JPH10248587A

JPH10248587A - 汚泥を原料とする生分解性高分子の製造方法

Info

Publication number: JPH10248587A
Application number: JP9084396A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiro Katori; 義洋香取; Tadaaki Kawasugi; 忠昭河杉; Toshihito Uechi; 俊仁植地; Takashi Nishishiro; 孝志西代; Masayoshi Minami; 政慶南; Masaaki Kimura; 正昭木村; Sou Kuriaki; 創栗秋; Kazue Sano; 和恵佐野
Original assignee: Kubota Corp
Current assignee: Kubota Corp
Priority date: 1997-03-17
Filing date: 1997-03-17
Publication date: 1998-09-22

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、汚泥を発酵させた発酵液を利用し
て生分解性高分子を製造することを課題とする。【解決手段】汚泥を乳酸発酵または酸発酵することに
より生じた乳酸または有機酸を、生分解性高分子を産生
する微生物の炭素源として利用することが可能となっ
た。本発明により、汚泥を有効利用し、したがって低コ
ストで環境的に優れた生分解性高分子を製造することが
可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、汚泥を乳酸発酵または
酸発酵することにより生じた乳酸または有機酸を利用し
て生分解性高分子を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ポリβヒドロキシ酪酸（PHB）は、3-ヒ
ドロキシ酪酸が数十〜数千個重合したポリマーであり、
種々の細菌が細胞内に炭素源やエネルギー源として蓄積
する貯蔵物質である。生物による分解性があり、疎水性
が強く水に溶けず可塑性のあるポリマーであるため、生
分解性高分子の材料として開発が進められている。ま
た、生分解性高分子としては、PHBの他にポリヒドロキ
シ吉草酸（PHV）、ポリヒドロキシ酢酸、ポリヒドロキ
シ酪酸−吉草酸共重合体、ポリ乳酸、ポリグリコール
酸、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネ
ート、ポリカプロラクトンなどの他、澱粉などを主成分
として各種のポリマーを混合したブレンド系と呼ばれる
もの等が知られている（日経バイオ年鑑97(日経BP社)、
628頁参照）。

【０００３】従来、PHB等の生分解性高分子は、アルカ
リジェネシス（Alcaligenese）属の細菌を適当な条件下
で培養することにより生産可能であるが、その培養時、
酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸などの有機酸モノマ
ーの添加を行っている（生物工学74巻482頁参照）。

【０００４】一方、汚水、排水等の処理により生じる汚
泥には、通常30〜40％の糖、オリゴ糖、セルロース成分
が含まれ、これを乳酸発酵または酸発酵することにより
5000〜10000mg/lの乳酸または有機酸が得られる。これ
らの乳酸や有機酸を微生物が菌体内に生分解性高分子を
蓄積する際の炭素源として用いることができれば、汚泥
の有効利用が可能となる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、汚泥の有効
利用の一つとして、汚泥を酸発酵または乳酸発酵させた
発酵液を生分解性高分子の製造に利用することを課題と
する。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、汚泥を乳
酸発酵または酸発酵させることにより、乳酸、酢酸、プ
ロピオン酸、酪酸、または吉草酸等の有機酸が生成する
ことに着目し、乳酸発酵または酸発酵により生成した乳
酸または有機酸を利用して生分解性高分子を製造できる
ことを見出し、本発明を完成した。

【０００７】すなわち本発明は、（１）汚泥を発酵させ
た発酵液または該発酵液に特定の処理を施した液の中
で、有機酸類または乳酸類から生分解性高分子を産生す
る能力を有する微生物による生分解性高分子の生産を行
うことを特徴とする、生分解性高分子の製造方法、
（２）発酵液として、汚泥を発酵させたのち遠心分離し
た上清を利用することを特徴とする（１）記載の方法、
（３）生分解性高分子を産生する能力を有する微生物が
バシラス（Bacillus）属、アルカリジェネシス（Alcali
genese）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、シュ
ードモナス（Pseudomonas）属、及びリゾビウム（Rhizo
bium）属からなる群に属する微生物である（１）記載の
方法、（４）生分解性高分子を産生する能力を有する微
生物がバシラス（Bacillus）属に属する微生物である
（３）記載の方法、（５）生産される生分解性高分子
が、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ吉草酸または
それらを含むコポリマーである（１）記載の方法、及び
（６）菌体の自己溶菌作用により、菌体細胞内に蓄積し
た高分子成分が菌体から放出され凝集したものを回収す
る過程を更に含む（１）記載の方法、に関する。

【０００８】汚泥から生分解性高分子を製造する本発明
の方法には、汚泥を有効利用することができ、低コスト
で生分解性高分子を製造できるという利点がある。さら
に、汚泥に含まれる窒素源を除去する必要がなく、ま
た、加熱またはフィルター処理などの滅菌処理工程を省
略しても、雑菌の増殖による重大な障害を生じないとい
う利点も有する。

【０００９】

【発明の実施の形態】原料として好適な汚泥としては、
下水汚泥が挙げられる。下水には、生活排水や、畜産排
水、漁業排水、および食品加工工業廃水等の産業排水が
含まれる。また、汚泥のうち、初沈汚泥（処理場への流
入下水を自然に、または塩化鉄や高分子の凝集剤を添加
して沈降させたもの）が通常用いられるが、余剰汚泥
（活性汚泥法などの生物処理に伴って生じるもの）、ま
たはこれらを混合したものを用いることも可能である。
汚泥の濃度は、約0.3〜8.0％、好ましくは約0.5〜7.0
％、より好ましくは約1.0％〜6.0％である。

【００１０】また、汚泥の酸発酵は、約5℃〜70℃、好
ましくは約10℃〜65℃、より好ましくは約15℃〜60℃、
最も好ましくは約15℃〜30℃で、嫌気条件で撹拌しなが
ら行うことが好ましい。

【００１１】培養方法としては、好ましくは、連続培養
を用いる。連続培養（連続発酵）とは、培養槽の一方か
ら培地を連続的に投入し、同時に他方から等量の培養液
を取り出して定常状態を保ちながら長時間培養を維持す
る方法である。このような方法で長期間連続的に発酵す
ることにより、生産量は格段に増大する。また、この連
続培養において、培養槽の培養液全量が何日で入れ替わ
るかを示す平均滞留時間は、約3時間〜20日、好ましく
は約6時間〜15日、より好ましくは約9時間〜10日が適当
である。

【００１２】また、発酵が終わったら槽中の全発酵液を
抜き出すという回分培養（回分発酵）、発酵液の半分を
交換する半回分培養発酵（半回分発酵）を適用すること
も可能である。

【００１３】また、酸発酵の他に、乳酸発酵も可能であ
る。この場合、例えば、乳酸発酵液のpHを7.0に調製
し、2日程度培養する。発酵により生じた乳酸が、吉草
酸に変換されるため、ポリヒドロキシ酪酸、吉草酸共重
合体の蓄積に有利であると考えられる。

【００１４】このような乳酸発酵または酸発酵によって
得られた発酵液中の乳酸類または有機酸類の濃度は、約
100mg/l〜30,000mg/lが好ましく、約500mg/l〜25,000mg
/lがより好ましく、約1,000mg/l〜20,000mg/lがさらに
好ましい。

【００１５】生分解性高分子の生産を行う際は、上記発
酵液から、遠心分離などにより固形分を除去することが
好ましい。この固液分離は、遠心分離の他に、ベルトプ
レス、フィルター濾過、膜分離、自然沈降、または薬品
添加などによっても行うことができる。この培養上清
は、窒素除去を行う必要がなく、また、加熱またはフィ
ルター処理などの滅菌処理工程も省略することができ
る。また、発酵液に特定の処理を施した液を用いること
もできる。例えば、発酵液から抽出した特定の有機酸ま
たは乳酸を利用することができる。抽出は、透析、電気
透析、イオン交換樹脂を用いた分離、蒸留等の通常の方
法によって行うことができる。

【００１６】上述の、遠心分離した上清等のpHを、約3
〜10、好ましくは約3.5〜9.5、より好ましくは約4〜9に
調製し、菌を稙菌し、生分解性高分子の生産を行う。pH
調製は水酸化ナトリウム、石灰などを用いて行うことが
できる。菌は、生分解性高分子を蓄積する菌であればい
かなるものでもよいが、例えば、バシラス（Bacillus）
属、アルカリジェネシス（Alcaligenese）属、アチオロ
ジウム（Athiorodium）属、アゾトバクター（Azotobact
er）属、ノカルジア（Nocardia）属、シユードモナス
（Pseudomonas）属、リゾビウム（Rhizobium）属、スピ
リリウム（Spirilium）属等の微生物が使用可能であ
る。

【００１７】培養温度は、菌により異なるが、一般的に
は、約5℃〜55℃、好ましくは約10℃〜50℃、より好ま
しくは約15℃〜45℃が適当である。

【００１８】培養時間もまた、使用する微生物種、培養
条件によるが、約3時間〜20日、好ましくは約6時間〜10
日、より好ましくは約12時間〜7日が適当である。

【００１９】なお、バシラス属の菌を用いた場合には、
好気または微好気が必須である。好気条件を維持するた
めには、強い振とうを行うか、または培養槽の下部から
送気等を行うことができる。

【００２０】菌により産生された生分解性高分子は、核
磁気共鳴スペクトル（NMR）で解析するか、加水分解で
モノマーにした後ガスクロマトグラフィーまたはGC-MAS
で分析するなどの方法により検出できる。また、高分子
に対して特異的な抗体で検出することも可能であると考
えられる。また、例えばPHBの場合、PHBに特異的な蛍光
色素であるナイルブルーAで菌体を染色し、蛍光顕微鏡
で観察することにより、その蓄積を確認することができ
る（Anthony G. Ostle and J. G.Holt, Appl.Env. Micr
obiol.(1982) 44, p238-241）。

【００２１】生産される生分解性高分子は、汚泥の発酵
液の組成によっても異なるが、ポリヒドロキシ酪酸、ポ
リヒドロキシ吉草酸またはそれらを含むコポリマーが得
られることが多い。

【００２２】菌体からの生分解性高分子の分離は、クロ
ロホルムなどの有機溶媒への溶解、高温の水による凝集
などの方法により行う。また、菌体の自己溶菌作用によ
り、菌体細胞内に蓄積した高分子成分が菌体から放出さ
れ凝集したものを回収することにより、高分子を得るこ
とも可能である。

【００２３】また、生分解性高分子の含有率は、ガスク
ロマトグラフィーなどにより生分解性高分子を定量し、
乾燥菌体重量に占める割合として示すことができる。

【００２４】

【実施例】

［実施例1］初沈汚泥の有機酸発酵 2.5lの反応器中で、1lの下水処理場初沈汚泥（総固形分
=1.8％）を、25℃、pH5.0、嫌気条件下で、ガス撹拌を
行いながら発酵させた。1日1回、100mlの培養液を投入
し、100mlの培養液を採取するという連続培養を行った
（平均滞留時間10日）。

【００２５】このようにして得られた発酵液は、炭水化
物、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸等の有機酸を含
有していた。結果を図１に示す。図１から、上記のよう
な条件で、7,000mg/lの有機酸を、100日以上連続培養す
ることが可能であることが示された。また、アンモニア
の生成も伴い、その濃度は600mg/Lであった。

【００２６】発酵液に対して、8,000rpm、10分の遠心分
離を行うことにより、培養液中の固形分を除去した。

【００２７】［実施例2］バシラスによるPHB生産および
蛍光顕微鏡による確認実施例1によって得られた培養液の遠心分離上清を、6N
水酸化ナトリウムによりpH7.0に調製し、バシラス属の
菌（Bacillus sp.）を植菌した後、30℃、好気条件で48
時間振とう培養した。

【００２８】PHB蓄積の確認には、PHBに特異的な染色試
薬であるナイルブルーAでの染色（Anthony G. Ostle an
d J. G.Holt, Appl. Env. Microbiol.(1982) 44, p238-
241）を用いた。まず、培養液1mlを15,000rpmで5分間遠
心分離し、得られた沈殿（菌体）を200mg/lのナイルブ
ルーAエタノール溶液100μLに懸濁した。室温で10分染
色した後、15,000rpmで遠心分離し、沈殿（菌体）を1ml
のエタノールで洗浄し、生理食塩水に再懸濁させた。蛍
光顕微鏡で観察することにより、PHBが蓄積しているこ
とが確認された（図２）。

【００２９】［実施例3］バシラスによるPHB生産および
収量測定実施例1と同様にして有機酸発酵を行った。それによっ
て得られた培養液の組成を以下の表1に示す。

【００３０】

【表１】培養液を8,000rpmで10分間遠心分離して得られた上清
に、バシラス属の菌を植菌し、25℃で72時間、好気培養
した。培養液200mlを8,000rpm、4℃で15分間遠心分離
し、沈殿を約200mlの蒸留水で洗浄後、6,000rpm、4℃で
15分間遠心分離し、さらに沈殿を200mlのアセトンで洗
浄後、6,000rpm、4℃で15分間遠心分離した。沈殿をド
ライオーブンで60℃で2時間以上乾燥させることによ
り、0.6859gの乾燥菌体が得られた。100mgの菌体（固形
物の表面および固形物の底の白い固まり）に2mlのクロ
ロホルム、2mlの3％（v/v）硫酸メタノール溶液を加
え、100℃のオートクレーブで3.5時間加熱した後、30分
間放冷し、1mlの蒸留水を加え、10分間撹拌した。クロ
ロホルム層を取り出し、ガスクロマトグラフィー分析に
用いた。ガスクロマトグラフィーの測定条件は以下の通
りである。ガスクロマトグラフィー：GC-14A カラム：Chromosorb GAW 60/80 Reoplex 400 2％（ガラ
スキャピラリー、内径3mm、3.1m）検出器：FID ヒドロキシ酪酸ナトリウムを外部標準としてPHBの定量
を行ったところ、乾燥菌体重量に占めるPHBの割合は、
固形物の表面では11.5％、固形物の底の白い固まりでは
7.5％であった。

【００３１】

【発明の効果】本発明により、汚泥を酸発酵または乳酸
発酵させることにより生じた有機酸または乳酸から、生
分解性高分子を製造することが可能になった。これによ
り、汚泥を有効利用することができ、また、低コスト
で、環境的に優れた生分解性高分子を製造することがで
きる。

【図面の簡単な説明】

【図１】初沈汚泥の酸連続発酵による酢酸、プロピオン
酸、酪酸、および吉草酸の生成量を示すグラフである。

【図２】菌体がPHBを蓄積していることを示す、ナイル
ブルーAで染色した菌体の顕微鏡写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:065） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:41） (72)発明者西代孝志茨城県竜ヶ崎市向陽台五丁目６番株式会社クボタ基盤技術研究所内 (72)発明者南政慶茨城県竜ヶ崎市向陽台五丁目６番株式会社クボタ基盤技術研究所内 (72)発明者木村正昭茨城県竜ヶ崎市向陽台五丁目６番株式会社クボタ基盤技術研究所内 (72)発明者栗秋創茨城県竜ヶ崎市向陽台五丁目６番株式会社クボタ基盤技術研究所内 (72)発明者佐野和恵茨城県竜ヶ崎市向陽台五丁目６番株式会社クボタ基盤技術研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】汚泥を発酵させた発酵液または該発酵液
に特定の処理を施した液の中で、有機酸または乳酸から
生分解性高分子を産生する能力を有する微生物による生
分解性高分子の生産を行うことを特徴とする、生分解性
高分子の製造方法。
【請求項２】発酵液として、汚泥を発酵させたのち遠
心分離した上清を利用することを特徴とする、請求項１
記載の方法。
【請求項３】生分解性高分子を産生する能力を有する
微生物がバシラス（Bacillus）属、アルカリジェネシス
（Alcaligenese）属、アゾトバクター（Azotobacter）
属、シュードモナス（Pseudomonas）属、及びリゾビウ
ム（Rhizobium）属からなる群に属する微生物である、
請求項１記載の方法。
【請求項４】生分解性高分子を産生する能力を有する
微生物がバシラス（Bacillus）属に属する微生物であ
る、請求項３記載の方法。
【請求項５】生産される生分解性高分子が、ポリヒド
ロキシ酪酸、ポリヒドロキシ吉草酸またはそれらを含む
コポリマーである、請求項１記載の方法。
【請求項６】菌体の自己溶菌作用により、菌体細胞内
に蓄積した高分子成分が菌体から放出され凝集したもの
を回収する過程を更に含む、請求項１記載の方法。