JPH10251300A - 低分子の発光タンパク質コンジュゲート - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 動的測定幅、シグナル対ノイズ比、分析感度
に関して性能の向上した検出試薬としての発光タンパク
質コンジュゲートを提供する。 【解決手段】 発光タンパク質と結合相手が１：１で互
いと共有結合しているコンジュゲートを主に含有する、
発光タンパク質と結合相手からなるコンジュゲートの組
成物を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、発光タンパク質と
結合相手からなる新規なコンジュゲートの組成物、並び
にその製造方法に関する。さらに、被検体特異的または
普遍的検出試薬としての本発明によるコンジュゲート組
成物をサンプルと接触させることによるサンプル中の被
検体の検出方法、並びに他の試験成分に加えて、検出試
薬として本発明によるコンジュゲート組成物を含有する
試薬キットを開示する。

【０００２】

【従来の技術】受容体−リガンド結合アッセイという用
語は、２種の分子単位の生物特異的相互作用に基づくあ
らゆるタイプの試験法として理解されている。このよう
な試験法の検出試薬として、しばしば生物特異的反応成
分とシグナル発生成分から構成されたコンジュゲートが
用いられる。この試験法を最適化するために、広範な動
的測定幅、高感度、良好な精度、そして高いシグナル対
ノイズ比を達成するための努力がなされている。そのた
めの重要な必要条件は、コンジュゲートの一方の成分の
生物特異的反応性と他方のシグナル発生成分の標識活性
をいずれも高く保持させることである。

【０００３】この目的のために、コンジュゲートの特異
的反応性または標識活性または両活性がさまざまである
種々の戦略が開発されてきた。例として次のものを挙げ
ることができる。アクリジニウムエステル分子を官能化
リポソーム中に保持させ、それを生物特異的成分とカッ
プリングさせることによるアクリジニウムエステルコン
ジュゲートの化学発光の増幅 (Law ら, J. Bioluminesc
ence and Chemiluminescence 4 (1989), 88-98; 米国特
許第5,449,556 号) 、生物特異的成分と標識成分との多
重共有結合架橋（オリゴマー化）(WO 96/23226) 、ユー
ロピウムキレートによる生物特異的成分の標識化、例え
ばジアゾフェニル-EDTA-ユーロピウムを用いる抗体あた
り３〜４個の標識基、またはp-イソチオシアナトベンジ
ル-EDTA-ユーロピウムを用いる抗体あたり50個までの標
識基 (Hemmila ら, Anal. Biochem. 137 (1984), 335-3
43) またはp-イソチオシアナトベンジル-EDTA-ユーロピ
ウムを用いるオリゴヌクレオチドあたり約20個の標識基
(DELFIA^TM Research Products, 放射能の不在下での高
感度測定; Wallac Oy Turku/Finland, 情報パンフレッ
ト番号 1244-1202-03)を結合させるものである。

【０００４】検出系としての発光標識の使用は、他の検
出系（例えば、放射性マーカー基）と比べて、感度が比
較的高いという利点を有する。検出法で用いるのに適し
た発光標識の例は発光タンパク質、例えばエクオリンフ
ァミリーのカルシウム活性化可能な発光タンパク質であ
る。

【０００５】エクオリンは触媒活性タンパク質成分のア
ポエクオリンと、被酸化性の発光団成分のコエレンテラ
ジンと、おそらくヒドロペルオキシドとしてタンパク質
に結合している酸化剤の分子状酸素と、からなる発光タ
ンパク質である。Ｃａ⁺⁺イオン（トリガー）を添加する
と、この反応複合体の個々の成分間で発光反応が開始さ
れる。エクオリンの生物発光は光子収率が非常に高いこ
と (≧25%)と迅速であること (＜５秒) に特徴がある
(Blinks, J. Pharmacological Reviews 28 (1976), 1-9
3を参照のこと) 。しかし、エクオリンとその関連発光
タンパク質にも欠点があり、すなわち、それらはどのよ
うな化学的修飾にも非常に敏感である。その結果、通
常、触媒活性の低下および／またはトリガーの不在下で
の早期放電が生じる。

【０００６】米国特許第5,486,455 号には、付加的なＳ
Ｈ基を導入することによる発光タンパク質の温和な修飾
が記載されている。結合相手（例えば、タンパク質、核
酸、ハプテン）のマレイミド基を、例えば、適当な反応
性基を介してこれらのＳＨ基に結合させることができ
る。これは発光タンパク質−結合相手コンジュゲートを
高い発光タンパク質活性を保持したままで製造すること
を可能にする。米国特許第5,486,455 号に記載されたコ
ンジュゲートは、未反応の出発物質を分離した後に、結
合相手と発光タンパク質とのカップリング反応からの反
応生成物をプールすることにより精製される。このカッ
プリング反応の生成物のサブ分画化については記載がな
い。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】米国特許第5,486,455
号による発光タンパク質−結合相手コンジュゲートは試
験法において検出試薬として成功裏に使えることが証明
されたものの、例えば、動的測定幅および分析感度に関
して、性能の向上した検出試薬の必要性が依然存在して
いる。

【０００８】

【課題を解決するための手段】驚いたことに、さまざま
なタイプの受容体−リガンド結合アッセイにおいて、特
に低分子の発光タンパク質−結合相手コンジュゲート組
成物を使用することが試験の性能の向上につながること
が判明した。これらの低分子コンジュゲート組成物は、
発光タンパク質と結合相手とのカップリング反応中に生
成された反応生成物をサブ分画化することにより、かつ
／または特定の反応相手もしくはカップリング化学量論
を用いることにより得ることが可能である。実際には、
両処置を組み合わせることが特に好適である。

【０００９】それゆえ、本発明の主題は、発光タンパク
質と結合相手が単数（１：１）で一緒に共有結合されて
いるコンジュゲート分子を主に含有する、発光タンパク
質と結合相手との低分子コンジュゲートの組成物を提供
することである。本発明によるコンジュゲート組成物
は、好ましくは、結合相手および／または発光タンパク
質の数個の分子が一緒に結合された高分子凝集体を実質
的に含むべきでない。このコンジュゲート組成物は、発
光タンパク質と結合試薬からなる低分子コンジュゲート
を、組成物中の全コンジュゲート分子に対して好ましく
は少なくとも70%の割合で、特に好ましくは少なくとも8
0% の割合で、最も好ましくは少なくとも90% の割合で
含有する。さらに、コンジュゲート組成物中の発光タン
パク質対結合相手のモル比は１：0.8 〜１：２、特に
１：１〜１：1.5 の範囲にあることが好適である。最も
好ましくは、発光タンパク質対結合相手のモル比は約
１：１である。

【００１０】発光タンパク質はカルシウム活性化可能な
発光タンパク質が好ましい。この用語は、エクオリンと
同様に、タンパク質（アポ発光タンパク質）と、強固に
しかし非共有結合で結合された光電子放出体に相当する
有機化学基質（発光団）と、さらに発光反応を開始させ
るのに必要な恒久的に結合された分子状酸素（酸化剤）
と、からなる反応複合体を形成する発光可能なタンパク
質のファミリーを包含する。発光反応はアポ発光タンパ
ク質へのＣａ⁺⁺イオンの結合が引き金となり、環境由来
の酸素とは無関係である。

【００１１】カルシウム活性化可能な発光タンパク質は
特に好ましくは次のような共通の特性を有する。すなわ
ち、 ａ）物理化学的側面： − タンパク質性触媒（＝アポ発光タンパク質）と、強
固にしかし非共有結合で結合された光電子放出体に相当
する有機化学基質（発光団）と、さらに発光反応を開始
させるのに必要な恒久的に結合された分子状酸素（おそ
らくヒドロペルオキシドとしてタンパク質に共有結合し
ている）（酸化剤）とからなる、あらかじめ形成された
反応複合体； − 発光反応に必要な全成分が結合されているという点
で酵素系と異なる； − 約22,000ダルトンの範囲の相対分子量； − 自然発光団としての「コエレンテラジン」(coelent
erazin) [2-(p-ヒドロキシベンジル)-6-(p- ヒドロキシ
フェニル)-8-ベンジル-7- ヒドロイミダゾピラジン-3-
オン] ； − 青色光の発光極大波長 (λmax) (約470 nm) ； − 発光反応がアポ発光タンパク質への２〜３個のＣａ
⁺⁺イオンの結合により開始される − アポ発光タンパク質中にＥＦハンド（＝ヘリックス
- ループ- ヘリックス）構造の形のＣａ⁺⁺結合ドメイン
が存在する； − 発光反応が環境由来の酸素と無関係である、すなわ
ち、完全な発光タンパク質は周囲の雰囲気中の酸素の存
在下でも不在下でも発光する； − 発光タンパク質の反応はフラッシュ速度論、すなわ
ち、Ｃａ⁺⁺イオン添加の結果としての集中的な発光、の
形で進行する（これについては、Blinks J.R. ら, Phar
macological Reviews 28/1, 1-93, 1976を参照）。

【００１２】ｂ）分子生物学的側面： − 一般的に鎖長が189 〜196 個のアミノ酸からなる機
能性アポ発光タンパク質； − Ｃａ⁺⁺活性化可能な発光タンパク質のファミリーの
各メンバー間でヌクレオベース配列およびアミノ酸配列
の同一性が高い（60% 以上の相同性）。

【００１３】適当なＣａ活性化可能な発光タンパク質の
例はエクオリン、オベリン(obelin)、クリチン(clyti
n)、ミトロコミン(mitrocomin)、ベロビン(berovin) 、
ムネミオプシン(mnemiopsin)およびサラシコリン(thala
ssicolin) である。エクオリンを使用することが好まし
い。

【００１４】Ｃａ活性化可能な発光タンパク質はその起
源生物から単離された天然タンパク質として、または、
例えば大腸菌由来の、組換えタンパク質として使用する
ことができる。組換え発光タンパク質の使用が好適であ
る。エクオリンは例えば発光オワンクラゲ(Aequorea vi
ctoria) から分離精製される。エクオリンのクローニン
グおよび大腸菌による組換え生産は、Prasher ら, Bioc
hem. Biophys. Res. Comm. 126/3 (1985), 1259-1268;
Prasher ら, Meth. Enzymol. 133 (1986), 288-299; Pr
asher ら, Biochemistry 26 (1987), 1326-1332; Cormi
erら, Photochemistry and Photobiology 49/4 (1989),
509-512およびStultsら, Biochemistry31 (1992), 143
3-1442 に記載されている。生物オベリア・ロンギシマ
(Obelialongissima) から得られる発光タンパク質オベ
リンのクローニング、発現および配列は、Illarionov
ら, "J. Biolumineszenz und Chemolumineszenz" 8 (19
93),VII. International Symposium Abstracts 88およ
びGene 153 (1995), 273-274に記載されている。発光タ
ンパク質クリチンおよびミトロコミンのクローニング、
発現および配列は、Inouye and Tsuji, FEBS 315 (199
3), 343-346およびFagan ら, FEBS 333 (1993), 301-30
5に記載されている。エクオリンファミリーの他のメン
バーとして、発光タンパク質ベロビンおよびムネミオプ
シンが Ward andSeliger, Biochemistry 13 (1974), 14
91-1499および1500-1519 に、そしてサラシコリンがCam
pbellら, Application of the photoprotein obelin to
the measurement of Ca²⁺ in cells (細胞内Ca²⁺の測
定への発光タンパク質オベリンの適用) in: Biolumines
cence and Chemiluminescence, publ. DeLuca M.A. & M
cElroy, W.D., p. 601-607, Academic Press, New York
にそれぞれ記載されている。Ｃａ活性化可能な発光タン
パク質の単離についての開示は上記の文献を参照のこ
と。

【００１５】スルフヒドリル基により活性化することが
でき、かつスルフヒドリル基を介して結合試薬にカップ
リングする発光タンパク質が特に好適である。発光タン
パク質へのスルフヒドリル基の導入は、例えば、N-スク
シンイミジル-(S-アセチル)チオアセテート(SATA)、N-
スクシンイミジル-(S-アセチル) チオプロピオネート(S
ATP)、S-アセチル- メルカプトスクシンアンハイドライ
ド(SAMSA) 、特に2-イミノチオラン(Traut試薬) などの
適当な試薬を用いる化学的修飾と、場合により、その後
の保護基の開裂（例えばヒドロキシルアミンのような還
元剤による）により達成され得る。この化学的修飾は米
国特許第5,486,455 号に記載されており、この方法が明
快に言及されている。

【００１６】発光タンパク質にカップリングされる結合
相手はどのような生物学的物質であってもよい。分子量
が４kDa 以上の生物学的物質が好ましい。なんとなれ
ば、このような物質との低分子コンジュゲートの利点が
オリゴマーコンジュゲートと比べて特に顕著であるから
である。結合相手は検出法において測定すべき被検体に
直接または間接に結合しうる物質であるか、受容体との
結合について被検体と競合しうる物質である。結合相手
は好ましくは分子量が４kDa 以上の非ハプテンである。
結合相手の例としては、ストレプトアビジン、アビジ
ン、酵素、糖タンパク質、ペプチド、受容体、特に免疫
グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントのような
ポリペプチドを挙げることができる。さらに、結合相手
はレクチン、ホルモン、薬剤などでありうる。本発明の
さらに好適な実施態様において、結合相手は核酸、例え
ばＲＮＡ、ＤＮＡまたはペプチジック核酸（ＰＮＡ）の
ような核酸類似体である。

【００１７】結合相手は化学的修飾後に発光タンパク質
のスルフヒドリル基と反応しうるアミノ基を１個以上も
つものが好ましい。化学的修飾により結合相手に導入し
うる適当な反応性基の例はα−ハロゲンカルボニル基お
よび特にマレイミド基である。例えば、スクシンイミジ
ル-4-(N-マレイミドメチル) シクロヘキサン(SMCC)、ス
ルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル) シクロ
ヘキサン-1- カルボキシレート (スルホ-SMCC)、N-マレ
イミドベンゾイル-N- ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル(MBS) またはMBS のスルホン化誘導体 (スルホ-MBS)
、スクシンイミジル-4-(p-マレイミドフェニル) ブチ
レート(SMPB)またはそのスルホン化誘導体(スルホ-SMP
B)、マレイミドヘキサノイル-N- ヒドロキシ- スクシン
イミドエステル(MHS) 、N¹-[8-(N- スクシンイミジル)
スベリルアミド] N⁸-[マレイミド]-1,8-ジアミノ-3,6-
ジオキサ- オクタン(SS-MADOO)およびビス−マレイミド
メチルエーテル(BMME)などの二官能性試薬によりマレイ
ミド基を導入することができる。ＭＨＳを用いるのが特
に好ましい。

【００１８】単一的に結合された低分子成分を可能な限
り高い割合で含有する本発明のコンジュゲート組成物を
得るために、発光タンパク質１モルあたり平均２個未
満、特に1.6 個未満の付加的スルフヒドリル基を有する
スルフヒドリル活性化発光タンパク質を用いることがで
きる。さらに、発光タンパク質と反応できる反応性基を
1.5 個未満含有する結合相手を用いることが可能であ
る。これに関連して、本発明によるコンジュゲートはDE
-A-44 38 660に記載されるカップリング方法に従って製
造できることにも留意すべきである。この方法では、結
合相手をカルボン酸官能基を介して発光タンパク質のア
ミノ基にカップリングさせることが好ましい。

【００１９】本発明の特に好適な実施態様では、結合相
手の単一の反応性基の位置が局在化されていて、結合相
手がこの基により発光タンパク質にカップリングできる
ことが好ましい。この方法では、少なくとも結合相手に
関して正確に規定された化学量論を有するコンジュゲー
トが得られる。この方法では、例えば、発光タンパク質
と免疫反応性ポリペプチドとのコンジュゲート、さらに
はヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体とのコンジュ
ゲートも製造することが可能である。

【００２０】発光タンパク質と免疫反応性物質とのコン
ジュゲートを製造するには、例えば、マウスγ１免疫グ
ロブリンをペプシンで開裂し、次いでＦ(ab')₂フラグメ
ントをスルフヒドリル試薬（例：メルカプトエタノー
ル、システアミン）で還元的に開裂し、生じたＦab'フ
ラグメントの放出されたＳＨ基を活性化する。この活性
化はアミノ基、好ましくは第一級アミノ基をもつ試薬、
例えばヨードアセトアミド、または好ましくはN-ヨード
エチルトリフルオロアセトアミド（トリフルオロ酢酸の
アルカリ分解の際に、この化合物から第一級アミノ基が
放出され、このアミノ基をＭＨＳやＳＭＣＣのような試
薬を用いてマレイミド基を導入することにより活性化す
ることができる）との反応により達成できる。また一方
では、ビス−ＭＨ試薬を用いて直接ＳＨ誘導体化を行う
ことも可能である。２本のＨ鎖間のジスルフィド橋をヒ
ンジ領域に数個もつ非マウスγ１ＩｇＧ免疫グロブリン
から、位置的に規定された１：１コンジュゲートを製造
することが可能である。N-ヨードエチルトリフルオロア
セトアミドと反応させ、続いて、統計的に好ましくはこ
の位置（第一級アルキルアミノ基が増加密度で導入され
る）にただ１つのＭＨ：ＳＨカップリング部位を生成さ
せる化学量論で例えばＭＨＳと反応させることにより
１：１コンジュゲートを製造できる。この方法の更なる
利点は、カップリングが抗原結合ドメインから離れた側
面で起こり、免疫反応性の保持の増加につながる点であ
る。

【００２１】ハイブリッド形成可能な物質と発光タンパ
ク質のコンジュゲートは、例えばヌクレオベース、糖ま
たはリン酸基の適当な修飾により化学合成中に行われ
る、核酸の標的化単一官能化により製造することができ
る。例えば、5'末端にN-トリフルオロアセトアミド-(3-
オキサ)-ペンチル[N,N- ジイソプロピル- メチル] ホス
ホルアミダイト（塩基の作用によりその後第一級アミン
末端基を放出する）を組み込むことにより官能化しう
る。あるいはまた、アルキルアミノデオキシ糖ヌクレオ
シドを5'末端にまたはその配列内に直接導入してもよ
い。ヌクレオシド間官能化のためにアミノアルキル−ホ
スホルアミダイトを使用したり、塩基特異的官能化のた
めにアルキルアミノ誘導体化ヌクレオベースを含むヌク
レオチドを使用してもよい。アミノ基を（例えばＭＨＳ
により）活性化した後には、低活性化ＳＨ発光タンパク
質と１：１でカップリングさせ得る核酸または核酸類似
体がそれぞれの場合に存在することとなる。

【００２２】本発明の更なる主題は本発明によるコンジ
ュゲート組成物の製造方法であり、この方法では、発光
タンパク質と結合相手を、これらの間に共有結合による
カップリング生成物が形成される条件下で接触させ、カ
ップリング生成物の低分子画分をカップリング生成物の
高分子画分および未反応の出発物質から分離する。

【００２３】目的の低分子画分を精製するには、好まし
くは、最初に反応混合物から遊離の結合相手を分離する
ためのイオン交換クロマトグラフィーを行う。第二の精
製工程では、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いてサイ
ズの差に基づいてコンジュゲートから未反応の発光タン
パク質を分離する。この工程において、分子サイズに従
ってコンジュゲートを分離することができ、それゆえ低
分子コンジュゲート画分を単離することが可能である。

【００２４】本発明のコンジュゲートは検出試薬として
使用することができる。かくして、本発明の主題は、サ
ンプルと被検体特異的検出試薬（この検出試薬として発
光タンパク質と結合相手からなる低分子コンジュゲート
の組成物が用いられる）を接触させることによるサンプ
ル中の被検体の検出方法を包含する。本発明による検出
方法はどのような被検体の測定にも用いることができ、
例えば抗原、ハプテン、抗体、ホルモン、ホルモン受容
体、代謝産物、核酸または全細胞またはその成分を測定
できる。この方法では、本発明によるコンジュゲート組
成物が被検体特異的検出試薬として用いられ、この試薬
の結合相手成分は測定すべき被検体と直接結合するか、
測定すべき被検体の別の結合相手と間接的に結合する。

【００２５】検出試薬と被検体または別の被検体結合相
手との結合のタイプは、受容体−リガンド相互作用、す
なわち高アフィニティー生物特異的相互作用であり、例
えば抗原／ハプテンと抗体の相互作用、ホルモンとホル
モン受容体の相互作用、ビオチンとストレプトアビジン
／アビジンの相互作用、レクチンとサッカライド／糖タ
ンパク質の相互作用、または核酸間のもしくは核酸と核
酸類似体の相互作用などがある。

【００２６】本発明による方法は一工程として、または
二工程もしくは多工程として行うことができ、その際の
反応工程あたりのインキュベーション容量は好ましくは
200μl 以下、特に好ましくは20〜100 μl ほどであ
る。免疫反応の試験フォーマットの場合、反応工程あた
りのインキュベーション期間は好ましくは最大60分、特
に好ましくは最大45分であり、ハイブリダイゼーション
反応の場合には好ましくは最大120 分、特に好ましくは
最大60分である。本発明による方法は例えば免疫学的検
出法または核酸ハイブリダイゼーション検出法として実
施することができる。試験フォーマットを競合または非
競合として選択することができる。さらに、この方法を
逆滴定法として行ってもよい。

【００２７】本発明による方法は、速度論的に制御され
た受容体−リガンドアッセイ、すなわちインキュベーシ
ョン期間が短い（それゆえ熱力学的に制御された平衡か
ら遠く離れた、動的に変化しうる反応位置を有する）試
験法、小型化された試験法、または反応工程が少ない簡
便化された試験法にとって、またはこれらの任意の組合
せにとって特に有利である。

【００２８】古典的な試験法（例えば、サンプルが 200
〜500 μl 以上で、全インキュベーション期間が２時間
以上、しばしば一夜）と比べて、このような方法では比
較的少数の結合現象が起こるだけなので、特に低分子コ
ンジュゲート組成物（１個の結合相手と発光タンパク質
を含む）の方がより高分子のコンジュゲート（例えば、
それぞれが３〜５個のエクオリンと結合相手分子を含む
網状構造）より優れているということは、さらに驚くべ
きことである。こうして、本発明によるコンジュゲート
を検出法で用いるとき、非常に低い化学ノイズレベル
（非特異的結合）、より高分子のコンジュゲート画分と
比べたときの特異的結合シグナルのほんの少しの減少、
非常に動的な反応複合体の形成、それゆえ優れたシグナ
ル対ノイズ比、より広い、実質的に直線状の測定幅、良
好な精度（特にゼロキャリブレーターのレベルで）、そ
れゆえ、例えばブランク値の反復測定の平均値以上また
は以下の２倍標準偏差に基づいて計算した、すなわち95
% 信頼レベルでの、分析感度の向上が見られる。

【００２９】さらに、とりわけ１：１コンジュゲートを
用いるときには、発光タンパク質活性がより高く保持さ
れ、それゆえ、特に溶液中での、貯蔵安定性が増加す
る。一連の異なる試験フォーマット（例えば、ワンステ
ップ同時インキュベーションおよび逐次インキュベーシ
ョンを行うマルチステップアッセイ）に基づいて本発明
による方法の利点を検証し、確認した。ワンステップ同
時インキュベーションは、例えば被検体としてＴＳＨや
ＨＣＧのような抗原またはハプテン（例：チロキシン）
に関しての、非競合試験フォーマット（サンドイッチア
ッセイまたは過剰試薬アッセイ）だけでなく競合試験フ
ォーマット（制限試薬アッセイ）でも行った。マイクロ
タイタープレートのような標準的な試験キャリアーおよ
び全反応容量がたった40μl である、特別に開発された
使い捨ての小型試験キャリアー(Dispos)でこれらの試験
を実施した。

【００３０】用いたエクオリン結合相手は、免疫グロブ
リン、例えば、マウスＩｇＧサブクラスγ１、取り扱い
が難しいマウスＩｇＧサブクラスγ２ｂモノクローナル
抗体、いろいろな動物種（例：ヒツジ、ヤギ）由来のポ
リクローナル抗体、完全なＩｇＧ、Ｆ(ab')₂フラグメン
ト、Ｆab' フラグメント、Ｆabフラグメント、およびＤ
ＮＡオリゴヌクレオチドである。さらに、所望の低分子
画分が部分的画分として精製の過程で生成物混合物から
単離されるコンジュゲートの製造と、一官能性結合試薬
を用いることによって１：１コンジュゲート構造が多か
れ少なかれ課せられるコンジュゲートの製造が採用され
た。

【００３１】本発明の更なる主題は、本発明の方法を実
施するための本発明のコンジュゲート組成物を含有する
試薬である。このコンジュゲート組成物は溶液、懸濁液
または凍結乾燥物として存在しうる。この試薬は、本発
明の検出試薬に加えて、それぞれの測定に必要とされる
他の試験成分を含有する、サンプル中の被検体を検出す
るための試薬キットの一成分として存在してもよい。本
発明を以下の実施例および図面によりさらに詳しく説明
することにする。

【００３２】

【実施例】材料 2-イミノチオランをPierce社から、ＭＨＳをBoehringer
Mannheim 社から、ＢＭＨをPierce社から、Q-Sepharos
e FFをPharmacia社から、DEAE Bio Gel AをBioRad社か
ら、Sephacryl S 200 HRをPharmacia社から、Superose
12 をPharmacia社から、Superdex 200をPharmacia社か
ら、Automlumat LB 953 をBerthold社から入手した。

【００３３】実施例１ エクオリンコンジュゲートの製造 1.1. 2-イミノチオランによるエクオリンの誘導体化 10mM Tris, 0.15M NaCl, pH8.0, 2mM EDTA中のエクオリ
ンを10mM Hepes, 0.2MNaCl, 2mM EDTA, 2mM ジチオトレ
イトール(DTT), pH8.0に対して透析し、セファデックス
G25を通して再緩衝化した。この緩衝液中で2-イミノチ
オランによる活性化を行った。活性化すべきエクオリン
の濃度を、モル吸光係数を考慮してＯＤ280 を用いて測
定した。

【００３４】15〜30倍過剰モル量の、好ましくは約15倍
過剰量の2-イミノチオランを用いて2-イミノチオランに
よる活性化を行った。活性化の間のエクオリンの濃度は
2.4mg/ml であった。連続攪拌しながら水浴中25℃でイ
ンキュベーションを30分行った。１Ｍリシン塩酸塩を最
終濃度 10mM で加え、この混合物をさらに15分インキュ
ベートして活性化反応を停止させた。25mM Hepes, 3mM
EDTA, pH7.5 で平衡化したセファデックス G25カラムを
用いるか、または同じ緩衝液中４℃で透析して過剰の2-
イミノチオランを分離した。このタンパク質の濃度をＯ
Ｄ280 により測定した。

【００３５】これらの条件下で、エクオリン１分子に１
〜1.5 個の追加のスルフヒドリル基を導入できた。この
間、取り込み率を 4,4'-ジチオジピリジンにより測定し
た。この発光タンパク質の比活性は未修飾エクオリンの
比活性の95% 以上であった。2-イミノチオランにより活
性化したエクオリンは氷浴中で保存し、結合相手のマレ
イミド基との結合反応を実施するまで１日より長く保存
するときは-70 ℃に維持した。

【００３６】1.2. 結合相手（抗体）の活性化 抗体を1.2 〜1.7 倍過剰モル量のＭＨＳで活性化した。
活性化の間、抗体の濃度を20 mg/mlとした。凍結乾燥抗
体を30mMリン酸ナトリウム緩衝液(NaPP), pH7.1 中に直
接溶解し、溶解した抗体(Ab)調製物を30mM NaPP, pH7.1
中で再緩衝化した。活性化すべき抗体の濃度を、対応す
るモル吸光係数を考慮してＯＤ280 により測定した。Ｍ
ＨＳは常に新しくジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し
て、直ちに活性化に供した。

【００３７】この反応混合物を連続攪拌しながら水浴中
25℃で60分インキュベートした。１Ｍリシン塩酸塩を最
終濃度 10mM で加えて反応を停止させた。さらにインキ
ュベーションを30分続けた。25mM Hepes, 3mM EDTA, pH
7.5 で平衡化したセファデックス G25カラムを用いる
か、または同じ緩衝液中で透析して過剰の活性化試薬を
分離した。このタンパク質の濃度をＯＤ280 により測定
した。これらの条件下で抗体１分子に約１個のマレイミ
ド基が導入された。遊離アミノ酸としてL-システインを
加え、4,4'- ジチオジピリジンにより未反応のL-システ
インを逆滴定することで取り込み率を決定した。マレイ
ミド活性化抗体は2-イミノチオラン活性化エクオリンと
結合させるまで氷浴中に保存した。より長く（１日より
長く）保存する場合はマレイミド活性化抗体を-70 ℃に
維持した。

【００３８】1.3. コンジュゲート形成 2-イミノチオラン活性化エクオリンとマレイミド活性化
結合相手を１：１〜５：１、好ましくは約 2.5：１のモ
ル比で組み合わせた。この混合物中のエクオリンの濃度
は１mg/ml であった。この結合混合物を連続攪拌しなが
ら水浴中でインキュベートした。結合反応の進行を分析
用ゲル濾過クロマトグラフィーによりモニターし、最初
に反応混合物と同じ濃度の反応成分（抗体とエクオリ
ン）のプロフィールを記録した。反応の開始後、結合反
応のプロフィールを15分おきに記録した。通常この反応
は45〜60分で完了する。主に低架橋のコンジュゲートが
形成された。しかし、小割合の抗体とエクオリンが活性
化により凝集し、これが高架橋コンジュゲートの形成を
もたらした。抗体の遊離マレイミド基の反応を、最終濃
度２mMで0.2M システイン塩酸塩を添加し、インキュベ
ーションをさらに15分続けて停止させた。停止後のコン
ジュゲートの残留活性は依然として未修飾エクオリンの
比活性の70〜90% であった。

【００３９】1.4. 精製 第一段階として、コンジュゲートと遊離エクオリンと遊
離抗体を含有する結合反応混合物からイオン交換クロマ
トグラフィー(IEC) を用いて遊離抗体を分離した。ＩＥ
Ｃの条件（イオン交換体、緩衝液、イオン強度、勾配）
を両反応相手についてあらかじめ最適化させた。適当な
イオン交換体の例はQ-Sepharose FFである。反応停止
後、反応混合物を緩衝液Ａ（ＩＥＣの添加緩衝液または
結合緩衝液）中で再緩衝化し、最適条件下で精製した。
混合物の分離後、コンジュゲートに属すると分類される
画分をプールし、このプールの発光タンパク質活性を測
定した。さらに、（コンジュゲート形成に関して）分析
用ゲル濾過クロマトグラフィーカラムにより活性プロフ
ィールを調べた。一つのプールがコンジュゲートと遊離
エクオリンを含んでいた。その後これらの２成分を分取
ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＦ）により分離した。

【００４０】ゲル濾過材料としてSephacryl S-200 HR、
Superose 12 、Superdex 200またはBio Gel A を用い
た。この段階で、遊離エクオリンはコンジュゲートから
分離され、同時にコンジュゲートが分子のサイズにした
がって分離された。ゲル濾過カラムを25mM Hepes, 0.15
M NaClおよび10mM EGTA, pH7.4で平衡化し、４℃で分離
を行った。これを同じ緩衝液を用いて10カラム容量／時
の流速で溶出した。画分サイズはカラム容量の５％とし
た。ＯＤ280 での溶出プロフィールと溶出プロフィール
の吸光度曲線を記録した。最初の不均質なピーク形成
（通常は数個のピークと数個の肩部をもつ）はコンジュ
ゲートの混合物に相当する。コンジュゲート画分の４〜
６のプール（各プール中に種々の生成物種が濃厚化され
る）が得られるように画分をプールする。

【００４１】プールした最初の画分は高分子生成物の濃
厚化に相当する。溶出が進行するにつれて、コンジュゲ
ート種の分布がより低分子の生成物（理想的には１：１
コンジュゲート）の方に移動する。その後、各プールを
Amicon YM10 メンブランまたはCentricon 10を用いて濃
縮した。各プールの分子量を分析用ゲル濾過クロマトグ
ラフィーカラム（コンジュゲート形成のときと同じ条件
下）により決定した。各プールの発光タンパク質活性を
測定し、タンパク質濃度をBradfordまたは BCA法により
測定した。プール（溶出緩衝液中）を保存し、0.05% 窒
化ナトリウム, 0.05% Tween 20および 0.2% ウシ血清ア
ルブミンで安定化させた。

【００４２】実施例２ 甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の定量 試験フォーマット： 反応体のワンステップ同時インキュベーション、 室温で振盪しながら15分インキュベートする； 非競合、用量−反応が直接比例する 試験キャリアー： ホワイトNunc MaxiSorb マイクロタイタープレート(MTP) (全反応用量75μl)または小型の透明Dispos (全反応用量 40μl)；各試験キャリアーにはストレプトアビジン(SA)が コーティングしてある サンプル希釈： １：３、すなわち25μl サンプル＋50μl 試薬(MTP) および 13μl サンプル＋27μl 試薬(Dispos) インキュベーション緩衝液： 200mM 酒石酸Na, 0.5% Synperonic,各 6mMのED TAおよびEGTA, 各0.1%のウシ血清アルブミン(B SA) およびウサギ(R)-IgG, 8μg/l マウス(M)- IgG を含有する100mM リン酸Na緩衝液pH7.4 壁面抗体： モノクローナル抗TSH抗体(IgG)-ビオチン結合体、20 nmol/l キャリブレーター： マトリックス： 2% BSA, 0.9% NaCl 濃度範囲： 0 〜約45μU/ml hTSH コンジュゲート： ａ．モノクローナル抗TSHマウス抗体 V03 (IgG)- エクオリンコンジュゲート ｂ．モノクローナル抗TSHマウス抗体 A8 (IgGγ1)- エクオリンコンジュゲート ｃ．モノクローナル抗TSHマウス抗体 A8 (F(ab')₂フラグ メント) - エクオリンコンジュゲート 活性： 各試験につき約２×10⁶ cps (Lumo) 洗浄装置： MTP ではSLT プレート洗浄機 SW812、 ミニDisposではDispos用に特別に設計された洗浄ヘッド トリガー溶液： 100mM CaCl₂ を含有する10mM Tris 緩衝液 pH7.5 測定装置： 増強フラッシュモード（すなわちトリガー添加開始後0.2 〜1.2 秒の一定評価積分）でMTP 用のDynatech ML 3000プレートルミ ノメーター； 透明ミニDispos用に特別に設計されたルミノメーター(Lumo)、上 からトリガーを添加し、トリガー添加開始後0.2 〜1.2 秒の一定 評価積分により下から測定する； トリガー用量、ML 3000 では 100μl 、Lumoでは40μl

【００４３】コンジュゲート(a) 、(b) および(c) を実
施例１に記載した手順にしたがい製造した。ゲル濾過で
は画分をいくつかのプールに分割した。コンジュゲート
(a)の場合、プール１および２がもっぱら高架橋コンジ
ュゲートを含み、プール３が主に架橋コンジュゲートを
含み、プール４および５が所望の低分子コンジュゲート
画分を含んでいた（図２および３参照）。コンジュゲー
ト(b) の場合は、プール１が高架橋コンジュゲートを含
み、プール２が高架橋および低架橋コンジュゲートの混
合物を含み、所望の低分子コンジュゲートはプール３に
含まれていた。プール４は多量の架橋エクオリンと他の
副生成物を含んでいたため、良好な結果が得られなかっ
た。コンジュゲート(c) の場合は、プール１および２が
高架橋コンジュゲートを含み、プール３〜５が低架橋コ
ンジュゲートを含んでいた。結果を表１〜３に示してあ
る。なお、下記の表１〜１１中、Assay=アッセイ、conj
ugate=コンジュゲート、aequorin= エクオリン、lot=ロ
ット、pool= プール、calibrator= キャリブレーター、
concentration=濃度、signal= シグナル、dynamics= 変
動幅、[RLU bound]=結合RLU 、[diff.S(X-A)]=[差S(X-
A)] 、correlation dose:signal response=用量：シグ
ナル応答相関、linear regression=直線回帰を表す。

【００４４】

【表１】

【００４５】

【００４６】

【表２】

【００４７】

【００４８】

【表３】

【００４９】

【００５０】これらの表から、用いた抗体(MAB V03およ
びMAB A8) および抗体調製物(MAB A8 - 完全IgG および
F(ab')₂)とは無関係に、プール１（＝実質的にもっぱら
高分子物質）からプール４または５（＝実質的にもっぱ
ら低分子物質）に進むにつれて非特異的結合が顕著に減
少し、特異的結合の絶対差は少し低下するだけであっ
た。かくして、シグナル：ノイズ比（線勾配）は実質的
に増加することが明らかである。コンジュゲート(c) の
例として：

【００５１】良好なゼロ値精度と組み合わせた良好な線
勾配は良好な分析感度（検量線感度）の土台となる。非
特異的結合が少なければ少ないほど、少なくとも一定の
ゼロ値精度での線勾配が良好になり、それゆえ通常、検
出下限がより低分子のコンジュゲートプールに向けてさ
らに減少する、すなわち感度がかなり増加する。

【００５２】この関係は、表１にコンジュゲート(a) プ
ール３に基づいて示してあるように、ＴＳＨアッセイを
Disposシステムからマイクロタイタープレートシステム
（すなわち、マルチチャンネルピペット、８または16本
のニードル洗浄ヘッドなどを使って作業するのに特に有
利である）に移すとき、特に明らかである。 Disposシステム： ゼロ値精度：38.8% 勾配Ｂ／Ａ＝約4.9 検出下限＝0.10μU/ml ＭＴＰシステム： ゼロ値精度：20.2% 勾配Ｂ／Ａ＝19.3 検出下限＝0.01μU/ml(7×10^-14mol/l)

【００５３】Ｓ／Ｎデータおよび用量応答相関からはさ
らに検量線のすぐれた直線性が強調される。直線状の測
定幅が0.01〜10,000μU/mlに拡大する（図１）。コンジ
ュゲート分布曲線の低分子端の最後のプールは、いくつ
かの場合、凝集エクオリンと他の副生成物を含有し、そ
の結果最後から２番目のプールが最良の結果を与えるこ
とに注意すべきである（例えば、表２のプール３および
４を参照）。

【００５４】最も活性の高い画分は、キャリブレートさ
れたゲル濾過クロマトグラフィーカラムと合致すること
により示されるように、結合相手としてＩｇＧを用いた
場合は約170 kDa の分子量をもつ反応生成物を主に含有
する点に特徴がある。図２は、ＵＶ測定（ＯＤ280)に基
づくゲル濾過クロマトグラフィーカラム(Superose 12)
からのコンジュゲート混合物(a) の溶出プロフィール並
びにプール１、２、３、４および５への分割を示す。図
３は、ＨＰＬＣカラム(TSK3000) の各プールの溶出プロ
フィールを示す。図３には、分子量が17 kDaから450 kD
a までの種々のＨＰＬＣ標準が示してある。150 〜170
kDa の参照標準の保持時間は約７分である。図３ｂ〜ｄ
は、主に高分子コンジュゲート（保持時間５〜６分）を
含むプール１〜３を示す。約11〜12分の保持時間で生じ
るピークは緩衝液に由来するものである。図３ｅから、
プール４が所望の低分子コンジュゲート（保持時間 6.3
8分）を比較的高い割合で含有し、5.13分に見られる肩
部が少量の高分子不純物を示すことが見てとれる。図３
ｆに示したプール５は、測定可能量の高分子生成物を含
まないが、おそらく凝集エクオリンを含んだ望ましくな
い低分子コンジュゲート（保持時間 6.59 分）を多量に
含み、その結果、試験につき２×10⁶ cps の一定使用に
おいて試験の動的測定幅（表１参照）が再度減少する。

【００５５】ＨＰＬＣ標準と比較したときの移動度に基
づくと、図３の溶出プロフィールに見られる低分子コン
ジュゲートは、間違いなく、免疫反応性および発光タン
パク質活性を有する１個のＩｇＧ分子 (約150 kDa)と１
個のエクオリン分子 (約22 kDa) からなる１：１カップ
リング生成物に相当する。結果的に、低分子コンジュゲ
ート画分がイムノアッセイの性能を顕著に増加させる鍵
となる。

【００５６】実施例３ ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）の定量 試験フォーマット： 反応体のワンステップ同時インキュベーション、 室温で振盪しながら15分インキュベートする； 非競合、用量−反応が直接比例する 試験キャリアー： ホワイトNunc MaxiSorb マイクロタイタープレート、 SAコーティング、 全反応用量60μl サンプル希釈： １：６、すなわち10μl サンプル＋50μl 試薬 インキュベーション緩衝液： 300mM NaCl, 0.5% BSAおよび0.1% R-IgG, 1% Synperonic, 6mM EDTAおよび6mM EGTAを含有す る 40mM リン酸Na緩衝液 pH7.4 壁面抗体： モノクローナル抗HCGマウス抗体(IgG)-ビオチン結合体、 20 nmol/l キャリブレーター： マトリックス： 2% BSA, 0.015%リポタンパク質 濃度範囲： 0 〜約19,000 U/ml HCG コンジュゲート： モノクローナル抗HCGマウス抗体 (IgG γ1)- エクオリンコンジュゲート 活性： 各試験につき約２×10⁶ cps (Lumo) 洗浄装置： SLT プレート洗浄機 SW812 トリガー溶液： 100mM CaCl₂ を含有する10mM Tris 緩衝液 pH7.5 測定装置： 積算フラッシュモード（すなわちピーク認識による、 ピークの0.1 秒前とピークの２秒後の積算）でMTP 用のDynatech ML 3000プレートルミノメーター

【００５７】実施例１に記載したとおりにコンジュゲー
トを製造し精製した。精製により合計４つのプールが得
られた。プール１は高架橋コンジュゲートを含み、プー
ル２は低架橋および高架橋コンジュゲートの混合物を含
み、プール３および４は低架橋コンジュゲートを含んで
いた。結果を表４に示す。おおむね実施例２の結果が確
認された。最大の差異（Ｓ／Ｎ）および感度はカップリ
ング生成物の低分子画分の濃厚化（プール３および４）
により達成された。プール５はかなりの量の非コンジュ
ゲート成分を含んでいた。この場合に特に注目すべき点
は、ワンステップアッセイでさえも非常に広い測定幅
（約１〜20,000 mU/ml、これに対して従来技術、例えば
Enzymun^TMテストHCG では約１〜500 mU/ml)が得られる
ことである。このことはこれらのコンジュゲートの膨大
な動的測定幅を示すものである。

【００５８】

【表４】

【００５９】

【００６０】

【００６１】実施例４ サイトケラチン断片（ＣＫ１９）の定量 試験フォーマット： 反応体のワンステップ同時インキュベーション、 室温で振盪しながら15分インキュベートする 非競合、用量−反応が直接比例する 試験キャリアー： ホワイトNunc MaxiSorb マイクロタイタープレート、 SAコーティング、 全反応用量60μl サンプル希釈： １：６、すなわち10μl サンプル＋50μl 試薬 インキュベーション緩衝液： 150mM NaCl, 0.6% Synperonic, 10mM EDTAおよ び10mM EGTA, 1% PEG 40,000, 1% BSA, 0.2% R -IgG, 20mg/l M-IgGを含有する 50mM リン酸Na 緩衝液 pH7.4 壁面抗体： モノクローナル抗CK19マウス抗体(Fabフラグメント)-ビオチン結 合体、１μg/ml キャリブレーター： マトリックス： 6% BSA/0.9% NaCl 濃度範囲： 0 〜44 ng/ml CK19 コンジュゲート： モノクローナル抗CK19マウス抗体 (IgG γ1)- エクオリンコンジュゲート 活性： 各試験につき約２×10⁶ cps (Lumo) 洗浄装置： SLT プレート洗浄機 SW812 トリガー溶液： 100mM CaCl₂ を含有する10mM Tris 緩衝液 pH7.5 測定装置： 増強フラッシュモード（すなわちトリガー添加開始後0.2 〜1.2 秒の一定評価積分）でMTP 用のDynatech ML 3000プレートルミノ メーター

【００６２】実施例１に記載したとおりに抗体−エクオ
リンコンジュゲートを製造した。ゲル濾過後に合計６つ
のプールが得られた。プール１および２は高架橋コンジ
ュゲートを含み、プール３および４は低分子コンジュゲ
ートを最も多く含んでいた。プール５、特にプール６は
遊離のＩｇＧを含んでいるようである。この実験の結果
を表５に示す。おおむね実施例２で得られた結果が確認
された。最大の差異（Ｓ／Ｎ）および感度は、高濃度範
囲だけでなく低濃度範囲でもカップリング生成物の低分
子画分の濃厚化（プール４および５）により達成され
た。プール６は非特異的結合の増加と特異的結合レベル
の低下をもたらすエクオリン凝集物のような非コンジュ
ゲート成分をかなりの量で含んでいた。

【００６３】

【表５】

【００６４】

【００６５】

【００６６】表５中、cytokeratin fragment= サイトケ
ラチン断片を表し、その他は上記のとおりである。

【００６７】実施例５ 総ＩｇＥの定量 試験フォーマット： ３ステップ逐次インキュベーションアッセイ、 ビオチン化壁面抗体、サンプルおよびコンジュゲートを 各回室温で振盪しながら20分インキュベートする； 非競合、用量−反応が直接比例する 試験キャリアー： ホワイトNunc MaxiSorb マイクロタイタープレート、 SAコーティング、 １ステップにつき全反応用量50μl サンプル希釈： １：２、すなわち25μl サンプル＋25μl インキュベーショ ン緩衝液 インキュベーション緩衝液： 400mM KCl, 0.2% BSA, 0.5% Synperonicを含有 する100mM Tris緩衝液 pH7.6 壁面抗体： モノクローナル抗ヒトIgE マウス抗体(IgG)-ビオチン結合体、 0.1 μg/ml キャリブレーター： マトリックス： ウマ血清 濃度範囲： 0 〜約450 U/ml コンジュゲート： モノクローナル抗ヒトIgE マウス抗体 (IgG γ2b)- エクオリンコンジュゲート 活性： 各試験につき約１×10⁶ cps (Lumo) 洗浄装置： SLT プレート洗浄機 SW812 トリガー溶液： 100mM CaCl₂ を含有する10mM Tris 緩衝液 pH7.5 測定装置： 増強フラッシュモード（すなわちトリガー添加開始後0.2 〜1.2 秒の一定評価積分）でMTP 用のDynatech ML 3000プレートルミノ メーター

【００６８】実施例１に記載したとおりにコンジュゲー
トを製造した。ゲル濾過でコンジュゲート画分を５つの
プールに分けた。プール１および２は高架橋コンジュゲ
ートを含み、プール３および４は低架橋コンジュゲート
を含んでいた。プール５は痕跡量のＩｇＧを含んでいる
ようであった。結果を表６に示す。特にプール１とプー
ル４（＝低分子画分）を比較すると、特異的結合の実質
的な低下なしに非特異的結合の劇的な減少が見られた。
かくして、連続的な感度の向上をもたらす逐次マルチス
テップフォーマットでも、検量線の勾配が大きく増加し
た。プール５は動力学の減少と特異的結合の低下をもた
らす非反応性成分をかなりの割合で含んでいるようであ
る。

【００６９】

【表６】

【００７０】

【００７１】実施例６ トロポニンＴ（ＴＮ−Ｔ）の定量 試験フォーマット： 反応体のワンステップ同時インキュベーション、 室温で振盪しながら15分インキュベートする 非競合、用量−反応が直接比例する 試験キャリアー： ホワイトNunc MaxiSorb マイクロタイタープレート、 SAコーティング、 全反応用量60μl サンプル希釈： １：６、すなわち10μl サンプル＋50μl 試薬 インキュベーション緩衝液： 6mM EDTAおよび6mM EGTA, 0.1% BSA, 0.5% Synperonicを含有する50mMリン酸Na/10mM クエ ン酸Na緩衝液 pH6.0 壁面抗体： モノクローナル抗ヒトTN-Tマウス抗体(IgG)-ビオチン結合体、 ７μg/ml キャリブレーター： マトリックス： 6% BSA/0.9% NaCl 濃度範囲： 0 〜約16.5 ng/ml コンジュゲート： モノクローナル抗ヒトTN-Tマウス抗体 (IgG γ1)- エクオリンコンジュゲート 活性： 各試験につき約２×10⁶ cps (Lumo) 洗浄装置： SLT プレート洗浄機 SW812 トリガー溶液： 100mM CaCl₂ を含有する10mM Tris 緩衝液 pH7.5 測定装置： 増強フラッシュモード（すなわちトリガー添加開始後0.2 〜1.2 秒の一定評価積分）でMTP 用のDynatech ML 3000プレートルミノ メーター

【００７２】実施例１に記載したとおりにコンジュゲー
トを製造した。ゲル濾過後に５つの画分を得た。プール
１および２は主に高架橋コンジュゲートを含み、プール
３〜５は低架橋コンジュゲートを含んでいた。この実験
の結果を表７に示す。この場合にもプール１（＝濃厚化
された高分子物質）からプール５（＝実質的に低分子コ
ンジュゲート種）に進むにつれて実施例２で述べた観察
が理想的に当てはまった。

【００７３】

【表７】

【００７４】 表７中、Troponin= トロポニンを表し、その他は上記の
とおりである。

【００７５】実施例７ 総チロキシンアッセイ この試験で使用する抗クレアチンキナーゼサブタイプＭ
Ｍ（ＣＫ−ＭＭ）抗体は、他の試薬に対して低い特異的
親和性を有し、そのため不活性担体タンパク質として使
用できる。 試験フォーマット： 反応体のワンステップ同時インキュベーション、 室温で振盪しながら15分インキュベートする； 担体媒介トレーサー技法を用いる標識類似体フォーマッ トでの競合アッセイ、用量−反応が逆比例する 試験キャリアー： ホワイトNunc MaxiSorb マイクロタイタープレート、 SAコーティング、 全反応用量54μl サンプル希釈： １：25、すなわち２μl サンプル＋２μl トレーサー（担体 タンパク質とチロキシン誘導体とエクオリンからなるコンジ ュゲート）＋50μl 試薬 インキュベーション緩衝液： 0.04% ANS, 10mM EGTA, 0.2% BSAを含有する 120mM バルビタールNa緩衝液 pH 8.7 壁面抗体： ポリクローナル抗チロキシンヒツジ抗体- ビオチン結合体、 0.2 μg/ml キャリブレーター： マトリックス： 6% BSA/0.9% NaCl, 10 mg/l チロキシン結合性グロブリン(TBG) II 濃度範囲： 0 〜約25μg/dl コンジュゲート： モノクローナル抗CK-MM マウス抗体 (IgG γ1)； (=トレーサー） チロキシン-(O-メチル)-N-ヘミスクシニル-NHSエステルと 結合させ、MH活性化後にSH活性化エクオリンと結合、 11.4 nmol/l のチロキシン反応性等価物に設定 洗浄装置： SLT コロンブスプレート洗浄機 トリガー溶液： 100mM CaCl₂ を含有する10mM Tris 緩衝液 pH7.5 測定装置： 積算フラッシュモード（すなわちピーク認識による、 ピークの0.1 秒前とピークの２秒後の積算）でMTP 用のDynatech ML 3000プレートルミノメーター

【００７６】この試験のために、エクオリンを担体タン
パク質（非特異的マウスＩｇＧ）を介してハプテンＴ４
に結合させた。そのため、最初にT4 (O-Me) N-スクシン
イミジル誘導体をＩｇＧのアミノ基にカップリングし
た。その後、実施例１に記載したとおりにエクオリンコ
ンジュゲートを製造した。ゲルクロマトグラフィーで合
計５つの画分を得た。プール１および２は高架橋コンジ
ュゲートを含み、プール３は低分子コンジュゲートを最
も多く含んでいた。プール４および５は多量の遊離Ｉｇ
Ｇを含んでいた。この実験の結果を表８に示す。最良の
差異（Ｓ／Ｎ）がプール３により達成された。プール３
は高分子種の割合が低く、非コンジュゲート画分の混入
がなく、低分子コンジュゲート生成物を非常に多く含む
点に特徴がある。これに対して、プール４および５は、
それ自体検量線の変動幅の低減をもたらす非コンジュゲ
ート成分（例えば、未結合のＩｇＧ）でかなり汚染され
ていた。

【００７７】

【表８】

【００７８】 表８中、total thyroxine=総チロキシン、after logit-
log transformation=logit-log変換後を表し、その他は
上記の通りである。

【００７９】実施例８ この試験で用いるビオチン／ＤＩＧペプチドを、Gross
E. & Meienhofer J.,The Peptides, Academic Press, N
ew York, 1981, p.145-147 中にKamberおよびHiskeyが
記載するとおりに製造した。Fmoc-ε-アミノカプロン酸
によるN-末端誘導体化後に、担体樹脂上のD-ビオチンと
反応させてこのペプチドをビオチン化した。担体樹脂か
ら切り離した後、溶液中でジゴキシゲニン処理を行い、
C-末端トリエチレングリコールアセチルリシン官能化ペ
プチドをジゴキシゲニン-3-O- メチル- カルボニル-N-
ヒドロキシスクシンイミジルエステルと反応させて最終
生成物のD-ビオチノイル-ε-アミドカプロイル-Ser-Gln
-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val- アミドトリエチレングリコール
アセチル-ε-ジゴキシゲニン-3-O- メチル- カルボニル
-Lys-OH を生成した。

【００８０】ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）：抗ＤＩＧ結合試験 試験フォーマット： 反応体のワンステップ同時インキュベーション、 室温で振盪しながら15分インキュベートする； SA固相上で二重官能化ビオチン／DIG ペプチドおよび抗 DIG 抗体- エクオリンコンジュゲートを用いる直接結合 試験、用量−反応が正比例する 試験キャリアー： 小型の透明 Dispos 、全反応用量40μl ； SAコーティング サンプル希釈： １：３、すなわち13μl サンプル(=BIO/DIG ペプチド) ＋ 27μl 試薬 インキュベーション緩衝液： 150mM NaCl, 0.2% BSA, 0.15% BSA-c, 10mM EGTA, 0.05% Tween 20を含有する25mM HEPES pH 7.0 壁面抗体： −−− キャリブレーター： マトリックス： HEPES 緩衝液中のペプチド濃度系列 濃度範囲： 0 〜1000 pmol/l ビオチン/DIGヘプタペプチド コンジュゲート： ポリクローナル抗DIG ヒツジ抗体 (Fab)- エクオリンコンジュゲート 活性： 各試験につき約２×10⁶ cps (Lumo) 洗浄装置： ミニDispos用に特別に設計されたDispos用洗浄機ヘッド トリガー溶液： 100mM CaCl₂ を含有する10mM Tris 緩衝液 pH7.5 測定装置： 透明ミニDispos用に特別に設計されたルミノメーター(Lumo)、 トリガーを上から添加し、測定を下から行い、トリガー添加開始 後0.2 〜1.2 秒の一定評価積分； Lumoの場合のトリガー容量 40 μl

【００８１】実施例１に記載したとおりにコンジュゲー
トを製造した。ゲル濾過で６つの画分を得た。プール１
〜３は高架橋コンジュゲートを含み、プール４〜６は次
第に濃度を増した低分子コンジュゲート種を含んでい
た。この実験の結果を表９にまとめてある。低分子コン
ジュゲート生成物の濃度が増すにつれて（プール５およ
び６）特異的結合の低下なしに非特異的結合がより低下
し、シグナル対ノイズ比がより高くなり、用量応答相関
も良くなり、感度も高くなる。

【００８２】

【表９】

【００８３】 表９中、DIG:anti DIG binding test (model assay)=DI
G:抗DIG 結合試験（モデルアッセイ）、DIG molecules=
DIG 分子を表し、その他は上記のとおりである。

【００８４】上記の実施例では、精製の過程で生成物混
合物から部分的画分として所望の [１：１] 画分が分離
されたコンジュゲート調製物が用いられた。下記の２つ
の実施例は、 [１：１] コンジュゲート構造がいわゆる
合成法により得られることを示すものである。

【００８５】実施例９ この試験で用いるＤＮＰオリゴヌクレオチドは、ジーン
アセンブラー(Gene Assembler; Pharmacia) 上でホモ-d
T-オリゴマーとして標準ホスホルアミダイト法で合成し
た5'- ビオチン修飾した48塩基長のオリゴヌクレオチド
である。1-ジメトキシトリチル-3-O-(2,4-ジニトロフェ
ニル)-3-アミノプロピル)-トリエチレングリコールグリ
セリル-2-O-(2-シアノエチル)-(N,N- ジイソプロピル)
ホスホルアミダイト(Clontech,注文番号 10-1985 xx)の
取り込みにより、このオリゴを47位でのみ官能化した。

【００８６】ジニトロフェノール（ＤＮＰ）：抗ＤＮＰ結合試験 試験フォーマット： 反応体のワンステップ同時インキュベーション、 室温で振盪しながら15分インキュベートする； SA固相上で二重官能化ビオチン／DNP 48mer オリゴヌク レオチドおよび抗DNP 抗体- エクオリンコンジュゲート を用いる直接結合試験、用量−反応が正比例する 試験キャリアー： ホワイトNunc MaxiSorb マイクロタイタープレート、 SAコーティング、 全反応用量 74 μl サンプル希釈： １：３、すなわち25μl サンプル(=BIO/DNP オリゴヌクレオ チド) ＋50μl 試薬 インキュベーション緩衝液： 150mM NaCl, 0.2% BSA, 0.15% BSA-c, 10mM EGTA, 0.05% Tween 20を含有する25mM HEPES pH 7.0 壁面抗体： −−− キャリブレーター： マトリックス： HEPES 緩衝液中のオリゴヌクレオチド 濃度系列 濃度範囲： 0 〜1000 pmol/l ビオチン/DNPオリゴヌクレオチド コンジュゲート： ポリクローナル抗DNP ヤギ抗体 (Fab'フラグメント)- エクオリンコンジュゲート 活性： 入手可能なストック溶液の濃度に応じて、 各試験につき約１〜３×10⁶ cps (Lumo) 洗浄装置： SLT プレート洗浄機 SW812 トリガー溶液： 100mM CaCl₂ を含有する10mM Tris 緩衝液 pH7.5 測定装置： 増強フラッシュモード（すなわちトリガー添加開始後0.2 〜1.2 秒の一定評価積分）でMTP 用のDynatech ML 3000プレートルミノ メーター

【００８７】エクオリンコンジュゲートを製造するため
に、F(ab')₂ フラグメントをシステアミンで還元した。
この還元より得られたFab'に、ホモ二官能性リンカー
（ビス- マレイミドメチルエーテル）で活性化すること
によりヤギFab'フラグメントのただ１つのスルフヒドリ
ル基を介してマレイミド基を導入した。こうして、Fab'
分子への１つのマレイミド基の導入は１：１の化学量論
でコンジュゲートを生成させる。

【００８８】この抗体の場合には、200mM Na⁺ 以下の塩
濃度での溶解性が不十分なため、イオン交換クロマトグ
ラフィーを用いて精製することができなかった。ゲル濾
過クロマトグラフィーにより精製して３つの画分を得
た。プール１は高架橋コンジュゲートを含み、プール２
は主にコンジュゲートの低分子画分を含んでいた。プー
ル３は遊離のエクオリンだけを含むようであった。抗体
調製物の「粘着性」のため分離は完全でなかった。この
実験の結果を表１０に示す。この場合にも、コンジュゲ
ートの低分子画分を含むプール２（対照的に、プール３
は活性コンジュゲートをほとんど含まない）が最良の結
果をもたらした。

【００８９】

【表１０】

【００９０】

【００９１】実施例１０ ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ １．ＤＮＡ−エクオリンコンジュゲートの製造 天然クラミジア・トラコーマチス(Chlamydia trachomat
is) に相補的なオリゴヌクレオチドを、Pharmacia 社製
のジーンアセンブラープラス(Gene AssemblerPlus) で
操作説明書の標準プロトコールに従って、標準ホスホル
アミダイト化学を用いて合成した。ヌクレオチド・ビル
ディングブロックとして次の標準ホスホルアミダイトを
用いた：5'- ジメトキシトリチル-N- ベンゾイル-2'-デ
オキシ- アデノシン-3'-[(2-シアノエチル)-(N,N- ジイ
ソプロピル)]- ホスホルアミダイト、5'- ジメトキシト
リチル-N- ベンゾイル-2'-デオキシ- シチジン-3'-[(2-
シアノエチル)-(N,N- ジイソプロピル)]- ホスホルアミ
ダイト、5'- ジメトキシトリチル-N- イソブチリル-2'-
デオキシ- グアノシン-3'-[(2-シアノエチル)-(N,N- ジ
イソプロピル)]- ホスホルアミダイト、および5'- ジメ
トキシトリチル-2'-デオキシ- チミジン-[(2- シアノエ
チル)-(N,N- ジイソプロピル)]- ホスホルアミダイト(A
BI社)。2%アンモニア液中で55℃にて５時間後、担体か
らオリゴヌクレオチドを切り離し、同時にβ−シアノエ
チル基と塩基に不安定なアミノ保護基を除去した。粗生
成物をHPLC (Lichrosorb RP 18, 8 x 250 mm, Chromato
graphie Service から)で0.1 M 酢酸トリエチルアンモ
ニウム／アセトニトリル勾配を用いて精製し、透析によ
り脱塩した。

【００９２】３つのアミノアルキル官能化は塩基配列
5'-CAT AGC ACT ATA GAA CTC TG-3'から出発して次のよ
うに行った。 Ｉ．合成の最終工程として [N-トリフルオロアセトアミ
ド-(3-オキサ) ペンチル-N,N- ジイソプロピルメチル]-
ホスホルアミダイトを結合させることによる5'末端の誘
導体化。塩基の作用によるトリフルオロアセテート基の
開裂後、アルキル基に5'末端第一級アミノ基が結合した
オリゴヌクレオチドを形成させる。その後、この位置で
マレインイミド試薬（例：ＭＨＳ、ＳＭＣＣ）と反応さ
せて5'-ＭＨ活性化オリゴヌクレオチドを生成し、次に
これを低ＳＨ活性化エクオリンと反応させる。こうし
て、主に１：１（オリゴヌクレオチドに対するカップリ
ングが位置および数に関して決定される）の成分の化学
量論比をもつコンジュゲートが得られる。

【００９３】II. N-(9- フルオレニルメトキシカルボニ
ル)-1-ジメトキシトリチル-3-(β-シアノエトキシ-N,N-
ジイソプロピルアミノホスフィニル)-4-アミド-(3,6-
ジオキサ-1,8- ジアミノ- オクタン)-3,3-ジメチルブチ
レートを11位に組み込むことによる配列内の誘導体化。
すなわち、8-アミノ-3,6- ジオキサ- オクタン-1- アミ
ド-3,3- ジメチルブチリル-2,4- ホスホリル- ジエステ
ルの形でアルキル基上に第一級アミノ基を受け入れる塩
基ギャップを導入する。これにより、Ｉと同様のＭＨ−
ＳＨカップリング化学を行うことができる。

【００９４】III.アミノアルキル官能化ヌクレオベー
ス、この場合には [5-(N- アミノヘキシル)-3-アクリル
イミド)-2'- デオキシウリジル-N,N- ジイソプロピル-
β- シアノエチル]-ホスホルアミダイトの組み込みによ
る配列内の誘導体化。この場合もＭＨ活性化とさらに低
ＳＨ活性化エクオリンへのカップリングを末端の第一級
アミノアルキル基で行うことができる。その結果、Ｉお
よびIIの場合と同様に、位置および数に関してオリゴヌ
クレオチドの側であらかじめ決定されたコンジュゲート
（エクオリンの非常に低いＳＨ活性化を選択したため
に、主に１：１反応生成物を含む）が得られる。

【００９５】アミノアルキル官能化オリゴヌクレオチド
のＭＨ活性化と、これに続くＳＨ活性化エクオリンへの
カップリングは次のように行った。0.1M NaHCO₃ 緩衝液
pH 8.5 中の初期濃度約 100μmol/l(反応混合物中約20
nmol) のアミノ修飾オリゴヌクレオチドを、SMCC（反応
開始前に加水分解を抑えるためにジメチルホルムアミド
(DMF) 中に濃厚物として溶解する）との反応によりＭＨ
誘導体化する。DMF の容量％を依然５％以下とするよう
にオリゴヌクレオチドに対して10倍過剰モル量に調整す
べく少量のSMCCを加えた。振盪しながら室温で４時間イ
ンキュベートすると、確実にほぼ定量的な反応が得られ
る。Pharmacia 社製のNAP 10カラムにより過剰の出発物
質を分離した。エクオリンは実施例１に記載したように
低レベルのＳＨ活性化（エクオリン１分子あたり約1.5
個の追加ＳＨ基）を有する。最後に、両方の活性化成分
を、安定なチオエーテル橋の形成によりエクオリン−Ｓ
Ｈ：オリゴヌクレオチド−ＭＨ＝2.5 ：１の化学量論で
カップリングさせた。このカップリング条件（緩衝液、
反応停止）は実施例１に記載したとおりである。

【００９６】続いて、Trap-Qカラム(Pharmacia) で勾配
溶出（添加緩衝液＝10mM Tris, 2mMEDTA, pH 8.0; 添
加緩衝液、添加緩衝液＋0.25M, 0.5M または1.0M NaCl
を用いる段階的洗浄による溶出）する１段階精製を行っ
た。コンジュゲートは0.5M NaCl で鋭いピークとして溶
出し（保持時間 19 〜21分）、0.25M NaClでカラムから
溶出する（保持時間 10 〜17分）遊離エクオリンから明
確に分離された。このコンジュゲートを機能性試験のた
めに試験緩衝液（下記参照）中に約１〜２×10⁶ RLU/試
験に希釈した。

【００９７】２．試験手順 ビオチン化捕獲プローブのヌクレオチド配列は次のとお
りである。 5'- ビオチン-CCC CCC CCC CCA GAG TTC TAT AGT GCT A
TG-3' 試験フォーマット： 反応体のワンステップ同時インキュベーション、 37℃で振盪(180rpm)しながら60分インキュベートする； SA固相上でビオチン化捕獲プローブ（30mer オリゴヌク レオチド）およびそれに相補的なＤＮＡ−エクオリンコ ンジュゲートを用いる直接結合試験、用量−反応が直接 比例する 試験キャリアー： ホワイトNunc MaxiSorb マイクロタイタープレート、 SAコーティング、 全反応用量 200μl サンプル希釈： １：２、すなわち 100μl ビオチン化捕獲プローブ（＝サン プル）＋ 100μl コンジュゲート インキュベーション緩衝液： 150mM KCl, 0.2% BSA, 10mM EGTA, 0.05% Tween 20, 15mM NaN₃ を含有する25mM HEPES pH 7.0（＝緩衝液Ａ） 1880mM NaCl, 188mMクエン酸Na, 50mM MgCl₂, 40mM EGTA, 4mM EDTA, 0.125% BSA, 10mM NaN₃ を含有する125mM リン酸Na pH 7.0 （＝緩衝液 Ｂ） 緩衝液Ａ＋緩衝液Ｂを１＋１で混合 キャリブレーター： インキュベーション緩衝液中の捕獲プローブ（＝サンプ ル）の濃度系列 コンジュゲート： 20mer ＤＮＡオリゴヌクレオチド-5'-MH：HSエクオリン、 約２×10⁶ cps ／試験 洗浄装置： Source Instrumentsプレート洗浄機 トリガー溶液： 100mM CaCl₂ を含有する10mM Tris 緩衝液 pH7.5 測定装置： 増強フラッシュモード（すなわちトリガー添加開始後 0〜1.0 秒 の一定評価積分）でMTP 用のDynatech ML 3000プレートルミノメ ーター

【００９８】この結果を表１１にまとめてある。この規
定された１：１コンジュゲート構造体を用いると、広範
な動的測定幅（４〜５桁）、良好なシグナル対ノイズ
比、高い分析感度（アトモル範囲）といった望ましい特
徴を有するハイブリダイゼーションアッセイへとすぐに
結びつく。これらの良好な結果は、カップリング位置
（末端、中心）およびカップリング化学（末端またはヌ
クレオシド間ホスホルアミダイト、誘導体化ヌクレオベ
ース）とは無関係に得られる。 結論：この１：１コンジュゲート構造体は高性能ハイブ
リダイゼーションアッセイの構築を確実にすることが判
明した。

【００９９】

【表１１】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のエクオリンコンジュゲートを用いてＴ
ＳＨを定量するための生物発光イムノアッセイの用量応
答曲線を示した図である。

【図２】ゲル濾過クロマトグラフィーカラムからのコン
ジュゲート調製物の溶出プロフィールおよび個々のプー
ルへの分割を示した図である。

【図３】ＨＰＬＣカラムからの個々のコンジュゲートプ
ールの溶出プロフィールを示した図である。

フロントページの続き (72)発明者 エリカ サイデンシュバルツ ドイツ連邦共和国 ディー−82343 ポエ ッキング リンデンバーグ 11 (72)発明者 ナンシー スタルツ アメリカ合衆国 27513 ノース キャロ ライナ州 ，ケーリー，リビングストーン ドライブ 416 (72)発明者 デビッド エフ．スミス アメリカ合衆国 30606 ジョージア州, アテンズ，ペンドルトン ドライブ 205

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 発光タンパク質と結合相手からなるコン
   ジュゲートの組成物であって、主として、発光タンパク
   質と結合相手が１：１で互いと共有結合しているコンジ
   ュゲート分子を含有することを特徴とするコンジュゲー
   ト組成物。
2. 【請求項２】 発光タンパク質対結合相手のモル比が
   １：0.8 〜１：２である、請求項１に記載のコンジュゲ
   ート組成物。
3. 【請求項３】 発光タンパク質がエクオリン、オベリン
   (obelin)、クリチン(clytin)、ミトロコミン(mitrocomi
   n)、ベロビン(berovin) 、ムネミオプシン(mnemiopsin)
   およびサラシコリン(thalassicolin) から選択されるＣ
   ａ活性化可能な発光タンパク質である、請求項１または
   ２に記載のコンジュゲート組成物。
4. 【請求項４】 発光タンパク質がスルフヒドリル活性化
   発光タンパク質であり、そのスルフヒドリル基を介して
   結合相手に結合されている、請求項１〜３のいずれか１
   項に記載のコンジュゲート組成物。
5. 【請求項５】 結合相手が分子量４kDa 以上の生物学的
   物質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のコン
   ジュゲート組成物。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のコ
   ンジュゲート組成物の製造方法であって、発光タンパク
   質と結合相手を、該発光タンパク質と該結合相手の間に
   共有結合によるカップリング生成物が形成される条件下
   で接触させ、該カップリング生成物の低分子画分を、該
   カップリング生成物のより高分子の画分および未反応の
   出発物質から分離することを特徴とする方法。
7. 【請求項７】 サンプルを被検体特異的検出試薬と接触
   させることによるサンプル中の被検体の検出方法であっ
   て、該検出試薬として、請求項１〜５のいずれか１項に
   記載される発光タンパク質と結合相手からなるコンジュ
   ゲートの組成物を使用することを特徴とする方法。
8. 【請求項８】 主として、発光タンパク質と結合相手が
   １：１で互いと共有結合しているコンジュゲート分子を
   含有する、発光タンパク質と結合相手からなるコンジュ
   ゲートの組成物を含むことを特徴とする、請求項７に記
   載の方法を実施するための試薬。
9. 【請求項９】 サンプル中の被検体を検出するための試
   薬キットであって、他の試験成分に加えて、請求項８に
   記載の試薬を含むことを特徴とする試薬キット。
10. 【請求項１０】 被検体の検出方法における試薬として
    の請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲート
    組成物の使用。