産生したが、ＦＡＰαは産生しなかった。前記ｍＡｂＦ１９沈降物中における判定により、コトランスフェクタントは、ＣＤ２６とＦＡＢα／ＦＡＢβヘテロマを産生した。この結果は、ＦＡＰβが、ＣＤ２６産生物であるという直接的な証拠を提供するものである。例８いくつかの培養ヒト細胞タイプが、ＦＡＰαとＣＤ２６とを共同発現し、ＦＡＰα／ＣＤ２６ヘテロマ形成を示すことが既に観察されている。しかしながら、以前の免疫組織化学的研究において測定されたＦＡＰαとＣＤ２６とのインヴィヴォ分布パターンは、重複していないようであった（レティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉ．ＵＳＡ８５：３１１０〜３１１４（１９８８）；ギャリン‐チェサ（Ｇａｒｉｎ‐Ｃｈｅｓａ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：７２３５〜７３２９（１９９０）；レティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）等，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５３：３３２７〜３３３５（１９９５）；ステイン（Ｓｔｅｉｎ）等，ｉｎＫｎａｐｐ等，ｅｄｓ．ＬｅｕｋｏｃｙｔｅｔｙｐｉｎｇＩＶ−ｗｈｉｔｅｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎｓ，ｐｐ４１２〜４１５（ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１９８９），ｐｐ．４１２〜４１５；メビウス（Ｍｏｅｂｉｏｕｓ）等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７４：４３１〜４３７（１９８８）参照）。ＦＡＰα／ＣＤ２６の相互関連の潜在的重要性に鑑みて、ＦＡＰα⁺線維芽細胞またはＦＡＰα⁺悪性細胞を含有していることが知られている正常な組織と病変組織との比較において、組織分布を再検査した。前記サンプルをテストするために、これらをＯＣＴ化合物中に埋設し、予め液体窒素中で冷却されたイソペンタン中で凍結させ、使用まで−７０℃で保存した。５マイクロメータの厚みの断片を切取り、ポリ−Ｌ−リジン被覆スライド上にセットし、空気乾燥させ、低温アセトン中で固定した（４℃で１０分間）。次に、これらの断片を、例えば、ギャリン‐チェサ（Ｇａｒｉｎ‐Ｃｈｅｓａ）等，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３７：１７６７〜１７７６（１９８９）；ギャリン‐チェサ（Ｇａｒｉｎ‐Ｃｈｅｓａ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：７２３５〜７２３９（１９９０）；レティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）等、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５３：３３２７〜３３３５（１９９３）；ギャリン‐チェサ（Ｇａｒｉｎ‐Ｃｈｅｓａ）等，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４２：５５７〜５６７に記載されているような、周知のアビジン−ビオチンイムノ−ペロキシダーゼ法を使用して、ｍＡｂｓ（１０〜２０ｕｇ／ｍｌ）でテストした。その結果を、図５に示す。乳、結腸直腸、膵臓、および肺癌は、ＦＡＰαの強い発現を示したが、ＣＤ２６は見られなかった（図５Ａ及び５Ｂ参照）。悪性線維組織球腫（図５Ｃ及び５Ｄ）を含む５つのＦＡＰα⁺肉腫をテストしたが、ＣＤ２６の発現は無かった。治癒中の皮膚傷の反応性線維芽細胞の検査は、ＦＡＰ αとＣＤ２６との両方の多量の発現を示した。前述のテストした３つの腎臓癌（図５Ｇ及び５Ｈ）は、悪性上皮細胞中におけるＣＤ２６の発現を示した。ＦＡＰ αは、悪性上皮細胞においては不在であり、これらの癌のストローマにおいて低い発現を示した。上述した諸例は、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（”ＦＡＰα”）をコードする単離核酸分子を記載するものである。前記配列の発現産生物は、ＳＤＳ −ＰＡＧＥにおいて、約７５ｋｄの分子量を示すタンパク質である。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１に提示されているような、前記分子の１つに対する推定アミノ酸配列は、約８８ｋｄの分子量を産出する。尚、前述したように、ＦＡＰαは、前記分子を発現する細胞のタイプに応じて、異なるタイプと量のグリコシル化によってグリコシル化が可能である。これは、ここに記載された諸実験例によって示されている。本発明は、更に、前記ＦＡＰα分子の製造において有用な発現ベクターの製造にも関する。その最も広い範囲において、これらのベクターは、プロモータに作動連結されたＦＡＰαコード配列である。抗生物質抵抗を提供する遺伝子、増幅可能な遺伝子などのその他の要素も、この発現ベクターの一部を構成するものである。前記コード配列およびベクターは、細胞系の製造にも使用可能であり、ここでは、このコード配列または発現ベクターを使用して、受容側宿主をトランスフェクションしたり、あるいは形質転換する。使用される細胞のタイプとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ等の原核生物、あるいは、イースト、ＣＨＯ，ＣＯＳ等の真核生物、又はその他の細胞タイプであってよい。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１に示したような核酸分子の同定によって、更に、当業者は、ストリンジェント（緊縮）条件下において、それにハイブリダイゼーションする核酸分子を同定し、単離することが可能となる。ここで言う”ストリンジェント条件”とは、上述したようなパラメータを指し、これによって、ネズミとハムスタとの両方の配列が同定できたものである。当業者においては、これらの条件が、ここに記載されたものとは異なるパラメータを使用しても達成可能な程度の緊縮を提供するものであることが理解されるであろう。これような改変も、この”ストリンジェント条件”という表現に含まれている。核酸分子が、相補的分子にハイブリダイゼーションできるという能力により、当業者は、核酸ハイブリダイゼーション・アッセイを使用して、ＦＡＰαを発現する細胞を同定することが可能である。本発明において記載された配列を使用して、相補的配列に対してハイブリダイゼーションして、これによって、それらの配列を同定することができる。このようにして、ｍＲＮＡ、例えば、前記ＦＡＰ α分子を発現するすべての細胞に存在するｍＲＮＡを標的化することができる。もちろん、本発明の核酸分子は、組換えＦＡＰαの製造においても有用である。この組換えタンパク質は、例えば、公知のｍＡｂＦ１９に類似の抗体の産生のための免疫源として、そして同じ使用方法で使用可能である。同様に、前記組換えタンパク質および／又はその表面に前記分子を発現する細胞は、ＦＡＰα分子と相互反応するアンタゴニスト、アゴニスト、又はその他の分子を判定するアッセイに利用することができる。このような分子としては、基質、抑制分子、抗体等が挙げられるが、これらに限られるものではない。この本発明の最後の特徴は、膜結合酵素に対する観察された構造的類似性に鑑みて考慮されるべきものである。このタイプの分子は、ここで詳述する必要のないある種の特性に関連している。ここでは、ＦＡＰαに関連するこれらの特性の抑制または強化は本発明の１つの特徴であると述べることで十分である。例えば、組換え細胞または組換えＦＡＰα自身を使用することによって、基質またはＦＡＰαのための基質を同定することができる。これらの基質を変質させて、その効果を改善したり、その効果を少なくしたり、あるいは、単に、それらを検出可能な信号によってラベル化して、これらを、例えば、ＦＡＰαを発現する細胞の同定に利用することができる。基質とＦＡＰαとの間の相互作用、及び、ＦＡＰαとその他の分子との間の相互作用の研究を利用して、前記ＦＡＰα分子のアゴニスト及びアンタゴニストの開発および／又は同定を行うことができる。本発明のその他の態様は、当業者にとって明らかであろう。従って、これらについてはここで記載しない。ここに使用した用語および表現は、記載のためのものであって限定的なものではなく、これらの用語および表現を使用するに当たって、図示および記載した特徴構成またはその一部の均等物を除外する意図はなく、本発明の範囲内において種々の改変が可能であると理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ギャリン−チェサ，ピラードイツ連邦共和国デー−88400 ビーバラッハアムリスヴィルシュトラーセ７ (72)発明者オールド，ロイド，ジェイアメリカ合衆国ニューヨーク 10105 ニューヨークアベニュー・オブ・ジ・アメリカズ 1345

Claims

【特許請求の範囲】１．その推定アミノ酸配列に基づき約８８キロダルトンの分子量を有するほ乳類ＦＡＰαをコードする単離核酸分子。２．請求項１の単離核酸分子であって、前記ＦＡＰαは、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１に記載のアミノ酸配列からなる。３．請求項１の単離核酸分子であって、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のヌクレオチド配列からなる。４．ストリンジェント条件下において、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする単離核酸分子。５．プロモータに作動連結された、請求項１の単離核酸分子を有する発現ベクター。６．請求項１の単離核酸分子によって形質転換またはトランスフェクションされた細胞系。７．請求項５の発現ベクターによって形質転換またはトランスフェクションされた細胞系。８．細胞中におけるＦＡＰαの発現の判定方法であって、前記細胞を、請求項１の単離核酸分子に接触させる工程と、前記単離核酸分子の、前記細胞中の相補性配列に対するハイブリダイゼーションを、ＦＡＰαの発現の判定として判定する工程とを有する。