JPH10304878A - 高温性海洋細菌由来のフェノール分解酵素遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 リゾービアセア エスピー（Rhizobidac
ea sp.) 501 株（微工研菌寄第11778 号) を由来とし、
大きさが約６．０ｋｂであって、下記に示す制限酵素地
図を有することを特徴とする、フェノール類分解酵素遺
伝子を含有するＤＮＡ断片。 【化１】 【効果】 本発明によれば、新規なフェノール類分解酵
素遺伝子が提供される。該遺伝子によれば、高濃度フェ
ノール含有汚染物処理に有効な高温性フェノール類分解
酵素を遺伝子工学的手法により効率的に生産することが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、高温性海洋細菌を
由来とするフェノール分解酵素遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】フェノール類は生物に対し高い毒性を示
すことが知られているが、これらの多くは製薬および合
成樹脂工業などの合成製造工場やガス工場から、また消
毒剤として使用している医療機関からの排水として、河
川、湖沼、港湾などの公共用水域および下水道などに放
出されている。これまでに、高濃度フェノール含有汚染
物の生物学的処理に適したフェノール分解菌が多数分離
されている。例えば、リゾービアセア エスピー（Rhiz
obiaceae sp.) 501 株（微工研菌寄第11778 号)は、高
塩度の水の中で生育可能で、また高温下（約50〜55℃）
でフェノールあるいはメチル、エチル、ハロゲンの各置
換フェノールを好気性条件下で分解できる細菌であり
（特開平４−１７３０８９号公報）、その性質上、実際
の排水処理において好適に使用できる。しかしながら、
微生物の菌体または固定化菌体を用いる処理では、処理
能力上自ずと限界がある。

【０００３】また、上記フェノール分解菌より、フェノ
ール分解に関与する酵素遺伝子を取得するには至ってい
ない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、フェノール分解酵素を遺伝子工学的手法により高生
産量で安定に生産すべく、その生産の元となるフェノー
ル分解菌よりフェノール分解酵素遺伝子をクローニング
することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、高温性海洋細菌で
ある、リゾービアセア エスピー（Rhizobiaceae sp.)
501 株（微工研菌寄第11778 号) よりフェノール分解酵
素遺伝子をクローニングし、該遺伝子を含むＤＮＡ断片
の制限酵素地図を作成するとともに、該ＤＮＡ断片中の
フェノールハイドロキシラーゼ遺伝子の塩基配列を決定
して本発明を完成するに到った。

【０００６】即ち、本発明は、リゾービアセア エスピ
ー（Rhizobiaceae sp.) 501 株（微工研菌寄第11778
号) を由来とし、大きさが約６ｋｂであって、下記の制
限酵素地図を有することを特徴とする、フェノール分解
酵素遺伝子を含有するＤＮＡ断片である。

【０００７】

【化２】

【０００８】本発明はまた、前記フェノール分解酵素遺
伝子を含有するＤＮＡ断片を組込んだ組換えベクターで
ある。さらに、本発明は前記組換えベクターを含有する
形質転換体、および該形質転換体を培地に培養し、フェ
ノール分解酵素を採取することを特徴とするフェノール
分解酵素の製造法である。さらにまた、本発明は、以下
の(a) 又は(b) のタンパク質をコードする遺伝子であ
る。 (a) 配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質 (b) 配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数
個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸
からなり、かつフェノール分解酵素活性を有するタンパ
ク質 以下、本発明を詳細に説明する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明のフェノール分解酵素遺伝
子は、例えばフェノール分解酵素を生産し、フェノール
分解酵素遺伝子の供与体である微生物より得られる。か
かる微生物としては具体的には新潟県沿岸の海底下鹹水
（かんすい）より分離された、リゾービアセア エスピ
ー（Rhizobiaceae sp.) 501 株（微工研菌寄第11778
号) が使用できる。

【００１０】本発明において、フェノール分解酵素と
は、フェノールの他、プロピル−フェノール、イソプロ
ピル−フェノール、エチル−フェノール、キシレノー
ル、オルソ−クレゾール、メタ−クレゾール、パラ−ク
レゾール等の置換フェノール、カテコール等のフェノー
ル代謝中間体に作用してこれらを分解する。

【００１１】本発明のフェノール分解酵素遺伝子は、以
下の工程を経て取得できる。 (i) 上記の微生物からＤＮＡを分離・精製し、該ＤＮ
Ａを制限酵素を用いて切断したものと、リニヤーなコス
ミドとを両ＤＮＡの接着末端部においてＤＮＡリガーゼ
によって結合閉環させて組換えコスミドを得、(ii) 該
組換えコスミドを複製可能な宿主微生物に導入し、フェ
ノールを分解して蓄積される代謝中間体（カテコール、
２−ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド）の呈色（茶
色、黄色）を指標として、該組換えコスミドを保持する
微生物を単離し、そして、(iii)該微生物培養菌体から
該組換えコスミドを分離・精製し、これより制限酵素に
て目的とするＤＮＡを切り出す。

【００１２】以下に、上記取得方法を詳細に説明する。
まず、供与微生物である上述した細菌を例えば液体培地
で約１〜２日間通気撹拌培養し、得られる培養物を遠心
分離して集菌し、次いでこれを溶菌させることにより目
的とする遺伝子含有溶菌物を調製することができる。溶
菌方法としては、例えばリゾチームなどの細胞壁溶解酵
素により処理を施し、必要によりプロテアーゼなどの他
の酵素やラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤を併
用する。さらに細胞壁の物理的破壊方法である凍結融解
やフレンチプレス処理を上述の溶菌法と組合わせて行っ
てもよい。

【００１３】このようにして得られた溶菌物からＤＮＡ
を分離・精製するには常法に従って、例えばフェノール
抽出による除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレ
アーゼ処理、アルコール沈殿遠心分離などの方法を適宜
組合わせることにより行うことができる。

【００１４】分離・精製された微生物のＤＮＡを適当な
制限酵素（例えばSau3AI）で処理し、部分分解を行った
後、ショ糖密度勾配超遠心法で分画して６〜２０ｋｂｐ
の断片を得る。

【００１５】得られた遺伝子断片を組込むベクターとし
ては、宿主微生物で自律的に増殖しうるファージまたは
プラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが
適している。ファージとしては、例えばエシェリシア・
コリー (E.coli) を宿主微生物とする場合にはＭ１３ｍ
ｐ１８、λｇｔ１０、λｇｔ１１などが使用できる。プ
ラスミドとしては、例えばエシェリシア・コリーを宿主
微生物とする場合にはｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８
４、ｐＵＣ１１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが使用
できる。

【００１６】本発明においては、目的とする遺伝子が大
きいため、コスミドベクターを使用することが好まし
く、具体的には、ｐＬＡＦＲ３、ｐＡＴ５、ｐＷＥ１５
などが使用できる。

【００１７】このようなベクターを先に述べたフェノー
ル分解酵素遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの制限酵素
処理断片に対して接着末端を生じさせるような制限酵素
で切断してベクター断片を得る。

【００１８】微生物ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合
させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であ
ればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクタ
ー断片の接着末端とをアニーリングした後、適当なＤＮ
Ａリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクター断
片との組換えＤＮＡを作成する。必要ならばアニーリン
グの後、宿主微生物に移して、生体内のＤＮＡリガーゼ
を利用し、組換えＤＮＡを作成することもできる。

【００１９】組み換えＤＮＡを導入する宿主微生物とし
ては、組換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能であれ
ばよく、例えば E.coli XL1-Blue、E.coli JM109、E.co
li HB101などが利用できる。

【００２０】宿主微生物に組換えＤＮＡを導入する方法
としては、例えば宿主微生物がエシェリシア・コリーの
場合には、市販のコンピテントセルを用いて組換えＤＮ
Ａの導入を行い、さらにエレクトロポレーション法を用
いてもよい。

【００２１】目的とする組換えＤＮＡが導入されている
宿主微生物の選択は、組換えＤＮＡを保持するベクター
の薬剤耐性マーカーとフェノール分解酵素とを同時に発
現しうる微生物を検索する方法、あるいは選択培地に生
育したコロニーについて、一部配列決定したアミノ酸配
列をもとに合成したＤＮＡプローブとハイブリダイゼー
ションを行い検索する方法などが挙げられる。

【００２２】本発明においては、フェノール分解酵素の
発現は、フェノールの分解によって蓄積される代謝中間
体であるカテコール、２−ヒドロキシムコン酸セミアル
デヒドの呈色（茶色、黄色）を指標に確認する。

【００２３】次に、上記の選択で陽性が確認されたコロ
ニーから組換えＤＮＡを採取し、種々の制限酵素で消化
した断片をpBluescriptSK(+)プラスミドベクターにサブ
クローニングし、E.coli XL1-Blue 細胞に導入する。目
的とする遺伝子断片の制限酵素地図は、各サブクローン
株のフェノール分解活性と該株に挿入されている制限酵
素断片とを比較解析することにより作成することができ
る。また、目的とする遺伝子断片の塩基配列は、ジデオ
キシ法 [Sanger. F, Science, 214, 1205-1210 (1981)]
によって配列決定をすることができる。

【００２４】このようにして一度選択されたフェノール
分解酵素遺伝子を保有する組換えＤＮＡは、形質転換微
生物から取り出され、他の宿主微生物に導入することも
できる。

【００２５】形質転換体である宿主微生物の培養形態は
宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば
よく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には
通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源とし
ては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用さ
れうる。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であれ
ばよく、例えばグルコース、スクロース、ラクトース、
糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては、
利用可能な窒素化合物であればよく、例えばアンモニウ
ム塩、硝酸塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどが
使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグ
ネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛
などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必
要に応じて使用される。

【００２６】培養温度は菌が生育し、フェノール分解酵
素を生産する範囲で適宜変更しうるが、エシェリシア・
コリーの場合、好ましくは、２０〜４２℃程度である。
培養時間は条件によって多少異なるが、フェノール分解
酵素が最高収量に達する時間を見計らって適当な時期に
培養を終了すればよく、通常は、８〜３６時間程度であ
る。培地pHは菌が発育し、フェノール分解酵素を生産す
る範囲で適宜変更しうるが、好ましくはｐＨ６．０〜
８．０程度である。

【００２７】培養物中のフェノール分解酵素は、培養物
をろ過または遠心分離などの手段により、菌体を採取
し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなど
の酵素法で破壊し、また必要に応じてエチレンジアミン
四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤および／または界
面活性剤を添加してフェノール分解酵素を可溶化し、水
溶液として分離採取する。

【００２８】このようにして得られたフェノール分解酵
素を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウ
ムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメ
タノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法
により沈殿せしめればよい。以下、実施例により本発明
を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。

【００２９】

【実施例】

〔実施例１〕（染色体ＤＮＡのジーンライブラリーの作
成） リゾービアセア エスピー（Rhizobiaceae sp.) 501 株
（微工研菌寄第11778号) の染色体ＤＮＡを次の方法で
分離した。まず、同菌株をＬ−ブロス培地（バクトペプ
トン1%、バクト酵母エキス0.5%、人工海水、フェノール
200ppm, pH7)に接種し、50℃にて24時間振盪培養後、得
られた菌体を集菌し、滅菌水で洗浄した。

【００３０】次にこの菌体の水分を濾紙により除去した
後、液体窒素中で破砕した。この菌体破砕物をＴＥ溶液
（10mM Tris-HCl 、1mM EDTA、pH8.0)に懸濁した後、プ
ロテアーゼＫ溶液、溶菌溶液(0.5%SDS, 50mM EDTA)を等
量加えて穏やかに攪拌し、37℃で30分放置した。得られ
た溶菌液を3000rpm,20分間遠心分離後、上清を取得し
た。その上清を等量のフェノール・クロロホルム混合液
で２回処理し、夾雑するタンパク質を除去後、2.5 倍容
の冷エタノールを加えＤＮＡを沈殿させた。この沈殿物
を0.1mg /ml のRN aseを含むＴＥ溶液に穏やかに溶解し
て30℃、30分間反応させた。この溶液をフェノール・ク
ロロホルム混合液で再び処理し、2.5 倍容の冷エタノー
ルを添加し、生じた染色体ＤＮＡをパスツールピペット
で巻き取った。このＤＮＡを乾燥後、ＴＥ溶液に溶解
し、染色体ＤＮＡ溶液を調製した。得られたＤＮＡをSa
u3AIで部分分解後、分解断片を５〜２０％のショ糖密度
勾配超遠心法により約２０ｋｂの染色体ＤＮＡ断片を調
製した。

【００３１】一方、コスミドベクターｐＬＡＦＲ３（B.
Staskawicz et al., J. Bateriol.169 : 5789-94 (198
7) [88058799]) は、大量培養し、塩化セシウム密度勾
配遠心法により単離を行い、EcoRI とHindIII でそれぞ
れ消化し、脱リン酸処理を行った後、いずれもBamHI で
二重消化し、BamHI アームを調製した。得られた２種類
のアームを前記ＤＮＡ断片と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ（東洋紡績社製）で、16℃で一晩ライゲーションを行
った。得られたファージＤＮＡをインビトロパッケージ
ングキット（ギガパックゴールド，東洋紡績社製）を用
いてパッケージングした後、E. coli S17-1 株に前記フ
ァージを感染させ、染色体ＤＮＡのジーンライブラリー
を作製した。

【００３２】〔実施例２〕（染色体ＤＮＡのジーンライ
ブラリーからのフェノール分解酵素遺伝子のクローニン
グ） 実施例１の染色体ＤＮＡのジーンライブラリーから、フ
ェノールを分解して蓄積される代謝中間体（カテコー
ル、２−ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド）の呈色
（黄色）を指標に、フェノール分解酵素遺伝子を含むク
ローンの選択を行った。約10,000個のコロニーの中か
ら、３個の陽性クローンを選択できた。得られた３つの
陽性クローンから組換えコスミドを抽出して、ｐＬＰＨ
１、ｐＬＰＨ２、ｐＬＰＨ３とした。

【００３３】ｐＬＰＨ１、ｐＬＰＨ２、ｐＬＰＨ３をそ
れぞれ制限酵素HindIII で消化し、アガロースゲル電気
泳動解析することにより、コスミドベクターｐＬＡＦＲ
３への501 株由来ＤＮＡ断片の挿入を確認した（図
１）。

【００３４】上記解析による挿入断片の分子量から ｐ
ＬＰＨ１、ｐＬＰＨ２、ｐＬＰＨ３には、それぞれ25k
b、22kb、25kbの501 株由来ＤＮＡが挿入されているこ
とがわかった。

【００３５】また、ｐＬＰＨ１、ｐＬＰＨ２、ｐＬＰＨ
３を導入したE. coli S17-1 クローン株（ｐＬＰＨ１／
E.coli、ｐＬＰＨ２／E.coli、ｐＬＰＨ３／E.coli）の
フェノール分解性の確認は、Ｔｃ（１２．５μｇ／ｍ
ｌ）、フェノール（最終濃度、１００ｐｐｍ）を添加し
た３ｍｌＬＢ液体培地で３７℃で振盪培養を行い、２４
時間毎に培養液から５００μl づつサンプリングし、培
養液中の残存フェノール濃度を４−アミノアンチピリン
法で測定することにより行った（図２）。

【００３６】いずれのクローン株においても４８時間の
培養でフェノールは４０ｐｐｍまで分解されるととも
に、フェノール分解代謝物の蓄積により培養液が黄色を
呈した。以上の結果から、ｐＬＰＨ１、ｐＬＰＨ２、ｐ
ＬＰＨ３にはフェノール分解酵素遺伝子がコードされて
いることが明らかとなった。

【００３７】〔実施例３〕（フェノール分解酵素遺伝子
の解析） (1) フェノール分解酵素遺伝子のサブクローニング 実施例２で行ったフェノール分解活性測定で高い分解性
を示し、比較的挿入ＤＮＡ断片の短いｐＬＰＨ２をサブ
クローニングに用いた。サブクローニングのためのベク
ターにはpBluescript SK⁺ 、宿主にはE. coli XL1-Blue
を用いた。インサートであるｐＬＨ２およびベクターで
あるpBluescript SK⁺ のプラスミド単離を行い、インサ
ートとベクターをそれぞれBamHI, EcoRI, HindIII によ
り制限酵素消化し、ベクターの脱リン酸処理を行った。
これらをＴ４ＤＮＡリガーゼで１６℃で一晩ライゲーシ
ョンを行い、各制限酵素断片が組み込まれたベクターを
調製した。

【００３８】これらの各々のベクターをコンピテントセ
ル化した大腸菌XL1-Blueに形質転換し、１００ｍＭ Ｉ
ＰＴＧ、フェノール１００ｐｐｍ、Ａｍｐ（５０μｇ／
ｍｌ）、Ｘ−ｇａｌを含むＬＢプレートにプレーティン
グし、コロニーを形成させた。

【００３９】サブクローニングにより得たコロニーをラ
ンダムに選択し、フェノールを含むＬＢ培地（バクトペ
プトン１％、バクト酵母エキス０．５％、塩化ナトリウ
ム１％）で培養したところ、培養液が黄色または茶色を
呈するものが得られた。黄色を呈するものはHindIII 断
片を、茶色を呈するものはEcoRI 断片を、薄茶色を呈す
るものはBamHI 断片を導入したクローン株であった。Ba
mHI 断片、EcoRI 断片, HindIII 断片をそれぞれ挿入し
たこれらのクローン株から抽出した組換えプラスミドを
それぞれｐＢＰＨＨ１、ｐＢＰＨＨ２、ｐＢＰＨＥ１、
ｐＢＰＨＢ１とした（図３）。

【００４０】(2) サブクローン株のフェノール分解性 ｐＢＰＨＨ１、ｐＢＰＨＨ２、ｐＢＰＨＥ１をに導
入したE. coli XL1-Blueサブクローン株（それぞれ、ｐ
ＢＰＨＨ１／E.coli、ｐＢＰＨＨ２／E.coli、ｐＢＰＨ
Ｅ１／E.coli）のフェノール分解性を、以下のようにし
て測定した。まず、各サブクローン株を、Ａｍｐ（５０
μｇ／ｍｌ）、フェノール（最終濃度：１００ｐｐｍ）
を添加した３ｍｌのＬＢ液体培地にて、３７℃で振盪培
養を行った。１２時間毎に５００μl ずつサンプリング
し、４−アミノアンチピリン法で残存フェノール濃度を
測定した（図４）。この結果、ｐＢＰＨＨ１／E.coli、
ｐＢＰＨＨ２／E.coli、ｐＢＰＨＥ１／E.coliは高いフ
ェノール分解活性を示したが、ｐＢＰＨＢ１／E.coliは
フェノール分解活性が認められなかった。

【００４１】また、ｐＢＰＨＨ１／E.coli、ｐＢＰＨＨ
２／E.coliの培養液は２−ヒドロキシムコン酸セミアル
デヒドの蓄積によると推定される黄色を呈していたこと
から、ｐＢＰＨＨ１、ｐＢＰＨＨ２上にはフェノールハ
イドロキシラーゼ遺伝子およびカテコール２，３−ジオ
キシゲナーゼ遺伝子がコードされていることが示唆され
た。一方、ｐＢＰＨＥ１／E.coliの培養液はカテコール
の蓄積によると推定される茶色を呈したことから、フェ
ノールハイドロキシラーゼ遺伝子のみがコードされてい
ることが示唆された。尚、形質転換株ｐＢＰＨＨ１／E.
coliは工業技術院生命工学工業技術研究所に平成９年２
月27日付けでFERM P-16100として寄託されている。

【００４２】 次に、目的遺伝子がコードされている
ことが示唆されたｐＢＰＨＨ１およびｐＢＰＨＥ１をさ
らに別の制限酵素で消化してサブクローニングを行っ
た。ｐＢＰＨＨ１を制限酵素SalIで消化し、セルフライ
ゲーションさせてｐＢＰＨＨ１Ｓとし、またｐＢＰＨＨ
１を制限酵素PstIで消化し、pBluescriptSK ⁺ とライゲ
ーションをしたものをｐＢＰＨＨ１Ｐとした。

【００４３】この二種類の組換えプラスミドを新たに導
入したE. coli XL1-Blueサブクローン株（ｐＢＰＨＨ１
Ｓ／E.coli、ｐＢＰＨＨ１Ｐ／E.coli）、ならびに前出
のｐＢＰＨＨ１／E.coli、ｐＢＰＨＨ２／E.coli、ｐＢ
ＰＨＥ１／E.coliのフェノール分解活性とカテコール
２，３−ジオキシゲナーゼ活性を測定することにより、
フェノールハイドロキシラーゼ遺伝子とカテコール２，
３−ジオキシゲナーゼ遺伝子の挿入断片上の位置を特定
し、制限酵素地図を作製した。さらにフェノールハイド
ロキシラーゼ遺伝子の塩基配列の決定を、ｐＢＰＨＥ１
についてKilo-Sequence用 Deletion Kit（宝酒造社製）
及びABI 377 DNA Sequencing System （アプライドバイ
オシステムズ社製）を用いて行なった。決定したフェノ
ールハイドロキシラーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号２
に、また、該ＤＮＡ配列から翻訳されるタンパク質のア
ミノ酸配列を配列番号１に示した。

【００４４】フェノール分解活性は形質転換株の生育に
伴うフェノール分解を、カテコール２，３−ジオキシゲ
ナーゼ活性は形質転換株から調製した無細胞抽出液を用
いカテコールを基質として反応を行い、生成する２−ヒ
ドロキシムコン酸セミアルデヒドを３７５ｎｍの吸収度
増加を測定することにより行った。各欠失プラスミドと
両酵素活性との関係を図５に示す。

【００４５】以上の結果より、高温性海洋細菌由来のフ
ェノールハイドロキシラーゼとカテコール２，３−ジオ
キシゲナーゼをコードする遺伝子は、ｐＢＰＨＨ１Ｓの
約５．２ｋｂのSalI-HindIII断片上にタンデムに並んで
配座していると推定した。

【００４６】

【発明の効果】本発明によれば、新規なフェノール分解
酵素遺伝子が提供される。該遺伝子によれば、高濃度フ
ェノール含有汚染物処理に有効な高温性フェノール分解
酵素を遺伝子工学的手法により効率的に生産することが
できる。

【００４７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：397 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列： Met Gly Lys His Asp Pro Ile Ser Leu Glu Lys Arg Leu Thr Ile Thr 1 5 10 15 Lys Asp Gln Val Lys Ala Trp Ala Gln Ala Ala Glu Ala Glu Ile Gly 20 25 30 Glu Ala Glu Lys Asn Cys Gln Phe Ser Asp Ala Leu Met Lys Ser Tyr 35 40 45 Lys Glu Gln Gly Phe His Arg Leu Leu Arg Pro Trp Arg His Gly Gly 50 55 60 Pro Ser Val Arg Pro Thr Ala Phe Met Glu Leu Val Arg Thr Val Gly 65 70 75 80 Tyr His Ser Ser Ala Ala Ala Trp Leu Phe Tyr Phe Tyr Pro Ile His 85 90 95 Glu Ala Trp Val Ala Tyr Leu Pro Gln Asn Arg Gln Glu Glu Ile Phe 100 105 110 Gly Ser Asp Ala Leu Val Val Asp Val Phe Thr Pro Leu Gly Lys Val 115 120 125 Glu Lys Asp Gly Glu Gly Tyr Arg Leu Ser Gly Glu Trp Lys Phe Ala 130 135 140 Ser Gly Val Met His Ser Glu Trp Ile Gly Leu Gly Gly Val Val Pro 145 150 155 160 Leu Pro Asp Gly Pro Gln Pro Cys Leu Ile Ala Ile Arg Thr Asp Gln 165 170 175 Val Glu Ile Val Lys Asn Trp Asp Thr Leu Gly Leu Arg Ser Thr Gly 180 185 190 Ser Asn Ala Val Arg Cys Glu Asn Val Tyr Val Ala Pro Asp Met Ile 195 200 205 Leu Pro Leu Val Thr Thr Val Ser Thr Gly Met Pro Gln Thr Thr Asp 210 215 220 Phe Asp Pro Glu Asp Pro Ser Tyr Arg Thr Pro Phe Met Pro Arg Phe 225 230 235 240 Leu Met Gly Phe Pro Ala Val Ala Leu Gly Gly Ala Glu Arg Val Val 245 250 255 Asp Glu Phe Glu Ala Arg Thr Lys Asn Arg Ile Arg Val Tyr Gln Gly 260 265 270 Gly Gln Ala Glu Ala Gln Asn Pro Ser Gly Ile Arg Ala Leu Ala Asn 275 280 285 Val Arg Leu Arg Leu Asp Thr Leu Arg Ala Ser Phe Asp Ala Tyr Ala 290 295 300 Glu Gln Leu Glu Ala Trp Thr Asp Gln Lys His His Val Ala Ser Asp 305 310 315 320 Ala Glu Arg Glu Arg Met Phe Ala Leu Arg Ala His Ile Ala Arg Glu 325 330 335 Ala Met Leu Ile Ala Val Asp Val Gln Thr Met Ala Gly Gly Ser Ala 340 345 350 Ile Phe Lys Gly Asp Pro Ile Glu Arg Phe Thr Arg Asp Leu Ile Thr 355 360 365 Val Ala Thr His Thr Thr His Leu Tyr Glu Asp Ala Leu Gln Gly Tyr 370 375 380 Gly Lys Ala Leu Met Gly Ile Gly Ala His Pro Leu Trp *** 385 390 395

【００４８】配列番号：２ 配列の長さ：1382 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：リゾービアセア エスピー（Rhizobiaceae s
p.) 株名：501 株 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置 :109..1302 特徴を決定した方法 : E 配列： AACTATTGAC AGCCGCCCGT CCACGCCATC TTAGTCGTGC AACAGTCGTT AAACGTCAGA 60 TCATCACATT TTTTGTGAAG AGAGTCTGAA CCCAAGGGAG GAAGATAG 108 ATG GGA AAA CAC GAT CCG ATC AGT CTC GAG AAG AGG CTC ACG ATT ACG 156 Met Gly Lys His Asp Pro Ile Ser Leu Glu Lys Arg Leu Thr Ile Thr 5 10 15 AAG GAT CAG GTA AAG GCC TGG GCA CAG GCC GCC GAG GCC GAG ATC GGC 204 Lys Asp Gln Val Lys Ala Trp Ala Gln Ala Ala Glu Ala Glu Ile Gly 20 25 30 GAG GCG GAG AAG AAC TGC CAG TTC TCC GAT GCG CTC ATG AAG AGC TAC 252 Glu Ala Glu Lys Asn Cys Gln Phe Ser Asp Ala Leu Met Lys Ser Tyr 35 40 45 AAG GAG CAG GGT TTT CAC CGG CTC TTG CGC CCT TGG CGT CAT GGT GGT 300 Lys Glu Gln Gly Phe His Arg Leu Leu Arg Pro Trp Arg His Gly Gly 50 55 60 CCC TCG GTC CGC CCC ACC GCC TTC ATG GAG CTC GTG CGT ACG GTC GGC 348 Pro Ser Val Arg Pro Thr Ala Phe Met Glu Leu Val Arg Thr Val Gly 65 70 75 80 TAC CAC AGT TCG GCG GCT GCC TGG CTG TTC TAT TTC TAC CCG ATC CAC 396 Tyr His Ser Ser Ala Ala Ala Trp Leu Phe Tyr Phe Tyr Pro Ile His 85 90 95 GAG GCT TGG GTC GCC TAT CTT CCG CAG AAC CGG CAG GAA GAG ATC TTC 444 Glu Ala Trp Val Ala Tyr Leu Pro Gln Asn Arg Gln Glu Glu Ile Phe 100 105 110 GGC AGC GAC GCG CTT GTC GTC GAT GTT TTC ACC CCG CTC GGC AAG GTC 492 Gly Ser Asp Ala Leu Val Val Asp Val Phe Thr Pro Leu Gly Lys Val 115 120 125 GAG AAG GAC GGC GAA GGC TAC CGC CTG TCC GGT GAG TGG AAA TTC GCT 540 Glu Lys Asp Gly Glu Gly Tyr Arg Leu Ser Gly Glu Trp Lys Phe Ala 130 135 140 TCG GGC GTG ATG CAT TCC GAA TGG ATC GGC CTT GGC GGG GTG GTG CCG 588 Ser Gly Val Met His Ser Glu Trp Ile Gly Leu Gly Gly Val Val Pro 145 150 155 160 CTG CCG GAC GGG CCG CAG CCC TGC CTG ATA GCG ATC CGC ACC GAT CAG 636 Leu Pro Asp Gly Pro Gln Pro Cys Leu Ile Ala Ile Arg Thr Asp Gln 165 170 175 GTC GAG ATC GTG AAG AAC TGG GAT ACG CTC GGC CTG CGC TCC ACC GGT 684 Val Glu Ile Val Lys Asn Trp Asp Thr Leu Gly Leu Arg Ser Thr Gly 180 185 190 TCT AAC GCC GTC AGG TGC GAG AAT GTC TAT GTC GCG CCG GAC ATG ATC 732 Ser Asn Ala Val Arg Cys Glu Asn Val Tyr Val Ala Pro Asp Met Ile 195 200 205 CTG CCA CTG GTC ACG ACG GTG AGC ACG GGC ATG CCG CAG ACC ACC GAT 780 Leu Pro Leu Val Thr Thr Val Ser Thr Gly Met Pro Gln Thr Thr Asp 210 215 220 TTC GAC CCC GAG GAT CCG TCC TAC CGG ACC CCG TTC ATG CCG CGC TTC 828 Phe Asp Pro Glu Asp Pro Ser Tyr Arg Thr Pro Phe Met Pro Arg Phe 225 230 235 240 TTG ATG GGC TTC CCC GCG GTG GCG CTC GGT GGC GCC GAA CGG GTC GTG 876 Leu Met Gly Phe Pro Ala Val Ala Leu Gly Gly Ala Glu Arg Val Val 245 250 255 GAT GAG TTC GAG GCC CGC ACC AAG AAC CGC ATC CGG GTT TAT CAG GGC 924 Asp Glu Phe Glu Ala Arg Thr Lys Asn Arg Ile Arg Val Tyr Gln Gly 260 265 270 GGC CAG GCC GAG GCC CAG AAC CCC TCG GGC ATC CGG GCG CTG GCG AAT 972 Gly Gln Ala Glu Ala Gln Asn Pro Ser Gly Ile Arg Ala Leu Ala Asn 275 280 285 GTC CGG CTG CGG CTG GAT ACC CTG CGC GCG AGC TTC GAT GCC TAT GCC 1020 Val Arg Leu Arg Leu Asp Thr Leu Arg Ala Ser Phe Asp Ala Tyr Ala 290 295 300 GAG CAG CTC GAA GCA TGG ACG GAC CAG AAA CAC CAC GTC GCC TCG GAT 1068 Glu Gln Leu Glu Ala Trp Thr Asp Gln Lys His His Val Ala Ser Asp 305 310 315 320 GCC GAG CGC GAA CGA ATG TTC GCC CTG CGC GCC CAC ATC GCC CGC GAG 1116 Ala Glu Arg Glu Arg Met Phe Ala Leu Arg Ala His Ile Ala Arg Glu 325 330 335 GCG ATG CTG ATC GCT GTC GAT GTC CAG ACG ATG GCG GGC GGC TCG GCG 1164 Ala Met Leu Ile Ala Val Asp Val Gln Thr Met Ala Gly Gly Ser Ala 340 345 350 ATC TTC AAA GGT GAT CCG ATC GAA CGT TTC ACG CGC GAT CTG ATC ACC 1212 Ile Phe Lys Gly Asp Pro Ile Glu Arg Phe Thr Arg Asp Leu Ile Thr 355 360 365 GTC GCG ACC CAT ACG ACG CAT CTC TAC GAG GAC GCG CTG CAA GGC TAC 1260 Val Ala Thr His Thr Thr His Leu Tyr Glu Asp Ala Leu Gln Gly Tyr 370 375 380 GGA AAG GCG CTG ATG GGC ATC GGG GCG CAC CCG CTC TGG TAA 1302 Gly Lys Ala Leu Met Gly Ile Gly Ala His Pro Leu Trp *** 385 390 395 GGAACGCGCA AGACGCGGGG CCGCCTGTTG CGGCCTTGCG TGACATGATT AACATGATTG 1362 ACATGCTGGG AGGAACGTAA 1382

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＬＰＨ１、ｐＬＰＨ２、ｐＬＰＨ３、ならび
にそれらの制限酵素HindIII 消化断片のアガロースゲル
電気泳動写真を示す。

【図２】ｐＬＰＨ１、ｐＬＰＨ２、ｐＬＰＨ３を導入し
たE. coli クローン株によるフェノール分解活性を示
す。

【図３】ｐＢＰＨＨ１、ｐＢＰＨＨ２、ｐＢＰＨＥ１、
ｐＢＰＨＢ１の制限酵素地図を示す。

【図４】ｐＢＰＨＨ１、ｐＢＰＨＨ２、ｐＢＰＨＥ１、
ｐＢＰＨＢ１を導入したE.coliクローン株によるフェノ
ール分解活性を示す。

【図５】各欠失プラスミドとフェノールハイドロキシラ
ーゼ、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼの酵素活性
との関係を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成９年９月１２日

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 青山 勝博 東京都目黒区中目黒４丁目13番21号 アー バンハイツ中目黒Ａ棟806号

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 リゾービアセア エスピー（Rhizobiace
   ae sp.) 501 株（微工研菌寄第11778 号) を由来とし、
   大きさが約６ｋｂであって、下記に示す制限酵素地図を
   有することを特徴とする、フェノール分解酵素遺伝子を
   含有するＤＮＡ断片。 【化１】
2. 【請求項２】 請求項１記載のフェノール分解酵素遺伝
   子を含有するＤＮＡ断片を組込んだ組換えベクター。
3. 【請求項３】 請求項２記載の組換えベクターを含有す
   る形質転換体。
4. 【請求項４】 請求項３記載の形質転換体を培地に培養
   し、フェノール分解酵素を採取することを特徴とするフ
   ェノール分解酵素の製造法。
5. 【請求項５】 以下の(a) 又は(b) のタンパク質をコー
   ドする遺伝子。 (a) 配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質 (b) 配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数
   個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸
   からなり、かつフェノール分解酵素活性を有するタンパ
   ク質