JPH10265498A

JPH10265498A - ヒト尿由来の神経グリア細胞増殖因子とその製造法

Info

Publication number: JPH10265498A
Application number: JP9090305A
Authority: JP
Inventors: Shoichiro Kamei; 正一郎亀井; Kiyoshi Kirihara; 清桐原; Rie Nishinaka; 理恵西中; Hiroyuki Kino; 浩之城野; Junichi Koga; 淳一古賀
Original assignee: NIPPON CHEM RES KK; JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: NIPPON CHEM RES KK; JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 1997-03-24
Filing date: 1997-03-24
Publication date: 1998-10-06

Abstract

(57)【要約】【目的】ヒト尿に存在する新規なグリア細胞増殖因子
とその製造法を提供すること。【構成】ヒト尿から限外ろ過、硫安による塩析、ゲル
ろ過、イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相クロマ
トグラフィーにより精製することができ、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによる分子量が約２９ｋＤａである神経グリア細胞
増殖因子。【効果】本発明のグリア細胞増殖因子はグリア細胞を
増殖させる作用のほか同細胞のＮＧＦ因子分泌を促進さ
せ、また神経細胞のコリンアセチルトランスフェラーゼ
活性を増殖させる作用を示し、種々の神経系疾患の治療
への用途が期待され、また同因子を遺伝子工学の手法に
よって製造する途が開かれる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は神経細胞の一部であ
るグリア細胞の新規な増殖因子に関し、この因子は種々
の神経系疾患の治療に応用されうるものである。

【０００２】

【従来の技術と発明が解決しようとする課題】神経系は
神経細胞（ニューロン）とグリア細胞から構成され、そ
の神経細胞は細胞本体と他の神経細胞に情報を伝える突
起細胞からなり、突起の接着部（シナプス）を通じて神
経情報が次の神経細胞に伝えられる。グリア細胞の役割
は、一般に神経細胞への栄養供給として知られ、オート
クリン的及びパラクリン的に神経栄養因子を分泌して、
神経細胞の分化、成長、生存維持を調節している。中枢
神経系のグリア細胞種としてはアストロサイト、オリゴ
デンドロサイト、ミクログリア細胞があり、また末梢神
経系にはシュワン細胞などが存在している。

【０００３】神経系に於いて、神経細胞は出生後に増殖
を止めるが、グリア細胞は絶えず分化、増殖、成長を繰
り返すことを特徴としている。グリア細胞種であるシュ
ワン細胞は末梢神経の神経軸索の周囲にミエリン梢を形
成して神経細胞を支持し、この様なミエリン梢の弱体化
は、即ちシュワン細胞の損傷や成長不全は、末梢神経系
の疾患に深く関連していると推察されている。

【０００４】神経細胞系の発達、恒常性の維持や機能は
宿主の神経栄養因子に媒介される細胞間の相互作用によ
り調節されている〔Ｔ．Ｅｂｅｎｄａｌ，ｅｔａ
ｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃ
ｅＲｅｓｅａｒｃｈ４０，２７６−２８４，１９９
５〕。それらの神経栄養因子としてＮＧＦ、脳由来神経
栄養因子としてＢＤＮＦ、ニューロトロフィンとしてＮ
Ｔ−３、ＮＴ−４、グリア細胞由来の神経発育因子も報
告され、またシュワン細胞由来神経発育因子などが知ら
れている。

【０００５】現在の医療で治癒困難とされている、アル
ツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮側索硬化症など
の各種の神経疾患の細胞レベルでの特徴は、神経細胞の
顕著な脱落・消失であることが確認されている。この様
な理由で、神経細胞の生存維持が病状の軽減やその進行
を遅延させると推察される。脳神経系の細胞の死滅を防
ぐには、これらの細胞の賦活化が効果的であり、特に細
胞数で神経細胞の約１０倍を占めて増殖・分化能力を有
するグリア細胞を賦活化することが出来れば神経細胞の
賦活、生存維持が神経疾患の重要な改善方策になると期
待されるが、未だグリア細胞を賦活し、維持する有効な
手段は知られていない。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これまで
にラット胚・脳中隔野神経細胞を用いた生物活性スクリ
ーニング系を確立し、これを用いてヒト生体由来の画分
中の神経栄養活性の存在について検索した。その結果、
ヒト尿画分に神経細胞のコリンアセチルトランスフェラ
ーゼ（ＣｈＡＴ）活性を増加させる物質を見いだし、単
離、精製を行った。

【０００７】すなわち、本発明者らは、ラット胚・脳中
隔野神経細胞の初代培養系を用い、尿・血液などの生体
画分の神経栄養活性について探索した結果、ヒト尿ＨＰ
Ａ２５樹脂非吸着画分に神経細胞のＣｈＡＴ活性を増加
させる活性が存在することを発見し、その活性因子の単
離・精製することに成功した。具体的には、尿を限外ろ
過膜（Ｍ．Ｗ，５０，０００ｃｕｔｏｆｆ）でろ過
し、そのろ過液を２．２−２．９Ｍの硫酸アンモニウム
で塩析し、沈澱物を溶解してＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００
を用いるゲルろ過クロマトグラフィーで処理した（図
１）。ＣｈＡＴ活性画分を集めて、アニオン交換クロマ
トグラフィー及び逆相クロマトグラフィーで精製し、凍
結乾燥処理して活性なグリア細胞増殖因子を得た。精製
した活性因子はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量約２９ｋＤａ
付近にブロードなバンドを示し（図３）、逆相液体クロ
マトグラフィーで一つのピークを示した（図２）。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにおいて幅広いバンドを示すために、活性
因子の蛋白質に糖鎖が結合していると推察される。バン
ドは、β−メルカプトエタノールの有無にかかわらず、
分子量の位置に変化は見られず、したがって単量体のポ
リペプチドから構成されていることを示した（図３）。

【０００８】ヒト尿より本発明の細胞増殖因子を単離・
精製するには、公知の分離精製方法を適切に組み合わせ
て行うことができる。塩析や沈澱法などの溶解度を利用
する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子
量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィ
ー、等電点電気泳動などの電荷の差を利用する方法、ア
フィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を
利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの
疎水性の差を利用する方法などが挙げられる。この様な
操作で、効率よく該蛋白質の濃縮、精製を行うことが可
能である。

【０００９】本活性因子のＮ−末端アミノ酸配列の３９
残基の配列が決定された（図６、図７）。この配列につ
いてＳｗｉｓｓ−Ｐｌｏｔアミノ酸配列データベースと
のホモロジー検索で、新規な蛋白質であることが判明し
た。Ｎ−末端のアミノ酸について二種類のセリンとチロ
シンが認められ、二番目のアミノ酸残基以下が１種類の
アミノ酸配列が認められるために、２種類の変異体が存
在すると考えられる。

【００１０】本発明の活性化因子をラット胚・脳中隔野
神経細胞の初代培養系に添加すると（最終濃度０．００
１Ｏ．Ｄ．ｕｎｉｔ／ｍｌ）、神経細胞のＣｈＡＴ活
性を増加し、グリア細胞の増殖を示した（図４
（ａ））。本活性因子とＤＮＡ合成阻害剤のシトシンア
ラビノシド〔Ｃｙｔｏｓｉｎｅａｒａｂｉｎｏｓｉｄ
ｅ（ＡｒａＣ）〕を同時に添加すると増殖は抑制され
た（図４（ｂ））。培養に無血清培地Ｎｅｕｒｏｂａ
ｓａｌ（商標、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いるため、本
来の細胞の増殖は抑制される（図４（ｃ））〔Ｇ．Ｊ．
Ｄｒｅｗｒｅｔａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅ
ｓ．，３５：５６７（１９９３）〕。また、神経細胞と
グリア細胞の初代培養細胞を血清除去の培地で本活性因
子の添加の有無の条件で培養し、培養５日間で顕著な細
胞増加数をＭＴＴ法により確認した（図５）。本活性因
子添加の条件下では、経時的に細胞数の増加が認めら
れ、その無添加の条件では細胞数に殆ど変化が検出され
ない。

【００１１】本活性因子を他の細胞種、例えば神経芽細
胞腫のＧｏｌｏ細胞に、無血清培地下で添加しても細胞
増殖は示されず、本活性因子が細胞種特異性をもつこと
を示した。グリア細胞が増殖していることを確認する一
つの方法として、細胞の免疫染色を行った。グリア細胞
のアストロサイトに極在する蛋白質〔Ｇｌｉａｌｆｉ
ｂｒｉｌｌａｒｙａｃｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎ（Ｇ
ＦＡＰ）〕に対し、酵素β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓ
ｅを結合した抗ＧＦＡＰ抗体を反応染色させることによ
りアストロサイトを確認できる。増殖細胞をこの抗体で
処理すると、増殖した細胞の約半分が染色された。増殖
した細胞の半分がアストロサイトで、抗ＧＦＡＰ抗体で
染色しない細胞は、その形態よりＯ−２Ａ幹細胞（アス
トロサイト−タイプIIとオリゴデンドロサイトの幹細
胞）であることを示した（実施例３）。

【００１２】本活性因子を神経培養に添加し、神経細胞
のＣｈＡＴ活性の培養日数に従う変化を測定した（図
８）。本活性化因子を添加することにより、培養６日目
以降著しくＣｈＡＴ活性の増加を示した。本活性化因子
とＤＮＡ合成阻害剤のＡｒａＣを加えると、グリア細胞
の増殖と神経細胞のＣｈＡＴの増加が抑制された。Ａｒ
ａＣのみの添加の場合と活性因子の無添加の場合で
は、ＣｈＡＴ活性に変化が無く、これらの結果はＡｒａ
Ｃ自体が神経細胞のＣｈＡＴ活性を抑制しないことを
示している。この様にグリア細胞の増殖と神経細胞のＣ
ｈＡＴ活性の増加に正の相関関係があり、グリア細胞の
増殖により、グリア細胞由来の神経栄養因子量が増大し
ていると推察された。

【００１３】これまでにグリア細胞由来の神経栄養因子
として神経成長因子（ＮＧＦ）、Ｇｌｉａｃｅｌｌ
ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ
ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ）等が知られている。そこ
で、ＮＧＦに対する中和抗体を本活性因子とともに加え
てＣｈＡＴ活性を比較すると、神経細胞のＣｈＡＴ活性
の増加は顕著に抑制された（図９）。このとき、グリア
細胞の増殖の抑制は認められない。ＮＧＦ抗体（１ｕｇ
／ｍｌ）添加で本活性因子のＣｈＡＴに対する効果は抑
制され、ＮＧＦ抗体のみではＣｈＡＴ活性に変化はみら
れず、神経細胞のＣｈＡＴ活性の増加が、グリア細胞の
増殖に伴ったグリア細胞由来のＮＧＦの増加に原因する
ことを示している。

【００１４】本活性因子は、神経栄養活性を指標に精製
したが、栄養活性は常にグリア細胞の増殖とともに示さ
れた。ＤＮＡ合成阻害剤の同時添加によりグリア細胞の
増殖を抑制した場合、神経細胞のＣｈＡＴ活性の増加は
見られず、本活性因子は神経細胞に間接的に作用してい
ると考えられる。従って、本活性因子の添加によるＣｈ
ＡＴ活性の増加は、本因子によるグリア細胞の増殖促進
に伴いグリア細胞由来の栄養因子の増加により促進され
た結果である。

【００１５】本発明は本活性因子のＮ−末端側アミノ酸
配列を含有するグリア細胞増殖因子を含み、また、本活
性因子のＮ−末端側アミノ酸配列をコードするデオキシ
リポヌクレオチド配列を含有するグリア細胞増殖因子の
デオキシリポヌクレオチド配列を含む。さらに、グリア
細胞増殖因子のｃＤＮＡを得ることで、大腸菌や酵母な
どの微生物、哺乳動物の細胞を利用して遺伝子工学的に
生産が容易に可能である。グリア細胞増殖因子のｃＤＮ
Ａに人為的にアミノ酸の欠損、置換、附加などの操作に
より実質的にそれの生物活性を維持したグリア細胞増殖
因子の誘導体を製造可能である。

【００１６】神経系細胞由来の蛋白質・ペプチドである
神経栄養因子はこれまでに数種類見いだされているが、
これらの栄養因子の血流から脳への投与は脳関門で阻止
されるために、困難と見なされている。本発明の活性化
因子は、尿由来であり、組織への直接投与だけでなく血
管投与などの全身的な投与法の可能性を示唆し、脳神経
及び抹消神経の種々の疾患の治療薬になると期待され
る。

【００１７】

【発明の実施の形態】本発明の活性因子は、たとえば、
ヒト尿をキトサンや陰イオン交換樹脂のような吸着剤へ
の吸着、溶出により予備処理したのち限外ろ過し、ろ液
を硫酸アンモニウムで塩析し、沈澱を緩衝液に溶解して
ゲルろ過してＣｈＡＴ活性画分を集め、陰イオン交換樹
脂を用いるクロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフ
ィーによって精製物として得ることができる。

【００１８】

【実施例】以下に実施例の形で本発明をさらに具体的に
説明する。

【００１９】実施例１活性因子の精製材料ヒト尿、硫酸アンモニウム（日産化学または和光純
薬）、リン酸二水素ナトリウム二水和物（ナカライテス
ク）、塩化ナトリウム（和光純薬）、エチレンジアミン
四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ−２Ｎａ）（同仁化
学）、フッ化フェニルメチルスルフォニル（ナカライテ
スク）、ＰＢＳ（−）（日水製薬）、トリフルオロ酢酸
（ナカライテスク）、高速液体クロマトグラフィー用ア
セトニトリル（和光純薬）、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣｃｏ
ｌｕｍｎ２１８ＴＰ５４（Ｖｙｄａｃ）、Ｈｉｔｒａｐ
−Ｑ〔Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）〕、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）。

【００２０】操作濃縮したヒト尿を、キトサンに吸着、溶出した後に、６
０％飽和濃度の硫酸アンモニウムで硫安分画し、０．１
ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．５）で平衡化したＨＰＡ２５陰イオン交換樹
脂に通した。樹脂への非吸着画分１Ｌを分画分子量５
０，０００のＯＭＥＧＡＣＥＬＬ（ＦＩＬＴＲＯＮ）
を用いて限外ろ過した。ろ液に最終濃度２．２Ｍ（約５
５％飽和）になるように硫酸アンモニウムを加え、３０
分穏やかに攪拌した。攪拌後、５，０００ｘｇで１時間
遠心し、その上清を回収した。上清に最終濃度２．９Ｍ
（約７４％飽和）になるように硫酸アンモニウムを加
え、再度３０分間穏やかに攪拌し、５，０００ｘｇで１
時間遠心して沈澱を回収した。沈澱物を１０−１５ｍｌ
のＰＢＳ（−）に溶解した後に、ＰＢＳ（−）で平衡化
したＨｉＬｏａｄ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２
００ｐｇ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で流速２ｍｌ／ｍｉｎ
でゲルろ過した。ＣｈＡＴ活性画分は、０．７５Ｃ．
Ｖ．（ｃｏｌｕｍｎｖｏｌｕｍｅ）−０．９４Ｃ．
Ｖ．に溶出した（図１）。その活性画分を等量の１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）と混合し、７５ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤ
ＴＡを含む１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化したＨｉ−ＴｒａｐＱ５ｍｌ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）に吸着させた。ＮａＣｌ濃度を１３０ｍ
Ｍとした溶液でカラムを洗浄した後に、ＮａＣｌ濃度を
１６０ｍＭとした溶液で活性成分を溶出した。

【００２１】活性画分をさらに逆相高速液体クロマトグ
ラフィー（逆相ＨＰＬＣ）により精製した。カラムはＣ
１８Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ５４（Ｖｙｄａｃ）を用
い、溶媒に０．１％トリフルオロ酢酸を含むＭｉｌｌｉ
−Ｑ水−アセトニトリル系を用いた。流速は１ｍｌ／
ｍｉｎとし、溶出物の検出は波長２１４ｎｍにおける吸
光度で測定した。活性は５３−５４％アセトニトリル溶
出画分に示される（図２上部）。画分を回収し、凍結乾
燥した後に再度逆相ＨＰＬＣで精製した。最終的に逆相
ＨＰＬＣにおいて一本のピークのみを示す活性画分が得
られた（図２下部）。以上の精製操作を室温で行った。
上記の逆相ＨＰＬＣの詳細を次に記す。

【００２２】逆相ＨＰＬＣ（図２）材料トリフルオロ酢酸（ナカライテスク）、高速液体クロマ
トグラフィー用アセトニトリル（和光純薬）、Ｃ１８逆
相ＨＰＬＣｃｏｌｕｍｎ２１８ＴＰ５４（Ｖｙｄａ
ｃ）。操作溶媒に０．１％トリフルオロ酢酸を含むＭｉｌｌｉ−Ｑ
水−アセトニトリル系を用い、流速を１ｍｌ／ｍｉｎと
した。０．１％トリフルオロ酢酸、５％アセトニトリル
を含むＭｉｌｌｉ−Ｑ水で平衡化したＣ１８逆相ＨＰＬ
Ｃｃｏｌｕｍｎ２１８ＴＰ５４で、０．１％トリフル
オロ酢酸を含むＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解した活性因子を
移動分離した。図２の破線で示す様に、５−７０％のア
セトニトリルの濃度勾配で溶出し、溶出物を波長２１４
ｎｍで検出して、本活性因子のシャープなピークを認め
た。

【００２３】実施例２ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３）材料酢酸（和光純薬）、メタノール（和光純薬）、濃度勾配
１５−２５％ポリアクリルアミドゲル「マルチゲル１５
／２５」（第一化学薬品）、クマーシーブリリアントブ
ルー（ＣＢＢ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、銀染色試薬「第
一」（第一化学薬品）、分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ）。操作逆相ＨＰＬＣによって精製した活性因子をトリス−ＳＤ
Ｓ溶液に溶解後に、９０℃、２分間の熱処理を行い、こ
れをＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の試料とした。試料を濃度勾配
１５−２５％のポリアクリルアミドゲル上で、４０ｍＡ
の定電流下、泳動した。泳動後にゲルをＣＢＢ染色及び
銀染色した。ＣＢＢ染色では、０．２５％ＣＢＢ（Ｗ
／Ｖ）を含むメタノール：酢酸：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水
（９：２：９）の混合液に浸し染色後、メタノール：酢
酸：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（１５：１０：７５）混合液で脱
色した。銀染色は、第一化学薬品社の銀染色試薬を用
い、添付の手順書に従って染色した。分子量約２９ｋＤ
ａ付近にブロードな蛋白質バンドが認められ、β−メル
カプトエタノールによる還元及び非還元条件下で蛋白質
バンドに変化が見られず、本活性化因子は単量体のポリ
ペプチドであることを示した。

【００２４】実施例３グリア細胞増殖因子のＮ−末端側のアミノ酸配列の決定逆相ＨＰＬＣで精製した本活性因子を凍結乾燥した後に
０．１％トリフルオロ酢酸を含むＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶
解してＮ−末端アミノ酸配列決定用の試料とした。Ｎ−
末端アミノ酸配列の決定は、気相シーケンサーモデル４
７６Ａ（ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ）を用いた。アミノ
酸配列のホモロジー検索にインターネットを通じた検索
プログラムＢＬＳＴ及びＤＮＡＳＩＳを用いた。Ｎ−末
端がチロシンとセリンの二種のポリペプチドが見いださ
れた。

【００２５】

【図６】

【図７】

【００２６】実施例４ラット胚・脳中隔野神経細胞の
初代培養材料胎生１７日目ラット胚、Ｌ−１５ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉ
ｂｃｏＢＲＬ）、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌｍｅｄｉｕ
ｍ（ＧｉｂｃｏＲＲＬ）、ＰＢＳ（−）（ニッス
イ）、Ｂ−２７ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｉ（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ）、Ｌ−グルタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、ゲ
ンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）、ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ）、パパイン（和光純薬）、ＤＬ−システイン
ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍ
ａ）、グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、エーテル（和光純
薬）、ナイロンメッシュ（ＣＥＬＬＳＴＲＡＩＮＥＲ
１００ｕｍｍｅｓｈ：Ｆａｌｃｏｎ）、ポリ−Ｌ−
リジンコートプレート（セルタイトＰＬプレート：住
友ベークライト）、シトシンアラビノシド（Ｓｉｇｍ
ａ）。

【００２７】操作妊娠１７日目のラットをエーテルにより麻酔後、腹部を
切開して胎児の入っている子宮を摘出した。子宮よりラ
ット胚を取り出し、その胚から脳・中隔野を摘出した。
中隔野を細胞分散用酵素液（９０ｕｎｉｔｓＰａｐａ
ｉｎ、０．０１％ＤＮａｓｅＩをＤＬ−システイン
ＨＣｌ２ｍｇ、ウシ血清アルブミン２ｍｇ、グルコー
ス５０ｍｇを含むＰＢＳ（−）１０ｍｌに溶解した液に
浸し、３７℃、１５分間処理後に、ウマ血清で酵素反応
を止め、ピペッティング操作により細胞を分散した。１
０分間室温で静置後、１００ｕｍｍｅｓｈのナイロン
メッシュ（ＣＥＬＬＳＴＲＡＩＮＥＲ：Ｆａｌｃｏ
ｎ）でろ過して細胞塊や破砕した細胞から漏出したＤＮ
Ａを除去した。得られた細胞は、ポリ−Ｌ−リジンコー
トプレート（住友ベークライト）に２０×１０⁴ｃｅ
ｌｌ／ｃｍ²の密度で蒔く。培地に２ｍＭＬ−グルタ
ミン、０．１ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを含む無血清培
地Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ）に添加物Ｂ−２７（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を
加えたものを用い、神経細胞を５％ＣＯ₂存在下、３
７℃で培養した。本活性因子を神経細胞の培養開始時に
添加して、適当な日数培養した後に、下記するように細
胞増殖と神経細胞のコリンアセチルトランスフェラーゼ
の活性を測定した。本活性因子とともに、ＤＮＡ合成阻
害剤シトシンアラビノシドを添加した細胞群でも同様な
測定をした。本活性因子を添加すると細胞のコリンアセ
チルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）活性が増加し細胞
の増殖が示され、本活性因子と共にシトシンアラビノシ
ドを添加すると増殖は阻害された（図４、図８）。

【００２８】細胞増殖測定（ＭＴＴ法）材料９６穴プレートで培養した中隔野神経細胞の初代培養細
胞、細胞増殖測定キットＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６
（Ｐｒｏｍｅｇａ）、プレートリーダーＳＰＥＣＴＲ
ＡＭＡＸ２５０（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃ
ｅ）。操作摘出したラット胚・脳中隔野神経細胞を２０×１０⁴ｃ
ｅｌｌ／ｃｍ²の密度で９６穴のポリ−Ｌ−リジンコー
トプレート（住友ベークライト）に蒔き、５％ＣＯ₂、
３７℃の条件で目的の日数培養した後に、細胞増殖を測
定した。反応は、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＣｅｌｌＴｉｔ
ｅｒ９６を用いて添付の手順書に従った。反応後にプレ
ートリーダーＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ）を用いて、Ａ₆₇₀−Ａ₆₃₀
ｎｍの差吸光度を測定した。差吸光度を、本活性化因子
の添加有無の培養細胞で比較した。測定は各回毎に細胞
培養の４穴ずつ行い、それらの平均値を求めた（図４、
図５）。

【００２９】コリンアセチルトランスフェラーゼ（Ｃｈ
ＡＴ）活性の測定（図８）材料２４穴プレートで培養した中隔野神経細胞の初代培養細
胞、ＰＢＳ（−）、塩化ナトリウム（和光純薬）、Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００（ナカライテスク）、塩化コリン
（Ｓｉｇｍａ）、ＥＳＥＲＩＮＥ（フィゾスチグミン硫
酸塩：Ｓｉｇｍａ）、〔１−¹⁴Ｃ〕ａｃｅｔｙｌＣｏ
Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、リン酸二水素カリウム（和光
純薬）、テトラフェニルホウ酸ナトリウム（ナカライテ
スク）、液体クロマトブラフィー用アセトニトリル（和
光純薬）、液体シンチレーション用トルエン（ナカライ
テスク）、シンチレーションカウンター（ＢＥＣＫＭＡ
Ｎ）、抗ＮＧＦ中和抗体（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａ
ｎｎｈｅｉｍ）、シトシンアラビノシド（Ｓｉｇｍ
ａ）。

【００３０】操作実施例２に記載の方法で摘出したラット胚中隔野神経細
胞を２４穴ポリ−Ｌ−リジンコートプレートで目的の日
数培養し、プレートの培地を２４Ｇ注射針を付けたアス
ピレーターで吸引除去した。各穴に細胞可溶化液（１Ｍ
ＮａＣｌ、２．５ｇＴｒｉｔｏｎＸ−１００）１０
ｕｌと反応溶液（５０ｍＭＰＢ−ＫｐＨ６．８、０．
２ＭＮａＣｌ、８ｍＭ塩化コリン、１ｍＭＥＤＴ
Ａ、０．１ｍＭエゼリン、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００、２５ｕＭ〔１−¹⁴Ｃ〕ａｃｅｔｙｌＣｏＡ
（２−１０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）１００ｕｌを添加して
３７℃、３０分インキュベートした。反応停止液（５０
ＭＰＢ−ＫｐＨ６．５、１ｍＭＥＤＴＡ）２５０
ｕｌを加えて酵素反応を停止した。反応液３６０ｕｌを
カリグノスト液（０．５％テトラフェニルホウ酸ナトリ
ウム／アセトニトリル溶液）１ｍｌ及び液体シンチレー
ション用トルエン２ｍｌを分注した試験管に加えた。ボ
ルテックスミキサーで１分間攪拌混和し、抽出した。５
０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上層の有機溶媒層１
ｍｌ採取して、シンチレターＵＬＴＩＭＡＧＯＬＤ
（パッカードジャパン）１ｍｌを分注したオムニバイア
ルに加えて混和した。オムニバイアルをラックに並べ、
シンチレーションカウンターで〔１−¹⁴Ｃ〕アセチルコ
リンの放射活性を測定した。本活性化因子を添加した神
経培養細胞と非添加の神経培養細胞のＣｈＡＴ活性を測
定した。また、本活性因子と同時に抗ＮＧＦ中和抗体
（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）またはシ
トシンアラビノシド（Ｓｉｇｍａ）を添加した神経培養
細胞で測定し、本活性因子のみを添加した神経培養細胞
と比較した（図８、図９）。

【００３１】実施例５神経の特異的蛋白質抗体による
免疫染色材料胎生１７日目ラット胚・中隔野神経細胞の初代培養細
胞、Ａｎｔｉ−Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ１６０ｋ
Ｄａ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）、Ａ
ｎｔｉ−ＧｌｉａｌＦｉｂｒｉｌｌａｒｙＡｃｉｄ
ｉｃＰｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）、アルカリフォスファターゼ
標識抗マウスＩｇＧ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＰＢＳ（−）
（ニッスイ）、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、発
色基質溶液ＮＢＴ−ＢＣＩＰｓｔａｂｌｅｍｉｘ
（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、メタノール（和光純薬）、ポ
リ−Ｄ−リジンコートカバースリップ（ＢＩＯＣＯＡ
ＴＣＥＬＬＷＡＲＥ、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ
ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ）。

【００３２】操作実施例４に記載の様に摘出したラット胚中隔野神経細胞
を１２穴プレートにおいて、ポリ−Ｄ−リジンコートカ
バースリップ上に培養した。培養細胞液から培地を除
き、ＰＢＳ（−）で細胞を濯う。予め−２０℃で冷却し
たメタノールを加え、細胞を固定する。カバースリップ
を新しい１２穴プレートへ移し、０．１％ＢＳＡ／ＰＢ
Ｓ（−）を静かに加え、３分間静置した。さらに、０．
１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）１ｍｌの新しいウエルにカ
バースリップを移し、これを３回繰り返した。最後に、
カバースリップをウエルより取り出し、縁をキムワイプ
で拭いてＰＢＳ（−）を取り除く。モイスチャンバー
（チップケース）にカバースリップを移し、１次抗体
（Ａｎｔｉ−Ｎｅｕｒｏ−ｆｉｌａｍｅｎｔ１６０ｋ
ＤａまたはＡｎｔｉ−ＧＦＡＰ）を添加した。３０分室
温に静置した。カバースリップを０．１％ＢＳＡ／Ｐ
ＢＳ（−）１ｍｌで３回洗浄した。最後に、キムワイプ
で縁を拭いて、モイストチャンバーにカバースリップを
移し、２次抗体（アルカリフォスファターゼ標識ａｎｔ
ｉ−マウスＩｇＧ抗体）を添加した。３０分室温に静置
する。カバースリップを０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ
（−）１ｍｌで３回洗浄し、最後にキムワイプで拭った
後に、発色基質溶液ＮＢＴ−ＢＣＩＰｓｔａｂｌｅ
ｍｉｘを添加した。１５分間室温に静置した後に、位相
差顕微鏡で発色を確認後に、ＰＢＳ（−）を分注した新
しいウエルに移し観察した。増殖した細胞の約半分が染
色されアストロサイトであることを示し、染色されない
細胞はその形態からＯ−２Ａ幹細胞であることを示し
た。

【００３３】

【発明の効果】本発明によれば、ヒト尿由来の新規なグ
リア細胞増殖因子が単離され、その分子量及びＮ末端ア
ミノ酸配列等の知見が提供され、同因子の量産への途が
開かれた。同因子はグリア細胞のＮＧＦ因子分泌を促進
させ、ＣｈＡＴ活性を増大させる作用を示すので種々の
神経系疾患の治療に応用されうる。

【図面の簡単な説明】

【図１】陰イオン交換樹脂ＨＰＡ２５非吸着画分を硫安
分画した試料をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｃｏｌｕｍ
ｎ上でゲルろ過したときの本活性因子分画フラクション
の溶出パターン。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇＸＫ２６／６０（３２
０ｍｌ）緩衝液：ＰＢＳ（−）流速：２ｍｌ／ｍｉｎ分画量：４ｍｌ本活性因子は溶出開始から０．７５Ｃ．Ｖ．−０．９４
Ｃ．Ｖ．の灰色分画に溶出。

【図２】ＲＰ−ＨＰＬＣ上での本活性因子のクロマトグ
ラム。カラム：Ｃ１８、ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ５４溶出液Ａ：０．１％ＴＦＡｉｎｍｉｌｌｉ−Ｑ溶出液Ｂ：０．１％ＴＦＡｉｎ７０％アセトニト
リル流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ勾配：破線検出：ＵＶ２１４ｎｍ

【図３】本活性因子のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析の
写真。レーン１：分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）レーン２：非還元、銀染色レーン３：還元、銀染色レーン４：分子量マーカーレーン５：非還元、ＣＢＢ染色レーン６：還元、ＣＢＢ染色

【図４】ラット胚・脳中隔野神経細胞を各添加物存在下
で７日間培養後の細胞の写真。上）本活性化因子を添加した細胞中）本活性化因子と１ｕＭのシトシンアラビノシドを添
加した細胞下）無添加の細胞

【図５】ラット胚・脳中隔野神経細胞を本活性因子の添
加および無添加の下に培養して細胞数の変化をＭＴＴ法
により測定したグラフ。初代培養細胞を２×１０⁴ｃｅ
ｌｌ／ｃｍ²の密度で蒔き、無血清培地Ｎｅｕｒｏｂａ
ｓａｌｍｅｄｉｕｍ下、培養日数に従い測定した。（●）：本活性因子添加（０．００１Ｏ．Ｄ．ｕｎｉ
ｔｓ／ｍｌ）（▲）：本活性因子無添加

【図６】本活性因子のＮ−末端アミノ酸配列。１位がＴ
ｙｒ。

【図７】本活性因子のＮ−末端アミノ酸配列。１位がＳ
ｅｒ。

【図８】神経細胞を血清除去の培地で、種々の項目の条
件で培養したときのアセチルコリントランスフェラーゼ
（ＣｈＡＴ）活性の経時変化を示すグラフ。（●）：本活性因子添加（０．００１Ｏ．Ｄ．ｕｎｉ
ｔｓ／ｍｌ）、（○）：本活性因子無添加、（▲）：本活性因子添加（０．００１Ｏ．Ｄ．ｕｎｉ
ｔｓ／ｍｌ）とシトシンアラビノシド（１ｕＭ）添加（◆）：シトシンアラビノシド（１ｕＭ）添加

【図９】抗ＮＧＦ中和抗体による神経栄養因子効果の阻
害を示す棒グラフ。細胞を血清除去の培地に本活性因子
（０．００１Ｏ．Ｄ．ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）と抗ＮＧＦ
中和抗体を（０、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌ）
を加えて８日間培養し、ＣｈＡＴ活性を測定した。デー
タはＣｈＡＴにより生成した¹⁴Ｃ−ａｃｅｔｙｌｃｈｏ
ｌｉｎｅの放射活性値ＣＰＭで表した３検体の平均値を
測定値とした。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/02 ＡＡＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者古賀淳一神戸市西区狩場台１−30−５

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト尿から限外ろ過、硫安による塩析、
ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相ク
ロマトグラフィーにより精製することができ、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥによる分子量が約２９ｋＤａである神経グリア
細胞増殖因子。
【請求項２】Ｎ−末端のアミノ酸配列が【図６】である請求項１記載の増殖因子。
【請求項３】Ｎ末端のアミノ酸配列が【図７】である請求項１記載の増殖因子。
【請求項４】請求項１の増殖因子よりなるグリア細胞
の神経成長因子の分泌促進剤。
【請求項５】請求項１の増殖因子よりなる神経細胞の
コリンアセチルトランスフェラーゼ活性の増強剤。
【請求項６】請求項２に記載のアミノ酸配列をコード
するデオキシリボヌクレオチド配列を含有する神経グリ
ア細胞増殖因子のデオキシリボヌクレオチド。
【請求項７】請求項３に記載のアミノ酸配列をコード
するデオキシリボヌクレオチド配列を含有する神経グリ
ア細胞増殖因子のデオキシリボヌクレオチド。