JPH1023897A - ボルナ病ウイルスのタンパク質ｐ５７又は９．５のアミノ酸配列に相当するポリペプチド、これをコ−ドする核酸フラグメント並びに診断および免疫処置を目的とするこれらの用途 - Google Patents
ボルナ病ウイルスのタンパク質ｐ５７又は９．５のアミノ酸配列に相当するポリペプチド、これをコ−ドする核酸フラグメント並びに診断および免疫処置を目的とするこれらの用途Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- A—HUMAN NECESSITIES
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＢＤＶ（ボルナ病ウイルス）感染の診断及び
ワクチンの製造に役立つポリペプチドを提供する。 【解決手段】 本発明は、それぞれボルナ病ウイルスに
よってコ−ドされる、タンパク質ｐ５７またはｐ９．５
のアミノ酸配列に相当するポリペプチドに係るのであ
る。前記ポリペプチド及び単離されたＤＮＡとＲＮＡフ
ラグメントは、試験キット及びワクチン接種に用いるこ
とが出来る。
ワクチンの製造に役立つポリペプチドを提供する。 【解決手段】 本発明は、それぞれボルナ病ウイルスに
よってコ−ドされる、タンパク質ｐ５７またはｐ９．５
のアミノ酸配列に相当するポリペプチドに係るのであ
る。前記ポリペプチド及び単離されたＤＮＡとＲＮＡフ
ラグメントは、試験キット及びワクチン接種に用いるこ
とが出来る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ボルナ病ウイルス
により起こるウイルス性感染症の診断およびワクチン接
種に関する。
により起こるウイルス性感染症の診断およびワクチン接
種に関する。
【０００２】
【従来の技術】ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）は、運動と
行動の障害に到る免疫媒介症状を惹起する神経向性ウイ
ルスである。当初は、この疾病はドイツ東南部の小さな
町であるボルナにおいてウマの自然疾患として記述され
たものである。ボルナ病（ＢＤ）は、深刻な行動異常、
炎症性の細胞浸潤および大脳辺縁系ニュ−ロンにおける
疾患特異的抗原の蓄積とを特徴とする中枢神経系の伝染
性疾患である。ボルナ病の病因因子であるボルナ病ウイ
ルス（ＢＤＶ）による自然感染症はこれまでに主として
ウマおよびヒツジにおいて確認されている。しかしなが
ら、この疾患は、齧歯類や人間以外の霊長類を含む広範
な動物種にも実験的には感染させてることができるので
あって、その臨床症状や病理学的症状も異なる。細菌の
疫病学的デ−タに基づくと、ボルナ病は無症状の態様で
さらに汎く伝播する可能性があることが示唆される。ボ
ルナ病ウイルスは、ヒトの中枢神経疾患に関与している
可能性があるのである。従って、信頼性の高い診断シス
テムおよび有効なワクチン接種を活用出来ることは重要
である。
行動の障害に到る免疫媒介症状を惹起する神経向性ウイ
ルスである。当初は、この疾病はドイツ東南部の小さな
町であるボルナにおいてウマの自然疾患として記述され
たものである。ボルナ病（ＢＤ）は、深刻な行動異常、
炎症性の細胞浸潤および大脳辺縁系ニュ−ロンにおける
疾患特異的抗原の蓄積とを特徴とする中枢神経系の伝染
性疾患である。ボルナ病の病因因子であるボルナ病ウイ
ルス（ＢＤＶ）による自然感染症はこれまでに主として
ウマおよびヒツジにおいて確認されている。しかしなが
ら、この疾患は、齧歯類や人間以外の霊長類を含む広範
な動物種にも実験的には感染させてることができるので
あって、その臨床症状や病理学的症状も異なる。細菌の
疫病学的デ−タに基づくと、ボルナ病は無症状の態様で
さらに汎く伝播する可能性があることが示唆される。ボ
ルナ病ウイルスは、ヒトの中枢神経疾患に関与している
可能性があるのである。従って、信頼性の高い診断シス
テムおよび有効なワクチン接種を活用出来ることは重要
である。
【０００３】ボルナ病ウイルスは未だに完全にその特異
性決定は行われてはいないのであるが、クビットら［Cu
bitt et al.、 J. Viro. 68, p.1382-1396 (1994)］およ
びブリ−ゼら（Brise et al.、Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA、 vol. 91、 p.4362-4366(May 1994)］によって細胞
適応ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）株のゲノムは既にクロ
−ニングされ且つ配列決定もされている。
性決定は行われてはいないのであるが、クビットら［Cu
bitt et al.、 J. Viro. 68, p.1382-1396 (1994)］およ
びブリ−ゼら（Brise et al.、Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA、 vol. 91、 p.4362-4366(May 1994)］によって細胞
適応ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）株のゲノムは既にクロ
−ニングされ且つ配列決定もされている。
【０００４】ＢＤＶは、相補的３’および５’末端を有
するセグメント化されていないネガティブセンス８．９
ｋｂＲＮＡ−ゲノムを含んでいる。副サブゲノムＲＮ
Ａは、ウイルスゲノムに対して既にマップ化されている
が、その内の幾つかは、ＲＮＡスプライシングによって
転写後の修飾を受けていることが見出されている。現在
までに知られている特徴によれば、ＢＤＶはモノネガウ
イルス科(Mononegavirales)に属する動物ウイルスの新
規グル−プのプロトタイプであることが明らかである。
するセグメント化されていないネガティブセンス８．９
ｋｂＲＮＡ−ゲノムを含んでいる。副サブゲノムＲＮ
Ａは、ウイルスゲノムに対して既にマップ化されている
が、その内の幾つかは、ＲＮＡスプライシングによって
転写後の修飾を受けていることが見出されている。現在
までに知られている特徴によれば、ＢＤＶはモノネガウ
イルス科(Mononegavirales)に属する動物ウイルスの新
規グル−プのプロトタイプであることが明らかである。
【０００５】ＢＶＤは、厳密に神経向性であり、感染部
位から軸索内輸送により伝播する。このウイルスは、イ
ンビトロでは種々の動物種の胚脳細胞の中で増殖する。
このような脳細胞を例えばＭＤＣＫ又はベロ細胞等の種
々の永久細胞株とともに培養すると、永続感染が生起す
る。感染力は、主として細胞性であるので、このウイル
スは非細胞変性であり細胞間接触により拡り、伝染して
いく。細胞内ウイルス性抗原は、感染細胞の細胞核と原
形質に認めることができる。形態学的には、ビリオン
は、電子密度の高い内部構造を有する、６０乃至９０ｎ
ｍの厚さの外被に覆われた球状粒子である。
位から軸索内輸送により伝播する。このウイルスは、イ
ンビトロでは種々の動物種の胚脳細胞の中で増殖する。
このような脳細胞を例えばＭＤＣＫ又はベロ細胞等の種
々の永久細胞株とともに培養すると、永続感染が生起す
る。感染力は、主として細胞性であるので、このウイル
スは非細胞変性であり細胞間接触により拡り、伝染して
いく。細胞内ウイルス性抗原は、感染細胞の細胞核と原
形質に認めることができる。形態学的には、ビリオン
は、電子密度の高い内部構造を有する、６０乃至９０ｎ
ｍの厚さの外被に覆われた球状粒子である。
【０００６】細胞内におけるＢＤＶ増殖は、分子量が１
８（ｇｐ１８）、２４（ｐ２４）および３８／４０（ｐ
３８またはｐ４０）キロダルトンである少なくとも三種
類のウイルス特異的抗原の存在に関連している。抗ボル
ナ病ウイルス抗体特異的タンパク質によって検出する酵
素結合イムノソルベント検定法については、ブリ−ゼら
［Briese et al.、Journal of Clinical Microbiology 、
33、 p.348-351 (February 1995)］によって記載されて
いるが、ブリ−ゼが記載したこのＥＬＩＳＡ試験は、前
記タンパク質ｐ３８／４０、ｐ２３およびｇｐ１８を使
用するのであるが、これらのタンパク質はインビトロで
もまたインビボでも感染細胞の核および原形質において
認められる。ブリ−ゼのＥＬＩＳＡ検定法に使用される
遺伝子組み換え型タンパク質は、ＢＤＶに永続感染した
ＭＤＣＫ細胞から作製した実験室的細胞適応ＢＤＶ株を
使用することによって調製した。
８（ｇｐ１８）、２４（ｐ２４）および３８／４０（ｐ
３８またはｐ４０）キロダルトンである少なくとも三種
類のウイルス特異的抗原の存在に関連している。抗ボル
ナ病ウイルス抗体特異的タンパク質によって検出する酵
素結合イムノソルベント検定法については、ブリ−ゼら
［Briese et al.、Journal of Clinical Microbiology 、
33、 p.348-351 (February 1995)］によって記載されて
いるが、ブリ−ゼが記載したこのＥＬＩＳＡ試験は、前
記タンパク質ｐ３８／４０、ｐ２３およびｇｐ１８を使
用するのであるが、これらのタンパク質はインビトロで
もまたインビボでも感染細胞の核および原形質において
認められる。ブリ−ゼのＥＬＩＳＡ検定法に使用される
遺伝子組み換え型タンパク質は、ＢＤＶに永続感染した
ＭＤＣＫ細胞から作製した実験室的細胞適応ＢＤＶ株を
使用することによって調製した。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】公知のＥＬＩＳＡ試験
の欠点は、いくつかのＢＤＶタンパク質しか使用でき
ず、従ってボルナ病ウイルスの感染が全て信頼性よく検
出出来る訳ではない、ということである。
の欠点は、いくつかのＢＤＶタンパク質しか使用でき
ず、従ってボルナ病ウイルスの感染が全て信頼性よく検
出出来る訳ではない、ということである。
【０００８】本発明の完成過程において、タンパク質ｐ
５７およびｐ９．５にそれぞれ相当するポリペプチド
が、ＢＤＶ感染の診断を一層改善して行え、またワクチ
ンの製造に有利に使用することができることを見出した
のである。
５７およびｐ９．５にそれぞれ相当するポリペプチド
が、ＢＤＶ感染の診断を一層改善して行え、またワクチ
ンの製造に有利に使用することができることを見出した
のである。
【０００９】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の態様】本
発明は従って、ボルナ病ウイルスによってコ−ドされか
つ図１-3または図4図に於いてそれぞれ示すアミノ酸配
列のうちの少なくとも１０個の連続したアミノ酸配列を
有するタンパク質ｐ５７またはｐ９．５のアミノ酸配列
に相当するポリペプチドに係るのである。
発明は従って、ボルナ病ウイルスによってコ−ドされか
つ図１-3または図4図に於いてそれぞれ示すアミノ酸配
列のうちの少なくとも１０個の連続したアミノ酸配列を
有するタンパク質ｐ５７またはｐ９．５のアミノ酸配列
に相当するポリペプチドに係るのである。
【００１０】従来技術に基づけば、タンパク質ｐ９．５
またはｐ５７が現実に存在するのか否かまたはＢＤＶの
自然感染では産生されない単なる仮説上のタンパク質で
あるのか否かについては明らかにされたことはなかっ
た。ブリ−ゼらもまたカビットら(Cubitt et al.)もｐ
５７またはｐ９．５の発現を確認しておらずまたこれら
のタンパク質の単離したものを提供していない。本発明
の過程において、タンパク質ｐ９．５は現実に産生され
ていることおよびこの糖化されていないタンパク質が感
染したＭＤＣＫ細胞の核内に存在していることを見出し
たのである。タンパク質ｐ５７が，糖化されたタンパク
質であって、感染細胞の原形質内のみならずその細胞膜
にも存在し、それぞれのウイルス特異的細胞受容体に結
合することによってＢＤＶの屈性を決定している可能性
が高いＢＶＤ特異的主要表面タンパク質であることは明
かである。このタンパク質ｐ５７はまた、感染細胞と他
の非感染細胞との融合を惹起する融合タンパク質として
機能する可能性もある。このような融合こそが、ウイル
スの細胞間での感染拡大を可能ならしめるのである。従
って、このタンパク質は、治療という観点から極めて重
要となるのであるが、その理由は、融合活性を有するこ
のような表面タンパク質を標的とした体液性または細胞
媒介免疫応答を効果的なワクチンの調製に利用できるか
らである。タンパク質ｐ５７は、このタンパク質を活性
型に転換するズブチリシンまたはフリンプロテア−ゼな
どのプロテア−ゼによって翻訳後に修飾される可能性が
ある。
またはｐ５７が現実に存在するのか否かまたはＢＤＶの
自然感染では産生されない単なる仮説上のタンパク質で
あるのか否かについては明らかにされたことはなかっ
た。ブリ−ゼらもまたカビットら(Cubitt et al.)もｐ
５７またはｐ９．５の発現を確認しておらずまたこれら
のタンパク質の単離したものを提供していない。本発明
の過程において、タンパク質ｐ９．５は現実に産生され
ていることおよびこの糖化されていないタンパク質が感
染したＭＤＣＫ細胞の核内に存在していることを見出し
たのである。タンパク質ｐ５７が，糖化されたタンパク
質であって、感染細胞の原形質内のみならずその細胞膜
にも存在し、それぞれのウイルス特異的細胞受容体に結
合することによってＢＤＶの屈性を決定している可能性
が高いＢＶＤ特異的主要表面タンパク質であることは明
かである。このタンパク質ｐ５７はまた、感染細胞と他
の非感染細胞との融合を惹起する融合タンパク質として
機能する可能性もある。このような融合こそが、ウイル
スの細胞間での感染拡大を可能ならしめるのである。従
って、このタンパク質は、治療という観点から極めて重
要となるのであるが、その理由は、融合活性を有するこ
のような表面タンパク質を標的とした体液性または細胞
媒介免疫応答を効果的なワクチンの調製に利用できるか
らである。タンパク質ｐ５７は、このタンパク質を活性
型に転換するズブチリシンまたはフリンプロテア−ゼな
どのプロテア−ゼによって翻訳後に修飾される可能性が
ある。
【００１１】本発明に従ったポリペプチドにはまたもう
一つ別の利点がある。本明の配列はボルナ病ウイルスの
実地での単離物（ウマから）から得たものであるので、
実験室株を永久培養することによって惹起される修飾は
一切生起しなかったのである。従って本願により請求さ
れるポリペプチドｐ５７およびｐ９．５の配列は、従来
技術において記載された相当する配列とは異なるもので
ある。
一つ別の利点がある。本明の配列はボルナ病ウイルスの
実地での単離物（ウマから）から得たものであるので、
実験室株を永久培養することによって惹起される修飾は
一切生起しなかったのである。従って本願により請求さ
れるポリペプチドｐ５７およびｐ９．５の配列は、従来
技術において記載された相当する配列とは異なるもので
ある。
【００１２】タンパク質ｐ９．５は、永続的にＢＤＶ感
染したＭＤＣＫ細胞の核に存在し、従ってこのウイルス
の核酸に関連している可能性がある。それゆえ、本タン
パク質は、タンパク質ｐ５．９を選択的に固相に結合さ
せることによってゲノムウイルスＲＮＡを調製するため
に有利に使用することが出来る。このことは、タンパク
質ｐ９．５を標的とする特異的抗体を用いたアフィニテ
ィ−クロマトグラフィ−を用いて実現することが出来
る。
染したＭＤＣＫ細胞の核に存在し、従ってこのウイルス
の核酸に関連している可能性がある。それゆえ、本タン
パク質は、タンパク質ｐ５．９を選択的に固相に結合さ
せることによってゲノムウイルスＲＮＡを調製するため
に有利に使用することが出来る。このことは、タンパク
質ｐ９．５を標的とする特異的抗体を用いたアフィニテ
ィ−クロマトグラフィ−を用いて実現することが出来
る。
【００１３】本発明の一つの好ましい実施態様において
は、本ポリペプチドは、形成される抗体の標的となる主
要エピト−プまたは複数の主要エピト−プから構成され
る。従って、このポリペプチドは好ましくは、長さがそ
れぞれ図１−３または図４に示したアミノ酸配列のうち
少なくとも２５個の連続したアミノ酸であり、更に好ま
しくは５０個の連続したアミノ酸を有してなる。
は、本ポリペプチドは、形成される抗体の標的となる主
要エピト−プまたは複数の主要エピト−プから構成され
る。従って、このポリペプチドは好ましくは、長さがそ
れぞれ図１−３または図４に示したアミノ酸配列のうち
少なくとも２５個の連続したアミノ酸であり、更に好ま
しくは５０個の連続したアミノ酸を有してなる。
【００１４】一方、本発明に従ったポリペプチドは好ま
しくは、上限として図１−３または図４に示すアミノ酸
配列のうちの高々８０個までのアミノ酸を有する。
しくは、上限として図１−３または図４に示すアミノ酸
配列のうちの高々８０個までのアミノ酸を有する。
【００１５】本発明はまた、試料中のボルナ病ウイルス
を標的とした抗体を決定する試験キットであって、本発
明に従ったポリペプチドの少なくとも一つ及び当該ポリ
ペプチドと決定するべき抗体とによって形成される複合
体を検出するための標識とを含有して成る試験キットに
係る。
を標的とした抗体を決定する試験キットであって、本発
明に従ったポリペプチドの少なくとも一つ及び当該ポリ
ペプチドと決定するべき抗体とによって形成される複合
体を検出するための標識とを含有して成る試験キットに
係る。
【００１６】本試験キットは一般的言えば、少なくとも
一つのエピト−プと前記エピト−プを標的とする抗体と
から成る、当該ポリペプチドによって形成される複合体
を検出する機構に基づく。かかる試験キットとしては種
々の型式のものがあるが、ＥＬＩＳＡ試験は、実験室で
容易に取り扱えるため最も一般的に汎く用いられる試験
の一つである。一つの好ましい実施態様において、かか
るポリペプチドはミクロタイタ−プレ−トのウエルに結
合される。試験する試料は、好ましくは試験を受ける個
人の血清試料であるが、これをかかるウエルの中に入
れ、一定時間経過後これを除去する。その後、このウエ
ルを洗浄し、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体
は、ウエルに未だ残留している抗体に特異的に結合する
もう一つ別の抗体を添加することによって可視化するこ
とができる。前記した第二の抗体は、通常は標識には共
有結合し、テストウエルの内部で形成された複合体の検
出を行うことが出来るのである。かかる標識は、好まし
くは例えばセイヨウワサビペルオキシダ−ゼなどの発色
反応を接触・触媒する酵素から選択すればよい。
一つのエピト−プと前記エピト−プを標的とする抗体と
から成る、当該ポリペプチドによって形成される複合体
を検出する機構に基づく。かかる試験キットとしては種
々の型式のものがあるが、ＥＬＩＳＡ試験は、実験室で
容易に取り扱えるため最も一般的に汎く用いられる試験
の一つである。一つの好ましい実施態様において、かか
るポリペプチドはミクロタイタ−プレ−トのウエルに結
合される。試験する試料は、好ましくは試験を受ける個
人の血清試料であるが、これをかかるウエルの中に入
れ、一定時間経過後これを除去する。その後、このウエ
ルを洗浄し、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体
は、ウエルに未だ残留している抗体に特異的に結合する
もう一つ別の抗体を添加することによって可視化するこ
とができる。前記した第二の抗体は、通常は標識には共
有結合し、テストウエルの内部で形成された複合体の検
出を行うことが出来るのである。かかる標識は、好まし
くは例えばセイヨウワサビペルオキシダ−ゼなどの発色
反応を接触・触媒する酵素から選択すればよい。
【００１７】本発明の好ましい実施態様においては、か
かる試験キットは、ＥＬＩＳＡを実施するための成分、
ウエスタンブロット、ＲＩＡ又はドットブロット試験と
から構成されて成る。
かる試験キットは、ＥＬＩＳＡを実施するための成分、
ウエスタンブロット、ＲＩＡ又はドットブロット試験と
から構成されて成る。
【００１８】ボルナ病ウイルスによる感染を決定するた
めの本発明に係る方法は、以下の二つの工程から構成さ
れる：即ち、 ａ）測定するべき試料を本発明に従ったポリペプチドの
少なくとも一つに接触させ、かくしてかかるポリペプチ
ドを、以前のボルナ病ウイルスによる感染によって生成
した抗体に結合させること。及び ｂ）前記ポリペプチドが試験するべき試料に含まれる特
異的抗に結合したことを決定すること。
めの本発明に係る方法は、以下の二つの工程から構成さ
れる：即ち、 ａ）測定するべき試料を本発明に従ったポリペプチドの
少なくとも一つに接触させ、かくしてかかるポリペプチ
ドを、以前のボルナ病ウイルスによる感染によって生成
した抗体に結合させること。及び ｂ）前記ポリペプチドが試験するべき試料に含まれる特
異的抗に結合したことを決定すること。
【００１９】本発明はまた別の局面において、本発明に
従ったポリペプチドをコ−ドする、単離されたＤＮＡフ
ラグメントであって、その長さが２４０塩基対以下であ
り、更に好ましくは１５０塩基対以下であるような前記
ＤＮＡフラグメントに関する。本発明のまた別の局面
は、本発明に従ったポリペプチドをコ−ドする、単離さ
れたＲＮＡフラグメントであって、その長さが２４０塩
基対以下であるような前記ＲＮＡフラグメントに関す
る。
従ったポリペプチドをコ−ドする、単離されたＤＮＡフ
ラグメントであって、その長さが２４０塩基対以下であ
り、更に好ましくは１５０塩基対以下であるような前記
ＤＮＡフラグメントに関する。本発明のまた別の局面
は、本発明に従ったポリペプチドをコ−ドする、単離さ
れたＲＮＡフラグメントであって、その長さが２４０塩
基対以下であるような前記ＲＮＡフラグメントに関す
る。
【００２０】本発明の好ましい実施態様においては、該
ＤＮＡ及びＲＮＡフラグメントは、それぞれ図７，図８
および図９に示す配列に少なくとも一部相当するか又は
かかる配列に補完的である配列を有する。
ＤＮＡ及びＲＮＡフラグメントは、それぞれ図７，図８
および図９に示す配列に少なくとも一部相当するか又は
かかる配列に補完的である配列を有する。
【００２１】本発明に従ったポリペプチドは、ワクチン
の製造に使用することが出来る。ワクチン接種のために
タンパク質、ペプチド及びポリペプチドを使用すること
は、長年広く知られたことであり、またワクチンを製造
する技術も当該技術分野に通暁した人にはよく知られて
いることである。
の製造に使用することが出来る。ワクチン接種のために
タンパク質、ペプチド及びポリペプチドを使用すること
は、長年広く知られたことであり、またワクチンを製造
する技術も当該技術分野に通暁した人にはよく知られて
いることである。
【００２２】しかしながら、本発明の核酸フラグメント
について実施することが出来るワクチン接種のために
は、もう一つ別の方法がある。最近発見されたことであ
るが、プラスミドＤＮＡを特殊な挿入機構を一切伴うこ
となくインビボにおいて骨格筋細胞に取込み、染色体外
の、非複製性の円状形態で長期間生存させることが出来
るのである。即ち、異物遺伝子を一時的に骨格筋内にお
いて発現させることが出来るのである。また、本発明の
ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントを免疫するのにそのま
ま使用出来る伝染性の自殺ウイルス粒子内に封入するこ
とも可能である。更には、単離されたかかるＤＮＡ及び
ＲＮＡフラグメントをそれぞれ免疫するべきヒトまたは
動物の骨格筋内に注入することもやはり可能である。単
離したＤＮＡフラグメントは更に、かかるＤＮＡフラグ
メントを免疫するべき個体に導入する態様に依存して、
当該ＤＮＡフラグメントの転写及び発現を行わせるのに
必要な配列を包含して成るものである。かかる核酸がベ
クタ−中に導入された場合、当該核酸フラグメントは、
適当なウイルスベクタ−又は遺伝子組み換えプラスミド
と結合されることになろう。
について実施することが出来るワクチン接種のために
は、もう一つ別の方法がある。最近発見されたことであ
るが、プラスミドＤＮＡを特殊な挿入機構を一切伴うこ
となくインビボにおいて骨格筋細胞に取込み、染色体外
の、非複製性の円状形態で長期間生存させることが出来
るのである。即ち、異物遺伝子を一時的に骨格筋内にお
いて発現させることが出来るのである。また、本発明の
ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントを免疫するのにそのま
ま使用出来る伝染性の自殺ウイルス粒子内に封入するこ
とも可能である。更には、単離されたかかるＤＮＡ及び
ＲＮＡフラグメントをそれぞれ免疫するべきヒトまたは
動物の骨格筋内に注入することもやはり可能である。単
離したＤＮＡフラグメントは更に、かかるＤＮＡフラグ
メントを免疫するべき個体に導入する態様に依存して、
当該ＤＮＡフラグメントの転写及び発現を行わせるのに
必要な配列を包含して成るものである。かかる核酸がベ
クタ−中に導入された場合、当該核酸フラグメントは、
適当なウイルスベクタ−又は遺伝子組み換えプラスミド
と結合されることになろう。
【００２３】本発明に係わるＤＮＡフラグメント又はＲ
ＮＡフラグメントは従って、核酸免疫を行うために使用
することが出来るのである。
ＮＡフラグメントは従って、核酸免疫を行うために使用
することが出来るのである。
【００２４】
【実施例】本発明を、添付した図面によって更に詳しく
説明する。 実施例１ ｐ５７及びｐ４７／ｃ ＢＤＶ−遺伝子のクロ−ニング
と発現：ｐ５７ＢＤＶ−タンパク質 p57/c;bp 2685-bp
3747,カビットら(Cubitt et al.), (1994) J.Virol/6
8, 7669-7675, Briese et al.(1994) p57 bp x-347〕
のオ−プンリ−ディングフレ−ムの全領域及びそのＣ−
タ−ミナル領域をＢＤＶに感染させたラットから単離し
たＲＮＡから下記するプライマを用いて増幅した：Ｃ−
タ−ミナル領域：３’−プライマ−（アンチセンセス）
ＧＴＡＧＡＡＴＴＣ ＴＴＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＣＣＧ
ＧＣＣＧＡＧＧＣＧＴＣ（Ｓｅｑ．−ＩＤ ６）ｐ５７
ＯＲＦの全領域：５’プライマ−（センス）：ＧＡＴ
ＧＧＡＴＣＣ ＡＴＧＴＡＣＴＧＣＡＧＴＴＴＣＧＣＧ
ＧＡＣＴＧＴＡＧ（Ｓｅｑ．−ＩＤ ７）５’−プライ
マ−：
説明する。 実施例１ ｐ５７及びｐ４７／ｃ ＢＤＶ−遺伝子のクロ−ニング
と発現：ｐ５７ＢＤＶ−タンパク質 p57/c;bp 2685-bp
3747,カビットら(Cubitt et al.), (1994) J.Virol/6
8, 7669-7675, Briese et al.(1994) p57 bp x-347〕
のオ−プンリ−ディングフレ−ムの全領域及びそのＣ−
タ−ミナル領域をＢＤＶに感染させたラットから単離し
たＲＮＡから下記するプライマを用いて増幅した：Ｃ−
タ−ミナル領域：３’−プライマ−（アンチセンセス）
ＧＴＡＧＡＡＴＴＣ ＴＴＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＣＣＧ
ＧＣＣＧＡＧＧＣＧＴＣ（Ｓｅｑ．−ＩＤ ６）ｐ５７
ＯＲＦの全領域：５’プライマ−（センス）：ＧＡＴ
ＧＧＡＴＣＣ ＡＴＧＴＡＣＴＧＣＡＧＴＴＴＣＧＣＧ
ＧＡＣＴＧＴＡＧ（Ｓｅｑ．−ＩＤ ７）５’−プライ
マ−：
【００２５】ＲＮＡを、酸グアニジウム イソチオシア
ネ−トフェノ−ル−クロロフォルム標準法を用いてＢＤ
Ｖに感染させたラットの脳から単離し、２ｕｇのＲＮＡ
をＲＴ反応に使用した。ＲＴ反応及びＰＣＲの条件は、
リヒトらによって記載されたものである〔Richit et a
l.、Med. Microbio. Immunol. 182(1993)pp.293-304〕。
ネ−トフェノ−ル−クロロフォルム標準法を用いてＢＤ
Ｖに感染させたラットの脳から単離し、２ｕｇのＲＮＡ
をＲＴ反応に使用した。ＲＴ反応及びＰＣＲの条件は、
リヒトらによって記載されたものである〔Richit et a
l.、Med. Microbio. Immunol. 182(1993)pp.293-304〕。
【００２６】増幅生成物は、アガロ−スゲルから精製
し、制限部位を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩを用
いて〔プロメガ(Promega)社，Madison,USA〕解裂させた
後プラスミドベクタ−ｐＧＥＸ−２Ｔ〔ファルマシア(P
harmacia)社，Ｎｏ．２７−４８０１−０１）にクロ−
ンした。このウイルス遺伝子をｔａｃプロモ−タで制御
されたSchistosoma japonicumのグルタチオンＳ−トラ
ンスフェラ−ゼ（ＧＳＴ）に融合させた。発現プラスミ
ドは、コンピテントセルであるＥ．ｃｏｌｉＳｕｒｅTM
−ｃｅｌｌに形質転換させ、遺伝子組み換えプラスミド
を制限解析及びＤＮＡ塩基配列決定法を用いて解析し
た。フラグメントｐ５７ｃのアミノ酸配列は、塩基配列
決定したＤＮＡフラグメントから推定したが、これを図
５，図６に示す。
し、制限部位を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩを用
いて〔プロメガ(Promega)社，Madison,USA〕解裂させた
後プラスミドベクタ−ｐＧＥＸ−２Ｔ〔ファルマシア(P
harmacia)社，Ｎｏ．２７−４８０１−０１）にクロ−
ンした。このウイルス遺伝子をｔａｃプロモ−タで制御
されたSchistosoma japonicumのグルタチオンＳ−トラ
ンスフェラ−ゼ（ＧＳＴ）に融合させた。発現プラスミ
ドは、コンピテントセルであるＥ．ｃｏｌｉＳｕｒｅTM
−ｃｅｌｌに形質転換させ、遺伝子組み換えプラスミド
を制限解析及びＤＮＡ塩基配列決定法を用いて解析し
た。フラグメントｐ５７ｃのアミノ酸配列は、塩基配列
決定したＤＮＡフラグメントから推定したが、これを図
５，図６に示す。
【００２７】実施例２ ｐ５７及びｐ５７／ｃＢＤＶ−タンパク質のＥ．ｃｏｌ
ｉにおける発現と精製：ｐＧＥＸ−ｐ５７／ｃを含む
Ｅ．ｃｏｌｉの１００ｍｌを０．１ｍｇのアンピシリン
添加ＬＢ−培地〔セルバ(Serva)社、Heiderberg、ドイ
ツ〕中で一晩増殖させた。この一晩増殖培養した培養液
をアンピシリン添加ＬＢ−培地１リットルに稀釈し、対
数増殖期まで２ないし４時間増殖させた。ＧＴＳ−ｐ５
７／ｃとＧＳＴ−ｐ５７との融合タンパク質の発現は、
ＩＰＴＧ〔０．１ｍＭ；プロメガ(Promega)社、Heidelb
erg、ドイツ〕を用いて４時間誘導させた。バクテリア
を遠心分離する（５９００ ｇ、１０分、４°Ｃ）こと
によってペレット化し、ＰＢＳ中に再分散させた。細胞
を氷上で音波破砕処理することによって溶解させ、細胞
断片を遠心分離（９８００ｇ、１０分、４°Ｃ）するこ
とによってペレット化させた。このように音波破砕処理
した融合タンパク質の上澄液をグルタチオンのアフィニ
ティ−マトリックス（グルタチオンセファロ−ス４Ｂ；
ファルマシア（Pharmacia）社、Ｎｏ． ２７−４５７
０−０１）に加えた。このＧＳＴ−ｐ５７／ｃとＧＳＴ
−ｐ５７との融合タンパク質のグルタチオンセファロ−
ス４Ｂを用いた精製は、メ−カ−のプロトコ−ルに従っ
て行った。溶出された融合タンパク質は、１ｘＰＢＳに
対して４°Ｃにて２４時間透析した。発現生成物は、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロット分析法で解析した。
ｉにおける発現と精製：ｐＧＥＸ−ｐ５７／ｃを含む
Ｅ．ｃｏｌｉの１００ｍｌを０．１ｍｇのアンピシリン
添加ＬＢ−培地〔セルバ(Serva)社、Heiderberg、ドイ
ツ〕中で一晩増殖させた。この一晩増殖培養した培養液
をアンピシリン添加ＬＢ−培地１リットルに稀釈し、対
数増殖期まで２ないし４時間増殖させた。ＧＴＳ−ｐ５
７／ｃとＧＳＴ−ｐ５７との融合タンパク質の発現は、
ＩＰＴＧ〔０．１ｍＭ；プロメガ(Promega)社、Heidelb
erg、ドイツ〕を用いて４時間誘導させた。バクテリア
を遠心分離する（５９００ ｇ、１０分、４°Ｃ）こと
によってペレット化し、ＰＢＳ中に再分散させた。細胞
を氷上で音波破砕処理することによって溶解させ、細胞
断片を遠心分離（９８００ｇ、１０分、４°Ｃ）するこ
とによってペレット化させた。このように音波破砕処理
した融合タンパク質の上澄液をグルタチオンのアフィニ
ティ−マトリックス（グルタチオンセファロ−ス４Ｂ；
ファルマシア（Pharmacia）社、Ｎｏ． ２７−４５７
０−０１）に加えた。このＧＳＴ−ｐ５７／ｃとＧＳＴ
−ｐ５７との融合タンパク質のグルタチオンセファロ−
ス４Ｂを用いた精製は、メ−カ−のプロトコ−ルに従っ
て行った。溶出された融合タンパク質は、１ｘＰＢＳに
対して４°Ｃにて２４時間透析した。発現生成物は、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロット分析法で解析した。
【００２８】ウイルスに特異的なＧＴＳ−ｐ５７／ｃと
ＧＳＴ−ｐ５７との融合タンパク質のｐＧＥＸ−ｐ．５
７／ｃ又はｐＧＥＸ−ｐ５７クロ−ンによる発現は、Ｉ
ＰＴＧによる処理を行ったか又は行わなかったＥ．ｃｏ
ｌｉの溶解物を使用してイムノブロッティングで解析し
た。対照として、遺伝子組み換えしていないｐＧＥＸ−
２Ｔプラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉの溶解産物
を用いた。次に、溶出した融合タンパク質の品質をＢＶ
Ｄ−特異的であるラットとウサギの抗血清を用いてウエ
スタンブロット解析にて解析した。かくして精製したＧ
ＳＴ−ｐ５７／ｃとＧＳＴ−ｐ５７とは、ラットとウサ
ギから得たウイルス特異的抗血清によって分子量が約６
５又は８０キダルトンである明瞭なバンドとして容易に
検出され、一方融合タンパク質の２６キロダルトンは、
ＧＳＴタンパク質を表し、またほぼ４０キロダルトン又
は５７キロダルトンは、ｐ５７ ＢＤＶＤ−タンパク質
のＣ−端末部又はｐ５７ ＢＤＶ−タンパク質の全領域
を表わす。
ＧＳＴ−ｐ５７との融合タンパク質のｐＧＥＸ−ｐ．５
７／ｃ又はｐＧＥＸ−ｐ５７クロ−ンによる発現は、Ｉ
ＰＴＧによる処理を行ったか又は行わなかったＥ．ｃｏ
ｌｉの溶解物を使用してイムノブロッティングで解析し
た。対照として、遺伝子組み換えしていないｐＧＥＸ−
２Ｔプラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉの溶解産物
を用いた。次に、溶出した融合タンパク質の品質をＢＶ
Ｄ−特異的であるラットとウサギの抗血清を用いてウエ
スタンブロット解析にて解析した。かくして精製したＧ
ＳＴ−ｐ５７／ｃとＧＳＴ−ｐ５７とは、ラットとウサ
ギから得たウイルス特異的抗血清によって分子量が約６
５又は８０キダルトンである明瞭なバンドとして容易に
検出され、一方融合タンパク質の２６キロダルトンは、
ＧＳＴタンパク質を表し、またほぼ４０キロダルトン又
は５７キロダルトンは、ｐ５７ ＢＤＶＤ−タンパク質
のＣ−端末部又はｐ５７ ＢＤＶ−タンパク質の全領域
を表わす。
【００２９】実施例３ 抗血清及びモノクロ−ナル抗体の製造：ＧＳＴ−ｐ５７
／ｃ融合タンパク質の多価、単一特異的抗血清を，コン
プリ−トアジュバント（ＣＦＡ）中１ｍｇのＧＳＴ−ｐ
５７／ｃ融合タンパク質を皮下注入して免疫処理したウ
サギから得た。４週間後及び８週間後に、このウサギに
同量の抗原でブ−スタ−免疫を付与し、最後の免疫処理
操作後１週間飼育した。この血清は、ＢＤＶ感染させた
ＭＤＣＫ細胞及び未感染ＭＤＣＫ細胞における間接蛍光
抗体法並びに融合タンパク質を用いたウエスタンブロッ
ト解析法でその反応性を試験した。
／ｃ融合タンパク質の多価、単一特異的抗血清を，コン
プリ−トアジュバント（ＣＦＡ）中１ｍｇのＧＳＴ−ｐ
５７／ｃ融合タンパク質を皮下注入して免疫処理したウ
サギから得た。４週間後及び８週間後に、このウサギに
同量の抗原でブ−スタ−免疫を付与し、最後の免疫処理
操作後１週間飼育した。この血清は、ＢＤＶ感染させた
ＭＤＣＫ細胞及び未感染ＭＤＣＫ細胞における間接蛍光
抗体法並びに融合タンパク質を用いたウエスタンブロッ
ト解析法でその反応性を試験した。
【００３０】モノクロ−ナル抗体は、既に報告された方
法(Koehler & Milstein、1975)を用いて調製した。紕臓
細胞をＣＦＡ中１００ｕｇのＧＳＴ−ｐ５７で三回免疫
したＢａｌｂ／ｃマウスから得た；この動物は、殺害時
には強度の抗体反応を示した。ハイブリド−マの上澄み
液は、永続感染させたＭＤＣＫ細胞による間接蛍光抗体
法（ＩＦＡ）によりＢＤＶ特異抗体について試験を行っ
た。更には、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット解析法
を実施した。ハイブリド−マ細胞は、光学顕微鏡下で個
別細胞を選別することによって二度クロ−ンニングさせ
た。
法(Koehler & Milstein、1975)を用いて調製した。紕臓
細胞をＣＦＡ中１００ｕｇのＧＳＴ−ｐ５７で三回免疫
したＢａｌｂ／ｃマウスから得た；この動物は、殺害時
には強度の抗体反応を示した。ハイブリド−マの上澄み
液は、永続感染させたＭＤＣＫ細胞による間接蛍光抗体
法（ＩＦＡ）によりＢＤＶ特異抗体について試験を行っ
た。更には、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット解析法
を実施した。ハイブリド−マ細胞は、光学顕微鏡下で個
別細胞を選別することによって二度クロ−ンニングさせ
た。
【００３１】多価で、単一特異的な抗ＧＳＴ−ｐ５７／
ｃ融合タンパク質抗血清は、上記した如くにしてＧＳＴ
−ｐ５７／ｃ融合タンパク質を皮下注射して免疫したウ
サギから得た。この抗血清を、アセトン（−２０°Ｃに
て６０分）又は室温で３０分間４％パラホムアルデヒド
（ＰＦＡ）中に固定化処理したＢＤＶに永続感染させた
ＭＤＣＫ細胞に適用した。この単一特異的抗血清は、感
染させたＭＤＣＫ細胞の細胞質全体に散布された状態で
存在するアセトン固定化細胞内のウイルス特異的タンパ
ク質を認識した。表面抗原のために染色処理するためこ
れらの細胞をＰＦＡで固定化した場合、強度の染色がＢ
ＤＶに感染させたＭＤＣＫ細胞の表面において認められ
た。更には、実験的にＢＤＶに感染させたラットの脳部
分を前記単一特異的及びモノクロ−ナル抗ｐ５７／ｃ抗
血清と共に培養した。ウイルス抗原は主として、ラット
の中枢神経系において感染ニュ−ロンの細胞質全体にわ
たって検出された。
ｃ融合タンパク質抗血清は、上記した如くにしてＧＳＴ
−ｐ５７／ｃ融合タンパク質を皮下注射して免疫したウ
サギから得た。この抗血清を、アセトン（−２０°Ｃに
て６０分）又は室温で３０分間４％パラホムアルデヒド
（ＰＦＡ）中に固定化処理したＢＤＶに永続感染させた
ＭＤＣＫ細胞に適用した。この単一特異的抗血清は、感
染させたＭＤＣＫ細胞の細胞質全体に散布された状態で
存在するアセトン固定化細胞内のウイルス特異的タンパ
ク質を認識した。表面抗原のために染色処理するためこ
れらの細胞をＰＦＡで固定化した場合、強度の染色がＢ
ＤＶに感染させたＭＤＣＫ細胞の表面において認められ
た。更には、実験的にＢＤＶに感染させたラットの脳部
分を前記単一特異的及びモノクロ−ナル抗ｐ５７／ｃ抗
血清と共に培養した。ウイルス抗原は主として、ラット
の中枢神経系において感染ニュ−ロンの細胞質全体にわ
たって検出された。
【００３２】実施例４ ＥＬＩＳＡ：ＢＤＶに感染させたラットから得た抗体産
生性ハイブリド−マ及び血清のスクリ−ニングは、遺伝
子組み換えＧＳＴ−ｐ５７／ｃタンパク質及び対照タン
パク質としてＧＳＴを用いて実施した。
生性ハイブリド−マ及び血清のスクリ−ニングは、遺伝
子組み換えＧＳＴ−ｐ５７／ｃタンパク質及び対照タン
パク質としてＧＳＴを用いて実施した。
【００３３】９６ウエルのマイクロタイタ−プレ−ト
（グライナ−(Greiner)社、ドイツ）を、５０ｕｌの緩
衝液（１０００ｍｌＨ2 Ｏ中に１．５９ｇＮａ2 Ｃ
Ｏ3 、２．９３ｇＮａＨＣＯ3 及び０．２０ｇＮａＮ）
中ウエル１個当り３１及び１２５ｎｇの遺伝子組み換え
ＧＳＴｐ５７／ｃ又はＧＳＴタンパク質で４°Ｃにおい
て一晩コ−トした。プレ−トは、室温において洗浄用緩
衝液（ＰＢＳ中０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で三回洗浄
し、次いでブロッキング緩衝液（０．５％Ｔｗｅｅｎ−
２０を含むＰＢＳ中０．５％ゼラチン、１％ＰＢＳＡ、
０．１％チメロサ−ル）と共に１時間培養した。このマ
イクロタイタ−プレ−トを三回洗浄緩衝液で洗浄し、血
清の二倍稀釈液をブロッキング緩衝液で作製した。この
血清を１：２０ないし１：１０、２４０までに稀釈した
液のそれぞれの５０ｕｌを各ウエルに加え、室温で１時
間培養した。プレ−トを三回洗浄用緩衝液で洗浄し、ビ
オチン接合したラット抗血清又は抗マウスＩｇＧ及びｉ
Ｇｍをブロッキング緩衝液で１：１０，０００に稀釈し
た液を各ウエルに加え、室温で１時間培養した。三回洗
浄した後、プレ−トをストレプタビジン（streptavidi
n、アメルシャム（Amersham）社、Braunschweig）に接
合したセイヨウワサビペルオキシダ−ゼをブロッキング
緩衝液で１：１０、０００に稀釈した液と共に培養し
た。このプレ−トを三回洗浄した後で、２００ｕｇの基
質溶液を各ウエルに加えたが、この基質溶液は、５０ｍ
ｌのＨ2 Ｏ2 中において０．５Ｍ Ｎａ2 ＰＯ4 、０．
１Ｍクエン酸、２０ｍｇフェニルジアミン及び２０ｍｌ
の３％Ｈ2 Ｏ2 を含んで成るものであった。これらのプ
レ−トを室温で５ないし１０分間培養し、反応を各ウエ
ルに５０ｕｌの硫酸を添加することによって停止させ
た。４９２ｎｍにおける吸光度を各ウエルについてマイ
クロプレ−トリダ−を用いて測定した。一次抗血清を含
まないネガティブコントロ−ルウエルをいて補正を行っ
た。各血清のＥＬＩＳＡタイタ−は、光学密度として
０．２を生じる終点稀釈比であると定義した。回復期及
びコントロ−ルのラット血清を用いて行ったこの試験の
結果を図１０に示す。
（グライナ−(Greiner)社、ドイツ）を、５０ｕｌの緩
衝液（１０００ｍｌＨ2 Ｏ中に１．５９ｇＮａ2 Ｃ
Ｏ3 、２．９３ｇＮａＨＣＯ3 及び０．２０ｇＮａＮ）
中ウエル１個当り３１及び１２５ｎｇの遺伝子組み換え
ＧＳＴｐ５７／ｃ又はＧＳＴタンパク質で４°Ｃにおい
て一晩コ−トした。プレ−トは、室温において洗浄用緩
衝液（ＰＢＳ中０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で三回洗浄
し、次いでブロッキング緩衝液（０．５％Ｔｗｅｅｎ−
２０を含むＰＢＳ中０．５％ゼラチン、１％ＰＢＳＡ、
０．１％チメロサ−ル）と共に１時間培養した。このマ
イクロタイタ−プレ−トを三回洗浄緩衝液で洗浄し、血
清の二倍稀釈液をブロッキング緩衝液で作製した。この
血清を１：２０ないし１：１０、２４０までに稀釈した
液のそれぞれの５０ｕｌを各ウエルに加え、室温で１時
間培養した。プレ−トを三回洗浄用緩衝液で洗浄し、ビ
オチン接合したラット抗血清又は抗マウスＩｇＧ及びｉ
Ｇｍをブロッキング緩衝液で１：１０，０００に稀釈し
た液を各ウエルに加え、室温で１時間培養した。三回洗
浄した後、プレ−トをストレプタビジン（streptavidi
n、アメルシャム（Amersham）社、Braunschweig）に接
合したセイヨウワサビペルオキシダ−ゼをブロッキング
緩衝液で１：１０、０００に稀釈した液と共に培養し
た。このプレ−トを三回洗浄した後で、２００ｕｇの基
質溶液を各ウエルに加えたが、この基質溶液は、５０ｍ
ｌのＨ2 Ｏ2 中において０．５Ｍ Ｎａ2 ＰＯ4 、０．
１Ｍクエン酸、２０ｍｇフェニルジアミン及び２０ｍｌ
の３％Ｈ2 Ｏ2 を含んで成るものであった。これらのプ
レ−トを室温で５ないし１０分間培養し、反応を各ウエ
ルに５０ｕｌの硫酸を添加することによって停止させ
た。４９２ｎｍにおける吸光度を各ウエルについてマイ
クロプレ−トリダ−を用いて測定した。一次抗血清を含
まないネガティブコントロ−ルウエルをいて補正を行っ
た。各血清のＥＬＩＳＡタイタ−は、光学密度として
０．２を生じる終点稀釈比であると定義した。回復期及
びコントロ−ルのラット血清を用いて行ったこの試験の
結果を図１０に示す。
【００３４】この遺伝子組み換え型ＢＤＶ ｐ５７／ｃ
タンパク質に対する特異的且つ高感度のＥＬＩＳＡを確
立するために、最適抗原濃度を、下記する抗原濃度に対
する陽性及び陰性のラット血清のチェッカ−ボ−ド滴定
を行って決定した：即ち、３１、６２、１２５、２５０
ｎｇ／ウエル。最も直線的な応答を与える最適濃度は、
３１ｎｇ／ウエルであった。遺伝子組み換え型Ｐ５７／
ｃＢＤＶタンパク質に対するＥＬＩＳＡシステムの感度
は、実験的に感染させたラットから感染（ｐ．ｉ．）後
４０、５０及び６０日目に得た、ＩＦＡ（タイタ−は、
１：２２８０から１：５１２０までの範囲）及びウエス
タンブロット解析によって反応性を有することが判明し
ている血清を用いて決定した。これらの方法によって陽
性であると判明した血清は全て、遺伝子組み換え型ｐ５
７／ｃタンパク質を用いたＥＬＩＳＡシステムにおいて
も陽性であった。特異性は、５匹の非感染ラットから得
た血清及び遺伝子組み換え型ＧＳＴタンパク質を用いて
試験した。ＥＬＩＳＡ試験は何れも、遺伝子組み換え型
ｐ５７／ｃタンパク質に対する抗体を検出するのに極め
て特異性が高いことが判明した：稀釈比が１：８０にお
いて、非感染ラットの血清は、ＯＤ範囲が０．０２６か
ら０．０５１までであり、またＢＤＶ感染ラット血清は
０．３６３から０．５６６までであった。非特異的バッ
クグラウンドは、稀釈比が１：４０以上の場合全く認め
られなかった。
タンパク質に対する特異的且つ高感度のＥＬＩＳＡを確
立するために、最適抗原濃度を、下記する抗原濃度に対
する陽性及び陰性のラット血清のチェッカ−ボ−ド滴定
を行って決定した：即ち、３１、６２、１２５、２５０
ｎｇ／ウエル。最も直線的な応答を与える最適濃度は、
３１ｎｇ／ウエルであった。遺伝子組み換え型Ｐ５７／
ｃＢＤＶタンパク質に対するＥＬＩＳＡシステムの感度
は、実験的に感染させたラットから感染（ｐ．ｉ．）後
４０、５０及び６０日目に得た、ＩＦＡ（タイタ−は、
１：２２８０から１：５１２０までの範囲）及びウエス
タンブロット解析によって反応性を有することが判明し
ている血清を用いて決定した。これらの方法によって陽
性であると判明した血清は全て、遺伝子組み換え型ｐ５
７／ｃタンパク質を用いたＥＬＩＳＡシステムにおいて
も陽性であった。特異性は、５匹の非感染ラットから得
た血清及び遺伝子組み換え型ＧＳＴタンパク質を用いて
試験した。ＥＬＩＳＡ試験は何れも、遺伝子組み換え型
ｐ５７／ｃタンパク質に対する抗体を検出するのに極め
て特異性が高いことが判明した：稀釈比が１：８０にお
いて、非感染ラットの血清は、ＯＤ範囲が０．０２６か
ら０．０５１までであり、またＢＤＶ感染ラット血清は
０．３６３から０．５６６までであった。非特異的バッ
クグラウンドは、稀釈比が１：４０以上の場合全く認め
られなかった。
【００３５】実施例５ ｐ９．５ＢＤＶ−遺伝子のクロ−ニング及び発現：ｐ
９．５ＢＤＶタンパク質のオ−プンリ−ディングフレ−
ムをＢ８クロ−ンのｃＤＮＡ〔バンデウ−デ（VandeWou
de）ら、(1990) Science 250,p.1278-1281〕及びＢＤＶ
の野性型単離株（ウマ）から下記するプライマ−を用い
て増幅させた： ３’プライマ−（アンチセンス）：ＧＣＧＧＡＡＴＴＣ
ＴＣＡＴＣＡＴＴＣＧＡＴＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣ（Ｓ
ｅｑ．−ＩＤ８） ５’プライマ−（センス）：ＡＴＡＧＧＡＴＣＣ ＡＴ
ＧＡＧＴＴＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＣ（Ｓｅｑ．−ＩＤ
９）
９．５ＢＤＶタンパク質のオ−プンリ−ディングフレ−
ムをＢ８クロ−ンのｃＤＮＡ〔バンデウ−デ（VandeWou
de）ら、(1990) Science 250,p.1278-1281〕及びＢＤＶ
の野性型単離株（ウマ）から下記するプライマ−を用い
て増幅させた： ３’プライマ−（アンチセンス）：ＧＣＧＧＡＡＴＴＣ
ＴＣＡＴＣＡＴＴＣＧＡＴＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣ（Ｓ
ｅｑ．−ＩＤ８） ５’プライマ−（センス）：ＡＴＡＧＧＡＴＣＣ ＡＴ
ＧＡＧＴＴＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＣ（Ｓｅｑ．−ＩＤ
９）
【００３６】ＰＣＲ反応の条件は、実施例１において記
載した通りである。増幅生成物は、アガロ−セゲルから
精製し、制限酵素ＢａｍＨｉ及びＥｃｏＲＩ〔プロメガ
（Promega）社、マジソン、アメリカ〕を用いて制限部
位を解裂させた後プラスミドベクタ−ｐＧＥＸ−２Ｔ
〔ファルマシア（Pharmacia）社、フライブルク、ドイ
ツ；Ｎｏ． ２７−４８０１−０１）にクロ−ニングし
た。ウイルス遺伝子をｔａｃプロモ−タ−によって制御
されるSchistosoma japonicumのグルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラ−ゼ（ＧＳＴ）に融合させた。この発現プ
ラスミドをコンピ−テントセルであるＥ．ｃｏｌｉ Ｓ
ｕｒｅ TM−ｃｅｌｌに形質転換させた。組み換えプラ
スミドは、制限解析法びＤＮＡ−塩基配列決定法を用い
て解析した。この野性型単離株から得たクロ−ニング処
理フラグメント（ｐＧＥＸ−−ｐ９．５）のＤＮＡ塩基
配列を図９に示す。
載した通りである。増幅生成物は、アガロ−セゲルから
精製し、制限酵素ＢａｍＨｉ及びＥｃｏＲＩ〔プロメガ
（Promega）社、マジソン、アメリカ〕を用いて制限部
位を解裂させた後プラスミドベクタ−ｐＧＥＸ−２Ｔ
〔ファルマシア（Pharmacia）社、フライブルク、ドイ
ツ；Ｎｏ． ２７−４８０１−０１）にクロ−ニングし
た。ウイルス遺伝子をｔａｃプロモ−タ−によって制御
されるSchistosoma japonicumのグルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラ−ゼ（ＧＳＴ）に融合させた。この発現プ
ラスミドをコンピ−テントセルであるＥ．ｃｏｌｉ Ｓ
ｕｒｅ TM−ｃｅｌｌに形質転換させた。組み換えプラ
スミドは、制限解析法びＤＮＡ−塩基配列決定法を用い
て解析した。この野性型単離株から得たクロ−ニング処
理フラグメント（ｐＧＥＸ−−ｐ９．５）のＤＮＡ塩基
配列を図９に示す。
【００３７】実施例６ Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｐ９．５ＢＤＶ−タンパク質の発
現及び精製：ｐＧＥＸ−ｐ９．５含有Ｅ．ｃｏｌｉの１
００ｍｌを０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリン添加ＬＢ−
培地〔セルバ（Serva）社、ハイデルベルク、ドイツ〕
において一夜培養した。この一夜培養した培養物をアン
ピシリン添加ＬＢ−培地の１リットルに稀釈し、２ない
し４時間対数成育期にまで増殖させた。ＧＳＴ−ｐ９．
５融合タンパク質の発現は４時間ＩＰＴＧ〔０．１ｍ
ｇ；プロメガ（Promega）社、ハイデルベルク、ドイ
ツ〕を用いて誘導した。バクテリアを遠心分離する（５
９００ｇ、１０分、４°Ｃ）ことによってペレット化
し、ＰＢＳ中に再分散させた。細胞を氷上で音波破砕処
理することによって溶解させ、細胞断片を遠心分離（９
８００ｇ、１０分、４°Ｃ）することによってペレット
化させた。このように音波破砕処理した融合タンパク質
の上澄液をグルタチオンを含むアフィニティ−マトリッ
クス（グルタチオンセファロ−ス４Ｂ；ファルマシア
社、Ｎｏ．２７−４５７０−０１）に加えた。このＧＳ
Ｔ−ｐ９．５融合タンパク質のグルタチオンセファロ−
ス４Ｂを用いた精製は、メ−カ−のプロトコ−ルに従っ
て行った。溶出された融合タンパク質は、１ｘＰＢＳに
対して４°Ｃにて２４時間透析した。発現生成物は、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロット分析法で解析した。
現及び精製：ｐＧＥＸ−ｐ９．５含有Ｅ．ｃｏｌｉの１
００ｍｌを０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリン添加ＬＢ−
培地〔セルバ（Serva）社、ハイデルベルク、ドイツ〕
において一夜培養した。この一夜培養した培養物をアン
ピシリン添加ＬＢ−培地の１リットルに稀釈し、２ない
し４時間対数成育期にまで増殖させた。ＧＳＴ−ｐ９．
５融合タンパク質の発現は４時間ＩＰＴＧ〔０．１ｍ
ｇ；プロメガ（Promega）社、ハイデルベルク、ドイ
ツ〕を用いて誘導した。バクテリアを遠心分離する（５
９００ｇ、１０分、４°Ｃ）ことによってペレット化
し、ＰＢＳ中に再分散させた。細胞を氷上で音波破砕処
理することによって溶解させ、細胞断片を遠心分離（９
８００ｇ、１０分、４°Ｃ）することによってペレット
化させた。このように音波破砕処理した融合タンパク質
の上澄液をグルタチオンを含むアフィニティ−マトリッ
クス（グルタチオンセファロ−ス４Ｂ；ファルマシア
社、Ｎｏ．２７−４５７０−０１）に加えた。このＧＳ
Ｔ−ｐ９．５融合タンパク質のグルタチオンセファロ−
ス４Ｂを用いた精製は、メ−カ−のプロトコ−ルに従っ
て行った。溶出された融合タンパク質は、１ｘＰＢＳに
対して４°Ｃにて２４時間透析した。発現生成物は、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロット分析法で解析した。
【００３８】ウイルスに特異的なＧＳＴ−ｐ９．５融合
タンパク質の遺伝子組み換えｐＧＥＸ−ｐ９．５クロ−
ンによる発現は、ＩＰＴＧによる処理を行ったか又は行
わなかったＥ．ｃｏｌｉの溶解物を使用してイムノブロ
ッティングで解析した。対照として、非遺伝子組み換え
ｐＧＥＸ−２Ｔプラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ
の溶解物を用いた。次に、溶出した融合タンパク質の品
質をＢＤＶ−特異的であるラットとウサギの抗血清を用
いてウエスタンブロット解析法にて解析した。かくして
精製したＧＳＴ−ｐ９．５は、ラットとウサギから得た
ウイルス特異的抗血清によって分子量が約３５である明
瞭なバンドとして容易に検出された；融合タンパク質の
２６キロダルトンは、ＧＳＴタンパク質を表し、またほ
ぼ９キロダルトンは、ｐ９．５ ＢＤＶ−タンパク質を
表わす。
タンパク質の遺伝子組み換えｐＧＥＸ−ｐ９．５クロ−
ンによる発現は、ＩＰＴＧによる処理を行ったか又は行
わなかったＥ．ｃｏｌｉの溶解物を使用してイムノブロ
ッティングで解析した。対照として、非遺伝子組み換え
ｐＧＥＸ−２Ｔプラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ
の溶解物を用いた。次に、溶出した融合タンパク質の品
質をＢＤＶ−特異的であるラットとウサギの抗血清を用
いてウエスタンブロット解析法にて解析した。かくして
精製したＧＳＴ−ｐ９．５は、ラットとウサギから得た
ウイルス特異的抗血清によって分子量が約３５である明
瞭なバンドとして容易に検出された；融合タンパク質の
２６キロダルトンは、ＧＳＴタンパク質を表し、またほ
ぼ９キロダルトンは、ｐ９．５ ＢＤＶ−タンパク質を
表わす。
【００３９】実施例７ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−Ｔｒｉｃｉｎ及
びウエスタンブロット解析：精製した 遺伝子組み換え
型ＧＳＴ−ｐ９．５とＧＳＴタンパク質、ＢＤＶ非感染
とＢＤＶ感染ＯｌｉｇｏＴＬ細胞の溶解物並びにＢＤＶ
非感染とＢＤＶ感染ラットの脳ホモジネ−トの１０ｍｌ
をＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Laemmli、1970）中に分散
させ、２時間１００°Ｃに加熱し、１２％ポリアクリル
アミドを含有するゲル上におけるドデシル硫酸ナトリウ
ム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）によって分離させた。かくして分離したタンパク
質を電気ブロッティングによってニトロセルロ−ス膜上
に転写した。ウサギ及びラットから得たポリクロ−ナル
抗血清と単一特異的ウサギ抗ＧＳＴ−ｐ９．５抗血清
を、０．５％のＴｗｅｅｎ−８０と５％のＢＳＡとを含
有するＰＢＳに１：１００の比率で稀釈した。ニトロセ
ルロ−スの断片をそれぞれの稀釈抗血清と共に４°Ｃに
おいて一夜培養した。これらの断片を ＰＢＳ／０．５
％Ｔｗｅｅｎ−２０（洗浄用緩衝液）で三回洗浄した
後、ビオチンでマ−クした抗種抗体〔アメルシャム（Am
ersham）社、ブラウンシュバイク、ドイツ〕と共に希釈
比１：１、０００にて培養した。洗浄用緩衝液で三回洗
浄した後、これらのニトロセルロ−ス断片を、洗浄用緩
衝液に１：２、０００の比で希釈したストレプタビジン
ン接合ホ−スラディッシュペルオキシダ−ゼ〔アメルシ
ャム（Amersham）社、ブラウンシュバイク、ドイツ〕と
共に培養した。最後に、コレラ断片をＰＢＳ中にて三回
洗浄し、次いで０．５ｍｇ／ｍｌの４−クロロ−１−ナ
フト−ル、２０％（ｖ／ｖ）メタノ−ル及び０．４ｍｌ
／ｍｌのＨ2 Ｏ2 からなる溶液中で染色した。
びウエスタンブロット解析：精製した 遺伝子組み換え
型ＧＳＴ−ｐ９．５とＧＳＴタンパク質、ＢＤＶ非感染
とＢＤＶ感染ＯｌｉｇｏＴＬ細胞の溶解物並びにＢＤＶ
非感染とＢＤＶ感染ラットの脳ホモジネ−トの１０ｍｌ
をＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Laemmli、1970）中に分散
させ、２時間１００°Ｃに加熱し、１２％ポリアクリル
アミドを含有するゲル上におけるドデシル硫酸ナトリウ
ム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）によって分離させた。かくして分離したタンパク
質を電気ブロッティングによってニトロセルロ−ス膜上
に転写した。ウサギ及びラットから得たポリクロ−ナル
抗血清と単一特異的ウサギ抗ＧＳＴ−ｐ９．５抗血清
を、０．５％のＴｗｅｅｎ−８０と５％のＢＳＡとを含
有するＰＢＳに１：１００の比率で稀釈した。ニトロセ
ルロ−スの断片をそれぞれの稀釈抗血清と共に４°Ｃに
おいて一夜培養した。これらの断片を ＰＢＳ／０．５
％Ｔｗｅｅｎ−２０（洗浄用緩衝液）で三回洗浄した
後、ビオチンでマ−クした抗種抗体〔アメルシャム（Am
ersham）社、ブラウンシュバイク、ドイツ〕と共に希釈
比１：１、０００にて培養した。洗浄用緩衝液で三回洗
浄した後、これらのニトロセルロ−ス断片を、洗浄用緩
衝液に１：２、０００の比で希釈したストレプタビジン
ン接合ホ−スラディッシュペルオキシダ−ゼ〔アメルシ
ャム（Amersham）社、ブラウンシュバイク、ドイツ〕と
共に培養した。最後に、コレラ断片をＰＢＳ中にて三回
洗浄し、次いで０．５ｍｇ／ｍｌの４−クロロ−１−ナ
フト−ル、２０％（ｖ／ｖ）メタノ−ル及び０．４ｍｌ
／ｍｌのＨ2 Ｏ2 からなる溶液中で染色した。
【００４０】Ｔｒｉｃｉｎ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて
アフィニティ−精製したタンパク質を分離した；Ｔｒｉ
ｃｉｎは、小型のタンパク質の分離を可能ならしめるも
のである。要約すれば、１２％アクリルアミドゲルを上
記したようにして作製した。陽極緩衝液は、０．２ＭＴ
ｒｉｓ（ｐＨ８．９）から成り、また陰極緩衝液は、
０．１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．２５）、０．１ＭＴｒｉｃ
ｉｎ及び０．１％ＳＤＳから成るものであった〔シェ−
ガ−及びヤ−ゴウ（Schaegger & Jagow)、1987〕。Ｔｒ
ｉｃｉｎ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによる分離タンパク質
は、更に上記したと同じくイムノブロッティング法によ
って解析した。
アフィニティ−精製したタンパク質を分離した；Ｔｒｉ
ｃｉｎは、小型のタンパク質の分離を可能ならしめるも
のである。要約すれば、１２％アクリルアミドゲルを上
記したようにして作製した。陽極緩衝液は、０．２ＭＴ
ｒｉｓ（ｐＨ８．９）から成り、また陰極緩衝液は、
０．１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．２５）、０．１ＭＴｒｉｃ
ｉｎ及び０．１％ＳＤＳから成るものであった〔シェ−
ガ−及びヤ−ゴウ（Schaegger & Jagow)、1987〕。Ｔｒ
ｉｃｉｎ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによる分離タンパク質
は、更に上記したと同じくイムノブロッティング法によ
って解析した。
【００４１】実施例８ 抗血清の製造：ＧＳＴ−ｐ９．５融合タンパク質に対す
る多価、単一特異的抗血清を，コンプリ−トアジュバン
ト（ＣＦＡ）中１ｍｇのＧＳＴ−ｐ９．５融合タンパク
質を皮下注入して免疫処理したウサギから得た。４週間
後及び８週間後に、このウサギに同量の抗原でブ−スタ
−免疫を付与し、最後の免疫処理操作後１週間飼育し
た。この血清は、ＢＤＶ感染させたＭＤＣＫ細胞及び未
感染ＭＤＣＫ細胞における間接蛍光抗体法並びにウエス
タンブロット解析法でその反応性を試験した。
る多価、単一特異的抗血清を，コンプリ−トアジュバン
ト（ＣＦＡ）中１ｍｇのＧＳＴ−ｐ９．５融合タンパク
質を皮下注入して免疫処理したウサギから得た。４週間
後及び８週間後に、このウサギに同量の抗原でブ−スタ
−免疫を付与し、最後の免疫処理操作後１週間飼育し
た。この血清は、ＢＤＶ感染させたＭＤＣＫ細胞及び未
感染ＭＤＣＫ細胞における間接蛍光抗体法並びにウエス
タンブロット解析法でその反応性を試験した。
【００４２】この抗血清を、−２０°Ｃにて６０分間ア
セトン中てに固定化処理したＢＶＤ永続感染させたＭＤ
ＣＫ細胞に適用した。この単一特異的抗血清は、感染細
胞の核に主として局在するウイルス特異的タンパク質を
認識した。この染色パタ−ンは、ｐ３８ ＢＤＶ−タン
パク質に特異的であるモノクロ−ナル又は単一特異的抗
体との反応に類似している。ＦＩＴＣ及びＴＲＩＴＣ−
標識化二次抗体を用いた二重蛍光抗体法を行ったとこ
ろ、このｐ９．５ ＢＤＶ−タンパク質は、ＢＤＶの推
定核タンパク質であるｐ３８ ＢＤＶ−タンパク質と共
に感染細胞の核内において局在化していることが明らか
となった。更には、実験的にＢＤＶに感染させたラット
の脳部分を単一特異的抗−ＧＳＴ−ｐ９．５ウサギ抗血
清と共に培養した。ウイルス抗原は、ラットの中枢神経
系において感染ニュ−ロンの核及び細胞質全体において
検出された。
セトン中てに固定化処理したＢＶＤ永続感染させたＭＤ
ＣＫ細胞に適用した。この単一特異的抗血清は、感染細
胞の核に主として局在するウイルス特異的タンパク質を
認識した。この染色パタ−ンは、ｐ３８ ＢＤＶ−タン
パク質に特異的であるモノクロ−ナル又は単一特異的抗
体との反応に類似している。ＦＩＴＣ及びＴＲＩＴＣ−
標識化二次抗体を用いた二重蛍光抗体法を行ったとこ
ろ、このｐ９．５ ＢＤＶ−タンパク質は、ＢＤＶの推
定核タンパク質であるｐ３８ ＢＤＶ−タンパク質と共
に感染細胞の核内において局在化していることが明らか
となった。更には、実験的にＢＤＶに感染させたラット
の脳部分を単一特異的抗−ＧＳＴ−ｐ９．５ウサギ抗血
清と共に培養した。ウイルス抗原は、ラットの中枢神経
系において感染ニュ−ロンの核及び細胞質全体において
検出された。
【００４３】実施例９ 抗体媒介アフィニティ−クロマトグラフィ−：この方法
は、ハ−スら〔Haas et al.,J. Gen.Virol.67(1986),p.
235-241〕によって発表されたものである。要約すれ
ば、セファロ−スＣＬ−６Ｂをフォログルシノ−ル（ph
oroglucinol）及びエピクロロヒドリンで処理し、臭化
シアンをアセトニトリルに溶かした溶液で活性化させ、
次いで単一特異的ウサギの抗−ＧＳＴ−ｐ９．５血清の
ガンマグロブリンフラクションと４°Ｃにおいて一夜接
合させた。タンパク質は、充填した活性化セファロ−ス
１０ｍｌにつきほぼ３００ｍｇ使用した。かくして抗体
でコ−ト処理したセファロ−スを充填したカラムをＰＢ
Ｓで平衡化させた。組織又は細胞の抽出物を適用した
後、カラムをＰＢＳ／１Ｍ ＮａＣｌで充分に洗浄し、
最後にＴｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液（ＴＮ）のみで洗浄し
た。免疫吸着剤上に残留する物質をＰＢＳ／１Ｍ Ｎａ
ＣｌＯ4 で溶出させ、溶出液は、ウルトラフリ−ＭＣ
１０ｋｄ−フィルタ−〔ミリポア−（Millipore）社、
ドイツ〕を用いて４°Ｃにて遠心分離透析で濃縮した。
は、ハ−スら〔Haas et al.,J. Gen.Virol.67(1986),p.
235-241〕によって発表されたものである。要約すれ
ば、セファロ−スＣＬ−６Ｂをフォログルシノ−ル（ph
oroglucinol）及びエピクロロヒドリンで処理し、臭化
シアンをアセトニトリルに溶かした溶液で活性化させ、
次いで単一特異的ウサギの抗−ＧＳＴ−ｐ９．５血清の
ガンマグロブリンフラクションと４°Ｃにおいて一夜接
合させた。タンパク質は、充填した活性化セファロ−ス
１０ｍｌにつきほぼ３００ｍｇ使用した。かくして抗体
でコ−ト処理したセファロ−スを充填したカラムをＰＢ
Ｓで平衡化させた。組織又は細胞の抽出物を適用した
後、カラムをＰＢＳ／１Ｍ ＮａＣｌで充分に洗浄し、
最後にＴｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液（ＴＮ）のみで洗浄し
た。免疫吸着剤上に残留する物質をＰＢＳ／１Ｍ Ｎａ
ＣｌＯ4 で溶出させ、溶出液は、ウルトラフリ−ＭＣ
１０ｋｄ−フィルタ−〔ミリポア−（Millipore）社、
ドイツ〕を用いて４°Ｃにて遠心分離透析で濃縮した。
【００４４】ＢＤＶ感染細胞からｐ９．５ＢＤＶ−タン
パク質を精製するために、ＢＤＶ−感染ＯｌｉｇｏＴＬ
細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで培養皿の底からかきとっ
た。この細胞分散液をＰＢＳで洗浄し、次いで再分散さ
せ、１０秒間三回音波破砕処理した。この細胞ホモジネ
−トを遠心分離（５０００ ｇ、１０分、４°Ｃ）し、
得られた上澄液を抗−ｐ９．５抗体を充填したカラムに
適用した。カラムを上記したように洗浄し、次いで溶出
させた。同様にして、ＢＤＶ感染ラットの脳をＴＮ−緩
衝液中でホモジネ−ト処理した１０％ホモジネ−トを、
１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．５％デオキシコ
−ル酸塩を添加してから室温において１時間攪拌した。
このホモジネ−トをベックマン４５ Ｔｉロ−タにおい
て３０，０００ｒ．ｐ．ｍ．で２時間遠心分離した。上
澄液を上記したようにアフィニティ−カラムに適用し、
処理した。
パク質を精製するために、ＢＤＶ−感染ＯｌｉｇｏＴＬ
細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで培養皿の底からかきとっ
た。この細胞分散液をＰＢＳで洗浄し、次いで再分散さ
せ、１０秒間三回音波破砕処理した。この細胞ホモジネ
−トを遠心分離（５０００ ｇ、１０分、４°Ｃ）し、
得られた上澄液を抗−ｐ９．５抗体を充填したカラムに
適用した。カラムを上記したように洗浄し、次いで溶出
させた。同様にして、ＢＤＶ感染ラットの脳をＴＮ−緩
衝液中でホモジネ−ト処理した１０％ホモジネ−トを、
１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．５％デオキシコ
−ル酸塩を添加してから室温において１時間攪拌した。
このホモジネ−トをベックマン４５ Ｔｉロ−タにおい
て３０，０００ｒ．ｐ．ｍ．で２時間遠心分離した。上
澄液を上記したようにアフィニティ−カラムに適用し、
処理した。
【００４５】二種類の抗体源を用いた抗体媒介アフィニ
ティ−精製法を行ったところ、分子量がほぼ９．５ｋｄ
であるウイルス特異的タンパク質が明瞭に単離された；
この９．５ ＢＤＶ−タンパク質は、ＤＩＧグリコン
（DIG glycon）検出キットを用いて分析したが、糖側鎖
は含んでいない。
ティ−精製法を行ったところ、分子量がほぼ９．５ｋｄ
であるウイルス特異的タンパク質が明瞭に単離された；
この９．５ ＢＤＶ−タンパク質は、ＤＩＧグリコン
（DIG glycon）検出キットを用いて分析したが、糖側鎖
は含んでいない。
【００４６】実施例１０ ＥＬＩＳＡ：ＢＤＶに感染させたラットから得た抗体産
生性ハイブリド−マ及び血清のスクリ−ニングは、遺伝
子組み換えＧＳＴ−ｐ５７／ｃタンパク質及び対照タン
パク質としてＧＳＴを用いて実施した。
生性ハイブリド−マ及び血清のスクリ−ニングは、遺伝
子組み換えＧＳＴ−ｐ５７／ｃタンパク質及び対照タン
パク質としてＧＳＴを用いて実施した。
【００４７】９６ウエルのマイクロタイタ−プレ−ト
（グライナ−（Greiner）社、ドイツ）を、５０ｕｌの
緩衝液（１０００ｍｌＨ2 Ｏ中に１．５９ｇＮａ2 ＣＯ
3 、２．９３ｇＮａＨＣＯ3 及び０．２０ｇＮａＮ3 ）
中ウエル１個当り３１及び１２５ｎｇの遺伝子組み換え
ＧＳＴｐ５７／ｃ又はＧＳＴタンパク質で４°Ｃにおい
て一晩コ−トした。プレ−トは、洗浄用緩衝液（ＰＢＳ
中０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で三回洗浄し、次いでブ
ロッキング緩衝液（０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰ
ＢＳ中０．５％ゼラチン、１％ＢＳＡ、０．１％チメロ
サ−ル）と共に室温において１時間培養した。このマイ
クロタイタ−プレ−トを三回洗浄用緩衝液で洗浄し、血
清の二倍稀釈液をブロッキング緩衝液で作製した。この
血清を１：２０ないし１：１０、２４０までに稀釈した
液のそれぞれの５０ｕｌを各ウエルに加え、室温で１時
間培養した。プレ−トを三回洗浄用緩衝液で洗浄し、ビ
オチン接合したラット抗血清又は抗マウスＩｇＧ及びＩ
ｇＭをブロッキング緩衝液で１：１０，０００に稀釈し
た液を各ウエルに加え、室温で１時間培養した。三回洗
浄した後、プレ−トをストレプタビジン（streptavidi
n、アメルシャム（Amersham）社、Braunschweig）に接
合したセイヨウワサビペルオキシダ−ゼをブロッキング
緩衝液で１：１０，０００に稀釈した液と共に培養し
た。このプレ−トを三回洗浄した後で、２００ｕｌの基
質溶液を各ウエルに加えたが、この基質溶液は、５０ｍ
ｌのＨ2 Ｏ中において０．５ＭＮａ2 ＰＯ4 、０．１Ｍ
クエン酸、２０ｍｇフェニルジアミン及び２０ｍｌ３０
％Ｈ2 Ｏ2 を含んで成るものであった。これらのプレ−
トを室温で５ないし１０分間培養し、反応を各ウエルに
５０ｕｌの硫酸を添加することによって停止させた。４
９２ｎｍにおける吸光度を各ウエルについてマイクロプ
レ−トリダ−を用いて測定した。一次抗血清を含まない
ネガティブコントロ−ルウエルをいて補正を行った。各
血清に対するＥＬＩＳＡタイタ−は、光学密度として
０．２を生じる終点稀釈比であると定義した。回復期及
びコントロ−ルのラット血清を用いて行ったこの試験の
結果を図１１に示す。
（グライナ−（Greiner）社、ドイツ）を、５０ｕｌの
緩衝液（１０００ｍｌＨ2 Ｏ中に１．５９ｇＮａ2 ＣＯ
3 、２．９３ｇＮａＨＣＯ3 及び０．２０ｇＮａＮ3 ）
中ウエル１個当り３１及び１２５ｎｇの遺伝子組み換え
ＧＳＴｐ５７／ｃ又はＧＳＴタンパク質で４°Ｃにおい
て一晩コ−トした。プレ−トは、洗浄用緩衝液（ＰＢＳ
中０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で三回洗浄し、次いでブ
ロッキング緩衝液（０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰ
ＢＳ中０．５％ゼラチン、１％ＢＳＡ、０．１％チメロ
サ−ル）と共に室温において１時間培養した。このマイ
クロタイタ−プレ−トを三回洗浄用緩衝液で洗浄し、血
清の二倍稀釈液をブロッキング緩衝液で作製した。この
血清を１：２０ないし１：１０、２４０までに稀釈した
液のそれぞれの５０ｕｌを各ウエルに加え、室温で１時
間培養した。プレ−トを三回洗浄用緩衝液で洗浄し、ビ
オチン接合したラット抗血清又は抗マウスＩｇＧ及びＩ
ｇＭをブロッキング緩衝液で１：１０，０００に稀釈し
た液を各ウエルに加え、室温で１時間培養した。三回洗
浄した後、プレ−トをストレプタビジン（streptavidi
n、アメルシャム（Amersham）社、Braunschweig）に接
合したセイヨウワサビペルオキシダ−ゼをブロッキング
緩衝液で１：１０，０００に稀釈した液と共に培養し
た。このプレ−トを三回洗浄した後で、２００ｕｌの基
質溶液を各ウエルに加えたが、この基質溶液は、５０ｍ
ｌのＨ2 Ｏ中において０．５ＭＮａ2 ＰＯ4 、０．１Ｍ
クエン酸、２０ｍｇフェニルジアミン及び２０ｍｌ３０
％Ｈ2 Ｏ2 を含んで成るものであった。これらのプレ−
トを室温で５ないし１０分間培養し、反応を各ウエルに
５０ｕｌの硫酸を添加することによって停止させた。４
９２ｎｍにおける吸光度を各ウエルについてマイクロプ
レ−トリダ−を用いて測定した。一次抗血清を含まない
ネガティブコントロ−ルウエルをいて補正を行った。各
血清に対するＥＬＩＳＡタイタ−は、光学密度として
０．２を生じる終点稀釈比であると定義した。回復期及
びコントロ−ルのラット血清を用いて行ったこの試験の
結果を図１１に示す。
【００４８】この遺伝子組み換え型ＢＤＶ ｐ９．５タ
ンパク質に対する特異的且つ高感度のＥＬＩＳＡを確立
するために、最適抗原濃度を、下記する抗原濃度に対す
る陽性及び陰性ラット血清についてチェッカ−ボ−ド滴
定を行って決定した：即ち、３１、６２、１２５、２５
０ｎｇ／ウエル。最も直線的な応答を与える最適濃度
は、３１ｎｇ／ウエルであった。遺伝子組み換え型ｐ
９．５ ＢＤＶ−タンパク質に対するＥＬＩＳＡシステ
ムの感度は、実験的に感染させたラットから感染（ｐ．
ｉ．）後４０、５０及び６０日目に得た、ＩＦＡ（タイ
タ−は、１：２２８０から１：５１２０までの範囲）及
びウエスタンブロット解析によって反応性を有すること
が判明している血清を用いて決定した。これらの方法に
よって陽性であると判明した血清は全て、遺伝子組み換
え型ｐ９．５タンパク質を用いたＥＬＩＳＡシステムに
おいても陽性であった。特異性は、５匹の非感染ラット
から得た血清及び遺伝子組み換え型ＧＳＴタンパク質を
用いて試験した。ＥＬＩＳＡ試験は何れも、遺伝子組み
換え型ｐ５７／ｃＢＤＶ−タンパク質に対する抗体を検
出するのに極めて特異性が高いことが判明した：稀釈比
が１：８０において、非感染ラットの血清は、ＯＤ範囲
が０．０２６から０．０５１までであり、またＢＤＶ感
染ラット血清は０．３６３から０．５６６までであっ
た。非特異的バックグラウンドは、稀釈比が１：４０以
上の場合全く認められなかった。
ンパク質に対する特異的且つ高感度のＥＬＩＳＡを確立
するために、最適抗原濃度を、下記する抗原濃度に対す
る陽性及び陰性ラット血清についてチェッカ−ボ−ド滴
定を行って決定した：即ち、３１、６２、１２５、２５
０ｎｇ／ウエル。最も直線的な応答を与える最適濃度
は、３１ｎｇ／ウエルであった。遺伝子組み換え型ｐ
９．５ ＢＤＶ−タンパク質に対するＥＬＩＳＡシステ
ムの感度は、実験的に感染させたラットから感染（ｐ．
ｉ．）後４０、５０及び６０日目に得た、ＩＦＡ（タイ
タ−は、１：２２８０から１：５１２０までの範囲）及
びウエスタンブロット解析によって反応性を有すること
が判明している血清を用いて決定した。これらの方法に
よって陽性であると判明した血清は全て、遺伝子組み換
え型ｐ９．５タンパク質を用いたＥＬＩＳＡシステムに
おいても陽性であった。特異性は、５匹の非感染ラット
から得た血清及び遺伝子組み換え型ＧＳＴタンパク質を
用いて試験した。ＥＬＩＳＡ試験は何れも、遺伝子組み
換え型ｐ５７／ｃＢＤＶ−タンパク質に対する抗体を検
出するのに極めて特異性が高いことが判明した：稀釈比
が１：８０において、非感染ラットの血清は、ＯＤ範囲
が０．０２６から０．０５１までであり、またＢＤＶ感
染ラット血清は０．３６３から０．５６６までであっ
た。非特異的バックグラウンドは、稀釈比が１：４０以
上の場合全く認められなかった。
【図１】タンパク質ｐ５７のアミノ酸配列を示す（Ｓｅ
ｑ．− ＩＤ １）。
ｑ．− ＩＤ １）。
【図２】図１の続き。
【図３】図２の続き。
【図４】タンパク質９．５のアミノ酸配列を示す（Ｓｅ
ｑ．−ＩＤ ２）。
ｑ．−ＩＤ ２）。
【図５】タンパク質ｐ５７のＣ−タ−ミナルに対応する
ポリペプチドのアミノ酸配列を示す（Ｓｅｑ．−ＩＤ
３）。
ポリペプチドのアミノ酸配列を示す（Ｓｅｑ．−ＩＤ
３）。
【図６】図５の続き。
【図７】タンパク質ｐ５７のＤＮＡ配列を示す（Ｓｅ
ｑ．−ＩＤ ４）。
ｑ．−ＩＤ ４）。
【図８】図７の続き。
【図９】タンパク質９．５のＤＮＡ配列を示す（Ｓｅ
ｑ．−ＩＤ ５）。
ｑ．−ＩＤ ５）。
【図１０】実施例４において記載したＥＬＩＳＡ試験に
よって得られた結果を示す。
よって得られた結果を示す。
【図１１】実施例１０において記載したＥＬＩＳＡ試験
によって得られた結果を示す。
によって得られた結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ａ６１Ｋ 37/02
Claims (17)
- 【請求項１】 ボルナ病ウイルスによってコ−ドされ，
図１−３または図４においてそれぞれ示すアミノ酸配列
のうちの少なくとも１０個の連続したアミノ酸配列を有
するタンパク質ｐ５７またはｐ９．５のアミノ酸配列に
相当するポリペプチド。 - 【請求項２】 該タンパク質ｐ５７またはｐ９．５がそ
れぞれ、ボルナ病ウイルスの野性型単離株によってコ−
ドされることを特徴とする、請求項１において記載され
たポリペプチド。 - 【請求項３】 該ポリペプチドが、図１−３または図４
にそれぞれ示したアミノ酸配列のうちの少なくとも２５
個の連続したアミノ酸の配列を有することを特徴とす
る、請求項１又は２において記載されたポリペプチド。 - 【請求項４】 該ポリペプチドが、図１−３または図４
にそれぞれ示したアミノ酸配列のうちの少なくとも５０
個の連続したアミノ酸の配列を有することを特徴とす
る、請求項１乃至３のうちの何れか一項において記載さ
れたポリペプチド。 - 【請求項５】 該ポリペプチドが、図１−３または図４
にそれぞれ示したアミノ酸配列のうちの高々８０個の連
続したアミノ酸の配列を有することを特徴とする、請求
項１乃至４のうちの何れか一項において記載されたポリ
ペプチド。 - 【請求項６】 請求項１乃至５に記載されたポリペプチ
ドの少なくとも一種及び該ポリペプチドと測定するべき
抗体とによって形成される複合体を検出する標識とから
構成される、試料中のボルナ病ウイルスを標的とする抗
体を測定する試験キット。 - 【請求項７】 該標識が、測定さるべき抗体に特異的に
結合する抗体に連結されていることを特徴とする、請求
項６に記載された試験キット。 - 【請求項８】 該試験キット画、ＥＬＩＳＡ、ウエスタ
ンブロット、ＲＩＡ又はドットブロット試験を実施すた
めのキットであることを特徴とする、請求項６に記載さ
れた試験キット。 - 【請求項９】 該標識が、発色終点を生じる反応を接触
・触媒する酵素であることを特徴とする、請求項７に記
載された試験キット。 - 【請求項１０】 下記する二つの工程から成る，ボルナ
病ウイルスによる感染を決定する方法： ａ）測定するべき試料を請求項１乃至５において記載さ
れたポリペプチドの少なくとも一つに接触させ、以前の
ボルナ病ウイルスによる感染によって生成した抗体に該
ポリペプチドを結合させること。 ｂ）試験するべき試料に含まれる特異的抗に当ポリペプ
チドが結合したことを決定すること。 - 【請求項１１】 単離されたＤＮＡフラグメントにおい
て、当該ＤＮＡが請求項１乃至５において記載されたポ
リペプチドをコ−ドするものであるが、該ＤＮＡフラグ
メントは高々２４０塩基対を含有して成るもであること
を特徴とする、前記単離ＤＮＡフラグメント。 - 【請求項１２】 該ＤＮＡフラグメントが高々１５０塩
基対を含有して成ることを特徴とする、請求項７に記載
された単離ＤＮＡフラグメント。 - 【請求項１３】 該ＤＮＡ配列が、それぞれ図７，図８
又は図９において示す配列の一部分に相当することを特
徴とする、請求項１１又は１２に記載された単離ＤＮＡ
フラグメント。 - 【請求項１４】 単離されたＲＮＡフラグメントにおい
て、当該ＲＮＡが請求項１乃至５において記載されたポ
リペプチドをコ−ドするものであるが、但し該ＤＮＡフ
ラグメントは高々２４０塩基対を含有して成るものであ
ることを特徴とする、前記単離ＲＮＡフラグメント。 - 【請求項１５】 請求項１乃至５において記載されたポ
リペプチドをワクチンを製造するために使用する用途。 - 【請求項１６】 請求項１１乃至１３において記載され
たＤＮＡフラグメントを核酸免疫処理のために使用する
用途。 - 【請求項１７】 請求項１４において記載されたＲＮＡ
フラグメントを核酸免疫処理のために使用する用途。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE96102575.6 | 1996-02-21 | ||
| EP96102575A EP0791654A1 (en) | 1996-02-21 | 1996-02-21 | Polypeptides corresponding to the amino acid sequences of proteins p57 or p9.5 of Borna disease virus, nucleic acid fragments coding therefore and their use for diagnostic and immunization purposes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1023897A true JPH1023897A (ja) | 1998-01-27 |
Family
ID=8222494
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9054225A Pending JPH1023897A (ja) | 1996-02-21 | 1997-02-21 | ボルナ病ウイルスのタンパク質ｐ５７又は９．５のアミノ酸配列に相当するポリペプチド、これをコ−ドする核酸フラグメント並びに診断および免疫処置を目的とするこれらの用途 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6010700A (ja) |
| EP (1) | EP0791654A1 (ja) |
| JP (1) | JPH1023897A (ja) |
| AU (1) | AU726689B2 (ja) |
| CA (1) | CA2197847A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US6740486B1 (en) * | 1998-08-26 | 2004-05-25 | Salem International University (Salem-Teikyo University) | Nucleic acid and polypeptide p10 of a Borna Disease virus (BDV) and their use for diagnostic and immunization purposes |
| AU5493899A (en) * | 1998-08-26 | 2000-03-21 | Salem-Teikyo University | Nucleic acid and polypeptide p10 of a borna disease virus (bdv) and their use for diagnostic and immunization purposes |
| US6248535B1 (en) | 1999-12-20 | 2001-06-19 | University Of Southern California | Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens |
| US6602670B2 (en) * | 2000-12-01 | 2003-08-05 | Response Genetics, Inc. | Method of determining a chemotherapeutic regimen based on ERCC1 expression |
| US7049059B2 (en) | 2000-12-01 | 2006-05-23 | Response Genetics, Inc. | Method of determining a chemotherapeutic regimen based on ERCC1 and TS expression |
| ES2394630T3 (es) * | 2000-12-01 | 2013-02-04 | Response Genetics, Inc. | Método de determinación de la expresión génica del receptor del factor de crecimiento epidérmico y HER2-NEU y niveles de correlación de la misma con las tasas de supervivencia |
| US20020142328A1 (en) | 2000-12-01 | 2002-10-03 | Danenberg Kathleen D. | Method of determining a chemotherapeutic regimen by assaying gene expression in primary tumors |
| US7005278B2 (en) * | 2001-03-02 | 2006-02-28 | Danenberg Kathleen D | Method of determining dihydropyrimidine dehydrogenase gene expression |
| US6956111B2 (en) | 2001-03-02 | 2005-10-18 | Response Genetics, Inc. | Method of determining dihydropyrimidine dehydrogenase gene expression |
| US6686155B2 (en) * | 2001-06-14 | 2004-02-03 | Response Genetics, Inc. | Method of determining a chemotherapeutic regimen based on glutathione-S-transferase pi expression |
| EP1460426A1 (en) | 2003-03-20 | 2004-09-22 | Sysmex Corporation | Method for detecting antibody against BDV (Borna disease virus) for detecting a BDV infection |
| US20070054168A1 (en) * | 2005-09-06 | 2007-03-08 | Hao Chang | Zinc/air cell |
-
1996
- 1996-02-21 EP EP96102575A patent/EP0791654A1/en not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-01-30 AU AU12399/97A patent/AU726689B2/en not_active Ceased
- 1997-02-18 CA CA002197847A patent/CA2197847A1/en not_active Abandoned
- 1997-02-21 US US08/803,603 patent/US6010700A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-21 JP JP9054225A patent/JPH1023897A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6010700A (en) | 2000-01-04 |
| EP0791654A1 (en) | 1997-08-27 |
| AU1239997A (en) | 1997-08-28 |
| CA2197847A1 (en) | 1997-08-21 |
| AU726689B2 (en) | 2000-11-16 |
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