JPH10276762A

JPH10276762A - 細胞活性測定装置

Info

Publication number: JPH10276762A
Application number: JP9092641A
Authority: JP
Inventors: Shinichiro Kusunoki; 慎一郎楠; Hideo Katayama; 秀夫片山; Koji Tsukurida; 弘司造田; Chiaki Okumura; 千晶奥村; Yoshihisa Amano; 義久天野; Junichiro Arai; 潤一郎新井
Original assignee: Daikin Industries Ltd
Current assignee: Daikin Industries Ltd
Priority date: 1997-04-10
Filing date: 1997-04-10
Publication date: 1998-10-20
Anticipated expiration: 2017-04-10
Also published as: JP3368456B2

Abstract

(57)【要約】【課題】簡単な作業で、かつ短時間で細胞活性を測定
し、しかも途中経過を観察し続ける。【解決手段】測定対象細胞が添加された液体培地を
収容する第１測定セルと、測定対象細胞および測定対象
物質が添加された液体培地を収容する第２測定セルと、
両測定セルを支持するカセット１と、カセット１と共に
両測定セルを収容して液体培地中の測定対象細胞の培養
を行わせる培養部１１と、所定時間の培養後に、培養部
から取り出された両測定セルの液体培地中の溶存酸素量
を酸素電極を用いて測定する電極接続部１５と、酸素電
極から出力される電気信号を入力として所定の処理を行
なって細胞活性測定結果を出力するデータ処理部１６
と、培養部１１と電極接続部１５との間で両測定セルを
循環させるコンベア２１とを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は細胞活性測定装置
に関し、さらに詳細にいえば、測定対象細胞および測定
対象物質を添加した液体培地を測定セルに収容して所定
時間培養を行い、液体培地中の溶存酸素量を酸素電極を
用いて測定することにより細胞活性を測定するための装
置に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から、生物や人体内に挿入された
り、直接触れる医療用具や化粧品、薬剤など（測定対象
物質）の細胞毒性を検査する方法として、モルモット、
ラットなどに代表される動物実験を行う方法が知られて
いる。しかし、動物実験はコスト、期間、個体差などの
問題があり、また動物愛護の見地からも必要最小限の実
験数にとどめる必要がある。

【０００３】このような見地から、最近は、ターゲット
になる細胞を培養させ、この細胞に医療用具や化粧品、
薬剤などを作用させ、その後、細胞の活性を測定し、動
物実験に代替する試みがなされてきた。これまでに開発
されてきた細胞活性の測定方法としては、ＭＴＴアッセ
イ法がある。

【０００４】このＭＴＴアッセイ法は、図８に示すよう
に、ステップSP１において、回転速度２０００ｒｐｍで
５分間遠心分離処理を行い、ステップSP２において、２
分間待って上澄みを捨て、ステップSP３において、濃度
０．０４％の色素（ＭＴＴ）を１００μｌ添加して５分
間待ち、ステップSP４において、３７℃で１８０分間培
養を行い、ステップSP５において、リン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）を１００μｌ添加して１分間待ち、ステップSP６に
おいて、回転速度２０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理
を行い、ステップSP７において、２分間待って上澄みを
捨て、ステップSP８において、濃度１００％のジメチル
スルホキサイド（ＤＭＳＯ）を１００μｌ添加して１分
間待ち、ステップSP９において、０．５分間撹拌を行
い、ステップSP１０において、０．５分間波長５５０ｎ
ｍの吸光度を測定する方法である。

【０００５】したがって、このＭＴＴアッセイ法を採用
することにより、溶存酸素量（細胞の呼吸量に対応する
量）に基づいて細胞活性を測定することができる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかし、ＭＴＴアッセ
イ法は、１０以上の工程が必要であり、しかも２００分
以上の測定所要時間がかかる。そして、ＭＴＴアッセイ
法の殆どの工程は、既存の分注工程、培養工程、遠心分
離工程、吸光分析などであり、人手がかかるとともに、
技能が必要であり、簡単には実施することができない。

【０００７】また、ＭＴＴアッセイ法は、色素の変色を
波長５５０ｎｍの吸光度により測定するのであるから、
一連の処理工程が非可逆的であり、途中経過を観察し続
けることが著しく困難である。特に、毒性が一方的に進
行するのではなく、回復するような場合には、毒性から
の回復過程の測定を行うことが殆ど不可能になってしま
う。さらに詳細に説明すると、例えば「カテーテル」の
開発のために、ＭＴＴアッセイ法を用いて途中経過（特
に毒性からの回復過程）を観察し続けようとすれば、各
部品に採用される可能性がある複数種類の材質、身体部
位ごとの細胞の種類、前記各材質の濃度などを設定する
とともに、種々の培養時間を設定して測定を行わなけれ
ばならず、前記の各工程の作業を効率よく遂行し、短時
間で誤差なく測定を行うことは殆ど不可能である。

【０００８】

【発明の目的】この発明は上記の問題点に鑑みてなされ
たものであり、簡単な作業で、かつ短時間で細胞活性を
測定することができ、しかも途中経過を観察し続けるこ
とができる細胞活性測定装置を提供することを目的とし
ている。

【０００９】

【課題を解決するための手段】請求項１の細胞活性測定
装置は、測定対象細胞が添加された液体培地を収容する
第１測定セルと、測定対象細胞および測定対象物質が添
加された液体培地を収容する第２測定セルと、両測定セ
ルを収容して液体培地中の測定対象細胞の培養を行わせ
る培養部と、所定時間の培養後に、培養部から取り出さ
れた両測定セルの液体培地中の溶存酸素量を酸素電極を
用いて測定する測定部と、酸素電極から出力される電気
信号を入力として所定の処理を行なって細胞活性測定結
果を出力するデータ処理部と、培養部と測定部との間で
両測定セルを循環させる循環部とを含むものである。

【００１０】請求項２の細胞活性測定装置は、第２測定
セルの数が複数であり、それぞれの液体培地に互いに異
なる濃度の薬剤が添加されているものである。請求項３
の細胞活性測定装置は、第１測定セルおよび第２測定セ
ルを支持するカセットをさらに含み、カセットに支持さ
れた両測定セルに液体培地、測定対象物質、測定対象細
胞を供給する供給部をさらに含むものである。

【００１１】請求項４の細胞活性測定装置は、カセット
に支持された両測定セルの数と等しい個数の酸素電極が
一体的に形成されているとともに、カセットに支持され
た両測定セルの液体培地中の溶存酸素量を同時に測定で
きるように相対位置が設定されているものである。請求
項５の細胞活性測定装置は、酸素電極として、少なくと
も作用極および対極を有するものを採用し、作用極およ
び対極として金、白金もしくは銀をカーボンで覆ったも
のからなるものを採用するものである。

【００１２】

【作用】請求項１の細胞活性測定装置であれば、測定対
象細胞が添加された液体培地を収容する第１測定セル
と、測定対象細胞および測定対象物質が添加された液体
培地を収容する第２測定セルとを培養部に収容して液体
培地中の測定対象細胞の培養を行わせ、所定時間の培養
後に、培養部から取り出された両測定セルの液体培地中
の溶存酸素量を測定部により酸素電極を用いて測定し、
酸素電極から出力される電気信号を入力としてデータ処
理部により所定の処理を行なって細胞活性測定結果を出
力する。そして、循環部により培養部と測定部との間で
両測定セルを循環させることにより、両測定セルの内容
を変更することなく、反復的に細胞活性の測定を行うこ
とができる。

【００１３】したがって、細胞活性測定を効率よく行う
ことができ、測定を短時間でかつ少ない誤差で達成する
ことができ、しかも、途中経過を観察し続けることがで
きる。特に、細胞の毒性からの回復過程の測定を達成す
ることができる。請求項２の細胞活性測定装置であれ
ば、第２測定セルの数が複数であり、それぞれの液体培
地に互いに異なる濃度の薬剤が添加されているのである
から、薬剤の有効濃度を測定することができるほか、請
求項１と同様の作用を達成することができる。

【００１４】請求項３の細胞活性測定装置であれば、第
１測定セルおよび第２測定セルを支持するカセットをさ
らに含み、カセットに支持された両測定セルに液体培
地、測定対象物質、測定対象細胞を供給する供給部をさ
らに含むのであるから、細胞活性の測定を簡単に自動化
することができるほか、請求項２と同様の作用を達成す
ることができる。

【００１５】請求項４の細胞活性測定装置であれば、カ
セットに支持された両測定セルの数と等しい個数の酸素
電極が一体的に形成されているとともに、カセットに支
持された両測定セルの液体培地中の溶存酸素量を同時に
測定できるように相対位置が設定されているのであるか
ら、全ての測定セルの液体培地中の溶存酸素量を同時に
測定することができるほか、請求項３と同様の作用を達
成することができる。

【００１６】請求項５の細胞活性測定装置であれば、酸
素電極として、少なくとも作用極および対極を有するも
のを採用し、作用極および対極として金、白金もしくは
銀をカーボンで覆ったものからなるものを採用するので
あるから、作用極および対極として銀からなるものを採
用する場合に問題になる、銀の溶出に起因する細胞毒性
の影響を皆無にすることができるほか、請求項４と同様
の作用を達成することができる。

【００１７】

【発明の実施の態様】以下、添付図面を参照しながらこ
の発明の細胞活性測定装置の実施態様を詳細に説明す
る。図１はこの発明の細胞活性測定装置の一実施態様を
示す概略図である。この細胞活性測定装置は、予め多数
の測定セルが収容されたカセット１を上下方向に複数個
積重状態で収容するカセットマガジン２と、カセットマ
ガジン２内の最も下部のカセット１を押し出すプッシャ
ー３と、カセット１の各測定セルに液体培地、毒性物
質、希釈液、細胞などを分注する分注部５と、カセット
１を収容して、各測定セル内の細胞の培養を行わせる培
養部１１と、カセット１の各測定セルにそれぞれ酸素電
極を挿入する電極挿入部１８と、酸素電極から出力され
る電気信号を入力として所定のデータ処理を行い、細胞
活性測定結果を出力するデータ処理部１６と、酸素電極
とデータ処理部１６との間の電気的接続を行わせる電極
接続部（測定部）１５と、カセット１の各測定セルから
それぞれ酸素電極を回収する電極回収部１７と、酸素電
極が回収された後のカセット１を回収する廃棄カセット
マガジン２０と、カセット１を搬送するためのコンベア
４、１３、１４、１９、２１と、培養部１１に対するカ
セット１の出し入れを行わせるための出し入れ部１２と
を有している。なお、７は液体培地供給部、８は毒性物
質供給部、９は希釈液供給部、１０は細胞供給部であ
る。前記コンベア２１は、酸素電極が回収された後のカ
セット１を再び培養部１１に搬送するためのものであ
る。

【００１８】図２は酸素電極２２の一構成例を概略的に
示す正面図である。この酸素電極２２は、セラミック
ス、プラスチックスなどからなる絶縁性基板２２ａの表
面所定位置に作用極２２ｂ、対極２２ｃ、および参照極
２２ｄを設けているとともに、これらの極とそれぞれ電
気的に接続された配線を設けている。そして、各配線の
端部に引き出し線２２ｅの一方の端部を電気的に接続
し、各引き出し線２２ｅの他方の端部に外部接続用の端
子２２ｆを電気的に接続している。ここで、一般的に
は、作用極２２ｂとして金、白金などの貴金属、炭素な
どからなるもの、対極２２ｃ、および参照極２２ｄとし
て銀からなるものが採用されているが、毒性からの回復
を測定する場合には、対極２２ｃとして金、白金、銀を
炭素で覆ったものなどからなるものを採用し、酸素測定
の際に陽極となる対極２２ｃからの銀の溶出を回避する
ことが好ましい。なお、参照極２２ｄとして銀以外の材
質からなるものを採用することができる。ただし、この
材質としては、銀と同様に電位の安定したものを採用す
ればよい。また、作用極２２ｂ、対極２２ｃとしては、
金、白金、炭素以外の導体であって、細胞への毒性が少
ないものからなるものを採用することが可能である。さ
らに、酸素電極２２のコストを低減する場合などには、
銀ペーストの印刷により作用極２２ｂ、対極２２ｃ、お
よび参照極２２ｄを形成し、作用極２２ｂ、対極２２ｃ
に対応する銀を覆うようにカーボンペーストを印刷する
ようにすればよい。

【００１９】上記の構成の細胞活性測定装置の作用は次
のとおりである。予め多数の測定セルが収容されたカセ
ット１がカセットマガジン２に上下方向に複数個積重状
態で収容されているので、プッシャー３を動作させるこ
とにより、カセットマガジン２内の最も下部のカセット
１を押し出すことができる。このカセット１は、コンベ
ア４によって分注部５に搬送され、分注部５において、
カセット１の各測定セルに対して液体培地供給部７から
液体培地が、毒性物質供給部８から毒性物質が、希釈液
供給部９から希釈液が、細胞供給部１０から細胞がそれ
ぞれ分注される。このように各測定セルに液体培地、毒
性物質、希釈液、細胞が供給されたカセット１を培養部
１１に供給することにより、所定時間にわたって各測定
セル内の細胞の培養を行わせる。培養部１１において細
胞の培養を行えば、毒性物質が細胞に対して毒性を示す
場合に、細胞の増殖が皆無になるか、もしくは著しく少
なくなる。逆に、毒性物質が細胞に対して毒性を示さな
い場合に、細胞の増殖が多くなる。この結果、前者の場
合には、細胞の呼吸が全くないか、もしくは著しく少な
いので、液体培地中の溶存酸素量が多く、後者の場合に
は、細胞の呼吸が多いので液体培地中の溶存酸素量が著
しく少なくなる。

【００２０】したがって、電極挿入部１８によってカセ
ット１の各測定セルにそれぞれ酸素電極を挿入し、電極
接続部１５によって酸素電極とデータ処理部１６との間
の電気的接続を行わせることにより、データ処理部１６
において、酸素電極から出力される電気信号を入力とし
て所定のデータ処理を行い、細胞活性測定結果を出力す
ることができる。具体的には、例えば、少なくとも１つ
の測定セル（第１測定セル）に毒性物質を分注せず、こ
の第１測定セルの液体培地中の溶存酸素量と、他の測定
セル（第２測定セル）に毒性物質を分注し、この第２測
定セルの液体培地中の溶存酸素量とを酸素電極２２を用
いて測定し、測定された両溶存酸素両間に有意な差が存
在するか否かを判定することにより、細胞活性の有無
（毒性物質の影響を受けないか否か）を判定することが
できる。また、第２測定セルの数を増加させ、それぞれ
に互いに異なる濃度（量）の毒性物質を分注し、有意な
差が発生する限界となる第２測定セルを検出することに
より、細胞活性の程度（毒性物質の影響を受ける最小濃
度）を測定することができる。

【００２１】その後は、電極回収部１７において、カセ
ット１の各測定セルからそれぞれ酸素電極を回収し、廃
棄カセットマガジン２０において、酸素電極が回収され
た後のカセット１を回収することができる。ただし、コ
ンベア２１によって、酸素電極が回収された後のカセッ
ト１を再び培養部１１に搬送することができ、この場合
には、細胞の培養を断続的に継続しながら細胞活性の測
定を行うことができる。したがって、細胞培養の途中段
階での細胞活性の測定を行うことができ、またある程度
毒性物質の影響を受けた後ろに細胞活性が回復する過程
での細胞活性の測定を行うことができる。

【００２２】また、多数の測定セルを収容したカセット
１を順次搬送しながら測定を行うのであるから、多数の
測定を同時に、かつ短時間で効率よく達成することがで
きる。図３は酸素電極の他の構成例を示す概略図であ
る。ただし、右半分が正面図を、左半分が背面図をそれ
ぞれ示している。

【００２３】この酸素電極は、櫛歯状の複数の突出部を
有する絶縁性基板を採用し、各突出部にそれぞれ作用
極、対極および参照極を設け、絶縁性基板のうち、突出
部と反対側の所定位置にコネクタとの電気的接続を達成
するための引き出し電極を設けている。ただし、作用極
および参照極が突出部の正面側に、対極が突出部の背面
側に設けられている。

【００２４】したがって、この構成の酸素電極を採用す
れば、複数個の測定セルに対して同時に酸素電極の挿
入、回収を行うことができ（図４および図５参照）、酸
素電極を挿入し、回収するための機構を簡単化すること
ができる。なお、図４、図５において、２３が測定セル
を示している。図６は酸素電極のさらに他の構成例を概
略的に示す斜視図である。

【００２５】この酸素電極は、Ｕ字状に湾曲形成された
絶縁性基板の両端部に櫛歯状の複数の突出部を形成し、
各突出部にそれぞれ作用極（図示せず）、対極（図示せ
ず）および参照極（図示せず）を設けている。また、突
出部以外の所定位置に引き出し電極（図示せず）を設け
ている。したがって、この構成の酸素電極を採用すれ
ば、測定セルに対して同時に挿入、回収を行うことがで
きる酸素電極の数を図３の構成例と比較して増加させる
ことができ、酸素電極を挿入し、回収するための機構を
一層簡単化することができる。

【００２６】図７は図１の装置および図２の酸素電極を
用いてガン細胞の細胞活性を測定した結果を示す図であ
る。なお、毒性物質として、１％エタノールを採用し
た。また、図７中、白丸がガン細胞および液体培地を分
注した場合を、白三角がガン細胞、１％エタノールおよ
び液体培地を分注した場合を、黒丸が１％エタノールお
よび液体培地を分注した場合を、黒三角が液体培地のみ
を分注した場合をそれぞれ示している。

【００２７】図７から明らかなように、黒丸と黒三角の
場合には、溶存酸素を消費するガン細胞が全く含まれて
いないので、溶存酸素量が殆ど減少してないことが分か
る。また、白丸は溶存酸素を消費するガン細胞が含まれ
ているだけであるから、次官の経過と共に溶存酸素量が
減少するのに対して、白三角はさらに１％エタノールが
添加されているので、ガン細胞の呼吸が１％エタノール
により阻害され、白丸の場合と比較して溶存酸素量の減
少の程度がかなり少なく、両者を明確に区別することが
できる。また、所要時間が１０分程度でよく、細胞活性
を迅速に測定できることが分かる。

【００２８】

【発明の効果】請求項１の発明は、細胞活性測定を効率
よく行うことができ、測定を短時間でかつ少ない誤差で
達成することができ、しかも、途中経過を観察し続ける
ことができるという特有の効果を奏する。請求項２の発
明は、薬剤の有効濃度を測定することができるほか、請
求項１と同様の効果を奏する。

【００２９】請求項３の発明は、細胞活性の測定を簡単
に自動化することができるほか、請求項２と同様の効果
を奏する。請求項４の発明は、全ての測定セルの液体培
地中の溶存酸素量を同時に測定することができるほか、
請求項３と同様の効果を奏する。請求項５の発明は、作
用極および対極として銀からなるものを採用する場合に
問題になる、銀の溶出に起因する細胞毒性の影響を皆無
にすることができるほか、請求項４と同様の効果を奏す
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明の細胞活性測定装置の一実施態様を示
す概略図である。

【図２】酸素電極の一構成例を概略的に示す正面図であ
る。

【図３】酸素電極の他の構成例を概略的に示す正面図で
ある。

【図４】図３の酸素電極をカセットの測定セルに挿入す
る状態を示す概略斜視図である。

【図５】図３の酸素電極をカセットの全ての測定セルに
挿入する状態を示す概略斜視図である。

【図６】酸素電極のさらに他の構成例を概略的に示す斜
視図である。

【図７】図１の装置および図２の酸素電極を用いてガン
細胞の細胞活性を測定した結果を示す図である。

【図８】ＭＴＴアッセイ法を説明するフローチャートで
ある。

【符号の説明】

１カセット５分注部１１培養部１５電極接続部１６データ処理部２１コンベア２２酸素電極２２ｂ作用極２２ｃ対極２２ｄ参照極２３測定セル

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者奥村千晶茨城県つくば市御幸が丘３番地ダイキン工業株式会社内 (72)発明者天野義久茨城県つくば市御幸が丘３番地ダイキン工業株式会社内 (72)発明者新井潤一郎茨城県つくば市御幸が丘３番地ダイキン工業株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】測定対象細胞が添加された液体培地を収
容する第１測定セル（２３）と、測定対象細胞および測
定対象物質が添加された液体培地を収容する第２測定セ
ル（２３）と、両測定セル（２３）を収容して液体培地
中の測定対象細胞の培養を行わせる培養部（１１）と、
所定時間の培養後に、培養部から取り出された両測定セ
ル（２３）の液体培地中の溶存酸素量を酸素電極（２
２）を用いて測定する測定部（１５）と、酸素電極（２
２）から出力される電気信号を入力として所定の処理を
行なって細胞活性測定結果を出力するデータ処理部（１
６）と、培養部（１１）と測定部（１５）との間で両測
定セルを循環させる循環部（２１）とを含むことを特徴
とする細胞活性測定装置。
【請求項２】第２測定セル（２３）の数が複数であ
り、それぞれの液体培地に互いに異なる濃度の薬剤が添
加されている請求項１に記載の細胞活性測定装置。
【請求項３】第１測定セル（２３）および第２測定セ
ル（２３）を支持するカセット（１）をさらに含み、カ
セット（１）に支持された両測定セル（２３）に液体培
地、測定対象物質、測定対象細胞を供給する供給部
（５）をさらに含む請求項２に記載の細胞活性測定装
置。
【請求項４】カセット（１）に支持された両測定セル
（２３）の数と等しい個数の酸素電極（２２）が一体的
に形成されているとともに、カセット（１）に支持され
た両測定セル（２３）の液体培地中の溶存酸素量を同時
に測定できるように相対位置が設定されている請求項３
に記載の細胞活性測定装置。
【請求項５】少なくとも作用極（２２ｂ）および対極
（２２ｃ）を有するものであり、作用極（２２ｂ）およ
び対極（２２ｃ）は金、白金もしくは銀をカーボンで覆
ったものからなるものである請求項１から請求項４の何
れかに記載の細胞活性測定装置。