JPH1019803A - 塩基配列決定方法 - Google Patents
塩基配列決定方法Info
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- JPH1019803A JPH1019803A JP8179534A JP17953496A JPH1019803A JP H1019803 A JPH1019803 A JP H1019803A JP 8179534 A JP8179534 A JP 8179534A JP 17953496 A JP17953496 A JP 17953496A JP H1019803 A JPH1019803 A JP H1019803A
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- JP
- Japan
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- fluorescent dye
- nucleic acid
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- electrophoresis
- capillary
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 蛍光色素により標識された核酸を励起光源お
よびその光学系を使用せずに検出する新規な方法を提供
する。 【解決手段】 本発明では、先ず泳動分離用細管１の一
端から泳動試料を注入し、泳動用電源１２より高電圧を
印加して図の右方向に泳動させる。泳動試料が泳動分離
用細管１の終端部にくると、化学発光性基質供給用配管
８より供給された化学発光性基質（例えばＴＣＰＯ及び
Ｈ2 ０2 ）と混合され、化学反応によって生じる1,2-ダ
イオキセタン−ダイオン（1,2-dioxetane-dione ）の化
学エネルギーが核酸に結合した蛍光色素の励起源として
利用され、蛍光色素から蛍光が発生する。蛍光は、検出
窓部１１から取り出され、図示しないバンドパスフィル
タを経て、光電子増倍管で検出される。得られた検出信
号は、蛍光色素の構造の差異によって生じる泳動移動度
のズレを補正した後、塩基配列データとして解析され
る。
よびその光学系を使用せずに検出する新規な方法を提供
する。 【解決手段】 本発明では、先ず泳動分離用細管１の一
端から泳動試料を注入し、泳動用電源１２より高電圧を
印加して図の右方向に泳動させる。泳動試料が泳動分離
用細管１の終端部にくると、化学発光性基質供給用配管
８より供給された化学発光性基質（例えばＴＣＰＯ及び
Ｈ2 ０2 ）と混合され、化学反応によって生じる1,2-ダ
イオキセタン−ダイオン（1,2-dioxetane-dione ）の化
学エネルギーが核酸に結合した蛍光色素の励起源として
利用され、蛍光色素から蛍光が発生する。蛍光は、検出
窓部１１から取り出され、図示しないバンドパスフィル
タを経て、光電子増倍管で検出される。得られた検出信
号は、蛍光色素の構造の差異によって生じる泳動移動度
のズレを補正した後、塩基配列データとして解析され
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡなどの核酸
の塩基配列を決定する方法であって、更に詳しくは蛍光
色素により標識された核酸を電気泳動により分離した
後、発する蛍光を検出するものに関する。
の塩基配列を決定する方法であって、更に詳しくは蛍光
色素により標識された核酸を電気泳動により分離した
後、発する蛍光を検出するものに関する。
【０００２】
【従来の技術】プライマー部又はダイデオキシ部に蛍光
ラベルを付し、サンガーの方法で調整した核酸断片をゲ
ル電気泳動を行い、得られる展開パターンを解析してＤ
ＮＡの塩基配列を決定する塩基配列決定装置が知られて
いる。
ラベルを付し、サンガーの方法で調整した核酸断片をゲ
ル電気泳動を行い、得られる展開パターンを解析してＤ
ＮＡの塩基配列を決定する塩基配列決定装置が知られて
いる。
【０００３】従来の塩基配列決定装置としては、例えば
特開昭６３−３１３０３５号公報に記載にものを挙げる
ことができる。この装置は、図２に示されるものであ
り、ガラス板に挟まれて図で紙面垂直方向に延びる泳動
ゲル１０４に蛍光ラベルしたサンプルが紙面垂直方向に
泳動する。
特開昭６３−３１３０３５号公報に記載にものを挙げる
ことができる。この装置は、図２に示されるものであ
り、ガラス板に挟まれて図で紙面垂直方向に延びる泳動
ゲル１０４に蛍光ラベルしたサンプルが紙面垂直方向に
泳動する。
【０００４】ステージ２３９はガイドレール２３３に案
内され、モータ２３７で駆動される棒ネジ２５２の回転
によって泳動方向と直交する図の上下方向に走査され
る。ステージ２３９には集光レンズ２６０が設けられ、
励起光であるレーザビーム２５０がミラー２５１で反射
されてレンズ２６０に入射し、ステージ２３９上のミラ
ー２５５で反射されて泳動ゲル１０４の測定部分を照射
する。
内され、モータ２３７で駆動される棒ネジ２５２の回転
によって泳動方向と直交する図の上下方向に走査され
る。ステージ２３９には集光レンズ２６０が設けられ、
励起光であるレーザビーム２５０がミラー２５１で反射
されてレンズ２６０に入射し、ステージ２３９上のミラ
ー２５５で反射されて泳動ゲル１０４の測定部分を照射
する。
【０００５】その測定部分から出た蛍光はステージ２３
９に設けられた集光レンズ２２１で集光され、干渉フィ
ルタ２２３で分光されてレンズ２２５を通り、光電子増
倍管２２９で検知される。
９に設けられた集光レンズ２２１で集光され、干渉フィ
ルタ２２３で分光されてレンズ２２５を通り、光電子増
倍管２２９で検知される。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかし、図２の装置で
は、高価なレーザー光源、複雑な光学系を必要とし、ま
た光源に由来する迷光、散乱光等によって、試料からの
蛍光検出を妨害することが知られている。また、迷光等
の影響を除く為にパルス発振レーザーを光源として、時
間分割蛍光検出を行うことも可能であるが、このような
光学系は非常に高価である。しかも、励起・受光光学系
をステージ２３９に載せ走査しているため、高速で各泳
動レーンの信号をサンプリングしようとすれば、ステー
ジ２３９を高速駆動するための特別な駆動機構を必要と
し、装置全体の大型化を招いていた。
は、高価なレーザー光源、複雑な光学系を必要とし、ま
た光源に由来する迷光、散乱光等によって、試料からの
蛍光検出を妨害することが知られている。また、迷光等
の影響を除く為にパルス発振レーザーを光源として、時
間分割蛍光検出を行うことも可能であるが、このような
光学系は非常に高価である。しかも、励起・受光光学系
をステージ２３９に載せ走査しているため、高速で各泳
動レーンの信号をサンプリングしようとすれば、ステー
ジ２３９を高速駆動するための特別な駆動機構を必要と
し、装置全体の大型化を招いていた。
【０００７】そこで、本発明は、上記に鑑みなされたも
ので、蛍光色素により標識された核酸を励起光源および
その光学系を使用せずに検出する新規な方法を提供する
ことを目的とする。
ので、蛍光色素により標識された核酸を励起光源および
その光学系を使用せずに検出する新規な方法を提供する
ことを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するため、蛍光色素により標識された核酸の検出手段
として、化学発光法を利用することで励起光源およびそ
の光学系の設置を不要とした。すなわち、本発明は、蛍
光色素により標識された核酸を電気泳動により分離した
後、化学発光性基質を混合することにより発する蛍光を
検出して、核酸の塩基配列を決定することを特徴とす
る。
決するため、蛍光色素により標識された核酸の検出手段
として、化学発光法を利用することで励起光源およびそ
の光学系の設置を不要とした。すなわち、本発明は、蛍
光色素により標識された核酸を電気泳動により分離した
後、化学発光性基質を混合することにより発する蛍光を
検出して、核酸の塩基配列を決定することを特徴とす
る。
【０００９】ここで、蛍光色素としては、例えば、イソ
チオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、イソチオシ
アン酸エオシン（ＥＩＴＣ）、イソチオシアン酸テトラ
メチルローダミン（ＴＭＩＲＴＣ）、置換イソチオシア
ン酸ローダミン（ＸＲＩＴＣ）、テキアスレッドなどを
挙げることができる。また、蛍光ラベルは塩基の種類、
Ａ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン），Ｇ
（グアニン）毎に異なるものを用いても良いし、同一の
ものを用いてもよい。もし、塩基の種類毎に蛍光ラベル
を異なえる場合（４種類の蛍光ラベルを用いる場合）
は、一つの泳動レーンで４種類の塩基の測定が可能とな
る。蛍光色素の標識の方法は、従来公知の方法、例えば
Smith, L.M.らの方法（Nature, 321: 674-679,1986 ）
によって行うことができ、標識された核酸断片は、サン
ガー反応（Sanger.F.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,7
4,5463-5467）を行い、電気泳動により分離する。
チオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、イソチオシ
アン酸エオシン（ＥＩＴＣ）、イソチオシアン酸テトラ
メチルローダミン（ＴＭＩＲＴＣ）、置換イソチオシア
ン酸ローダミン（ＸＲＩＴＣ）、テキアスレッドなどを
挙げることができる。また、蛍光ラベルは塩基の種類、
Ａ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン），Ｇ
（グアニン）毎に異なるものを用いても良いし、同一の
ものを用いてもよい。もし、塩基の種類毎に蛍光ラベル
を異なえる場合（４種類の蛍光ラベルを用いる場合）
は、一つの泳動レーンで４種類の塩基の測定が可能とな
る。蛍光色素の標識の方法は、従来公知の方法、例えば
Smith, L.M.らの方法（Nature, 321: 674-679,1986 ）
によって行うことができ、標識された核酸断片は、サン
ガー反応（Sanger.F.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,7
4,5463-5467）を行い、電気泳動により分離する。
【００１０】電気泳動は、キャピラリー（細管式）電気
泳動が好ましい。キャピラリー電気泳動は、内径１００
μｍ程度もしくはそれ以下のガラスキャピラリー内に泳
動バッファを充填し、一方の端に試料を導入した後、キ
ャピラリー両端に高電圧を印加して、分析対象物をキャ
ピラリー内で展開させるもので、ガラスキャピラリー内
が容積に対して表面積が大きい、すなわち冷却効率が高
いことより、高電圧の印加が可能となり、核酸を高速か
つ高分解能にて分離できる。キャピラリーの本数は１本
でも多数本でもいずれでもよい。
泳動が好ましい。キャピラリー電気泳動は、内径１００
μｍ程度もしくはそれ以下のガラスキャピラリー内に泳
動バッファを充填し、一方の端に試料を導入した後、キ
ャピラリー両端に高電圧を印加して、分析対象物をキャ
ピラリー内で展開させるもので、ガラスキャピラリー内
が容積に対して表面積が大きい、すなわち冷却効率が高
いことより、高電圧の印加が可能となり、核酸を高速か
つ高分解能にて分離できる。キャピラリーの本数は１本
でも多数本でもいずれでもよい。
【００１１】電気泳動により分離した後、化学発光性基
質を混合する。化学発光性基質としては、例えばビス
（2,4,6-トリクロロフェニル）オキサレート（ＴＣＰ
Ｏ）および過酸化水素（Ｈ2 ０2 ）を用いることができ
る。これら化学発光性基質は、分離された試料に対して
シースフローとなって混合するのが好ましい。そのため
には、キャピラリー出口を覆うように化学発光性基質供
給用配管を設ける。化学発光性基質は、化１によって示
される化学反応によって生じる1,2-ダイオキセタン−ダ
イオンの化学エネルギーが核酸に結合した蛍光色素
（Ｆ）の励起源として利用され、色素から蛍光（ｈυ）
が発生する。
質を混合する。化学発光性基質としては、例えばビス
（2,4,6-トリクロロフェニル）オキサレート（ＴＣＰ
Ｏ）および過酸化水素（Ｈ2 ０2 ）を用いることができ
る。これら化学発光性基質は、分離された試料に対して
シースフローとなって混合するのが好ましい。そのため
には、キャピラリー出口を覆うように化学発光性基質供
給用配管を設ける。化学発光性基質は、化１によって示
される化学反応によって生じる1,2-ダイオキセタン−ダ
イオンの化学エネルギーが核酸に結合した蛍光色素
（Ｆ）の励起源として利用され、色素から蛍光（ｈυ）
が発生する。
【００１２】
【化１】 蛍光の検出手段としては、例えば光電子増倍管、フォト
ダイオードアレイ、ＣＣＤカメラなどを挙げることがで
きるが、これらに限定されない。
ダイオードアレイ、ＣＣＤカメラなどを挙げることがで
きるが、これらに限定されない。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明の方法を実施する装置の概
略を図面に基づいて説明する。図１は、本発明にかかる
装置の概略図で、１は泳動分離用細管を示す。これは、
例えば内径数十μｍのガラスキャピラリーで、一端（図
の左側）は図示しない電極槽に挿入されている。また、
泳動分離用細管１の他端（図の右側）は反応・検出用細
管２にすっぽりと挿入されており、反応・検出用細管２
の終端は図示しない電極槽に挿入される。電極槽には、
電極及び例えばトリス・ホウ酸・ＥＤＴＡ緩衝液が入れ
られ、泳動用電源１２によって電極間に高電圧が印加さ
れる。泳動分離用細管１及び反応・検出用細管２は、フ
ィッティング・ジョイント４、５により中空のＴ字配管
３に嵌合されており、フィッティング・ジョイント４、
５は締付けナット６、７により締結される。
略を図面に基づいて説明する。図１は、本発明にかかる
装置の概略図で、１は泳動分離用細管を示す。これは、
例えば内径数十μｍのガラスキャピラリーで、一端（図
の左側）は図示しない電極槽に挿入されている。また、
泳動分離用細管１の他端（図の右側）は反応・検出用細
管２にすっぽりと挿入されており、反応・検出用細管２
の終端は図示しない電極槽に挿入される。電極槽には、
電極及び例えばトリス・ホウ酸・ＥＤＴＡ緩衝液が入れ
られ、泳動用電源１２によって電極間に高電圧が印加さ
れる。泳動分離用細管１及び反応・検出用細管２は、フ
ィッティング・ジョイント４、５により中空のＴ字配管
３に嵌合されており、フィッティング・ジョイント４、
５は締付けナット６、７により締結される。
【００１４】また、Ｔ字配管３には上部に開口があり、
化学発光性基質を供給する化学発光性基質供給用配管８
を挿入する。化学発光性基質供給用配管８はフィッティ
ング・ジョイント９によりＴ字配管３に嵌合されてお
り、フィッティング・ジョイント９は締付けナット１０
により締結される。化学発光性基質供給用配管８より供
給された化学発光性基質（例えばＴＣＰＯ及びＨ
2 ０2 ）は、泳動分離用細管１の試料に対してシースフ
ローとなって混合される。なお、反応・検出用細管２に
は、化学発光性基質により励起されて生じた蛍光を取り
出すための検出窓部１１が備わっており、検出窓部１１
に対向するところには、図示しないバンドパスフィル
タ、光電子増倍管が配置される。但し、検出は、信号増
強のため、イメージインテンシファイアーで増幅後、冷
却型ＣＣＤカメラによって行ってもよい。得られた検出
信号は、泳動時間（検出時刻）によって、時系列データ
として図示しないデータ解析部に送られる。
化学発光性基質を供給する化学発光性基質供給用配管８
を挿入する。化学発光性基質供給用配管８はフィッティ
ング・ジョイント９によりＴ字配管３に嵌合されてお
り、フィッティング・ジョイント９は締付けナット１０
により締結される。化学発光性基質供給用配管８より供
給された化学発光性基質（例えばＴＣＰＯ及びＨ
2 ０2 ）は、泳動分離用細管１の試料に対してシースフ
ローとなって混合される。なお、反応・検出用細管２に
は、化学発光性基質により励起されて生じた蛍光を取り
出すための検出窓部１１が備わっており、検出窓部１１
に対向するところには、図示しないバンドパスフィル
タ、光電子増倍管が配置される。但し、検出は、信号増
強のため、イメージインテンシファイアーで増幅後、冷
却型ＣＣＤカメラによって行ってもよい。得られた検出
信号は、泳動時間（検出時刻）によって、時系列データ
として図示しないデータ解析部に送られる。
【００１５】以上の構成で、核酸の塩基配列を決定する
のは次のように行う。まず、試料核酸の蛍光標識を行
う。これは Smith, L.M.らの方法（Nature, 321: 674-6
79,1986 ）によって、４種の核酸の識別が可能となる様
に、４種の蛍光色素を用いて行う。この標識された核酸
断片（プライマー）を用いて、サンガー反応（Sanger.
F.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463-5467）を行
い、泳動試料とする。泳動分離用細管１の一端（図の左
側）から泳動試料を毛細管現象により注入し、その後泳
動分離用細管１の一端を電極槽に挿入して、泳動用電源
１２より高電圧を印加する。泳動試料は図１中の右方向
に泳動し、泳動分離用細管１の終端部にくると、化学発
光性基質供給用配管８より供給された化学発光性基質
（例えばＴＣＰＯ及びＨ2 ０2 ）と混合される。その結
果化１によって示される化学反応によって生じる1,2-ダ
イオキセタン−ダイオン（1,2-dioxetane-dione ）の化
学エネルギーが核酸に結合した蛍光色素の励起源として
利用され、蛍光色素から蛍光が発生する。
のは次のように行う。まず、試料核酸の蛍光標識を行
う。これは Smith, L.M.らの方法（Nature, 321: 674-6
79,1986 ）によって、４種の核酸の識別が可能となる様
に、４種の蛍光色素を用いて行う。この標識された核酸
断片（プライマー）を用いて、サンガー反応（Sanger.
F.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463-5467）を行
い、泳動試料とする。泳動分離用細管１の一端（図の左
側）から泳動試料を毛細管現象により注入し、その後泳
動分離用細管１の一端を電極槽に挿入して、泳動用電源
１２より高電圧を印加する。泳動試料は図１中の右方向
に泳動し、泳動分離用細管１の終端部にくると、化学発
光性基質供給用配管８より供給された化学発光性基質
（例えばＴＣＰＯ及びＨ2 ０2 ）と混合される。その結
果化１によって示される化学反応によって生じる1,2-ダ
イオキセタン−ダイオン（1,2-dioxetane-dione ）の化
学エネルギーが核酸に結合した蛍光色素の励起源として
利用され、蛍光色素から蛍光が発生する。
【００１６】蛍光は、検出窓部１１から取り出され、図
示しないバンドパスフィルタを経て、光電子増倍管で検
出される。得られた検出信号は、泳動時間（検出時刻）
によって、時系列データとして図示しないデータ解析部
に送られ、蛍光色素の構造の差異によって生じる泳動移
動度のズレを補正した後、塩基配列データとして解析さ
れる。
示しないバンドパスフィルタを経て、光電子増倍管で検
出される。得られた検出信号は、泳動時間（検出時刻）
によって、時系列データとして図示しないデータ解析部
に送られ、蛍光色素の構造の差異によって生じる泳動移
動度のズレを補正した後、塩基配列データとして解析さ
れる。
【００１７】なお、以上の説明では泳動分離用細管１は
１本だけであったが、本発明では１本に限定されず、複
数本並列に並べてもよい。この場合には化学発光性基質
供給用配管８は分流させて、同時に複数本の泳動分離用
細管に供給させるようにすればよい。
１本だけであったが、本発明では１本に限定されず、複
数本並列に並べてもよい。この場合には化学発光性基質
供給用配管８は分流させて、同時に複数本の泳動分離用
細管に供給させるようにすればよい。
【００１８】
【発明の効果】本発明によれば、レーザ等の高価、複雑
な光学系が不要となり、安価な構成で迷光等の影響を抑
えた高感度検出が可能となる。また、試薬をシースフロ
ーとして試料を混合することで、試料の拡散を低減する
ことができる。さらに、励起光源を不要とすることで、
泳動分離用細管を多数本化（マルチキャピラリー）する
際に、従来必要であった励起光源の走査系等も不要とな
り、容易にマルチキャピラリーに対応できる。
な光学系が不要となり、安価な構成で迷光等の影響を抑
えた高感度検出が可能となる。また、試薬をシースフロ
ーとして試料を混合することで、試料の拡散を低減する
ことができる。さらに、励起光源を不要とすることで、
泳動分離用細管を多数本化（マルチキャピラリー）する
際に、従来必要であった励起光源の走査系等も不要とな
り、容易にマルチキャピラリーに対応できる。
【図１】本発明の装置の概略を示す図である。
【図２】従来の装置の概略図
１：泳動分離用細管 ２：反応・検出用細管 ８：化学発光性基質供給用配管
Claims (2)
- 【請求項１】 蛍光色素により標識された核酸を電気泳
動により分離した後、化学発光性基質を混合することに
より発する蛍光を検出して、核酸の塩基配列を決定する
ことを特徴とする塩基配列決定方法。 - 【請求項２】 化学発光性基質がビス（2,4,6-トリクロ
ロフェニル）オキサレートおよび過酸化水素である請求
項１記載の塩基配列決定方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8179534A JPH1019803A (ja) | 1996-07-09 | 1996-07-09 | 塩基配列決定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8179534A JPH1019803A (ja) | 1996-07-09 | 1996-07-09 | 塩基配列決定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1019803A true JPH1019803A (ja) | 1998-01-23 |
Family
ID=16067443
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8179534A Pending JPH1019803A (ja) | 1996-07-09 | 1996-07-09 | 塩基配列決定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1019803A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6528258B1 (en) | 1999-09-03 | 2003-03-04 | Lifebeam Technologies, Inc. | Nucleic acid sequencing using an optically labeled pore |
| JP2007093230A (ja) * | 2005-09-27 | 2007-04-12 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 標的ｄｎａ解析方法及び解析装置 |
-
1996
- 1996-07-09 JP JP8179534A patent/JPH1019803A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6528258B1 (en) | 1999-09-03 | 2003-03-04 | Lifebeam Technologies, Inc. | Nucleic acid sequencing using an optically labeled pore |
| JP2007093230A (ja) * | 2005-09-27 | 2007-04-12 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 標的ｄｎａ解析方法及び解析装置 |
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