JPH10500776A - 網状赤血球の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 血液サンプルにおける網状赤血球集団を測定するための方法であって、該方法か網状赤血球を染色するためのコリホスフィンＯの使用を含み、前記方法がフローサイトメトリー技術による検出に特に適していることを特徴とする方法。この方法において有用なフローサイトメーターの光学系（10）は、フローセル（14）を通して流れる血液サンプルを照射する光源としてのアルゴンイオンレーザー（12）を含む。散乱光及び蛍光は直角散乱光（24）を反射して蛍光（26）を通過する二色性ミラー（22）に達する。二色性ミラーは、緑色蛍光（32）を反射して赤色蛍光（38）を透過する。

Description

【発明の詳細な説明】 網状赤血球の検出 技術分野 本発明は、血液サンプル中の網状赤血球の検出及び計数に関する。更に詳しく は、本発明は、リボ核酸(RNA)及びリボ核酸ポリマーを染色するのに適した染料 に関し、蛍光フローサイトメトリー技術により網状赤血球の検出するのに特に適 する。 従来技術 網状赤血球は、その核が失われている未熟な赤血球(RBC)である。網状赤血球 は、RNAを含むことが知られており、血液サンプル中における網状赤血球の検出 及び計数は、臨床医に価値あるものである。血液サンプルの網状赤血球数は、急 性出血、溶血性貧血、及び骨髄移植における赤血球生成活性、診断及び予後値の 指示体として、並びに鉄、ビタミンＢ₁₂及び葉酸療法に対する応答の尺度として 用いられている。当該技術において知られているように、網状赤血球は成熟赤血 球への前駆体であり、従って、網状赤血球という言葉は、それにより成熟細胞が 形成されるその細胞の進化及び発達を含む。 過去において、血液サンプル中の網状赤血球は、ニューメチレンブルー(NMB) 、ブリリアントクレシルブルー(BCB)、アクリジンオレンジ、及びピロニンＹ、 及びチアゾールオレンジのような適切な染色剤を用いることにより手動及び自動 的な方法の両方により測定されてきた。 染料ニューメチレンブルーでの生体染色は、網状赤血球測定のた めの標準方法であると考えられ、使用において、この染料はRNAを沈殿させる。 この方法は手で行うものであり、顕微鏡で大量(例えば500〜1,000)の細胞を計数 することを必要とし、遅く、単調で退屈で、統計誤差がある。ニューメチレンブ ルーは、非蛍光性であり、本当に沈殿したRNAは、沈殿した染色剤から区別する ことがしばしば困難である。 アクリジンオレンジは、手動及び自動的な手順により網状赤血球を染色するの にいくらか用いられている。アクリジンオレンジはRNAを沈殿させる；これは潜 在的なクエンチングのためRNA成分の量的見積もりを妨げる。更に、アクリジン オレンジは、染色された細胞の蛍光分布を拡散に導かない。（RNA成分が蛍光に 比例することを基礎にした）細胞の熟成プロファイルは信頼できない。アクリジ ンオレンジはフローサイトメーターにおけるプラスチック管材に対して大きなア フィニティーを有し、これはバックグラウンドを増加させ、及びフローサイトメ ーター管材から染料を除去するための手順を長びかせる。更に、アクリジンオレ ンジ染色された細胞は、自己蛍光性赤血球ピークから分離するのが困難であり、 網状赤血球数は、ニューメチレンブルーで得られたものより通常低い。 ピロニンＹの使用は、先のホルマリンでの赤血球の固定を必要とする；これは 扱いにくく、時間を浪費し、一般的にほとんど結果を出さない。更に、ピロニン Ｙは極めて低い量子効率であるので、極めて低い蛍光シグナルを導く。 網状赤血球を検出するためのチアゾールオレンジを用いる例は、現在放棄され ている1985年11月１日に出願された出願通し番号793,813号の一部継続出願であ る1989年11月28日に発行された米国特許第4,883,867号において見い出され得る 。 網状赤血球を検出するためのチオフラビンを用いる例は、1986年 ２月18日に発行された米国特許第4,571,388号において見い出され得る。 Shapiro，Howard M.，Practical Flow Cytometry，p．144，Alan R．Liss，In c，1985の表７−３はDNA及び／又はRNAを染色するために用いられるトリサイク リックヘテロ環式化合物をリストする。表７−３はコリホスフィンＯ(CPO)をリ ストするか、それは網状赤血球又はRNA染色としてのCPOを含まない。 発明の開示 本発明は、全体の血液における網状赤血球の定量的測定のための染料及び該染 料を組み込む試薬を提供する。 本発明は、染料がコリホスフィン(coriphosphine)Ｏであることを特徴とする 網状赤血球の定量的測定のための方法を提供する。 本発明は、サンプルをコリホスフィンＯを染色し；励起波長の光で前記サンプ ルを励起させ；そして前記サンプルから発する蛍光を測定することを含む網状赤 血球を検出する方法を更に提供する。 前記サンプルを励起させ、フローサイトメーターの手段により蛍光を測定する ことを特徴とする網状赤血球を検出する方法も提供する。 本発明は、血小板、核形成された赤血球及びハウエルージョリー体によりほと んどじゃまされない細胞を区別的に染色する方法を更に提供する。 本発明は、細胞を染色する方法であって、該方法が他の周知の方法により製造 された複合体により安定であるRNA−染料複合体を製造し、これにより該RNA−染 色体複合体により発せられる全部の色を見ることができる間の時間の増加を引き おこす方法を提供する。 図面の簡単な説明 図１は、本発明の方法を行うのに用いられ得るフローサイトメーターの光学系 の概略図を示す。 図２は、通常のドナーからのフローサイトメトリーヒストグラムの例を示す。 図３は、異常な（高い）患者からのフローサイトメトリーヒストグラムの例を 示す。 図４は、RNA及びコリホスフィンＯ試薬の投与／応答曲線を示す。 図５は、チアゾールオレンジ法に対する本発明のCPO法の相互関係を示す。 図６は、CPOの安定性を示す。 図７は、赤血球及び血小板の分析結果を与える。 図８は、赤血球及び白血球の分析結果を与える。 発明の実施の形態 便利のため、網状赤血球を染色するための本発明の染料は、ベイシック・イエ ローセブンとしても知られるオリホスフィンＯ(CPO）として言及される。コリホ スフィンＯは、Pfaltz & Bauer，Inc．Division of Aceto Corporation，Waterb ury，Connecticutから利用できる。 出願人は、コリホスフィンＯが網状赤血球を染色するための有効な染料である ことを見い出した。網状赤血球染料の機能は、フローサイトメーターにおける光 散乱計数のために網状赤血球を更に示すことである。これにより、染料剤として コリホスフィンを用いることにより、全体の血液サンプルにおける網状赤血球を 検出して計数することが可能である。コリホスフィンＯは、網状赤血球の細胞内 リボ核酸を沈殿させないフルオロクロム染料である。 コリホスフィンＯの使用は、細胞を区別的に染色する利点を供し、血小板、核 形成した赤血球及びハウエル−ジョリー体により少い妨害の原因となる。コリホ スフィンＯは、RNA−染料複合体の安定性を増加させ、これにより前記RNA−染料 複合体により発せられる全ての色を見ることができる間の時間を増加させる更な る利点を供する。これにより、発せられた色は、当該技術において用いられる染 料より極めて長い期間安定である。例えば、チアゾールオレンジの使用により発 せられる色は、約３時間、安定であるが、コリホスフィンＯの使用により発せら れた色は約８〜24時間、安定である。 本発明に従うと、血液サンプル中の網状赤血球を染色する場合、コリホスフィ ンＯは、水溶液として、好ましくは等張塩類溶液中で ulter Corporation，Miami，Florida)中で、約0.8〜80mg/Ｌ、好ましくは１〜40 、最も好ましくは５〜10mg／Ｌにおいて好ましくは用いられ、これらの溶液は少 量のメタノールを含み得る。全体の血液又は血液フラクションであり得る血液サ ンプルは、血液サンプルをコリホスフィンＯの溶液と混合することによりコリホ スフィンＯで染色される。用いられる血液サンプル及び溶液の量は、RBCの濃度 が装置を通過するのに十分であるような量である。これにより、濃度は、１：50 〜１：5000、好ましくは１：100〜１：1000、最も好ましくは１：200〜１：800 の範囲である。その後サンプルは最小約60秒から約８時間まで、好ましくは30分 間インキュベートされ、その後フローサイトメーターに流される。出願人は、CP Oが生体染色剤であり、従って固定化が必要でないことを見い出した。 コリホスフィンＯは、リボ核酸(RNA)と結合していない場合、ほとんど又は全 く赤色蛍光を示さず、約491.5nmにおいて強い吸収ピ ークを示す。コリホスフィンＯが網状赤血球中のRNAに結合した場合、その光学 的特性は劇的に変化する。特に、網状赤血球中のRNAに結合した場合のコリホス フィンＯは強い赤色蛍光を示す。最大励起は約491.5nmで最大発光は約630〜700n mであり、約160nmのストークスシフトを与える。結合したコリホスフィンＯの励 起ピークが約490nmのオーダーである結果として、光源は約485nmにおいてエネル ギーラインを有する水銀ランプ又は約488nmにおいて強い発光を有するアルゴン イオンレーザーであり得る。励起は他の波長においても行われ得るが、コリホス フィンＯで染色された網状赤血球は、約450nm〜約500nmの波長において好ましく は励起される。 白血球中のデオキシリボ核酸(DNA)に結合していない場合のコリホスフィンＯ は、ほとんど又は全く緑色蛍光を与えないが、白血球中のDNAに結合した場合の コリホスフィンＯは、強い緑色蛍光を示す。核酸に結合していない場合のコリホ スフィンＯ染料の蛍光の欠如は低いバックグラウンドを与え、作業者が自動フロ ーサイトメーターのための蛍光しきい値を選択する（又は“ゲートする”）こと を許容する。 RNAに結合した場合のCPOは赤色蛍光を発し、DNAに結合したCPOは緑色蛍光を発 するので、CPOの使用は細胞を区別的に染色して血小板、核形成されている赤血 球、白血球、及びハウエル−ジョリー体によりほとんどじゃまされない利点を供 する。これは赤血球をゲートイン(gate-in)し、これによりより正確な数を得る ことを可能にする。 更に、CPOが結合した場合、緑色蛍光の量又は強度は“他の”構造へのCPOの結 合のためのバックグラウンド又は非特異的染色の量に比例する。これらの細胞の 構造又は要素は、DNA並びにリソソーム、エンドソーム、及び顆粒のような副次 細胞的ベシクルを含む。 これらの要素の各々は、区別的にCPOに結合し、これにより異なる量の蛍光を生 ずる。しかしながら、唯一一本鎖RNAはCPOと結合して赤色のみの蛍光を発するで あろう。我々は、赤血球と網状赤血球の両方のための“しきい値”として成熟赤 血球集団の緑色蛍光の最大量を決定する。全ての他の細胞はこのしきい値を超え る緑色の蛍光を発するであろう。緑色蛍光の強度における差異は区別的に細胞を 染色して血小板及び白血球のような非特異的細胞をゲートアウト(gate-out)する ことを可能にする利点を供する。 コリホスフィンＯ染料はRNAで沈殿させないので、結果としてコリホスフィン Ｏで染色された網状赤血球は細胞内RNAの比較的均一な分散を維持し、これによ り個々の網状赤血球及びそのRNA成分のために測定された蛍光シグナル間のほぼ 直線的な関係がある。臨床的に、これはRNA成分が網状赤血球熟成の関数である という網状赤血球数を超える付加的な情報を医師に提供する。従って、コリホス フィンＯを用いることにより、臨床医は網状赤血球熟成プロファイル及び単純な 網状赤血球数を得ることができる。 血液サンプル中の網状赤血球を染色するためのコリホスフィンＯの使用におい て、染色された網状赤血球からの蛍光シグナルは、成熟網状赤血球のものから十 分に分離されるので、これにより結果は、大量のデータ操作を行うことなく自動 フローサイトメーターにおいて直接読みとることができる。 CPOで染色された網状赤血球、RNA又はDNAは、自動フローサイトメーターにお いて好ましくは計数されるが、手動操作又は自動顕微鏡によっても計数すること ができる。 フローサイトメーターの基本的概念は、特定の検知領域を通しての一度に１つ の細胞の本質的な通過である。流体力学焦点化法の手段により、単一の細胞が焦 点レーザー光源並びに散乱した蛍光の測 定のための検出システムからなる検知ゾーンを通過する。 自動フローサイトメーターは当該技術において公知であり、本発明は、いずれ の特定のフローサイトメーターの使用にも限定されない。 本発明に用いられるフローサイトメーターの光学系の特定の例は、図１の参照 と共に以下に記載される。図１に示される光学は、直角散乱光、赤色蛍光及び緑 色蛍光を測定するためにデザインされたフローサイトメーターにおいて用いられ る。10により示される光学系は光源としてアルゴンイオンレーザー12を用い、48 8nmの波長において作動し、15mWの出力を発生する。レーザー12から発せられた 光は、円筒状レンズ16により集光され、慣用的な手段においてフローセル14を通 して流れる血液サンプルを照射する。 サンプル中の染色された赤血球がレーザー光により照射される時、それらは散 乱した光及び蛍光を発する。直角散乱した光及び蛍光は、コンデンサーレンズ18 で集光され、窓20を通過して二色性ミラー22に達する。二色性ミラー22から反射 された直角散乱光24は、光電子増倍管又はオートダイオード28において検出され る。二色性ミラー22を通過した蛍光26において、緑色蛍光32は二色性ミラー30に より反射し、赤色蛍光38はこのミラーを透過する。反射した緑色蛍光32は有色フ ィルター34を通過して光電子増倍管36において検出される。透過した赤色蛍光38 は有色フィルター40を通過して光電子増倍管42において検出される。 これにより、例えば、コリホスフィンＯで染色された網状赤血球は、コールタ ー社(Coulter Corporation，Miami，Florida)により 数され得る。このようなフローサイトメーターを用いることにおいて、蛍光のゲ ートはサンプル中の成熟赤血球の位置の使用によりセ ットされ、その後この蛍光ゲートは網状赤血球を計数するためにセットされる。 コリホスフィンＯで染色された網状赤血球の検出及び計数のための自動フロー サイトメーターの使用は、メチレンブルーもしくはアクリジンオレンジ、又はチ アゾールオレンジを用いる網状赤血球を計数するための周知である標準的な方法 により得られる結果と密接に関連する結果を与える。 自動フローサイトメーターにおけるコリホスフィンＯで染色された網状赤血球 の使用は、低い蛍光バックグラウンド及び蛍光ゲートが容易に選択され得ること により特に利点がある。更に、細胞内網状赤血球のRNAが沈殿しないので細胞が 固定化される必要がない。更に、網状赤血球の熟成に関する情報を供する個々の 網状赤血球のための蛍光シグナル間に直線的な関係がある。 コリホスフィンＯで染色された網状赤血球は、好ましくは自動フローサイトメ ーターにおいて計数されるが、手動手順又は自動顕微鏡によっても計数され得る 。 従って、本方法は、 （ａ）テストするべきサンプルを主題の誘導体染料組成物を含む主題の試薬組 成物に混合して細胞の懸濁液を形成するステップと、 （ｂ）２℃以上25℃以下の温度で１分以上24時間以下の時間、前記細胞の懸濁 液をインキュベートするステップと、 （ｃ）フローサイトメーターにおいて前記細胞の誘導された蛍光を測定するス テップと、 （ｄ）赤色蛍光対緑色蛍光のゲートされた光の散乱（LFS vs SS）の相関デー タヒストグラムを作るステップと、 （ｅ）前記網状赤血球集団の蛍光しきい値を選択するステップと、 （ｆ）COULTER STKS(Coulter Corporation，Miami，Florida)のようなヘマト グラフィーアナライザから網状赤血球Ｘ全RBC(10億／mLにおける全RBC)の割合と して全網状赤血球を計算するステップと、 を含む。 以下の非限定的実施例は本発明の種々の特徴を詳しく示す。染色の以下の実施 例は、図４〜８に示される結果を得るのに利用されている。 実施例１ 試料をトリホスフェートEDTA（K3EDTA）内に収集した。0.002mLの患者全血液 試料を1.0mLの試薬に加えた。このサンプルを混合して最少15分間から８時間以 下で室温でインキュベートした。その後この試料を測定用XLフローサイトメータ ーで分析する直前に再び混合した。 図２〜４は、CPOを用いる通常及び異常な血液の網状赤血球の分析についての データを示す。特に図２は、525nm光電子増倍管により、及び630nm光電子増倍管 により検出された赤血球の事象の分布を示す通常のヒトの血液の蛍光ヒストグラ ムを示す。図２に示されるように、領域Ｅは白血球及び血小板から分離した網状 赤血球を線引きする。 図３は、525nm光電子増倍管により、及び630nm光電子増倍管により検出された 赤血球の事象の分布を示す異常な血液の蛍光ヒストグラムを示す。図３に示され るように、網状赤血球領域（領域Ｅ）において増加した数の事象がある。図３に 示すように、CPOはRNAと特異的に反応して、サンプル中のRNAの量の増加は蛍光 の増加を引きおこす。 図４は、増加する量のリボ核酸(RNA)と混合した時に試薬に対す る投与応答のグラフを示す。より多くのRNAが加えられると、蛍光強度が増加し ていく。 図５は、トリアゾールオレンジ法（標準法）に対する本発明のCPO法の相関関 係を示す。図５に示すように、この結果は、CPOについて標準法と同じである。 これにより、CPOは網状赤血球の尺度である。 図６は、時間対網状赤血球の関数としてCPOの安定性を示す。図６は、試薬に 血液を混合した後、約15分で平衡に達することを示す。いったん平衡に達すると 、CPO−RNA複合体は少くとも８時間安定である。他方、トリアゾールオレンジ、 アクリジンオレンジ及びチオフラビンＴは２時間未満の安定性を有する。 図７は、赤血球及び血小板の分析結果を示す。増加した量の血小板を有するサ ンプルを用いた。赤血球及び血小板の分析は、血小板分布が網状赤血球から異な ることを示す。 図８は、赤血球及び白血球の分析結果を示す。増加した量の白血球を有するサ ンプルを用いた。赤血球及び白血球の分析は、白血球分布が赤血球及び網状赤血 球から異なることを示す。 本発明の多くの改良及びバリエーションが先の技術の範囲内において可能であ り、それゆえ本発明は特に記載されたものと別な方法で実施し得る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．サンプルにおける網状赤血球を検出するための方法であって、網状赤血球 が、コリホスフィンＯで染色し；前記サンプルを励起波長の光で励起させ；そし て前記サンプルから発せられる蛍光を測定することにより検出されることを特徴 とする方法。 ２．フローサイトメーターの手段により前記サンプルが励起され、蛍光が測定 されることを更に特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．蛍光顕微鏡の手段により前記サンプルが励起され、蛍光が測定されること を更に特徴とする請求項１に記載の方法。 ４．前記サンプルが、水銀アークランプからの光でフローサイトメーターにお いて励起されることを更に特徴とする請求項１に記載の方法。 ５．前記サンプルが、アルゴンレーザーからの光でフローサイトメーターにお いて励起されることを更に特徴とする請求項１に記載の方法。 ６．前記網状赤血球が全体の血液を含むサンプルにおいて存在することを更に 特徴とする請求項１に記載の方法。 ７．前記網状赤血球がその固定化なしに検出されることを更に特徴とする請求 項１に記載の方法。 ８．前記細胞が区別的に染色されることを更に特徴とする請求項１に記載の方 法。 ９．定量のための全体の血液サンプルにおける網状赤血球を染色するための試 薬であって、試薬が、コリホスフィンＯの水溶液及び緩衝系を含むことを特徴と する試薬。 10．前記緩衝系が6.0〜8.0のpHを有することを特徴とする請求項９に記載の試 薬。 11．安定したRNA−染料複合体を形成する方法であって、テストされるべき血 液のサンプルをコリホスフィンＯの水溶液を含む試薬と混合し、その誘導体が網 状赤血球により効果的に取り込まれるように十分な時間、その懸濁液を反応させ ることを特徴とする方法。 12．前記RNA−染料複合体が約８〜24時間安定であることを更に特徴とする請 求項11に記載の方法。 13．フローサイトメーターにより全体の血液サンプルにおける網状赤血球を定 量するための方法であって、 （ａ）テストされるべき血液のサンプルをコリホスフィンＯの水溶液を含む試 薬と混合するステップと、 （ｂ）その誘導体が前記網状赤血球により効果的に取り込まれるように十分な 時間、その懸濁液を反応させるステップと、 （ｃ）前記懸濁液をフローサイトメーターに通すステップと、 （ｄ）光散乱に基づいてゲートされた赤血球集団の緑色蛍光に対する赤色蛍光 の強度を測定するステップと、 （ｅ）前記測定からサンプルにおける網状赤血球の量又は割合を決定するステ ップと、 を特徴とする方法。