JPH10201496A - 環境微生物計数方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 効率よく且つ簡単に、夾雑物を含む環境試料
中に含まれる微生物総数を計数し、さらに、短時間の操
作により、環境微生物総数に対する特定菌の割合を求め
ることができる環境微生物計数方法を提供する。 【解決手段】 環境試料中に含まれる微生物数を測定す
る希釈平板法（コロニーカウント法）において、微生物
成分と相互作用した場合にのみ蛍光を発する染色剤を用
い、環境試料をプレート培地に展開直後に、該染色剤に
より染色された微生物が発する蛍光を測定することによ
って総微生物数を計数し、さらに、特定された培地で培
養を行って増殖させた後にコロニー数から特定微生物の
数を計数することにより、総微生物中の特定微生物の割
合を算出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物の計数方法
に関する。より詳細には、夾雑物を含む環境試料中に含
まれる微生物総数を効率よく且つ簡単に計数し、さらに
特定の栄養培地の中でのみ生育する特定菌のコロニーを
計数することにより、環境微生物総数に対する特定菌の
割合いを算出する方法に関する。さらに本発明は、栄養
要求性の違いによる特定の菌群を計数するコロニーカウ
ント法において、蛍光強度が検知可能になる程度まで菌
を培養すればよく、コロニーを目視できるまで生育させ
る従来の方法に比べてより短時間で計数できるコロニー
カウント法を提供する。

【０００２】

【従来の技術】近年、芳香族炭化水素、パラフィン、ナ
フテンなどの脂肪族炭化水素、トリクロロエチレンなど
の有機塩素系化合物、洗剤、その他生活排水などに含ま
れる様々な有機物などによる環境汚染が大きな問題とな
っており、これらの物質による環境汚染の拡大を防止す
るとともに、すでに汚染されてしまった環境を浄化し、
もとの状態に修複していく技術の確立が強く求められて
いる。

【０００３】この環境修復技術としては、例えば、有機
溶媒系の汚染物質の場合は、曝気処理、天日処理、真空
釜による処理、真空抽出処理などの物理化学的手段を挙
げることができるが、コスト、操作性、投下エネルギー
量、処理範囲などに問題があり、また、汚染物質の単な
る抽出であって無害な物質への変換ではないこと等の観
点から必ずしも実用的な技術であるとはいえない。

【０００４】そこで、上記の物理化学的方法に対して、
微生物を利用する方法が実用的に汚染環境を修復できる
ものとして期待されている。

【０００５】例えば、土壌汚染を引き起こしている芳香
族炭化水素や有機塩素系化合物などの難分解性化合物を
分解する種々の微生物が土壌中に見いだされており、こ
れらの微生物を活性化もしくは大量培養等の操作後、汚
染土壌に注入することによる土壌中の汚染物質の分解が
検討され始めている。また、遺伝子組換え技術により分
解活性を向上させた組換え微生物の土壌への散布も検討
され始めている。

【０００６】このような微生物を利用した環境修復技術
を普及させ、これを実用的かつ社会的に有効な技術とし
て定着させていくためには、様々な有用微生物の開発と
ともに、それらを導入した環境の管理、つまり、汚染環
境における導入微生物やその環境に従来存在していた在
来微生物の活動、増殖、伝搬、生残などの把握が重要な
課題となる。すなわち、導入された特定の微生物数を知
る方法と、従来存在していた微生物の総数を知る方法が
必要になる。

【０００７】微生物総数を計数する方法としては、フロ
ーサイトメーター（ＦＣＭ）をはじめとして数多くの方
法がある。これらの方法は簡便であり、環境試料の中で
の環境水のような場合には有効と考えられる。

【０００８】しかし、土壌懸濁液のような環境試料の場
合には、ＦＣＭ計測では、その流路径が通常、数十〜百
マイクロメーター程度しかなく、混入した微粒子等によ
って目詰まりしてしまうという問題がある。そのため、
ＦＣＭ計測では微生物が高度に精製されていることが必
要になる。

【０００９】一般に、土壌などの環境試料から微生物を
回収しようとする場合、まず、水もしくは緩衝液などの
分散媒に懸濁し、液中に分離した微生物を培養などの操
作後に計数する。このような微生物を液中に懸濁・分散
させる操作は、一見簡単であるが、その効率を明らかに
し、試料中の微生物の実数を正確に把握することは非常
に難しいことである。

【００１０】その主な原因としては、まず、荷電を挙げ
ることができる。一般に、細菌などの微生物は負の荷電
を帯びている。これに対して土壌粒子などの夾雑物は正
の荷電を有しているものもあり、そのため、一旦は分散
液中に分離された微生物も、比較的短時間のうちに再
び、凝集・吸着してしまい、計数されない場合がある。
この現象は、土壌などの環境試料の物理的性質（イオン
交換能など）に大きく左右され、試料毎にその程度は異
なる。

【００１１】第二の原因としては、バイオフィルム等の
粘着用物質の存在を挙げることができる。土壌細菌など
の微生物は、一般にバイオフィルムと呼ばれる形態で環
境中に生息している。バイオフィルムとは、細菌などの
微生物が分泌する粘着物質などが菌体同士、菌体と土壌
粒子等の担体とを相互に接着し、層状をなしたもので、
その組成・形状は微生物の種類、栄養状態などの環境因
子、土壌粒子などの担体の形状、組成などによって変化
し、当然、このバイオフィルムの強度が、分散液に分離
してくる微生物に大きく影響し、計数値を大きく変化さ
せる。つまり、環境試料の場合、試料毎にバイオフィル
ムの強度が異なり、微生物の分離効率は一定しないこと
になる。

【００１２】これらの理由により、土壌懸濁液からの微
生物の回収は困難であり、抽出効率を高めようとする
と、何らかの酵素処理等の人為的操作を加える必要があ
る。これらの操作は回収効率を上げるという点では効果
的と考えられるが、それぞれの操作の過程で微生物の種
類により回収効率に差が生じるため、試料中の微生物数
を必ずしも反映していないという問題がある。さらに、
効率向上のための操作を加えても、現実的には、土壌等
の試料の場合、たとえ１ｇのサンプル中に１０⁶〜１０⁸
個程度の微生物が存在していても（１０⁸個／ｇ土壌の
存在頻度はかなり豊富な生物量である）、精製した微生
物の絶対量は非常に微量であり、複雑な分離工程を経る
間にロスが生じていることは明らかである。

【００１３】そこで、土壌や環境水そのものを前処理を
施すことなくプレートに展開するという古典的なプレー
トカウント法が、環境試料本来の微生物数を反映できる
という点で注目できる。この方法では、土壌粒子等の混
入は、培養そのものにはほとんど影響しないという利点
を持つ。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、微生物
を培養・増殖させ、菌塊（コロニー）等を計数するとい
う古典的な方法（コロニーカウント法）は以下の問題を
有する。このコロニーカウント法は、特定の目的微生物
を決め、その活動・増殖・伝搬・生残等の把握をするた
めにはある程度有効である。しかし、それぞれの微生物
が要求する栄養素等の培養条件が微生物によって異な
り、さらに多種多様な微生物のうちの大部分については
それらの培養条件すら知られていないため、ある特定の
培養条件を選び微生物を培養することは、培養の過程で
栄養要求等により微生物のセレクションが施されてしま
い、環境試料中の微生物数を再現した形で、コロニーを
形成させ、その数を計測することはほとんど不可能であ
る。また、培養条件が合った菌の場合でも、コロニーを
形成させるには最低でも一晩、硝化菌のように増殖が遅
いものでは１カ月もかかってしまうため、迅速な計数は
困難である。

【００１５】本発明は、上記の従来技術における問題、
特に菌体回収法、コロニーカウント法等の問題点に鑑み
なされたものであり、その目的は、効率よく且つ簡単
に、夾雑物を含む環境試料中に含まれる微生物総数を計
数し、さらに特値の栄養培地の中でのみ生育する特定菌
のコロニーを計数することにより、環境微生物総数に対
する特定菌の割合を算出できる環境微生物計数方法を提
供することにある。さらに、栄養要求性等が明らかな特
定菌の数を短時間で把握するのに有効なコロニーカウン
ト法を提供することにある。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために種々の検討を重ねた結果、本発明を
完成した。

【００１７】本発明は、環境試料中に含まれる微生物数
を測定する希釈平板法（コロニーカウント法）におい
て、微生物成分と相互作用した場合にのみ蛍光を発する
染色剤を用い、該染色剤により染色された微生物が発す
る蛍光を測定することによって総微生物数を計数するこ
とを特徴とする環境微生物計数方法に関する。

【００１８】また本発明は、環境試料中に含まれる微生
物数を測定する希釈平板法（コロニーカウント法）にお
いて、微生物成分と相互作用した場合にのみ蛍光を発す
る染色剤を用い、環境試料をプレート培地に展開直後
（好ましくは同時から１時間以内）に、該染色剤により
染色された微生物が発する蛍光を測定することによって
総微生物数を計数し、さらに、特定された培地で培養を
行って増殖させた後にコロニー数から特定微生物の数を
計数することにより、総微生物中の特定微生物の割合を
算出することを特徴とする環境微生物計数方法に関す
る。

【００１９】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を挙げ
て詳細に説明する。

【００２０】本発明は、試料から定量しようとする目的
微生物（もしくはその微生物の構成成分）を精製する工
程を極力排除し、土壌粒子等の環境由来の挟雑物が混在
する試料において、生物成分と相互作用したときのみ蛍
光を発する染色剤をプレートの培地に加え、展開された
試料中の染色された菌が発する蛍光を測定することによ
って微生物の総数を計数することを特徴とする微生物定
量方法である。このとき、染色剤はあらかじめプレート
の培地に加えておいても、或いはサンプルに加えて菌等
と一緒に展開しても、或いはサンプル展開後、染色剤を
プレートに加えてもよい。また、試料が展開されたプレ
ートを数時間培養することにより、栄養要求性によって
分離されたある特定の菌群を定量することができる。こ
の方法では、同一サンプルについて総数と特定の菌群の
両方を測定できることから、サンプリング誤差の少ない
計測値を得ることができる。

【００２１】本発明における試料とは、土壌、河川等の
底泥、河川水、生活排水等の環境試料を含み、微生物が
生存可能な試料であれば特にその種類は問わない。ま
た、本発明における微生物とは、細菌、酵母、微細藻
類、かび、放線菌、原生動物等を含み、特に産業上有益
なものは細菌である。ここでは、特に細菌について説明
する。

【００２２】本発明では、サンプルを前処理することな
くそのままプレートに展開することによって、人為的操
作に伴う誤差を少なくすることを目的とする。したがっ
て、土壌は水に懸濁し、汚染水の場合には直接それをプ
レートに展開する。このとき、土壌中の大きな石や原生
動物などは重力沈降や目の粗いフィルターで除外しても
よい。

【００２３】通常、プレートに展開でき分離計測が可能
な菌数として知られている数は、直径１０ｃｍのプレー
トの場合、大腸菌のコロニー数でせいぜい１０００個で
ある。本発明では、細菌をプレートに展開後、コロニー
を形成させずに直ちに菌を１個１個、蛍光で直接計測す
るため、計測できる菌数はその１０〜１００倍程度まで
可能である。土壌、河川の底泥等に含まれる菌数は、通
常１グラム当たり１０ ⁵〜１０⁸個程度であるから、これ
らの土壌を水または生理食塩水に懸濁し、１０ ⁴〜１０⁵
を超えないようにプレート上に展開することが好まし
い。濃度の見当がつかないようなサンプルの場合には、
試料を何段階か希釈し、濃度の異なる複数のサンプルを
調製するとよい。

【００２４】計数法としては、蛍光顕微鏡により幾つか
の視野内の菌数を測定し、その平均を取ってプレート全
体の量に換算する方法を用いることができる。このと
き、蛍光顕微鏡にＣＣＤカメラを接続して画像解析によ
り計数してもよい。また、励起光側と蛍光側に適当なフ
ィルターを用意し、光源をプレート全体にスキャンさせ
ることによりデータを取り込み、画像解析により計数す
る方法も有効である。

【００２５】本方法では、蛍光顕微鏡の視野内の菌数を
計測することを考えると、従来より小さなプレートに展
開することも可能である。この場合は、サンプリング誤
差を生じやすいので、複数個のプレートでの平均をとる
ことが望ましい。

【００２６】これに対して、生活排水、河川水等の比較
的夾雑物が少なく且つ単位体積量当たりの微生物数の少
ない試料においては、濃縮操作を行うことが、試薬等の
節約になり、より望ましい。河川水等の試料の場合、１
リットル当たりの微生物数は、汚染等の程度によって著
しく変化するが、通常およそ１０²〜１０⁶程度である。

【００２７】濃縮方法として最も適しているのは、フィ
ルター等による濾過である。この方法では、フィルター
そのものを色素化合物で染色することも可能であると同
時に、プレートにのせて培養を継続し（数時間後フィル
ターを取り除くのが好ましい。）、栄養要求性による選
択培養にそのまま用いることができるという利点もあ
る。しかし、遠心分離による沈降分離等の他の方法も可
能であり特に上記方法に限定するものではない。

【００２８】本発明ではプレート中の培地に色素化合物
を加えることが特徴である。このとき、染色剤はあらか
じめプレートの培地に加えておいても、或いはサンプル
に加えて微生物等と一緒に展開しても、或いはサンプル
展開後にプレートに加えてもよい。

【００２９】本発明で用いられる色素化合物は、遊離時
には蛍光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を
発するものである。この色素化合物と２本鎖核酸との反
応は、該色素化合物が２本鎖核酸の安定な２重らせん構
造の溝構造の溝部内などに特異的に挿入されて結合する
ことであり、その状態で色素化合物は励起光の照射によ
って蛍光を発するようになる。したがって、遊離時、即
ち、単独で存在する場合には励起光が照射されても蛍光
を発しない。

【００３０】この色素化合物は微生物の核酸と相互作用
し、特にＤＮＡの２重らせん構造と特異的に反応して結
合する。このような色素化合物としては、２重らせん構
造の主溝あるいは副溝に特異的に入り込んで結合するも
のと、インターカレーターのような核酸塩基対と平行に
挿入されるものとが利用できる。このような色素化合物
を利用することによって、土壌懸濁液中の微生物以外の
夾雑物の影響を避けて微生物のみを染色し、計数するこ
とが可能となる。

【００３１】このような色素化合物（染色剤）として
は、例えば、ＤＡＰＩ(4',6-Diamino-2-phenylindole
Dihydrochloride)、Ｈｏｅｃｈｓｔ33258（商品名）、
Ｈｏｅｃｈｓｔ33342、及び、下記一般式［Ｉ］で表さ
れるピリリウム化合物を挙げることができる。

【００３２】

【化１３】 （上記一般式［Ｉ］において、ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ又はＴ
ｅであって、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³から選ばれる２つの置換
基は、置換もしくは未置換のアリール基であり、残りの
置換基は、水素原子、ハロゲン原子、スルホネート基、
アミノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カ
ルボキシル基、シアノ基、置換もしくは未置換のアルキ
ル基、置換もくしは未置換シクロアルキル基、−Ａ又は
−Ｌ−Ａであり、Ｌは、−Ｌ¹−、−Ｌ²−Ｌ³−又は−
Ｌ⁴−Ｌ⁵−Ｌ⁶−であり、Ｌ¹〜Ｌ⁶はそれぞれ独立し
て、−（ＣＨ＝ＣＨ）−、置換もしくは未置換アリール
基から誘導される２価の基、置換もしくは未置換低級ア
ルキレン基、または−ＣＨ＝Ｒ⁴−（Ｒ⁴はオキソ基を有
する環構造を示す）を表し、Ａは、置換もしくは未置換
アリール基、−ＣＨ＝Ｒ⁵（Ｒ⁵は、置換もしくは未置換
複素環、置換もしくは未置換シクロアルキル基、または
置換もしくは未置換芳香環を示す）を表し、Ｙ^-はアニ
オンを示す。） 上記の−Ｌ−としては、下記一般式［II］、［III］、
［IV］、［Ｖ］又は［VI］で表される基を好ましいもの
として挙げることができる。

【００３３】

【化１４】 （上記一般式［II］中、Ｚは水素原子または置換もしく
は未置換低級アルキル基を表し、ｎは０、１又は２であ
る。）

【００３４】

【化１５】 （上記一般式［III］中、ｎは０、１又は２であり、Φ
は置換もしくは未置換ｏ−、ｍ−又はｐ−フェニレン基
を表す。）

【００３５】

【化１６】 （上記一般式［IV］中、Φは置換もしくは未置換ｏ−、
ｍ−又はｐ−フェニレン基を表す）

【００３６】

【化１７】

【００３７】

【化１８】 上記一般式中のフェニレン基の置換基としては先に例示
したものを挙げることができる。

【００３８】上記一般式［Ｉ］の化合物は、可視光で励
起するため、菌を殺傷することなく計測できる。また、
溶液中では無蛍光であるため、菌の検出感度を高めるこ
とができる。さらに、膜透過性が良好であるため、短時
間で菌染色が可能である。

【００３９】以上に挙げた各種置換基にさらに置換され
る基がハロゲン原子の場合には、該ハロゲン原子として
は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等を挙げることができる。また、低
級アルキル基は直鎖状でも分岐状でもよく、その炭素数
としては１〜４程度のものが好ましい。アリール基とし
ては、例えばフェニル基等を挙げることができる。アリ
ール基やフェニレン基の置換基としては、例えば、低級
アルキル基で置換されたアミノ基（低級アルキルアミノ
基）等を挙げることができる。尚、この低級アルキルア
ミノ基としては、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基
等がパラ位で置換しているものが好ましい。低級アルア
ルキル基としては、上記の置換もしくはアリール基で置
換された低級アルキル基を挙げることができる。

【００４０】上記一般式の化合物の中ではＸを含む複素
環が、置換もしくは未置換アリール基の２以上で置換さ
れたものが好ましい。例えば、Ｘを含む複素環が６員環
の場合のそのような化合物として、（１）Ｘを含む複素
環の２位、４位及び６位が、置換もしくは未置換アリー
ル基で置換されているもの、（２）Ｘを含む複素環の２
位と４位が置換もしくは未置換アリール基で置換され、
６位が未置換、あるいはハロゲン原子、スルホネート
基、アミノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシル
基、カルボキシル基、シアノ基、置換もしくは未置換の
アルキル基、置換もくしは未置換シクロアルキル基、−
Ａ又は−Ｌ−Ａで置換されているもの、（３）Ｘを含む
複素環の２位および６位が置換もしくは未置換アリール
基で置換され、４位が未置換、あるいはハロゲン原子、
スルホネート基、アミノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒ
ドロキシル基、カルボキシル基、シアノ基、置換もしく
は未置換のアルキル基、置換もくしは未置換シクロアル
キル基、−Ａ又は−Ｌ−Ａで置換されているものなどを
挙げることができる。

【００４１】また、Ｘを含むピリリウム環の置換基に更
に親水性基が導入されていてもよい。

【００４２】このような化合物の具体例として、表１に
示す化合物を挙げることができる。その中で好ましい化
合物としては、例えば、

【００４３】

【化１９】 （上記一般式［VII］中、Ｙ^-はアニオンを示す。）で表
される２−メチル−４，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアミノフェニル）ピリリウム塩、

【００４４】

【化２０】 （上記記一般式［VIII］中、Ｙ^-はアニオンを示す。）
で表される２−メチル−４，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジ
メチルアミノフェニル）チオピリリウム塩、

【００４５】

【化２１】 （上記一般式［IX］中、Ｙ^-はアニオンを示す。）で表
される４−メチル−２，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアミノフェニル）ピリリウム塩、

【００４６】

【化２２】 （上記一般式［Ｘ］中、Ｙ^-はアニオンを示す。）で表
される４−メチル−２，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアミノフェニル）チオピリリウム塩、

【００４７】

【化２３】 （上記一般式［XI］中、Ｙ^-はアニオンを示す。）で表
される４−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−
２，６−ジフェニルピリリウム塩、

【００４８】

【化２４】 （上記一般式［XII］中、Ｙ^-はアニオンを示す。）で表
される４−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−
２，６−ジフェニルチオピリリウム塩を挙げることがで
きる。

【００４９】

【表１】

【００５０】

【表２】

【００５１】

【表３】

【００５２】

【表４】

【００５３】

【表５】

【００５４】

【表６】

【００５５】

【表７】

【００５６】

【表８】

【００５７】

【表９】

【００５８】

【表１０】

【００５９】

【表１１】

【００６０】

【表１２】

【００６１】

【表１３】

【００６２】

【表１４】

【００６３】

【表１５】

【００６４】

【表１６】

【００６５】

【表１７】

【００６６】

【表１８】

【００６７】

【表１９】

【００６８】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに説明する
が、本発明はこれらに限定するものではない。

【００６９】参考例１（染色剤の調製） 無水酢酸１００ｍｌと濃硫酸３０ｍｌとを冷却しながら
混合し、得られた混合液をウォーターバスで８０℃に保
ちながら３時間加温した。そこに無水酢酸２０ｍｌ、ｐ
−ジメチルアミノアセトフェノン３０ｍｌを室温下で加
え、その後４５℃に温度を上昇させて２４時間攪拌し反
応させた。この反応液に等量のエタノールを加え、冷却
し、更にヨウ化カリウム水溶液を加えると粗結晶が析出
した。この粗結晶を濾過により回収し、エタノール／エ
ーテルの混合系（容積比１：４）で再結晶させて、２−
メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ
フェニル）ピリリウムヨージドの緑色の結晶を得た。

【００７０】得られた上記化合物の分析結果を以下に示
す。 融点：２５４〜２５７℃ ＵＶ／可視（ＣＨ₃Ｎ ε×１０^-4）λmax：４４４ｎｍ
(2.43)、５５０ｎｍ(8.24) ＮＭＲ（¹Ｈ，ＤＭＳＯ）δppm：８．３７３７（1Ｈ，
ｓ）、８．２７２９（1Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）、
８．１７９５（1Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）、７．８８
６４（1Ｈ，ｓ）、６．９１１７（４Ｈ，ｔ，Ｊ_AB＝Ｊ
_BC＝９．７７），３．１８２９（６Ｈ，ｓ）、３．１３
４０（６Ｈ，ｓ）、２．６８０９（３Ｈ，ｓ）ＦＡＢ
ｍａｓｓ ｍ／ｚ：３３３ ＩＲ（ＫＢｒ）νｃｍ^-1：１６４５、１６１０（ｓ
ｈ）、１５８０（ｓ）、１４９０（ｓ）、１２７０、１
２００、１１６０

【００７１】実施例１（土壌中の微生物の定量） スライドグラスへの寒天の塗布 蒸留水にＢａｃｔｏＡｇａｒ（ＧＩＢＣＯ社製）を１．
２％になるように加え、オートクレーブで滅菌溶解し
た。約６０℃に降温後、参考例１で調製したピリリウム
色素（２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアミノフェニル）ピリリウムヨージド）の生理食塩
水溶液（１ｍｇ／５ｍｌ）を１／１００量加え、攪拌
後、検鏡用スライドグラスの表面に塗布して固化させ
た。

【００７２】土壌試料の作製 土壌１０ｇをサンプリングし、１０ｍｌの滅菌生理食塩
水に懸濁した。３０秒間、ｖｏｒｔｅｘにて完全に土壌
を分散させた後、１０秒間静置して大型の土壌粒子など
を沈殿除去し、上澄みだけを回収して懸濁液とした。こ
れを１００倍希釈したものと１０００倍希釈したものを
用意し、それぞれ１μｌをマイクロピペットで正確に計
り取り、寒天を塗布したスライドグラスに滴下した。

【００７３】土壌菌総数の計測 約１時間経過した後、スライドグラスの寒天の上にカバ
ーグラスをかけて蛍光顕微鏡（オリンパス倒立顕微鏡Ｉ
ＭＴ２に上記色素の光学特性に適したフィルターを装着
したもの）を用い、色素で染色された全菌数を数えた。

【００７４】計測は各希釈倍率で５枚づつ行い、測定値
は５枚の平均値とした。１００倍希釈のスライドグラス
では全菌数は平均して約５００個が、１０００倍希釈の
サンプルでは、平均して４８個の菌が検出された。この
結果、土壌懸濁液１ｍｌ中には約５×１０⁷個の菌が存
在する、すなわち土壌懸濁液１ｍｌは土壌１ｇに相当す
るので、土壌１ｇ当たり約５×１０⁷個の菌が存在する
ことがわかる。

【００７５】実施例２（土壌中の微生物の定量） 寒天培地の作製 以下の組成の培地にＢａｃｔｏＡｇａｒ（ＧＩＢＣＯ社
製）を１．２％になるように加え、オートクレーブで滅
菌溶解した。

【００７６】培地組成（％） Ｎａ₂ＰＯ₄ ： ６．２ ＫＨ₂ＰＯ₄ ： ３．０ ＮＨ₄Ｃｌ ： １．０ ＮａＣｌ ： ０．５ リンゴ酸 ： １．０ 約６０℃に降温後、ピリリウム色素（２−メチル−４，
６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピ
リリウムヨージド）の生理食塩水溶液（１ｍｇ／５ｍ
ｌ）を１／１００量加え、攪拌後、直径１０ｃｍのシャ
ーレに注いで固体培地を作製した。

【００７７】土壌試料の作製 実施例１と同様な方法で、土壌懸濁液を得た。これを１
０倍希釈したものと１００倍希釈したものを用意し、そ
れぞれ１００μｌを上記プレートに展開した。

【００７８】土壌菌総数の計測 約１時間経過した後、実施例１と同様にして、蛍光顕微
鏡を用い色素で染色された菌数を数えた。

【００７９】計測は５ヵ所で行い、測定値は５視野の平
均値とした。１０倍希釈のサンプルでは１視野中に平均
して約２００個の菌が、また１００倍希釈のサンプルで
は、平均値として２３個の菌が検出された。この測定条
件での視野面積は直径２ｍｍ程度と見積もることができ
るので、プレート全体では約５×１０⁶個、また土壌１
ｇ当たりの菌数に換算すると約５×１０⁷個の菌が存在
することがわかる。この結果は実施例１で得られた結果
と一致する。

【００８０】栄養要求性によるセレクション 計測後のプレートを１５℃のインキュベーターにいれて
５時間培養し、蛍光顕微鏡を用いて色素で染色されたコ
ロニー数を数えた。１０倍希釈の液ではコロニーはプレ
ートを埋め尽くす程になっており、１０００個以上と見
積もれる。１００倍希釈のサンプルでは、プレート中に
３５７個のコロニーが存在し、この培地で生育できる
菌、すなわちリンゴ酸単独培地で増殖する菌は１／１０
０程度の割合で存在することが判明した。さらに、コロ
ニー形状から、Corynebacterium属の菌は２０個程度存
在することがわかった。

【００８１】実施例３（地下水中の菌数計測） 寒天培地の作製 以下の組成の培地にＢａｃｔｏＡｇａｒ（ＧＩＢＣＯ社
製）を１．２％になるように加え、オートクレーブで滅
菌溶解した。

【００８２】培地組成（％） Ｎａ₂ＰＯ₄ ： ６．２ ＫＨ₂ＰＯ₄ ： ３．０ ＮＨ₄Ｃｌ ： １．０ ＮａＣｌ ： ０．５ グルタミン酸ナトリウム ： ０．２ フェノール ： １００ｐｐｍ 約６０℃に降温後、ピリリウム色素（２−メチル−４，
６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピ
リリウムヨージド）の生理食塩水溶液（１ｍｇ／５ｍ
ｌ）を１／１００量加え、攪拌後、直径１０ｃｍのシャ
ーレに注いで固体培地を作製した。

【００８３】地下水中の総菌数計測 ある工場の地下水１リットルを汲み上げ、そのなかの１
００μｌを上記プレート５枚に展開した。実施例１と同
様、約１時間経過した後、蛍光顕微鏡を用い色素で染色
された菌数を数えた。

【００８４】計測は１０ヵ所で行い、測定値は１０視野
の平均値とした。１視野中に３〜５個の菌が検出され、
５枚のプレートの平均値は３．９であった。この測定条
件での視野面積は直径２ｍｍ程度と見積もることができ
るので、プレート全体では、約１×１０⁴個、また地下
水１ｍｌ当たりの菌数に換算すると約１×１０⁵個／ｍ
ｌの菌が存在することがわかる。

【００８５】栄養要求性によるセレクション 計測後のプレートを３０℃のインキュベーターにいれて
５時間培養し、形成されたコロニー数を数えた。プレー
ト中に平均１０個のコロニーが存在し、この培地で生育
できる菌、すなわちフェノール耐性菌またはフェノール
資化菌は地下水中の全菌数の１／１０００程度の割合
（１０²個／ｍｌ）で存在することが判明した。さら
に、コロニー形状から、そのほとんどがCorynebacteriu
m属の菌であることがわかった。

【００８６】実施例４ 実施例３で用いた地下水にピリリウム色素（２−メチル
−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニ
ル）ピリリウムヨージド）の生理食塩水溶液（１ｍｇ／
５ｍｌ）を１／１００量加えて蛍光染色して、フローサ
イトメーター（ＦＣＭ、Becton Dickinson&Co.社製）
で菌数を測定したところ、９．６８×１０⁴個／ｍｌで
あることがわかった。この値は実施例３で得られた数値
と一致する。

【００８７】参考例２ 実施例３と同様な組成をもち、ピリリウム色素を含まな
い寒天プレートを用意し、そこに実施例３で用いた地下
水１００μｌを展開して３０℃のインキュベーター中１
６時間培養し、形成されたコロニー数を数えたところ、
実施例３と同様な結果が得られた。このことから、ピリ
リウム色素が菌の培養に与える影響はほとんどないと考
えられる。

【００８８】実施例５（フィルター濃縮による地下水中
の菌数計測） ある川の水１リットルを採取し、あらかじめ滅菌したＨ
Ａメンブレンフィルター（孔径０．４５μｍ、直径４７
ｍｍ、ミリポア社製）を用いてマイクロフィルトレーシ
ョンを行い、水中の菌をトラップした。

【００８９】そのフィルターを実施例３で用いたものと
同様なピリリウム色素の１００倍希釈液に浸し、回収さ
れた菌を染色した。実施例１と同様、蛍光顕微鏡で菌数
を計測すると、フィルター上に５×１０³個の細菌がい
ることがわかった。

【００９０】さらに、実施例１と同様な割合でピリリウ
ム色素を加えたデオキシコール酸入の寒天培地に上記フ
ィルターをのせ、３７℃で数時間培養し、コロニー数を
計測した。コロニーはプレート当たり３００個あった。
従って、大腸菌群数は３０／１００ｍｌであり、この河
川の水質は良好であると判断された。

【００９１】

【発明の効果】以上の説明から明らかなように本発明に
よれば、抽出操作によって生じるロスやセレクションを
受けることなく、土壌等の環境試料中の総菌数を計測す
ることができるようになった。

【００９２】また、同一サンプルを用いて、総菌数と栄
養要求性に基づく特定菌数の両方を計数し、その割合を
正確に知ることができるようになった。

【００９３】さらに本発明によれば、栄養要求性の違い
による特定の菌群を計数するコロニーカウント法におい
て、蛍光強度が検知可能になる程度まで菌を培養すれば
よく、コロニーを目視できるまで生育させる従来の方法
に比べてより短時間で計数できるようになった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 栗山 朗 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 環境試料中に含まれる微生物数を測定す
   る希釈平板法（コロニーカウント法）において、微生物
   成分と相互作用した場合にのみ蛍光を発する染色剤を用
   い、該染色剤により染色された微生物が発する蛍光を測
   定することによって総微生物数を計数することを特徴と
   する環境微生物計数方法。
2. 【請求項２】 環境試料中に含まれる微生物数を測定す
   る希釈平板法（コロニーカウント法）において、微生物
   成分と相互作用した場合にのみ蛍光を発する染色剤を用
   い、環境試料をプレート培地に展開直後に、該染色剤に
   より染色された微生物が発する蛍光を測定することによ
   って総微生物数を計数し、さらに、特定された培地で培
   養を行って増殖させた後にコロニー数から特定微生物の
   数を計数することにより、総微生物中の特定微生物の割
   合を算出することを特徴とする環境微生物計数方法。
3. 【請求項３】 増殖のための培養時間が３〜５時間であ
   る請求項２記載の環境微生物計数方法。
4. 【請求項４】 環境試料が、環境水である請求項１、２
   又は３記載の環境微生物計数方法。
5. 【請求項５】 環境試料が、土壌懸濁液である請求項
   １、２又は３記載の環境微生物計数方法。
6. 【請求項６】 環境試料中に含まれる微生物が、細菌で
   ある請求項１〜５のいずれか１項に記載の環境微生物計
   数方法。
7. 【請求項７】 蛍光を発する染色剤が、下記一般式
   ［Ｉ］の構造を有するピリリウム化合物から選ばれる１
   種または２種以上の混合物である請求項１〜６のいずれ
   か１項に記載の環境微生物計数方法。 【化１】 （上記一般式［Ｉ］において、ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ又はＴ
   ｅであって、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³から選ばれる２つの置換
   基は、置換もしくは未置換のアリール基であり、残りの
   置換基は、水素原子、ハロゲン原子、スルホネート基、
   アミノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カ
   ルボキシル基、シアノ基、置換もしくは未置換のアルキ
   ル基、置換もくしは未置換シクロアルキル基、−Ａ又は
   −Ｌ−Ａであり、Ｌは、−Ｌ¹−、−Ｌ²−Ｌ³−又は−
   Ｌ⁴−Ｌ⁵−Ｌ⁶−であり、Ｌ¹〜Ｌ⁶はそれぞれ独立し
   て、−（ＣＨ＝ＣＨ）−、置換もしくは未置換アリール
   基から誘導される２価の基、置換もしくは未置換低級ア
   ルキレン基、または−ＣＨ＝Ｒ⁴−（Ｒ⁴はオキソ基を有
   する環構造を示す）を表し、Ａは、置換もしくは未置換
   アリール基、−ＣＨ＝Ｒ⁵（Ｒ⁵は、置換もしくは未置換
   複素環、置換もしくは未置換シクロアルキル基、または
   置換もしくは未置換芳香環を示す）を表し、Ｙ^-はアニ
   オンを示す。）
8. 【請求項８】 Ｘを含む複素環の２位と４位が置換もし
   くは未置換アリール基で置換され、６位が未置換、ある
   いはハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリ
   ル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シ
   アノ基、置換もしくは未置換のアルキル基、置換もくし
   は未置換シクロアルキル基、−Ａ又は−Ｌ−Ａで置換さ
   れている請求項７記載の環境微生物計数方法。
9. 【請求項９】 Ｘを含む複素環の２位、４位および６位
   が、置換もしくは未置換アリール基で置換されている請
   求項７に記載の環境微生物計数方法。
10. 【請求項１０】 Ｘを含む複素環の２位および６位が置
    換もしくは未置換アリール基で置換され、４位が未置
    換、あるいはハロゲン原子、スルホネート基、アミノ
    基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキ
    シル基、シアノ基、置換もしくは未置換のアルキル基、
    置換もくしは未置換シクロアルキル基、−Ａ又は−Ｌ−
    Ａで置換されている請求項７記載の環境微生物計数方
    法。
11. 【請求項１１】 −Ｌ−が、下記一般式［II］、［II
    I］、［IV］、［Ｖ］又は［VI］で表される基である請
    求項７〜１０のいずれか１項に記載の環境微生物計数方
    法。 【化２】 （上記一般式［II］中、Ｚは水素原子または置換もしく
    は未置換低級アルキル基を表し、ｎは０、１又は２であ
    る。） 【化３】 （上記一般式［III］中、ｎは０、１又は２であり、Φ
    は置換もしくは未置換ｏ−、ｍ−又はｐ−フェニレン基
    を表す。） 【化４】 （上記一般式［IV］中、Φは置換もしくは未置換ｏ−、
    ｍ−又はｐ−フェニレンを表す） 【化５】 【化６】
12. 【請求項１２】 Ｘを含む複素環の置換基にさらに親水
    性基が導入されている請求項７〜１１いずれか１項に記
    載の環境微生物計数方法。
13. 【請求項１３】 蛍光を発する染色剤が、下記一般式
    ［VII］ 【化７】 （上記一般式［VII］中、Ｙ^-はアニオンを示す。）で表
    される２−メチル−４，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチ
    ルアミノフェニル）ピリリウム塩である請求項１〜６の
    いずれか１項に記載の環境微生物計数方法。
14. 【請求項１４】 蛍光を発する染色剤が、下記一般式
    ［VIII］ 【化８】 （上記一般式［VIII］中、Ｙ^-はアニオンを示す。）で
    表される２−メチル−４，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメ
    チルアミノフェニル）チオピリリウム塩である請求項１
    〜６のいずれか１項に記載の環境微生物計数方法。
15. 【請求項１５】 蛍光を発する染色剤が、下記一般式
    ［ＩＸ］ 【化９】 （上記一般式［IX］中、Ｙ^-はアニオンを示す。）で表
    される４−メチル−２，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチ
    ルアミノフェニル）ピリリウム塩である請求項１〜６の
    いずれか１項に記載の環境微生物計数方法。
16. 【請求項１６】 蛍光を発する染色剤が、下記一般式
    ［Ｘ］ 【化１０】 （上記一般式［Ｘ］中、Ｙ^-はアニオンを示す。）で表
    される４−メチル−２，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチ
    ルアミノフェニル）チオピリリウム塩である請求項１〜
    ６のいずれか１項に記載の環境微生物計数方法。
17. 【請求項１７】 蛍光を発する染色剤が、下記一般式
    ［XI］ 【化１１】 （上記一般式［XI］中、Ｙ^-はアニオンを示す。）で表
    される４−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−
    ２，６−ジフェニルピリリウム塩である請求項１〜６の
    いずれか１項に記載の環境微生物計数方法。
18. 【請求項１８】 蛍光を発する染色剤が、下記一般式
    ［XII］ 【化１２】 （上記一般式［XII］中、Ｙ^-はアニオンを示す。）で表
    される４−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−
    ２，６−ジフェニルチオピリリウム塩である請求項１〜
    ６のいずれか１項に記載の環境微生物計数方法。
19. 【請求項１９】 蛍光測定の際に画像解析を利用する請
    求項１〜１８のいずれか１項に記載の環境微生物計数方
    法。