JPH10155484A - 洗剤またはその分解物の免疫学的分析用モノクローナル抗体およびその用途 - Google Patents
洗剤またはその分解物の免疫学的分析用モノクローナル抗体およびその用途Info
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- JPH10155484A JPH10155484A JP9230819A JP23081997A JPH10155484A JP H10155484 A JPH10155484 A JP H10155484A JP 9230819 A JP9230819 A JP 9230819A JP 23081997 A JP23081997 A JP 23081997A JP H10155484 A JPH10155484 A JP H10155484A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 水や土壌試料中の洗剤および／または洗剤分
解物を、迅速かつ信頼性の高い免疫学的手法で検出す
る。 【解決手段】 洗剤および／または洗剤分解物に対する
高度の特異性と親和性を有する抗体、標識化合物、これ
らを用いる免疫化学的検出方法。
解物を、迅速かつ信頼性の高い免疫学的手法で検出す
る。 【解決手段】 洗剤および／または洗剤分解物に対する
高度の特異性と親和性を有する抗体、標識化合物、これ
らを用いる免疫化学的検出方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、洗剤またはその分
解物の免疫学的分析用モノクローナル抗体およびその用
途に関する。さらに詳しくは、本発明は、該抗体を産生
するハイブリドーマ、産生されたモノクローナル抗体、
それを用いる、洗剤、その分解物またはそれらの混合物
を免疫学的に分析するためのキットおよび方法に関す
る。
解物の免疫学的分析用モノクローナル抗体およびその用
途に関する。さらに詳しくは、本発明は、該抗体を産生
するハイブリドーマ、産生されたモノクローナル抗体、
それを用いる、洗剤、その分解物またはそれらの混合物
を免疫学的に分析するためのキットおよび方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】合成洗剤用界面活性剤化合物のうち陰イ
オン系界面活性剤である直鎖アルキルベンゼンスルホン
酸（以下、ＬＡＳと略記することがある）は、生分解性
の悪い分枝状アルキルベンゼンスルホン酸（ＡＢＳ）に
代わり、１９６７年から行政指導により販売、使用が実
施された。ＬＡＳは、安価かつ毒性の少ない洗浄剤とし
て家庭用合成洗剤の主成分として現在も使用されている
が、生活排水の河川への流入に伴い、近年、ＬＡＳおよ
びＬＡＳの分解物による水質汚染が問題となっており、
陰イオン系界面活性剤として水道水質基準（０.２ミリ
グラム／リットル以下）が設定されている。また、非イ
オン系界面活性剤も合成洗剤使用量の４０％を占め、水
道水質基準の設定が検討中である。かかる事情から、環
境中の合成洗剤やその分解物を測定、分析し、その結果
を環境保全に役立たせている。このような測定、分析法
として、例えば、上水、河川水、湖沼水または下水中の
これら洗剤および洗剤の分解物を定量測定するための高
速液体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィがある
が、これらは機器のコストが高く、前処理が必要で操作
に習熟を要することが問題となっている。また、陰イオ
ン系および非イオン系界面活性剤の公定測定法として
は、それぞれ、メチレンブルー吸光度法およびカリウム
テトラチオシアン酸亜鉛（ＩＩ）法があるが、これらの
測定法は、人体に有害な有機溶媒を抽出操作時に使用
し、また繁雑な濃縮操作を必要とするなど、定量法の改
良が期待されている。これらの問題から、陰イオンおよ
び非イオン界面活性剤について、従来の測定感度を維持
した上で、迅速かつ簡便で、特異的で、低コストの測定
法が望まれている。これらの問題を解決する手段として
酵素免疫測定法（以下、ＥＬＩＳＡ法と略記することが
ある）が挙げられる。
オン系界面活性剤である直鎖アルキルベンゼンスルホン
酸（以下、ＬＡＳと略記することがある）は、生分解性
の悪い分枝状アルキルベンゼンスルホン酸（ＡＢＳ）に
代わり、１９６７年から行政指導により販売、使用が実
施された。ＬＡＳは、安価かつ毒性の少ない洗浄剤とし
て家庭用合成洗剤の主成分として現在も使用されている
が、生活排水の河川への流入に伴い、近年、ＬＡＳおよ
びＬＡＳの分解物による水質汚染が問題となっており、
陰イオン系界面活性剤として水道水質基準（０.２ミリ
グラム／リットル以下）が設定されている。また、非イ
オン系界面活性剤も合成洗剤使用量の４０％を占め、水
道水質基準の設定が検討中である。かかる事情から、環
境中の合成洗剤やその分解物を測定、分析し、その結果
を環境保全に役立たせている。このような測定、分析法
として、例えば、上水、河川水、湖沼水または下水中の
これら洗剤および洗剤の分解物を定量測定するための高
速液体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィがある
が、これらは機器のコストが高く、前処理が必要で操作
に習熟を要することが問題となっている。また、陰イオ
ン系および非イオン系界面活性剤の公定測定法として
は、それぞれ、メチレンブルー吸光度法およびカリウム
テトラチオシアン酸亜鉛（ＩＩ）法があるが、これらの
測定法は、人体に有害な有機溶媒を抽出操作時に使用
し、また繁雑な濃縮操作を必要とするなど、定量法の改
良が期待されている。これらの問題から、陰イオンおよ
び非イオン界面活性剤について、従来の測定感度を維持
した上で、迅速かつ簡便で、特異的で、低コストの測定
法が望まれている。これらの問題を解決する手段として
酵素免疫測定法（以下、ＥＬＩＳＡ法と略記することが
ある）が挙げられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ＥＬＩＳＡ法による、
様々な他の環境汚染物質に対する定量系やキットが構築
されており、例えば、ＷＯ９４／１２５３６号には、環
境における石油燃料の検出用のＥＬＩＳＡ法や、そのキ
ットが開示されている。酵素と抗体で構成されるこれら
のキットは非常に迅速に、通常、数時間で測定が完了す
る。また、操作は、従来の高速液体クロマトグラフィ、
ガスクロマトグラフィなどよりも非常に簡便であり、こ
れらの測定操作に必要な煩雑な前処理もほとんどの場合
必要でない。さらに、抗体、特に、モノクローナル抗体
を使用することにより、非常に特異的な定量が可能にな
る。高速液体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ
などは非常に高価な機器であり、そのメンテナンスにか
かる費用もかなりなものであるが、ＥＬＩＳＡ法にはそ
のような問題がない。しかし、ＬＡＳをはじめ、合成洗
剤用の界面活性剤や、その分解物の検出、測定に使用で
きる免疫学的分析法、特に、ＥＬＩＳＡ法は未だ確立さ
れていない。
様々な他の環境汚染物質に対する定量系やキットが構築
されており、例えば、ＷＯ９４／１２５３６号には、環
境における石油燃料の検出用のＥＬＩＳＡ法や、そのキ
ットが開示されている。酵素と抗体で構成されるこれら
のキットは非常に迅速に、通常、数時間で測定が完了す
る。また、操作は、従来の高速液体クロマトグラフィ、
ガスクロマトグラフィなどよりも非常に簡便であり、こ
れらの測定操作に必要な煩雑な前処理もほとんどの場合
必要でない。さらに、抗体、特に、モノクローナル抗体
を使用することにより、非常に特異的な定量が可能にな
る。高速液体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ
などは非常に高価な機器であり、そのメンテナンスにか
かる費用もかなりなものであるが、ＥＬＩＳＡ法にはそ
のような問題がない。しかし、ＬＡＳをはじめ、合成洗
剤用の界面活性剤や、その分解物の検出、測定に使用で
きる免疫学的分析法、特に、ＥＬＩＳＡ法は未だ確立さ
れていない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＬＡＳお
よびポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（以
下、ＡＰＥと略記することがある）や、その分解物の免
疫学的分析法、特に、ＥＬＩＳＡ法による検出、測定法
を確立すべく、鋭意研究を重ねた。その結果、ＬＡＳの
類似化合物であるスルホフェニル吉草酸（以下、ＳＰＣ
と略記することがある）およびＡＰＥの類似化合物であ
るノニルフェノールエトキシレートと無水コハク酸との
ハーフエステル（以下、ＮＰ７ＥＣと略記することがあ
る）を用い、これらをキャリヤー蛋白質と結合させ、マ
ウスに免疫することにより、その脾臓より抗ＬＡＳまた
は抗ＡＰＥモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作
成できることを見出した。また、これらのモノクローナ
ル抗体と、ＬＡＳ、ＡＰＥ、それらの類似化合物を標識
したものを用いて高感度にＬＡＳ、ＡＰＥおよびそれら
の分解物を測定できることを見出した。これらの知見に
基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに
至った。
よびポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（以
下、ＡＰＥと略記することがある）や、その分解物の免
疫学的分析法、特に、ＥＬＩＳＡ法による検出、測定法
を確立すべく、鋭意研究を重ねた。その結果、ＬＡＳの
類似化合物であるスルホフェニル吉草酸（以下、ＳＰＣ
と略記することがある）およびＡＰＥの類似化合物であ
るノニルフェノールエトキシレートと無水コハク酸との
ハーフエステル（以下、ＮＰ７ＥＣと略記することがあ
る）を用い、これらをキャリヤー蛋白質と結合させ、マ
ウスに免疫することにより、その脾臓より抗ＬＡＳまた
は抗ＡＰＥモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作
成できることを見出した。また、これらのモノクローナ
ル抗体と、ＬＡＳ、ＡＰＥ、それらの類似化合物を標識
したものを用いて高感度にＬＡＳ、ＡＰＥおよびそれら
の分解物を測定できることを見出した。これらの知見に
基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに
至った。
【０００５】すなわち、本発明は、合成洗剤用界面活性
剤化合物と蛋白質との複合体で免疫した動物の脾細胞ま
たはリンパ節細胞と、骨髄腫細胞とを融合させて得られ
る該化合物またはその分解物に対するモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマを提供するものである。ま
た、本発明は、本発明のハイブリドーマより産生される
合成洗剤用界面活性剤化合物またはその分解物に対する
モノクローナル抗体を提供するものである。本発明は、
また、本発明のモノクローナル抗体を必須の構成成分と
してなることを特徴とする洗剤、その分解物またはそれ
らの混合物の免疫学的分析用キットも提供する。さら
に、本発明は、検体と、担体上に保持された本発明のモ
ノクローナル抗体と、標識剤で標識された洗剤、その分
解物またはそれらの混合物とを反応させた後、担体上に
保持された標識剤または担体上に保持されなかった標識
剤の活性を測定することを特徴とする検体中の該洗剤、
その分解物またはそれらの混合物の免疫学的分析方法、
特に、ＥＬＩＳＡ法を提供するものである。
剤化合物と蛋白質との複合体で免疫した動物の脾細胞ま
たはリンパ節細胞と、骨髄腫細胞とを融合させて得られ
る該化合物またはその分解物に対するモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマを提供するものである。ま
た、本発明は、本発明のハイブリドーマより産生される
合成洗剤用界面活性剤化合物またはその分解物に対する
モノクローナル抗体を提供するものである。本発明は、
また、本発明のモノクローナル抗体を必須の構成成分と
してなることを特徴とする洗剤、その分解物またはそれ
らの混合物の免疫学的分析用キットも提供する。さら
に、本発明は、検体と、担体上に保持された本発明のモ
ノクローナル抗体と、標識剤で標識された洗剤、その分
解物またはそれらの混合物とを反応させた後、担体上に
保持された標識剤または担体上に保持されなかった標識
剤の活性を測定することを特徴とする検体中の該洗剤、
その分解物またはそれらの混合物の免疫学的分析方法、
特に、ＥＬＩＳＡ法を提供するものである。
【０００６】本発明における、対象となる洗剤は、合成
洗剤用の界面活性剤、例えば、陰イオン界面活性剤や非
イオン界面活性剤を含有する洗剤であり、本発明によれ
ば、これらの洗剤、その生分解物またはそれらの混合物
を、免疫学的に、高感度かつ特異的に分析できる。
洗剤用の界面活性剤、例えば、陰イオン界面活性剤や非
イオン界面活性剤を含有する洗剤であり、本発明によれ
ば、これらの洗剤、その生分解物またはそれらの混合物
を、免疫学的に、高感度かつ特異的に分析できる。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明のハイブリドーマは、合成
洗剤用界面活性剤化合物と、蛋白質（キャリヤー蛋白
質）との複合体を使用し、自体公知の方法に準じて作成
できる。用いる合成洗剤用界面活性剤化合物は、例え
ば、アルキル硫酸、アルキルベンゼンスルホン酸、アル
キルナフタレンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸塩ホ
ルムアルデヒド縮合物およびそれらの塩（例、アルカリ
金属塩等）のような陰イオン界面活性剤化合物、ポリオ
キシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエ
チレンアルキルエーテル、ポリオキシエーテルポリスチ
リルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンスチレン化
フェニルエーテルおよびそれらの塩（例、リン酸塩、硫
酸塩等）のような非イオン界面活性剤化合物が挙げら
れ、ここに、アルキルとしては、炭素数２〜１８程度の
ものが包含される。これらは、分析対象とする洗剤や、
分解物に応じて適宜選択できるが、環境保全の観点から
は、特に、ＬＡＳ、ＡＰＥおよびその塩を選択すること
が望ましい。
洗剤用界面活性剤化合物と、蛋白質（キャリヤー蛋白
質）との複合体を使用し、自体公知の方法に準じて作成
できる。用いる合成洗剤用界面活性剤化合物は、例え
ば、アルキル硫酸、アルキルベンゼンスルホン酸、アル
キルナフタレンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸塩ホ
ルムアルデヒド縮合物およびそれらの塩（例、アルカリ
金属塩等）のような陰イオン界面活性剤化合物、ポリオ
キシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエ
チレンアルキルエーテル、ポリオキシエーテルポリスチ
リルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンスチレン化
フェニルエーテルおよびそれらの塩（例、リン酸塩、硫
酸塩等）のような非イオン界面活性剤化合物が挙げら
れ、ここに、アルキルとしては、炭素数２〜１８程度の
ものが包含される。これらは、分析対象とする洗剤や、
分解物に応じて適宜選択できるが、環境保全の観点から
は、特に、ＬＡＳ、ＡＰＥおよびその塩を選択すること
が望ましい。
【０００８】キャリヤー蛋白質としては、例えば、ウシ
血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す）、卵白アルブミ
ン（以下、ＯＶＡと略す）、牛チログロブリン（以下、
ＢＴＧと略す）などが挙げられる。
血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す）、卵白アルブミ
ン（以下、ＯＶＡと略す）、牛チログロブリン（以下、
ＢＴＧと略す）などが挙げられる。
【０００９】合成洗剤用界面活性剤化合物またはその類
縁化合物と蛋白質との複合体の形成は、例えば、式： Ａ−Ｒ （Ｉ） ［式中、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＮＨ2またはＳＨを、Ａは、
Ｒ基の離脱により、合成洗剤用界面活性剤化合物または
その類縁化合物となる基を示す。］で表される化合物
を、自体公知の方法により蛋白質に結合させることによ
り行える。式（Ｉ）で表される化合物も、自体公知の方
法で、適宜の原料に、カルボキシル基、アミノ基、スル
フヒドリル基を形成または導入することにより、化学的
に合成できる。例えば、ＲがＣＯＯＨで、ＡがＬＡＳと
なる式（Ｉ）で表される化合物は、フェニルアルキルカ
ルボン酸、例えばフェニル吉草酸をスルホン化すること
により製造できる［ジャーナル・オブ・クロマトグラフ
ィー（J. Chromato.），１７８，２５９（１９７
９）］。ＲがＣＯＯＨで、Ａがポリオキシエチレンアル
キルフェニルエーテルとなる式（Ｉ）で表される化合物
は、ポリオキシアルキルフェニルエーテルと無水コハク
酸を脱水縮合（ハーフエステル）することにより製造で
きる［キャンサー・バイオケミストリー・バイオフィジ
ックス（Cancer Biochem. Biophys.），７，１７５（１
９８４）］。ＲがＮＨ2で、ＡがＬＡＳとなる式（Ｉ）
で表される化合物は、クロロアルキルベンゼン、例えば
２−クロロエチルベンゼンをスルホン化した後［ジャー
ナル・オブ・クロマトグラフィー（J. Chromato.），１
７８，２５９（１９７９）］、アンモニアで処理するこ
とにより製造できる［オーガニック・ファンクショナル
・グループ・プレパレーションズ（Organic Functional
Group Preparations）, 第１巻, ３８２頁］。ＲがＮ
Ｈ2で、Ａがポリオキシエチレンアルキルフェニルエー
テルとなる式（Ｉ）で表される化合物は、ポリオキシア
ルキルフェニルエーテルの水酸基を塩化チオニルにより
塩素化した後［ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカ
ル・ソサエティー（J. Am. Che. Soc.），６０，２５４
０（１９３８）］、アンモニアで処理することにより製
造できる［オーガニック・ファンクショナル・グループ
・プレパレーションズ（Organic Functional Group Pre
parations）, 第１巻, ３８２頁］。ＲがＳＨで、Ａが
ＬＡＳとなる式（Ｉ）で表される化合物は、クロロアル
キルベンゼン、例えば２−クロロエチルベンゼンをスル
ホン化した後［ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー
（J. Chromato.），１７８，２５９（１９７９）］、水
硫化ナトリウムと反応させることにより製造できる［ジ
ャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー
（J. Am. Che. Soc.），７２，１８４３（１９５
０）］。ＲがＳＨで、Ａがポリオキシエチレンアルキル
フェニルエーテルとなる式（Ｉ）で表される化合物は、
ポリオキシアルキルフェニルエーテルの水酸基を塩化チ
オニルにより塩素化した後［ジャーナル・オブ・アメリ
カン・ケミカル・ソサエティー（J. Am. Che. Soc.），
６０，２５４０（１９３８）］、水硫化ナトリウムと反
応させることにより製造できる［ジャーナル・オブ・ア
メリカン・ケミカル・ソサエティー（J. Am. Che. So
c.），７２，１８４３（１９５０）］。
縁化合物と蛋白質との複合体の形成は、例えば、式： Ａ−Ｒ （Ｉ） ［式中、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＮＨ2またはＳＨを、Ａは、
Ｒ基の離脱により、合成洗剤用界面活性剤化合物または
その類縁化合物となる基を示す。］で表される化合物
を、自体公知の方法により蛋白質に結合させることによ
り行える。式（Ｉ）で表される化合物も、自体公知の方
法で、適宜の原料に、カルボキシル基、アミノ基、スル
フヒドリル基を形成または導入することにより、化学的
に合成できる。例えば、ＲがＣＯＯＨで、ＡがＬＡＳと
なる式（Ｉ）で表される化合物は、フェニルアルキルカ
ルボン酸、例えばフェニル吉草酸をスルホン化すること
により製造できる［ジャーナル・オブ・クロマトグラフ
ィー（J. Chromato.），１７８，２５９（１９７
９）］。ＲがＣＯＯＨで、Ａがポリオキシエチレンアル
キルフェニルエーテルとなる式（Ｉ）で表される化合物
は、ポリオキシアルキルフェニルエーテルと無水コハク
酸を脱水縮合（ハーフエステル）することにより製造で
きる［キャンサー・バイオケミストリー・バイオフィジ
ックス（Cancer Biochem. Biophys.），７，１７５（１
９８４）］。ＲがＮＨ2で、ＡがＬＡＳとなる式（Ｉ）
で表される化合物は、クロロアルキルベンゼン、例えば
２−クロロエチルベンゼンをスルホン化した後［ジャー
ナル・オブ・クロマトグラフィー（J. Chromato.），１
７８，２５９（１９７９）］、アンモニアで処理するこ
とにより製造できる［オーガニック・ファンクショナル
・グループ・プレパレーションズ（Organic Functional
Group Preparations）, 第１巻, ３８２頁］。ＲがＮ
Ｈ2で、Ａがポリオキシエチレンアルキルフェニルエー
テルとなる式（Ｉ）で表される化合物は、ポリオキシア
ルキルフェニルエーテルの水酸基を塩化チオニルにより
塩素化した後［ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカ
ル・ソサエティー（J. Am. Che. Soc.），６０，２５４
０（１９３８）］、アンモニアで処理することにより製
造できる［オーガニック・ファンクショナル・グループ
・プレパレーションズ（Organic Functional Group Pre
parations）, 第１巻, ３８２頁］。ＲがＳＨで、Ａが
ＬＡＳとなる式（Ｉ）で表される化合物は、クロロアル
キルベンゼン、例えば２−クロロエチルベンゼンをスル
ホン化した後［ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー
（J. Chromato.），１７８，２５９（１９７９）］、水
硫化ナトリウムと反応させることにより製造できる［ジ
ャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー
（J. Am. Che. Soc.），７２，１８４３（１９５
０）］。ＲがＳＨで、Ａがポリオキシエチレンアルキル
フェニルエーテルとなる式（Ｉ）で表される化合物は、
ポリオキシアルキルフェニルエーテルの水酸基を塩化チ
オニルにより塩素化した後［ジャーナル・オブ・アメリ
カン・ケミカル・ソサエティー（J. Am. Che. Soc.），
６０，２５４０（１９３８）］、水硫化ナトリウムと反
応させることにより製造できる［ジャーナル・オブ・ア
メリカン・ケミカル・ソサエティー（J. Am. Che. So
c.），７２，１８４３（１９５０）］。
【００１０】動物を免疫するには、得られた複合体を動
物に接種する。接種する動物としては、例えば、ヤギ、
ヒツジ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ニワト
リなどが用いられるが、ＬＡＳまたはＡＰＥに対するモ
ノクローナル抗体（以下、ＭoＡbと略記することがあ
る）が所望の場合には、マウスが特に好ましく用いられ
る。接種方法としては、通常実施される方法でよく、例
えば、マウスに１回に１〜１００μg、好ましくは５０
〜１００μgを等容量（０.１ml）の生理食塩水およびフ
ロイントの完全アジュバントまたはＲＩＢＩアジュバン
トシステムで乳化して、背部、腹部の皮下あるいは腹腔
内に２〜３週毎に３〜６回接種する方法がとられる。こ
れらの免疫動物、例えば、マウスから抗体価の高い個体
を選び、最終免疫３〜５日後に脾臓あるいはリンパ節を
採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と
融合させる。融合操作は既知の方法に従って実施でき、
融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（以下、
ＰＥＧと略す）や、センダイウイルスなどが挙げられる
が、好ましくは、ＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞とし
てはＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、Ｓp２／Ｏなどが用いられ、
特にＰ３Ｕ１が好ましい。例えば、脾細胞と骨髄腫細胞
との好ましい比率は１:１〜１０:１で、これに分子量
１,０００〜６,０００のＰＥＧが１０〜８０％の濃度で
添加され、２０〜３７℃、好ましくは３０〜３７℃で３
〜１０分インキュベートするのがよい。
物に接種する。接種する動物としては、例えば、ヤギ、
ヒツジ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ニワト
リなどが用いられるが、ＬＡＳまたはＡＰＥに対するモ
ノクローナル抗体（以下、ＭoＡbと略記することがあ
る）が所望の場合には、マウスが特に好ましく用いられ
る。接種方法としては、通常実施される方法でよく、例
えば、マウスに１回に１〜１００μg、好ましくは５０
〜１００μgを等容量（０.１ml）の生理食塩水およびフ
ロイントの完全アジュバントまたはＲＩＢＩアジュバン
トシステムで乳化して、背部、腹部の皮下あるいは腹腔
内に２〜３週毎に３〜６回接種する方法がとられる。こ
れらの免疫動物、例えば、マウスから抗体価の高い個体
を選び、最終免疫３〜５日後に脾臓あるいはリンパ節を
採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と
融合させる。融合操作は既知の方法に従って実施でき、
融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（以下、
ＰＥＧと略す）や、センダイウイルスなどが挙げられる
が、好ましくは、ＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞とし
てはＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、Ｓp２／Ｏなどが用いられ、
特にＰ３Ｕ１が好ましい。例えば、脾細胞と骨髄腫細胞
との好ましい比率は１:１〜１０:１で、これに分子量
１,０００〜６,０００のＰＥＧが１０〜８０％の濃度で
添加され、２０〜３７℃、好ましくは３０〜３７℃で３
〜１０分インキュベートするのがよい。
【００１１】所望の抗体産生ハイブリドーマのスクリー
ニングには、種々の方法が使用できるが、例えば、ＳＰ
ＣまたはＮＰ７ＥＣを結合させたＯＶＡを吸着させたマ
イクロプレートにハイブリドーマ培養上清を添加し、つ
いで、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略
す）標識した抗マウス免疫グロブリン抗体を加え、プレ
ート固相に結合した抗体を検出するＥＬＩＳＡ法などが
挙げられる。抗体活性陽性のハイブリドーマを直ちにク
ローニングに供するが、通常これは限界希釈法などで容
易に実施される。クローン化されたハイブリドーマ上清
の抗体価を上記の方法で測定し、安定的に力価の高い抗
体を産生するハイブリドーマを選択し、目的とするモノ
クローナルなハイブリドーマを取得することができる。
以上のよう方法で作成した抗ＬＡＳ抗体産生ハイブリド
ーマの例として、後の実施例に示すマウスハイブリドー
マＧＯＴ９３０−９、ＧＯＴ９３５−５４またはＭＯＦ
３−１３９が挙げられる。
ニングには、種々の方法が使用できるが、例えば、ＳＰ
ＣまたはＮＰ７ＥＣを結合させたＯＶＡを吸着させたマ
イクロプレートにハイブリドーマ培養上清を添加し、つ
いで、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略
す）標識した抗マウス免疫グロブリン抗体を加え、プレ
ート固相に結合した抗体を検出するＥＬＩＳＡ法などが
挙げられる。抗体活性陽性のハイブリドーマを直ちにク
ローニングに供するが、通常これは限界希釈法などで容
易に実施される。クローン化されたハイブリドーマ上清
の抗体価を上記の方法で測定し、安定的に力価の高い抗
体を産生するハイブリドーマを選択し、目的とするモノ
クローナルなハイブリドーマを取得することができる。
以上のよう方法で作成した抗ＬＡＳ抗体産生ハイブリド
ーマの例として、後の実施例に示すマウスハイブリドー
マＧＯＴ９３０−９、ＧＯＴ９３５−５４またはＭＯＦ
３−１３９が挙げられる。
【００１２】これらのハイブリドーマより産生される合
成洗剤用界面活性剤化合物またはその分解物に対するモ
ノクローナル抗体も本発明の範囲のものである。ハイブ
リドーマによるモノクローナル抗体の産生、精製も自体
公知の方法で行える。得られたモノクローナル抗体は、
該合成洗剤用界面活性剤化合物、その分解物のみなら
ず、式（Ｉ）で表される化合物に対する抗体となる。
成洗剤用界面活性剤化合物またはその分解物に対するモ
ノクローナル抗体も本発明の範囲のものである。ハイブ
リドーマによるモノクローナル抗体の産生、精製も自体
公知の方法で行える。得られたモノクローナル抗体は、
該合成洗剤用界面活性剤化合物、その分解物のみなら
ず、式（Ｉ）で表される化合物に対する抗体となる。
【００１３】得られたモノクローナル抗体は、例えば、
「代謝」，Vol.８，６９６（１９７１）に記載されてい
るブロムシアン法、グルタルアルデヒド（以下、ＧＬＡ
と略す）法などの公知の方法により、固相抗体とするこ
とができる。また、より簡便で好ましい方法として、抗
体を、マイクロプレートやチューブ、ポリスチレン粒子
上に物理的に吸着させる方法、イムノクロマト法を利用
した方法などがある。これらを、例えば、ＥＬＩＳＡ用
の酵素剤や、緩衝剤等と組み合わせて、洗剤、その分解
物またはそれらの混合物の免疫学的分析用キットとする
ことができ、かかるキットも本発明範囲のものである。
「代謝」，Vol.８，６９６（１９７１）に記載されてい
るブロムシアン法、グルタルアルデヒド（以下、ＧＬＡ
と略す）法などの公知の方法により、固相抗体とするこ
とができる。また、より簡便で好ましい方法として、抗
体を、マイクロプレートやチューブ、ポリスチレン粒子
上に物理的に吸着させる方法、イムノクロマト法を利用
した方法などがある。これらを、例えば、ＥＬＩＳＡ用
の酵素剤や、緩衝剤等と組み合わせて、洗剤、その分解
物またはそれらの混合物の免疫学的分析用キットとする
ことができ、かかるキットも本発明範囲のものである。
【００１４】本発明の免疫化学的分析方法においては、
検体（例、洗剤、その分解物またはそれらの混合物を含
有する水や土壌試料）と、既知の量の標識された洗剤、
その分解物またはそれらの混合物との、本発明のモノク
ローナル抗体に対する結合の量的な競合反応によって定
量するいわゆる競合法が用いられる。競合法において
は、未知の抗原を含む検体液に、担体上に保持された一
定量の抗体を加え、さらに標識剤で標識した一定量の抗
原を加える。担体上に保持された標識剤または担体上に
保持されなかった標識剤の活性を測定する。抗体と標識
された抗原の添加はほぼ同時に行うことが望ましい。こ
の競合法は、一般にサンドウィッチ法などに比べて、操
作が簡便で比較的短時間での測定が可能である。
検体（例、洗剤、その分解物またはそれらの混合物を含
有する水や土壌試料）と、既知の量の標識された洗剤、
その分解物またはそれらの混合物との、本発明のモノク
ローナル抗体に対する結合の量的な競合反応によって定
量するいわゆる競合法が用いられる。競合法において
は、未知の抗原を含む検体液に、担体上に保持された一
定量の抗体を加え、さらに標識剤で標識した一定量の抗
原を加える。担体上に保持された標識剤または担体上に
保持されなかった標識剤の活性を測定する。抗体と標識
された抗原の添加はほぼ同時に行うことが望ましい。こ
の競合法は、一般にサンドウィッチ法などに比べて、操
作が簡便で比較的短時間での測定が可能である。
【００１５】抗原を標識する標識剤としては、放射性同
位元素（以下、ＲＩと略す）、酵素、酵素基質、蛍光物
質、ビオチンなどが挙げられる。これら抗原と標識剤の
結合には、マレイミド法［ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（Ｊ.Ｂiochem.），７９，２３３（１９７
６）］、活性化ビオチン法［ジャーナル・オブ・アメリ
カン・ケミカル・ソサエティー（Ｊ.Ａm．Ｃhem．Ｓo
c.），１００，３５８５（１９７８）］などが用いられ
る。
位元素（以下、ＲＩと略す）、酵素、酵素基質、蛍光物
質、ビオチンなどが挙げられる。これら抗原と標識剤の
結合には、マレイミド法［ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（Ｊ.Ｂiochem.），７９，２３３（１９７
６）］、活性化ビオチン法［ジャーナル・オブ・アメリ
カン・ケミカル・ソサエティー（Ｊ.Ａm．Ｃhem．Ｓo
c.），１００，３５８５（１９７８）］などが用いられ
る。
【００１６】例えば、ＬＡＳの場合、競合法による特異
的免疫化学的測定方法を実施するには、未知量のＬＡＳ
を含有する被検試料に公知の常套手段で物理的または化
学的に抗体を結合させた固相を加えて反応させる。ま
た、同時に標識剤で標識した抗原の一定量を加えて反応
させる。つぎに、通常、固相をよく洗浄し、固相上に結
合している標識剤の活性を測定する。標識剤がＲＩであ
る場合、ウェル・カウンターまたは液体シンチレーショ
ン・カウンターで測定する。標識剤が酵素である場合、
基質を加えて放置し、比色法もしくは蛍光法で酵素活性
を測定する。標識剤が蛍光物質、発光物質であっても、
それぞれ公知の方法に従って測定する。本発明の方法に
おいては、特異性の高いモノクローナル抗体を用いてい
るので、ＬＡＳ、ＡＰＥおよびそれらの分解物以外の化
合物、例えば、トルエン、フェノール、ベンゼン、アニ
リンなどベンゼン環をもつような化合物または他の界面
活性剤について、交叉反応で誤って測定してしまうこと
はなく、非常に特異的にＬＡＳ、ＡＰＥおよびそれらの
分解物を定量することができるという極めて優れた特色
を有するものである。かくして、本発明では洗剤や、そ
の分解物に非常に特異的な抗体を用いることによって、
検体中の他の化学物質による影響を排除できるので、高
感度に、かつ特異的に、簡便に測定が行え、学術上での
分析はもとより、環境保全等における洗剤、その分解物
の影響等の調査等に有用である。
的免疫化学的測定方法を実施するには、未知量のＬＡＳ
を含有する被検試料に公知の常套手段で物理的または化
学的に抗体を結合させた固相を加えて反応させる。ま
た、同時に標識剤で標識した抗原の一定量を加えて反応
させる。つぎに、通常、固相をよく洗浄し、固相上に結
合している標識剤の活性を測定する。標識剤がＲＩであ
る場合、ウェル・カウンターまたは液体シンチレーショ
ン・カウンターで測定する。標識剤が酵素である場合、
基質を加えて放置し、比色法もしくは蛍光法で酵素活性
を測定する。標識剤が蛍光物質、発光物質であっても、
それぞれ公知の方法に従って測定する。本発明の方法に
おいては、特異性の高いモノクローナル抗体を用いてい
るので、ＬＡＳ、ＡＰＥおよびそれらの分解物以外の化
合物、例えば、トルエン、フェノール、ベンゼン、アニ
リンなどベンゼン環をもつような化合物または他の界面
活性剤について、交叉反応で誤って測定してしまうこと
はなく、非常に特異的にＬＡＳ、ＡＰＥおよびそれらの
分解物を定量することができるという極めて優れた特色
を有するものである。かくして、本発明では洗剤や、そ
の分解物に非常に特異的な抗体を用いることによって、
検体中の他の化学物質による影響を排除できるので、高
感度に、かつ特異的に、簡便に測定が行え、学術上での
分析はもとより、環境保全等における洗剤、その分解物
の影響等の調査等に有用である。
【００１７】
【実施例】以下に、実施例を挙げ、本発明をさらに具体
的に説明するが、これらは、本発明の範囲を限定するも
のではない。なお、以下の実施例は、ＬＡＳ、ＳＰＣ、
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびＡＰＥについ
てのものであるが、これらは同様に他の合成洗剤用界面
活性剤化合物にも適用できる。また、実施例におけるマ
ウス−マウスハイブリドーマＧＯＴ９３０−９およびＧ
ＯＴ９３５−５４は、それぞれ通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）にブタペスト条約の
下、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６０６５およびＦＥＲＭ
ＢＰ−６０６６として（原寄託日：平成８年９月２５
日）、また、ＭＯＦ３−１３９は、平成９年８月１３日
よりブタペスト条約の下、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６
０５９として寄託されている。 実施例１ 抗ハプテンモノクロナール抗体の取得 （１）免疫原の調製 ハプテンであるＳＰＣおよびＮＰ７ＥＣは公知の方法で
フェニル吉草酸およびノニルフェノールエトキシレート
から合成した。ハプテン５０mg／ml水溶液をＢＳＡ５０
mg／４ml水溶液に加え、水溶性カルボジイミド５０mg／
ml水溶液１mlを氷冷下、静かに滴下し、５時間反応させ
た。蒸留水で５回透析後（３リットル×５）、凍結保存
し免疫原として用いた。 （２）免疫 ハプテンとＢＳＡの複合体５００μg／ml生理食塩水に
等量のフロイント完全アジュバントを添加し十分乳濁
後、ＢＡＬＢ／cマウス（雌、１００μg／０.４ml／マ
ウス）に腹腔および背部皮下投与し、２週間隔で追加免
疫を実施した。６回の追加免疫後、２週で最大の血清抗
体価を示した個体について、同じ複合体溶液（３０μg
／０.１ml生理食塩水／マウス）を静脈投与した。
的に説明するが、これらは、本発明の範囲を限定するも
のではない。なお、以下の実施例は、ＬＡＳ、ＳＰＣ、
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびＡＰＥについ
てのものであるが、これらは同様に他の合成洗剤用界面
活性剤化合物にも適用できる。また、実施例におけるマ
ウス−マウスハイブリドーマＧＯＴ９３０−９およびＧ
ＯＴ９３５−５４は、それぞれ通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）にブタペスト条約の
下、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６０６５およびＦＥＲＭ
ＢＰ−６０６６として（原寄託日：平成８年９月２５
日）、また、ＭＯＦ３−１３９は、平成９年８月１３日
よりブタペスト条約の下、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６
０５９として寄託されている。 実施例１ 抗ハプテンモノクロナール抗体の取得 （１）免疫原の調製 ハプテンであるＳＰＣおよびＮＰ７ＥＣは公知の方法で
フェニル吉草酸およびノニルフェノールエトキシレート
から合成した。ハプテン５０mg／ml水溶液をＢＳＡ５０
mg／４ml水溶液に加え、水溶性カルボジイミド５０mg／
ml水溶液１mlを氷冷下、静かに滴下し、５時間反応させ
た。蒸留水で５回透析後（３リットル×５）、凍結保存
し免疫原として用いた。 （２）免疫 ハプテンとＢＳＡの複合体５００μg／ml生理食塩水に
等量のフロイント完全アジュバントを添加し十分乳濁
後、ＢＡＬＢ／cマウス（雌、１００μg／０.４ml／マ
ウス）に腹腔および背部皮下投与し、２週間隔で追加免
疫を実施した。６回の追加免疫後、２週で最大の血清抗
体価を示した個体について、同じ複合体溶液（３０μg
／０.１ml生理食塩水／マウス）を静脈投与した。
【００１８】（３）細胞融合 最後の免疫から３日後、マウス腹腔中から脾臓を摘出
し、脾細胞懸濁液を常法により調製した（約１０
8個）。ついで、血清無添加培地で３回洗浄したマウス
骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ１）２×１０7個を添加し、ＰＥＧ
６０００を用いてケーラーとミルスタインの方法［ネー
チャー（Ｎature），２５６，４９５（１９７５）］に
準じて細胞融合に供した。融合終了後、細胞混液をヒポ
キサンチン・アミノプテリンおよびチミジンを含む、い
わゆるＨＡＴ培地中に懸濁し、１０日間培養した。１０
日間の培養期間中に脾臓由来の細胞は自然に死滅し、Ｈ
ＡＴ培地により脾臓細胞と融合しなかったＰ３Ｕ１株も
死滅した。培地中に生存した細胞をハイブリドーマと
し、以後はＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたＨＴ
培地に代えて培養を続けた。 （４）ハイブリドーマの一次選択およびクローニング 固相にハプテンとＯＶＡの複合体（以下ハプテン−ＯＶ
Ａと略す）を吸着させたマイクロプレートを用いるＥＬ
ＩＳＡ法でハイブリドーマ培養上清の抗体価を測定し
た。融合１０日目から２０日後でハイブリドーマの出現
を認め、かつハプテン−ＯＶＡに結合する抗体の出現が
認められた。特に産生抗体の結合活性の強いハイブリド
ーマについて、限界希釈法によるクローニンングに供し
た。
し、脾細胞懸濁液を常法により調製した（約１０
8個）。ついで、血清無添加培地で３回洗浄したマウス
骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ１）２×１０7個を添加し、ＰＥＧ
６０００を用いてケーラーとミルスタインの方法［ネー
チャー（Ｎature），２５６，４９５（１９７５）］に
準じて細胞融合に供した。融合終了後、細胞混液をヒポ
キサンチン・アミノプテリンおよびチミジンを含む、い
わゆるＨＡＴ培地中に懸濁し、１０日間培養した。１０
日間の培養期間中に脾臓由来の細胞は自然に死滅し、Ｈ
ＡＴ培地により脾臓細胞と融合しなかったＰ３Ｕ１株も
死滅した。培地中に生存した細胞をハイブリドーマと
し、以後はＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたＨＴ
培地に代えて培養を続けた。 （４）ハイブリドーマの一次選択およびクローニング 固相にハプテンとＯＶＡの複合体（以下ハプテン−ＯＶ
Ａと略す）を吸着させたマイクロプレートを用いるＥＬ
ＩＳＡ法でハイブリドーマ培養上清の抗体価を測定し
た。融合１０日目から２０日後でハイブリドーマの出現
を認め、かつハプテン−ＯＶＡに結合する抗体の出現が
認められた。特に産生抗体の結合活性の強いハイブリド
ーマについて、限界希釈法によるクローニンングに供し
た。
【００１９】（５）ハイブリドーマの二次選択 （５）−１ 抗ＬＡＳ抗体、抗ＳＰＣ抗体、抗ＳＤＳ抗
体産生ハイブリドーマの選択 （４）の方法で取得したハイブリドーマーについて、Ｌ
ＡＳ、ＳＰＣ、ＳＤＳ、ベンゼンスルホン酸、トルエ
ン、ベンゼン、フェノールなどの化合物を、これらの培
養上清に添加し、ＳＰＣ−ＯＶＡを吸着したマイクロプ
レートへの結合能の阻害を見る結合阻害試験を行い、Ｌ
ＡＳのみ、またはＬＡＳ、ＳＰＣおよびＳＤＳにより結
合が阻害され、他のものについては結合が影響を受けな
いものを選択した。これらの結果、ＬＡＳに特異的に結
合するモノクロナール抗体産生ハイブリドーマＧＯＴ９
３５−５４およびＬＡＳ、ＳＰＣ、ＳＤＳと特異的に結
合するモノクロナール抗体産生ハイブリドーマＧＯＴ９
３０−９が得られた。これらの免疫グロブリンクラス、
サブクラスはＥＬＩＳＡ法による測定で両方ともＩｇＧ
１であった。 （５）−２ 抗ＡＰＥ抗体産生ハイブリドーマの選択 （４）の方法で取得したハイブリドーマについて、ＡＰ
Ｅ、ＡＰＥ生分解物（ＡＰＥＣと略記することもある）
およびＰＥＧ等の化合物をこの培養上清に加えて、ＮＰ
７ＥＣ−ＯＶＡを吸着したマイクロプレートへの結合能
の阻害を調べる阻害試験を行い、ＡＰＥおよびＡＰＥＣ
により結合が阻害され、他のものについては結合が影響
を受けないものを選択した。これらの結果から、ＡＰ
Ｅ、ＡＰＥＣに特異的に結合するモノクロナール抗体産
生ハイブリドーマＭＯＦ３−１３９が得られた。この免
疫グロブリンクラス、サブクラスはＥＬＩＳＡ法による
測定でＩｇＧ１であった。測定物質、用いたハプテン、
取得したハイブリドーマおよびその受託番号を表１にま
とめる。
体産生ハイブリドーマの選択 （４）の方法で取得したハイブリドーマーについて、Ｌ
ＡＳ、ＳＰＣ、ＳＤＳ、ベンゼンスルホン酸、トルエ
ン、ベンゼン、フェノールなどの化合物を、これらの培
養上清に添加し、ＳＰＣ−ＯＶＡを吸着したマイクロプ
レートへの結合能の阻害を見る結合阻害試験を行い、Ｌ
ＡＳのみ、またはＬＡＳ、ＳＰＣおよびＳＤＳにより結
合が阻害され、他のものについては結合が影響を受けな
いものを選択した。これらの結果、ＬＡＳに特異的に結
合するモノクロナール抗体産生ハイブリドーマＧＯＴ９
３５−５４およびＬＡＳ、ＳＰＣ、ＳＤＳと特異的に結
合するモノクロナール抗体産生ハイブリドーマＧＯＴ９
３０−９が得られた。これらの免疫グロブリンクラス、
サブクラスはＥＬＩＳＡ法による測定で両方ともＩｇＧ
１であった。 （５）−２ 抗ＡＰＥ抗体産生ハイブリドーマの選択 （４）の方法で取得したハイブリドーマについて、ＡＰ
Ｅ、ＡＰＥ生分解物（ＡＰＥＣと略記することもある）
およびＰＥＧ等の化合物をこの培養上清に加えて、ＮＰ
７ＥＣ−ＯＶＡを吸着したマイクロプレートへの結合能
の阻害を調べる阻害試験を行い、ＡＰＥおよびＡＰＥＣ
により結合が阻害され、他のものについては結合が影響
を受けないものを選択した。これらの結果から、ＡＰ
Ｅ、ＡＰＥＣに特異的に結合するモノクロナール抗体産
生ハイブリドーマＭＯＦ３−１３９が得られた。この免
疫グロブリンクラス、サブクラスはＥＬＩＳＡ法による
測定でＩｇＧ１であった。測定物質、用いたハプテン、
取得したハイブリドーマおよびその受託番号を表１にま
とめる。
【００２０】
【表１】 測定物質 ハプテン ハイブリドーマ 受託番号 ＬＡＳ ＳＰＣ ＧＯＴ９３５−５４ ＦＥＲＭ ＢＰ−６０６６ ＳＰＣ ＳＰＣ ＧＯＴ９３０−９ ＦＥＲＭ ＢＰ−６０６５ ＳＤＳ ＳＰＣ ＧＯＴ９３０−９ ＦＥＲＭ ＢＰ−６０６５ ＡＰＥ ＮＰ７ＥＣ ＭＯＦ３−１３９ ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５９
【００２１】（６）モノクローナル抗体の作製 クローン化されたハイブリドーマを、１０％ウシ胎児血
清を含むダイゴＴ培地（日本製薬、東京）中、３７℃、
５％ＣＯ2濃度のインキュベータを用いて培養し、その
上清より抗体を得た。一方、多量の抗体を得るために
は、予め０.５mlの鉱油を腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃ
マウスに５×１０6個のハイブリドーマを腹腔内接種し
た。細胞を接種したマウスは約１０日後に腹水の貯留が
見られた。腹水の貯留したマウスを開腹し、腹腔内より
腹水液を採取した。抗体の精製は常法により、細胞培養
上清または腹水上清より４５〜５０％飽和硫酸アンモニ
ウムで分画後、プロテインＡカラムクロマトグラフィー
に供し、実施した。腹水上清液２mlから、細胞株によっ
て２〜２０mgのモノクローナル抗体が得られた。また、
これら精製したモノクローナル抗体をＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に供したところ、９６％以上の純
度を示した。
清を含むダイゴＴ培地（日本製薬、東京）中、３７℃、
５％ＣＯ2濃度のインキュベータを用いて培養し、その
上清より抗体を得た。一方、多量の抗体を得るために
は、予め０.５mlの鉱油を腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃ
マウスに５×１０6個のハイブリドーマを腹腔内接種し
た。細胞を接種したマウスは約１０日後に腹水の貯留が
見られた。腹水の貯留したマウスを開腹し、腹腔内より
腹水液を採取した。抗体の精製は常法により、細胞培養
上清または腹水上清より４５〜５０％飽和硫酸アンモニ
ウムで分画後、プロテインＡカラムクロマトグラフィー
に供し、実施した。腹水上清液２mlから、細胞株によっ
て２〜２０mgのモノクローナル抗体が得られた。また、
これら精製したモノクローナル抗体をＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に供したところ、９６％以上の純
度を示した。
【００２２】実施例２ ＬＡＳおよびＬＡＳ分解物の測定 （１）ＨＲＰ標識ＳＰＣの作製 蒸留水に溶解したＨＲＰペルオキシダーゼ４mg／０.２m
lとＳＰＣ１０mg／０.２mlを混合し、氷上で１５mg／
０.１mlの水溶性カルボジイミド溶液を攪拌しながら滴
下した。氷上で約８時間反応後、ＰＢＳ（−）に対して
十分透析し、未反応のＳＰＣ、ＷＳＣを除去した。 （２）モノクローナル抗体の固相化 実施例１（５）−１で得られた抗体を２５mＭビス−ト
リス緩衝液に５μg／mlの濃度に溶解し、９６ウエル・
イムノプレート（ヌンク社製、デンマーク）の各ウェル
に１００μlずつ分注し、４℃で一晩静置し、抗体を固
相化した。抗体の結合しなかった結合基をブロックする
ために、０.０１％メルチオレートナトリウム（シグマ
社製、ＵＳＡ）を含むブロックエース溶液（雪印乳業株
式会社製、東京）を１５０μlずつ分注し、使用するま
で４℃にて保存した。 （３）ＬＡＳおよびＬＡＳ分解物の測定 蒸留水を用いてＬＡＳ、ＳＰＣ、ＳＤＳ（東京化成株式
会社製、東京）を希釈したものと、上記（１）で調製し
たＨＲＰ標識ＳＰＣ ２μg／ml（０.０２％Ｔween２０
−ＰＢＳ）を等量混合し、上記（２）で調製した抗体結
合マイクロプレートの各ウエルに添加した。室温で９０
分反応後、ＰＢＳでプレートを洗浄し、酵素基質液（Ｔ
ＭＢＺ ０.１mg／ml、ウレアハイドロゲンペルオキサイ
ド０.３５mg／mlを含む４０mＭクエン酸緩衝液、pＨ５.
０）１００μlを添加し、１５分間発色反応を行わせ
た。１Ｎリン酸で反応停止後、４５０nmにおける吸光度
を測定した。ＬＡＳ、ＳＰＣおよびＳＤＳの標準曲線を
それぞれ、図１、図２および図３に示す。この系で約２
０〜５００ｐｐｂのＬＡＳが、また、約５０〜５００ｐ
ｐｂのＳＰＣおよびＳＤＳが測定できた。
lとＳＰＣ１０mg／０.２mlを混合し、氷上で１５mg／
０.１mlの水溶性カルボジイミド溶液を攪拌しながら滴
下した。氷上で約８時間反応後、ＰＢＳ（−）に対して
十分透析し、未反応のＳＰＣ、ＷＳＣを除去した。 （２）モノクローナル抗体の固相化 実施例１（５）−１で得られた抗体を２５mＭビス−ト
リス緩衝液に５μg／mlの濃度に溶解し、９６ウエル・
イムノプレート（ヌンク社製、デンマーク）の各ウェル
に１００μlずつ分注し、４℃で一晩静置し、抗体を固
相化した。抗体の結合しなかった結合基をブロックする
ために、０.０１％メルチオレートナトリウム（シグマ
社製、ＵＳＡ）を含むブロックエース溶液（雪印乳業株
式会社製、東京）を１５０μlずつ分注し、使用するま
で４℃にて保存した。 （３）ＬＡＳおよびＬＡＳ分解物の測定 蒸留水を用いてＬＡＳ、ＳＰＣ、ＳＤＳ（東京化成株式
会社製、東京）を希釈したものと、上記（１）で調製し
たＨＲＰ標識ＳＰＣ ２μg／ml（０.０２％Ｔween２０
−ＰＢＳ）を等量混合し、上記（２）で調製した抗体結
合マイクロプレートの各ウエルに添加した。室温で９０
分反応後、ＰＢＳでプレートを洗浄し、酵素基質液（Ｔ
ＭＢＺ ０.１mg／ml、ウレアハイドロゲンペルオキサイ
ド０.３５mg／mlを含む４０mＭクエン酸緩衝液、pＨ５.
０）１００μlを添加し、１５分間発色反応を行わせ
た。１Ｎリン酸で反応停止後、４５０nmにおける吸光度
を測定した。ＬＡＳ、ＳＰＣおよびＳＤＳの標準曲線を
それぞれ、図１、図２および図３に示す。この系で約２
０〜５００ｐｐｂのＬＡＳが、また、約５０〜５００ｐ
ｐｂのＳＰＣおよびＳＤＳが測定できた。
【００２３】実施例３ ＡＰＥの測定 （１）ＨＲＰ標識ＮＰ７ＥＣの作製 ０.１３Ｍ ＮaＨＣＯ3水溶液に溶解したＨＲＰ３.３mg
／２mlと、公知の方法により活性化エステルを形成させ
たＮＰ７ＥＣ３００μg／５μlＤＭＳＯを混合し、４℃
で一晩反応させた。ＰＢＳ（−）に対して十分透析し、
未反応のＮＰ７ＥＣを除去した。 （２）モノクロナール抗体の固相化 実施例１（５）−２で得られた抗体をＰＢＳ（−）に５
μg／mlの濃度に溶解し、実施例２（２）の方法で９６
ウエル・イムノプレートに固相化した。 （３）ＡＰＥおよびＡＰＥ生分解物の測定 ６０％メタノール水溶液を用いてＡＰＥ（東京化成株式
会社）を希釈したものと、上記（１）で調製したＨＲＰ
標識ＮＰ７ＥＣ０.３μg／ml（０．１％Ｔween２０−２
倍濃縮ＰＢＳ）を当量混合し、上記（２）で調製した抗
体結合マイクロプレートの各ウエルに添加した。室温で
９０分反応後、０.０５％Ｔween２０−ＰＢＳでプレー
トを洗浄し、酵素基質液（ＴＭＢＺ ０.１mg／ml、ウレ
アハイドロゲンペルオキサイド０.０３５mg／mlを含む
４０mＭクエン酸緩衝液、pＨ５.０）１００μlを添加
し、１５分間発色反応を行わせた。１Ｎリン酸で反応停
止後、４５０nmにおける吸光度を測定した。ＡＰＥの標
準曲線を図４に示す。この系で約５０〜５００ｐｐｂの
ＡＰＥが測定できた。
／２mlと、公知の方法により活性化エステルを形成させ
たＮＰ７ＥＣ３００μg／５μlＤＭＳＯを混合し、４℃
で一晩反応させた。ＰＢＳ（−）に対して十分透析し、
未反応のＮＰ７ＥＣを除去した。 （２）モノクロナール抗体の固相化 実施例１（５）−２で得られた抗体をＰＢＳ（−）に５
μg／mlの濃度に溶解し、実施例２（２）の方法で９６
ウエル・イムノプレートに固相化した。 （３）ＡＰＥおよびＡＰＥ生分解物の測定 ６０％メタノール水溶液を用いてＡＰＥ（東京化成株式
会社）を希釈したものと、上記（１）で調製したＨＲＰ
標識ＮＰ７ＥＣ０.３μg／ml（０．１％Ｔween２０−２
倍濃縮ＰＢＳ）を当量混合し、上記（２）で調製した抗
体結合マイクロプレートの各ウエルに添加した。室温で
９０分反応後、０.０５％Ｔween２０−ＰＢＳでプレー
トを洗浄し、酵素基質液（ＴＭＢＺ ０.１mg／ml、ウレ
アハイドロゲンペルオキサイド０.０３５mg／mlを含む
４０mＭクエン酸緩衝液、pＨ５.０）１００μlを添加
し、１５分間発色反応を行わせた。１Ｎリン酸で反応停
止後、４５０nmにおける吸光度を測定した。ＡＰＥの標
準曲線を図４に示す。この系で約５０〜５００ｐｐｂの
ＡＰＥが測定できた。
【００２４】
【発明の効果】本発明によれば、洗剤や、その分解物を
高感度で、かつ特異的に、簡便に測定でき、学術的な研
究はもとより、環境保全等に役立たせることができる。
高感度で、かつ特異的に、簡便に測定でき、学術的な研
究はもとより、環境保全等に役立たせることができる。
【図１】 ＬＡＳ測定用の標準曲線である。
【図２】 ＳＰＣ測定用の標準曲線である。
【図３】 ＳＤＳ測定用の標準曲線である。
【図４】 ＡＰＥ測定用の標準曲線である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/18 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/18 33/24 Ｄ 33/24 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 藤本 茂 大阪府池田市石橋４丁目11番11号
Claims (16)
- 【請求項１】 合成洗剤用界面活性剤化合物と蛋白質と
の複合体で免疫した動物の脾細胞またはリンパ節細胞
と、骨髄腫細胞とを融合させて得られる該化合物または
その分解物に対するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ。 - 【請求項２】 合成洗剤用界面活性剤化合物が陰イオン
界面活性剤化合物である請求項１記載のハイブリドー
マ。 - 【請求項３】 陰イオン界面活性剤化合物が、アルキル
硫酸、アルキルベンゼンスルホン酸、アルキルナフタレ
ンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸塩ホルムアルデヒ
ド縮合物およびそれらの塩からなる群から選択される化
合物である請求項２記載のハイブリドーマ。 - 【請求項４】 陰イオン界面活性剤化合物が、直鎖アル
キルベンゼンスルホン酸またはその塩である請求項２記
載のハイブリドーマ。 - 【請求項５】 合成洗剤用界面活性剤が非イオン界面活
性剤である請求項１記載のハイブリドーマ。 - 【請求項６】 非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチ
レンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンア
ルキルエーテル、ポリオキシエーテルポリスチリルフェ
ニルエーテル、ポリオキシエチレンスチレン化フェニル
エーテルおよびそれらの塩からなる群から選択される化
合物である請求項５記載のハイブリドーマ。 - 【請求項７】 マウス−マウスハイブリドーマＧＯＴ９
３０−９、ＧＯＴ９３５−５４またはＭＯＦ３−１３９
である請求項１記載のハイブリドーマ。 - 【請求項８】 請求項１〜７いずれか１項記載のハイブ
リドーマより産生される合成洗剤用界面活性剤化合物ま
たはその分解物に対するモノクローナル抗体。 - 【請求項９】 合成洗剤用界面活性剤化合物が陰イオン
界面活性剤化合物である請求項８記載のモノクローナル
抗体。 - 【請求項１０】 陰イオン界面活性剤化合物が、アルキ
ル硫酸、アルキルベンゼンスルホン酸、アルキルナフタ
レンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸塩ホルムアルデ
ヒド縮合物およびそれらの塩からなる群から選択される
化合物である請求項９記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項１１】 陰イオン界面活性剤化合物が、直鎖ア
ルキルベンゼンスルホン酸またはその塩である請求項９
記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項１２】 合成洗剤用界面活性剤が非イオン界面
活性剤である請求項８記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項１３】 非イオン界面活性剤が、ポリオキシエ
チレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン
アルキルエーテル、ポリオキシエーテルポリスチリルフ
ェニルエーテル、ポリオキシエチレンスチレン化フェニ
ルエーテルおよびそれらの塩からなる群から選択される
化合物である請求項１２記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項１４】 マウス−マウスハイブリドーマＧＯＴ
９３０−９、ＧＯＴ９３５−５４またはＭＯＦ３−１３
９より産生されるマウスモノクローナル抗体である請求
項８記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項１５】 請求項８〜１４いずれか１項記載のモ
ノクローナル抗体を必須の構成成分としてなることを特
徴とする洗剤、その分解物またはそれらの混合物の免疫
学的分析用キット。 - 【請求項１６】 検体と、担体上に保持された請求項８
〜１４いずれか１項記載のモノクローナル抗体と、標識
剤で標識された洗剤、その分解物またはそれらの混合物
とを反応させた後、担体上に保持された標識剤または担
体上に保持されなかった標識剤の活性を測定することを
特徴とする検体中の該洗剤、その分解物またはそれらの
混合物の免疫学的分析方法。
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