JPH1036859A - 微生物による高温脱硫 - Google Patents

微生物による高温脱硫

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JPH1036859A JP8200696A JP20069696A JPH1036859A JP H1036859 A JPH1036859 A JP H1036859A JP 8200696 A JP8200696 A JP 8200696A JP 20069696 A JP20069696 A JP 20069696A JP H1036859 A JPH1036859 A JP H1036859A
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仁 小西
Yoshitaka Ishii
義孝 石井
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弘一 奥村
Masanori Suzuki
正則 鈴木
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 パエニバシラス属に属し、有機イオウ化
合物分解能を有する微生物により有機イオウ化合物を分
解することを特徴とする有機イオウ化合物の分解方法。 【効果】 高温度条件下で複素環式有機イオウ化合物を
Ｃ−Ｓ結合特異的に分解することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ベンゾチオフェ
ン、ジベンゾチオフェンなどの有機イオウ化合物を微生
物を利用して分解する方法に関するものである。本発明
の方法は、特に、石油等の化石燃料中に含まれる有機イ
オウ化合物の分解に利用できるので、通常石油・石炭等
の化石燃料の燃焼により空気中に拡散し環境汚染源とな
るイオウを化石燃料中から除去することを容易にする。
【０００２】
【従来の技術】
（１）従来の水素化脱硫方法 石油のような炭化水素燃料からイオウを除去する脱硫方
法としては、アルカリ洗浄や溶剤脱硫などの方法も知ら
れているが、現在では水素化脱硫が主流となっている。
水素化脱硫は、石油留分中のイオウ化合物を触媒の存在
下で水素と反応させ、硫化水素として除去して製品の低
イオウ化を図る方法である。触媒としては、アルミナを
担体としたコバルト、モリブデン、ニッケル、タングス
テン、などの金属触媒が使用される。モリブデン担持ア
ルミナ触媒の場合には、触媒性能を向上させるために、
通常コバルトやニッケルが助触媒として加えられる。金
属触媒を用いた水素化脱硫は、現在世界中で広く使用さ
れているきわめて完成度の高いプロセスであることは疑
いのないことである。しかし、より厳しい環境規制に対
応した石油製品を作るためのプロセスという観点から
は、いくつかの問題点がある。以下にその例を簡単に記
載する。
【０００３】金属触媒は、一般にその基質特異性が低
く、このため多様な種類のイオウ化合物を分解し、化石
燃料全体のイオウ含量を低下させる目的には適している
が、特定のグループのイオウ化合物に対してはその脱硫
効果が不十分となることがあると考えられる。たとえ
ば、脱硫後の軽油中にはなおも種々の複素環式有機イオ
ウ化合物が残存している。このように金属触媒による脱
硫効果が不十分となる原因の一つは、これらの有機イオ
ウ化合物中のイオウ原子の周囲に存在する置換基による
立体障害が考えられる。これらの置換基のうち、メチル
置換基の存在が水素化脱硫における金属触媒の反応性に
及ぼす影響は、チオフェン、ベンゾチオフェン、ジベン
ゾチオフェンなどについて検討されている。それらの結
果によると、一般的には置換基の数が増すほど脱硫反応
性は減少するが、置換基の位置が反応性に及ぼす影響も
きわめて大きいことが明らかである。メチルジベンゾチ
オフェン類の脱硫反応性を比較し、置換基による立体障
害が金属触媒の反応性に及ぼす影響が非常に大きいこと
を示した報告は、たとえば、Houalla, M., Broderick,
D.H., Sapre, A.V., Nag, N.K., de Beer, V.H.J., Gat
es, B.C., Kwart, H.J.Catalt., 61. 523-527 (1980)
に見られる。実際、これらのジベンゾチオフェンの種々
のアルキル化誘導体が軽油中にかなりの量存在すること
が知られている（たとえば、Kabe, T., Ishihara, A. a
nd Tajima, H. Ind. Eng. Chem. Res., 31, 1577-1580
(1992)) 。
【０００４】上記のように水素化脱硫に抵抗性を示す有
機イオウ化合物を脱硫するためには、現在用いられてい
るよりも高い反応温度や圧力が必要とされ、また、添加
する水素の量も非常に増大すると考えられている。この
ような水素化脱硫プロセスの改良は、ばく大な設備投資
と運転コストを必要とすることが予想される。このよう
な水素化脱硫に抵抗性を示す有機イオウ化合物を主たる
イオウ化合物種として含むものとしては、たとえば、軽
油があり、軽油のより高度な脱硫（超深度脱硫）を行う
場合には上記のような水素化脱硫プロセスの大幅な改良
が要求される。
【０００５】一方、生物が行う酵素反応は比較的穏和な
条件下で進行し、しかも酵素反応の速度自体は、化学触
媒を用いた反応の速度と遜色ないという特徴を有してい
る。さらに、生体内で起こる多種多様の生物反応に適切
に対応する必要があるため、非常に多くの種類の酵素が
存在し、それらの酵素は一般的に非常に高い基質特異性
を示すことが知られている。このような特徴は、微生物
を用いて化石燃料中に含まれるイオウ化合物中のイオウ
の除去を行ういわゆるバイオ脱硫反応においても生かさ
れるものと期待されている（Monticello, D.J., Hydroc
arbon Processing 39-45 (1994))。
【０００６】従来のバイオ脱硫方法：細菌を用いて石油
からイオウを除去する方法については、多数の報告があ
る。Joachim らは、Pseudomonas HECC39株を用いて30℃
で粘度の高い重油画分を連続的な処理を行うことによ
り、２日で60−80％の脱硫率を観察している(Bauch,
J., Herbert. G., Hieke, W., Eckart, V., Koehler,
M., Babenzin, H.D., Chemical Abstracts 82530y vol.
83(1975))。Yudaは、Pseudomonas haconensisを石油と
接触させ、水溶性の化合物へと変換させることを報告し
ている（Yuda, S., 日本特許公開番号75,107,002：Chem
ical Abstracts 46982j vol.84(1976)) 。また、Lee ら
は、イオウ酸化細菌株のThiobacillus thiooxidansとイ
オウ還元細菌株Pseudomonas sp. による原油、重質軽
油、ケロシン、ナフサの脱硫を報告している（Lee, M.
J., Hah, Y.C., Lee, K.W. Chemical Abstracts 145448
s vol.85 (1976)) 。彼らは、種々のイオウ酸化細菌お
よびイオウ還元細菌の脱硫能を調べ、Thiobacillus thi
ooxidans が最も効果的なイオウ酸化能を有し、Pseudom
onasputrefaciensとDesulfovibrio desulfuricans が最
も効果的なイオウ還元能を有しているとしている（Lee,
M.J., Hah, Y.C., Lee. K.W. Chemical Abstracts 156
414d vol.85(1976))。イオウ還元性のPseudomonas 株７
種の分離も同じグループにより報告されている。また、
Eckartらは、Romashkino原油や燃料油のPseudomonas de
smolyticumによる酸化的脱硫を報告している(Eckart,
V., Hieke, W.,Bauch, J., Gentzsch, H. Chemical Abs
tracts 142230q vol.94(1981); Eckart,V., Hieke, W.,
Bauch, J., Gentzsch, H. Chemical Abstracts 147259
c vol.97(1982))。Pseudomonas 属細菌により行われる
これらの脱硫反応に関しては、その分解産物が同定され
ており、脱硫反応機構が明らかにされた微生物では、す
べて油中のイオウ化合物分子中のＣ−Ｃ結合を切断する
反応を利用していることが分かっている。
【０００７】（Ａ）Ｃ−Ｃ結合攻撃型バイオ脱硫 微生物による脱硫の系統的な研究は、Yamadaらにより始
められた(Yamada, K.,Minoda, Y., Kodama, K., Nakata
ni, S., Akasaki, T., Agric. Biol. Chem.,32, 840-84
5(1968))。彼らは、Pseudomonas 属の細菌がジベンゾチ
オフェンを分解して水溶性の産物を与えることを報告し
ている。用いたPseudomonas 菌株には、Pseudomonas ab
ikonensis やPseudomonas jianiiなどが含まれる。この
二つの菌株の混合培養を用いた微生物脱硫の検討が、Na
kataniらにより行われている(Nakatani, S., Skasaki,
T., Kodama, K., Minoda, Y., Yamada, K., Agric. Bio
l. Chem. 32, 1205-1211(1968)) 。この研究では、５％
濃度のジベンゾチオフェンの軽油溶液が基質として使わ
れている。Kodamaらは、ジベンゾチオフェンの酸化や細
菌の増殖には、アミノ酸または他の炭素化合物が補助基
質cosubstrate として必須であると報告している。これ
らの脱硫活性を有する細菌は、ジベンゾチオフェンで代
表される複素環式イオウ化合物中のＣ−Ｃ結合の切断を
行い、ベンゼン環を分解し、その後の酸化反応カスケー
ドにより、硫酸塩を放出するというタイプの代謝を行う
ものであった。これらの炭素骨格攻撃型経路の反応機構
は芳香環の水酸化（ジベンゾチオフェン→→1,２−ジヒ
ドロキシジベンゾチオフェン）、環の解裂、水溶性産物
への酸化（1,２−ジヒドロキシジベンゾチオフェン→→
トランス−４［２−（３−ヒドロキシ）チアンナフテニ
ル］−２−オキソ−ブテノイン酸、３−ヒドロキシ−２
−ホルミルベンゾチオフェン）といったものであり、Ko
dama経路と呼ばれている。このタイプの反応は、Pseudo
monas 属でよく知られているが、この種の菌によるジベ
ンゾチオフェン分解反応はナフタレン分解に関与するの
と同じ酵素群によっで触媒されることが確認されている
(Eaton,R.W. and Chapman, P.J., J.Bacteriol., 174,
7542-7554, 1992; Denome, S.A., Stanley, D.C., Olso
n, E.S. and Young, K.D., J.Bacteriol., 175, 6890-6
901, 1993) 。これらの微生物の研究によって、それら
が原油のペンタン可溶性画分からジベンゾチオフェンや
置換ジベンゾチオフェンを除去する能力が証明された。
それらの株の一つ、Pseudomonas alcaligenes (DBT-2)
については、ジベンゾチオフェンの酸化に関与する25kb
のＤＮＡが単離され、多コピー発現ベクターにクローン
化されている（Finnerty, W.R. and Robinson, M., Bio
technol, Bioengieer. Symp. #16, 205-221(1986) 。こ
れらの場合、ジベンゾチオフェンのベンゼン環中のＣ−
Ｃ結合が攻撃を受け、油から抽出可能な種々の水溶性物
質を生じる。しかし、この反応により、油中の他の芳香
族分子が攻撃を受け、その結果かなりの量の炭化水素が
液相に移動することになる(Hartdegen. F.J., Coburn,
J.M. and Roberts, R.L., Chem. Eng. Progress, 80, 6
3-67(1984))。このようなことは石油の総熱量単位の低
下を招くことになり、工業的には受け入れられない反応
である。また、このタイプのジベンゾチオフェン酸化分
解菌は、児玉らが報告しているように酸化産物として水
溶性のチオフェン化合物（主として３−ヒドロキシ−２
−ホルミルベンゾチオフェン）を与えるが、これは液相
から除去するのが困難な物質でもある。
【０００８】上記のほかにも、以下のようないくつかの
微生物が上記と同様に炭素骨格を攻撃し、有機イオウヘ
テロ環の部分的酸化を触媒し、水溶性の産物に変換する
ことが知られている。Pseudomonas sp., Pseudomonas a
eruginosa, Beijerinckia sp. Pseudomonas alcaligene
s, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas putida(以上部
分酸化）、Brevibacterium sp.（鉱化作用＝鉱物生
成）。これらの酵素反応の遺伝的決定要素は一般にはプ
ラスミドであると考えられており、芳香族炭化水素の酸
化に特有のバイオ変換を代表するものである（Monticel
lo, D.J., Bakker,D., Finnerty, W.R. Appl. Environ,
Microbiol., 49, 756-760(1985))。これらの微生物系
は、酵素反応がイオウ攻撃型でなく、したがって、原油
中の高分子量画分から有機イオウを除去する際に機能的
ではないので、イオウ含量の高い化石燃料のバイオプロ
セシングにおいてはその実用性が限定されている。その
理由は以下の３点である。１）ジベンゾチオフェンの炭
素環の攻撃は、しばしばアルキル置換基やアリル置換基
を持つジベンゾチオフェンの２位及び３位の位置で起こ
る。これらの位置で置換されたジベンゾチオフェンはKo
dama経路の基質とはならない。２）炭素骨格破壊経路は
燃料のエネルギー含量を低下させる。３）炭素骨格破壊
経路の主要な産物は３−ヒドロキシ−２−ホルミルベン
ゾチオフェンであり、分解されて最終的に硫酸塩を生成
するのは非常に少量のジベンゾチオフェンでしかないの
で、十分な脱硫は起こらないことになる。
【０００９】（Ｂ）Ｃ−Ｓ結合攻撃型バイオ脱硫 原油や石炭のみならずイオウを含んだモデル化合物を分
解し、ヘテロ原子であるイオウを選択的に除去して、硫
酸塩や水酸化化合物を産生する微生物類が報告されてい
る。このタイプの反応は、その代謝産物の構造から考え
て、イオウ化合物中のＣ−Ｓ結合を特異的に切断して、
その結果イオウを硫酸塩の形で遊離する反応であると考
えられる。Isbister. J.D. and Kobylinski, E.A. (Mic
robial desulfurization of coal. in Coal Science an
d Technology, Ser. 9, p.627(1985))は、好気性で従属
栄養性の非酸性土壌細菌 Pseudomonas CB1、Acinetobac
ter CB2 がチオフェンイオウを硫酸塩に変換することを
報告した。ベンチスケールの連続バイオリアクターを使
用した場合、lllinois #6 の石炭の有機イオウ含量がＣ
Ｂ１により47％減少した。ジベンゾチオフェンの脱硫に
おける中間体としてはジベンゾチオフェンススルホキシ
ド、ジベンゾチオフェンスルホン、2,2'−ジヒドロキシ
ビフェニルが同定されている。これとは別に、未同定の
土壌分離菌が４つの異なったタイプの石炭から硫酸塩と
して有機イオウ分の35−45％を除去することが報告され
ている（Finnerty, W.R. and Robinson, M., Biotechno
l.Bioengieer. Symp. #16, 205-221(1986)) 。また、Rh
odococcus rhodochrous 分離株ATCC53968 がジベンゾチ
オフェンをヒドロキシビフェニルと硫酸塩に変換するイ
オウ攻撃型経路を有することが示されているが、この菌
により原油や石炭中の有機イオウの含量が70％減少する
という(Kilbane, J.J. Resources, Conservationand Re
cycling, 3, 69-70(1990)) 。Corynebacterium sp. の
細菌についてもジベンゾチオフェン分解経路が記述され
ており、同じくジベンゾチオフェンを酸化してジベンゾ
チオフェンスルホキシド、ジベンゾチオフェンスルホン
を経て２−ヒドロキシビフェニルと硫酸塩を生成するも
のである（Ohmori, T., Monna, L.,Saiki, Y. and Koda
ma, T. Appl. Environ, Microbiol., 58, 911-915, 199
2)。この場合、２−ヒドロキシビフェニルはさらに硝酸
塩となって２つの異なったヒドロキシニトロビフェニル
を生じる。さらに最近は、Brevibacterium sp. DOによ
るジベンゾチオフェンの安息香酸や亜硝酸塩への酸化
（van Afferden. M.,Schacht, S., Klein, J. and Trup
er, H.G. Arch. Microbiol., 153, 324- 328,1990)やPs
eudomonas sp. OS1 によるベンジルメチルスルフィドの
ベンズアルデヒドへの酸化（van Afferden, M., Tappe,
D., Beyer, M., Truper, H.G. and klein, J. Fuel 7
2, 1635-1643, 1993)も報告されている。Arthrobacter
K3bはBrevibacteriumと類似の反応を行うことが報告さ
れており、ジベンゾチオフェンスルホンを基質として用
いた場合、亜硫酸塩と安息香酸が産生される(Dahiberg,
M.D.(1992) Third International Symposium on the B
iological Processing ofCoal, May 4-7, Clearwater B
each, FL, pp.1-10, Electric Power Research Institu
te, Palo Alto, CA.)。一方、イオウを含んだ芳香族複
素環化合物の硫化水素への変換を非水溶媒中で行う新規
な系も報告されている(Finnerty, W.R. Fuel72, 1631-1
634, 1993) 。未同定株FE-9は 100％ジメチルホルムア
ミド中で水素雰囲気下にジベンゾチオフェンをビフェニ
ルと硫化水素に、また空気存在下でヒドロキシビフェニ
ルと硫酸塩にそれぞれ変換する。また、この株は、同じ
溶媒中で水素雰囲気下でチアントレンをベンゼンと硫化
水素に、空気存在下でベンゼンと硫酸塩に変換すると報
告されている。これらの好気的ジベンゾチオフェン分解
細菌とは別に、嫌気性の硫酸還元菌がジベンゾチオフェ
ンをビフェニルと硫化水素に変換し、また、石油有機イ
オウを硫化水素にバイオ変換することも示されている
（Kim, H.Y., Kim, T.S. and Kim, B.H., Biotechnol.
Lett. 12, 757-760,1990a; Kim, T.S., Kim, H.Y. and
Kim, B.H. Biotechnol. Lett. 12, 761-764, 1990b)。
以上述べたＣ−Ｓ結合攻撃型バイオ脱硫菌をまとめると
表１のようになる。
【００１０】
【表１】
【００１１】（Ｃ）従来の高温バイオ脱硫方法 以上記載したバイオ脱硫はすべて、30℃近辺の温度条件
下で進行する微生物代謝反応を利用するものである。一
方、化学反応の速度は一般に温度に依存して増大するこ
とが知られている。また、石油精製プロセス中の脱硫工
程では、高温・高圧条件下で分別蒸留や脱硫反応が行わ
れる。従って、石油精製プロセス中にバイオ脱硫工程を
組み込むとすると、常温近くにまで石油留分を冷却する
ことなしに、より高い冷却途中の温度でバイオ脱硫反応
ができる方が望ましいと考えられる。高温バイオ脱硫に
関する報告には以下のようなものがある。
【００１２】微生物を用いて高温で脱硫反応を行わせる
試みのほとんどは、石炭脱硫において見ることができ
る。石炭中には種々のイオウ化合物が含まれている。主
要な無機イオウ化合物は黄鉄鉱であるが、有機イオウ化
合物に関しては多種多様なものが混在しており、多くが
チオール、スルフィド、ジスルフィド、チオフェン基を
含んでいることが知られている。用いられた微生物は、
Sulfolobus 属の細菌で、これらはすべて好熱性細菌で
ある。鉱物スルフィドからの金属のリーチング（Brierl
ey C.L. & Murr, L.E., Science 179, 448-490(1973))
や石炭からの黄鉄鉱のイオウ除去などに種々の異なった
Sulfolobus株を用いた例が報告されている(Kargi, F. &
Robinson, J.M., Biotechnol. Bioeng. 24, 2115-2121
(1982); Kargi, F. & Robinson, J.M., Appl. Environ.
Microbiol., 44, 878-883(1982);Kargi, F. & Gervon
i. T.D., Biotechnol. Letters 5, 33-38(1983); Karg
i, F.and Robonson, J.M., Biotechnol. Bioeng., 26,
687-690(1984); Kargi, F. &Robinson, J.M., Biotechn
ol. Bioeng. 27, 41-49(1985); Kargi, F., Biotechno
l. Lett., 9, 478-482(1987)) 。Kargi とRobinson(Kar
gi. F. and Robinson,J.M., Appl. Environ. Microbio
l., 44, 878-883(1982))によれば、米国のイエロースト
ーン国立公園の酸性温泉から分離されたSulfolobus aci
docaldarius のある株は、45−70℃で生育するが、至適
pH２で元素状イオウを酸化する。また、別の２種のSulf
olobus acidocaldarius 株による黄鉄鉱の酸化も報告さ
れている（Tobita, M., Yokozeki, M., Nishikawa, N.
& Kawakami. Y., Biosci. Biotech. Biochem. 58, 771-
772(1994))。
【００１３】化石燃料中に含まれる有機イオウ化合物の
うち、ジベンゾチオフェンおよびその置換誘導体類は通
常の石油精製プロセスにおいて水素化脱硫を受けにくい
ことが知られている。そのジベンゾチオフェンのSulfol
obus acidocaldarius による高温分解も報告されている
(Kargi, K. & Robinson, J.M., Biotechnol. Bioeng.2
6, 687-690(1984); Kargi, F., Biotechnol. Letters
9, 478-482(1987)) 。これらの報告によれば、チアント
レン、チオキサンテン、ジベンゾチオフェンなどのモデ
ル芳香族複素環イオウ化合物を高温でこの微生物と反応
させると、これらのイオウ化合物は酸化されて、分解し
た。S. acidocaldarius によるこれらの芳香族複素環イ
オウ化合物の酸化は、70℃で観察されており、反応産物
として硫酸イオンを生じる。しかし、この反応はイオウ
化合物の他には炭素源を含まない培地中での反応であ
り、イオウ化合物を炭素源としても利用している。すな
わちイオウ化合物中のＣ−Ｃ結合を分解していることは
明瞭である。さらに、このSulfolobus acidocaldarius
は酸性の培地でのみ増殖でき、ジベンゾチオフェンの酸
化分解反応は、きびしい酸性条件下（pH 2.5) での進行
を要求する。このようなきびしい条件は石油製品の劣化
を引き起こすと同時に脱硫に関わる工程に耐酸性材料を
必要とするためプロセス上望ましくないと考えられる。
Sulfolobus acidocaldarius は、独立栄養条件下で増殖
させると、必要なエネルギーを還元された鉄・イオウ化
合物から獲得し、炭素源として二酸化炭素を利用する。
また、Sulfolobus acidocaldarius は、従属栄養条件下
に増殖させると、炭素源およびエネルギー源として種々
の有機化合物を利用することができる。すなわち、化石
燃料が存在すると炭素源として資化されるものと考えら
れる。
【００１４】Finnertyらは、Pseudomonas stutzeri、Ps
eudomonas alcaligenes 、Pseudomonas putidaに属する
株がジベンゾチオフェン、ベンゾチオフェン、チオキサ
ンテン、チアントレンを分解して、水溶性の物質に変換
することを報告している（Finnerty, W.R., Shockiey,
K., Attaway, H. in Microbial Enhanced Oil Recover
y, Zajic, J.E. et al.(eds.) Penwell. Tulsa, Okla.,
83-91(1983) 。この場合、酸化反応は55℃でも進むと
している。しかし、これらの Pseudomonas菌株によるジ
ベンゾチオフェンの分解産物は、Kodamaらが報告してい
る３−ヒドロキシ−２−ホルミルベンゾチオフェンであ
った（Monticello, D.J., Bakker, D., Finnerty, W.R.
Appl. Environ. Microbiol., 49, 756-760(1985))。こ
れらのPseudomonas 菌株によるジベンゾチオフェンの酸
化活性は、イオウを含まない芳香族炭化水素であるナフ
タレンやサリチル酸により誘導を受け、クロラムフェニ
コールにより阻止される。このことから、これらのPseu
domonas 菌株によるジベンゾチオフェンの分解反応は、
芳香環中のＣ−Ｃ結合を切断することによる分解を基礎
としていることが分かる。また、イオウ化合物以外にも
石油留分中に含まれる貴重な芳香族炭化水素類を同時に
分解するおそれもあり、これは、燃料の価値や石油留分
の品質を低下させることになる。
【００１５】このように、今までに発見されている高温
でジベンゾチオフェンを分解できる菌は、ジベンゾチオ
フェン分子中のＣ−Ｃ結合を切断し、炭素源として利用
する反応を触媒するものである。Ｃ−Ｓ結合を特異的に
切断するが、Ｃ−Ｃ結合は切断しないでそのまま残すタ
イプの有機イオウ化合物の分解反応が実際の石油の脱硫
方法として望ましいことは上記（従来のバイオ脱硫方
法）の通りである。すなわち、高温でジベンゾチオフェ
ンおよびそのアルキル置換誘導体分子中のＣ−Ｓ結合を
切断する活性を示し、水溶性の物質の形で、脱硫産物を
生じる微生物を利用するのがバイオ脱硫プロセスとして
最も望ましい。
【００１６】前述のように、Ｃ−Ｓ結合切断型のジベン
ゾチオフェン分解反応を行う微生物は、いくつかの属の
細菌で知られている。しかし、これらのすべての菌につ
いて、少なくとも42℃以上の高温条件下においてジベン
ゾチオフェンを分解する活性を示したということを記載
した例は見あたらない。たとえば、Rhodococcus sp.のA
TCC53968 はよく調べられたジベンゾチオフェン分解菌
株であり、ジベンゾチオフェンのイオウ原子に酸素原子
を付加し、ジベンゾチオフェンスルホキシドからジベン
ゾチオフェンスルホンを生成し、ついで2'−ヒドロキシ
ビフェニル−２−スルフィン酸塩を経て２−ヒドロキシ
ビフェニルを生成する反応を行う。しかし、この菌も通
常の培養温度である30℃よりも少し高い37℃および43℃
でさえ、48時間培養すると非常に生育が遅れるか、生育
しなくなることが報告されている（特開平6-54695)。こ
のことから、高温脱硫反応を行わせるためには、高温で
生育でき、しかも高温で有機イオウ化合物、特にジベン
ゾチオフェンおよびその置換誘導体化合物を含む複素環
式イオウ化合物類をＣ−Ｓ結合特異的に切断できる微生
物を用いるのが最適であると考えられる。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】以上述べた通り、石油
の脱硫工程で使用する微生物としては、高温で生育で
き、かつ、有機イオウ化合物のＣ−Ｓ結合を特異的に切
断できるものであることが望ましいが、そのような微生
物は見いだされていない。本発明は、このような技術的
背景の下になされたものであり、その目的とするところ
は、高温で生育でき、かつ、Ｃ−Ｓ結合を特異的に切断
できる微生物を自然界より分離し、該微生物を用いた石
油等の脱硫手段を提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため、鋭意検討を重ねた結果、パエニバシラス
（以下、「Paenibacillus 」と表記する）属に属する数
種の菌株が、高温条件下で生育でき、かつ、イオウ化合
物のＣ−Ｓ結合を特異的に切断できることを見いだし、
本発明を完成した。即ち、本発明は、Paenibacillus 属
に属し、有機イオウ化合物分解能を有する微生物により
有機イオウ化合物を分解することを特徴とする有機イオ
ウ化合物の分解方法である。また、本発明は、高温で有
機イオウ化合物を分解する能力を有するPaenibacillus
sp. A11-1 株、及びPaenibacillus sp. A11-2 株であ
る。
【００１９】以下、本発明を詳細に説明する。最初に本
発明のA11-1 株及びA11-2 株について説明する。A11-1
株及びA11-2 株は、本発明者が日本各地から採取した多
種類の土壌を分離源としてスクリーニングによって見出
したものである。A11-1 株及びA11-2 株は、以下のよう
な菌学的性質を有する。
【００２０】 A11-1 株 A11-2 株 細胞の形態 幅 0.5-0.7μｍ 幅 0.5-0.7μｍ 長さ 2.5-5.0μｍ 長さ 2.5-5.0μｍ 胞子の形成 ＋ ＋ 胞子の形態 楕円形 楕円形 カタラーゼ試験 ＋ ＋ ＶＰ反応 − − ＶＰ培地のpH 5.5 5.5 最高増殖温度 60℃ 60℃ pH 5.7での増殖性 − − ２％食塩存在下での増殖性 ＋ ＋ ５％食塩存在下での増殖性 − − ７％食塩存在下での増殖性 − − 10％食塩存在下での増殖性 − − Ｄ−グルコースからの酸の生成 ＋ ＋ Ｌ−アラビノースからの酸の生成 ＋ ＋ Ｄ−キシロースからの酸の生成 ＋ ＋ グルコースからのガスの発生 − − レシチナーゼ産生 − − でんぷんの加水分解 ＋ ＋ ゼラチンの加水分解 − − カゼインの加水分解 − − aesculinの加水分解 − − クエン酸の利用 − − プロピオン酸の利用 − − チロシンの分解 − − 硝酸塩から亜硝酸塩の生成 − − インドール生成 − − フェニルアラニンデアミナーゼ活性 − − アルギニンジヒドロラーゼ活性 − − ウレアーゼ試験 − − 16Sr DNAの部分配列 A11-1 株、A11-2 株ともにPaenibacillus グループに属する細菌の16S rDNAの部分配 列と最高 91-92％の相同性を有する
【００２１】上記菌学的性質について、 AshらによるAn
tonie van Leeuwenhock 64, 253-260(1993) に記載の菌
学的性質に照らして検討した結果、A11-１株およびA11-
２株はともに、Paenibacillus 属に属するものと同定さ
れたが、Paenibacillus 属に属する既知の種で上記の菌
学的性質すべてに該当するものは見当たらなかった。そ
こで、A11-１株およびA11-２株をそれぞれPaenibacillu
s sp.A11- １株及びPaenibacillus sp.A11- ２株とし
た。これらの菌株は、それぞれ工業技術院生命工学工業
技術研究所にFERM P-15751（寄託日：平成８年７月22
日）、FERM P-15752（寄託日：平成８年７月22日）とし
て寄託した。なお、Ash らは、1991年16S rRNA遺伝子の
配列を基に、Bacillusグループの細菌を rRNA group 1-
5 の５つのグループに分類している(Ash, C., Farrow,
J.A.E., Wallbanks, S. and CollinsM.D., Lett. Appl.
Microbiol., 13, 202-206(1991))。彼らは、これらの
グループのうち、グループに属するメンバー間の16SrRN
A 遺伝子の配列の相同性が非常に高いrRNA group 3をPa
enibacillus という一つの独立した属にまとめた。従来
Bacillus属の細菌として分類されていて、新たにこのPa
enibacillus 属として分類された細菌種には、Bacillus
alvei, B. amylolyticus, B. azotofixans, B.gordona
e, B. larvae, B. macerans, B. macquariensis, B. pa
buli, B. polymyxa, B. pulvifaciens, B. validus な
どがある。Paenibacillus 属の細菌は、16S rRNAの配列
を基礎とした高度に特異的な遺伝子プローブを用いたブ
ロッティング分析および16S rRNA遺伝子のシークエンシ
ングにより、他のBacillus属の細菌と容易に区別できる
ことが確認されている（Ash,C., Priest,F.G.,Collins,
M.O.Antonie van Leeuwenhock 64, 253-260(1993)) 。
【００２２】A11-１株及びA11-２株の培養は微生物の通
常の培養法にしたがって行われる。培養の形態は液体培
養が好ましい。培地の栄養源としては通常用いられてい
るものが広く用いられる。炭素源としては利用可能な炭
素化合物であればよく、例えば、グルコース、スクロー
ス、ラクトース、フルクトース、エタノールなどが使用
される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれば
よく、例えばペプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母
エキス、大豆粉、カゼイン加水分解物、などの有機栄養
物質も使用できる。脱硫反応に影響を与える可能性のあ
るイオウ化合物を含まない培地で培養するのが望ましい
場合には、塩化アンモニウムのような無機窒素化合物も
使用できる。そのほか、リン酸塩、炭酸塩、マグネシウ
ム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、マンガ
ン、亜鉛、モリブデン、タングステン、銅、ビタミン
類、などが必要に応じて用いられる。培養は、pH６〜
８、温度37〜60℃で振盪または通気条件下で好気的に１
日ないし２日行う。
【００２３】次に、本発明の有機イオウ化合物の分解方
法について説明する。本発明の有機イオウ化合物の分解
方法は、微生物を用いて行う。ここで用いる微生物とし
ては、上記のA11-１株及びA11-２株を使用できるが、こ
れらに限定されることなく、Paenibacillus 属に属し、
有機イオウ化合物を分解する能力を有するものであれば
どのようなものでもよい。
【００２４】本発明における有機イオウ化合物は、主に
複素環式有機イオウ化合物を意味するが、これのみに限
定されるわけではない。複素環式有機イオウ化合物とし
ては、例えば、ベンゾチオフェン、ジベンゾチオフェ
ン、及びこれらの置換誘導体を挙げることができる。置
換誘導体は、特に限定されないが、アルキルジベンゾチ
オフェン類を例示でき、より具体的には、4-メチルジベ
ンゾチオフェン、4,6-ジメチルジベンゾチオフェン、2,
8-ジメチルジベンゾチオフェン、3,4,6-トリメチルジベ
ンゾチオフェン等を例示できる。
【００２５】具体的な分解方法としては、微生物を有機
イオウ化合物を含む液体中で培養する方法（培養法）、
微生物菌体を有機イオウ化合物を含む液体と接触させる
方法（休止菌体法）等を例示することができるが、これ
らに限定されるわけではない。
【００２６】培養法は、例えば、以下のようにして行う
ことができる。有機イオウ化合物の分解は、適当な有機
イオウ化合物を含む液体を添加した新鮮な培地に対し適
当量、例えば１〜２％容量の種菌を接種し、50℃で往復
あるいは回転振とう培養を行うことによりできる。この
際、種菌としては対数増殖期後期のものが好適である
が、対数増殖期初期から定常期のいずれの状態の菌でも
構わない。また、接種量も必要に応じて容量を増減して
も構わない。培地としては高温性脱硫菌培地が好適であ
るが他の培地でも構わない。培地の栄養源としては通常
用いているものが広く用いられる。炭素源としては利用
可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、
スクロース、ラクトース、フルクトース、エタノール等
が使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物で
あればよく、例えばペプトン、ポリペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、大豆粉、カゼイン加水分解物等の有機
栄養物質も使用できる。脱硫反応に影響を与える可能性
のあるイオウ化合物を含まない培地で培養するのが望ま
しい場合には、上記の有機栄養物質の代わりに塩化アン
モニウムの様な無機窒素化合物を使用することもでき
る。そのほか、リン酸塩、炭酸塩、マグネシウム、カル
シウム、ナトリウム、鉄、マンガン、亜鉛、モリブデ
ン、タングステン、銅、ビタミン類等が必要に応じて用
いられる。通常の培養は、約50℃で振とうまたは通気培
養条件で好気的に１日ないし２日行う。ただし、培養温
度は50℃が好適であるが、37℃〜60℃の間の任意の温度
でも構わない。また、培養時間についても必要に応じて
増減しても構わない。
【００２７】有機イオウ化合物を含む液体としては、例
えば、原油、重油、軽油、灯油、ガソリン等の画分等を
使用できるが、有機イオウ化合物を含むものであればど
のようなものでもよい。この液体中の有機イオウ化合物
の濃度は、50〜500ppmが好適であるが、必要に応じて増
減できる。また、有機イオウ化合物を含む液体を添加す
る前に反応温度と同じ温度に培養液を予備加熱してもよ
い。また、本高温性脱硫菌を用いた菌体培養法による有
機イオウ化合物の分解は、テトラデカン等の有機溶媒を
添加した油水２相系中で行っても構わない。この場合、
用いる有機溶媒はテトラデカンのほか、分解反応を行う
温度で液体状態にある炭化水素やケロシン、軽油、重油
等でもよい。また、必要ならば培養液上方の気相を酸素
で置換封入しても構わない。さらに、空気または酸素を
培養液中に送入してもよい。
【００２８】休止菌体法は、例えば、以下のようにして
行うことができる。菌体調製は、新鮮な培地に対し適当
量、たとえば１〜２％容量の種菌を接種し、50℃で往復
あるいは回転振とう培養を行うことによりできる。この
際、種菌としては対数増殖期後期のものが好適である
が、対数増殖期初期から定常期のいずれの状態の菌でも
構わない。また、接種量も必要に応じて容量を増減でき
る。培地としては高温性脱硫菌培地が好適であるが他の
培地でも構わない。培地の栄養源としては通常用いられ
ているものが広く用いられる。炭素源としては利用可能
な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、スク
ロース、ラクトース、フルクトース、エタノールなどが
使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であ
ればよく、例えばペプトン、ポリペプトン、肉エキス、
酵母エキス、大豆粉、カゼイン加水分解物、などの有機
栄養物質も使用できる。脱硫反応に影響を与える可能性
のあるイオウ化合物を含まない培地で培養するのが望ま
しい場合には、塩化アンモニウムのような無機窒素化合
物も使用できる。そのほか、リン酸塩、炭酸塩、マグネ
シウム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、マン
ガン、亜鉛、モリブデン、タングステン、銅、ビタミン
類、などが必要に応じて用いられる。通常の培養は、約
50℃で振盪または通気条件下で好気的に１日ないし２日
行う。ただし、培養温度は50℃が好適であるが、37℃〜
60℃の間の任意の温度でも構わない。
【００２９】培養して得られた菌体は、遠心分離等の手
段により分離集菌して、菌体を洗浄後再度集菌して休止
菌体反応に使用するのが望ましい。この際、菌体は対数
増殖期中期から後期で集菌するのが好適であるが、対数
増殖期初期から定常期の菌体でも構わない。分離集菌の
ための手段としては、遠心分離の他、濾過や沈降分離な
どいかなる方法を用いても構わない。菌体の洗浄には、
生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等のいかなる
緩衝液も使用でき、また水を使用して菌体洗浄を行って
も構わない。
【００３０】休止菌体反応は、菌体を適当な緩衝液に懸
濁して調製した菌懸濁液に有機イオウ化合物を含む液体
を添加して行う。緩衝液としては種々の緩衝液を使用で
きる。緩衝液のpHは、pH６〜７が好適であるが他のpHで
も構わない。また、緩衝液の代わりに、水や培地等を使
用しても構わない。菌体懸濁液の濃度は、ＯＤ660 が１
〜50の間が好適であるが、必要に応じて増減できる。
【００３１】有機イオウ化合物を含む液体としては、例
えば、原油、重油、軽油、灯油、ガソリン等の石油画分
などを使用できるが、有機イオウ化合物を含むものであ
ればどのようなものでもよい。この液体中の有機イオウ
化合物の濃度は、50ppm 〜5000ppm が好適であるが、必
要に応じて増減できる。また、有機イオウ化合物を含む
液体を添加する前に反応温度と同じ温度に反応液を予備
加熱してもよい。休止菌体反応は50℃で行うのが好適で
あるが、37℃〜60℃の任意の温度でもよく、また反応時
間は１〜２時間が好適であるが、必要に応じて増減でき
る。また、休止菌体反応は、テトラデカン等の有機溶媒
を添加した油水２相系で行っても構わない。この場合、
用いる有機溶媒はテトラデカンの他、分解反応を行う温
度で液体状態にある炭化水素やケロシン、軽油、重油な
どでもよい。また、必要ならば反応液上方の気相を酸素
で置換封入しても構わない。
【００３２】以上のようにして、本発明の分解法を実施
できるが、分解により生じた反応生成物の抽出及び分析
は、例えば、以下のようにして行うことができる。反応
液を６規定の塩酸を用いてpH２前後に調整した後、酢酸
エチルを用いて攪拌抽出する。しかし、抽出に使用する
溶媒は、酢酸エチルに限定されるものではなく、目的と
する反応生成物が抽出できるものであればいずれの溶媒
を用いても構わない。酢酸エチルの量は反応液に対し等
量が好適であるが、必要に応じて増減できる。また、反
応生成物の分離は、逆相Ｃ18カラムあるいは順相シリカ
カラムを用いて行うことができるが、必要に応じて他の
カラムを用いても構わない。
【００３３】また、分離に使用する方法はこれらの方法
に限定されるものではなく、反応生成物が分離できる方
法であればいかなる方法を用いても構わない。反応生成
物の分析は、ガスクロマトグラフィー、ガスクロマトグ
ラフィー／質量スペクトル分析、ガスクロマトグラフィ
ー／原子発光検出分析, ガスクロマトグラフィー／フー
リエ変換赤外分光分析、核磁気共鳴法、などを使用して
行うことができる。また、必要に応じて他の分析方法を
併せて利用しても構わない。さらに、分析に使用する方
法はこれらの方法に限定されるものではなく、反応生成
物が分析できる方法であればいずれの方法を使用しても
構わない。
【００３４】
【発明の実施の形態】以下、本発明を実施例により具体
的に説明する。 ［実施例１］ジベンゾチオフェンを高温で分解する菌の
分離 高温性脱硫菌の分離は、以下のように実施した。目的の
脱硫菌の集積および分離には、石油留分中に含まれる代
表的な有機イオウ化合物であるジベンゾチオフェンを唯
一の硫黄源として含む表２に示した培地（高温性脱硫菌
培地）を使用した。まず、密栓付試験管（容量27ml、直
径18mm×長さ180mm)に、高温性脱硫菌培地５mlおよび日
本各地より採取した土壌など１スパテール（約0.５g)を
加え、50℃で２日ないし３日振盪培養（振盪速度120rp
m) し、集積培養を行った。培地に濁りの認められた試
料については、その培養液0.１mlを新鮮な同培地に加
え、集積培養を３回ないし４回繰り返した。これらの集
積培養により菌体の増殖が認められた試料について、高
温脱硫菌培地を用いて培養液を作製した。これらの培養
液2.５mlを前述の密栓付試験管に採取し、６規定の塩酸
を滴下しpHを2.５以下に調整後、等量の酢酸エチルを添
加し、攪拌することにより生成物を抽出した。抽出され
た生成物をガスクロマトグラフィーにより分析し、その
結果２−ヒドロキシビフェニルの生成が認められた試料
についてその集積培養液を使用し、次に述べるような菌
株の分離を行った。
【００３５】２−ヒドロキシビフェニルの生成が認めら
れた培養液を高温性脱硫菌培地を用いて希釈した。得ら
れた希釈液を、高温性脱硫菌培地に終濃度２％となるよ
うに寒天を加えて作製した寒天プレート上に塗布し、50
℃で静置培養して、コロニーを形成させた。つぎに、形
成したコロニーの一部を高温性脱硫菌培地に植菌し、前
述の集積培養に用いた方法により液体培養を行った。こ
うして得られた培養液を用いて前述の方法により、２−
ヒドロキシビフェニルの生成を調べた。２−ヒドロキシ
ビフェニルの生成が認められたコロニーを選択し、前述
の一連の操作を２回ないし３回繰り返すことにより目的
の菌株を単離した。
【００３６】
【表２】
【００３７】［実施例２］微生物によるジベンゾチオフ
ェンの高温分解 有機イオウ化合物であるジベンゾチオフェンを唯一の硫
黄源として含む高温性脱硫菌培地を用いて、種々の温度
で脱硫菌株の培養を試み、菌体の増殖および２−ヒドロ
キシビフェニルの生成を指標としたジベンゾチオフェン
の分解試験をおこなった。
【００３８】密栓付試験管に実施例１に記載の高温性脱
硫菌培地を５ml添加し、所定の温度で一時間予熱後、実
施例１に記載したものと同様の方法で調製した前培養液
を２％植菌し、実施例１に記載の培養条件で分解試験を
行った。測定波長660nm における各培養液の濁度を分光
光度計により測定し、これらの濁度をもって微生物の生
育度を評価した。また、分解生成物の分析は、実施例１
と同様にガスクロマトグラフィーで行い、２−ヒドロキ
シビフェニルの生成量を定量した。高温脱硫菌Paenibac
illus 属sp. A11-２株を使用した場合のジベンゾチオフ
ェン分解試験結果の例を表３に示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】表３に示す結果より、少なくとも33℃〜58
℃の範囲で脱硫菌の有意の増殖が見られ、それに伴いジ
ベンゾチオフェンが分解されていることがわかる。51℃
〜58℃の高温域での生育度と２−ヒドロキシビフェニル
の生成率がともにより低い温度域と比べて特に高くなっ
ている。すなわち、本発明で記載されている高温性脱硫
菌株は高い温度に依存して効率のよい脱硫を行うことが
できることが明らかである。
【００４１】［実施例３］ジベンゾチオフェン誘導体類
の高温分解 ジベンゾチオフェンのアルキル誘導体を唯一の硫黄源と
して含む高温性脱硫菌培地中に脱硫菌株を生育させ、こ
れらのジベンゾチオフェン誘導体化合物の分解性を調べ
た。ジベンゾチオフェンのアルキル誘導体化合物として
は、４−メチルジベンゾチオフェン（Ａ）、4,６−ジメ
チルジベンゾチオフェン（Ｂ）、2,８−ジメチルジベン
ゾチオフェン（Ｃ）、3,４,6−トリメチルジベンゾチオ
フェン（Ｄ）を用いた。石油中に実際に含まれる炭化水
素系溶媒が共存する条件下で、高温性脱硫菌株によりジ
ベンゾチオフェンのアルキル誘導体化合物が分解される
ことを確認するために、硫黄濃度が100ppmとなるように
上記のジベンゾチオフェン誘導体化合物をそれぞれｎ−
テトラデカンに溶解させたものを高温性脱硫菌培地に添
加して菌体培養に使用した。なお、化合物（Ａ）、
（Ｂ）、（Ｄ）は試薬として販売されていないためそれ
ぞれ図１の式（１）から（３）に示す合成反応に従って
合成した。
【００４２】100ml 容量の密栓付き三角フラスコに培地
10mlおよび有機イオウ化合物含有ｎ−テトラデカン２ml
を添加し、実施例１に記載の方法で調製した前培養菌液
を１％程度植菌し、温度50℃で毎分回転数120rpmで振盪
し培養した。測定波長660nmにおける各培養液の濁度を
分光光度計により測定し、これらの濁度をもって微生物
の生育度を評価した。全硫黄成分の分析は、培養液を遠
心分離して水と分離されたテトラデカンの一部を分取し
たものを分析用試料として用い、アンテック社製モデル
7000S 硫黄分析計を使用してパイロ紫外蛍光法により行
った。また、対照として、硫黄化合物を含まない培地を
用いた菌体生育試験を同時に行った。高温脱硫菌Paenib
acillus 属sp. A11-２株を使用した場合のジベンゾチオ
フェン誘導体分解試験の結果の例を表４に示す。
【００４３】
【表４】
【００４４】表４に示すように、脱硫菌の増殖に伴い、
石油に含まれる炭化水素系溶媒が共存する条件下で該溶
媒に溶解していた各種のジベンゾチオフェン誘導体が分
解され、それぞれ20〜30％程度のイオウ成分の減少が見
られた。この実施例は高温脱硫菌の増殖に伴いジベンゾ
チオフェン誘導体が効率的に分解されることを示してい
る。
【００４５】また、デカン層より脱硫生成物を固相抽出
カートリッジカラム（バリアン社製Bond Elut)を使用し
固相抽出した後、ガスクロマトグラフィーおよびガスク
ロマトグラフィー／質量分析法により分析した。各ジベ
ンゾチオフェン誘導体の高温性脱硫菌による分解生成物
について、ガスクロマトグラフィー／質量分析の結果得
られた質量スペクトルから推定される分子量を表５に示
す。表５より、各有機イオウ化合物より硫黄原子が特異
的に除去され、ジベンゾチオフェンの分解産物である２
−ヒドロキシビフェニルに相当するような各種水酸化物
が生成していることが推定される。
【００４６】
【表５】
【００４７】以下に一例として4,６−ジメチルジベンゾ
チオフェンの分解の方法と結果を示す。18mm径の密栓付
き試験管に、4,６−ジメチルジベンゾチオフェン(100pp
m)を唯一のイオウ源として含む高温性脱硫菌培地を５ml
加え、それにPaenibacillussp. A11-２株の菌懸濁液を
0.１ml加えて50℃で24時間振盪培養を行った。波長660n
m での濁度が1.08に達するまで培養した後、培養液を６
規定の塩酸でpH 2.0に調整、酢酸エチルで攪拌抽出を行
った。得られた抽出物をガスクロマトグラフィー、ガス
クロマトグラフィー／質量スペクトル分析、ガスクロマ
トグラフィー／原子発光検出法により分析したところ、
図２（ガスクロマトグラフィーの結果得られたクロマト
グラム）、図３（ガスクロマトグラフィー／質量スペク
トル分析の結果得られたクロマトグラム、図４（ガスク
ロマトグラフィー／質量スペクトル分析の結果得られた
質量スペクトル）および図５（ガスクロマトグラフィー
／原子発光分析の結果得られたクロマトグラム）に示す
ように、4,６−ジメチルジベンゾチオフェンが脱硫され
てヒドロキシ体に変換されていることが確認された。
【００４８】［実施例４］休止菌体によるジベンゾチオ
フェンの高温分解 以下に一例として高温性脱硫菌Paenibacillus 属A11-２
株を使用した休止菌体反応の詳細を示す。密栓付試験管
に実施例１に記載の高温性脱硫菌培地を５ml添加し、そ
れに保存用プレート（1.５％寒天を含む高温性脱硫菌培
地）上のコロニー１白金耳を植菌したものを50℃で１日
振とう培養を行い、得られた培養液を種菌培養液として
用いた。休止菌体反応に使用するための菌体は以下のよ
うにして調製した。500ml容量のバッフル付三角フラス
コに、ジベンゾチオフェンを20mg/l（20ppm)の濃度で含
む高温性脱硫菌培地を100ml 添加した。これに種菌培養
液を２ml接種した後、ＯＤ660 が0.５に達する（約15時
間）まで、50℃、160rpmで回転振とう培養を行った。つ
ぎに、得られた培養液を 8,000×ｇ、５分間遠心するこ
とにより集菌した。上清を除いた後、得られた菌体を生
理食塩水100ml で洗浄し、再び同じ条件で遠心分離を行
い集菌した。この洗浄操作を２回繰り返した後、得られ
た菌体を0.１Ｍのリン酸緩衝液（pH 7.0）を用いて、Ｏ
Ｄ660 が約20となるように再懸濁した。この再懸濁液を
休止菌体反応用菌体懸濁液とした。
【００４９】休止菌体反応は以下の様にして行った。７
ml容量の密栓付試験管に、前述の方法により調製した菌
懸濁液0.５mlを添加して、各反応温度（37℃、50℃、60
℃）で15分間予備加熱を行い、菌体懸濁液の温度を実際
に休止菌体反応を行う温度と同じとなるように調整し
た。この菌体懸濁液に10000ppmのジベンゾチオフェン溶
液（エタノールに溶解したもの）を7.５μl 添加( 終濃
度150 ppm)して、37℃、50℃、60℃の各温度で１時間倒
立回転攪拌することにより休止菌体反応を行った。
【００５０】反応後、菌体懸濁液に６規定の塩酸を加え
pHを２前後に調整した後、0.３mlの酢酸エチルを添加
し、ジベンゾチオフェンおよび休止菌体反応産物を抽出
した。得られた抽出液のガスクロマトグラフィー分析お
よびガスクロマトグラフィー／質量スペクトル分析を行
い、ジベンゾチオフェンの分解産物である２−ヒドロキ
シビフェニルが生成していることを確認した。表中＋の
表記は、基質であるジベンゾチオフェンから脱硫反応生
成物である２−ヒドロキシビフェニルが生成したことを
示す。この際、反応液は基質添加前に十分に予備加熱を
行い、反応液温度を反応温度と同一にしてから基質を添
加しているので、室温から所定の反応温度に達するまで
の途中の温度条件でジベンゾチオフェンの分解反応が進
行する可能性は除外できる。すなわち、表６に示した結
果は、37℃〜60℃の広い温度範囲で高温性脱硫菌による
ジベンゾチオフェンの分解が起こることを証明するもの
である。−は２−ヒドロキシビフェニルが検出されなか
ったことを示し、休止菌体反応系に基質であるジベンゾ
チオフェンを加えなかった対照実験の結果である。
【００５１】
【表６】
【００５２】［実施例５］軽油中のイオウ化合物の高温
分解 軽油を用いて実施例３と同様の条件で高温性脱硫菌によ
るイオウ化合物の分解試験を行った。100ml 容量の密栓
付き三角フラスコに培地10mlおよび全硫黄濃度800ppmの
軽油２mlを添加し、実施例１に記載の方法で調製した前
培養菌液を１％程度植菌し、振盪培養した。測定波長66
0nm における各培養液の濁度を分光光度計により測定
し、これらの濁度をもって微生物の生育度を評価した。
全イオウ成分の分析は、実施例３に記載の方法を用いパ
イロ紫外蛍光法により行った。また、対照として、イオ
ウ化合物を含まない培地を用いた菌体生育試験を同時に
行った。高温脱硫菌Paenibacilllus属sp. A11-１株およ
びA11-２株による軽油に対する脱硫試験の結果の例を表
７に示す。
【００５３】
【表７】
【００５４】表７より、脱硫菌の増殖に伴い軽油中のイ
オウ化合物が分解され、それぞれの菌株について７％、
11％のイオウ成分の減少が見られた。この実施例の結果
は、高温脱硫菌の増殖に伴い軽油が効率的に脱硫される
ことを示している。
【００５５】
【発明の効果】本発明によれば従来可能であったよりも
はるかに高い温度条件下で複素環式有機イオウ化合物を
Ｃ−Ｓ結合特異的に分解することができる。本発明によ
れば、例えば、化石燃料中に含まれるベンゾチオフェ
ン、ジベンゾチオフェン、アルキルジベンゾチオフェン
のような複素環式有機イオウ化合物を、現行の水素化脱
硫の条件よりははるかに穏和ではあるが、通常の微生物
脱硫よりははるかに高温の条件下でＣ−Ｓ結合特異的に
分解することができ、それに伴い効果的な脱硫を行うこ
とができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ジベンゾチオフェンの各種メチル誘導体化合物
の化学的合成法を示す。
【図２】4,６−ジメチルジベンゾチオフェンの高温脱硫
産物のガスクロマトグラムを示す。
【図３】ガスクロマトグラフィー・質量スペクトル分析
の結果得られた4,６−ジメチルジベンゾチオフェンの高
温脱硫産物のクロマトグラムを示す。
【図４】ガスクロマトグラフィー・質量スペクトル分析
の結果得られた4,６−ジメチルジベンゾチオフェンの高
温脱硫産物の質量スペクトルを示す。
【図５】ガスクロマトグラフィー／原子発光分析の結果
得られた4,６−ジメチルジベンゾチオフェンの高温脱硫
産物のクロマトグラムを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｓ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 パエニバシラス属に属し、有機イオウ化
    合物分解能を有する微生物により有機イオウ化合物を分
    解することを特徴とする有機イオウ化合物の分解方法。
  2. 【請求項２】 微生物を有機イオウ化合物を含む液体中
    で培養することにより有機イオウ化合物を分解すること
    を特徴とする請求項１記載の有機イオウ化合物の分解方
    法。
  3. 【請求項３】 微生物菌体を有機イオウ化合物を含む液
    体と接触させることにより有機イオウ化合物を分解する
    ことを特徴とする請求項１記載の有機イオウ化合物の分
    解方法。
  4. 【請求項４】 微生物が、パエニバシラス sp.A11-1 株
    又はパエニバシラスsp.A11-2 株であることを特徴とす
    る請求項１乃至３のいずれか一項に記載の有機イオウ化
    合物の分解方法。
  5. 【請求項５】 有機イオウ化合物が、複素環式有機イオ
    ウ化合物であることを特徴とする請求項１乃至４のいず
    れか一項に記載の有機イオウ化合物の分解方法。
  6. 【請求項６】 複素環式有機イオウ化合物が、ベンゾチ
    オフェン、ジベンゾチオフェン又はこれらの置換誘導体
    であることを特徴とする請求項５記載の有機イオウ化合
    物の分解方法。
  7. 【請求項７】 置換誘導体が、アルキルベンゾチオフェ
    ン類であることを特徴とする請求項６記載の有機イオウ
    化合物の分解方法。
  8. 【請求項８】 高温で有機イオウ化合物を分解する能力
    を有するパエニバシラス sp. A11-1株。
  9. 【請求項９】 高温で有機イオウ化合物を分解する能力
    を有するパエニバシラス sp. A11-2株。
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