JPH10504034A

JPH10504034A - 小胞製剤

Info

Publication number: JPH10504034A
Application number: JP8507102A
Authority: JP
Inventors: クリスティンカーター，キャサリン; ジョンベイリー，アラン; マーガレットウィリアムズ，デニス
Original assignee: University of Strathclyde
Current assignee: University of Strathclyde
Priority date: 1994-08-10
Filing date: 1995-08-07
Publication date: 1998-04-14
Also published as: DE69507488D1; DE69507488T2; US5869091A; WO1996004890A1; EP0774958A1; EP0774958B1; GB9416149D0

Abstract

(57)【要約】水性ビヒクル及びこの水性ビヒクルの中に懸濁された小胞を含んで成り、薬理活性剤がこの小胞及びこの水性ビヒクルの双方の中に位置している製剤、かかる製剤の利用、並びにそれによる処置方法。

Description

【発明の詳細な説明】小胞製剤発明の分野本発明は水性担体の中に懸濁された小胞の中に存在する薬理活性剤を含んで成る水性製剤（特に注射用製剤）を提供する。この製剤は、寄生体感染内臓リーシュマニア症の処置のための活性剤として五価のアンチモンを特に、しかしながら排他的にではなく、含む。背景内臓リーシュマニア症の処置のために現在使用されている第一線の薬剤は五価のアンチモン化合物、例えばナトリウムスチボグルコネート及びメグルミンアンチモネートである。これらの薬剤はその極性的な性質に基づき、経口ルートによっては不活性であり、そして非経口ルートによる投与に従うと迅速な腎性排泄を受け、多数の回数の投与療法が必要となる。内臓リーシュマニア症が風土病となっており、そして多大な率にまで達しているスーダンの如き僻地では、かかる療法の同意は得にくい。かかるアンチモン薬剤の小胞製剤の開発はその効能を高め、投与回数及び投与量の双方を軽減せしめる。小胞製剤の構成成分は小胞特性（例えば安定性、サイズ、電荷）、それ故その薬剤担体系としての安定性に影響を及ぼし、そして意図する用途に応じてのその製剤の要件は薬剤特異的となりうる。内臓リーシュマニア症のネズミモデルを利用した我々の従来の研究において、我々は小胞サイズが重要であることを示し、その理由は脾臓の如き深遠部位からのリーシュマニア寄生体の排除が小型の薬剤装填小胞の利用を必要とするからにある。これらの部位からの寄生体の不完全な除去は再発をもたらし、そしておそらくはアンチモン治療後に報告される再発率の２〜８％を占める。潜在的な治療的用途、例えば薬剤デリバリー（Ozerら、1991）及び免疫アジュバント（Brewer and Alexander，1993）用途を有する小胞を形成するのに様々な非イオン界面活性剤が利用されうる。我々はスチボグルコネート装填非イオン界面活性小胞が、実験系内臓リーシュマニア症の処置を向上させるのに、薬剤装填リポソームと同等に有効であることを既に実証している（Carterら、1989 a,b）。本発明の目的は向上した効能のかかる小胞製剤の提供にある。本発明のかかる及びその他の目的は以下の説明及び実施例から明らかとなるであろう。発明の記述広く述べると、本発明は向上した治療効能が小胞自体及び水性担体ビヒクルの双方中の活性剤の提供により達成されうるという発見に関与する。即ち、本発明は： −水性ビヒクル； −この水性ビヒクルの中に懸濁された小胞；並びに −この小胞及びこの水性ビヒクルの双方内において含まれる薬理活性剤；を含んで成る製剤を提供する。詳細な説明小胞相及び水性液体相の双方の中での薬理活性剤の存在はその効能を高める。水性ビヒクル中の活性剤の濃度は小胞中のその濃度と同一、高い、又は低くてもよい。便宜上、この活性剤を含む水性ビヒクルは一般に活性剤を小胞の中に装填するのに利用するものであり、ここではかかる方法を小胞の中に活性剤を導入するために利用する。原理的には、この小胞は当業界において公知であり、且つ活性剤をデリバリーするのに適する任意の方法で形成されうる。例えば、「ホモジナイゼーション」法又は「凍結乾燥」法のいづれかを利用して形成でき、双方の方法は当業界において公知である。ホモジナイゼーション法において、所望のモル比における脂質材料の必要たる量は以下の方法のいづれかにおいて処理されうる：乾燥粉末（即ち、脂質材料）を封入用活性剤の溶液により所望の温度（０〜150 ℃の範囲）で水和し、そして必要たる速度で所望の小胞特性が得られるのに必要な時間にわたってホモジナイズする。他方、脂質材料は必要たる温度での必要たる溶液による水和の前に加熱（例えば40〜150 ℃の温度範囲）により溶融させてよい。次いでこの懸濁物を、所望の特性を有する小胞ができるのに必要たる速度及び必要たる時間ホモジナイズすることができる。ナトリウムスチボグルコネート小胞懸濁物は小胞構成成分を例えば 135℃で加熱することによって上記に概略した方法を利用して生成できうる。次いで、溶融脂質を５mlの予備加熱したナトリウムスチボグルコネート溶液による水和の前に例えば70℃にまで冷却してよい。小胞サイズの縮小は、サンプルを一定の時間間隔、特定の時間で、例えば70℃で15分間において、Silversonミキサー（密封ユニット）又はUltra-turrac（モデルＴ25）（ホモジナイザー装置）で例えば 800 0rpmで運転させてホモジナイズすることにより達成できる。凍結乾燥法において、凍結乾燥調製品は以下の方法のいづれかで製造できる：所望のモル比の必要量の小胞構成成分を有機溶媒（例えばｔ−ブチルアルコール）に溶かし、次いで例えば多孔質膜（例えば0.2mm）で濾過することができる。次いで界面活性溶液を凍結し、そして有機溶媒の完全な除去に必要な時間凍結乾燥させることができる。次いで得られる凍結乾燥生成物を封入すべき活性剤溶液で水和し、そして小胞懸濁物ができるのに必要な温度で振盪させることができる。他方、小胞懸濁物を上記のホモジナイゼーションプロセスにより作り、多孔質膜（例えば0.2mm）で濾過し、次いで凍結乾燥させて水性溶媒を除去してよい。得られる凍結乾燥生成物を必要たる溶液で水和し、そして小胞懸濁物ができるのに必要な温度において振盪させることができる。小胞は好ましくはステロール、例えばコレステロール又はエルゴステロールと、界面活性剤とより形成する。もし非イオン界面活性剤を使用するなら、小胞の凝集を避けるために小胞製剤の中に脂肪酸の如き帯電物質を含ませることが一般に必要とされる。適当な帯電物質にはジセチルホスフェート、ステアリン酸及びパルミチン酸が含まれる。非イオン界面活性剤を使用することが極めて有利でありうる。これはモノ−、ジ−、トリ−又はポリ（10に至るまで）グリセロールモノ−又はジ−脂肪酸エステル（例えばＣ₁₀−Ｃ₂₀脂肪酸エステル）、例えばトリグリセロールモノステアレートであるか；又は例えば親水性頭部領域と疎水性尾部領域とを担うＣ₁₀−Ｃ₂₀ の直鎖もしくは枝分れアルキル鎖をもつ１〜10のオキシエチレン成分を好適に含んで成るポリオキシエチレンエーテルであってよい。非イオン界面活性剤、コレステロール及びジセチルホスフェート又は脂肪酸を含んで成る小胞製剤はそれぞれ３〜５：１〜４：０〜４のモル比で存在していてよい。好適な小胞製剤は非イオン界面活性剤、コレステロール、及びジアセチルホスフェート又はステアリン酸もしくはパルミチン酸より選ばれる脂肪酸を含んで成り、そしてこれらは好都合にはそれぞれ３〜５：２〜４：０〜３のモル比において存在する。本明細書に記載の通りにして決定された小胞の直径は 100〜2500nmの範囲にあることがこの度見い出され、それ故1000nmより有意に大きくてもよい。好ましくは、小胞の直径は 100〜1000nmの範囲、そしてより好ましくは 200〜600nm の範囲に属する。800nmを超える直径の小胞が有効であることが驚くべきことに発見された。かかる小胞製剤は肝臓、脾臓及び骨髄の感染症に対して極めて有効であり、そしてこれは活性剤の優先的なターゲッティングを可能にする。活性剤は小胞懸濁物中で効率的にデリバリーされうる原理的に任意の剤であってよい。特定の剤には、ナトリウムスチボグルコネート、メグルミンアンチモネート、ペンタミジン、抗生物質、例えばアミノグリコシド（例えばパロモマイシン）及びアンホテリシンＢが含まれる。親水性活性剤は一般に水性ビヒクル中で可溶性であり、一方親油性のものは一般に小胞二重層の中に存在しているであろう。小胞相中の活性成分の濃度は一般に0.01〜10重量／重量％である。製剤は一般に小胞成分の混合物を形成することにより調製する。通常はこれらを一緒に溶融し、次いで冷却することによる。小胞懸濁物を作るため、活性成分含有水性液体を溶融小胞製剤に加え（例えば70〜100 ℃の温度で）、次いで強力撹拌してよい。小胞懸濁物を多孔質膜を介して押し出し、粒径を変えることができうる。この製剤はできたまま使用するか、又は水性相中の活性剤の濃度を適宜変えてよい。本発明の更なる観点において、病気の処置、特に内臓リーシュマニア症の処置のための医薬の製造における本発明に係る製剤の利用を提供する。当然、当業者は本発明の更なる観点において、哺乳動物、特にヒトに対する本発明に係る製剤を投与することを含んで成る病気、特に内臓リーシュマニア症の処置の方法が提供されることを認識しているであろう。図１：Ｌ．ドノバニ（L ．donovani）感染マウスの脾臓、肝臓及び骨髄寄生体負荷に対する界面活性剤Ｖ，VII，VIII又はIX Ｖ／Ｄスチボグルコネート懸濁物（全用量／マウス： 17.2mg Sb^V／kg）による処置の効果。図２：Ｌ．ドノバニ（L ．donovani）感染マウスの脾臓、肝臓及び骨髄寄生体負荷に対する界面活性剤Ｖ，VII，VIIIもしくはIX Ｖ／Ｄスチボグルコネート懸濁物（全用量／マウス： 88.8mg Sb^V／kg）、スチボグルコネート溶液（全用量／マウス： 88.8mg Sb^V／kg）又はPBS（コントロール）による処置の効果。図３：Ｌ．ドノバニ感染マウスの脾臓、肝臓及び骨髄寄生体負荷に対する界面活性剤IX Ｖ／Ｄスチボグルコネート懸濁物（全用量／マウス：17.8，44.4又は88 .8mg Sb^V／kg）又はPBS（コントロール）による処置の効果。図４：Ｌ．ドノバニ感染マウスの脾臓、肝臓及び骨髄寄生体負荷に対する遊離薬剤（スチボグルコネート）溶液（全用量／マウス：17.8，44.4又は 88.8mg Sb^V ／kg）又はPBS（コントロール）による処置の効果。本発明の態様を例示的にこれより説明する。実施例第１章材料 0.32mgのSb^V／mgに相当するナトリウムスチボグルコネート（ペントスタム）を The Wellcome Foundation，UKより入手した。以下の化学的に規定される界面活性剤をこの研究において利用した：Bladgen Chemicals Ltd.，UKより購入した界面活性剤Ｖ（トリグリセロールモノステアレート）及び界面活性剤VI（ヘキサグリセロールジステアレート）；Chesham Chemicals Ltd.，UKより購入した界面活性剤VII（ジエチレングリコールモノｎ−ヘキサデシルエーテル）、界面活性剤VIII（テトラエチレングリコールモノｎ−ヘキサデシルエーテル）及び界面活性剤IX（ヘキサエチレングリコールモノｎ−ヘキサデシルエーテル）。アンチモン標準品、トリパンブルー、ジセチルホスフェート及び無灰コレステロールは S igmaから入手し、そしてブルーデキストランT-2000は Pharmacia Biosystems Lt d.，UKより入手した。その他の試薬は全て分析級のものとした。小胞サイズの縮小は押出機（Lipex Biomembranes Inc.）を用い、ポリカーボネート膜（Nucleop ore）を通すことにより実施した。小胞懸濁物をMalvern Zetasizer 4(Malvern I nstruments Ltd.，UK)を用い、製造者の仕様書に従う光子相関スペクトル測定によりサイズ選別した。動物及び寄生体歳及び性を合わせた生後８〜10週目の純系雄又は雌Balb／ｃマウスを研究全体を通じて使用した。リーシュマニア・ドノバニ（株MHOM／ET／67：LV82）を純系ゴールデン・シリアン（Golden Syrian）ハムスター（Mesocricetus Auratus，C arterら、1989）に一連の継代により維持させた。マウスを１〜２×10⁷のリーシュマニア・ドノバニ体の静脈内注射（尾静脈、麻酔なし）により感染させた（Ca rterら、1988に記載）。寄生体投与日を実験０日目と表示した。小胞形成ストック状の小胞溶融物をまず界面活性剤、コレステロール及びジアセチルホスフェートを５：４：１のモル比で混合し、その混合物を 150℃で５分加熱し、次いで冷却することにより調製した。150μｌの固形化ストック小胞溶融物を沸騰浴槽の中で溶けるまで加熱し、次いで５mlの0.5％ｗ／ｖのトリパンブルー溶液（色素小胞）、リン酸緩衝食塩水（PBS pH 7.4）又は 300mMのＤ−グルコース（「空」小胞）により70℃ですばやく水和させた。水和を70℃で２時間強力に撹拌し続けた。一部の小胞懸濁物を孔径 200nmのポリカーボネート膜を通じて10回押出し、次いでジャケット付き（70℃）押出機を用いた孔径50nmの２枚の膜を通じて押出して小胞の直径を変えた。一部の実験において、遊離薬剤又は遊離トリパンブルーを18×2.6cm のSephadex G50カラムを用い、溶出剤として PBS又は T es／ヒスチジン／食塩水（THSバッファー、pH 7.4）により小胞懸濁物から除去した。TesはＮ−トリス〔ヒドロキシメチル〕メチル−２−アミノエタンスルホン酸の略語である。このカラムのボイド容量はカラムにブルーデキストランT-20 00溶液を通すことにより確認した。本発明に係る「Ｖ／Ｄ」懸濁物の調製において、遊離薬剤の除去のためのゲル濾過工程は省略し、そして薬剤装填小胞は水和のために用いる薬剤の中で保存した。小胞懸濁物をレーザー光子相関スペクトル測定を利用してサイズ選別した。懸濁物を４℃で保存し、そして調製して３日以内に使用した。アンチモンの測定等容量のプロパノールの添加により破壊した 0.1mlの小胞懸濁物を蒸留水で１／50に希釈し、そして存在しているアンチモン（Sb物質）の量を火炎原子吸収スペクトルを利用して標準品（アンチモン標準溶液）との比較により決定した。小胞調製品についての捕促率（％として表示）は以下の等式を利用して決定した：薬剤処置及び寄生体数の決定感染マウス（５匹／処理）を、0.2mlの容量の PBS、「空」小胞、薬剤装填小胞（全アンチモン用量：0.64〜2.42mgのSb^V／kg）、0.97，2.5，5mgのSb^V／mlの濃度のスチブグルコネートで水和した本発明に係る「Ｖ／Ｄ」懸濁物（全アンチモン用量：17.2，44.4及び88.8mgのSb^V／kgそれぞれ）、又は遊離スチボグルコネート溶液（全アンチモン用量：17.2，44.4及び88.8mgのSb^V／kg）により、７日及び８日目、又は14日及び15日目にて尾静脈（麻酔なし）を介して処置した。１回目の薬剤処置の７日後、即ち14〜21日目に、コントロール並びに薬剤処置したマウスの肝臓、脾臓及び骨髄中の寄生体数（1000個の宿主細胞核当り）を決定した（Carterら、1988）。リーシュマン・ドノバン単位（LDU）を肝臓及び脾臓に関する器官当り、式 LDU＝1000個の宿主細胞核当りの寄生体数×器官重量（ｇ）を利用し、計算した(Bradley and Kirkley，1977)。データーの紹介及び統計学的分析脾臓及び肝臓の寄生体負荷を平均 LDU／器官±標準誤差として表示し、そして骨髄計測数は平均寄生体数／1000宿主細胞核±標準誤差として表示した。平均パーセント寄生体抑制±標準誤差（SE）も示し、それは各実験値を特定の部位についての相対平均コントロールと比較することにより決定されたものである。寄生体負荷は log10変換データーに基づく Studentの不対合（unpaired）検定を利用して分析した（脾臓及び肝臓については LDU／器官、そして骨髄については寄生体数／1000個の宿主細胞核）。結果小胞の形成小胞の形成の推定的な証拠はトリパンブルー溶液で水和した界面活性懸濁物のゲル濾過から得た。これに基づき、界面活性剤Ｖ〜IXは全て小胞を形成し、その理由はトリパンブルーが２本のバンド泳動し、第一のバンドはボイド容量において出現し（小胞封入化色素）、そしてはるかに大きい溶出容積を有する第二のバンドは非封入化色素を示したからである。５種類の界面活性剤は全て PBS又はグルコースによる水和により 203〜639nm に範囲する平均直径を有する小胞も形成した（表１）。利用した条件下で、界面活性剤IXはいづれの水和用溶液によっても最小の小胞を形成した。種々の濃度のナトリウムスチボグルコネート溶液による水和は界面活性剤Ｖ，VI，VII及びVII Iの場合は類似のサイズの小胞を供したが、界面活性剤VIは33.3mgのSb^V／mlに相当するスチボグルコネート溶液による水和では小胞を形成しなかった。同じ条件で（スチボグルコネート溶液による水和）、界面活性剤IXは最大の小胞を供した（表１）。ポリカーボネート膜を通じる押出は平均小胞径に対してはほとんど影響がなく、そして事実上界面活性剤IX小胞懸濁物の場合は平均径を増大させるようであった（表１）。薬剤装填界面活性剤VIII小胞を利用し、押出を行う膜の孔径を小さくしていくと、暫進的に平均径が大きくなっていく小胞が生成され（データーは示さない）、一方ゲル濾過は平均小胞径を小さくしていった（表１）。５種類の界面活性剤及び水和用の２通りの濃度のナトリウムスチボグルコネートを利用して作った小胞の捕促率を決定した。低めの薬剤濃度（５mgのSb^V／ml ）では、小胞調製品は全て水和用溶液中の約１％のアンチモンを捕促し、製剤間での変動は小さかった（0.73％〜1.1％）。33.3mgのSb^V／mlによる水和は変動性の捕促率（0.14％〜3.46％）を示し、界面活性剤IX小胞は最小の、そして界面活性剤VIII小胞は最大の捕促率を示した。寄生体の抑制表２は水性相中に薬剤の入っていない小胞懸濁物の効果の対比目的について示す。図１〜４は本発明に係るＶ／Ｄ懸濁物を示す。表３は改良Ｖ／Ｄ懸濁物を含むＶ／Ｄ懸濁物の効率の対比を示し、ここで水性ビヒクル中の薬剤の濃度は変えてある。１）対比結果界面活性剤Ｖ，VI，VII又はIXを利用して調製した「空」（グルコース装填）小胞によるＬ．ドノバニ感染マウスの処置は、対応のコントロールと比較して、肝臓、脾臓又は骨髄寄生体負荷に対する抑制効果がなかった（データーは示さず）。しかしながら、「空」界面活性剤VIII小胞による処置は肝臓中の寄生体数を減少させ（ｐ＜0.05）、しかしコントロールと比較して脾臓及び骨髄における寄生体数には有意な影響を及ぼさなかった（データーは示さず）。界面活性剤Ｖ（データーは示さず）並びに界面活性剤VII，VIII及びIX（表２）から調製した押出した又は押出していない薬剤装填小胞による処置（0.42〜2. 42mgのSb^V／kgの域の全薬剤用量）は対応のコントロールと比べて肝臓寄生体負荷を有意に抑制したが（ｐ＜0.0005）、骨髄寄生体数に対しては何ら影響を及ぼさなかった。脾臓中で、薬剤装填界面活性剤VIII小胞（押出又は押出していない）による処置のみが寄生体負荷を有意に(ｐ＜0.005)抑制した。小胞調製品間での効率の変動は薬剤含有量の相違に起因し得、いうなれば捕促率の差に反映する。しかしながら、重要な要因は、遊離形態と比較しての小胞薬剤の増大した効率である。全用量88.8mgのSb^V／kg の遊離スチボグルコネートにより得られる抑制は、小胞調製品（0.42〜2.42mgの Sb^V／kgの用量域）により達せられるものよりも有意に（ｐ＜0.0005）低かった。88.8mgのSb^V／kgの用量においては、スチボグルコネート処置は脾臓及び骨髄寄生体負荷を抑制しなかった（表２）。２）本発明に係るＶ／Ｄ懸濁物の結果図１は、Ｌ．ドノバニ感染マウスの脾臓、肝臓及び骨髄寄生体負荷に対する本発明に係る界面活性剤Ｖ，VII，VIII又はIX Ｖ／Ｄスチボグルコネート懸濁物〔図１（全用量／マウス：17.2mgのSb^V／kg）又は図２（全用量／マウス：88.8m gのSb^V／kg）〕、スチボグルコネート溶液（全用量／マウス：88.8mgのSb^V／kg ）又はPBS（コントロール）による処置の効果を示す。動物を感染後14及び15日目に処置し、そして６日後に殺した。コントロール値との対比での Student検定：^*ｐ＜0.05，^**ｐ＜0.005，^***ｐ＜0.0005 図３は、Ｌ．ドノバニ感染マウスの脾臓、肝臓及び骨髄寄生体負荷に対する本発明に係る界面活性剤IX Ｖ／Ｄスチボグルコネート懸濁物（全用量／マウス： 17.8，44.4又は88.8mgのSb^V／kg）、スチボグルコネート溶液（図４は全用量／マウス：17.8，44.4又は88.8mgのSb^V／kg）、又はPBS（コントロール）による処置の効果を示す。動物を感染後７及び８日目に処置し、そして６日後に殺した。コントロール値との対比での Student検定：^*ｐ＜0.05，^**ｐ＜0.005，^***ｐ＜0 .0005。 0.97mgのSb^V／kg（全用量17.2mgのSb^V／kg）で水和した界面活性剤Ｖ，VII，V III及びIXから調製した本発明に係るＶ／Ｄ懸濁物は肝臓寄生体数において類似の有意（ｐ＜0.0005）な低下を誘導した（図１）。これらの界面活性剤から調製したが、５mgのSb^V／ml（全用量88.8mg Sb^V／kg）で水和しておいたＶ／Ｄ懸濁物は肝臓寄生体数の多大な低下を誘導した（図２）。Ｖ／Ｄ懸濁物は全て肝臓寄生体に対する等用量の遊離薬剤よりも活性であった。低めの用量レベルでは、Ｖ／Ｄ調製品は脾臓又は骨髄寄生体に対して有意な効果がなく（図１）、一方４種のＶ／Ｄ調製品は全て高い用量レベルにおいて脾臓中の寄生体に対して活性であり（ｐ＜0.01、図２）、そして界面活性剤Ｖ及びIX Ｖ／Ｄ懸濁物は界面活性剤VII及びVIII懸濁物よりも活性であった。界面活性剤Ｖ及び界面活性剤IX Ｖ／Ｄ懸濁物（全用量88.8mgのSb^V／kg）のみがコントロールと比べて骨髄寄生体数を有意に抑制した（ｐ＜0.005、図２）。同等の濃度で、遊離薬剤処置は脾臓又は骨髄寄生体に対して有意な効果がなかった。より有効な界面活性剤Ｖ及びIX Ｖ／Ｄ懸濁物(それぞれ 831±156nm 及び1030±257 nm)は低い活性の界面活性剤VII及びVIII懸濁物（それぞれ平均径 536±19nm及び 546±40nm）よりも大型の小胞を含んだ。界面活性剤IX Ｖ／Ｄ懸濁物を利用し、脾臓、肝臓及び骨髄寄生負荷に対する用量依存式効果が得られた（図３）。同濃度の遊離薬剤による処置も肝臓Ｌ．ドノバニ寄生体負荷に対して用量依存式効果を示し、脾臓中の寄生体に対しては弱い効果を示し、そして骨髄寄生体数に対しては有意な効果を示さなかった（図４）。備考「空」小胞−小胞は薬剤の代わりにグルコース溶液を使用して作製小胞懸濁物−未封入薬剤の除去のため薬剤装填小胞を洗浄；これにより薬剤「パケット」のみ供されるＶ／Ｄ懸濁物−薬剤装填小胞をそれを形成するのに用いる薬剤溶液の中で保存；即ち、それは混合調製品改変Ｖ／Ｄ懸濁物−薬剤装填小胞を生成し、次いで未封入薬剤（通常は非常に高い薬剤濃度）を除去するために洗浄し、次いで薬剤装填小胞を希薄薬剤溶液の中に再懸濁実施例第２章材料 0.32mg Sb^V／mgに相当するナトリウムスチボグルコネート（ペントスタム）を The Wellcome Foundation，UKより入手した。パロマイシンスルフェートは Sig ma，UKより入手した。以下の化学的に規定される界面活性剤をこの研究において利用した：Bladgen Chemicals Ltd.，UKより購入した界面活性剤Ｖ（トリグリセロールモノステアレート）及び界面活性剤VI（ヘキサグリセロールジステアレート）；Chesham Chemicals Ltd.，UKより購入した界面活性剤VII（ジエチレングリコールモノｎ−ヘキサデシルエーテル）、界面活性剤VIII（テトラエチレングリコールモノｎ−ヘキサデシルエーテル）及び界面活性剤IX（ヘキサエチレングリコールモノｎ−ヘキサデシルエーテル）。ジセチルホスフェート及びコレステロール（無灰）は Sigmaから入手し、そしてその他の試薬は全て分析級のものとした。小胞懸濁物をMalvern Zetasizer 4（Malvern Instruments Ltd.，UK）を用いてサイズ選別した。動物及び寄生体歳及び性を合わせた生後８〜10週目の純系雄又は雌Balb／ｃマウス並びに歳及び性を合わせた純系ゴールデン・シリアンハムスター（90〜125 ｇ：Mesocricetus auratus）を研究全体を通じて使用した。リーシュマニア・ドノバニ（株MHOM／ET／67：LV82）を純系ゴールデン・シリアンハムスター（Carter ら1988，J.Pharm.Pharmacol.，40，370-373）に一連の継代により維持させた。マウス（尾静脈、麻酔なし、Carterら、1988，J.Pharm.Pharmacol.，40，370-37 3）又はハムスター(頸静脈、麻酔なし、Carterら、1989，Int.J.Pharmaceutics 53，129-137)を１〜２×10⁷のリーシュマニア・ドノバニ体の静脈内注射により感染させた。寄生体投与日を実験０日目と表示した。小胞形成ａ）小スケール製造方法ナトリウムスチボグルコネート又はパロマイシン非イオン小胞(NIV)懸濁物をW illiamsら（1995，J.Drug Targeting 3 1-7）に記載の通りにして調製した。簡単には、ストック溶融物をまず界面活性剤、コレステロール、及びジセチルホスフェート、パルミチン酸又はステアリン酸を所望のモル比で混合し、135℃で５分その混合物を加熱し、次いで冷却することによって調製した。150，750，3750 又は 6600molの固形化ストック溶融物を沸騰浴槽で溶融させ、次いで５mlのナトリウムスチボグルコネート溶液により70℃で急速水和させた。水和を70℃で２時間撹拌し続けた。NIV懸濁物は、薬剤装填小胞が水和用薬剤溶液の中に維持されているとき、「Ｖ／Ｄ」懸濁物と称する。あるケースにおいては、Ｖ／Ｄ懸濁物をその後水によるＶ／Ｄ懸濁物の直接希釈により又は水和用薬剤溶液を除去し、次いでＶ／Ｄ懸濁物の中に存在している薬剤装填小胞を希薄な薬剤溶液に再懸濁することにより、希薄な薬剤溶液の中で薬剤装填小胞の懸濁物が生成されるように処理した。例えば、6600molのＶ／Ｄ懸濁物を撹拌しながら水で希釈して3.75mgのSb^V／mlを含む750molの NIV懸濁物にした。水和用薬剤溶液を除去するため、Ｖ／Ｄ懸濁物を 35,000rpmで50分遠心し（Beckman XL-90 Ultracentrifuge）、次いで小胞ペレットをPBS(pH 7.4)又は新鮮なナトリウムスチボグルコネート溶液（0.97mgのSb^V／ml）に再懸濁した。5 0分間更に遠心した後、ペレットを最後に新鮮なナトリウムスチボグルコネート溶液（0.97，2.31又は５mgのSb^V／ml）又は PBSに再懸濁した。実験において、これらの NIV懸濁物の効能を小胞ペレットを再懸濁するのに用いた遊離薬剤のそれと比較した（0.97，2.31又は５mgのSb^V／ml）。ｂ）「ホモジネーション」を利用する小胞製剤の調製所望のモル比における小胞構成成分（界面活性剤、コレステロール及びジセチルホスフェート、パルミチン酸又はステアリン酸）を 135℃に加熱した。溶融混合物を次に70℃に冷却し、次いで５mlの予備加熱しておいたナトリウムスチボグルコネート溶液で水和させた。次いでこの懸濁物を Silversonミキサー（密封ユニット）又はホモジナイザーUltra-turrac（モデルＴ25； 8000rpmで運転）で70 ℃で15分ホモジナイズした。「薬剤非含有」小胞製剤の抗寄生体活性を決定するため、グルコース、PBS又は水装填（「空」）小胞懸濁物を上記と同じ方法で作った。小胞懸濁物をレーザー光子相関スペクトル測定を利用してサイズ選別し、そして４℃で保存した。小胞製剤を全て調製して３日以内に使用した。アンチモン決定遊離薬剤をゲル濾過により、18×2.6cm のSephadex G50カラムを溶出剤としての PBS又はpH 7.4の Tes／ヒスチジン／食塩水バッファーとを用いて小胞懸濁物から除去し、次いでアンチモン含有測定を行った。等容量のプロパノールの添加により破壊しておいた 0.1mlの小胞懸濁物を蒸留水で１／50に希釈し、そして存在しているアンチモンの全量を火炎原子吸収スペクトルを利用して標準品(アンチモン標準溶液、Sigma)との対比により決定した。薬剤処置感染したマウス又はハムスター（５匹／グループ）を感染後７，８又は29日目に下記の適当な調製品 200μｌで静脈内処置した（マウスに関しては尾静脈、そしてハムスターに関しては頸静脈）：PBS(コントロール)、Ｖ／Ｄ懸濁物（2.25 ，3.75又は33.3mgのSb^V／ml）、NIV懸濁物（アンチモン用量は存在する遊離薬剤溶液の濃度、即ち、2.25，3.75mg又は33.3Sb^V／mlに基づく）、グルコース、 PB S又は水装填小胞懸濁物、又はスチボグルコネート溶液（2.25，3.75又は33.3mg のSb^V／ml）。一部の実験においては、マウスに感染後７日目においてPBS（コントロール）又は薬剤調製品を一回注射又は30分間隔で２回注射した。寄生体数の測定コントロール並びに薬剤処置したマウスの肝臓、脾臓及び骨髄中の寄生体数（ 1000個の宿主細胞核当り）を決定した(Carterら、1988，J.Pharm.Pharmacol.，4 0，370-373)。リーシュマン・ドノバン単位(LDU)を肝臓及び脾臓に関する器官当り、式 LDU＝1000個の宿主細胞核当りの寄生体数×器官重量（ｇ）を利用し、計算した（Bradley and Kirkley，1977，Clin.Ex.Immunol.，30，119-129）。データーの紹介及び統計学的分析平均パーセント寄生体抑制±標準誤差（SE）を示し、それは各実験値を特定の部位についての相対平均コントロールと比較することにより決定されたものである。寄生体負荷は log10変換データーに基づく Studentの不対合（unpaired）検定を利用して分析した（脾臓及び肝臓については LDU／器官、そして骨髄については寄生体数／1000個の宿主細胞核）。結果表４Ｌ．ドノバニ感染Balb／ｃマウスの寄生体負荷に対する種々のスチボグルコネート NIV製剤による処置の効果（平均％抑制±SEで表示）。動物を感染後７日目に以下のいづれか 0.2mlにより静脈内処置した：PBS(コントロール)、遊離薬剤溶液（2.25mgのSb^V／ml）又は NIV製剤。次いで７日後に寄生体数を測定した。小胞懸濁物（5500mmol）を50mgのSb^V／mlナトリウムスチボグルコネートで水和し、そして水で希釈して2.25mgのSb^V／ml遊離薬剤溶液／mlを含む 750mmolの懸濁物にした。構成成分（界面活性剤VIII：コレステロール：ジセチルホスフェート又は脂肪酸）のモル比をかっこ内に示す。小胞懸濁物をホモジナイゼーション法を利用して作った。表５Ｌ．ドノバニ感染Balb／ｃマウスの脾臓、肝臓及び骨髄寄生体負荷に対する界面活性剤VIIIナトリウムスチボグルコネート NIV懸濁物（調製品１，２又は３；３：４：１のモル比）又はスチボグルコネート溶液（3.75又は33.3 mgのSb^V／ml）による処置の効果。調製品１は6600nmolの懸濁物であり、33.3mg のSb^V／mlの薬剤溶液により水和され、そして3.75mgのSb^V／mlの最終薬剤濃度（濃度 750mmol；薬剤用量／マウスは33.3mgのSb^V／kgに相当）となるように水で希釈してある。調製品２は33.3mgのSb^V／mlで水和した一定容量の 750mmolのＶ／Ｄ懸濁物を遠心し、次いで薬剤装填小胞をそのもとの容量の2.31mgのSb^V／ml の遊離薬剤溶液（濃度 750mmol；薬剤用量／マウスは20.5mgのSb^V／kgに相当）の中に再懸濁することにより調製した。調製品３は33.3mgのSb^V／ml薬剤溶液（薬剤用量は 296mgのSb^V／kgに相当）で水和した 750mmolのＶ／Ｄ懸濁物である。調製品４は PBSで水和した 750mmolのＶ／Ｄ懸濁物である（空の小胞懸濁物）。７日目に動物に 200μｌの用量を１回与え、そして６日後に殺した。抑制をコントロール動物の平均負荷を基礎に計算した。抑制についての平均小胞直径は：調製品１：2292±802nm ；調製品２： 389±24nm；調製品３： 403±18nm。小胞懸濁物を小スケール法を利用して製造した。表６Ｌ．ドノバニ感染ハムスターの寄生体負荷に対するナトリウムスチボグルコネート製剤による処置の効果。ハムスターを感染後７日目（急性感染症）又は29日目（慢性感染症）にて 0.2mlのPBS(コントロール)、遊離薬剤（33.3mgのSb^V／ml ）又は界面活性剤VIIIスチボグルコネート NIV製剤（３：４：１のモル比；750m ol；33.3mgのSb^V／ml薬剤溶液で水和）により静脈内処置した。動物を感染後７日目に殺した。コントロール値との対比^**ｐ＜0.01，^***ｐ＜0.005。小胞懸濁物をホモジナイゼーション法を利用して調製した。表７Ｌ．ドノバニ感染Balb／ｃマウスの脾臓、肝臓及び骨髄寄生体負荷に対するパロモマイシン製剤による処置の効果。動物に 200μｌの用量のPBS(コントロール )もしくはパロモマイシン溶液(7.9mg／ml)、又は50μｌ用量の界面活性剤Ｘパロモマイシン NIV懸濁物（５：４：２のモル比、750mol）を感染後７日目に１回与え、そしてその６日後に殺した。NIV製剤は 3750molの懸濁物を39.5mg／mlのパロモマイシンにより水和することにより調製し、そして使用前に水で１：５に希釈した。小胞懸濁物は小スケール法を利用して作り、そしてマウスに付与した薬剤用量はかっこ内でmg／kgで示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年９月１０日【補正内容】明細書原理的には、この小胞は当業界において公知であり、且つ活性剤をデリバリーするのに適する任意の方法で形成されうる。例えば、「ホモジナイゼーション」法又は「凍結乾燥」法のいづれかを利用して形成でき、双方の方法は当業界において公知である。ホモジナイゼーション法において、所望のモル比における脂質材料の必要たる量は以下の方法のいづれかにおいて処理されうる：乾燥粉末（即ち、脂質材料）を封入用活性剤の溶液により所望の温度（０〜150 ℃の範囲）で水和し、そして必要たる速度で所望の小胞特性が得られるのに必要な時間にわたってホモジナイズする。他方、脂質材料は必要たる温度での必要たる溶液による水和の前に加熱（例えば40〜150 ℃の温度範囲）により溶融させてよい。次いでこの懸濁物を、所望の特性を有する小胞ができるのに必要たる速度及び必要たる時間ホモジナイズすることができる。ナトリウムスチボグルコネート小胞懸濁物は小胞構成成分を例えば 135℃で加熱することによって上記に概略した方法を利用して生成できうる。次いで、溶融脂質を５mlの予備加熱したナトリウムスチボグルコネート溶液による水和の前に例えば70℃にまで冷却してよい。小胞サイズの縮小は、サンプルを一定の時間間隔、特定の時間で、例えば70℃で15分間において、Silversonミキサー（密封ユニット）又はUltra-turrac(モデルＴ25)(ホモジナイザー装置)で例えば 8000rpm で運転させてホモジナイズすることにより達成できる。凍結乾燥法において、凍結乾燥調製品は以下の方法のいづれかで製造できる：所望のモル比の必要量の小胞構成成分を有機溶媒（例えばｔ−ブチルアルコール）に溶かし、次いで例えば多孔質膜(例えば0.2mm)で濾過することができる。次いで界面活性溶液を凍結し、そして有機溶媒の完全な除去に必要な時間凍結乾燥させることができる。次いで得られる凍結乾燥生成物を封入すべき活性剤溶液で水和し、そして小胞懸濁物ができるのに必要な温度で振盪させることができる。他方、小胞懸濁物を上記のホモジナイゼーションプロセスにより作り、多孔質膜(例えば0.2mm)で濾過し、次いで凍結乾燥させて水性溶媒を除去してよい。得られる凍結乾燥生成物を必要たる溶液で水和し、そして小胞懸濁物ができるのに必要な温度において振盪させることができる。小胞は好ましくはステロール、例えばコレステロール又はエルゴステロールと、界面活性剤とより形成する。もし非イオン界面活性剤を使用するなら、小胞の凝集を避けるために小胞製剤の中に脂肪酸の如き帯電物質を含ませることが一般に必要とされる。適当な帯電物質にはジセチルホスフェート、ステアリン酸及びパルミチン酸が含まれる。非イオン界面活性剤を使用することが極めて有利でありうる。これはモノ−、ジ−、トリ−又はポリ（10に至るまで）グリセロールモノ−又はジ−脂肪酸エステル（例えばＣ₁₀−Ｃ₂₀脂肪酸エステル）、例えばトリグリセロールモノステアレートであるか；又は例えば親水性頭部領域と疎水性尾部領域とを担うＣ₁₀−Ｃ₂₀ の直鎖もしくは枝分れアルキル鎖をもつ１〜10のオキシエチレン成分を好適に含んで成るポリオキシエチレンエーテルであってよい。非イオン界面活性剤、コレステロール及びジセチルホスフェート又は脂肪酸を含んで成る小胞製剤はそれぞれ３〜５：１〜４：０〜４のモル比で存在していてよい。データーの紹介及び統計学的分析脾臓及び肝臓の寄生体負荷を平均 LDU／器官±標準誤差として表示し、そして骨髄計測数は平均寄生体数／1000宿主細胞核±標準誤差として表示した。平均パーセント寄生体抑制±標準誤差（SE）も示し、それは各実験値を特定の部位についての相対平均コントロールと比較することにより決定されたものである。寄生体負荷は log10変換データーに基づく Studentの不対合（unpaired）検定を利用して分析した（脾臓及び肝臓については LDU／器官、そして骨髄については寄生体数／1000個の宿主細胞核）。結果小胞の形成小胞の形成の推定的な証拠はトリパンブルー溶液で水和した界面活性懸濁物のゲル濾過から得た。これに基づき、界面活性剤Ｖ〜IXは全て小胞を形成し、その理由はトリパンブルーが２本のバンド泳動し、第一のバンドはボイド容量において出現し（小胞封入化色素）、そしてはるかに大きい溶出容積を有する第二のバンドは非封入化色素を示したからである。５種類の界面活性剤は全て PBS又はグルコースによる水和により 203〜639nm に範囲する平均直径を有する小胞も形成した（表１）。利用した条件下で、界面活性剤IXはいづれの水和用溶液によっても最小の小胞を形成した。種々の濃度のナトリウムスチボグルコネート溶液による水和は界面活性剤Ｖ，VI，VII及びVII Iの場合は類似のサイズの小胞を供したが、界面活性剤VIは33.3mgのSb^V／mlに相当するスチボグルコネート溶液による水和では小胞を形成しなかった。同じ条件で（スチボグルコネート溶液による水和）、界面活性剤IXは最大の小胞を供した（表１）。ポリカーボネート膜を通じる押出は平均小胞径に対してはほとんど影響がなく、そして事実上界面活性剤IX小胞懸濁物の場合は平均径を増大させるようであった（表１）。薬剤装填界面活性剤VIII小胞を利用し、押出を行う膜の孔径を小さくしていくと、暫進的に平均径が大きくなっていく小胞が生成され（データーは示さない）、一方ゲル濾過は平均小胞径を小さくしていった（表１）。５種類の界面活性剤及び水和用の２通りの濃度のナトリウムスチボグルコネートを利用して作った小胞の捕促率を決定した。低めの薬剤濃度（５mgのSb^V／ml ）では、小胞調製品は全て水和用溶液中の約１％のアンチモンを捕促し、製剤間での変動は小さかった（0.73％〜1.1％）。33.3mgのSb^V／mlによる水和は変動性の捕促率（0.14％〜3.46％）を示し、界面活性剤IX小胞は最小の、そして界面活性剤VIII小胞は最大の捕促率を示した。寄生体の抑制表２は水性相中に薬剤の入っていない小胞懸濁物の効果の対比目的について示す。図１〜４は本発明に係るＶ／Ｄ懸濁物を示す。表３は改良Ｖ／Ｄ懸濁物を含むＶ／Ｄ懸濁物の効率の対比を示し、ここで水性ビヒクル中の薬剤の濃度は変えてある。１）対比結果界面活性剤Ｖ，VI，VII又はIXを利用して調製した「空」（グルコース装填）小胞によるＬ．ドノバニ感染マウスの処置は、対応のコントロールと比較して、肝臓、脾臓又は骨髄寄生体負荷に対する抑制効果がなかった（データーは示さず）。しかしながら、「空」界面活性剤VIII小胞による処置は肝臓中の寄生体数を減少させ（ｐ＜0.05）、しかしコントロールと比較して脾臓及び骨髄における寄生体数には有意な影響を及ぼさなかった（データーは示さず）。界面活性剤Ｖ（データーは示さず）並びに界面活性剤VII，VIII及びIX（表２）から調製した押出した又は押出していない薬剤装填小胞による処置（0.42〜2.42mgのSb^V／kgの域の全薬剤用量）は対応のコントロールと比べて肝臓寄生体負荷を有意に抑制したが（ｐ＜0.0005）、骨髄寄生体数に対しては何ら影響を及ぼさなかった。脾臓中で、薬剤装填界面活性剤VIII小胞（押出又は押出していない）による処置のみが寄生体負荷を有意に(ｐ＜0.005)抑制した。小胞調製品間での効率の変動は薬剤含有量の相違に起因し得、いうなれば捕促率の差に反映する。しかしながら、重要な要因は、遊離形態と比較しての小胞薬剤の増大した効率である。全用量88.8mgのSb^V／kgの遊離スチボグルコネートにより得られる抑制は、小胞調製品（0.42〜2.42mgのSb^V／kgの用量域）により達せられるものよりも有意に（ｐ＜0.0005）低かった。88.8mgのSb^V／kgの用量においては、スチボグルコネート処置は脾臓及び骨髄寄生体負荷を抑制しなかった（表２）。動物及び寄生体歳及び性を合わせた生後８〜10週目の純系雄又は雌Balb／ｃマウス並びに歳及び性を合わせた純系ゴールデン・シリアンハムスター（90〜125 ｇ：Mesocricet us auratus）を研究全体を通じて使用した。リーシュマニア・ドノバニ（株MHOM ／ET／67：LV82）を純系ゴールデン・シリアンハムスター(Carterら1988，J.Pha rm.Pharmacol.，40，370-373)に一連の継代により維持させた。マウス(尾静脈、麻酔なし、Carterら、1988，J.Pharm.Pharmacol.，40，370-373)又はハムスター（頸静脈、麻酔なし、Carterら、1989，Int.J.Pharmaceutics 53，129-137)を１〜２×10⁷のリーシュマニア・ドノバニ体の静脈内注射により感染させた。寄生体投与日を実験０日目と表示した。小胞形成ａ）小スケール製造方法ナトリウムスチボグルコネート又はパロマイシン非イオン小胞(NIV)懸濁物をW illiamsら（1995，J.Drug Targeting 3 1-7）に記載の通りにして調製した。簡単には、ストック溶融物をまず界面活性剤、コレステロール、及びジセチルホスフェート、パルミチン酸又はステアリン酸を所望のモル比で混合し、135℃で５分その混合物を加熱し、次いで冷却することによって調製した。150，750，3750 又は6600μmoleの固形化ストック溶融物を沸騰浴槽で溶融させ、次いで５mlのナトリウムスチボグルコネート溶液により70℃で急速水和させた。水和を70℃で２時間撹拌し続けた。NIV懸濁物は、薬剤装填小胞が水和用薬剤溶液の中に維持されているとき、「Ｖ／Ｄ」懸濁物と称する。あるケースにおいては、Ｖ／Ｄ懸濁物をその後水によるＶ／Ｄ懸濁物の直接希釈により又は水和用薬剤溶液を除去し、次いでＶ／Ｄ懸濁物の中に存在している薬剤装填小胞を希薄な薬剤溶液に再懸濁することにより、希薄な薬剤溶液の中で薬剤装填小胞の懸濁物が生成されるように処理した。例えば、6600μmoleのＶ／Ｄ懸濁物を撹拌しながら水で希釈して3.75mgのSb^V／mlを含む 750μmoleの NIV懸濁物にした。水和用薬剤溶液を除去するため、Ｖ／Ｄ懸濁物を 35,000rpmで50分遠心し(Beckman XL-90 Ultracentrifuge)、次いで小胞ペレットをPBS(pH 7.4)又は新鮮なナトリウムスチボグルコネート溶液（0.97mgのSb^V／ml）に再懸濁した。50分間更に遠心した後、ペレットを最後に新鮮なナトリウムスチボグルコネート溶液（0.97，2.31又は５mgのSb^V／ml）又は PBSに再懸濁した。実験において、これらの NIV懸濁物の効能を小胞ペレットを再懸濁するのに用いた遊離薬剤のそれと比較した（0.97 ，2.31又は５mgのSb^V／ml）。ｂ）「ホモジネーション」を利用する小胞製剤の調製所望のモル比における小胞構成成分（界面活性剤、コレステロール及びジセチルホスフェート、パルミチン酸又はステアリン酸）を 135℃に加熱した。溶融混合物を次に70℃に冷却し、次いで５mlの予備加熱しておいたナトリウムスチボグルコネート溶液で水和させた。次いでこの懸濁物を Silversonミキサー（密封ユニット）又はホモジナイザーUltra-turrac（モデルＴ25；8000rpmで運転）で70 ℃で15分ホモジナイズした。「薬剤非含有」小胞製剤の抗寄生体活性を決定するため、グルコース、PBS又は水装填（「空」）小胞懸濁物を上記と同じ方法で作った。小胞懸濁物をレーザー光子相関スペクトル測定を利用してサイズ選別し、そして４℃で保存した。小胞製剤を全て調製して３日以内に使用した。薬剤処置感染したマウス又はハムスター（５匹／グループ）を感染後７，８又は29日目に下記の適当な調製品 200μｌで静脈内処置した（マウスに関しては尾静脈、そしてハムスターに関しては頸静脈）：PBS(コントロール)、Ｖ／Ｄ懸濁物（2.25 ，3.75又は33.3mgのSb^V／ml）、NIV懸濁物（アンチモン用量は存在する遊離薬剤溶液の濃度、即ち、2.25，3.75mg又は33.3Sb^V／mlに基づく）、グルコース、PBS 又は水装填小胞懸濁物、又はスチボグルコネート溶液（2.25，3.75又は33.3mgの Sb^V／ml）。一部の実験においては、マウスに感染後７日目においてPBS(コントロール)又は薬剤調製品を一回注射又は30分間隔で２回注射した。寄生体数の測定コントロール並びに薬剤処置したマウスの肝臓、脾臓及び骨髄中の寄生体数（ 1000個の宿主細胞核当り）を決定した(Carterら、1988，J.Pharm.Pharmacol.，4 0，370-373)。リーシュマン・ドノバン単位(LDU)を肝臓及び脾臓に関する器官当り、式 LDU＝1000個の宿主細胞核当りの寄生体数×器官重量（ｇ）を利用し、計算した（Bradley and Kirkley，1977，Clin.Ex.Immunol.，30，119-129）。データーの紹介及び統計学的分析平均パーセント寄生体抑制±標準誤差（SE）を示し、それは各実験値を特定の部位についての相対平均コントロールと比較することにより決定されたものである。寄生体負荷は log10変換データーに基づく Studentの不対合（unpaired）検定を利用して分析した（脾臓及び肝臓については LDU／器官、そして骨髄については寄生体数／1000個の宿主細胞核）。結果表４Ｌ．ドノバニ感染Balb／ｃマウスの寄生体負荷に対する種々のスチボグルコネート NIV製剤による処置の効果（平均％抑制±SEで表示）。動物を感染後７日目に以下のいづれか 0.2mlにより静脈内処置した：PBS(コントロール)、遊離薬剤溶液（2.25mgのSb^V／ml）又は NIV製剤。次いで７日後に寄生体数を測定した。小胞懸濁物（5500μmole）を50mgのSb^V／mlナトリウムスチボグルコネートで水和し、そして水で希釈して2.25mgのSb^V／ml遊離薬剤溶液／mlを含む 750μmole の懸濁物にした。構成成分（界面活性剤VIII：コレステロール：ジセチルホスフェート又は脂肪酸）のモル比をかっこ内に示す。小胞懸濁物をホモジナイゼーション法を利用して作った。表５Ｌ．ドノバニ感染Balb／ｃマウスの脾臓、肝臓及び骨髄寄生体負荷に対する界面活性剤VIIIナトリウムスチボグルコネート NIV懸濁物（調製品１，２又は３；３：４：１のモル比）又はスチボグルコネート溶液（3.75又は33.3mgのSb^V／ml ）による処置の効果。調製品１は6600μmoleの懸濁物であり、33.3mgのSb^V／ml の薬剤溶液により水和され、そして3.75mgのSb^V／mlの最終薬剤濃度（濃度 750μmole；薬剤用量／マウスは33.3mgのSb^V／kgに相当）となるように水で希釈してある。調製品２は33.3mgのSb^V／mlで水和した一定容量の 750μmoleのＶ／Ｄ懸濁物を遠心し、次いで薬剤装填小胞をそのもとの容量の2.31mgのSb^V／mlの遊離薬剤溶液（濃度 750μmole；薬剤用量／マウスは20.5mgのSb^V／kgに相当）の中に再懸濁することにより調製した。調製品３は33.3mgのSb^V／ml薬剤溶液（薬剤用量は 296mg のSb^V／kgに相当）で水和した 750μmoleのＶ／Ｄ懸濁物である。調製品４は PB Sで水和した 750μmoleのＶ／Ｄ懸濁物である（空の小胞懸濁物）。７日目に動物に200μｌの用量を１回与え、そして６日後に殺した。抑制をコントロール動物の平均負荷を基礎に計算した。抑制についての平均小胞直径は：調製品１：22 92±802nm；調製品２： 389±24nm；調製品３： 403±18nm。小胞懸濁物を小スケール法を利用して製造した。表６Ｌ．ドノバニ感染ハムスターの寄生体負荷に対するナトリウムスチボグルコネート製剤による処置の効果。ハムスターを感染後７日目（急性感染症）又は29日目（慢性感染症）にて 0.2mlのPBS(コントロール)、遊離薬剤（33. 3mgのSb^V／ml）又は界面活性剤VIIIスチボグルコネート NIV製剤（３：４：１のモル比； 750μmole；33.3mgのSb^V／ml薬剤溶液で水和）により静脈内処置した。動物を感染後７日目に殺した。コントロール値との対比^**ｐ＜0.01，^***ｐ＜0 .005。小胞懸濁物をホモジナイゼーション法を利用して調製した。表７Ｌ．ドノバニ感染Balb／ｃマウスの脾臓、肝臓及び骨髄寄生体負荷に対するパロモマイシン製剤による処置の効果。動物に 200μｌの用量のPBS(コントロール )もしくはパロモマイシン溶液(7.9mg／ml)、又は50μｌ用量の界面活性剤Ｘパロモマイシン NIV懸濁物（５：４：２のモル比、750mol）を感染後７日目に１回与え、そしてその６日後に殺した。NIV製剤は3750μmoleの懸濁物を39.5mg／mlのパロモマイシンにより水和することにより調製し、そして使用前に水で１：５に希釈した。小胞懸濁物は小スケール法を利用して作り、そしてマウスに付与した薬剤用量はかっこ内でmg／kgで示す。請求の範囲１．ｉ）水性ビヒクル； ii）前記水性ビヒクル中に懸濁された非イオン界面活性剤、ステロール及び帯電物質を含んで成る小胞；並びに iii）前記小胞及び前記水性ビヒクルの双方内に位置する薬理活性剤；を含んで成る製剤。２．前記非イオン界面活性剤がモノ−、ジ−、トリ−又はポリ（10まで）グリセロールモノー又はジ−脂肪酸エステル及びポリオキシエチレンエーテルより選ばれる、請求項１記載の製剤。３．前記非イオン界面活性剤がＣ₁₀〜Ｃ₂₀直鎖又は枝分れアルキル鎖をもつ１〜10個のオキシエチレン成分を含んで成るポリオキシエチレンエーテルである、請求項１又は２記載の製剤。４．前記小胞の直径が 100nm〜2500nmの範囲に属する、先の請求項のいづれか１項記載の製剤。５．前記小胞の直径が 100nm〜1000nmの範囲に属する、先の請求項のいづれか１項記載の製剤。６．前記小胞の直径が 200nm〜600nm の範囲に属する、先の請求項のいづれか１項記載の製剤。７．前記非イオン界面活性剤、ステロール及び帯電物質がそれぞれ３〜５：１〜４：０〜４のモル比で存在している、先の請求項のいづれか１項記載の製剤。８．前記非イオン界面活性剤、ステロール及び帯電物質がそれぞれ３〜５：２〜４：０〜３のモル比で存在している、請求項７記載の製剤。９．前記ステロールがコレステロールであり、そして前記帯電物質がジセチルホスフェートである、請求項７記載の製剤。 10．前記帯電物質が脂肪酸である、請求項７又は８記載の製剤。 11．前記脂肪酸がステアリン酸及びパルミチン酸より選ばれる、請求項10記載の製剤。 12．前記薬理活性剤がナトリウムスチボグルコネート、メグルミンアンチモネート、ペンタミジン及び抗生物質、特にアミノグリコシド類から選ばれる、先の請求項のいづれか１項記載の製剤。 13．前記アミノグリコシド類がパロモマイシン及びアンホテリシンＢより選ばれる、請求項12記載の製剤。 14．前記小胞相中の活性成分の濃度が0.01〜10重量％である、請求項１〜13のいづれか１項記載の製剤。 15．病気の処置のための医薬品の製造における先の請求項のいづれか１項記載の製剤の利用。 16．内臓リーシュマニア症の処置のための医薬品の製造における先の請求項のいづれか１項記載の製剤の利用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ウィリアムズ，デニスマーガレットイギリス国，アードロサンケーエー22 ７イービー，ミルグレンロード 13

Claims

【特許請求の範囲】１．ｉ）水性ビヒクル； ii）前記水性ビヒクル中に懸濁された小胞；並びに iii）前記小胞及び前記水性ビヒクルの双方内に位置する薬理活性剤；を含んで成る製剤。２．前記小胞が非イオン界面活性剤、ステロール及び帯電物質を含んで成る、請求項１記載の薬剤。３．前記非イオン界面活性剤がモノ−、ジ−、トリ−又はポリ（10まで）グリセロールモノ−又はジ−脂肪酸エステル及びポリオキシエチレンエーテルより選ばれる、請求項１又は２記載の製剤。４．前記非イオン界面活性剤がＣ₁₀〜Ｃ₂₀直鎖又は枝分れアルキル鎖をもつ１〜10個のオキシエチレン成分を含んで成るポリオキシエチレンエーテルである、先の請求項のいづれか１項記載の製剤。５．前記小胞の直径が 100nm〜2500nmの範囲に属する、先の請求項のいづれか１項記載の製剤。６．前記小胞の直径が 100nm〜1000nmの範囲に属する、先の請求項のいづれか１項記載の製剤。７．前記小胞の直径が 200nm〜600nm の範囲に属する、先の請求項のいづれか１項記載の製剤。８．前記非イオン界面活性剤、ステロール及び帯電物質がそれぞれ３〜５：１〜４：０〜４のモル比で存在している、先の請求項のいづれか１項記載の製剤。９．前記非イオン界面活性剤、ステロール及び帯電物質がそれぞれ３〜５：２〜４：０〜３のモル比で存在している、請求項８記載の製剤。 10．前記ステロールがコレステロールであり、そして前記帯電物質がジセチルホスフェートである、請求項８記載の製剤。 11．前記帯電物質が脂肪酸である、請求項８又は９記載の製剤。 12．前記脂肪酸がステアリン酸及びパルミチン酸より選ばれる、請求項11記載の製剤。 13．前記薬理活性剤がナトリウムスチボグルコネート、メグルミンアンチモネート、ペンタミジン及び抗生物質、特にアミノグリコシド類から選ばれる、先の請求項のいづれか１項記載の製剤。 14．前記アミノグリコシド類がパロモマイシン及びアンホテリシンＢより選ばれる、請求項13記載の製剤。 15．前記小胞相中の活性成分の濃度が0.01〜10重量％である、請求項１〜14のいづれか１項記載の製剤。 16．病気の処置のための医薬品の製造における先の請求項のいづれか１項記載の製剤の利用。 17．内臓リーシュマニア症の処置のための医薬品の製造における先の請求項のいづれか１項記載の製剤の利用。