JPH10146192A

JPH10146192A - 新規生理活性物質、その製造法および用途

Info

Publication number: JPH10146192A
Application number: JP8348328A
Authority: JP
Inventors: Kuniji Hinuma; 州司日沼; Yuugo Habatake; 祐吾羽畑; Yuji Kawamata; 裕二川俣; Masaki Hosoya; 昌樹細谷; Akira Fujii; 亮藤井; Masashi Fukuzumi; 昌司福住; Chieko Kitada; 千恵子北田
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1995-12-28
Filing date: 1996-12-26
Publication date: 1998-06-02
Anticipated expiration: 2016-12-26
Also published as: JP4306816B2

Abstract

(57)【要約】【課題】新規生理活性物質、その製造法および用途の提
供。【解決手段】本発明は、ヒト下垂体およびマウス膵臓由
来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩、該
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質がリガンドとして認識
するポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドまた
は該ポリペプチドをコードするＤＮＡ等は、組換え型
レセプター蛋白質の発現系を用いたレセプター結合アッ
セイ系の開発と医薬品候補化合物のスクリーニング、
下垂体機能調節剤、中枢機能調節剤または膵臓機能調節
剤などの医薬の開発等に用いることができる。特に、本
発明の組換え型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現
系を用いたレセプター結合アッセイ系によって、ヒトな
どの温血動物に特異的なＧ蛋白質共役型レセプターアゴ
ニストまたはアンタゴニストをスクリーニングすること
ができ、該アゴニストまたはアンタゴニストを各種疾病
の治療・予防剤などとして使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質のリガンドポリペプチド、及びこ
れをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡに関する。

【０００２】

【従来の技術】多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜
に存在する特異的なレセプターを通じて生体の機能を調
節している。これらのレセプターの多くは共役している
guanine nucleotide-binding protein（以下、Ｇ蛋白
質と略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシ
グナル伝達を行い、また７個の膜貫通領域を有する共通
した構造をもっていることから、Ｇ蛋白質共役型レセプ
ターあるいは７回膜貫通型レセプターと総称される。こ
のようなホルモンや神経伝達物質とＧ蛋白質共役型レセ
プターによる生体の機能を調節する経路の一つとして視
床下部−下垂体系がある。これは、視床下部ホルモン
（向下垂体性ホルモン）によって下垂体からの下垂体ホ
ルモンの分泌が調節され、血中に放出された下垂体ホル
モンを介して標的細胞・器官の機能調節が行われるもの
である。この経路によって、ホメオスタシスの維持や生
殖系、個体の発達、代謝、成長の調節などの生体にとっ
て重要な機能調節が行われている。下垂体ホルモンは視
床下部ホルモンと標的内分泌腺より分泌される末梢ホル
モンによるポジティブフィードバック機構またはネガテ
ィブフィードバック機構によって分泌調節されている。
下垂体に存在する各種のレセプター蛋白質は、視床下部
−下垂体系を調節する上で中心的な役割を担っている。

【０００３】また、これらのホルモン・因子およびその
レセプターは視床下部−下垂体系だけに限局して存在す
るのではなく、一般に脳内に広く分布することが知られ
ている。このことは視床下部ホルモンと呼ばれている物
質が、中枢神経系においては神経伝達物質あるいは神経
調節物質として機能していると考えられている。また、
末梢組織においても同様に分布し、それぞれ重要な機能
を担っていると考えられている。膵臓は消化液を分泌す
る他にグルカゴンやインスリンを分泌することにより糖
代謝に重要な役割を果たしている。インスリンは膵臓の
β細胞から分泌されるが、主としてグルコースにより促
進される。しかしβ細胞には様々なレセプターが存在
し、グルコース以外の様々な因子、ペプチドホルモン
（ガラニン、ソマトスタチン、ガストリック・インヒビ
トリー・ポリペプチド、グルカゴン、アミリンなど）、
糖（マンノースなど）、アミノ酸、神経伝達物質などに
より、インスリンの分泌が制御されていることが知られ
ている。これまでに上記Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質のリガンドを決定する一般的な手段としては、Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質の一次構造上の類似性から推
定するしかなかった。最近、動物細胞にリガンドが不明
な、いわゆるオーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質をコードするｃＤＮＡを導入し、新規オピオイドペプ
チドを探索した例が報告されている（Reinsheid, R. K.
et al. , Science、270巻、792-794頁、1995年、Menul
ar, J.-C., et al. , Nature 377巻、532-535頁、1995
年）。しかしこの場合は既知Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質との類似性や組織分布から、容易にリガンドはオ
ピオイドペプチドのファミリーに属することが予想され
ていた。オピオイドレセプターを介して生体に作用する
物質の研究・開発の歴史は長く、種々のアンタゴニスト
・アゴニストが開発されていた。そこで人為的に合成し
た化合物群の中からこの受容体に対するアゴニストを見
出し、それをプローブとして受容体ｃＤＮＡ導入細胞に
おける受容体の発現を検証した後に、アゴニストと同じ
様な細胞内情報伝達系の活性化物質を探索し、これを精
製し、リガンドの構造を決定している。しかし、このよ
うにオーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の中で
リガンドがおおよそ推定されうるものはほとんどなく、
特に、既知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ファミリ
ーと類似性が低い場合、リガンドに関する情報はほとん
どなく、リガンドを推定することは困難であった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】下垂体、中枢神経系お
よび膵臓β細胞等で発現しているオーファンＧ蛋白質共
役型レセプターに対するリガンドは、医薬として有用で
あると考えられるが、これまでにその構造および機能に
ついては明らかにされていない。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、オーファ
ンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮ
Ａを適当な手段で発現させた細胞を用い、特異的な細胞
刺激（シグナル伝達）活性の測定等を指標に、該レセプ
ター蛋白質がリガンドとして認識するポリペプチドをス
クリーニングすることに成功した。さらに、本発明者ら
は、該活性因子であるリガンドと上記レセプター蛋白質
との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行な
うことができることを見いだした。

【０００６】すなわち、本発明は、（１）配列番号：７３で表されるアミノ酸配列と同一も
しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩、（２）配列番号：３、４、５、６、７、８、９、１０、
４７、４８、４９、５０、５１、５２、６１、６２、６
３、６４、６５または６６で表されるアミノ酸配列を含
有するポリペプチドである第（１）項記載のポリペプチ
ド。（３）配列番号：１、４４、４５または５９で表される
アミノ酸配列を含有するポリペプチドである第（１）項
記載のポリペプチド、（４）第（１）項記載のポリペプ
チドの部分ペプチドまたはそのアミド、エステルもしく
はその塩。（５）第（１）項記載のポリペプチドまたは第（４）項
記載の部分ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮ
Ａを含有するＤＮＡ、（６）配列番号：２、１１、１２、１３、１４、１５、
１６、１７、１８、４６、５３、５４、５５、５６、５
７、５８、６０、６７、６８、６９、７０、７１または
７２で表される塩基配列を有する第（５）項記載のＤＮ
Ａ、（７）第（５）項記載のＤＮＡを含有する組換えベクタ
ー、（８）第（５）項記載のＤＮＡまたは第（７）項記載の
組換えベクターを保持する形質転換体、（９）第（８）項記載の形質転換体を培養することを特
徴とする第（１）項記載のポリペプチドまたは第（４）
項記載の部分ペプチドの製造法、（１０）第（１）項記載のポリペプチドまたはそのアミ
ド、エステルもしくはその塩を含有してなる医薬、（１１）第（４）項記載の部分ペプチドまたはそのアミ
ド、エステルもしくはその塩を含有してなる医薬、（１２）第（５）項記載のＤＮＡを含有してなる医薬、（１３）下垂体機能調節剤である第（１０）項、第（１
１）項または第（１２）項記載の医薬、（１４）中枢神経機能調節剤である第（１０）項、第
（１１）項または第（１２）項記載の医薬、（１５）膵臓機能調節剤である第（１０）項、第（１
１）項または第（１２）項記載の医薬、（１６）第（１）項記載のポリペプチドまたは第（４）
項記載の部分ペプチドに対する抗体、（１７）（ｉ）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列
と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
受容体蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩
に、第（１）項記載のポリペプチドまたは第（４）項記
載の部分ペプチドを接触させた場合と（ii）配列番号：
２１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同
一のアミノ酸配列を含有する受容体蛋白質もしくはその
部分ペプチドまたはその塩に、第（１）項記載のポリペ
プチドまたは第（４）項記載の部分ペプチド、および試
験化合物を接触させた場合との比較を行うことを特徴と
する第（１）項記載のポリペプチドまたは第（４）項記
載の部分ペプチドと、配列番号：２１で表されるアミノ
酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含
有する受容体蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそ
の塩との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方
法、（１８）第（１）項記載のポリペプチドまたは第（４）
項記載の部分ペプチドと、配列番号：２１で表されるア
ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列
を含有する受容体蛋白質もしくはその部分ペプチドまた
はその塩との結合性を変化させる化合物のスクリーニン
グ用キット、（１９）第（１）項記載のポリペプチドまたは第（４）
項記載の部分ペプチドと、配列番号：２１で表されるア
ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列
を含有する受容体蛋白質もしくはその部分ペプチドまた
はその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
および（２０）第（１）項記載のポリペプチドまたは第（４）
項記載の部分ペプチドをリガンドとして認識するＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質またはその塩に関する。

【０００７】さらに、本発明は、（２１）ポリペプチドが、配列番号：７３で表わされる
アミノ酸配列、配列番号：７３で表わされるアミノ酸配
列中の１個以上１５個以下、好ましくは１個以上１０個
以下、より好ましくは１個以上５個以下のアミノ酸が欠
失したアミノ酸配列、配列番号：７３で表わされるアミ
ノ酸配列に１個以上８０個以下、好ましくは１個以上５
０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ
酸が付加したアミノ酸配列、あるいは配列番号：７３で
表わされるアミノ酸配列中の１個以上１５個以下、好ま
しくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５
個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸
配列を含有するペプチドである第（１）項記載のポリペ
プチドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩、（２２）配列番号：７３で表されるアミノ酸配列を含有
するポリペプチドのＮ末端にさらに配列番号：７４で表
されるペプチドが付加したアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドである第（１）項記載のポリペプチド、（２３）ウシ、ラットまたはヒト由来である第（１）項
記載のポリペプチド、および（２４）痴呆、鬱病、多動児（微細脳障害）症候群、意
識障害、不安障害、精神分裂症、恐怖症、成長ホルモン
分泌障害、過食症、多食症、高コレステロール血症、高
グリセリド血症、高脂血症、高プロラクチン血症、糖尿
病、癌、膵炎、腎疾患、ターナー症候群、神経症、リウ
マチ関節炎、脊髄損傷、一過性脳虚血発作、筋萎縮性側
索硬化症、急性心筋梗塞、脊髄小脳変性症、骨折、創
傷、アトピー性皮膚炎、骨粗鬆症、喘息、てんかん、不
妊症または乳汁分泌不全などの疾病の治療・予防剤であ
る第（１０）項、第（１１）項または第（１２）項記載
の医薬を提供するものである。

【０００８】本発明におけるリガンドポリペプチドに対
するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に関して、具体的
には、（２５）配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列と同
一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列または（およ
び）配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列と同一ま
たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴
とする、第（２０）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質またはその塩、（２６）配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列と同
一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有すること
を特徴とする第（２５）項記載のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質またはその塩、（２７）配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と同
一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有すること
を特徴とする第（２５）項記載のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質またはその塩、（２８）配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列と同
一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有すること
を特徴とする第（２５）項記載のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質またはその塩、（２９）第（２５）項〜第（２８）項記載のいずれかの
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドまたは
その塩、

【０００９】（３０）第（２５）項記載のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮ
Ａを含有するＤＮＡ、（３１）第（２６）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有する
ＤＮＡ、（３２）第（２７）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有する
ＤＮＡ、（３３）第（２８）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有する
ＤＮＡ、（３４）配列番号：２４で表わされる塩基配列または
（および）配列番号：２５で表わされる塩基配列を有す
る第（３０）項記載のＤＮＡ、（３５）配列番号：２６で表わされる塩基配列で表され
る塩基配列を有する第（３１）項記載のＤＮＡ、（３６）配列番号：２７で表わされる塩基配列で表され
る塩基配列を有する第（３２）項記載のＤＮＡ、（３７）配列番号：２８で表わされる塩基配列で表され
る塩基配列を有する第（３３）項記載のＤＮＡ、（３８）第（３０）項〜第（３３）項記載のいずれかの
ＤＮＡを含有する組換えベクター、（３９）第（３８）項記載の組換えベクターを保持する
形質転換体、（４０）第（３９）項記載の形質転換体を培養し、形質
転換体の細胞膜にＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を生
成せしめることを特徴とする第（２５）項〜第（２８）
項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩
の製造方法、および（４１）第（２５）項〜第（２８）項記載のいずれかの
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または
第（２９）項記載の部分ペプチドもしくはその塩に対す
る抗体を提供する。

【００１０】さらに具体的には、（４２）蛋白質が、（ｉ）配列番号：１９で表わされる
アミノ酸配列、配列番号：１９で表わされるアミノ酸配
列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個
以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１
９で表わされるアミノ酸配列に１個以上３０個以下、好
ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加したアミ
ノ酸配列、あるいは配列番号：１９で表わされるアミノ
酸配列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１
０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ
酸配列または（および）（ii）配列番号：２０で表わさ
れるアミノ酸配列、配列番号：２０で表わされるアミノ
酸配列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１
０個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番
号：２０で表わされるアミノ酸配列に１個以上３０個以
下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加し
たアミノ酸配列、あるいは配列番号：２０で表わされる
アミノ酸配列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個
以上１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された
アミノ酸配列を含有する蛋白質である第（２５）項記載
のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩、（４３）蛋白質が、配列番号：２１で表わされるアミノ
酸配列、配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列中の
１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下の
アミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：２１で表
わされるアミノ酸配列に１個以上３０個以下、好ましく
は１個以上１０個以下のアミノ酸が付加したアミノ酸配
列、あるいは配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列
中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以
下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列
を含有する蛋白質である第（２６）項記載のＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質またはその塩、（４４）蛋白質が、配列番号：２２で表わされるアミノ
酸配列、配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列中の
１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下の
アミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：２２で表
わされるアミノ酸配列に１個以上３０個以下、好ましく
は１個以上１０個以下のアミノ酸が付加したアミノ酸配
列、あるいは配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列
中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以
下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列
を含有する蛋白質である第（２７）項記載のＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質またはその塩、および（４５）蛋白質が、配列番号：２３で表わされるアミノ
酸配列、配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列中の
１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下の
アミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：２３で表
わされるアミノ酸配列に１個以上３０個以下、好ましく
は１個以上１０個以下のアミノ酸が付加したアミノ酸配
列、あるいは配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列
中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以
下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列
を含有する蛋白質である第（２８）項記載のＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質またはその塩に関する。本明細書
において、「実質的に同一」とはタンパク質の活性、例
えば、リガンドと受容体の結合活性、生理的な特性など
が、実質的に同じことを意味する。アミノ酸の置換、欠
失あるいは挿入はしばしばポリペプチドの生理的な特性
や化学的な特性に大きな変化をもたらさないが、こうし
た場合その置換、欠失あるいは挿入を施されたポリペプ
チドは、そうした置換、欠失あるいは挿入のされていな
いものと実質的に同一であるとされるであろう。該アミ
ノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換物として
は、たとえばそのアミノ酸が属するところのクラスのう
ち他のアミノ酸類から選ぶことができうる。非極性（疎
水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロ
イシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプ
トファン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）
アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、シス
テイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどが挙
げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としてはア
ルギニン、リジン、ヒスチジンなどが挙げられる。負電
荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、
グルタミン酸などが挙げられる。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明のリガンドポリペプチド
は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合することが
できる、配列番号：７３で表されるアミノ酸配列と同一
もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドもしくは該部分ペプチドまたはそのアミド、エス
テルもしくはその塩が挙げられる。ここで、配列番号：
７３において第１０番目のXaaはAlaまたはThr、第１１
番目のXaaはGlyまたはSer、第２１番目のXaaはH、Gly、
またはGlyArgを示す。本発明のリガンドポリペプチドま
たはそのアミド、エステルもしくはその塩（以下、単に
リガンドポリペプチドまたはポリペプチドと略称する場
合がある）、その製造法および用途を以下にさらに詳細
に説明する。本発明の上記リガンドポリペプチドとして
は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マ
ウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる組織
（たとえば、下垂体、膵臓、脳、腎臓、肝臓、生殖腺、
甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化
管、血管、心臓など）または細胞などに由来するポリペ
プチドであって、配列番号：７３で表わされるアミノ酸
配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有
するものであればよい。例えば、本発明のリガンドポリ
ペプチドとしては、配列番号：７３で表わされるアミノ
酸配列を含有する蛋白質などの他に、配列番号：７３で
表わされるアミノ酸配列と約５０〜９９．９％（好まし
くは７０〜９９．９％、より好ましくは８０〜９９．９
％、さらに好ましくは９０〜９９．９％）の相同性を有
するアミノ酸配列を含有し、配列番号：７３で表わされ
るアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性
を有する蛋白質などが挙げられる。実質的に同質の活性
としては、例えばレセプター結合活性、シグナル伝達活
性などが挙げられる。実質的に同質とは、レセプター結
合活性などが性質的に同質であることを示す。したがっ
て、レセプター結合活性の強さなどの強弱、ポリペプチ
ドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。

【００１２】さらに具体的には、本発明のリガンドポリ
ペプチドとしては、配列番号：７３で表わされるアミノ
酸配列を含有するラット全脳、ウシ視床下部またはヒト
全脳由来のポリペプチドなどが挙げられる。また、本発
明のリガンドポリペプチドとしては、配列番号：７３で
表わされるアミノ酸配列中の１個以上１５個以下、好ま
しくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５
個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：
７３で表わされるアミノ酸配列に１個以上８０個以下、
好ましくは１個以上５０個以下、より好ましくは１個以
上１０個以下のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列
番号：７３で表わされるアミノ酸配列中の１個以上１５
個以下、好ましくは１個以上１０個以下、より好ましく
は１個以上５個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換さ
れたアミノ酸配列を含有するポリペプチドなどの実質的
に同一のアミノ酸配列も挙げられる。配列番号：７３で
表されるアミノ酸配列を示せば、配列番号：８，９，１
０，５０，５１，５２，６４，６５または６６である。
また、配列番号：７３で表されるアミノ酸配列と実質的
に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとして
は、具体的には配列番号：１，３，４，５，６，７，４
４，４５，４７，４８，４９，５９，６１，６２または
６３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドな
どを挙げることができる。上記のうち好ましくは配列番
号：７３で表されるアミノ酸を含有するポリペプチド及
び配列番号：７３で表されるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドのＮ末端に配列番号：７４で表されるペプチ
ドがさらに付加したアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ドなどを挙げることができる。さらに、本発明のポリペ
プチドもしくは部分ペプチドには、ＧｌｎのＮ端側が生
体内で切断され、該Ｇｌｎがピログルタミン酸化したも
のなども含まれる。本明細書におけるペプチドはペプチ
ド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右
端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：７
３で表されるポリペプチドはＣ末端が通常カルボキシル
基（-COOH)またはカルボキシレート(-COO^-)であるが、
Ｃ末端がアミド（-CONH₂)またはエステル(-COOR)であっ
てもよい。エステルのＲとしては、例えばメチル、エチ
ル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルな
どのＣ_1-6アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシ
ルなどのＣ_3-8シクロアルキル基、フェニル、α−ナフ
チルなどのＣ_6-12アリール基、ベンジル、フェネチル、
ベンズヒドリルなどのフェニル−Ｃ_1-2アルキル、もし
くはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_1-2ア
ルキルなどのＣ_7-14アラルキル基のほか、経口用エステ
ルとして汎用されるピバロイルオキシメチルエステルな
どが挙げられる。配列番号：７３で表されるポリペプチ
ドがＣ末端以外にカルボキシル基またはカルボキシレー
トを有している場合、それらの基がアミド化またはエス
テル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれ
る。この時のエステルとしては、例えば上記したＣ末端
のエステルなどが用いられる。本発明のリガンドポリペ
プチドとしては特にＣ末端がアミドであるペプチドが好
ましい。なかでも、配列番号：５、８、４７、５０、６
１、６４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
のＣ末端がアミドであるポリペプチドが好ましい。本発
明のポリペプチドの塩としては、生理学的に許容される
塩基（例えばアルカリ金属など）や酸（有機酸、無機
酸）との塩が用いられるが、とりわけ生理学的に許容さ
れる酸付加塩が好ましい。このような塩としては例えば
無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）と
の塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオ
ン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエ
ン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン
酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。本
発明のリガンドポリペプチドまたはそのアミド、エステ
ルもしくはその塩は、ヒトや温血動物の組織または細胞
からポリペプチドを精製する方法によって製造すること
もできるし、後述のポリペプチド合成法に準じて製造す
ることもできる。また、後述するポリペプチドをコード
するＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっ
ても製造することができる。ヒトや温血動物の組織また
は細胞から製造する場合、ヒトや温血動物の組織または
細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽
出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのク
ロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離す
ることができる。

【００１３】上記したように本発明のリガンドポリペプ
チドは、自体公知のポリペプチドの合成法に従って製造
することができる。ペプチドの合成法としては、例えば
固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すな
わち、蛋白質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ
酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場
合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造
することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離とし
てはたとえば、以下の〜に記載された方法が挙げら
れる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチドシン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)
（1975年）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発第14巻ペプチド合成
広川書店また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明のポリペプチドを
精製単離することができる。上記方法で得られるポリペ
プチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当
な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合
は、公知の方法によって遊離体に変換することができ
る。

【００１４】ポリペプチドのアミド体は、アミド形成に
適したペプチド合成用樹脂を用いることができる。その
ような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロ
キシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメ
チル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹
脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、
４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチ
ル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（2',4'-ジメト
キシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４
−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル）フ
ェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹
脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護した
アミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、自体公
知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の
最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基
を除去し、目的のポリペプチドを取得する。上記した保
護されたアミノ酸を縮合させるには、ペプチド合成に使
用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特
に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類として
はDCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル
-N'-(3-ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなど
が挙げられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添
加剤（例えば、HOBt)とともに保護されたアミノ酸を直
接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはHOBtエ
ステルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護さ
れたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加するこ
とができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮
合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用
しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。
たとえばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミ
ド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭
化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール
類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリ
ジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフ
ランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニト
リルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどの
エステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いら
れる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得る
ことがしられている範囲から適宜選択され、通常約−２
０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化された
アミノ酸誘導体は通常1.5-4倍過剰で用いられる。ニン
ヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場
合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返す
ことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り
返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸ま
たはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をア
セチル化することができる。原料アミノ酸のアミノ基の
保護基としては、たとえば、Ｚ、Boc、ターシャリーア
ミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニ
ル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br
-Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセ
チル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフ
ェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが挙
げられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえば
上記したＣ_1-6アルキル基、Ｃ_3-8シクロアルキル基、Ｃ
_7-14アラルキル基の他、２−アダマンチル、４−ニトロ
ベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジ
ル、フェナシル基およびベンジルオキシカルボニルヒド
ラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、
トリチルヒドラジドなどが挙げられる。セリンおよびス
レオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテ
ル化によって保護することができる。このエステル化に
適する基としては例えばアセチル基などの低級アルカノ
イル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキ
シカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭素から
誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に適
する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピ
ラニル基、ターシャリーブチル基などである。チロシン
のフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばBz
l、Cl₂-Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリー
ブチルなどが挙げられる。ヒスチジンのイミダゾールの
保護基としては、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチル
ベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bu
m、Boc、Trt、Fmocなどが挙げられる。原料のカルボキ
シル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する
酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（たとえ
ば、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノ
ール、2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコー
ル、パラニトロフェノール、HONB、N-ヒドロキシスクシ
ミド、N-ヒドロキシフタルイミド、HOBt）とのエステ
ル］などが挙げられる。原料のアミノ基の活性化された
ものとしては、たとえば対応するリン酸アミドが挙げら
れる。

【００１５】保護基の除去（脱離）方法としては、たと
えばPd黒あるいはPd-炭素などの触媒の存在下での水素
気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタン
スルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフル
オロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、
ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペ
リジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アン
モニア中ナトリウムによる還元なども挙げられる。上記
酸処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度
で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノー
ル、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾー
ル、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-
エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効
である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として
用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処
理により除去され、トリプトファンのインドール保護基
として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオ
ール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理によ
る脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアな
どによるアルカリ処理によっても除去される。原料の反
応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、なら
びにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化
などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しう
る。ポリペプチドのアミド体を得る別の方法としては、
まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を
アミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長
まで延ばした後、α−アミノ基の保護基を除いたカルボ
キシル末端側ペプチドと所望ペプチドからカルボキシル
末端側を除いたアミノ末端側ペプチドのα−カルボキシ
ル基の保護基のみを除去し、α−アミノ基や側鎖官能基
に上記したような適当な保護基を付けた保護ペプチドを
上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳
細については上記と同様である。縮合により得られた保
護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護
基を除去し、所望の粗ペプチドを得ることができる。こ
の粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、
主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチドのア
ミド体を得ることができる。ポリペプチドのエステル体
を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル
基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとし
た後、ポリペプチドのアミド体と同様にして所望のポリ
ペプチドのエステル体を得ることができる。

【００１６】本発明のリガンドポリペプチドの部分ペプ
チドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩として
は、上記した配列番号：７３で表されるアミノ酸配列と
同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドと同様の作用（下垂体機能調節作用、中枢神
経機能調節作用または膵臓機能調節作用など）を有して
いるものであれば、どのようなペプチドであってもよ
い。このようなペプチドとしてはたとえば、上記した配
列番号：７３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド
から１ないし１５個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸
配列を有するペプチドを挙げることができる。具体的に
は、配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第２番
目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、
配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第３番目から
第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番
号：７３で表されるアミノ酸配列の第４番目から第２１
番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：７
３で表されるアミノ酸配列の第５番目から第２１番目の
アミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：７３で表
されるアミノ酸配列の第６番目から第２１番目のアミノ
酸配列を有するペプチド、配列番号：７３で表される
アミノ酸配列の第７番目から第２１番目のアミノ酸配列
を有するペプチド、配列番号：７３で表されるアミノ
酸配列の第８番目から第２１番目のアミノ酸配列を有す
るペプチド、配列番号：７３で表されるアミノ酸配列
の第９番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプ
チド、配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第１
０番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチ
ド、■配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第１１
番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、
■配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第１２番目
から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、■配
列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第１３番目から
第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、■配列番
号：７３で表されるアミノ酸配列の第１４番目から第２
１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、■配列番号：
７３で表されるアミノ酸配列の第１５番目から第２１番
目のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。さ
らに、配列番号：７４で表されるアミノ酸配列を有する
ペプチドなども好ましい。リガンドポリペプチドまたは
該部分ペプチドはさらに抗リガンドポリペプチド抗体の
調製のための抗原として用いることができる。このよう
な抗原としてのポリペプチドは上記したリガンドポリペ
プチドまたは該部分ペプチドの他に、上記リガンドポリ
ペプチドのＮ末端ペプチド、Ｃ末端ペプチド、中央部分
のペプチドが用いられ、より具体的にはたとえば配列番
号：９２、９３、９４で表される部分ペプチドが好まし
く用いられる。部分ペプチドとしては、個々のドメイン
を個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを
同時に含む部分のペプチドでも良い。本明細書における
部分ペプチドもＣ末端がアミド（-CONH₂)またはエステ
ル(-COOR)であってもよい。ここでエステル基の例とし
ては上記したポリペプチドの場合と同様である。該部分
ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基またはカルボキ
シレートを有している場合、それらの基がアミド化また
はエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに
含まれる。この時のエステルとしては、例えば、上記し
たＣ末端のエステルなどが用いられる。本発明のリガン
ドポリペプチドまたはその部分ペプチドは、さらに、機
能あるいは性質がよく知られているタンパク質との融合
タンパク質であってもよい。本発明のリガンドポリペプ
チドの部分ペプチドの塩としては、前述のポリペプチド
の塩と同様のものが用いられる。本発明のリガンドポリ
ペプチドの部分ペプチドまたはそのアミド、エステルも
しくはその塩は、上記したポリペプチドの場合と同様の
合成法に従って、あるいは本発明のポリペプチドを適当
なペプチダーゼで切断することによって製造することが
できる。

【００１７】本発明のリガンドポリペプチドまたはその
部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、本発明の配
列番号：７３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実
質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ
ードする塩基配列を含有するものであればいかなるもの
であってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡラ
イブラリー、組織・細胞由来のｃＤＮＡ、組織・細胞由
来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよ
い。ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファ
ージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれ
であってもよい。また、組織・細胞よりＲＮＡ画分を調
製したものを用いて直接ＲＴ-ＰＣＲ法によって増幅す
ることもできる。より具体的には、配列番号：１または
配列番号：４４のアミノ酸配列を含有するラット全脳あ
るいはウシ視床下部由来のポリペプチドをコードするＤ
ＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列を有
するＤＮＡなどが用いられる。ここで、配列番号：２に
おいて第１２９番目のＲはＧまたはＡを、第１７９番目
および２４０番目のＹはＣまたはＴを示す。第１７９番
目のＹがＣのとき、配列番号：１で表されるアミノ酸配
列をコードし、第１７９番目のＹがＴのとき、配列番
号：４４で表されるアミノ酸配列をコードする。また、
配列番号：３、４、５、６、７、８、９または１０で表
されるアミノ酸配列を含有するウシ由来ポリペプチドを
コードするＤＮＡとしては、配列番号：１１、１２、１
３、１４、１５、１６、１７または１８で表わされる塩
基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。ここで、配列
番号：１１、１３、１４、１５の第６３番目のＲおよび
配列番号：１２、１６、１７、１８の第２９番目のＲは
ＧあるいはＡを示す。また、配列番号：４５、４７、４
８、４９、５０、５１または５２で表されるラット由来
ポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：
４６、５３、５４、５５、５６、５７または５８で表さ
れる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。さら
に、配列番号：５９、６１、６２、６３、６４、６５ま
たは６６で表されるヒト由来ポリペプチドをコードする
ＤＮＡとしては、配列番号：６０、６７、６８、６９、
７０、７１または７２で表される塩基配列を有するＤＮ
Ａなどが用いられる。また、本発明の配列番号：１、配
列番号：４４で表されるアミノ酸配列を含有するウシ型
ポリペプチド、配列番号：４５で表されるアミノ酸配列
を含有するラット型ポリペプチド、または配列番号：５
９で表されるアミノ酸配列を含有するヒト型ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡの中で例えば６個以上９０個以下
（好ましくは６個以上６０個以下、より好ましくは９個
以上３０個以下、さらに好ましくは１２個以上３０個以
下）の部分塩基配列を含有するＤＮＡ断片はＤＮＡ検出
プローブとしても好ましく用いられる。

【００１８】本発明のポリペプチドまたはその部分ペプ
チドをコードするＤＮＡは以下の遺伝子工学的手法によ
っても製造することができる。本発明のポリペプチドま
たはその部分ペプチドを完全にコードするＤＮＡのクロ
ーニングの手段としては、ポリペプチドまたはその部分
ペプチドの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマー
を用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベ
クターに組み込んだＤＮＡを例えばヒト由来ポリペプチ
ドの一部あるいは全領域を有するＤＮＡ断片もしくは合
成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーシ
ョンによって選別する。ハイブリダイゼーションの方法
は、例えば Molecular Cloning （２nd ed.；J. Sambr
ook et al., Cold Spring HarborLab. Press, 1989）に
記載の方法などに従って行われる。また、市販のライブ
ラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法
に従って行う。クローン化されたポリペプチドまたはそ
の部分ペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのま
ま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカー
を付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはそ
の５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、
また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、Ｔ
ＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開
始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプ
ターを用いて付加することもできる。ポリペプチドまた
はその部分ペプチドの発現ベクターは、例えば、（イ）
本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコード
するＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、
（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモー
ターの下流に連結することにより製造することができ
る。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、
ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１
３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐ
ＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳ
Ｈ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオフ
ァージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュ
ロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。本発
明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に
用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいか
なるものでもよい。

【００１９】形質転換する際の宿主がエシェリヒア属菌
である場合は、trp プロモーター、lac プロモーター、
recＡプロモーター、λＰＬプロモーター、lpp プロモ
ーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰ
Ｏ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、penＰプロ
モーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロ
モーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、
ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が動物細胞で
ある場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウ
イルスのプロモーター、メタロチオネインプロモータ
ー、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイル
スプロモーター、ＳＲαプロモーターなどがそれぞれ利
用できる。なお、発現にエンハンサーの利用も効果的で
ある。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列
を、ポリペプチドまたはその部分ペプチドのＮ端末側に
付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、アル
カリフォスファターゼ・シグナル配列、ＯmpＡ・シグナ
ル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−
アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配
列などが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファ
クターα・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配
列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシ
ュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナ
ル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用で
きる。このようにして構築されたポリペプチドまたはそ
の部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクター
を用いて、形質転換体を製造する。

【００２０】宿主としては、たとえばエシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫、動物細胞などが用いら
れる。エシェリヒア属菌、バチルス属菌の具体例として
は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・
ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエス
エー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１
６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッ
ズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３
０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー（Journal ofMolecular Biol
ogy）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４
１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用
いられる。バチルス属菌としては、たとえばバチルス・
サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，
２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemis
try），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。

【００２１】酵母としては、たとえばサッカロマイセス
セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae)ＡＨ２２，Ａ
Ｈ２２Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ
−１２などが用いられる。昆虫としては、例えばカイコ
の幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Natur
e），３１５巻，５９２(１９８５)〕。動物細胞として
は、たとえばサル細胞ＣＯＳ−７，Ｖero，チャイニー
ズハムスター細胞ＣＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-ＣＨＯ細胞），
マウスＬ細胞，マウスミエローマ細胞，ヒトＦＬ細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌を形質転換するに
は、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユー
エスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９
巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１
０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なわれる。
バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecula
r ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７
９)などに記載の方法に従って行われる。酵母を形質転
換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・
ザ・ユーエスエー（Proc. Natl.Acad. Sci. ＵＳＡ），
７５巻，１９２９(１９７８)に記載の方法に従って行な
われる。

【００２２】昆虫細胞を形質転換するには、たとえばバ
イオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(198
8)）などに記載の方法に従って行なわれる。動物細胞を
形質転換するには、たとえばヴィロロジー（Virolog
y），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って
行なわれる。このようにして、ポリペプチドまたはその
部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクタ
ーで形質転換された形質転換体が得られる。宿主がエシ
ェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養す
る際、培養に使用される培地としては液体培地が適当で
あり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、
窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源とし
ては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱
粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウ
ム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプト
ン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液な
どの無機または有機物質、無機物としてはたとえば塩化
カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウ
ムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン類、生長促
進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が
望ましい。

【００２３】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリル
アクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主が
エシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で
約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加える
こともできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常
約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通
気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質
転換体を培養する際、培地としては、たとえばバークホ
ールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.
ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５
０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ
培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・
オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ
ＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられ
る。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培
養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必
要に応じて通気や撹拌を加える。

【００２４】宿主が昆虫である形質転換体を培養する
際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.
C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化
した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが
用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整する
のが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行
い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞
である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえ
ば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエ
ンス（Seience），１２２巻，５０１(１９５２)〕，Ｄ
ＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６
(１９５９)〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・
オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション
（The Jounal of the American Medical Association）
１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシー
ジング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオ
ロジカル・メディスン（Proceeding of the Society fo
r the Biological Medicine），７３巻，１(１９５
０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好
ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時
間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。

【００２５】上記培養物からポリペプチドまたはその部
分ペプチドを分離精製するには、例えば下記の方法によ
り行なうことができる。ポリペプチドまたはその部分ペ
プチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際して
は、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、こ
れを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび
／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊
したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドまたはそ
の部分ペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用い得
る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのたんぱく
変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標。以下、ＴＭ
と省略することがある。）などの界面活性剤が含まれて
いてもよい。培養液中にポリペプチドまたはその部分ペ
プチドが分泌される場合には、培養終了後、自体公知の
方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集め
る。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液
中に含まれるポリペプチドまたはその部分ペプチドの精
製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行
なうことができる。これらの公知の分離、精製法として
は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透
析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差
を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの
荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラ
フィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液
体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方
法、等電点電気泳動法やクロマトフォーカシングなどの
等電点の差を利用する方法などが用いられる。かくして
得られるポリペプチドまたはその部分ペプチドが遊離体
で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準
じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得
られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方
法により、遊離体または他の塩に変換することができ
る。なお、組換え体が産生するポリペプチドを、精製前
または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることに
より、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に
除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例え
ば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペ
プチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなど
が用いられる。かくして生成するポリペプチドまたはそ
の部分ペプチドの活性はレセプターとの結合実験および
特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより
測定することができる。

【００２６】本発明のリガンドポリペプチドをコードす
るＤＮＡ、リガンドポリペプチドまたは該部分ペプチド
は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質のリガンドの一
部、あるいは全長の合成、本発明のリガンドポリペプ
チドまたは該部分ペプチドの有する生理作用の探索、
合成オリゴヌクレオチドプローブあるいはＰＣＲのプラ
イマーの作成、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質のリ
ガンドや前駆体蛋白質をコードするＤＮＡの入手、組
換え型レセプター蛋白質の発現系を用いたレセプター結
合アッセイ系の開発と医薬品候補化合物のスクリーニン
グ、抗体および抗血清の入手、該抗体または抗血清
を用いた診断薬の開発、下垂体機能調節剤、中枢神経
機能調節剤あるいは膵臓機能調節剤などの医薬の開発、
遺伝子治療等に用いることができる。特に、後述の組
換え型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現系を用い
たレセプター結合アッセイ系によって、ヒトなどの温血
動物に特異的なＧ蛋白質共役型レセプターアゴニストま
たはアンタゴニストをスクリーニングすることができ、
該アゴニストまたはアンタゴニストを各種疾病の予防・
治療剤などとして使用することができる。

【００２７】さらに、上記に関し、本発明のリガンド
ポリペプチド、該部分ペプチド、またはそれをコードす
るＤＮＡは下垂体、中枢神経系、膵臓β細胞などで発現
しているＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質がリガンドと
して認識するものであるので、安全で低毒性な医薬とし
て有用である。本発明のリガンドポリペプチド、該部分
ペプチド、またはそれをコードするＤＮＡは下垂体機能
調節作用、中枢神経機能調節作用あるいは膵臓機能調節
作用に関与していることから、たとえば老人性痴呆、脳
血管性痴呆、系統変成型の退行変成疾患（例：アルツハ
イマー病、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン病
など）に起因する痴呆、感染性疾患（例：クロイツフェ
ルト−ヤコブ病などの遅発ウイルス感染症など）に起因
する痴呆、内分泌性・代謝性・中毒性疾患（例：甲状腺
機能低下症、ビタミンＢ１２欠乏症、アルコール中毒、
各種薬剤・金属・有機化合物による中毒など）に起因す
る痴呆、腫瘍性疾患（例：脳腫瘍など）に起因する痴
呆、外傷性疾患（例：慢性硬膜下血腫など）に起因する
痴呆などの痴呆、鬱病、多動児（微細脳障害）症候群、
意識障害、不安障害、精神分裂症、恐怖症、成長ホルモ
ン分泌障害（例：巨人症、末端肥大症など）、過食症、
多食症、高コレステロール血症、高グリセリド血症、高
脂血症、高プロラクチン血症、糖尿病性合併症、糖尿病
性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病、
癌（例：乳癌、リンパ性白血病、膀胱癌、卵巣癌、前立
腺癌など）、膵炎、腎疾患（例：慢性腎不全、腎炎な
ど）、ターナー症候群、神経症、リウマチ関節炎、脊髄
損傷、一過性脳虚血発作、筋萎縮性側索硬化症、急性心
筋梗塞、脊髄小脳変性症、骨折、創傷、アトピー性皮膚
炎、骨粗鬆症、喘息、てんかん、不妊症または乳汁分泌
不全などの疾病の治療・予防剤として用いることができ
る。さらに手術後の栄養状態改善剤、昇圧剤などとして
も用いることができる。本発明のポリペプチド、該部分
ペプチド、またはそれをコードするＤＮＡを上述の医薬
として使用する場合、常套手段に従って実施することが
できる。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプ
セル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして
経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容
し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤
の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物または
その塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、
ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に
認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和す
ることによって製造することができる。これら製剤にお
ける有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られ
るようにするものである。

【００２８】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスター
チ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結
晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラ
チン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マ
グネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカ
リンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油または
チェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形
態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさら
に油脂のような液状担体を含有することができる。注射
のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活
性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油な
どを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にした
がって処方することができる。注射用の水性液として
は、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を
含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニト
ール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶
解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノー
ル）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコー
ル、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤
（たとえばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５
０）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大
豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジ
ル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、
緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調整された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えばヒトや哺乳動物（例え
ば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、
ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、マントヒヒ、
チンパンジーなど）に対して投与することができる。本
発明のポリペプチド、該部分ペプチド、またはそれをコ
ードするＤＮＡの投与量は、症状などにより差異はある
が、経口投与の場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）
においては、一日につき約０.１から１００ｍｇ、好ま
しくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０
から２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その
１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法など
によっても異なるが、たとえば注射剤の形では通常成人
（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１
から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程
度、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注
射により投与するのが好都合である。他の動物の場合
も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができ
る。

【００２９】上記本発明のリガンドポリペプチドに対す
るＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質としては、ヒトや温
血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ブタ、
ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる組織（例えば、下
垂体、膵臓、脳、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆の
う、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓
など）または細胞などに由来するＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質であって、配列番号：１９、２０、２１、２
２または２３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは
これらのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を
含有するものであれば如何なるものであってもよい。す
なわち、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質とし
ては、配列番号：１９、２０、２１、２２または２３で
表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質などの他に、
配列番号：１９、２０、２１、２２または２３で表わさ
れるアミノ酸配列と約９０〜９９．９％の相同性を有す
るアミノ酸配列を含有し、配列番号：１９、２０、２
１、２２または２３で表わされるアミノ酸配列を含有す
る蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが挙
げられる。これらの蛋白質が示す活性としては、例えば
リガンド結合活性、シグナル伝達などが挙げられる。実
質的に同質とは、リガンド結合活性などが性質的に同質
であることを示す。したがって、リガンド結合活性の強
さなどの強弱、レセプター蛋白質の分子量などの量的要
素は異なっていてもよい。

【００３０】さらに具体的には、Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質としては、配列番号：１９または（および）
配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列を含有するヒ
ト下垂体由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、配列
番号：２２で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス
膵臓由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、配列番
号：２３で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス膵
臓由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質などが挙げら
れる。そして、配列番号：１９および配列番号：２０で
表わされるアミノ酸配列を含有するヒト下垂体由来のＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質としては、具体的には配
列番号：２１で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト
下垂体由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質などが挙
げられる。また、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質とし
ては、配列番号：１９、２０、２１、２２または２３で
表わされるアミノ酸配列中の１以上３０個以下、より好
ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が欠失したアミ
ノ酸配列、配列番号：１９、２０、２１、２２または２
３で表わされるアミノ酸配列に１個以上３０個以下、よ
り好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加した
アミノ酸配列、配列番号：１９、２０、２１、２２また
は２３で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個以
下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が他
のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白質
なども挙げられる。ここで、配列番号：２１で表される
アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配
列を含有する蛋白質は、ヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型
レセプター蛋白質の全アミノ酸配列を含有するものであ
る。配列番号：１９または（および）配列番号：２０で
表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
ミノ酸配列を含有する蛋白質は、該配列番号：２１で表
されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有する蛋白質の断片あるいは部分ペプチド
である。さらに、配列番号：２２または配列番号：２３
で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の
アミノ酸配列を含有する蛋白質は、マウス膵臓由来のＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質であるが、配列番号：１
９または（および）配列番号：２０で表されるアミノ酸
配列に非常に高い類似性を示す（実施例８、特に〔図１
３〕）ことから、配列番号：２２または２３で表される
アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配
列を含有する蛋白質も同様に、配列番号：２１で表され
るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸
配列を含有する蛋白質の断片あるいは部分ペプチドの中
に含まれる。すなわち、上述の配列番号：２１で表され
るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸
配列を含有する蛋白質もしくは後述する該蛋白質の部分
ペプチドまたはその塩は、配列番号：１９、２０、２２
または２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質
的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩
をも含むものである。さらに、Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質には、Ｎ末端のMetが保護基（例えば、ホルミ
ル基、アセチル基などのＣ_1-6アシル基など）で保護さ
れているもの、ＧｌｕのＮ端側が生体内で切断され、該
Ｇｌｕがピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸
の側鎖が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル
基などのＣ_1-6アシル基など）で保護されているもの、
あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋
白質なども含まれる。

【００３１】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の塩とし
ては、上記したリガンドポリペプチドと同様のものが挙
げられる。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその
塩または該部分ペプチドは、ヒトや温血動物の組織また
は細胞から自体公知の蛋白質の精製方法によって製造す
ることもできるし、前述のポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを含有する形質転換体を培養する方法と同じ方法に
よっても製造することができる。また、前述のペプチド
合成法に準じて製造することもできる。Ｇ蛋白質共役型
レセプター蛋白質の部分ペプチドとしては、例えば、Ｇ
蛋白質共役型レセプター蛋白質分子のうち、細胞膜の外
に露出している部位などが用いられる。具体的には、
〔図３〕、〔図４〕、〔図８〕、〔図１１〕または〔図
１４〕で示される本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質の疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性
（Hydrophilic）部位）であると分析された部分を含む
ペプチドである。また、疎水性（Hydrophobic）部位を
一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々
のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数の
ドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドの塩として
は、上記したリガンドポリペプチドの塩と同様のものが
用いられる。

【００３２】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコード
するＤＮＡとしては、配列番号：１９、２０、２１、２
２または２３のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同
一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質をコードする塩基配列を含有するものであればい
かなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノ
ムＤＮＡライブラリー、組織・細胞由来のｃＤＮＡ、組
織・細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのい
ずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターはバク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
などいずれであってもよい。また、組織・細胞よりＲＮ
Ａ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ-ＰＣＲ法によ
って増幅することもできる。具体的には、配列番号：１
９のアミノ酸配列を含有するヒト下垂体由来のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡとしては、
配列番号：２４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡな
どが用いられる。配列番号：２０のアミノ酸配列を含有
するヒト下垂体由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２５で表わさ
れる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。配列番
号：２１のアミノ酸配列を含有するヒト下垂体由来のＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡとし
ては、配列番号：２６で表わされる塩基配列を有するＤ
ＮＡなどが用いられる。配列番号：２２のアミノ酸配列
を含有するマウス膵臓由来のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２７で
表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２３のアミノ酸配列を含有するマウス膵臓由
来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａとしては、配列番号：２８で表わされる塩基配列を有
するＤＮＡなどが用いられる。

【００３３】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を完全に
コードするＤＮＡのクローニングの方法、用い得るベク
ター、プロモーター、宿主、形質転換方法、培養方法、
分離精製の方法については上記したリガンドポリペプチ
ドの場合と同様である。たとえば、後述する実施例５で
得られるプラスミドｐｈＧＲ３を制限酵素SalIで消化
し、ｈＧＲ３をコードするｃＤＮＡの完全長の翻訳枠部
分を取り出す。これを同じくSalI消化後に自己閉環を防
止するためにＢＡＰ(Bacterial AlkalinePhosphatase)
処理を施した動物細胞用発現ベクターpAKKO-111等とラ
イゲーション反応を行う。ライゲーション反応完了後は
反応液の一部を用いて大腸菌ＤＨ５等を形質転換する。
得られた形質転換体のうち、ｈＧＲ３をコードするｃＤ
ＮＡが発現ベクターにあらかじめ組み込んであるＳＲα
などのプロモーターに対して順方向に挿入されているも
のを制限酵素切断によるマッピングあるいは塩基配列の
決定によって選別しそのプラスミドＤＮＡを大量に調製
する。作成した発現ベクターのＤＮＡを用い、リン酸カ
ルシウム法あるいはリポソーム法などにもとづく動物細
胞への遺伝子導入用のキットを用いてＣＨＯ dhfr^-細胞
に導入してＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ｈＧＲ
３）高発現ＣＨＯ細胞株を得る。得られたＣＨＯ細胞を
核酸不含の選択培地でCO₂インキュベーターで３７℃、
５％CO₂の条件下で１〜４日培養することによりＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質（ｈＧＲ３）を産生させる。
該ＣＨＯ細胞からＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ある
いはその部分ペプチドに対する抗体を担体に架橋させて
作製されたアフィニティーカラムあるいはＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質に対するリガンドを担体に架橋させ
たアフィニティーカラムを用いてＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質を分離精製する。

【００３４】かくして生成するＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質の活性は標識したリガンドとの結合実験および
特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより
測定することができる。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質をコードするＤＮＡおよびＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する
リガンドの決定方法、抗体および抗血清の入手、組
換え型レセプター蛋白質の発現系の構築、同発現系を
用いたレセプター結合アッセイ系の開発と医薬品候補化
合物のスクリーニング、構造的に類似したリガンド・
レセプターとの比較にもとづいたドラッグデザインの実
施、遺伝子診断におけるプローブ、ＰＣＲプライマー
の作成、遺伝子治療等に用いることができる。特に、
組換え型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現系を用
いたレセプター結合アッセイ系によって、ヒトなどの温
血動物に特異的なＧ蛋白質共役型レセプターアゴニスト
またはアンタゴニストをスクリーニングすることがで
き、該アゴニストまたはアンタゴニストを各種疾病の予
防・治療剤などとして使用することができる。本発明の
リガンドポリペプチドおよびそれに対するＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質、リガンドポリペプチドおよびＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡおよび
抗体等の用途について、以下にさらに具体的に説明す
る。

【００３５】（１）Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に
対するリガンドの決定方法、該リガンドの製造法および
用途上記したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその
塩または該部分ペプチドもしくはその塩は、Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質に対するリガンドを探索しまたは
決定するための試薬として有用である。すなわち、Ｇ蛋
白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチド
と、試験化合物とを接触させることを特徴とするＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの決定方法
を提供する。

【００３６】試験化合物としては、公知のリガンド（例
えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、
コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニ
ン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプ
レッシン、オキシトシン、ＶＩＰ（バソアクティブイ
ンテスティナルアンドリレイテッドペプチド）、
ソマトスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブ
ラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティ
ッドペプチド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチ
ン、プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシ
ン、アドレナリン、αおよびβ−chemokine（ＩＬ−
８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮ
Ａ−７８、ＰＦ４、ＩＰ１０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ−
１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３０９、ＭＩＰ１α、
ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなど）、エンドセリン、エ
ンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、Ｔ
ＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラニンな
ど）の他に、例えばヒトや温血動物（例えば、マウス、
ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなど）の組織抽出
物、細胞培養上清などが用いられる。例えば、該組織抽
出物、細胞培養上清などをＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質に添加し、細胞刺激活性などを測定しながら分画
し、最終的に単一のリガンドを得ることができる。

【００３７】具体的には、上記したＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質もしくはその塩、または該部分ペプチドも
しくはその塩を用いるか、または組換え型レセプター蛋
白質の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結
合アッセイ系を用いることによって、Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質に結合して細胞刺激活性（例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊
離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、細胞外ｐＨの低下などを促
進する活性または抑制する活性）を有する化合物（例え
ば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合
物、発酵生産物など）またはその塩を決定する方法を提
供する。細胞刺激活性の測定としては上記した中でも特
にアラキドン酸遊離を促進する活性または抑制する活性
を測定するのが好ましい。

【００３８】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合す
るリガンドを決定する具体的な方法としては、標識した試験化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質もしくはその塩または本発明の部分ペプチドもしく
はその塩に接触させた場合における、標識した試験化合
物の該蛋白質もしくはその塩、または該部分ペプチドも
しくはその塩に対する結合量を測定することを特徴とす
るＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの
決定方法、標識した試験化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた
場合における、標識した試験化合物の該細胞または該膜
画分に対する結合量を測定することを特徴とするＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの決定方
法、標識した試験化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養す
ることによって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質に接触させた場合における、標識した試験
化合物の該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する結
合量を測定しすることを特徴とするＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質に対するリガンドの決定方法、

【００３９】試験化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、Ｇ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を介した細胞刺激活性
（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細
胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ
生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞
内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、細胞外ｐＨ
の低下などを促進する活性または抑制する活性など）を
測定することを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質に対するリガンドの決定方法、および試験化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコ
ードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することに
よって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質に接触させた場合における、Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン
酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞
内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリ
ン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、
ｃ−ｆｏｓの活性化、細胞外ｐＨの低下などを促進する
活性または抑制する活性など）を測定することを特徴と
する方法を挙げることができる。リガンド決定方法の具
体的な説明を以下にする。まず、リガンド決定方法に用
いるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質としては、上記し
たＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質または該Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質の部分ペプチドを含有するもので
あれば何れのものであってもよいが、動物細胞を用いて
大量発現させたＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質が適し
ている。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を製造するに
は、前述の方法が用いられるが、該蛋白質をコードする
ＤＮＡを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現することにより
行うことができる。目的部分をコードするＤＮＡ断片に
は相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約され
るものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用
いてもよい。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコード
するＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率
よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主と
するバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nu
clear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプ
ロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイ
ルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、
ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイル
スプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み
込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の検査
はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、文
献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,19555〜
19559頁,1992年〕に記載の方法に従って行うことができ
る。

【００４０】したがって、リガンド決定方法において、
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質の部分ペプチドを含有するものとして
は、それ自体公知の方法に従って精製したＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質または該Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質の部分ペプチドであってもよいし、該蛋白質を含
有する細胞を用いてもよく、また該蛋白質を含有する細
胞の膜画分を用いてもよい。リガンド決定方法におい
て、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞を
用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリン
などで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の
方法に従って行うことができる。Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質を含有する細胞としては、Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細
胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細
胞などが挙げられる。膜画分としては、細胞を破砕した
後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれ
る画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter
−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワ
ーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）に
よる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加
圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる
破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分
離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が
主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５０
０ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜
１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ
〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得
られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現した
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質と細胞由来のリン脂質
や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。

【００４１】該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有
する細胞や膜画分中のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
の量は、１細胞当たり１０³〜１０⁸分子であるのが好ま
しく、１０⁵〜１０⁷分子であるのが好適である。なお、
発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比
活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が
可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測
定できるようになる。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質
に結合するリガンドを決定する前記の〜の方法を実
施するためには、適当なＧ蛋白質共役型レセプター画分
と、標識した試験化合物が必要である。Ｇ蛋白質共役型
レセプター画分としては、天然型のＧ蛋白質共役型レセ
プター画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え
型Ｇ蛋白質共役型レセプター画分などが望ましい。ここ
で、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示
す。標識した試験化合物としては、〔³Ｈ〕、
〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識した上記の
試験化合物などが好適である。

【００４２】具体的には、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質に結合するリガンドの決定方法を行うには、まずＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞または細
胞の膜画分を、決定方法に適したバッファーに懸濁する
ことによりレセプター標品を調製する。バッファーに
は、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バ
ッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレ
セプターとの結合を阻害しないバッファーであればいず
れでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、
ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^TM（花王−アトラス
社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤
やウシ血清アルブミンやゼラチンなどの各種蛋白質をバ
ッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼ
によるレセプターやリガンドの分解を抑える目的でＰＭ
ＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、
ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加すること
もできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍlの該レセプター溶液
に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の
〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識し
た試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）
を知るために大過剰の未標識の試験化合物を加えた反応
チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましく
は４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３
０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過
し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙
に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンター
あるいはγ−カウンターで計測する。全結合量（Ｂ）か
ら非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ−Ｎ
ＳＢ）が０ｃｐｍを越える試験化合物を本発明のＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドとして選択
することができる。

【００４３】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合す
るリガンドを決定する前記の〜の方法を実施するた
めには、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を介する細胞
刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン
遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内
ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、細
胞外ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性
など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて
測定することができる。具体的には、まず、Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質を含有する細胞をマルチウェルプ
レート等に培養する。リガンド決定を行なうにあたって
は前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適
当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一
定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清
液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って
定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、ア
ラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素に
よって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を
添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産
生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細
胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生
抑制作用として検出することができる。

【００４４】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合す
るリガンド決定用キットは、Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質またはその塩、その部分ペプチドまたはその塩、
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞、ある
いはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞の
膜画分を含有するものである。リガンド決定用キットの
例としては、次のものが挙げられる。１．リガンド決定用試薬測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質標品Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細
胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個／穴で継代し、３
７℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日間培養したも
の。標識試験化合物市販の〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで
標識した化合物、または適当な方法で標識化したもの。
適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを４℃あるいは
−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに
希釈する。水に難溶性を示す試験化合物については、ジ
メチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、メタノール等に溶解す
る。非標識試験化合物標識化合物を同じものを１００〜１０００倍濃い濃度に
調製する。

【００４５】２．測定法１２穴組織培養用プレートにて培養したＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質を発現させた細胞を、測定用緩衝液
１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を
各穴に加える。標識試験化合物を５μｌ加え、室温にて１時間反応さ
せる。非特異的結合量を知るためには非標識試験化合物
を５μｌ加えておく。反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識試験化合物を０.２ＮＮａＯ
Ｈ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーター
Ａ（和光純薬製）と混合する。液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定する。

【００４６】（２）リガンドポリペプチドまたはＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質欠乏症の予防・治療剤上記（１）の方法において、明らかにされたＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質に対するリガンドポリペプチドが
有する作用に応じて、リガンドポリペプチドまたはＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡをリガ
ンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質欠乏症の予防・治療剤としても使用することができ
る。例えば、生体内において、リガンドポリペプチドま
たはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質が減少しているた
めにリガンドの生理作用（下垂体機能調節作用、中枢神
経機能調節作用あるいは膵臓機能調節作用など）が期待
できない患者がいる場合に、（イ）リガンドポリペプチ
ドまたはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする
ＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、ある
いは（ロ）脳細胞などにリガンドポリペプチドもしくは
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを
挿入し発現させた後に、該脳細胞を該患者に移植するこ
となどによって、該患者の脳細胞におけるリガンドポリ
ペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の量を
増加させ、リガンドポリペプチドの作用を充分に発揮さ
せることができる。したがって、リガンドポリペプチド
またはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤ
ＮＡは、安全で低毒性なリガンドポリペプチドまたはＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質欠乏症の予防・治療剤な
どとして用いることができる。上記ＤＮＡを上記治療剤
として使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロ
ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウ
イルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当な
ベクターに挿入した後、上記したリガンドポリペプチド
もしくは該部分ペプチドをコードするＤＮＡを医薬とし
て使用する場合と同様の手段に従って実施することがで
きる。

【００４７】（３）リガンドポリペプチドに対するＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質の定量法本発明のリガンド
ポリペプチドはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質または
その塩や該レセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその
塩に対して結合性を有しているので、生体内におけるＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩、または
該レセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩の濃度
を感度良く定量することができる。この定量法は、例え
ば競合法と組み合わせることによって用いることができ
る。すなわち、被検体を本発明のリガンドポリペプチド
と接触させることによって被検体中のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質もしくはその塩、またはＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩の濃度
を測定することができる。具体的には、例えば、以下の
またはなどに記載の方法あるいはそれに準じる方法
に従って用いることができる。入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４
９年発行）入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和
５４年発行）

【００４８】（４）Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質
と、本発明のリガンドポリペプチド、該部分ペプチドま
たはそれらのアミド、エステルもしくはそれら塩（以
下、リガンドまたはリガンドポリペプチドと略称する場
合がある。）との結合性を変化させる化合物のスクリー
ニング方法Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩や該部分
ペプチドもしくはその塩を用いるか、または組換え型レ
セプター蛋白質の発現系を構築し、該発現系を用いたレ
セプター結合アッセイ系を用いることによって、リガン
ドポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との
結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、蛋白
質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物な
ど）またはその塩をスクリーニングすることができる。
このような化合物には、Ｇ蛋白質共役型レセプターを介
して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチ
ルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生
成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細
胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの
活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する
活性など）を有する化合物（即ちＧ蛋白質共役型レセプ
ターアゴニスト）と該細胞刺激活性を有しない化合物
（即ちＧ蛋白質共役型レセプターアンタゴニスト）など
が含まれる。「リガンドとの結合性を変化させる」と
は、リガンドとの結合を阻害する場合とリガンドとの結
合を促進する場合の両方を包含するものである。

【００４９】すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または該レ
セプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩に、本発
明のリガンドを接触させた場合と（ii）上記したＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または該レセ
プター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩に、本発明
のリガンドおよび試験化合物を接触させた場合との比較
を行なうことを特徴とする本発明のリガンドと上記した
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させ
る化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供す
る。本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）上
記したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質または該レセプ
ター蛋白質の部分ペプチドに、本発明のリガンドポリペ
プチドを接触させた場合と（ii）上記したＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質または該レセプター蛋白質の部分ペ
プチドに、本発明のリガンドポリペプチドおよび試験化
合物を接触させた場合における、例えば該Ｇ蛋白質共役
型レセプター蛋白質または該レセプター蛋白質の部分ペ
プチドに対するリガンドの結合量、細胞刺激活性などを
測定して、比較する。

【００５０】本発明のスクリーニング方法は具体的に
は、標識した本発明のリガンドポリペプチドを、上記した
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドまたは
その塩に接触させた場合と、標識した本発明のリガンド
ポリペプチドおよび試験化合物をＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質もしくはその塩またはＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた
場合における、標識した本発明のリガンドポリペプチド
の該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩、
または該部分ペプチドもしくはその塩に対する結合量を
測定し、比較することを特徴とする本発明のリガンドポ
リペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合
性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方
法、標識した本発明のリガンドポリペプチドを、Ｇ蛋白質
共役型レセプター蛋白質を含有する細胞または該細胞の
膜画分に接触させた場合と、標識した本発明のリガンド
ポリペプチドおよび試験化合物をＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触
させた場合における、標識した本発明のリガンドポリペ
プチドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定
し、比較することを特徴とする本発明のリガンドポリペ
プチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を
変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、標識した本発明のリガンドポリペプチドを、Ｇ蛋白質
共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する
形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合と、
標識した本発明のリガンドポリペプチドおよび試験化合
物をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜
上に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触さ
せた場合における、標識した本発明のリガンドポリペプ
チドの該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する結合
量を測定し、比較することを特徴とする本発明のリガン
ドポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との
結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン
グ方法、

【００５１】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を活性
化する化合物（例えば、本発明のリガンドポリペプチ
ド）をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞
に接触させた場合と、Ｇ蛋白質共役型レセプターを活性
化する化合物および試験化合物をＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、
Ｇ蛋白質共役型レセプターを介した細胞刺激活性（例え
ば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃ
ａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、
イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白
質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを
促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較
することを特徴とする本発明のリガンドポリペプチドと
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させ
る化合物またはその塩のスクリーニング方法、およびＧ蛋白質共役型レセプターを活性化する化合物（例え
ば、本発明のリガンドポリペプチドなど）をＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形
質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合と、Ｇ
蛋白質共役型レセプターを活性化する化合物、および試
験化合物をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードす
るＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって
細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に
接触させた場合における、Ｇ蛋白質共役型レセプターを
介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセ
チルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生
成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細
胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの
活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する
活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明
のリガンドポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスク
リーニング方法である。

【００５２】Ｇ蛋白質共役型レセプターアゴニストまた
はアンタゴニストをスクリーニングする場合、まずラッ
トなどのＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含む細胞、
組織またはその細胞膜画分を用いて候補化合物を得て
（一次スクリーニング）、その後に該候補化合物が実際
にヒトのＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質とリガンドと
の結合を阻害するか否かを確認する試験（二次スクリー
ニング）が必要である。しかし、細胞、組織または細胞
膜画分をそのまま用いれば他のレセプター蛋白質も混在
するために、目的とするレセプター蛋白質に対するアゴ
ニストまたはアンタゴニストを実際にスクリーニングす
ることは困難である。しかしながら、ヒト由来Ｇ蛋白質
共役型レセプター蛋白質を用いることによって、一次ス
クリーニングの必要がなくなり、リガンドポリペプチド
とＧ蛋白質共役型レセプターとの結合性を変化させる化
合物を効率良くスクリーニングすることができる。さら
に、スクリーニングされた化合物がＧ蛋白質共役型レセ
プターアゴニストかＧ蛋白質共役型レセプターアンタゴ
ニストかを評価することができる。本発明のスクリーニ
ング方法の具体的な説明を以下にする。まず、本発明の
スクリーニング方法に用いるＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質としては、上記のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質またはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチ
ドを含有するものであれば何れのものであってもよい
が、ヒトや温血動物の臓器の膜画分が好適である。しか
し、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことか
ら、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え
体を用いて大量発現させたＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質が適している。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
製造するには、前述の方法が用いられる。本発明のスク
リーニング方法において、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質を含有する細胞あるいは該細胞膜画分を用いる場
合、前述の調製法に従えばよい。

【００５３】本発明のリガンドとＧ蛋白質共役型レセプ
ターとの結合性を変化させる化合物をスクリーニングす
る前記の〜を実施するためには、適当なＧ蛋白質共
役型レセプター画分と、標識した本発明のリガンドポリ
ペプチドが必要である。Ｇ蛋白質共役型レセプター画分
としては、天然型のＧ蛋白質共役型レセプター画分か、
またはそれと同等の活性を有する組換え型Ｇ蛋白質共役
型レセプター画分などが望ましい。ここで、同等の活性
とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識したリ
ガンドとしては、標識したリガンド、標識したリガンド
アナログ化合物などが用いられる。例えば〔³Ｈ〕、〔
¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識されたリガン
ドなどを利用することができる。具体的には、リガンド
ポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結
合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、
まずＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞ま
たは細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファ
ーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バ
ッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）
のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリ
ガンドとレセプターとの結合を阻害しないバッファーで
あればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させ
る目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^TM（花王−ア
トラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面
活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プ
ロテアーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える
目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研
究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添
加することもできる。０.０１ml〜１０ｍｌの該レセプ
ター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃ
ｐｍ）の標識したリガンドを添加し、同時に１０^-4Ｍ〜
１０^-10 Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量
（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のリガンドを加
えた反応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、
望ましくは４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ま
しくは３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙
等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス
繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカ
ウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物
質がない場合のカウント(Ｂ₀）から非特異的結合量（Ｎ
ＳＢ）を引いたカウント（Ｂ₀−ＮＳＢ）を１００％と
した時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以
下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質とし
て選択することができる。

【００５４】本発明のリガンドとＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニ
ングする前記の〜の方法を実施するためには、Ｇ蛋
白質共役型レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性（例
えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内
Ｃａ遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、
イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白
質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを
促進する活性または抑制する活性など）を公知の方法ま
たは市販の測定用キットを用いて測定することができ
る。具体的には、まず、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養す
る。スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮
な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファー
に交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュ
ベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、
生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞
刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸な
ど）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困
難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッ
セイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの
活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産
生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用とし
て検出することができる。細胞刺激活性を測定してスク
リーニングを行なうには、適当なＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質を発現した細胞が必要である。本発明のＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質を発現した細胞としては、
天然型の本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を有
する細胞株（例えば、マウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６な
ど）、前述の組換え型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質
発現細胞株などが望ましい。試験化合物としては、例え
ばペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合
物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽
出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であ
ってもよいし、公知の化合物であってもよい。

【００５５】本発明のリガンドとＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩
のスクリーニング用キットは、Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質またはその塩、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質の部分ペプチドまたはその塩、Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質を含有する細胞、あるいはＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質を含有する細胞の膜画分、および本発明
のリガンドポリペプチドを含有するものである。本発明
のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙
げられる。１．スクリーニング用試薬測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。Ｇ蛋白質共役型レセプター標品Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細
胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個／穴で継代し、３
７℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日間培養したも
の。標識リガンド市販の〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで
標識したリガンド適当な溶媒または緩衝液に溶解したも
のを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩
衝液にて１μＭに希釈する。リガンド標準液リガンドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）
を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で
保存する。

【００５６】２．測定法１２穴組織培養用プレートにて培養したＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質を発現させた細胞を、測定用緩衝液
１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を
各穴に加える。１０^-3〜１０^-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた
後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応さ
せる。非特異的結合量を知るためには試験化合物のかわ
りに１０^-3Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識リガンドを０.２ＮＮａＯＨ
−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ
（和光純薬製）と混合する。液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding
（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。

【数１】ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ：検体を加えた時の値ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）Ｂ₀ ：最大結合量

【００５７】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、本発明のリガンドポリペプチドとＧ蛋白質共役型レ
セプターとの結合を変化させる（結合を阻害あるいは促
進する）化合物であり、具体的にはＧ蛋白質共役型レセ
プターを介して細胞刺激活性を有する化合物またはその
塩（いわゆるＧ蛋白質共役型レセプターアゴニスト）、
あるいは該刺激活性を有しない化合物（いわゆるＧ蛋白
質共役型レセプターアンタゴニスト）である。該化合物
としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、
合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物
は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であっ
てもよい。該Ｇ蛋白質共役型レセプターアゴニストは、
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドポリ
ペプチドが有する生理活性と同様の作用を有しているの
で、該リガンド活性に応じて安全で低毒性な医薬として
有用である。逆に、Ｇ蛋白質共役型レセプターアンタゴ
ニストは、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリ
ガンドポリペプチドが有する生理活性を抑制することが
できるので、該リガンド活性を抑制する安全で低毒性な
医薬として有用である。本発明のリガンドポリペプチド
は下垂体機能調節作用、中枢神経機能調節作用または膵
臓機能調節作用に関与していることから、上記したアゴ
ニストあるいはアンタゴニストをたとえば老人性痴呆、
脳血管性痴呆、系統変成型の退行変成疾患（例：アルツ
ハイマー病、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン
病など）に起因する痴呆、感染性疾患（例：クロイツフ
ェルト−ヤコブ病などの遅発ウイルス感染症など）に起
因する痴呆、内分泌性・代謝性・中毒性疾患（例：甲状
腺機能低下症、ビタミンＢ１２欠乏症、アルコール中
毒、各種薬剤・金属・有機化合物による中毒など）に起
因する痴呆、腫瘍性疾患（例：脳腫瘍など）に起因する
痴呆、外傷性疾患（例：慢性硬膜下血腫など）に起因す
る痴呆などの痴呆、鬱病、多動児（微細脳障害）症候
群、意識障害、不安障害、精神分裂症、恐怖症、成長ホ
ルモン分泌障害（例：巨人症、末端肥大症など）、過食
症、多食症、高コレステロール血症、高グリセリド血
症、高脂血症、高プロラクチン血症、低血糖症、下垂体
機能低下症、下垂体性小人症、糖尿病（例：糖尿病性合
併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜
症など）、癌（例：乳癌、リンパ性白血病、膀胱癌、卵
巣癌、前立腺癌など）、膵炎、腎疾患（例：慢性腎不
全、腎炎など）、ターナー症候群、神経症、リウマチ関
節炎、脊髄損傷、一過性脳虚血発作、筋萎縮性側索硬化
症、急性心筋梗塞、脊髄小脳変性症、骨折、創傷、アト
ピー性皮膚炎、骨粗鬆症、喘息、てんかん、不妊症また
は乳汁分泌不全などの疾病の治療・予防剤として用いる
ことができる。さらに催眠鎮静剤、手術後の栄養状態改
善剤、昇圧剤、降圧剤などとしても用いることができ
る。

【００５８】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
を上述の医薬として使用する場合、上記のリガンドポリ
ペプチドを医薬として実施する場合と同様にして実施す
ることができる。

【００５９】（５）本発明のリガンドポリペプチドまた
はＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する抗体または
抗血清の製造本発明のリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質に対する抗体（例えば、ポリクローナル
抗体、モノクローナル抗体）または抗血清は、本発明の
リガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清
の製造法に従って製造することができる。例えば、ポリ
クローナル抗体は、後述の方法に従って製造することが
できる。

【００６０】［ポリクローナル抗体の作製］上記抗原と
してのペプチドもしくは蛋白質は、キャリアー用蛋白と
結合される。該キャリアー用蛋白としては、例えば、牛
チログロブリン、牛血清アルブミン、牛ガンマグロブリ
ン、ヘモシアニン、フロインドの完全アジュバント（デ
ィフコ社製）などがあげられる。該抗原としての蛋白質
とキャリアー用蛋白との結合には、公知の常套手段を用
いて実施し得る。結合に用いる試薬としては、例えば、
グルタールアルデヒド、水溶性カルボジイミドなどがあ
げられる。抗原としての蛋白質とキャリアー用蛋白との
使用比は、約１対１ないし約１対１０が適当であり、反
応のｐＨは、中性付近、特に約６〜８前後が良好な結果
を与える場合が多い。また、反応に要する時間は、約１
〜１２時間が良い場合が多いが、特に、約２〜６時間が
適当である。このようにして作成された複合物は、常套
手段で約０〜１８℃前後で水に対して透析し、凍結して
保存しても良いし、凍結乾燥して保存しても良い。ポリ
クローナル抗体を製造するためには、上記のようにして
製造した免疫原を温血動物に接種される。上記抗体の製
造に用いられる温血動物としては、例えば、哺乳温血動
物（例、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、モル
モット、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニワトリ、ハ
ト、アヒル、ガチョウ、ウズラ）などが挙げられる。免
疫原を、温血動物に接種する方法としては、動物に接種
する免疫原は、抗体産生をする有効な量でよく、例え
ば、ウサギに１回１mgを１mlの生理食塩水およびフロイ
ンドの完全アジュバントで乳化して、背部ならびに後肢
掌皮下に４週間おきに５回接種すると抗体を産生させる
場合が多い。このようにして、温血動物中に形成された
抗体を採取する方法としては、例えばウサギでは、通常
最終接種後７日から１２日の間に耳静脈から採取し、遠
心分離して血清として得られる。得られた抗血清は、通
常、各抗原ペプチドを保持させた担体を用いるアフィニ
ティクロマトグラフィーで吸着した画分を回収すること
によりポリクローナル抗体を精製することができる。

【００６１】また、モノクローナル抗体は、後述の方法
に従って製造することができる。〔モノクローナル抗体の作製〕（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製本発明のリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質は、温血動物に対して投与により抗体産
生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤ととも
に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、
完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュ
バントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回
ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物
としては、たとえばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、
マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられる
が、マウスおよびラットが好ましく用いられる。

【００６２】モノクローナル抗体産生細胞の作製に際し
ては、抗原を免疫された温血動物、たとえばマウスから
抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後
に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体
産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができ
る。抗血清中の抗体価の測定は、例えば後記の標識化ポ
リペプチドまたは標識化Ｇ蛋白質共役型レセプターと抗
血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性
を測定することによりなされる。融合操作は既知の方
法、たとえばケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャ
ー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施できる。融
合促進剤としてはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や
センダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥ
Ｇが用いられる。骨髄腫細胞としてはたとえばＮＳ−
１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などがあげられる
が、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産
生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率
は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰ
ＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の
濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７
℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よ
く細胞融合を実施できる。抗リガンドポリペプチド抗体
または抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体産生ハイブリド
ーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、
たとえばリガンドポリペプチド抗原またはＧ蛋白質共役
型レセプター抗原を直接あるいは担体とともに吸着させ
た固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養
上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗
免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウ
スの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）
またはプロテインＡを加え、固相に結合した抗リガンド
ポリペプチドモノクローナル抗体または抗Ｇ蛋白質共役
型レセプターモノクローナル抗体を検出する方法、抗免
疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相
にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素
などで標識したリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共
役型レセプターを加え、固相に結合した抗リガンドポリ
ペプチドモノクローナル抗体または抗Ｇ蛋白質共役型レ
セプターモノクローナル抗体を検出する方法などがあげ
られる。抗リガンドポリペプチドモノクローナル抗体ま
たは抗Ｇ蛋白質共役型レセプターモノクローナル抗体の
選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行
なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミ
ノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行
なわれる。選別および育種用培地としては、ハイブリド
ーマが生育できるものならばどのような培地を用いても
良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の
牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地、１〜１０％
の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））
あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１
０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培
養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃であ
る。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間
〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なわ
れる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血
清中の抗リガンドポリペプチド抗体価または抗Ｇ蛋白質
共役型レセプター抗体価の測定と同様にして測定でき
る。

【００６３】（ｂ）モノクロナール抗体の精製抗リガンドポリペプチドモノクローナル抗体または抗Ｇ
蛋白質共役型レセプターモノクローナル抗体の分離精製
は通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グ
ロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿
法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、Ｄ
ＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原
結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧな
どの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離さ
せて抗体を得る特異的精製法〕に従って行われる。以上
の（ａ）および（ｂ）の方法に従って製造させる本発明
のリガンドポリペプチド抗体またはＧ蛋白質共役型レセ
プター抗体は、それぞれリガンドポリペプチドまたはＧ
蛋白質共役型レセプターを特異的に認識することができ
るので、被検液中のリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白
質共役型レセプターの定量、特にサンドイッチ免疫測定
法による定量などに使用することができる。すなわち、
本発明は、例えば、（ｉ）本発明のリガンドポリペプチ
ドまたはＧ蛋白質共役型レセプターに反応する抗体と、
被検液および、標識化リガンドポリペプチドまたは標識
化Ｇ蛋白質共役型レセプターとを競合的に反応させ、該
抗体に結合した標識化リガンドポリペプチドまたは標識
化Ｇ蛋白質共役型レセプターの割合を測定することを特
徴とする被検液中のリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白
質共役型レセプターの定量法、（ii）被検液と担体上に
不溶化した抗体および標識化された抗体とを同時あるい
は連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活
性を測定することを特徴とする被検液中のリガンドポリ
ペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターの定量法にお
いて、一方の抗体が、リガンドポリペプチドまたはＧ蛋
白質共役型レセプターのＮ端部を認識する抗体で、他方
の抗体がリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レ
セプターのＣ端部に反応する抗体であることを特徴とす
る被検液中のリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役
型レセプターの定量法を提供する。

【００６４】本発明のリガンドポリペプチドまたはＧ蛋
白質共役型レセプターを認識するモノクローナル抗体
（以下、抗リガンドポリペプチド抗体または抗Ｇ蛋白質
共役型レセプター抗体と称する場合がある）を用いてリ
ガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターの
測定を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこ
ともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用
いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')₂ 、Ｆａｂ'、
あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用
いる測定法は、特に制限されるべきものではなく、被
測定液中の抗原量（例えばリガンドポリペプチド量また
はＧ蛋白質共役型レセプター量）に対応した抗体、抗原
もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手
段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用
いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、い
ずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリ
ー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法
が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述する
サンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。標識物質を
用いる測定法に用いられる標識剤としては、放射性同位
元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが挙げられる。放
射性同位元素としては、例えば〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹³¹Ｉ〕、
〔³Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕などが、上記酵素としては、安定で
比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシ
ダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が、蛍光
物質としては、フルオレスカミン、フルオレッセンイソ
チオシアネートなどが、発光物質としては、ルミノー
ル、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど
がそれぞれ挙げられる。さらに、抗体あるいは抗原と標
識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもで
きる。

【００６５】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等
を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる
方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラ
ン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポ
リアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガ
ラス等が挙げられる。サンドイッチ法においては不溶化
した抗リガンドポリペプチド抗体または抗Ｇ蛋白質共役
型レセプター抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さ
らに標識化抗リガンドポリペプチド抗体または標識化抗
Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体を反応させ（２次反応）
たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することに
より被検液中のリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共
役型レセプター量を定量することができる。１次反応と
２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なって
もよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤およ
び不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。
また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相
用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも
１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目
的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本発明
のサンドイッチ法によるリガンドポリペプチドまたはＧ
蛋白質共役型レセプターの測定法においては、１次反応
と２次反応に用いられる抗リガンドポリペプチド抗体ま
たは抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体はリガンドポリペ
プチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターの結合する部位
が相異なる抗体が好ましく用いられる。即ち、１次反応
および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応
で用いられる抗体が、リガンドポリペプチドまたはＧ蛋
白質共役型レセプターのＣ端部を認識する場合、１次反
応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えば
Ｎ端部を認識する抗体が用いられる。

【００６６】本発明のリガンドポリペプチド抗体または
Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体をサンドイッチ法以外の
測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あ
るいはネフロメトリーなどに用いることができる。競合
法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競
合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と(Ｆ）と抗
体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分
離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗
原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体
を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗
体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１
抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体
は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用い
る固相化法とが用いられる。イムノメトリック法では、
被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に
対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、ある
いは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応さ
せ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に
結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれ
かの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗
原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定す
る。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか
得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザー
ネフロメトリーなどが好適に用いられる。

【００６７】これら個々の免疫学的測定法を本発明の測
定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてリガ
ンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターの測
定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳
細については、総説、成書などを参照することができる
〔例えば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ〕（講談
社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイムノア
ッセイ〕（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石
川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、
昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」
（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods
in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(P
art A))、同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(P
art B))、同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(P
art C))、同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(P
art D:Selected Immunoassays))、同書 Vol. 92(Immun
ochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies
and General Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121
(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Techno
logy and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミッ
クプレス社発行)など参照〕。以上のように、本発明の
リガンドポリペプチド抗体またはＧ蛋白質共役型レセプ
ター抗体を用いることによって、リガンドポリペプチド
またはＧ蛋白質共役型レセプターを感度良く定量するこ
とができる。本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commision on Biochemical Nomenclature による略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。

【００６８】ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシンＲＮＡ：リボ核酸ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ：アデノシン三リン酸ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウムＥＩＡ：エンザイムイムノアッセイＧｌｙまたはＧ：グリシンＡｌａまたはＡ：アラニンＶａｌまたはＶ：バリンＬｅｕまたはＬ：ロイシンＩｌｅまたはＩ：イソロイシンＳｅｒまたはＳ：セリン

【００６９】ＴｈｒまたはＴ：スレオニンＣｙｓまたはＣ：システインＭｅｔまたはＭ：メチオニンＧｌｕまたはＥ：グルタミン酸ＡｓｐまたはＤ：アスパラギン酸ＬｙｓまたはＫ：リジンＡｒｇまたはＲ：アルギニンＨｉｓまたはＨ：ヒスチジンＰｈｅまたはＦ：フェニルアラニンＴｙｒまたはＹ：チロシンＴｒｐまたはＷ：トリプトファンＰｒｏまたはＰ：プロリンＡｓｎまたはＮ：アスパラギンＧｌｎまたはＱ：グルタミンｐＧｌｕ：ピログルタミン酸Ｍｅ：メチル基Ｅｔ：エチル基Ｂｕ：ブチル基Ｐｈ：フェニル基ＴＣ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキ
サミド基

【００７０】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。ＢＨＡ：ベンズヒドリルアミンｐＭＢＨＡ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミンＴｏｓ：ｐ−トルエンスルフォニルＣＨＯ：ホルミルＨＯＮＢ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネンー２，３
−ジカルボキシイミドＯｃＨｅｘ：シクロヘキシルエステルＢｚｌ：ベンジルＢｏｍ：ベンジルオキシメチルＢｒ−Ｚ：２−ブロモベンジルオキシカルボニルＢｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニルＤＣＭ：ジクロロメタンＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンズトリアゾールＤＣＣ：Ｎ、Ｎ‘−ジシクロヘキシルカルボジイミドＴＦＡ：トリフルオロ酢酸ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミンＦｍｏｃ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニルＤＮＰ：ジニトロフェニルＢｕｍ：ターシャリーブトキシメチルＴｒｔ：トリチル

【００７１】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。〔配列番号：１〕ｐＢＯＶ３に含まれるウシ視床下部由
来リガンドポリペプチドの全長アミノ酸配列を示す。〔配列番号：２〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプチ
ドｃＤＮＡの全塩基配列を示す。〔配列番号：３〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプチ
ドを精製し、P-3画分のＮ末端配列分析をした結果得ら
れたアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第２３〜５１
番目のアミノ酸配列に対応している。〔配列番号：４〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプチ
ドを精製、P-2画分のＮ末端配列分析をした結果得られ
たアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第３４〜５２番
目のアミノ酸配列に対応している。〔配列番号：５〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第２３〜５３
番目のアミノ酸配列に対応している。〔配列番号：６〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第２３〜５４
番目のアミノ酸配列に対応している。〔配列番号：７〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第２３〜５５
番目のアミノ酸配列に対応している。〔配列番号：８〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第３４〜５３
番目のアミノ酸配列に対応している。〔配列番号：９〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第３４〜５４
番目のアミノ酸配列に対応している。〔配列番号：１０〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第３４〜５
５番目のアミノ酸配列に対応している。〔配列番号：１１〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チド（配列番号：３）をコードするＤＮＡの塩基配列を
示す。〔配列番号：１２〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チド（配列番号：４）をコードするＤＮＡの塩基配列を
示す。〔配列番号：１３〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チド（配列番号：５）をコードするＤＮＡの塩基配列を
示す。〔配列番号：１４〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チド（配列番号：６）をコードするＤＮＡの塩基配列を
示す。〔配列番号：１５〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チド（配列番号：７）をコードするＤＮＡの塩基配列を
示す。〔配列番号：１６〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チド（配列番号：８）をコードするＤＮＡの塩基配列を
示す。〔配列番号：１７〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チド（配列番号：９）をコードするＤＮＡの塩基配列を
示す。〔配列番号：１８〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チド（配列番号：１０）をコードするＤＮＡの塩基配列
を示す。〔配列番号：１９〕ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由
来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコー
ドされるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質の部分アミノ酸配列を示す。〔配列番号：２０〕ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由
来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコー
ドされるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質の部分アミノ酸配列を示す。〔配列番号：２１〕ｐｈＧＲ３に含まれるヒト下垂体由
来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡにコードさ
れるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の
全アミノ酸配列を示す。〔配列番号：２２〕ｐＧ３−２およびｐＧ１−１０にそ
れぞれ含まれるマウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列から
導きだした塩基配列（配列番号：２７）を有するマウス
膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質ｃＤＮＡ断片にコードされるマウス膵臓β細胞株Ｍ
ＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分アミ
ノ酸配列を示す。〔配列番号：２３〕ｐ５Ｓ３８にコードされるマウス膵
臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質の部分アミノ酸配列を示す。〔配列番号：２４〕ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由
来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基
配列を示す。〔配列番号：２５〕ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由
来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基
配列を示す。〔配列番号：２６〕ｐｈＧＲ３に含まれるヒト下垂体由
来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡの全塩基配
列を示す。〔配列番号：２７〕ｐＧ３−２およびｐＧ１−１０にそ
れぞれ含まれるマウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列をも
とに導き出したマウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列を示
す。〔配列番号：２８〕ｐ５Ｓ３８に含まれるマウス膵臓β
細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃ
ＤＮＡ断片の塩基配列を示す。〔配列番号：２９〕Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成Ｄ
ＮＡ〔配列番号：３０〕Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成Ｄ
ＮＡ〔配列番号：３１〕Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成Ｄ
ＮＡ〔配列番号：３２〕Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成Ｄ
ＮＡ〔配列番号：３３〕Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成Ｄ
ＮＡ〔配列番号：３４〕Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成Ｄ
ＮＡ〔配列番号：３５〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（Ｐ５−１）〔配列番号：３６〕本発明のウシ視床下部由来ポリガン
ドリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（Ｐ３−１）〔配列番号：３７〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（Ｐ３−２）〔配列番号：３８〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（ＰＥ）〔配列番号：３９〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（ＰＤＮ）〔配列番号：４０〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（ＦＢ）〔配列番号：４１〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（ＦＣ）〔配列番号：４２〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（ＢＯＶＦ）〔配列番号：４３〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（ＢＯＶＲ）〔配列番号：４４〕ウシゲノム由来リガンドポリペプチ
ドの全長アミノ酸配列を示す。〔配列番号：４５〕ｐＲＡＶ３に含まれるラット型リガ
ンドポリペプチドの全長アミノ酸配列を示す。〔配列番号：４６〕ラット型リガンドポリペプチドｃＤ
ＮＡの全塩基配列を示す。〔配列番号：４７〕ラット型リガンドポリペプチドのア
ミノ酸配列を示す。配列番号：４５の第２２〜５２番目
のアミノ酸配列に対応している。〔配列番号：４８〕ラット型リガンドポリペプチドのア
ミノ酸配列を示す。配列番号：４５の第２２〜５３番目
のアミノ酸配列に対応している。〔配列番号：４９〕ラット型リガンドポリペプチドのア
ミノ酸配列を示す。配列番号：４５の第２２〜５４番目
のアミノ酸配列に対応している。〔配列番号：５０〕ラット型リガンドポリペプチドのア
ミノ酸配列を示す。配列番号：４５の第３３〜５２番目
のアミノ酸配列に対応している。〔配列番号：５１〕ラット型リガンドポリペプチドのア
ミノ酸配列を示す。配列番号：４５の第３３〜５３番目
のアミノ酸配列に対応している。〔配列番号：５２〕ラット型リガンドポリペプチドのア
ミノ酸配列を示す。配列番号：４５の第３３〜５４番目
のアミノ酸配列に対応している。〔配列番号：５３〕ラット型リガンドポリペプチド（配
列番号：４７）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：５４〕ラット型リガンドポリペプチド（配
列番号：４８）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：５５〕ラット型リガンドポリペプチド（配
列番号：４９）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：５６〕ラット型リガンドポリペプチド（配
列番号：５０）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：５７〕ラット型リガンドポリペプチド（配
列番号：５１）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：５８〕ラット型リガンドポリペプチド（配
列番号：５２）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：５９〕ｐＨＯＢ７に含まれるヒト型リガン
ドポリペプチドの全長アミノ酸配列を示す。〔配列番号：６０〕ヒト型リガンドポリペプチドｃＤＮ
Ａの全塩基配列を示す。〔配列番号：６１〕ヒト型リガンドポリペプチドのアミ
ノ酸配列を示す。配列番号：５９の第２３〜５３番目の
アミノ酸配列に対応している。〔配列番号：６２〕ヒト型リガンドポリペプチドのアミ
ノ酸配列を示す。配列番号：５９の第２３〜５４番目の
アミノ酸配列に対応している。〔配列番号：６３〕ヒト型リガンドポリペプチドのアミ
ノ酸配列を示す。配列番号：５９の第２３〜５５番目の
アミノ酸配列に対応している。〔配列番号：６４〕ヒト型リガンドポリペプチドのアミ
ノ酸配列を示す。配列番号：５９の第３４〜５３番目の
アミノ酸配列に対応している。〔配列番号：６５〕ヒト型リガンドポリペプチドのアミ
ノ酸配列を示す。配列番号：５９の第３４〜５４番目の
アミノ酸配列に対応している。〔配列番号：６６〕ヒト型リガンドポリペプチドのアミ
ノ酸配列を示す。配列番号：５９の第３４〜５５番目の
アミノ酸配列に対応している。〔配列番号：６７〕ヒト型リガンドポリペプチド（配列
番号：６１）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：６８〕ヒト型リガンドポリペプチド（配列
番号：６２）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：６９〕ヒト型リガンドポリペプチド（配列
番号：６３）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：７０〕ヒト型リガンドポリペプチド（配列
番号：６４）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：７１〕ヒト型リガンドポリペプチド（配列
番号：６５）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：７２〕ヒト型リガンドポリペプチド（配列
番号：６６）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：７３〕本発明のリガンドポリペプチドのア
ミノ酸配列を示す。ここで、第１０番目のXaaはAlaまた
はThr、第１１番目のXaaはGlyまたはSer、第２１番目の
XaaはH、Gly、またはGlyArgを示す。〔配列番号：７４〕本発明のリガンドポリペプチド断片
のアミノ酸配列を示す。ここで、第３番目のXaaはAlaま
たはThrを示し、第５番目のXaaはGlnまたはArgを示し、
第１０番目のXaaはIleまたはThrを示す。〔配列番号：７５〕本発明のラット型リガンドポリペプ
チドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した
合成ＤＮＡ（ＲＡ）〔配列番号：７６〕本発明のラット型リガンドポリペプ
チドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した
合成ＤＮＡ（ＲＣ）〔配列番号：７７〕本発明のラット型リガンドポリペプ
チドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した
合成ＤＮＡ（ｒＦ）〔配列番号：７８〕本発明のラット型リガンドポリペプ
チドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した
合成ＤＮＡ（ｒＲ）〔配列番号：７９〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（Ｒ１）〔配列番号：８０〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（Ｒ３）〔配列番号：８１〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（Ｒ４）〔配列番号：８２〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（ＨＡ）〔配列番号：８３〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（ＨＢ）〔配列番号：８４〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（ＨＥ）〔配列番号：８５〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（ＨＦ）〔配列番号：８６〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（５Ｈ）〔配列番号：８７〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（３ＨＮ）〔配列番号：８８〕ラット型Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質（ＵＨＲ−１）をコードするｃＤＮＡのスクリー
ニングに使用した合成ＤＮＡ（ｒＲＥＣＦ）〔配列番号：８９〕ラット型Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質（ＵＨＲ−１）をコードするｃＤＮＡのスクリー
ニングに使用した合成ＤＮＡ（ｒＲＥＣＲ）〔配列番号：９０〕Ｇ３ＰＤＨ，ＵＨＲ−１，リガンド
の増幅に使用した合成ＤＮＡ（ｒ１９Ｆ）〔配列番号：９１〕Ｇ３ＰＤＨ，ＵＨＲ−１，リガンド
の増幅に使用した合成ＤＮＡ（ｒ１９Ｒ）〔配列番号：９２〕抗原として使用したリガンドポリペ
プチドのＮ末端側ペプチド（ペプチド−I）〔配列番号：９３〕抗原として使用したリガンドポリペ
プチドのＣ末端側ペプチド（ペプチド−II）〔配列番号：９４〕抗原として使用したリガンドポリペ
プチドの中央部分のペプチド（ペプチド−III）〔配列番号：９５〕ラット型Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質（ＵＨＲ−１）をコードするｃＤＮＡのスクリー
ニングに使用した合成ＤＮＡ〔配列番号：９６〕ラット型Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質（ＵＨＲ−１）をコードするｃＤＮＡのスクリー
ニングに使用した合成ＤＮＡ

【００７２】後述の実施例２で得られた形質転換体エシ
ェリヒアコリ（Escherichia coli) ＩＮＶαＦ’／ｐ
１９Ｐ２および実施例４で得られた形質転換体エシェリ
ヒアコリ（Escherichia coli)ＩＮＶαＦ’／ｐＧ３−
２は、それぞれ平成６年８月９日から通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）にそれぞれ寄
託番号ＦＥＲＭＢＰ−４７７６およびＦＥＲＭＢＰ
−４７７５として寄託されており、また平成６年８月２
２日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にそれぞれＩＦ
Ｏ１５７３９およびＩＦＯ１５７４０として寄託さ
れている。後述の実施例５で得られた形質転換体エシェ
リヒアコリ（Escherichia coli) ＪＭ１０９／ｐｈＧ
Ｒ３は、平成６年９月２７日から通商産業省工業技術院
生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲ
ＭＢＰ−４８０７として寄託されており、また平成６
年９月２２日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦ
Ｏ１５７４８として寄託されている。後述の実施例８
で得られた形質転換体エシェリヒアコリ（Escherichi
a coli) ＪＭ１０９／ｐ５Ｓ３８は、平成６年１０月２
７日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−４８５６とし
て寄託されており、また平成６年１０月２５日から財団
法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ１５７５４として
寄託されている。後述の実施例２０で得られた形質転換
体エシェリヒアコリ（Escherichia coli) ＪＭ１０９
／ｐＢＯＶ３は、平成８年２月１３日から通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番
号ＦＥＲＭＢＰ−５３９１として寄託されており、ま
た平成８年１月２５日から財団法人発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）にＩＦＯ１５９１０として寄託されている。後述
の実施例２９で得られた形質転換体エシェリヒアコリ
（Escherichia coli) ＪＭ１０９／ｐＲＡＶ３は、平成
８年９月１２日から通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−５
６６５として寄託されており、また平成８年９月３日か
ら財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ１６０１２
として寄託されている。後述の実施例３２で得られた形
質転換体エシェリヒアコリ（Escherichia coli) ＪＭ
１０９／ｐＨＯＶ７は、平成８年９月１２日から通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に
寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−５６６６として寄託されてお
り、また平成８年９月５日から財団法人発酵研究所（Ｉ
ＦＯ）にＩＦＯ１６０１３として寄託されている。

【００７３】

【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。

【００７４】

【参考例１】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコード
するＤＮＡを増幅させるための合成ＤＮＡプライマーの
製造公知のヒト由来ＴＲＨレセプター蛋白質（ＨＴＲＨ
Ｒ）、ヒト由来ＲＡＮＴＥＳレセプター蛋白質（Ｌ１０
９１８、ＨＵＭＲＡＮＴＥＳ）、ヒトバーキットリンパ
腫由来リガンド不明レセプター蛋白質（Ｘ６８１４９、
ＨＳＢＬＲ１Ａ）、ヒト由来ソマトスタチンレセプター
蛋白質（Ｌ１４８５６、ＨＵＭＳＯＭＡＴ）、ラット由
来μ−オピオイドレセプター蛋白質（Ｕ０２０８３、Ｒ
ＮＵ０２０８３）、ラット由来κ−オピオイドレセプタ
ー蛋白質（Ｕ００４４２、Ｕ００４４２）、ヒト由来ニ
ューロメジンＢレセプター蛋白質（Ｍ７３４８２、ＨＵ
ＭＮＭＢＲ）、ヒト由来ムスカリン作動性アセチルコリ
ンレセプター蛋白質（Ｘ１５２６６、ＨＳＨＭ４）、ラ
ット由来アドレナリンα₁Ｂレセプター蛋白質（Ｌ０８
６０９、ＲＡＴＡＡＤＲＥ０１）、ヒト由来ソマトスタ
チン３レセプター蛋白質（Ｍ９６７３８、ＨＵＭＳＳＴ
Ｒ３Ｘ）、ヒト由来Ｃ₅ａレセプター蛋白質（ＨＵＭＣ
５ＡＡＲ）、ヒト由来リガンド不明レセプター蛋白質
（ＨＵＭＲＤＣ１Ａ）、ヒト由来リガンド不明レセプタ
ー蛋白質（Ｍ８４６０５、ＨＵＭＯＰＩＯＤＲＥ）およ
びラット由来アドレナリンα₂Ｂ（Ｍ９１４６６、ＲＡ
ＴＡ２ＢＡＲ）の第１膜貫通領域付近のアミノ酸配列を
コードするｃＤＮＡの塩基配列を比較し、類似性の高い
部分を見いだした。

【００７５】また、公知のマウス由来リガンド不明レセ
プター蛋白質（Ｍ８０４８１、ＭＵＳＧＩＲ）、ヒト由
来ボンベジンレセプター蛋白質（Ｌ０８８９３、ＨＵＭ
ＢＯＭＢ３Ｓ）、ヒト由来アデノシンＡ２レセプター蛋
白質（Ｓ４６９５０、Ｓ４６９５０）、マウス由来リガ
ンド不明レセプター蛋白質（Ｄ２１０６１、ＭＵＳＧＰ
ＣＲ）、マウス由来ＴＲＨレセプター蛋白質（Ｓ４３３
８７、Ｓ４３３８７）、ラット由来ニューロメジンＫレ
セプター蛋白質（Ｊ０５１８９、ＲＡＴＮＥＵＲＡ）、
ラット由来アデノシンＡ１レセプター蛋白質（Ｍ６９０
４５、ＲＡＴＡ１ＡＲＡ）、ヒト由来ニューロキニンＡ
レセプター蛋白質（Ｍ５７４１４、ＨＵＭＮＥＫＡ
Ｒ）、ラット由来アデノシンＡ３レセプター蛋白質（Ｍ
９４１５２、ＲＡＴＡＤＥＮＲＥＣ）、ヒト由来ソマト
スタチン１レセプター蛋白質（Ｍ８１８２９、ＨＵＭＳ
ＲＩ１Ａ）、ヒト由来ニューロキニン３レセプター蛋白
質（Ｓ８６３９０、Ｓ８６３７１Ｓ４）、ラット由来リ
ガンド不明レセプター蛋白質（Ｘ６１４９６、ＲＮＣＧ
ＰＣＲ）、ヒト由来ソマトスタチン４レセプター蛋白質
（Ｌ０７０６１、ＨＵＭＳＳＴＲ４Ｚ）およびラット由
来ＧｎＲＨレセプター蛋白質（Ｍ３１６７０、ＲＡＴＧ
ＮＲＨＡ）の第６膜貫通領域付近のアミノ酸配列をコー
ドするｃＤＮＡの塩基配列を比較し、類似性の高い部分
を見いだした。

【００７６】上記の（）内の略語はDNASIS Gene/Prot
einシークエンスデータベース（ＣＤ０１９、日立ソフ
トウエアエンジニアリング）を用いて GenBank/EMBL Da
ta Bank を検索した際に示される整理番号であり、それ
ぞれ通常Accession Numberおよびエントリーネームと呼
ばれるものである。ただし、ＨＴＲＨＲは特開平７−３
０４７９７号に記載されている配列である。特に、多く
のレセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡで一致する塩
基部分を基準とし、その他の部分においてもなるべく多
くのレセプターｃＤＮＡと配列の一致性を高めるために
混合塩基の導入を計画した。この配列をもとに、共通す
る塩基配列に相補的である配列番号：２９または配列番
号：３０で表わされる塩基配列を有する合成ＤＮＡ２本
を作成した。〔合成ＤＮＡ〕５'−ＣＧＴＧＧ（ＧまたはＣ）Ｃ（Ａ
またはＣ）Ｔ（ＧまたはＣ）（ＧまたはＣ）ＴＧＧＧＣ
ＡＡＣ（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）（ＣまたはＴ）ＣＣＴＧ
−３’（配列番号：２９）５’−ＧＴ（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）Ｇ（ＡまたはＴ）
（ＡまたはＧ）（ＡまたはＧ）ＧＧＣＡ（Ａ、Ｇ、Ｃま
たはＴ）ＣＣＡＧＣＡＧＡ（ＧまたはＴ）ＧＧＣＡＡＡ
−３'
（配列番号：３０）（）内は合成時に複数の塩基に混合して合成する。

【００７７】

【実施例１】ヒト下垂体由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法
による受容体ｃＤＮＡの増幅ヒト下垂体由来ｃＤＮＡ（QuickClone、クロンテック
社）を鋳型として用い、参考例１で合成したＤＮＡプラ
イマーを用いてＰＣＲ法による増幅を行った。反応液の
組成は、合成ＤＮＡプライマー（配列：５’プライマー
配列および３’プライマー配列）各１μＭ、鋳型ｃＤＮ
Ａ１ｎｇ、０.２５ｍＭｄＮＴＰｓ、ＴａｑＤＮＡ
polymerase １μｌおよび酵素に付属のバッファーで、
総反応溶液量は１００μｌとした。増幅のためのサイク
ルはサーマルサイクラー（パーキン・エルマー社）を用
い、９５℃・１分、５５℃・１分、７２℃・１分のサイ
クルを３０回繰り返した。ＴａｑＤＮＡ polymerase
を添加する前に、残りの反応液を混合し、９５℃・５
分、６５℃・５分の加熱を行った。増幅産物の確認は
１.２％アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロ
マイド染色によって行った。

【００７８】

【実施例２】ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへのサブ
クローニングおよび挿入ｃＤＮＡ部分の塩基配列の解読
による新規レセプター蛋白質候補クローンの選択実施例
１で行なったＰＣＲ後の反応産物は０.８％の低融点ア
ガロースゲルを用いて分離し、バンドの部分をカミソリ
で切り出した後、熱融解、フェノール抽出、エタノール
沈殿を行ってＤＮＡを回収した。ＴＡクローニングキッ
ト（インビトロゲン社）の処方に従い、回収したＤＮＡ
をプラスミドベクターｐＣＲ^TMII（ＴＭは登録商標を意
味する）へサブクローニングした。これを大腸菌ＩＮＶ
αＦ’ competent cell（インビトロゲン社）に導入し
て形質転換したのち、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローン
をアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地中
で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊
枝を用いて分離し、形質転換体エシェリヒアコリ（Es
cherichia coli) ＩＮＶαＦ’／ｐ１９Ｐ２を得た。個
々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養
し、自動プラスミド抽出装置（クラボウ社）を用いてプ
ラスミドＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡの一部を用
いてＥｃｏＲＩによる切断を行い、挿入されているｃＤ
ＮＡ断片の大きさを確認した。残りのＤＮＡの一部をさ
らにＲＮａｓｅ処理、フェノール・クロロフォルム抽出
し、エタノール沈殿によって濃縮した。塩基配列の決定
のための反応は DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencin
g Kit（ＡＢＩ社）を用いて行い、蛍光式自動シーケン
サーを用いて解読し、得られた塩基配列の情報はＤＮＡ
ＳＩＳ（日立システムエンジニアリング社）を用いて行
った。下線で示した部分は合成プライマーに相当する部
分である。決定した塩基配列〔配列番号：２４（図１の
塩基配列から下線部分を除いた塩基配列）および配列番
号：２５（図２の塩基配列から下線部分を除いた塩基配
列）〕をもとにホモロジー検索を行なった結果、形質転
換体Ｅ. ＣｏｌｉＩＮＶαＦ’／ｐ１９Ｐ２の保有す
るプラスミドｐ１９Ｐ２に挿入されたｃＤＮＡ断片が新
規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードすることが
分かった。それをさらに確認するために、ＤＮＡＳＩＳ
（日立システムエンジニアリング社）を用い、塩基配列
をアミノ酸配列に変換した〔配列番号：１９（図１のア
ミノ酸配列から下線部分を除いたアミノ酸配列）および
配列番号：２０（図２のアミノ酸配列から下線部分を除
いたアミノ酸配列）〕。疎水性プロット〔図３および図
４〕およびアミノ酸配列に基づくホモロジー検索を行な
い、ニューロペプチドＹ受容体等との相同性を見いだし
た〔図５〕。

【００７９】

【実施例３】マウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６からのpoly
(Ａ)⁺ＲＮＡ画分の調製およびｃＤＮＡの合成マウス膵β細胞株ＭＩＮ６（Jun-ichi Miyazaki et al.
Endocrinology, Vol.127, No.1, p126-132）よりグア
ニジンイソチオシアネート法により Total ＲＮＡを調
製後（Kaplan B.B. et al., Biochem. J. 183, 181-184
（1979）)、ｍＲＮＡ精製キット（ファルマシア社）を
用いて、 poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分を調製した。次に、poly
(Ａ)⁺ＲＮＡ画分５μｇにプライマーとしてランダムＤ
ＮＡヘキサマー（ＢＲＬ社）を加え、モロニイマウス白
血病ウイルスの逆転写酵素（ＢＲＬ社）により、添付バ
ッファーを用いて相補ＤＮＡを合成した。反応後の産物
はフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、エタ
ノール沈殿を行った後、３０μｌのＴＥに溶解した。

【００８０】

【実施例４】ＭＩＮ６由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法に
よる受容体ｃＤＮＡの増幅と塩基配列の決定実施例３でマウス膵β細胞株ＭＩＮ６より調製したｃＤ
ＮＡ５μｌを鋳型として使用し、参考例１で合成した
ＤＮＡプライマーを用いて実施例１と同条件でＰＣＲ法
を行った。得られたＰＣＲ産物は実施例２に記載の方法
と同様にして、プラスミドベクターｐＣＲ^TMIIにサブク
ローニングし、プラスミドｐＧ３−２を得た。このプラ
スミドで大腸菌ＩＮＶαＦ’を形質転換し、形質転換体
エシェリヒアコリ（Escherichia coli)ＩＮＶαＦ’
／ｐＧ３−２を得た。また、マウス膵β細胞株ＭＩＮ６
より調製したｃＤＮＡ５μｌを鋳型として使用し、Lib
ert, Fら（Science 244:569-572, 1989）に記載されて
いる合成ＤＮＡプライマー、すなわち、５'−ＣＴＧＴ
Ｇ（ＣまたはＴ）Ｇ（ＣまたはＴ）（ＧまたはＣ）ＡＴ
（ＣまたはＴ）ＧＣＩＩＴ（ＧまたはＴ）ＧＡ（Ｃまた
はＴ）（ＡまたはＣ）Ｇ（ＧまたはＣ）ＴＡＣ−３'
（配列番号：３
１）〔Ｉはイノシンを示す。〕で表される合成プライマーお
よび５'−Ａ（ＧまたはＴ）Ｇ（ＡまたはＴ）ＡＧ（Ａ
またはＴ）ＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＩ（Ｇまた
はＣ）（ＡまたはＧ）（ＣまたはＴ）ＧＡＡ−３'（配
列番号：３２）〔Ｉをイノシンを示す。〕で表される合成プライマーを
用いて、実施例１と同条件でＰＣＲ法を行った。得られ
たＰＣＲ産物は実施例２に記載の方法と同様にして、プ
ラスミドベクターｐＣＲ^TMIIにサブクローニングし、プ
ラスミドｐＧ１−１０を得た。

【００８１】塩基配列の決定のための反応は DyeDeoxy
Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ社）を用い
て行い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、得ら
れた塩基配列の情報はＤＮＡＳＩＳ（日立システムエン
ジニアリング社）を用いて行った。ｐＧ３−２およびｐ
Ｇ１−１０の配列をもとにマウス膵β細胞株ＭＩＮ６由
来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａの塩基配列（配列番号：２７）およびこれにコードさ
れるアミノ酸配列（配列番号：２２）を〔図６〕に示し
た。下線で示した部分は合成プライマーに相当する部分
である。決定した塩基配列〔図６〕をもとにホモロジー
検索を行なった結果、得られたｃＤＮＡ断片が新規Ｇ蛋
白質共役型レセプター蛋白質をコードすることが分かっ
た。それをさらに確認するために、ＤＮＡＳＩＳ（日立
システムエンジニアリング社）を用い、塩基配列をアミ
ノ酸配列に変換した後〔図６〕、疎水性プロットを行な
ったところ、６個の疎水性領域の存在が確認できた〔図
８〕。また、アミノ酸配列を実施例２で得たｐ１９Ｐ２
と比較したところ、〔図７〕に示すとおり高い相同性を
見いだした。その結果、ｐＧ３−２およびｐＧ１−１０
にコードされるマウス膵β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質
共役型レセプター蛋白質とヒト下垂体由来ｐ１９Ｐ２に
コードされるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質は由来す
る動物種は異なるが、同一のリガンドを認識するレセプ
ター蛋白質であることが強く示唆された。

【００８２】

【実施例５】ヒト下垂体由来ｃＤＮＡライブラリーから
のレセプター蛋白質の全コード領域を含むｃＤＮＡのク
ローニングヒト下垂体由来ｃＤＮＡライブラリーとしては、クロー
ンテック社製のλｇｔ１１ファージベクターを使ったラ
イブラリーを用いた（クローンテック、ＣＬＨＬ１１３
９ｂ）。２×１０⁶ｐｆｕ（プラーク・フォーミング・
ユニット）分のヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリーを、硫
酸マグネシウムで処理した大腸菌Ｙ１０９０^-と混ぜ、
３７℃、１５分間インキュベートした後、０.５％アガ
ロース（ファルマシア社）ＬＢを加え、１.５％寒天
（和光純薬社）ＬＢプレート(５０μg/ml Ampicilin含
有）に播いた。プラークのできたプレートにニトロセル
ロースフィルターを置き、フィルター上にプラークを転
写した。このフィルターをアルカリ処理することによっ
て変性させた後、８０℃、３時間の加熱によってＤＮＡ
の固定を行った。このフィルターを、５０％ formamid
e，５×ＳＳＰＥ，５× Denhardt's溶液，０.１％ＳＤ
Ｓ，１００μg/ml salmon sperm ＤＮＡを含むバッファ
ー中で以下に述べるプローブと４２℃で一晩インキュベ
ートし、ハイブリダイズさせた。プローブとしては、実
施例２で得られたプラスミドｐ１９Ｐ２に挿入されたＤ
ＮＡ断片をＥｃｏＲＩで切断し、回収後、ランダムプラ
イムＤＮＡラベリングキット（アマシャム社）を用いて
〔³²Ｐ〕ｄＣＴＰ（デュポン社）を取り込ませることに
よって標識して用いた。洗浄は、２×ＳＳＣ，０.１％
ＳＤＳで５５℃、１時間行い、その後、−８０℃でオー
トラジオグラフィを行ってハイブリダイズするプラーク
を検出した。

【００８３】このスクリーニングにより、３個の独立し
たプラークにハイブリダイゼーションのシグナルが認め
られた。この３個のクローンからそれぞれＤＮＡを調製
し、ＥｃｏＲＩで消化したものをアガロース電気泳動
後、スクリーニングに用いたものと同じプローブを用い
て、サザンブロットにより解析を行ったところ、各々約
０.７ｋｂ，０.８ｋｂ，２.０ｋｂのところにそれぞれ
ハイブリダイズするバンドを生じ、このうち約２.０ｋ
ｂのバンドを生じるもの（λｈＧＲ３）を選択した。λ
ｈＧＲ３のハイブリダイズするサイズのＥｃｏＲＩ断片
をプラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩサイトにサブクロ
ーニングした後、このプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を
形質転換し、形質転換体Ｅ.ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐ
ｈＧＲ３を得た。このプラスミドｐｈＧＲ３を、実施例
２で示された塩基配列から予想される制限酵素地図をも
とにして制限酵素地図を作製したところ、実施例２で示
されるレセプター蛋白質をコードするＤＮＡから予想さ
れるレセプター蛋白質の全長をコードするＤＮＡを保持
していることが分かった。

【００８４】

【実施例６】ヒト下垂体由来レセプター蛋白質ｃＤＮＡ
の塩基配列の決定実施例５で得られたプラスミドｐｈＧＲ３に挿入したＥ
ｃｏＲＩ断片のうち、レセプター蛋白質をコードしてい
ると考えられるＥｃｏＲＩサイトからＮｈｅＩサイトま
での約１３３０ｂｐの塩基配列を決定した。具体的に
は、ＥｃｏＲＩ断片中に存在する制限酵素サイトを利用
して、不必要な部分を除き、または必要な断片をサブク
ローニングし、配列解析のための鋳型プラスミドを調製
した。塩基配列決定のための反応は Dye Deoxy Termina
tor Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ社）を用いて行い、
蛍光式ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社）を用いて解読
し、データー解析にはＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェア
エンジニアリング社）を使用した。ｐｈＧＲ３のコード
するＥｃｏＲＩサイト直後からＮｈｅＩサイトまでの塩
基配列を〔図９〕に示した。そして、ヒト下垂体由来レ
セプタータンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列は、
〔図９〕の塩基配列の第１１８番目〜第１２２７番目の
塩基配列（配列番号：２６）に対応する。そして、これ
にコードされるレセプター蛋白質のアミノ酸配列は配列
番号：２１で表わされるアミノ酸配列であることが分か
った。

【００８５】

【実施例７】ヒト下垂体由来レセプター蛋白質をコード
するｐｈＧＲ３を用いたノーザンハイブリダイゼーショ
ン実施例５で得られたプラスミドｐｈＧＲ３にコードされ
るヒト下垂体由来レセプター蛋白質の下垂体での発現を
ｍＲＮＡレベルで検出するため、ノーザンブロットを行
った。ｍＲＮＡとしてはヒト下垂体ｍＲＮＡ（クローン
テック社）２.５μｇを用い、プローブは実施例５で用
いたものと同じものを用いた。また、ノーザンブロット
用のフィルターは、Nylon membrane（Pall Biodyne, U.
S.A.）を用い、ｍＲＮＡの泳動フィルターへの吸い上げ
は Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laborator
y Press （1989）の方法に従って作製した。ハイブリダ
イゼーションは、上に述べたフィルターとプローブを５
０％ formamide，５×ＳＳＰＥ，５×Denhardt's溶液，
０.１％ＳＤＳ，１００μg/ml salmon sperm ＤＮＡを
含むバッファー中で、４２℃一晩インキュベートした。
フィルターの洗浄は０.１×ＳＳＣ，０.１％ＳＤＳで５
０℃にて行い、風乾後３日間−８０℃でＸ線フィルム
（ＸＡＲ５，コダック）に感光させた。その結果を〔図
１０〕に示した。〔図１０〕から、ｐｈＧＲ３がコード
するレセプター遺伝子はヒト下垂体で発現していると考
えられる。

【００８６】

【実施例８】ＭＩＮ６由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法に
よる受容体ｃＤＮＡの増幅と塩基配列の決定実施例３でマウス膵β細胞株ＭＩＮ６より調製したｃＤ
ＮＡ５μｌを鋳型として使用し、実施例４で合成したL
ibert, F.ら（Science 244:569-572, 1989）に記載され
ている合成ＤＮＡプライマー、すなわち、５'−ＣＴＧ
ＴＧ（ＣまたはＴ）Ｇ（ＣまたはＴ）（ＧまたはＣ）Ａ
Ｔ（ＣまたはＴ）ＧＣＩＩＴ（ＧまたはＴ）ＧＡ（Ｃま
たはＴ）（ＡまたはＣ）Ｇ（ＧまたはＣ）ＴＡＣ−３'
（配列番号：３
１）〔Ｉはイノシンを示す。〕で表される合成プライマーお
よび５'−Ａ（ＧまたはＴ）Ｇ（ＡまたはＴ）ＡＧ（Ａ
またはＴ）ＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＩ（Ｇまた
はＣ）（ＡまたはＧ）（ＣまたはＴ）ＧＡＡ−３'（配
列番号：３２）〔Ｉをイノシンを示す。〕で表される合成プライマーを
用いて、実施例１と同条件でＰＣＲ法を行った。得られ
たＰＣＲ産物は実施例２に記載の方法と同様にして、プ
ラスミドベクターｐＣＲ^TMIIにサブクローニングし、プ
ラスミドｐ５Ｓ３８を得た。このプラスミドで大腸菌Ｊ
Ｍ１０９を形質転換し、形質転換体エシェリヒアコリ
（Escherichia coli)ＪＭ１０９／ｐ５Ｓ３８を得た。

【００８７】塩基配列の決定のための反応は DyeDeoxy
Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ社）を用い
て行い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、得ら
れた塩基配列の情報はＤＮＡＳＩＳ（日立システムエン
ジニアリング社）を用いて行った。ｐ５Ｓ３８の配列を
もとにマウス膵β細胞株ＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列（配列
番号：２８）およびこれにコードされるアミノ酸配列
（配列番号：２３）を〔図１２〕に示した。下線で示し
た部分は合成プライマーに相当する部分である。決定し
た塩基配列〔図１２〕をもとにホモロジー検索を行なっ
た結果、得られたｃＤＮＡ断片が新規Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質をコードすることが分かった。それをさ
らに確認するために、ＤＮＡＳＩＳ（日立システムエン
ジニアリング社）を用い、塩基配列をアミノ酸配列に変
換した後〔図１２〕、疎水性プロットを行なったとこ
ろ、４個の疎水性領域の存在が確認できた〔図１４〕。
また、アミノ酸配列を実施例２で得たｐ１９Ｐ２および
実施例４で得たｐＧ３−２と比較したところ、〔図１
３〕に示すとおり高い相同性を見いだした。その結果、
ｐ５Ｓ３８にコードされるマウス膵β細胞株ＭＩＮ６由
来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質とｐ１９Ｐ２にコー
ドされるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質は、由来する動物種は異なるが、同一のリガンドを認
識するレセプター蛋白質であることが強く示唆された。
また、ｐ５Ｓ３８にコードされるマウス膵β細胞株ＭＩ
Ｎ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質とｐＧ３−２
およびｐＧ１−１０にコードされるマウス膵β細胞株Ｍ
ＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は、同一の
リガンドを認識するレセプター蛋白質であり、互いに近
縁なレセプター蛋白質（いわゆる、サブタイプ）である
ことが示唆された。

【００８８】

【実施例９】ｐｈＧＲ３発現ＣＨＯ細胞の作製ヒト下垂体由来レセプター蛋白質の全長アミノ酸配列を
コードするcDNAを組み込んだプラスミドｐｈＧＲ３（実
施例５）を制限酵素Nco I で切断し、アガロースゲル電
気泳動後に約1kbの断片を回収した。回収した断片の両
端をDNA blunting kit（宝酒造）を用いて平滑化した
後、Sal Iリンカーを付加しさらにSal Iで処理した後、
pUC119のSal I siteに組み込んでプラスミドS10を得
た。S10をSalIおよびSac IIで処理することにより約700
bpの断片（N末端側のコード領域を含む）を調製した。
次にｐｈＧＲ３よりSac II およびNhe I で切り出され
る約700bpの断片（終始コドンを含むＣ末端側コード領
域を含む）を調製した。これらの２つの断片をSal Iお
よびNhe I処理した動物細胞発現用ベクタープラスミド
ｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Biochim. Biophys. Acta, Hinu
ma, S., et al. 1219巻、251-259頁、1994年記載のpAKK
O1.11Hと同一のベクタープラスミド）に加えてligation
を行い全長レセプター蛋白質発現用プラスミドｐＡＫＫ
Ｏ−１９Ｐ２を構築した。ｐＡＫＫＯ−１９Ｐ２で形
質転換した大腸菌を培養後、ＱＵＩＡＧＥＮ Maxiによ
って大量にｐＡＫＫＯ−１９Ｐ２のプラスミドＤＮＡを
調製した。そのうち20μｇのプラスミドＤＮＡを1mlの
滅菌ＰＢＳに溶解した後、ジーントランスファー（和光
純薬）のバイアルに入れ、十分にボルテックスを行うこ
とによってリポソームの形成を行わせた。24時間前に直
径10cmシャーレに1×10⁶個ずつ継代し、直前に新鮮な培
地に交換したＣＨＯdhfr^-細胞に125μlのリポソーム溶
液を添加し、一晩培養した。新鮮な培地に交換してさら
に一日培養した後、選択培地に交換して１日間培養し
た。形質転換体を効率良く選別するために、低細胞密度
で継代を行い、選択培地中で増殖してくる細胞のみを選
択し、全長レセプター蛋白質発現CHO細胞株ＣＨＯ−１
９Ｐ２を樹立した。

【００８９】

【実施例１０】ＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株での全長レセプ
ター蛋白質の発現量の転写レベルでの確認 Fast Track kit (Invitrogen社）を用い、キットの処方
にしたがってｐＡＫＫＯ−１９Ｐ２を導入して形質転換
したＣＨＯ細胞とｍｏｃｋＣＨＯ細胞からpoly(A)⁺RN
Aを調製した。このpoly(A)⁺RNAを0.02μｇ用い、RNA PC
R Kit (宝酒造）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。用
いたプライマーの種類はrandom 9merで、反応液の全容
量は40μlとした。また、ｃＤＮＡ合成のネガティブコ
ントロールとして、リバーストランスクリプターゼを添
加しない反応液も準備した。最初、30℃で10分間のイン
キュベートを行ってプライマーからの伸長反応をある程
度行わせた。その後、42℃で３０分間インキュベートし
て十分に逆転写反応を進行させ、99℃で５分間加熱して
酵素を失活し、さらに5℃で５分間冷却した。逆転写反
応終了後に反応液の一部を回収し、蒸留水で希釈した
後、フェノール／クロロフォルム抽出、ジエチルエーテ
ル抽出を行った。これをエタノール沈殿し、一定量の蒸
留水に溶解したものをｃＤＮＡの試料とした。このｃＤ
ＮＡ溶液およびプラスミドＤＮＡ（ｐＡＫＫＯ−１９Ｐ
２）を段階的に希釈したものを作成し、全長レセプター
蛋白質に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。
全長レセプター蛋白質のコード領域の塩基配列に基づい
て作成したプライマーの配列は、５’側がＣＴＧＡＣＴ
ＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＧＣ（配列番号：３
３）、３’側がＡＡＣＡＣＣＧＡＣＡＣＡＴＡＧＡＣＧ
ＧＴＧＡＣＣ（配列番号：３４）である。ＰＣＲ反応
は、プライマー各1μMおよびTaq DNA polymerase (宝酒
造）0.5μl、酵素に添付の反応バッファーおよびdNTPs
と10μlの鋳型ＤＮＡ（ｃＤＮＡあるいはプラスミド溶
液）を用いて全容量100μlで行った。最初に94℃で２分
間熱処理を行って鋳型ＤＮＡの変性を十分に行った後
に、95℃で30秒、65℃で30秒、72℃で60秒のサイクルを
25回行った。反応終了後に10μlの反応液を用いてアガ
ロースゲル電気泳動を行い増幅産物の検出および量的な
比較を行った。その結果全長レセプター蛋白質をコード
するｃＤＮＡの配列から推定される大きさ（400bp）の
ＰＣＲ産物が、検出された〔図１５〕。リバーストラン
スクリプターゼを添加しなかった逆転写反応産物を鋳型
として用いたＰＣＲ反応液のレーンに特異的なバンドは
検出されず、ＣＨＯ細胞のゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲ産
物である可能性は除外され、また、ｍｏｃｋ細胞のレー
ンにも特異的なバンドが出現しないことから、ＣＨＯ細
胞にもとから発現しているｍＲＮＡ由来ではないことが
確認された〔図１５〕。

【００９０】

【実施例１１】ラット全脳抽出液に含まれるＣＨＯ−１
９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を
促進する活性の検出ラット全脳よりペプチド粗画分を以下の方法で調整し
た。屠殺後、直ちに摘出したラット全脳を液体窒素にて
凍結、-80℃にて保存した。凍結保存したラット全脳20g
(ラット10匹分)を細かく砕き、蒸留水80mlで10分間煮沸
した。煮沸後、氷上にて急冷し、終濃度 1.0M となるよ
う酢酸を4.7ml加え、ポリトロン(20,000rpm、6min)を用
いてホモジナイズした。ホモジェネートは、一晩撹拌し
た後、遠心(10,000rpm、20min)により上清をとり、沈殿
物を1.0M酢酸40mlでホモジナイズし遠心にて再度上清を
得た。上清をまとめ、3倍量のアセトンを加え、氷上に3
0分間放置した後遠心(10,000rpm、20min)にて上清を回
収した。回収したアセトン上清は、エバポレーションに
て脱アセトン、濃縮を行った。濃縮された脱アセトン上
清に、2倍量の0.05%トリフルオロ酢酸(TFA)/H₂Oを加
え、ガラス製カラムに詰めた逆相C18カラム(Prep C18 1
25Å 10ml：ミリポア)に添加した。上清を添加後、0.05
%TFA/H₂O でカラムを洗浄、10%、20%、30%、40%、50%、
60% CH₃CN/0.05%TFA/H₂O で段階的に溶出し、それぞれ
の画分を10等分して凍結乾燥した。1匹分の全脳由来の
乾燥標品を、ジメチルスルホキシド(DMSO)20μlにて溶
解し、0.05%ウシ血清アルブミン(BSA)を加えたハンクス
氏液(HBSS)1mlに懸濁し、ペプチド粗画分とした。全長
レセプター蛋白質発現CHO細胞およびｍｏｃｋＣＨＯ
細胞を、24well plateに0.5x10⁵cells/wellで播種し、2
4時間培養後、[³H]アラキドン酸を0.25μCi/well とな
るよう添加した。[³H]アラキドン酸添加16時間後、細胞
を0.05%BSAを含むHBSSで洗浄、上述のペプチド粗画分を
400μl/wellで添加した。37℃で30分間インキュベート
した後に、反応液400μl中300μlをシンチレーター4ml
に加え、反応液中に遊離された[³H]アラキドン酸代謝物
の量をシンチレーション・カウンターによりモニターし
た。その結果、30%CH₃CNの溶出画分に全長レセプター蛋
白質発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−１９Ｐ２）特異的なアラ
キドン酸代謝物遊離活性が検出された〔図１６〕。

【００９１】

【実施例１２】ウシ視床下部抽出液に含まれるＣＨＯ−
１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離
を促進する活性の検出実施例１１と同様の方法でウシ視床下部を含む脳組織片
360g(10頭分)よりペプチド粗画分を調製した。0.5頭分
由来の乾燥ペプチド標品を40μlのDMSO に溶解し、0.05
%BSAを含む2mlのHBSSに懸濁し、実施例１１と同様の方
法でアラキドン酸代謝物遊離活性の検出を試みた。その
結果、ウシ視床下部ペプチド粗画分のC18カラム30%CH₃C
N溶出画分に、ＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にア
ラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検出された
〔図１７〕。

【００９２】

【実施例１３】ウシ視床下部からのＣＨＯ−１９Ｐ２細
胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する
活性物質(ペプチド)の精製ＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的アラキドン酸代謝物
の遊離を促進する活性物質についてウシ視床下部から精
製した代表例を以下に具体的に述べる。視床下部を含む
凍結脳組織片4.0kg(80頭分)を小片化し、蒸留水8.0L中
で20分間煮沸した。氷上にて急冷した後、終濃度1.0Mと
なるように酢酸540mlを加え、ポリトロン(10,000rpm、1
2min)にてホモジナイズした。ホモジェネートを一晩撹
拌した後、遠心(9,500rpm、20min)にて上清を得た。沈
殿物は1.0M酢酸4.0Lに懸濁し、ポリトロンにてホモジナ
イズし遠心にて再度上清を得た。上清を一つにまとめ、
終濃度0.05%となるようにTFAを加え、ガラス製カラムに
詰めた逆相C18カラム(PrepC18 125Å 160ml:ミリポア)
に添加した。添加後、0.05%TFA/H₂0 320ml でカラムを
洗浄後、10%、30%、50% CH₃CN/0.05%TFA/H₂O で3段階に
溶出した。30% CH₃CN/0.05%TFA/H₂O 溶出画分に２倍量
の 20mM CH₃COONH₄/H₂O を加え、陽イオン交換カラム H
iPrep CM-Sepharose FF (Pharmacia)に添加した。20mM
CH₃COONH₄/10% CH₃CN/H₂O でカラムを洗浄後、100mM、
200mM、500mM、1000mM CH₃COONH₄/10%CH₃CN/H₂O で４段
階に溶出した。200mM CH₃COONH₄ 溶出画分にＣＨＯ−１
９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を
促進する活性が見いだされたので、この溶出画分に３倍
量のアセトンを加え、遠心して除タンパク質を行った
後、エバポレーションによる濃縮を行った。濃縮された
画分にTFA(終濃度0.1%)を加えた後さらに酢酸を加えて
pH4に調製し、逆相カラム RESOURCE RPC 3ml(Pharmaci
a)に添加した。15%-30% CH₃CN 濃度勾配による溶出で、
19%-21% CH₃CN の画分にＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特
異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検出
された。RESOURCE RPC の活性画分を凍結乾燥後、DMSO
で溶解したのち、50mM MES pH5.0/10% CH₃CN に懸濁
し、陽イオン交換カラム RESOURCE S 1ml(Pharmacia)に
添加した。0M-0.7M NaCl 濃度勾配による溶出で、0.32M
-0.46MNaCl の画分にＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異
的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検出さ
れた。RESOURCE S の活性画分を凍結乾燥後、DMSOに溶
解したのち、0.1%TFA/H₂O に懸濁し、逆相カラム C18 2
18TP5415(Vydac) に添加した。20%-30% CH₃CN 濃度勾配
による溶出で、22.5%、23%、23.5% CH₃CN の３つの画分
（活性画分をそれぞれP-1、P-2、P-3とする）にそれぞ
れＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代
謝物の遊離を促進する活性が検出された〔図１８〕。３
つに分離した活性のうちの 23.5% CH₃CN の画分（p-3)
を凍結乾燥後、DMSOで溶解したのち、0.1%TFA/H₂O に懸
濁し、逆相カラム diphenyl 219TP5415(Vydac) に添加
した。22%-25% CH₃CN 濃度勾配による溶出で、23% CH₃C
N で溶出される１つのピークにＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株
から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性
は収束した〔図１９〕。逆相カラムdiphenyl 219TP5415
で活性と一致したピークの画分を凍結乾燥後、0.1%TFA
/H₂O に懸濁し、逆相カラム μRPC C2/C18 SC 2.1/10(P
harmacia) に添加した。22%-23.5% CH₃CN 濃度勾配によ
る溶出で 23.0% と 23.2% CH₃CN で溶出される二つのピ
ークにそれぞれＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にア
ラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検出された
〔図２０〕。

【００９３】

【実施例１４】ウシ視床下部から精製したＣＨＯ−１９
Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促
進する活性ペプチドのアミノ酸配列決定実施例１３で精製されたＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特
異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性ペプチ
ド(P-3)のアミノ酸配列の決定を行った。逆相カラム μ
RPC C2/C18 SC 2.1/10 で活性と一致したピークの画分
を凍結乾燥後、70% CH₃CN 20μl に溶解し、ペプチドシ
ークエンサー(ABI.491) によるアミノ酸配列の分析を行
った。その結果、配列番号：３が得られた。ただし、７
番目と１９番目の配列はアミノ酸配列の分析のみでは決
定されていない。

【００９４】

【実施例１５】ウシ視床下部からのＣＨＯ-１９Ｐ２細
胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する
活性物質（ペプチド）の精製実施例１３において Vydac Ｃ１８２１８ＴＰ５４１５
で分離された３つの活性のうち２３.０％ＣＨ₃ＣＮの
活性画分（Ｐ-２）のさらなる精製を行った。この活性
画分を凍結乾燥後、DMSOで溶解したのち０.１％ＴＦＡ
／蒸留水に懸濁し、逆相カラムdiphenyl ２１９ＴＰ５
４１５（Vydac）に添加した。２１.０％−２４.０％Ｃ
Ｈ₃ＣＮ濃度勾配による溶出で、２１.９％ＣＨ₃ＣＮで
溶出される一つのピークにＣＨＯ-１９Ｐ２細胞株から
特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検
出された。この画分を凍結乾燥後、DMSOで溶解したのち
０.１％ＴＦＡ／蒸留水に懸濁し、逆相カラムμＲＰＣ
Ｃ２／Ｃ１８ＳＣ２.１／１０（Pharmacia）に添加
した。２１.５％−２３.０％ＣＨ₃ＣＮ濃度勾配による
溶出で、２２.０％ＣＨ₃ＣＮで溶出される一つのピー
クにＣＨＯ-１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸
代謝物の遊離を促進する活性が収束した〔図２１〕。

【００９５】

【実施例１６】ウシ視床下部から精製されたＣＨＯ-１
９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を
促進するペプチド（Ｐ-２）のアミノ酸配列決定実施例１５で精製されたＣＨＯ-１９Ｐ２細胞株から特
異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進するペプチド
（Ｐ-２）のアミノ酸配列の決定を行った。逆相カラム
μＲＰＣＣ２／Ｃ１８ＳＣ２.１／１０で活性と一致
したピークの画分を凍結乾燥後、７０％ＣＨ₃ＣＮ２
０μｌに溶解し、ペプチドシークエンサー（ＡＢＩ，４
９２）によるアミノ酸配列の分析を行った（配列番号：
４）。

【００９６】

【実施例１７】ウシ視床下部からの poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画
分の調製およびｃＤＮＡの合成ウシ１頭分の視床下部より Isogen（ニッポンジーン
社）により total ＲＮＡを調製後、FastTrack（Invitr
ogen社）を用いて poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分を調製した。次
にこの poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分１μｇから、３' ＲＡＣＥ
system（GIBCO BRL）および Marathon cDNA amplifica
tion kit（Clontech）により、マニュアルに従ってｃＤ
ＮＡを合成し、それぞれ２０および１０μｌに溶解し
た。

【００９７】

【実施例１８】実施例１４で明らかとなったアミノ酸配
列部分をコードするｃＤＮＡの取得実施例１４で明らかとなったアミノ酸配列を含むポリペ
プチドをコードするｃＤＮＡを取得するため、まず配列
番号：１をコードする塩基配列の取得をめざした。そこ
でプライマーＰ５-１（配列番号：３５）、Ｐ３-１（配
列番号：３６）、Ｐ３-２（配列番号：３７）を合成し
た（配列表においてＩはイノシンを示す）。実施例１７
で３' ＲＡＣＥ system を用いて調製したｃＤＮＡ０.
５μｌを鋳型として、ＤＮＡ polymerase としてＥＸＴ
aq（宝酒造）を用い、添付のバッファー２.５μｌ、ｄ
ＮＴＰ２００μＭと、プライマーＰ５-１，Ｐ３-１を
それぞれ２００ｎＭとなるように加え水で２５μｌとし
て、９４℃・１分後、９８℃・１０秒、５０℃・３０
秒、６８℃・１０秒のサイクルを３０回繰り返した。こ
の反応液をトリシン・ＥＤＴＡバッファーで５０倍に希
釈したもの２.５μｌを鋳型として、プライマーをＰ５-
１とＰ３-２に組み合わせに換え、その他は同じ条件で
反応を行った。サーマルサイクラーは GeneAmp9600（パ
ーキンエルマー社）を用いた。増幅産物を４％アガロー
ス電気泳動、エチジウムブロマイド染色し約７０ｂｐ
のバンドを切り出し、熱融解、フェノール抽出、エタノ
ール沈殿した。回収したＤＮＡをＴＡクローニングキッ
ト（Invitrogen）のマニュアルに従い、プラスミドベク
ターｐＣＲ^TMIIへサブクローニングした。これを大腸菌
ＪＭ１０９に導入して、得られた形質転換体をアンピシ
リンを含むＬＢ培地で培養後、自動プラスミド抽出器
（クラボウ）でプラスミドを調製した。このプラスミド
を Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ）で
マニュアルに従い反応し、蛍光自動ＤＮＡシーケンサー
（ＡＢＩ）により解読した。その結果〔図２２〕に示す
配列が得られ、これが配列番号：１をコードする塩基配
列の一部であることを確認した。

【００９８】

【実施例１９】実施例１８で明らかになった配列を用い
てのＲＡＣＥ法による生理活性ポリペプチドｃＤＮＡの
取得まず５'側の配列を増幅する（５’ＲＡＣＥ）のために
〔図２２〕に示した配列を利用してＰＥ（配列番号：３
８）とＰＤＮ（配列番号：３９）の２本のプライマーを
合成した。実施例１７で Marathon cDNA amplification
kit により調製したｃＤＮＡをトリシン・ＥＤＴＡバ
ッファーで１００倍に希釈したもの２.５μｌを鋳型と
して、実施例２と同様の方法で反応液を調製し、キット
添付のアダプタープライマーＡＰ１とＰＥの組み合わせ
で、９４℃・１分後、９８℃・１０秒、６８℃・５分の
サイクルを３０回繰り返した。さらにこの反応液をトリ
シン・ＥＤＴＡバッファーで５０倍に希釈したもの２.
５μｌを鋳型として、プライマーをＡＰ１とＰＤＮの組
み合わせに換え、９４℃・１分後、９８℃・１０秒、７
２℃・５分のサイクルを４回、９８℃・１０秒、７０℃
・５分のサイクルを４回、９８℃・１０秒、６８℃・５
分のサイクルを２６回繰り返した。増幅産物を１.２％
アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色し約１
５０ｂｐのバンドを切り出し、遠心濾過チューブ（ミ
リポア社）で遠心濾過後、フェノール抽出、エタノール
沈殿した。回収したＤＮＡをＴＡクローニングキット
（Invitrogen）のマニュアルに従い、プラスミドベクタ
ーｐＣＲ^TMIIへサブクローニングした。これを大腸菌Ｊ
Ｍ１０９に導入して、得られた形質転換体を実施例１８
と同様の方法で挿入されたｃＤＮＡ断片の配列を解析し
た。その結果、〔図２３〕に示す配列が得られた。さら
にこの配列を基にプライマーＦＢ（配列番号：４０），
ＦＣ（配列番号：４１）を合成し、３'側の配列取得を
行った（３’ＲＡＣＥ）。鋳型は５’ＲＡＣＥと同じも
のを同量用い、キット添付のアダプタープライマーＡＰ
１とＦＣの組み合わせで、９４℃・１分後、９８℃・１
０秒、７２℃・５分のサイクルを５回、９８℃・１０
秒、７０℃・５分のサイクルを５回、９８℃・１０秒、
６８℃・５分のサイクルを２５回繰り返した。さらにこ
の反応液をトリシン・ＥＤＴＡバッファーで５０倍に希
釈したもの２.５μｌを鋳型として、プライマーを、や
はりキット添付のＡＰ２とＦＢの組み合わせに換え、９
４℃・１分後、９８℃・１０秒、７２℃・５分のサイク
ルを４回、９８℃・１０秒、７０℃・５分のサイクルを
４回、９８℃・１０秒、６８℃・５分のサイクルを２７
回繰り返した。増幅産物を１.２％アガロース電気泳
動、エチジウムブロマイド染色し約４００ｂｐのバン
ドを切り出し、５’ＲＡＣＥのときと同様の方法でＤＮ
Ａを回収した。このＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐ
ＣＲ^TMIIへサブクローニング後、大腸菌ＪＭ１０９に導
入して、得られた形質転換体に挿入されたｃＤＮＡ断片
の配列を解析した。５'および３’ＲＡＣＥの結果か
ら、配列番号：１に示した生理活性ポリペプチドの全コ
ード領域をコードするｃＤＮＡ配列〔図２４〕を得た。
具体的には、図２４（ａ）および（ｂ）において、第１
３４番目の塩基がＧのものであって、第１８４番目の塩
基がＴおよびＣのもの、第２４５番目の塩基がＴおよび
Ｃのものが得られた。図２４に示したｃＤＮＡは９８ア
ミノ酸からなるポリペプチドをコードしていた。第１か
ら第２２番目のアミノ酸が疎水的なアミノ酸が集合して
いることと実施例１４に示したように活性ペプチドのＮ
末端が第２３番目のSerから始まっていることを考え合
わせると、第１から２２番目のアミノ酸は分泌シグナル
の配列であると推定された。一方、ポリペプチドの第５
４番目から５７番目に存在するGlyArgArgArg配列は生理
活性ペプチドが切断される場合に存在する典型的なアミ
ノ酸配列モチーフであることが分かった。またこの切断
モチーフの場合にはGlyが存在するためしばしば生成す
るペプチドのＣ末端はアミド化されることが知られてい
る。実施例１４のP-3のＮ末端配列および実施例１６のP
-2のＮ末端配列情報とこのGlyArgArgArg配列を考え合わ
せるとこのｃＤＮＡにコードされるポリペプチドから切
り出されてくる生理活性ペプチドの少なくとも一部は配
列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：
６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９もしく
は配列番号：１０であると考えられた。

【００９９】

【実施例２０】ＰＣＲ法によるウシ型生理活性ポリペプ
チドｃＤＮＡの全コード領域を含むＤＮＡ断片の取得実施例１７で Marathon cDNA amplification kit によ
り調製したｃＤＮＡを鋳型として生理活性ポリペプチド
ｃＤＮＡの全コード領域を含むＤＮＡ断片の取得を行っ
た。まず実施例１９で明らかとなったｃＤＮＡの配列を
基に、配列番号：４２、配列番号：４３で表される塩基
配列を有するプライマーを２本合成した。ＢＯＶＦ５'-ＧＴＧＴＣＧＡＣＧＡＡＴＧＡＡＧＧＣＧＧＴＧＧ
ＧＧＧＣＣＴＧＧＣ-３'
（配列番号：４２）ＢＯＶＲ（２４ｍｅｒ）５'-ＡＧＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＴＴＡＴＴＣＣＴＧＧＡ
Ｃ-３'（配列番号：４３）ＢＯＶＦは生理活性ポリペプチドｃＤＮＡのスタートコ
ドンを含み、制限酵素ＳａｌＩ部位を付加した−２〜＋
２２（スタートコドンＡＴＧのＡを＋１とする）に対応
するセンス配列で、ＢＯＶＲは生理活性ポリペプチドｃ
ＤＮＡのストップコドンを含む＋２８５〜＋３０９に対
応するアンチセンス配列である。ＰＣＲ反応は実施例１
７で Marathon cDNA amplification kit により調製し
たｃＤＮＡをトリシン・ＥＤＴＡバッファーで１００倍
に希釈したもの２.５μｌを鋳型として、実施例２と同
様の方法で反応液を調製し、９４℃・１分後、９８℃・
１０秒、７２℃・５分のサイクルを３回、９８℃・１０
秒、７０℃・５分のサイクルを３回、９８℃・１０秒、
６８℃・５分のサイクルを２７回繰り返した。増幅産物
を２％アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色
し約３２０ｂｐのバンドを切り出し、実施例３と同様
の方法でＤＮＡを回収、プラスミドベクターｐＣＲ^TMII
へサブクローニングした。これを大腸菌ＪＭ１０９に導
入して、形質転換体エシェリヒアコリ(Escherichia c
oli)ＪＭ１０９／ｐＢＯＶ３を得た。得られた形質転換
体に挿入されたｃＤＮＡ断片の配列を解析した。その結
果このＤＮＡ断片は生理活性ポリペプチドｃＤＮＡの全
コード領域を含む断片であることが確認された。

【０１００】

【実施例２１】Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-
Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gl
y-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH₂（１９Ｐ
２−Ｌ３１）の合成。１）Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Ala-His(Bom)-Gln-His(Bom)-Se
r(Bzl)-Met-Glu(OcHex)-Ile-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Pro-As
p(OcHex)-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp(CHO)-Tyr(Br-Z)-Ala-Gl
y-Arg(Tos)-Gly-Ile-Arg(Tos)-Pro-Val-Gly-Arg(Tos)-P
he-pMBHA-resinの合成。市販ｐ−メチルＢＨＡ樹脂（アプライドバイオシテム
ズ、現パ−キンエルマ−社製）0.71g(0.5 m mole)をペ
プチド合成機（アプライドバイオシテムズ社製４３０
Ａ）の反応器に入れ、ＤＣＭで膨潤させた後、最初のア
ミノ酸Boc-PheをHOBt/DCC法で活性化しｐ−メチルＢＨ
Ａ樹脂に導入した。樹脂を50%ＴＦＡ／ＤＣＭで処理
し、Boc基を除去してアミノ基を遊離させ、DIEAで中和
した。このアミノ基に次のアミノ酸Boc-Arg(Tos)をHOBt
/DCC法で縮合した。未反応アミノ基の有無をニンヒドリ
ンテストで調べ反応完了を確認後同様に、Boc-Gly、Boc-
Val、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ile、Boc-Gly、Boc-Arg(T
os)、Boc-Gly、Boc-Ala、Boc-Tyr(Br-Z)を順次縮合、ニン
ヒドリンテストで縮合が不十分であると判明したBoc-Al
a、 Boc-Tyr(Br-Z)は再縮合し反応を完了した。樹脂を乾
燥して半量の樹脂を取り出した残りに、Boc-Trp(CHO)、B
oc-Ala、Boc-Pro、Boc-Asn、Boc-Ile、Boc-Asp(OcHex)、Boc-
Pro、Boc-Thr(Bzl)、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ile、Boc-Glu(OcHe
x)、Boc-Met、Boc-Ser(Bzl)、Boc-His(Bom)、Boc-Gln、Boc-H
is(Bom)、Boc-Ala、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ser(Bzl)を同様に
ニンヒドリンテストで十分な縮合が得られるまで再縮合
をくり返した。１９Ｐ２−Ｌ３１の全配列アミノ酸が導
入され樹脂を50%ＴＦＡ／ＤＣＭで処理し樹脂上のBoc基
を除去後、樹脂を乾燥し1.28gのペプチド樹脂を合成し
た。２）Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Th
r-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-
Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH₂（１９Ｐ２−Ｌ３
１）の合成。１）で得た樹脂をｐ−クレゾール3.8g、1、4-ブタンジチ
オ−ル１ml、弗化水素10mlと共にテフロン製弗化水素反
応装置中で０℃ ６０分間反応した。弗化水素、1、4-ブ
タンジチオ−ル１mlを減圧留去し、残留物にジエチルエ
ーテル100mlを加え撹袢後、グラスフィルター上に濾
取、乾燥した。これを50%酢酸水溶液50ml中に懸濁、撹
袢し、ペプチドを抽出した後樹脂と分離し減圧下に約５
mlまでに濃縮した後、セファデックスG-25（２ｘ９０ｃ
ｍ）のカラムに付し50%酢酸水で展開し114 ml〜181 ml
の画分を集め凍結乾燥し、１９Ｐ２−Ｌ３１を含む白色
粉末290 ｍｇを得た。これをLiChroprep RP-18（ＭＥＲ
ＣＫ社製）を充填した逆相系カラムにつけ0.1% ＴＦＡ
水と0.1% ＴＦＡ含有3０％アセトニトリル水溶液を用
いたグラジエント溶出での精製をくり返し、アセトニト
リル濃度２５％前後に溶出される部分を集め凍結乾燥
し、白色粉末７１ｍｇを得た。質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺ ３５７４．６４５ＨＰＬＣ溶出時間１８．２分カラム条件カラム： Wakosil ５Ｃ１８（４．６ｘ１００ｍｍ）溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水）Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分）流速： 1.0 ｍｌ／分

【０１０１】

【実施例２２】Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met(O)-G
lu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala
-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH₂（１９
Ｐ２−Ｌ３１（Ｏ））の合成。合成１９Ｐ２−Ｌ３１６ｍｇを５％−酢酸水溶液２０
ｍｌに溶解し３０％−過酸化水素水４０μｌを加えMet
部分のみを酸化し、反応終了後直ちにLiChroprep RP-18
（ＭＥＲＣＫ社製）を充填した逆相系カラムにつけて精
製し目的物５．８ｍｇをえた。質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺ ３５９０．５３１ＨＰＬＣ溶出時間１７．９分カラム条件カラム： Wakosil ５Ｃ１８（４．６ｘ１００ｍｍ）溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水）Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分）流速： 1.0 ｍｌ／分

【０１０２】

【実施例２３】Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-
Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH
₂（１９Ｐ２−Ｌ２０）の合成。実施例２１の１）でBoc-Tyr(Br-Z)までを縮合した樹脂
にさらにBoc-Trp(CHO)、Boc-Ala、Boc-Pro、Boc-Asn、Boc-I
le、Boc-Asp(OcHex)、Boc-Pro、Boc-Thr(Bzl)を同様に縮合
し、 Boc-Thr(Bzl)-Pro-Asp(OcHex)-Ile-Asn-Pro-Ala-T
rp(CHO)-Tyr(Br-Z)-Ala-Gly-Arg(Tos)-Gly-Ile-Arg(To
s)-Pro-Val-Gly-Arg(Tos)-Phe-pMBHA-resin１．１４ｇ
を得た。これを実施例２１の２）と同様に弗化水素処
理、カラム精製し、白色粉末６０ｍｇを得た。質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺ ２２４２．１４９ＨＰＬＣ溶出時間１０．４分カラム条件カラム： Wakosil ５Ｃ１８（４．６ｘ１００ｍｍ）溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ含有１５％アセトニトリル水）Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有４５％アセトニトリル水）を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（１５分）流速： 1.0 ｍｌ／分

【０１０３】

【実施例２４】合成ペプチド（１９Ｐ２−Ｌ３１）によ
るアラキドン酸代謝物遊離活性の測定実施例１１と同様に、実施例２１で合成されたペプチド
（１９Ｐ２−Ｌ３１）によるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株か
らの特異的なアラキドン酸代謝物の遊離を測定した。合
成ペプチドは、脱気処理した蒸留水に１０^-3Ｍの濃度で
溶解し、０．０５％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで希釈して、
それぞれの濃度におけるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株からの
アラキドン酸代謝物の遊離を［³Ｈ］アラキドン酸代謝
物の量を指標に測定した。その結果、１０^-12Ｍ〜１０
^-6Ｍで濃度依存的なアラキドン酸代謝物遊離の活性が検
出された〔図２５〕。さらに、実施例２２で合成された
１９Ｐ２−Ｌ３１のメチオニン酸化体であるペプチド１
９Ｐ２−Ｌ３１（Ｏ）について１９Ｐ２−Ｌ３１とのア
ラキドン酸代謝物遊離活性の比較を行った結果、〔図２
６〕に示すように１９Ｐ２−Ｌ３１（Ｏ）は１９Ｐ２−
Ｌ３１と同等の活性を示すことが分かった。

【０１０４】

【実施例２５】合成ペプチド（１９Ｐ２−Ｌ２０）によ
るアラキドン酸代謝物遊離活性の測定実施例１１と同様に、実施例２３で合成された天然品Ｐ
−２に相当するペプチド（１９Ｐ２−Ｌ２０）によるＣ
ＨＯ−１９Ｐ２細胞株からの特異的なアラキドン酸代謝
物の遊離を測定した。合成ペプチドは、脱気処理した蒸
留水に１０^-3Ｍの濃度で溶解し、０．０５％ＢＳＡを含
むＨＢＳＳで希釈して、それぞれの濃度におけるＣＨＯ
−１９Ｐ２細胞株からのアラキドン酸代謝物の遊離を［
³Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を指標に測定した。その
結果、１０^-12〜１０^-6Ｍで濃度依存的なアラキドン酸
代謝物遊離の活性が１９Ｐ２−Ｌ３１とほぼ同程度に検
出された〔図２７〕。

【０１０５】

【実施例２６】ウシゲノムＤＮＡにおけるコード領域の
塩基配列の解析 pBOV3を制限酵素EcoRIで消化し、アガロースゲル電気泳
動で分離した後、cDNA断片部分のDNAを回収してプローブ
を調製した。これをマルチプライムＤＮＡラベリングキ
ット（アマシャム社）を用いて³²Ｐ標識した。クローニ
ングベクターEMBL3 SP6/T7を用いて構築したBovine Gen
omic Library (CLONTECH社 BL1015j)の約2.0x10⁶個のフ
ァージを大腸菌K802を宿主としてＬＢ寒天培地プレート
に播種し、一晩培養してプラークを形成させた。これを
ニトロセルロースフィルターに転写し、アルカリ変性、
中和処理を行った後、熱処理（80℃、2時間)によってＤ
ＮＡを固定化した。このフィルターを５０％ホルムアミ
ドを含むハイブリバッファー（50％formamide、5ｘDenh
ardt's溶液、4ｘSSPE、0.1mg/ml Salmon spermＤＮＡ、
0.1%SDS)中で標識プローブと４２℃で一晩インキュベー
ションし、ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーシ
ョン後のフィルターを室温で2ｘSSC、0.1%SDS中で１．
５時間洗浄した後、さらに５５℃の同バッファー中で３
０分間洗浄した。プローブとハイブリダイズするクロー
ンの検出は、コダック社のＸ線フィルム(X-OMAT^TMAR)と
増感スクリーンを用い、−８０℃で４日間の露光によっ
て行った。Ｘ線フィルムを現像した後、フィルムとプレ
ートの位置を対応させながらハイブリダイズしている部
分のファージを回収した。さらに上記の方法によって再
プレーティングとハイブリダイゼーションを繰り返して
行い、ファージのクローン化を行った。クローン化した
ファージをプレートライセート法によって大量に調製
し、ファージＤＮＡを抽出した後、ベクターのクローニ
ングサイトの両端に存在する制限酵素SalIおよびBamHI
切断部位で切断してウシゲノムDNA由来の挿入断片の検
出を１．２％アガロースゲル電気泳動によって行った
〔図２８〕。その結果、BamHI消化では３本の断片がフ
ァージ由来のバンドの他に検出された。また、SalI消化
ではファージ由来のバンドに重なって１本のバンドが検
出された。SalI消化断片が全長を保持していると考え、
この断片をプラスミドベクターにサブクローニングする
ために、SalI消化後にBAP(大腸菌由来のアルカリフォス
フォターゼ）処理したプラスミドベクターpUC18（ファ
ルマシア社）とライゲーション反応を行い、大腸菌JM10
9に導入した。この菌からゲノム由来のSalI断片が挿入
されたプラスミドＤＮＡを大量に調製し、パーキンエル
マー・アプライドバイオシステムズ社の370A蛍光式シー
ケンサーおよび同社のキットを用いてコード領域付近の
塩基配列の解析を行った。その結果、〔図２９〕に示す
ような配列が得られた。ｃＤＮＡのコード領域と比較す
ると、ゲノムＤＮＡ由来であるために472bpのイントロ
ンによってコード領域が２つに分割されている〔図３
０〕。〔図３１〕および配列番号：４４には、このウシ
のゲノムのコード領域（イントロン部分を除いたもの）
から推定されるアミノ酸配列を示す。

【０１０６】

【実施例２７】ラット延髄背側部poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分
の調製およびｃＤＮＡの合成ラットの延髄背側部よりIsogen（ニッポンジーン社）に
よりtotal ＲＮＡを調製後、FastTrack（Invitrogen
社）を用いてpoly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分を調製した。次にこ
のpoly(Ａ)⁺ＲＮＡ５μｇにプライマーとしてランダム
ＤＮＡヘキサマー（ＢＲＬ社）を加え、モロニーマウス
白血病の逆転写酵素（ＢＲＬ社）により、添付バッファ
ーを用いて相補ＤＮＡを合成した。反応後の産物はエタ
ノール沈殿を行った後、１２μｌの蒸留水に溶解した。
またこのpoly(Ａ)⁺ＲＮＡ１μｇから、Marathon ｃＤ
ＮＡ amplification kit（Clontech）により、マニュア
ルに従ってｃＤＮＡを合成し、１０μｌに溶解した。

【０１０７】

【実施例２８】ＲＡＣＥ法によるラット型生理活性ポリ
ペプチドのｃＤＮＡの取得ラット型生理活性ポリペプチドｃＤＮＡの全コード領域
を取得するため、ウシ型を取得した方法に準じて実験を
行った。まず実施例１８で使用したプライマーＰ５−１
（配列番号：３５）、Ｐ３−１（配列番号：３６）をプ
ライマーとし、鋳型には実施例２７でプライマーとして
ランダムＤＮＡヘキサマー（ＢＲＬ社）を加え、モロニ
ーマウス白血病の逆転写酵素（ＢＲＬ社）により合成し
た相補ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。反応液は鋳
型ｃＤＮＡを１.２５μｌ、ｄＮＴＰ２００μＭ，プラ
イマーを各１μＭ，ＤＮＡ polymeraseとしてExTaq（宝
酒造）を用い、添付のバッファー２.５μｌを加えて、
さらに水で全量を２５μｌとした。反応は９４℃・１分
後、９８℃・１０秒、５０℃・３０秒、７２℃・５秒の
サイクルを４０回繰り返した後、７２℃で２０秒放置し
た。サーマルサイクラーはGeneAmp2400（パーキンエル
マー社）を用いた。増幅産物を４％アガロース電気泳
動、エチジウムブロマイド染色し約８０ｂｐのバンドを
切り出し、実施例１９に示した方法でＤＮＡを回収、プ
ラスミドベクターｐＣＲ^TMIIへサブクローニング、大腸
菌ＪＭ１０９へ導入し挿入されたｃＤＮＡ断片の配列を
解析した。その結果ラット型生理活性ポリペプチドの部
分配列を得ることができた。この配列を基に３' ＲＡＣ
Ｅ用にＲＡ（配列番号：７５），５' ＲＡＣＥ用にＲＣ
（配列番号：７６）の２本のプライマーを合成し、５'
および３' ＲＡＣＥを行った。ＲＡ：５'−ＣＡＲＣＡＹＴＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＡ
ＧＡＡＣＣＣＣ−３'（ここでＲはＡまたはＧ、ＹはＴ
またはＣを示す。）（配列番号：７５）ＲＣ：５'−ＴＡＣＣＡＧＧＣＡＧＧＡＴＴＧＡＴＡＣ
ＡＧＧＧＧ−３'（配列番号：７６）鋳型は実施例２７でMarathon ｃＤＮＡ amplification
kit（Clontech）により合成したものを添付のトリシン
−ＥＤＴＡバッファーで４０倍に希釈したもの２.５μ
ｌを使用した。プライマーには３' ＲＡＣＥにはＲＡと
キット付属のアダプタープライマーＡＰ１を、また５'
ＲＡＣＥにはＲＣとＡＰ１をそれぞれ用いたほかは上記
と同様に反応液を調製した。反応条件は９４℃・１分
後、９８℃・１０秒、７２℃・４５秒のサイクルを５
回、９８℃・１０秒、７０℃・４５秒のサイクルを３
回、９８℃・１０秒、６８℃・４５秒のサイクルを４０
回繰り返した。その結果３' ＲＡＣＥからは約４００ｂ
ｐ、５' ＲＡＣＥからは約４００ｂｐと２５０ｂｐのバ
ンドが得られた。これらを上記と同様の方法で回収し、
これらを鋳型として反応に用いたプライマーでDye Term
inator Cycle SequencingKit（ＡＢＩ）により反応し配
列を解析した。その結果５'ノンコーディング領域と推
定される部分からpolyＡまでの配列を得ることができ
た。

【０１０８】

【実施例２９】ＰＣＲによるラット型生理活性ポリペプ
チドの全長ｃＤＮＡの取得実施例２８で得られた配列を基に開始コドンを含む領域
にｒＦ（配列番号：７７）、また終止コドンより３'側
にｒＲ（配列番号：７８）の２本のプライマーを合成し
全長ｃＤＮＡを含む断片を増幅することとした。ｒＦ：５'−ＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＧ
ＧＡＧＣＡＴ−３'（配列番号：７７）ｒＲ：５'−ＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＧＴ
ＡＧＡＧＧＡ−３'（配列番号：７８）実施例２７でモロニーマウス白血病の逆転写酵素を用い
て調製したｃＤＮＡを鋳型とし、ExTaq（宝酒造）を用
いて、９５℃・３０秒、６８℃・６０秒のサイクルを４
０回繰り返してＰＣＲを行った。増幅産物をアガロース
電気泳動、エチジウムブロマイド染色し約３５０ｂｐの
バンドを切り出し、実施例１９に示した方法でＤＮＡを
回収、プラスミドベクターｐＣＲ^TMIIへサブクローニン
グ、大腸菌ＪＭ１０９へ導入した。生じた形質転換体か
らプラスミドを抽出し、塩基配列を決定した結果、ラッ
ト型生理活性ポリペプチドの全長ｃＤＮＡを保有するE.
coli ＪＭ１０９／ｐＲＡＶ３を得た〔図３２〕。

【０１０９】

【実施例３０】ヒト Brain poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分からの
ｃＤＮＡの合成ヒト Brain poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分（Clontech）１μｇか
ら、Marathon ｃＤＮＡ amplification kit（Clontec
h）により、マニュアルに従ってｃＤＮＡを合成し、１
０μｌに溶解した。また同poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分５μｇ
にプライマーとしてランダムＤＮＡヘキサマー（ＢＲＬ
社）を加え、モロニーマウス白血病の逆転写酵素（ＢＲ
Ｌ社）により、添付バッファーを用いて相補ＤＮＡを合
成した。反応後の産物はエタノール沈殿を行った後、３
０μｌのＴＥに溶解した。

【０１１０】

【実施例３１】ＲＡＣＥ法によるヒト型生理活性ポリペ
プチドのｃＤＮＡの取得実施例２８で明らかになったラット型生理活性ポリペプ
チドのアミノ酸配列から〔図３３〕に示したように特に
ラット型とウシ型で保存性の高かった領域を選び以下の
Ｒ１（配列番号：７９）、Ｒ３（配列番号：８０）、
Ｒ４（配列番号：８１）の３本のプライマーを合成し、
ヒトのｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲをすることによりこ
れらに挟まれた領域の増幅を試みた。ここで、図３３に
おいてbovine.aaはウシ型ポリペプチドのアミノ酸配
列、bovine.seqはウシ型ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａの塩基配列、rat.seqはラット型ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡの塩基配列を示す。Ｒ１：５’−ＡＣＧＴＧＧＣＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣ
ＴＧＣ−３’（配列番号：７９）Ｒ３：５’−ＧＣＣＴＧＡＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＴ
ＧＴＡＣＣＡ−３’（配列番号：８０）Ｒ４：５’−ＴＴＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＧＡＡ
ＧＣＧＧＣＣＣ−３’（配列番号：８１）実施例３０でMarathon ｃＤＮＡ amplification kit（C
lontech）により調製したｃＤＮＡをトリシン−ＥＤＴ
Ａバッファーで３０倍に希釈したもの２.５μｌを鋳型
として使用した。反応液はｄＮＴＰ２００μＭ，プライ
マーをＲ１とＲ４を各０.２μＭ，Taq Start Antibody
（Clontech）と等量混合したＤＮＡ polymerase ExTaq
（宝酒造）を用い、添付のバッファー２.５μｌを加え
て、さらに水で全量を２５μｌとした。反応は９４℃・
１分後、９８℃・１０秒、６８℃・４０秒のサイクルを
４２回繰り返した後、７２℃で１分間放置した。さらに
この反応液をトリシン−ＥＤＴＡバッファーで１００倍
に希釈したもの１μｌを鋳型として、プライマーの組み
合わせをＲ１とＲ３に変えた以外は上記と同様の反応液
を調製して９４℃・１分後、９８℃・１０秒、６８℃・
４０秒のサイクルを２５回繰り返した。増幅産物を４％
アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色したと
ころ、期待される約１３０ｂｐのバンドが得られたた
め、これを実施例２８と同様の方法で回収し、その回収
した断片を鋳型として、Dye Terminator Cycle Sequenc
ing Kit（ＡＢＩ）を用いて反応し配列を解析した結
果、ヒト型生理活性ポリペプチドの部分配列を得ること
ができた。そこでこの配列を基に３'ＲＡＣＥ用にプラ
イマーＨＡ（配列番号：８２），ＨＢ（配列番号：８
３）を、５' ＲＡＣＥ用にプライマーＨＥ（配列番号：
８４），ＨＦ（配列番号：８５）を合成し、５'および
３' ＲＡＣＥを行った。ＨＡ：５'−ＧＧＣＧＧＧＧＧＣＴＧＣＡＡＧＴＣＧＴ
ＡＣＣＣＡＴＣＧ−３'（配列番号：８２）ＨＢ：５'−ＣＧＧＣＡＣＴＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＣ
ＧＣＡＣＣＣＣＴ−３'（配列番号：８３）ＨＥ：５'−ＣＡＧＧＣＡＧＧＡＴＴＧＡＴＧＴＣＡＧ
ＧＧＧＴＧＣＧＧ−３'（配列番号：８４）ＨＦ：５'−ＣＡＴＧＧＡＧＴＧＣＣＧＡＴＧＧＧＴＡ
ＣＧＡＣＴＴＧＣ−３'（配列番号：８５）鋳型は実施例３０で調製したものをトリシン−ＥＤＴＡ
バッファーで２０倍に希釈したもの２.５μｌを使用し
た。１回目のＰＣＲは３' ＲＡＣＥにはＨＡとアダプタ
ープライマーＡＰ１を、５' ＲＡＣＥにはＨＥとＡＰ１
を用いこれまでと同様に反応液を調製した。反応条件は
９４℃・１分後、９８℃・１０秒、７２℃・３５秒のサ
イクルを５回、９８℃・１０秒、７０℃・３５秒のサイ
クルを５回、９８℃・１０秒、６８℃・３５秒のサイク
ルを４０回繰り返した。さらにこの反応液をトリシン−
ＥＤＴＡバッファーで１００倍に希釈したもの１μｌを
鋳型として、１回目の反応サイクルと同じサイクルで２
回目のＰＣＲを行った。ただし３' ＲＡＣＥはプライマ
ーをＨＢとＡＰ１に、５' ＲＡＣＥはＨＦとＡＰ２に変
え、またＤＮＡ polymeraseとしてKlen Taq(Clontech)
を使用し、添付のバッファーで反応液を調製した。その
結果、３' ＲＡＣＥでは約２５０ｂｐのバンドまた５'
ＲＡＣＥでは約１５０ｂｐのバンドが得られ、これらを
上記と同様の方法で配列を読み、先に得られた部分配列
と併せてヒト型生理活性ポリペプチドの、５'ノンコー
ディング領域と推定される部分からpolyＡまでの配列を
得ることができた。

【０１１１】

【実施例３２】ＰＣＲ法によるヒト型生理活性ポリペプ
チドの全長ｃＤＮＡの取得実施例３１で得られた配列を基に５Ｈ（配列番号：８
６）と３ＨＮ（配列番号：８７）の２本のプライマーを
合成し全長ｃＤＮＡを含む断片を増幅することとした。５Ｈ：５'−ＧＧＣＣＴＣＣＴＣＧＧＡＧＧＡＧＣＣＡ
ＡＧＧＧＡＴＧＡ−３'（配列番号：８６）３ＨＮ：５'−ＧＧＧＡＡＡＧＧＡＧＣＣＣＧＡＡＧＧ
ＡＧＡＧＧＡＧＡＧ−３'（配列番号：８７）実施例３０でモロニーマウス白血病の逆転写酵素（ＢＲ
Ｌ社）を用いて調製したｃＤＮＡ２.５μｌを鋳型と
し、Klen Taq ＤＮＡ polymerase（Clontech）を用いた
反応液で、９４℃・１分後、９８℃・１０秒、６８℃・
３０秒のサイクルを４０回繰り返した。得られた約３６
０ｂｐの断片を実施例２９と同様の方法で、回収、サブ
クローニング（ただし、ベクターはｐＣＲ^TM２.１を用
いた。）、プラスミド回収し、塩基配列を決定した結
果、ヒト型生理活性ポリペプチドの全長ｃＤＮＡを保有
するE. coli ＪＭ１０９／ｐＨＯＶ７を得た〔図３
４〕。またこのヒト型生理活性ポリペプチドと実施例２
０に示したウシ型、および実施例２９に示したラット型
の翻訳領域についてアミノ酸配列を比較した〔図３
５〕。

【０１１２】

【実施例３３】（１）ＵＨＲ−１発現ＣＨＯ細胞の作製最近、Susan K. Welchらによってラット視交叉上核より
オーファンレセプターであるＵＨＲ−１がクローニング
されている（Biochemical and Biophysical Research C
ommunications, Vol.209, No.2, pp.606-613, 1995）。
本発明者らは、この報告をもとにＵＨＲ−１遺伝子によ
りコードされる蛋白質のアミノ酸配列とｈＧＲ３により
コードされる蛋白質のアミノ酸配列の比較を行った。そ
の結果、両者は３５９アミノ酸にわたり９１.６％のア
イデンティティーを有することから、ＵＨＲ−１はｐｈ
ＧＲ３のホモログであることが推定された。ＵＨＲ−１
によりコードされる蛋白が１９Ｐ２−Ｌ３１のレセプタ
ーとして機能することを確認するために以下に述べるよ
うに、本発明者らはＵＨＲ−１ｃＤＮＡをクローニン
グし、それをＣＨＯ細胞に導入して安定的な発現細胞株
を作製した。ラットの下垂体前葉からＦａｓｔＴｒａ
ｃｋ^TM ｋｉｔ（Invitrogen社）を用いて抽出した poly
(Ａ)⁺ＲＮＡを調製した。次に、得られた poly(Ａ)⁺Ｒ
ＮＡ０.２μgを鋳型とし、ＴａＫａＲａＲＮＡＰＣＲ
ｋｉｔ（宝酒造）を用いて全量４０μｌの反応スケー
ルでｃＤＮＡを合成した。反応産物は、フェノール：ク
ロロホルム（１：１）で抽出し、エタノール沈澱を行っ
た後、１０μｌの蒸留水に溶解した。既知のラット・Ｕ
ＨＲ−１ｃＤＮＡの塩基配列(GenBank, Accession Nu
mber Ｓ７７８６７）をもとに、以下に示す２種の合成
ＤＮＡプライマーを作成した。（１）５'−ＧＴＴＣＡＣＡＧ（ＧＴＣＧＡＣ）ＡＴＧ
ＡＣＣＴＣＡＣ−３'（括弧内はＳａｌＩ認識配列を示
す）（配列番号：９５）（２）５’−ＣＴＣＡＧＡ（ＧＣＴＡＧＣ）ＡＧＡＧＴ
ＧＴＣＡＴＣＡＧ−３’（括弧内はＮｈｅＩ認識配列を
示す）（配列番号：９６）上記のプライマー（１）と（２）を一組として用いて、
上述の方法で合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行
った。反応には、調製したｃＤＮＡ溶液を５倍に希釈し
たものを５μｌ、Ex Taq（宝酒造）とTaq Start Antibo
dy（クロンテック）を１：１で混合したものを１μｌ、
Ex Taqに添付の１０×反応バッファーを５μｌおよびｄ
ＮＴＰを４μｌ、５０μＭの濃度に調製したプライマー
を各１μｌ使用し、蒸留水にて液量を５０μｌに調製し
た。ＰＣＲは、９５℃・２分ののち、９５℃・３０秒、
６５℃・３０秒、７２℃・１分の３ステップを１サイク
ルとして２７回繰り返して行い、その後に７２℃・７分
の伸長反応を加えた。反応終了後に、反応液の一部を用
いてアガロースゲル電気泳動を行った。エチジウムブロ
マイド染色し約１.１ｋｂｐのバンドを切り出し、遠心
濾過チューブ（ミリポア社）で遠心濾過し、フェノール
抽出次いでエタノール沈澱を行ってＤＮＡを回収した。
回収したＤＮＡをＴＡクローニングキット（Invitrogen
社）のマニュアルに従い、プラスミドベクターｐＣＲ^TM
IIへサブクローニングし（以下、ｐＣＲII−ＵＨＲ−１
と称する）、大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた形質
転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地で培養後、自動プ
ラスミド抽出器（クラボウ社）でプラスミドを得た。こ
のプラスミドをABI PRISM Dye Terminator Cycle Seque
ncing kit，FS（パーキンエルマー社）を用い、マニュ
アルに従い反応させ、塩基配列を蛍光自動ＤＮＡシーケ
ンサー（ＡＢＩ社）により解読した。塩基配列の解析の
結果、ＰＣＲによって入手したｃＤＮＡ断片は１１１６
ｂｐから成ることが確認された〔図５２〕。〔図５２〕
は、発現ベクターｐＡＫＫＯ−ＵＨＲ−１上で構築され
たラット・ＵＨＲ−１の完全なコード領域の塩基配列
と、それにコードされるアミノ酸配列を示す。図中、ア
ンダーラインを付したprimer(1),(2)は、それぞれのプ
ライマー配列の一部に相当する部分を示す。また、二重
線は公知の塩基配列と異なる部分を示す（６６４番目の
Ｃ、８６５番目のＧ、８９７番目のＧ）。ここで、公知
の塩基配列はデータバンクGenBank Accession No. Ｓ７
７８６７を引用したものである。これらの塩基置換のう
ち、一つは²⁸⁹Ｌｅｕ（ＣＴＣ）→²⁸⁹Ｖａｌ（ＧＴＣ）
のアミノ酸置換を伴うものであった。ＵＨＲ−１発現ベ
クターの構築は以下の様にして行った。ｐＣＲII−ＵＨ
Ｒ−１を制限酵素ＮｈｅＩ（宝酒造）およびＳａｌＩ
（宝酒造）で切断した。切断したサンプルをアガロース
ゲル電気泳動した後エチジウムブロマイド染色し、その
バンド部分をカミソリで切り出した。このゲル断片をフ
ィルター付き遠心チューブ（ミリポア）に入れ、冷凍庫
内で凍結、その後に室温にて融解させた後、チューブを
８０００回転で１分間遠心して、フィルターの下部にＤ
ＮＡ断片を含む溶液を溶出させた。この溶液を、定法に
従ってフェノール抽出、フェノール・クロロホルム
（１：１）抽出、ジエチルエーテル抽出して不純物を除
去した後、エタノール沈澱によってＤＮＡを沈澱させｃ
ＤＮＡ断片を得た。ｐＡＫＫＯ−１１１Ｈを制限酵素Ｎ
ｈｅＩ（宝酒造）およびＳａｌＩ（宝酒造）で切断した
後、上述と同様の方法によりベクター部分をアガロース
ゲルから分離、抽出した。こうして得られたｃＤＮＡ断
片とｐＡＫＫＯ−１１１Ｈの制限酵素消化物をライゲー
ション・システム（宝酒造）を用い、１６℃で３０分反
応させた。ライゲーション反応産物の一部を用いて、大
腸菌ＪＭ１０９を形質転換させ、形質転換体Escherichi
a coli ＪＭ１０９／ｐＡＫＫＯ−ＵＨＲ−１を得た。
得られた形質転換体Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐ
ＡＫＫＯ−ＵＨＲ−１をアンピシリン（５０μg/ml）を
含むＬＢ培地２ml中で一晩培養し、プラスミド自動抽出
装置（クラボウ社）によってプラスミドＤＮＡ（ｐＡＫ
ＫＯ−ＵＨＲ−１）を調製した。蛍光式シーケンサーを
用いて、ｃＤＮＡ断片とｐＡＫＫＯ−１１１Ｈの連結部
位の塩基配列を解析し、発現ベクターｐＡＫＫＯ−ＵＨ
Ｒ−１の構築が完了したことを確認した。（２）ＣＨＯｄｈｆｒ^-細胞へのＵＨＲ−１発現ベクタ
ーの導入直径１０cmの組織培養用シャーレに１×１０⁶個のＣＨ
Ｏｄｈｆｒ^-細胞を播種し、２４時間培養した。（１）
で得られたＵＨＲ−１発現ベクターｐＡＫＫＯ−ＵＨＲ
−１を２０μｇ用い、リポソーム法による遺伝子導入キ
ット（ジーントランスファー、ニッポンジーン社）を用
いて、ＤＮＡ・リポソームの複合体を形成させた。培地
を新鮮なものに交換し、これにＤＮＡ・リポソームの複
合体を添加して一晩インキュベートした。培地を新鮮な
ものと交換してさらに１日間培養した後、形質転換体選
択用の培地に交換して２日間培養した。さらに、トリプ
シン−ＥＤＴＡ処理によってシャーレ内の細胞を回収
し、細胞密度が希薄な状態にて再培養を行うことによっ
て、形質転換体の割合の増加を図った。これにより、Ｕ
ＨＲ−１を安定に高発現する細胞株ＣＨＯ−ＵＨＲ−１
のクローンを得た。

【０１１３】

【実施例３４】１９Ｐ２−Ｌ３１の¹²⁵Ｉによる標識お
よび標識体を用いたレセプター結合実験１９Ｐ２−Ｌ３１のヨードラベル化は〔¹²⁵Ｉ〕−Bolto
n−Hunter Reagent（NEN/DuPont；NEX-120）を用いて行
った。まず、〔¹²⁵Ｉ〕−Bolton−Hunter Reagent（２
２００Ci/mmol）２００μlを５００μlエッペンドルフ
チューブに移し、窒素ガスにて完全に乾燥させた。アセ
トニトリル２μlにて再溶解し、さらに５０mMリン酸バ
ッファーｐＨ８.０４μl、合成１９Ｐ２−Ｌ３１３×
１０^-4Ｍ４μlを加え、混和し、室温にて４０分間反応
させた。反応後、１.０Ｍグリシン５μlを加えて反応を
停止し、反応液全量を逆相カラム（TOSO；TSKgel ODS−
80TMCTP）にかけ、〔¹²⁵Ｉ〕標識１９Ｐ２−Ｌ３１（〔
¹²⁵Ｉ〕−１９Ｐ２−Ｌ３１）を分離した。〔¹²⁵Ｉ〕−
１９Ｐ２−Ｌ３１を含む画分は、２倍量の５０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌｐＨ７.５、０.１％ＢＳＡ、０.０５％Ｃ
ＨＡＰＳにて希釈し、少量ずつ分注の後、−２０℃にて
保存した。レセプター結合実験ではレセプター発現ＣＨ
Ｏ細胞としてＣＨＯ−１９Ｐ２−９、ＣＨＯ−ＵＨＲ−
１およびｍｏｃｋＣＨＯを用いた。ＣＨＯ−１９Ｐ２
−９細胞はＣＨＯ−１９Ｐ２細胞を９６穴マイクロプレ
ートを用いた限界希釈法により、１９Ｐ２−Ｌ３１によ
るアラキドン酸代謝物の遊離促進反応がより強いクロー
ンとして選択したものである。ｍｏｃｋＣＨＯ細胞
は、発現ベクターｐＡＫＫＯ単独でトランスフォームし
たコントロール細胞である。組織培養用フラスコで培養
したこれらの細胞を５mM ＥＤＴＡ／ＰＢＳにて剥離
し、０.０５％ＢＳＡ、０.０５％ＣＨＡＰＳを含むＨＢ
ＳＳに０.５×１０⁷cells/mlとなるよう再懸濁した。こ
の細胞浮遊液１００μlに、〔¹²⁵Ｉ〕−１９Ｐ２−Ｌ３
１を２００pMとなるように、さらに一部の細胞浮遊液に
はＮＳＢ（non specific binding；非特異的結合）とし
て１９Ｐ２−Ｌ３１を２００nMとなるように追加し、室
温にて２.５時間反応させた。反応後、ガラスフィルタ
ーＧＦ／Ｆ（Wattman）を用いて、Ｂ／Ｆ分離を行い、
フィルターにトラップされたカウントをレセプター結合
量としてγ−カウンターにて測定した。〔図３６〕に
は、生細胞における〔¹²⁵Ｉ〕−１９Ｐ２−Ｌ３１を用
いたレセプター結合実験の結果を示す。細胞浮遊液０.
５×１０⁷cells/ml １００μlに〔¹²⁵Ｉ〕−１９Ｐ２−
Ｌ３１を２００pMとなるように加え、室温２.５時間の
反応でレセプターに結合した〔¹²⁵Ｉ〕−１９Ｐ２−Ｌ
３１の量および非特異的結合量をγ−カウンターで測定
した。実験はtriplicateで行い、その平均値および標準
偏差を示した。ｈＧＲ３とＵＨＲ−１を発現させたＣＨ
Ｏ細胞において、〔¹²⁵Ｉ〕−１９Ｐ２−Ｌ３１の特異
的結合が観察された。これらの結果はｈＧＲ３およびＵ
ＨＲ−１によってコードされる蛋白質が１９Ｐ２−Ｌ３
１の特異的なレセプターとして機能していることを示し
ている。

【０１１４】

【実施例３５】１９Ｐ２−Ｌ３１によるＣＨＯ−１９Ｐ
２−９およびＣＨＯ−ＵＨＲ１からの特異的なアラキド
ン酸代謝物の遊離促進実施例１１と同様の方法でＣＨＯ−１９Ｐ２−９、ＣＨ
Ｏ−ＵＨＲ１およびｍｏｃｋＣＨＯにおける１９Ｐ２
−Ｌ３１によるアラキドン酸代謝物遊離活性を測定し
た。〔図３７〕にはＣＨＯ−１９Ｐ２−９およびＣＨＯ
−ＵＨＲ１における１９Ｐ２−Ｌ３１によるアラキドン
酸代謝物遊離活性の測定結果を示す。実験はduplicate
で行い、その平均値を示した。ＵＨＲ１を発現させたＣ
ＨＯ細胞でも、ＣＨＯ−１９Ｐ２−９と同様の１９Ｐ２
−Ｌ３１によるアラキドン酸代謝物遊離の活性が確認さ
れた。これらの結果はＵＨＲ−１によってコードされる
蛋白質がｈＧＲ３と同様に１９Ｐ２−Ｌ３１の特異的な
レセプターとして機能していることを示している。

【０１１５】

【実施例３６】ＲＴ−ＰＣＲによるラット組織のリガン
ドポリペプチドおよびラット型Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー（ＵＨＲ−１）の発現定量（１）ラットの組織からの poly(Ａ)⁺ＲＮＡ調製８週齢のラット（♂）より各種組織の poly(Ａ)⁺ＲＮＡ
を、Ｉｓｏｇｅｎ（Nippon gene）による total ＲＮＡ
調製に引き続き、オリゴｄＴセルロースカラム（Pharma
cia）を用いて約５〜３０μg調製した。poly(Ａ)⁺ＲＮ
Ａ画分中の genome ＤＮＡを完全に除くため、ＤＮａｓ
ｅＩ（Gibco BRL. amplification grade）を１ユニット
用いて室温でＤＮＡを分解した。２５mM ＥＤＴＡを加
え、６５℃で１０分処理し、ＤＮａｓｅＩを不活性化し
た。水で４０ng/μlに希釈し、その１６０ngから１０ユ
ニットＡＭＶ reverse transcriptase XL（Takara），
２．５μＭｒａｎｄｏｍ９ｍｅｒ（Takara、終濃度
２.５μＭ），１０ｍＭ Tris-HCl（pH 8.3），０．４ｍ
Ｍの各ｄＮＴＰを用いてｃＤＮＡを合成した。合成反応
は３０℃・１０分の後、４２℃・３０分、９９℃・５
分、５℃・５分とした。反応産物をエタノール沈殿しト
リシン−ＥＤＴＡバッファーで４０μlに溶解した（４n
g poly(Ａ)⁺ＲＮＡ/μl）。（２）ポジティブコントロール用プラスミドベクターの
調製ラットのグリセロールアルデヒド−３−リン酸−脱水素
酵素（Ｇ３ＰＤＨ，GenBank accession number Ｍ１７
７０１）は、ＦａｓｔＴｒａｃｋ（Invitrogen）で調製
したラット下垂体由来細胞株ＧＨ３の poly(Ａ)⁺ＲＮＡ
から、上記（１）と同様の方法で合成したｃＤＮＡを鋳
型として、Clontech社のＧ３ＰＤＨ増幅用プライマーセ
ットを用いてＰＣＲ法で増幅させた。ＵＨＲ−１はやは
りＧＨ３のｃＤＮＡを鋳型として、ｒＲＥＣＦ：５'−ＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＡＴＴＣＴＣ
ＣＴＧＴＣＴＴＡＣ−３'（配列番号：８８）と、ｒＲＥＣＲ：５'−ＧＧＧＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＡ
ＧＡＡＧＧＴＴＧＡ−３'（配列番号：８９）を用いて増幅し、ＴＡクローニングキット(Invitrogen)
のｐＣＲ^TM２.１ベクターへサブクローニングして得
た。これらを大腸菌ＪＭ１０９に導入して形質転換体を
得た。またリガンドペプチドはＪＭ１０９／ｐＲＡＶ３
として寄託したものを用いた。これらの形質転換体はア
ンピシリンを含むＬＢ培地で培養後、ＱｉａｇｅｎＰ
ｌａｓｍｉｄＭｉｄｉｋｉｔ（QIAGEN）でプラスミ
ドを精製し、吸光度により濃度を定量してポジティブコ
ントロール用プラスミドベクターとした。（３）ＲＴ−ＰＣＲ上記（１）および（２）で調製したｃＤＮＡ溶液および
ポジティブコントロール用プラスミドベクターをそのま
まあるいは適当な濃度に水で希釈して鋳型とした。Ｇ３
ＰＤＨ，ＵＨＲ−１およびリガンドペプチド増幅用プラ
イマーは、それぞれClontech社のＧ３ＰＤＨ増幅用プラ
イマーセット、ｒＲＥＣＦとｒＲＥＣＲ、ｒ１９Ｆ：５'−ＧＡＡＧＡＣＧＧＡＧＣＡＴＧＧＣＣ
ＣＴＧＡＡＧＡＣ−３'（配列番号：９０）と、ｒ１９Ｒ：５'−ＧＧＣＡＧＣＴＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡ
ＡＧＴＣＣＡＧＴ−３'（配列番号：９１）を終濃度２００nMで使用した。反応液は希釈した鋳型４
μｌ、各２００ｎＭプライマー、ｄＮＴＰ（終濃度各１
００μＭ）、ＤＮＡ polymeraseとしてＫｌｅｎＴａｑ
（Clontech）を用い、KlenTaq添付のバッファーと水で
２５μlとした。反応はＧ３ＰＤＨは９４℃・１分の
後、９８℃・１０秒、６５℃・２０秒、７２℃・４０秒
のサイクルを２６回、ＵＨＲ−１とリガンドペプチドは
９４℃・１分の後、９８℃・１０秒、６８℃・２５秒の
サイクルを３４回繰り返した。増幅産物をあらかじめエ
チジウムブロマイド染色した１.２％あるいは４％のア
ガロースゲルを用いて電気泳動し、得られた泳動図をＣ
ＣＤカメラ（FOTODYNE，Foto/Ecrips）で取り込み、解
析ソフト（Advanced American Biotechnology）でバン
ドの濃さを数値化、定量した。定量値はＧ３ＰＤＨは４
ng poly(Ａ)⁺ＲＮＡあたりのpgで、またＵＨＲ−１とリ
ガンドペプチドは４ng poly(Ａ)⁺ＲＮＡあたりのpgおよ
びその値をＧ３ＰＤＨのpgで割った値として算出した
〔図３８、３９〕。その結果、ＵＨＲ−１とリガンドペ
プチドは調べた組織全てで発現が確認された。ＵＨＲ−
１は下垂体で発現量が多く、脳全体にも広く分布してい
たが、末梢の組織では副腎を除いて発現はあまり高くな
かった。一方、リガンドペプチドは、脳では延髄、視床
下部で発現が高く、下垂体での発現は低かった。末梢組
織においても肺、胸腺、膵臓、腎臓、副腎、精巣などで
比較的高い発現が認められた。これらの結果はＵＨＲ−
１とそのリガンドペプチドが様々な組織においてその機
能調節に重要な役割を果たしていることを示している。

【０１１６】

【実施例３７】１９Ｐ２−Ｌ３１のグルコースによる血
漿インスリン濃度の増加に及ぼす影響ペントバルビタール（６５mg/kg、腹腔内投与）で麻酔
したWistarラット（８−１０週齢 ♂）に総頸静脈から
一過性にグルコース（８６mg/ラット）を単独で、ある
いは同グルコースと１９Ｐ２−Ｌ３１（ラットあたり各
６７５pmol、２.２５nmol、６.７５nmol、６７.５nmo
l）を同時投与し、投与した反対側の総頸静脈から経時
的に採血し血漿中のインスリン濃度をラジオイムノアッ
セイで測定した。測定にはアマシャム社のインスリンア
ッセイキットを使用した。１９Ｐ２−Ｌ３１は投与量６
７５pmol、２.２５nmol、６.７５nmolでは、グルコース
による投与２分後の急激な第一相目のインスリン濃度の
増加、および投与後６分以降に見られる緩徐な第二相目
の血漿インスリン濃度の増加を部分的に抑制した。６
７.５nmolの１９Ｐ２−Ｌ３１は第一相と第二相両方の
インスリン濃度の増加を完全に抑制した〔図４０〕。

【０１１７】

【実施例３８】マウスの行動量に及ぼすリガンドポリペ
プチドの影響本発明者らは、１９Ｐ２−Ｌ３１、１９Ｐ２−Ｌ２０の
マウス側脳室内投与が行動量に及ぼす影響を検討した。
成熟ＩＣＲ系雄性マウス（手術時体重：約３５ｇ）をペ
ントバルビタール５０mg/kgの腹腔内投与にて麻酔し、
脳定位固定装置に固定した。頭蓋骨を露出し、一側脳室
にガイドカニューレを埋め込むために歯科用ドリルを用
いて骨に穴を開けた。側脳室内薬液注入用のステンレス
製ガイドカニューレ（２４Ｇ、長さ５mm）の先端をＡ
Ｐ：＋０.６mm（ブレグマより）、Ｌ：左１mm、Ｈ：−
１mm（硬膜より）の位置に挿入した。ガイドカニューレ
は頭蓋骨に接着剤で固定した。術後、マウスは３日以上
飼育して術後の回復を待ってから行動解析実験を行っ
た。マウスの自発運動量の測定には、防音箱内の２４×
３７×３０cmの透明アクリル製の自発運動測定用ケージ
を用いた。マウスを該ケージに一匹ずつ入れ、１２時間
毎の明暗条件（明：６−１８時）で、また、水と餌は自
由に摂取できる条件下で自発運動量と立ち上がり行動量
をそれぞれ測定した。行動量の測定には、Ｓｕｐｅｒｍ
ｅｘ（室町機械）を用いた。薬物あるいはリン酸緩衝生
理食塩水（ＰＢＳ）は午後２：３０±３０分に投与し
た。投与時には、ステンレス製マイクロインジェクショ
ンカニューレ（３０Ｇ、長さ６mm）をガイドカニューレ
に挿入した。マイクロインジェクションカニューレは、
テフロンチューブを用いてマイクロシリンジポンプにつ
なぎ、ＰＢＳあるいはペプチドを溶解したＰＢＳを流速
２μl/分で２分間注入した。注入後は、２分間以上待っ
てからマイクロインジェクションカニューレを外し、行
動量を測定した。結果は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表
し、これらペプチド処置とＰＢＳ処置とが体温に及ぼす
影響に有意差があるか否かの検定は Student's t-test
によって行った。判定は、両側検定で危険率（ｐ）が５
％以下を統計的に有意であるとした。〔図４１〕に示す
ごとく、１９Ｐ２−Ｌ３１を１０nmol投与した場合、マ
ウスの自発運動量は投与後７０分後から１０５分後ま
で、有意に増加した。立ち上がり行動も同様に有意な変
化を示した。１９Ｐ２−Ｌ３１を１nmol投与した場合、
自発運動量には変化が認められず、立ち上がり行動量が
投与１０５分後で有意な低下を示したのみであった〔図
４２〕。１９Ｐ２−Ｌ３１を０.１nmol投与した場合、
自発運動量は、投与後２５分および４０分、７０分にお
いて有意な増加を示した。立ち上がり行動量にも同様の
増加傾向は認められたが有意ではなかった〔図４３〕。
また、１９Ｐ２−Ｌ３１を０.０１nmol投与した場合、
自発運動量は、投与後２０分および４０分で有意に増加
した。立ち上がり行動も同じように増加傾向を示したが
有意な変化は認められなかった〔図４４〕。

【０１１８】

【実施例３９】マウスのレセルピン誘発低体温に及ぼす
リガンドポリペプチドの影響成熟ＩＣＲ系雄性マウス（手術時体重：約３５ｇ）をペ
ントバルビタール５０mg/kgの腹腔内投与にて麻酔し、
脳定位固定装置に固定した。頭蓋骨を露出し、一側脳室
にガイドカニューレを埋め込むために歯科用ドリルを用
いて骨に穴を開けた。側脳室内薬液注入用のステンレス
製ガイドカニューレ（２４Ｇ、長さ５mm）の先端をＡ
Ｐ：＋０.６mm（ブレグマより）、Ｌ：左１mm、Ｈ：−
１mm（硬膜より）の位置に挿入した。ガイドカニューレ
は頭蓋骨に接着剤で固定した。術後、マウスは３日以上
飼育して術後の回復を待ってから体温測定を行った。レ
セルピン（アポプロン注１mg、第一製薬）３mg/kgを皮
下注射し、その１５時間後にマウスを個別の測定用ケー
ジに移した。ステンレス製マイクロインジェクションカ
ニューレ（３０Ｇ、長さ６mm）をガイドカニューレに挿
入した。マイクロインジェクションカニューレは、テフ
ロンチューブを用いてマイクロシリンジポンプにつな
ぎ、ＰＢＳあるいはペプチドを溶解したＰＢＳを流速２
μl/分で２分間注入した。注入後は、２分間以上待って
からマイクロインジェクションカニューレを外し、直腸
温を測定した。結果は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表し、
これらペプチド処置とＰＢＳ処置とが体温に及ぼす影響
に有意差があるか否かの検定は Student's t-testによ
って行った。判定は、両側検定で危険率（ｐ）が５％以
下を統計的に有意であるとした。〔図４５〕に示すよう
に、１９Ｐ２−Ｌ３１を１０nmol投与した場合、レセル
ピンによって低下していた体温はＰＢＳを投与した対照
群に比し有意に上昇した。この体温の上昇は、１９Ｐ２
−Ｌ３１投与後４５分でピークに達した。一方、１nmol
の１９Ｐ２−Ｌ２０投与群と対照群との間には差が認め
られなかった。

【０１１９】

【実施例４０】リガンドポリペプチドがラットの血圧に
及ぼす影響本発明者らは、１９Ｐ２−Ｌ３１の延髄最後野への注入
が血圧に及ぼす影響を検討した。成熟Wistar系雄性ラッ
ト（手術時体重：約３００ｇ）をペントバルビタール５
０mg/kgの腹腔内投与にて麻酔し、ラット脳定位固定装
置に固定した。切歯用バーはインターオーラルラインか
ら３.３mm低くした。頭蓋骨を露出し、ガイドカニュー
レを埋め込むために歯科用ドリルを用いて骨に穴を開け
た。また、その周囲の２ケ所にアンカービスを埋めた。
ステンレス製ガイドカニューレ、ＡＧ−１２（内径０.
４mm、外径０.５mm、エイコム社）を、その先端が最後
野の上部に位置するように挿入した。そのために、ガイ
ドカニューレは垂直方向から２０度の角度をつけて前方
より挿入した（〔図４６〕、但し図中にはガイドカニュ
ーレより１.０mm長いマイクロインジェクションカニュ
ーレを示す）。定位座標は、PaxinosとWatson（1986）
のアトラスを参考にしてＡＰ：−０.６mm（インターオ
ーラルラインより）、Ｌ：０.０mm、Ｈ：＋１.５mm（イ
ンターオーラルラインより）とした。ガイドカニューレ
は瞬間接着剤と歯科用セメントおよびアンカービスで頭
蓋骨に固定した。ガイドカニューレにはステンレス製ダ
ミーカニューレ、ＡＤ−１２（外径０.３５mm、エイコ
ム社）を挿入し、キャップナット（エイコム社）で固定
した。その後、ラットは個別のケージで飼育した。ガイ
ドカニューレを埋め込んでから約１週間飼育して術後の
回復を待ち、無麻酔血圧測定用の手術を行った。ラット
をペントバルビタール５０mg/kgの腹腔内投与にて麻酔
し、解剖用パッドの上に背位に固定して左側の大腿動脈
を露出させた。ポリエチレンチューブＳＰ３５（内径
０.５mm、外径０.９mm、夏目製作所）を約６０cmの長さ
に切り、２００単位/mlヘパリン含有生理食塩水で満た
した後、大腿動脈に約２.５cm挿入し固定した。チュー
ブのもう一端は背側の皮下を通して頸部（背側）より露
出させた。術後一晩待ってからポリエチレンチューブを
トランスデューサー（Spectramed）に接続し、血圧を測
定した。安定した血圧が測定可能になった後、ラットの
頭蓋骨に装着したキャップナットとダミーカニューレを
取り外し、代わりにテフロンチューブ（長さ５０cm、内
径０.１mm、外径０.４mm、エイコム社）につなげたステ
ンレス製マイクロインジェクションカニューレ、AMI13
（内径０.１７mm、外径０.３５mm、エイコム社）を挿入
した。マイクロインジェクションカニューレの長さは、
その先端１mmがガイドカニューレから露出するように調
節しておいた〔図４６〕。テフロンチューブの一方をマ
イクロシリンジポンプにつなぎ、ＰＢＳまたは１９Ｐ２
−Ｌ３１を溶解させたＰＢＳを１.０μl/分の流速で計
２μｌを最後野に注入した。血圧測定後、１９Ｐ−Ｌ３
１を注入したマイクロインジェクションカニューレを外
し、色素（エバンスブルー）注入用マイクロインジェク
ションカニューレに替えた。色素は、１９Ｐ−Ｌ３１と
同様に流速１.０μl/分で２分間注入した後約３分間待
ってからマイクロインジェクションカニューレを外し
た。ラットを断頭し、速やかに脳を摘出し、凍結した。
クリオスタットを用いて凍結切片を作製し、色素の注入
位置を確認した。上記実験の結果、延髄最後野に１９Ｐ
２−Ｌ３１を１０nmol注入すると血圧の上昇が認められ
た。脈波および平均血圧の典型例を〔図４７〕に示す。

【０１２０】

【実施例４１】リガンドポリペプチドが血漿中下垂体ホ
ルモン量に及ぼす影響本発明者らは、１９Ｐ２−Ｌ３１の第三脳室内投与が血
漿中の下垂体ホルモン量に及ぼす影響を検討した。成熟
Wistar系雄性ラット（手術時体重：約２９０〜３５０
ｇ）をペントバルビタール５０mg/kgの腹腔内投与にて
麻酔し、ラット脳定位固定装置に固定した。切歯用バー
はインターオーラルラインから３.３mm低くした。頭蓋
骨を露出し、ガイドカニューレを埋め込むために歯科用
ドリルを用いて骨に穴を開けた。また、その周囲の一ケ
所にアンカービスを埋めた。ステンレス製ガイドカニュ
ーレ、ＡＧ−１２（内径０.４mm、外径０.５mm、エイコ
ム社）を、その先端が第三脳室の上部に位置するように
挿入した。定位座標は、PaxinosとWatson（1986）のア
トラスに従い、ＡＰ：＋７.２mm（インターオーラルラ
インより）、Ｌ：０.０mm、Ｈ：＋２.０mm（インターオ
ーラルラインより）とした。ガイドカニューレは瞬間接
着剤と歯科用セメントおよびアンカービスで頭蓋骨に固
定した。ガイドカニューレにはステンレス製ダミーカニ
ューレ、ＡＤ−１２（外径０.３５mm、エイコム社）を
挿入し、キャップナット（エイコム社）で固定した。術
後、ラットを個別のケージで３日以上飼育し、術後の回
復を待ってから、実験を行った。上記手術を施したラッ
トをペントバルビタール５０mg/kgの腹腔内投与にて麻
酔し、解剖用パッドの上に背位に固定した。両側の頸静
脈を露出させた後、容量１mlのツベルクリン用注射筒と
２４Ｇ注射針（いずれもテルモ社）を用いて４００μｌ
の血液を採取した。血液凝固を防止するため、注射筒に
は予め２００単位/mlのヘパリンを含有する生理食塩水
を２０μl入れておいた。ラットの頭蓋骨に装着したキ
ャップナットとダミーカニューレを取り外し、代わりに
テフロンチューブ（長さ５０cm、内径０.１mm、外径０.
４mm、エイコム社）につなげたステンレス製マイクロイ
ンジェクションカニューレ、AMI13（内径０.１７mm、外
径０.３５mm、エイコム社）を挿入した。マイクロイン
ジェクションカニューレの長さは、その先端１mmがガイ
ドカニューレから露出するように調節しておいた。テフ
ロンチューブの一方をマイクロシリンジポンプにつな
ぎ、ＰＢＳまたは１９Ｐ２−Ｌ３１を溶解させたＰＢＳ
を２.５μl/分の流速で計１０μｌを第三脳室に注入し
た。注入終了後１分間待ってからマイクロインジェクシ
ョンカニューレを取り外し、再びダミーカニューレをキ
ャップナットで固定した。脳室内投与を開始する直前、
および脳室内投与の開始時点から１０、２０、３０、４
０、６０分後に頸静脈より４００μlずつ採血した。採
取した血液は微量高速冷却遠心機（MR-150，トミー精
工）を用いて遠心（５,０００rpm、１０分間）し、上清
（血漿）を回収した。血漿中に含まれる下垂体ホルモン
（プロラクチン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、副腎皮質
刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳ
Ｈ）、成長ホルモン（ＧＨ））量をそれぞれラジオイム
ノアッセイを用いて測定した。結果は、平均値±Ｓ．
Ｅ．Ｍ．で表した。１９Ｐ２−Ｌ３１を溶解させたＰＢ
Ｓ投与群とＰＢＳのみを投与した対照群との間に有意差
があるか否かの検定にはStudent's t-testを用いた。判
定は、両側検定で危険率５％以下を統計的に有意である
とした。〔図４８〕に示すごとく、血漿中成長ホルモン
量は、５０nmolの１９Ｐ２−Ｌ３１を第三脳室に投与後
２０分において対照群に比し有意に減少した。投与後１
０、３０、４０分においても減少傾向は認められたが、
有意ではなかった。また、投与６０分後では対照群との
間に差は認められなかった。また、血漿中プロラクチ
ン、ＬＨ、ＡＣＴＨ、ＴＳＨ量は有意な変化を示さなか
った。

【０１２１】

【実施例４２】リガンドポリペプチドが自由行動下ラッ
トにおける血漿中成長ホルモン量に及ぼす影響成熟Wistar系雄性ラットをペントバルビタール５０mg/k
gの腹腔内投与にて麻酔し、実施例４１と同様にステン
レス製ガイドカニューレ、ＡＧ−１２（内径０.４mm、
外径０.５mm、エイコム社）を、その先端が第三脳室の
上部に位置するように固定した。術後、ラットを個別の
ケージで３日以上飼育し、術後の回復を待ってからペン
トバルビタール麻酔下（５０mg/kg、i.p.）でヘパリン
（２００単位/ml）含有生理食塩水を満たしたカニュー
レ（長さ３０cm、内径０.５mm、外径０.９mm、夏目製作
所）を右頸静脈より右心房に挿入した。ラットを一晩飼
育して完全に麻酔から覚醒させた後、透明アクリル製ケ
ージ（３０×３０×３５cm）に移した。容量１mlのツベ
ルクリン用注射筒と２４Ｇ注射針（いずれもテルモ社）
を心房に挿入したカニューレに接続し、３００μｌの血
液を採取した。血液凝固を防止するため、注射筒には予
め２００単位/mlのヘパリンを含有する生理食塩水を２
０μl入れておいた。第三脳室に挿入したガイドカニュ
ーレにテフロンチューブ（長さ５０cm、内径０.１mm、
外径０.４mm、エイコム社）につなげたステンレス製マ
イクロインジェクションカニューレ、AMI13（内径０.１
７mm、外径０.３５mm、エイコム社）を挿入した。マイ
クロインジェクションカニューレの長さは、その先端１
mmがガイドカニューレから露出するように調節しておい
た。テフロンチューブの一方をマイクロシリンジポンプ
につなぎ、ＰＢＳまたは１９Ｐ２−Ｌ３１を溶解させた
ＰＢＳを２.５μl/分の流速で計１０μｌを第三脳室に
注入した。第三脳室内投与開始１０分後に心房に挿入し
たカニューレを通して生理食塩水に溶解させた成長ホル
モン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）を５μg/kg投与した。脳
室内投与を開始する直前、およびＧＨＲＨ投与時点から
１０、２０、３０、４０、６０分後に頸静脈より３００
μlずつ採血した。採取した血液は遠心（５,０００rp
m、１０分間）し、上清（血漿）を回収した。血漿中に
含まれる成長ホルモン（ＧＨ）量はラジオイムノアッセ
イを用いて測定した。結果は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で
表した。１９Ｐ２−Ｌ３１を溶解させたＰＢＳ投与群と
ＰＢＳのみを投与した対照群との間に有意差があるか否
かの検定にはStudent's t-testを用いた。判定は、両側
検定で危険率５％以下を統計的に有意であるとした。
〔図４９〕に示すごとく、５μg/kgのＧＨＲＨ投与は血
漿中ＧＨ量を増加させた。しかし、５０nmolの１９Ｐ２
−Ｌ３１を第三脳室に投与するとＧＨＲＨによる血漿中
ＧＨ量の増加は有意に抑制された。

【０１２２】

【実施例４３】ウサギポリクローナル抗体の作製ウシ１９Ｐ２−Ｌ３１のＮ末端側ペプチド［ペプチド−
I、SRAHQHSMEIRTPDC（配列番号：９２）］、ｃ末端側ペ
プチド［ペプチド−II、CAWYAGRGIRPVGRFNH₂（配列番
号：９３）］および中央部分のペプチド［ペプチド-II
I、CEIRTPDINPAWYAG（配列番号：９４）］を化学合成
し、常法通りKLHと結合した。フロインドの完全アジュ
バント(FCA)と生理食塩水に溶解した上記ペプチド６０
０μｇを混合し、均一なエマルジョンにした後、それぞ
れ３羽ずつのウサギ(NZW、♂、２．５ｋｇ）の背部に皮
下注射した。さらに３週間後追加免疫として、フロイン
ドの不完全アジュバント(FIA)と生理食塩水に溶解した
上記のペプチドとKLHのコンジュゲイトを混合し、均一
なエマルジョンにした後ウサギ背部に皮下注射した。３
週間間隔で計３回追加免疫を行った。抗体価の測定は以
下のように行った。最終免疫の２週間後、ウサギ耳の静
脈から採血し、血液を３７℃で１時間保温後、４℃で１
昼夜放置したのち遠心し、抗血清を得た。抗血清を各濃
度に希釈し、予め、ヤギ抗ウサギIgG(Fc)抗体を固定し
たポリスチレン性９６穴マイクロプレートに１００μｌ
ずつ加え、４℃で１６時間インキュベートした。抗血清
を除去し、洗浄後、HRP標識ペプチド−I、II、IIIを添
加した。室温で４時間インキュベートし、十分にウエル
を洗浄した後、反応基質を加え、呈色反応を行った。酵
素反応停止溶液１００μｌを加えて反応を停止させた
後、マイクロプレート用比色計を用い４５０ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。〔図５０〕に示すように免疫後の
血清中に各ペプチドに対する結合活性が検出された。抗
体は以下のようにして調製した。抗血清は硫安塩析によ
りIgG画分を濃縮し、ホウ酸バッファーに溶解後、透析
した。抗ペプチド−IのIgG画分をペプチド−Iセルロフ
ァインカラムに、さらに抗ペプチド−IIおよび抗ペプチ
ド−IIIのIgG画分を１９Ｐ２−Ｌ３１−セファロ−ズ４
Ｂカラムに負荷し、ホウ酸バッファーおよび酢酸バッフ
ァー（１００ｍＭ、ｐＨ４．５）で洗浄後、グリシン塩
酸バッファー（２００ｍＭ、ｐＨ２．０）でそれぞれ溶
出した。溶出液には１Ｍのトリスを加えて中和した後、
精製抗体として使用した。

【０１２３】

【実施例４４】ウサギポリクローナル抗１９Ｐ２−Ｌ３
１抗体による１９Ｐ２−Ｌ３１の生物活性の中和作用実施例４３の方法で調製した３種類のIgG抗体の１９Ｐ
２−Ｌ３１に対する中和活性を実施例１１記載のアラキ
ドン酸代謝物放出活性測定系により検討した。すなわ
ち、IgG抗体を各濃度に希釈し、１９Ｐ２−Ｌ３１（５
ｘ１０^-10Ｍ）と室温で１時間インキュベーション後、
残存活性を１９Ｐ２レセプター発現ＣＨＯ細胞を使用し
て測定した〔図５１〕。ペプチド−IIに対するポリクロ
ーナル抗体に最も強い１９Ｐ２−Ｌ３１に対する中和活
性が認められた。

【０１２４】

【製剤例１】日局注射用蒸留水５０ｍｌに実施例２１で
得られた化合物５０ｍｇを溶解した後、日局注射用蒸留
水を加えて１００ｍｌとする。この溶液を滅菌条件下で
瀘過し、次にこの溶液１ｍｌずつを取り滅菌条件下注射
用バイアルに充填し凍結乾燥し密閉する。

【製剤例２】日局注射用蒸留水５０ｍｌに実施例２１で
得られた化合物１００ｍｇを溶解した後、日局注射用蒸
留水を加えて１００ｍｌとする。この溶液を滅菌条件下
で瀘過し、次にこの溶液１ｍｌずつを取り滅菌条件下注
射用バイアルに充填し凍結乾燥し密閉する。

【０１２５】

【発明の効果】本発明の生理活性物質であるリガンドポ
リペプチドまたはそのアミド、エステルもしくはその
塩、該部分ペプチドまたは該リガンドポリペプチドをコ
ードするＤＮＡは、下垂体、中枢神経系あるいは膵臓を
はじめ様々な組織・臓器（心臓、肺、肝臓、脾臓、胸
腺、腎臓、副腎、骨格筋、精巣など）の機能調節作用を
有し、医薬として有用である。また、該リガンドポリペ
プチドは、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質のアゴニス
トまたはアンタゴニスト化合物のスクリーニングに有用
である。該スクリーニングにより得られる化合物もまた
上記した組織・臓器の機能調節作用を有し、医薬として
有用である。本発明のリガンドポリペプチド、該アゴニ
ストまたはアンタゴニストの作用について以下に詳細に
説明する。上記の実施例３７〜４１は、リガンドポリペ
プチドの局所投与により、自発運動量、立ち上がり行動
量の増加、体温の上昇、血圧上昇、血漿中成長ホルモン
量の低下などを引き起こすことを証明したものである。
これらの生理活性は、リガンドポリペプチドが中枢神経
系および下垂体内分泌系に作用した場合に生じる種々の
顕著な生理学的変化を最初に証明したものである。この
ように、本発明のリガンドポリペプチドまたはその塩
は、ヒトあるいは温血動物（例えば、ラット、マウス、
モルモット、ニワトリ、ウサギ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒ
ツジ、サルなど）の中枢神経系に作用し、種々の薬理学
的変化を惹起するので、脳内神経系あるいは内分泌系を
変化させるものである。１９Ｐ２−Ｌ３１をマウスに側
脳室内投与したところ、０.０１〜１０nmolで行動量が
増加した。この事実は、リガンドポリペプチドが中枢神
経系のＧ蛋白質共役型レセプターを介して運動系の変化
を引き起こさせたものである。また、本ペプチドのマウ
ス側脳室内投与では体温上昇が認められ、ラットの延髄
最後野に投与した場合には血圧が上昇した。これらの作
用は既知の中枢神経系刺激剤（例えば、アンフェタミ
ン、コカイン、メチルフェニデートなど）の薬理作用と
類似している。したがって、リガンドポリペプチドは、
主として生体アミン（ドーパミン、ノルアドレナリン、
セロトニン）を神経終末の貯蔵部位から放出させるもの
であることがわかる（融道男と吉川武男生体の科学 4
2：535-536；1991）。さらに、ラットの第三脳室に１９
Ｐ２−Ｌ３１を注入したところ、血漿中の成長ホルモン
量が減少した。このことは、本リガンドポリペプチドが
視床下部に作用し、視床下部−下垂体系を介した下垂体
ホルモン分泌に関与していることを示すものである。第
三脳室近傍には下垂体からの成長ホルモン分泌を調節す
る作用を有する成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）
やソマトスタチンが存在する（遠山正弥ら化学的神経
機能解剖学：167-216；1987）。したがって、１９Ｐ２
−Ｌ３１は神経系を介してあるいは直接下垂体に作用し
て、これらの物質の放出を調節しているものである。上
記の事実は、リガンドポリペプチドが中枢神経系に作用
して自律神経系を調節しているペプチドであることを示
すものである。本リガンドポリペプチドおよびその受容
体のｍＲＮＡが視床下部や延髄に高発現しているという
事実も、リガンドポリペプチドが自律神経系の調節に関
与していることを示す。事実、自律神経末梢路に対する
上位中枢は延髄と視床下部であり、ここで交感神経系と
副交感神経系の統合が行われ、神経性調節、体液性調節
の両方に重要な役割を果たしていることが知られてい
る。これらの知見に基づけば、リガンドポリペプチド、
該アゴニストまたはそれらの塩は、自発運動亢進を生ず
る中枢神経系刺激剤として有用であり、例えば老人性痴
呆、脳血管性痴呆（脳血管障害に起因する痴呆）、系統
変性型の退行変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パ
ーキンソン病、ピック病、ハンチントン病など）に起因
する痴呆、感染性疾患（例えば、クロイツフェルト−ヤ
コブ病などの遅発ウィルス感染症）に起因する痴呆、内
分泌性・代謝性・中毒性疾患（例えば、甲状腺機能低下
症、ビタミンＢ１２欠乏症、アルコール中毒、各種薬剤
・金属・有機化合物による中毒など）に起因する痴呆、
腫瘍性疾患（例えば、脳腫瘍など）に起因する痴呆、外
傷性疾患（例えば、慢性硬膜下血腫など）に起因する痴
呆、鬱病、多動児（微細脳障害）症候群もしくは意識障
害の予防・治療剤などとして用いることができる。一
方、リガンドポリペプチドのアンタゴニストあるいはそ
の塩は、中枢神経系抑制剤などとして有用であり、例え
ば抗精神病剤、抗ハンチントン病剤、抗不安剤、催眠鎮
静剤などとして用いることができる。延髄最後野にリガ
ンドポリペプチドを注入すると血圧が上昇することが明
らかになった。したがって、リガンドポリペプチド、リ
ガンドポリペプチドのアゴニストまたはそれらの塩は、
昇圧剤などとして有用である。一方、リガンドポリペプ
チドのアンタゴニストあるいはその塩は、降圧剤などと
して有用である。リガンドポリペプチドが視床下部に作
用すると血漿中の成長ホルモン量が低下することが観察
された。成長ホルモンの過剰な分泌は巨人症や末端肥大
症を引き起こす（片桝ら内分泌症候群：78-80；199
3、廣井ら内分泌症候群：149-151；1993）。したがっ
て、成長ホルモンの分泌を抑制するリガンドポリペプチ
ド、リガンドポリペプチドのアゴニストまたはそれらの
塩は、巨人症、末端肥大症などの予防・治療剤などとし
て用いることができる。また、成長ホルモンは肝臓から
のグルコースの放出を促進し、筋肉や脂肪組織による血
中からのグルコースの取り込みを抑制する結果、高血糖
や糖尿を引き起こす（小林英司内分泌現象、1980）。
実際、糖尿病患者では成長ホルモン分泌量が増加してい
るといわれている（清野裕内分泌・代謝病学：385-40
2；1994）。したがって、リガンドポリペプチド、リガ
ンドポリペプチドのアゴニストまたはそれらの塩は、糖
尿病などの予防・治療剤などとして用いることができ
る。一方、上記実施例で得られた結果から、リガンドポ
リペプチドのアンタゴニストは成長ホルモンの分泌を促
進する。したがって、リガンドポリペプチドのアンタゴ
ニストまたはその塩は、成長ホルモンが減少する下垂体
機能低下症や下垂体性小人症、低血糖症などの予防・治
療剤などとして用いることができる。また、成長ホルモ
ンや成長ホルモンによって分泌されるインスリン様成長
因子は筋委縮性側索硬化症、骨粗鬆症、腎不全、手術後
の栄養状態改善などに効果がある（鎮目ら内分泌症候
群：84-87；1993、日経バイオ年鑑96：453-454；1996、
飛梅らホルモンと臨床 44：1205-1214；1996）ので、
リガンドポリペプチドのアンタゴニストまたはその塩は
これら疾患の予防・治療剤として用いることができる。

【０１２６】

【配列表】

【配列番号：１】配列の長さ：９８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Lys Ala Val Gly Ala Trp Leu Leu Cys Leu Leu Leu Leu Gly Leu 1 5 10 15 Ala Leu Gln Gly Ala Ala Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile 20 25 30 Arg Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg 35 40 45 Pro Val Gly Arg Phe Gly Arg Arg Arg Ala Ala Pro Gly Asp Gly Pro 50 55 60 Arg Pro Gly Pro Arg Arg Val Pro Ala Cys Phe Arg Leu Glu Gly Gly 65 70 75 80 Ala Glu Pro Ser Arg Ala Leu Pro Gly Arg Leu Thr Ala Gln Leu Val 85 90 95 Gln Glu

【０１２７】

【配列番号：２】配列の長さ：２９４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列 ATGAAGGCGG TGGGGGCCTG GCTCCTCTGC CTGCTGCTGC TGGGCCTGGC CCTGCAGGGG 60 GCTGCCAGCA GAGCCCACCA GCACTCCATG GAGATCCGCA CCCCCGACAT CAACCCTGCC 120 TGGTACGCRG GCCGTGGGAT CCGGCCCGTG GGCCGCTTCG GCCGGCGAAG AGCTGCCCYG 180 GGGGACGGAC CCAGGCCTGG CCCCCGGCGT GTGCCGGCCT GCTTCCGCCT GGAAGGCGGY 240 GCTGAGCCCT CCCGAGCCCT CCCGGGGCGG CTGACGGCCC AGCTGGTCCA GGAA 294

【０１２８】

【配列番号：３】配列の長さ：２９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly 20 25

【０１２９】

【配列番号：４】配列の長さ：１９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg 19

【０１３０】

【配列番号：５】配列の長さ：３１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe 20 25 30

【０１３１】

【配列番号：６】配列の長さ：３２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly 20 25 30

【０１３２】

【配列番号：７】配列の長さ：３３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly 20 25 30 Arg 33

【０１３３】

【配列番号：８】配列の長さ：２０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg Phe 20

【０１３４】

【配列番号：９】配列の長さ：２１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＴｈｒＰｒｏＡｓｐＩｌｅＡｓｎＰｒｏＡｌａＴｒｐＴｙｒ
ＡｌａＧｌｙＡｒｇＧｌｙＩｌｅＡｒｇＰｒｏ１５
１０１５ＶａｌＧｌｙＡｒｇＰｈｅＧｌｙ２０

【０１３５】

【配列番号：１０】配列の長さ：２２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＴｈｒＰｒｏＡｓｐＩｌｅＡｓｎＰｒｏＡｌａＴｒｐＴｙｒ
ＡｌａＧｌｙＡｒｇＧｌｙＩｌｅＡｒｇＰｒｏ１５
１０１５ＶａｌＧｌｙＡｒｇＰｈｅＧｌｙＡｒｇ２０

【０１３６】

【配列番号：１１】配列の長さ：８７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 AGCAGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGATC CGCACCCCCG ACATCAACCC TGCCTGGTAC 60 GCRGGCCGTG GGATCCGGCC CGTGGGC 87

【０１３７】

【配列番号：１２】配列の長さ：５７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 ACCCCCGACA TCAACCCTGC CTGGTACGCR GGCCGTGGGA TCCGGCCCGT GGGCCGC 57

【０１３８】

【配列番号：１３】配列の長さ：９３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 AGCAGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGATC CGCACCCCCG ACATCAACCC TGCCTGGTAC 60 GCRGGCCGTG GGATCCGGCC CGTGGGCCGC TTC 93

【０１３９】

【配列番号：１４】配列の長さ：９６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 AGCAGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGATC CGCACCCCCG ACATCAACCC TGCCTGGTAC 60 GCRGGCCGTG GGATCCGGCC CGTGGGCCGC TTCGGC 96

【０１４０】

【配列番号：１５】配列の長さ：９９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 AGCAGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGATC CGCACCCCCG ACATCAACCC TGCCTGGTAC 60 GCRGGCCGTG GGATCCGGCC CGTGGGCCGC TTCGGCCGG 99

【０１４１】

【配列番号：１６】配列の長さ：６０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 ACCCCCGACA TCAACCCTGC CTGGTACGCR GGCCGTGGGA TCCGGCCCGT GGGCCGCTTC 60

【０１４２】

【配列番号：１７】配列の長さ：６３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 ACCCCCGACA TCAACCCTGC CTGGTACGCR GGCCGTGGGA TCCGGCCCGT GGGCCGCTTC 60 GGC 63

【０１４３】

【配列番号：１８】配列の長さ：６６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 ACCCCCGACA TCAACCCTGC CTGGTACGCR GGCCGTGGGA TCCGGCCCGT GGGCCGCTTC 60 GGCCGG 66

【０１４４】

【配列番号：１９】配列の長さ：９１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Leu Val Leu Val Ile Ala Arg Val Arg Arg Leu His Asn Val Thr Asn 1 5 10 15 Phe Leu Ile Gly Asn Leu Ala Leu Ser Asp Val Leu Met Cys Thr Ala 20 25 30 Cys Val Pro Leu Thr Leu Ala Tyr Ala Phe Glu Pro Arg Gly Trp Val 35 40 45 Phe Gly Gly Gly Leu Cys His Leu Val Phe Phe Leu Gln Pro Val Thr 50 55 60 Val Tyr Val Ser Val Phe Thr Leu Thr Thr Ile Ala Val Asp Arg Tyr 65 70 75 80 Val Val Leu Val His Pro Leu Arg Arg Arg Ile 85 90

【０１４５】

【配列番号：２０】配列の長さ：５９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Leu Leu Leu Val Thr Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Val Ile Leu Leu 1 5 10 15 Ser Tyr Val Arg Val Ser Val Lys Leu Arg Asn Arg Val Val Pro Gly 20 25 30 Cys Val Thr Gln Ser Gln Ala Asp Trp Asp Arg Ala Arg Arg Arg Arg 35 40 45 Thr Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val Val 50 55

【０１４６】

【配列番号：２１】配列の長さ：３７０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Ala Ser Ser Thr Thr Arg Gly Pro Arg Val Ser Asp Leu Phe Ser 1 5 10 15 Gly Leu Pro Pro Ala Val Thr Thr Pro Ala Asn Gln Ser Ala Glu Ala 20 25 30 Ser Ala Gly Asn Gly Ser Val Ala Gly Ala Asp Ala Pro Ala Val Thr 35 40 45 Pro Phe Gln Ser Leu Gln Leu Val His Gln Leu Lys Gly Leu Ile Val 50 55 60 Leu Leu Tyr Ser Val Val Val Val Val Gly Leu Val Gly Asn Cys Leu 65 70 75 80 Leu Val Leu Val Ile Ala Arg Val Arg Arg Leu His Asn Val Thr Asn 85 90 95 Phe Leu Ile Gly Asn Leu Ala Leu Ser Asp Val Leu Met Cys Thr Ala 100 105 110 Cys Val Pro Leu Thr Leu Ala Tyr Ala Phe Glu Pro Arg Gly Trp Val 115 120 125 Phe Gly Gly Gly Leu Cys His Leu Val Phe Phe Leu Gln Pro Val Thr 130 135 140 Val Tyr Val Ser Val Phe Thr Leu Thr Thr Ile Ala Val Asp Arg Tyr 145 150 155 160 Val Val Leu Val His Pro Leu Arg Arg Arg Ile Ser Leu Arg Leu Ser 165 170 175 Ala Tyr Ala Val Leu Ala Ile Trp Ala Leu Ser Ala Val Leu Ala Leu 180 185 190 Pro Ala Ala Val His Thr Tyr His Val Glu Leu Lys Pro His Asp Val 195 200 205 Arg Leu Cys Glu Glu Phe Trp Gly Ser Gln Glu Arg Gln Arg Gln Leu 210 215 220 Tyr Ala Trp Gly Leu Leu Leu Val Thr Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Val 225 230 235 240 Ile Leu Leu Ser Tyr Val Arg Val Ser Val Lys Leu Arg Asn Arg Val 245 250 255 Val Pro Gly Cys Val Thr Gln Ser Gln Ala Asp Trp Asp Arg Ala Arg 260 265 270 Arg Arg Arg Thr Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val Val Phe Ala 275 280 285 Val Cys Trp Leu Pro Leu His Val Phe Asn Leu Leu Arg Asp Leu Asp 290 295 300 Pro His Ala Ile Asp Pro Tyr Ala Phe Gly Leu Val Gln Leu Leu Cys 305 310 315 320 His Trp Leu Ala Met Ser Ser Ala Cys Tyr Asn Pro Phe Ile Tyr Ala 325 330 335 Trp Leu His Asp Ser Phe Arg Glu Glu Leu Arg Lys Leu Leu Val Ala 340 345 350 Trp Pro Arg Lys Ile Ala Pro His Gly Gln Asn Met Thr Val Ser Val 355 360 365 Val Ile 370

【０１４７】

【配列番号：２２】配列の長さ：２０６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Leu Val Leu Val Ile Ala Arg Val Arg Arg Leu Tyr Asn Val Thr Asn 1 5 10 15 Phe Leu Ile Gly Asn Leu Ala Leu Ser Asp Val Leu Met Cys Thr Ala 20 25 30 Cys Val Pro Leu Thr Leu Ala Tyr Ala Phe Glu Pro Arg Gly Trp Val 35 40 45 Phe Gly Gly Gly Leu Cys His Leu Val Phe Phe Leu Gln Ala Val Thr 50 55 60 Val Tyr Val Ser Val Phe Thr Leu Thr Thr Ile Ala Val Asp Arg Tyr 65 70 75 80 Val Val Leu Val His Pro Leu Arg Arg Arg Ile Ser Leu Arg Leu Ser 85 90 95 Ala Tyr Ala Val Leu Ala Ile Trp Val Leu Ser Ala Val Leu Ala Leu 100 105 110 Pro Ala Ala Val His Thr Tyr His Val Glu Leu Lys Pro His Asp Val 115 120 125 Arg Leu Cys Glu Glu Phe Trp Gly Ser Gln Glu Arg Gln Arg Gln Leu 130 135 140 Tyr Ala Trp Gly Leu Leu Leu Val Thr Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Val 145 150 155 160 Ile Leu Leu Ser Tyr Ala Arg Val Ser Val Lys Leu Arg Asn Arg Val 165 170 175 Val Pro Gly Arg Val Thr Gln Ser Gln Ala Asp Trp Asp Arg Ala Arg 180 185 190 Arg Arg Arg Thr Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val Val 195 200 205

【０１４８】

【配列番号：２３】配列の長さ：１２６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Val Val Leu Val His Pro Leu Arg Arg Arg Ile Ser Leu Arg Leu Ser 1 5 10 15 Ala Tyr Ala Val Leu Gly Ile Trp Ala Leu Ser Ala Val Leu Ala Leu 20 25 30 Pro Ala Ala Val His Thr Tyr His Val Glu Leu Lys Pro His Asp Val 35 40 45 Ser Leu Cys Glu Glu Phe Trp Gly Ser Gln Glu Arg Gln Arg Gln Ile 50 55 60 Tyr Ala Trp Gly Leu Leu Leu Gly Thr Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Ala 65 70 75 80 Ile Leu Leu Ser Tyr Val Arg Val Ser Val Lys Leu Arg Asn Arg Val 85 90 95 Val Pro Gly Ser Val Thr Gln Ser Gln Ala Asp Trp Asp Arg Ala Arg 100 105 110 Arg Arg Arg Thr Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val Val 115 120 125

【０１４９】

【配列番号：２４】配列の長さ：２７３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列 CTGGTGCTGG TGATCGCGCG GGTGCGCCGG CTGCACAACG TGACGAACTT CCTCATCGGC 60 AACCTGGCCT TGTCCGACGT GCTCATGTGC ACCGCCTGCG TGCCGCTCAC GCTGGCCTAT 120 GCCTTCGAGC CACGCGGCTG GGTGTTCGGC GGCGGCCTGT GCCACCTGGT CTTCTTCCTG 180 CAGCCGGTCA CCGTCTATGT GTCGGTGTTC ACGCTCACCA CCATCGCAGT GGACCGGTAC 240 GTCGTGCTGG TGCACCCGCT GAGGCGGCGC ATC 273

【０１５０】

【配列番号：２５】配列の長さ：１７７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列ＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＴＣＣＣＴＣＴＧ
ＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＴＣＣＴＧＴＣＴＴＡＣＧＴＣＣＧＧ６０ＧＴＧＴＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＣＣＧＣＡＡＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＣＣＧ
ＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＣ１２０ＴＧＧＧＡＣＣＧＣＧＣＴＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣ
ＴＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧ１７７

【０１５１】

【配列番号：２６】配列の長さ：１１１０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列ＡＴＧＧＣＣＴＣＡＴＣＧＡＣＣＡＣＴＣＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＴＴ
ＴＣＴＧＡＣＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧ６０ＧＣＧＧＴＣＡＣＡＡＣＴＣＣＣＧＣＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＣＡＧＡＧ
ＧＣＣＴＣＧＧＣＧＧＧＣＡＡＣＧＧＧＴＣＧＧＴＧＧＣＴ１２０ＧＧＣＧＣＧＧＡＣＧＣＴＣＣＡＧＣＣＧＴＣＡＣＧＣＣＣＴＴＣＣＡＧ
ＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＡＡＧ１８０ＧＧＧＣＴＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＣＴＡＣＡＧＣＧＴＣＧＴＧＧＴＧ
ＧＴＣＧＴＧＧＧＧＣＴＧＧＴＧＧＧＣＡＡＣＴＧＣＣＴＧ２４０ＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＣＧＣＧＣＧＧＧＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧ
ＣＡＣＡＡＣＧＴＧＡＣＧＡＡＣＴＴＣＣＴＣＡＴＣＧＧＣ３００ＡＡＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＴＣＡＴＧＴＧＣＡＣＣ
ＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＧＣＣＴＡＴ３６０ＧＣＣＴＴＣＧＡＧＣＣＡＣＧＣＧＧＣＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＣ
ＧＧＣＣＴＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧ４２０ＣＡＧＣＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＡＴＧＴＧＴＣＧＧＴＧＴＴＣＡＣＧ
ＣＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＡＣＣＧＣＴＡＣ４８０ＧＴＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＣＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＧＧＣＧＣＡＴＣ
ＴＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＧＣＴＧＴＧ５４０ＣＴＧＧＣＣＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＣＧ
ＣＴＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＡＴＣＡＣ６００ＧＴＧＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＣＧＣＡＣＧＡＣＧＴＧＣＧＣＣＴＣＴＧＣ
ＧＡＧＧＡＧＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣ６６０ＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧ
ＧＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＴＣＣＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＣ７２０ＡＴＣＣＴＣＣＴＧＴＣＴＴＡＣＧＴＣＣＧＧＧＴＧＴＣＡＧＴＧＡＡＧ
ＣＴＣＣＧＣＡＡＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＴＧＣ７８０ＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＣＴＧＧＧＡＣＣＧＣＧＣＴ
ＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧ８４０ＧＴＧＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＣＧＣＣＧＴＣＴＧＣＴＧＧ
ＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＧＴＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧ９００ＣＧＧＧＡＣＣＴＣＧＡＣＣＣＣＣＡＣＧＣＣＡＴＣＧＡＣＣＣＴＴＡＣ
ＧＣＣＴＴＴＧＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＣＴＧＣ９６０ＣＡＣＴＧＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＴＡＣＡＡＣ
ＣＣＣＴＴＣＡＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＣＧＡＣ１０２０ＡＧＣＴＴＣＣＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＧＣＡＡＡＣＴＧＴＴＧＧＴＣ
ＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＧＣＡＡＧＡＴＡＧＣＣＣＣＣＣＡＴ１０８０ＧＧＣＣＡＧＡＡＴＡＴＧＡＣＣＧＴＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣ
１１１０

【０１５２】

【配列番号：２７】配列の長さ：６１８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列ＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＣＧＣＧＣＧＧＧＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧ
ＴＡＣＡＡＣＧＴＧＡＣＧＡＡＴＴＴＣＣＴＣＡＴＣＧＧＣ６０ＡＡＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＴＣＡＴＧＴＧＣＡＣＣ
ＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＧＣＣＴＡＴ１２０ＧＣＣＴＴＣＧＡＧＣＣＡＣＧＣＧＧＣＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＣ
ＧＧＣＣＴＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧ１８０ＣＡＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＡＴＧＴＧＴＣＧＧＴＧＴＴＣＡＣＧ
ＣＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＡＣＣＧＣＴＡＣ２４０ＧＴＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＣＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＧＧＣＧＣＡＴＣ
ＴＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＧＣＴＧＴＧ３００ＣＴＧＧＣＣＡＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＣＧ
ＣＴＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＡＴＣＡＣ３６０ＧＴＧＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＣＧＣＡＣＧＡＣＧＴＧＣＧＣＣＴＣＴＧＣ
ＧＡＧＧＡＧＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣ４２０ＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧ
ＧＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＴＣＣＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＣ４８０ＡＴＣＣＴＣＣＴＧＴＣＴＴＡＣＧＣＣＣＧＧＧＴＧＴＣＡＧＴＧＡＡＧ
ＣＴＣＣＧＣＡＡＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＣＧＣ５４０ＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＣＴＧＧＧＡＣＣＧＣＧＣＴ
ＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧ６００ＧＴＧＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧ
６１８

【０１５３】

【配列番号：２８】配列の長さ：３７８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列 GTGGTTCTGG TGCACCCGCT ACGTCGGCGC ATTTCACTGA GGCTCAGCGC CTACGCGGTG 60 CTGGGCATCT GGGCTCTATC TGCAGTGCTG GCGCTGCCGG CCGCGGTGCA CACCTACCAT 120 GTGGAGCTCA AGCCCCACGA CGTGAGCCTC TGCGAGGAGT TCTGGGGCTC GCAGGAGCGC 180 CAACGCCAGA TCTACGCCTG GGGGCTGCTT CTGGGCACCT ATTTGCTCCC CCTGCTGGCC 240 ATCCTCCTGT CTTACGTACG GGTGTCAGTG AAGCTGAGGA ACCGCGTGGT GCCTGGCAGC 300 GTGACCCAGA GTCAAGCTGA CTGGGACCGA GCGCGTCGCC GCCGCACTTT CTGTCTGCTG 360 GTGGTGGTGG TGGTAGTG 378

【０１５４】

【配列番号：２９】配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CGTGGSCMTS STGGGCAACN YCCTG 25

【０１５５】

【配列番号：３０】配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GTNGWRRGGC ANCCAGCAGA KGGCAAA 27

【０１５６】

【配列番号：３１】配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CTGTGYGYSA TYGCNNTKGA YMGSTAC 27

【０１５７】

【配列番号：３２】配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AKGWAGWAGG GCAGCCAGCA GANSRYGAA 29

【０１５８】

【配列番号：３３】配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CTGACTTATT TTCTGGGCTG CCGC 24

【０１５９】

【配列番号：３４】配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AACACCGACA CATAGACGGT GACC 24

【０１６０】

【配列番号：３５】配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCICAYCARC AYTGYATGGA 20

【０１６１】

【配列番号：３６】配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CCIACGGGIC KDATGCCICK GCCIGC 26

【０１６２】

【配列番号：３７】配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ACGGGCCKDA TGCCICKGCC IGCRTA 26

【０１６３】

【配列番号：３８】配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CCGGCGTACC AGGCAGGGTT 20

【０１６４】

【配列番号：３９】配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGGCAGGGTT GATGTCGGGG GTGCGGAT 28

【０１６５】

【配列番号：４０】配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列ＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣ
ＴＣＣＡ２７

【０１６６】

【配列番号：４１】配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列ＧＴＧＧＧＧＧＣＣＴＧＧＣＴＣＣＴＣＴＧＣＣＴ
ＧＣＴＧ２７

【０１６７】

【配列番号：４２】配列の長さ：３２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GTGTCGACGA ATGAAGGCGG TGGGGGCCTG GC 32

【０１６８】

【配列番号：４３】配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列ＡＧＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＴＴＡＴＴＣＣＴＧＧＡ
Ｃ２４

【０１６９】

【配列番号：４４】配列の長さ：９８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＭｅｔＬｙｓＡｌａＶａｌＧｌｙＡｌａＴｒｐＬｅｕＬｅｕ
ＣｙｓＬｅｕＬｅｕＬｅｕＬｅｕＧｌｙＬｅｕ１５
１０１５ＡｌａＬｅｕＧｌｎＧｌｙＡｌａＡｌａＳｅｒＡｒｇＡｌａ
ＨｉｓＧｌｎＨｉｓＳｅｒＭｅｔＧｌｕＩｌｅ２０２５
３０ＡｒｇＴｈｒＰｒｏＡｓｐＩｌｅＡｓｎＰｒｏＡｌａＴｒｐ
ＴｙｒＡｌａＧｌｙＡｒｇＧｌｙＩｌｅＡｒｇ３５４０
４５ＰｒｏＶａｌＧｌｙＡｒｇＰｈｅＧｌｙＡｒｇＡｒｇＡｒｇ
ＡｌａＡｌａＬｅｕＧｌｙＡｓｐＧｌｙＰｒｏ５０５５
６０ＡｒｇＰｒｏＧｌｙＰｒｏＡｒｇＡｒｇＶａｌＰｒｏＡｌａ
ＣｙｓＰｈｅＡｒｇＬｅｕＧｌｕＧｌｙＧｌｙ６５７０
７５８０ＡｌａＧｌｕＰｒｏＳｅｒＡｒｇＡｌａＬｅｕＰｒｏＧｌｙ
ＡｒｇＬｅｕＴｈｒＡｌａＧｌｎＬｅｕＶａｌ８５
９０９５ＧｌｎＧｌｕ

【０１７０】

【配列番号：４５】配列の長さ：８３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Ala Leu Lys Thr Trp Leu Leu Cys Leu Leu Leu Leu Ser Leu Val 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Ser Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg 20 25 30 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro 35 40 45 Val Gly Arg Phe Gly Arg Arg Arg Ala Thr Pro Arg Asp Val Thr Gly 50 55 60 Leu Gly Gln Leu Ser Cys Leu Pro Leu Asp Gly Arg Thr Lys Phe Ser 65 70 75 80 Gln Arg Gly

【０１７１】

【配列番号：４６】配列の長さ：２４９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列 ATGGCCCTGA AGACGTGGCT TCTGTGCTTG CTGCTGCTAA GCTTGGTCCT CCCAGGGGCT 60 TCCAGCCGAG CCCACCAGCA CTCCATGGAG ACAAGAACCC CTGATATCAA TCCTGCCTGG 120 TACACGGGCC GCGGGATCAG GCCTGTGGGC CGCTTCGGCA GGAGAAGGGC AACCCCGAGG 180 GATGTCACTG GACTTGGCCA ACTCAGCTGC CTCCCACTGG ATGGACGCAC CAAGTTCTCT 240 CAGCGTGGA 249

【０１７２】

【配列番号：４７】配列の長さ：３１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe 20 25 30

【０１７３】

【配列番号：４８】配列の長さ：３２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly 20 25 30

【０１７４】

【配列番号：４９】配列の長さ：３３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＳｅｒＡｒｇＡｌａＨｉｓＧｌｎＨｉｓＳｅｒＭｅｔＧｌｕ
ＴｈｒＡｒｇＴｈｒＰｒｏＡｓｐＩｌｅＡｓｎ１５
１０１５ＰｒｏＡｌａＴｒｐＴｙｒＴｈｒＧｌｙＡｒｇＧｌｙＩｌｅ
ＡｒｇＰｒｏＶａｌＧｌｙＡｒｇＰｈｅＧｌｙ２０２５
３０Ａｒｇ

【０１７５】

【配列番号：５０】配列の長さ：２０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＴｈｒＰｒｏＡｓｐＩｌｅＡｓｎＰｒｏＡｌａＴｒｐＴｙｒ
ＴｈｒＧｌｙＡｒｇＧｌｙＩｌｅＡｒｇＰｒｏ１５
１０１５ＶａｌＧｌｙＡｒｇＰｈｅ２０

【０１７６】

【配列番号：５１】配列の長さ：２１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg Phe Gly 20

【０１７７】

【配列番号：５２】配列の長さ：２２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg Phe Gly Arg 20

【０１７８】

【配列番号：５３】配列の長さ：９３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列 AGCCGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGACA AGAACCCCTG ATATCAATCC TGCCTGGTAC 60 ACGGGCCGCG GGATCAGGCC TGTGGGCCGC TTC 93

【０１７９】

【配列番号：５４】配列の長さ：９６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列 AGCCGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGACA AGAACCCCTG ATATCAATCC TGCCTGGTAC 60 ACGGGCCGCG GGATCAGGCC TGTGGGCCGC TTCGGC 96

【０１８０】

【配列番号：５５】配列の長さ：９９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列 AGCCGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGACA AGAACCCCTG ATATCAATCC TGCCTGGTAC 60 ACGGGCCGCG GGATCAGGCC TGTGGGCCGC TTCGGCAGG 99

【０１８１】

【配列番号：５６】配列の長さ：６０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列 ACCCCTGATA TCAATCCTGC CTGGTACACG GGCCGCGGGA TCAGGCCTGT GGGCCGCTTC 60

【０１８２】

【配列番号：５７】配列の長さ：６３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列ＡＣＣＣＣＴＧＡＴＡＴＣＡＡＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣＧＧＧＣ
ＣＧＣＧＧＧＡＴＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＧＣＣＧＣＴＴＣ６０ＧＧＣ
６３

【０１８３】

【配列番号：５８】配列の長さ：６６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列ＡＣＣＣＣＴＧＡＴＡＴＣＡＡＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣＧＧＧＣ
ＣＧＣＧＧＧＡＴＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＧＣＣＧＣＴＴＣ６０ＧＧＣＡＧＧ
６６

【０１８４】

【配列番号：５９】配列の長さ：８７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Lys Val Leu Arg Ala Trp Leu Leu Cys Leu Leu Met Leu Gly Leu 1 5 10 15 Ala Leu Arg Gly Ala Ala Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile 20 25 30 Arg Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg 35 40 45 Pro Val Gly Arg Phe Gly Arg Arg Arg Ala Thr Leu Gly Asp Val Pro 50 55 60 Lys Pro Gly Leu Arg Pro Arg Leu Thr Cys Phe Pro Leu Glu Gly Gly 65 70 75 80 Ala Met Ser Ser Gln Asp Gly 85

【０１８５】

【配列番号：６０】配列の長さ：２６１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列 ATGAAGGTGC TGAGGGCCTG GCTCCTGTGC CTGCTGATGC TGGGCCTGGC CCTGCGGGGA 60 GCTGCAAGTC GTACCCATCG GCACTCCATG GAGATCCGCA CCCCTGACAT CAATCCTGCC 120 TGGTACGCCA GTCGCGGGAT CAGGCCTGTG GGCCGCTTCG GTCGGAGGAG GGCAACCCTG 180 GGGGACGTCC CCAAGCCTGG CCTGCGACCC CGGCTGACCT GCTTCCCCCT GGAAGGCGGT 240 GCTATGTCGT CCCAGGATGG C 261

【０１８６】

【配列番号：６１】配列の長さ：３１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe 20 25 30

【０１８７】

【配列番号：６２】配列の長さ：３２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly 20 25 30

【０１８８】

【配列番号：６３】配列の長さ：３３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly 20 25 30 Arg

【０１８９】

【配列番号：６４】配列の長さ：２０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg Phe 20

【０１９０】

【配列番号：６５】配列の長さ：２１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg Phe Gly 20

【０１９１】

【配列番号：６６】配列の長さ：２２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg Phe Gly Arg 20

【０１９２】

【配列番号：６７】配列の長さ：９３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列 AGTCGTACCC ATCGGCACTC CATGGAGATC CGCACCCCTG ACATCAATCC TGCCTGGTAC 60 GCCAGTCGCG GGATCAGGCC TGTGGGCCGC TTC 93

【０１９３】

【配列番号：６８】配列の長さ：９６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列 AGTCGTACCC ATCGGCACTC CATGGAGATC CGCACCCCTG ACATCAATCC TGCCTGGTAC 60 GCCAGTCGCG GGATCAGGCC TGTGGGCCGC TTCGGT 96

【０１９４】

【配列番号：６９】配列の長さ：９９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列ＡＧＴＣＧＴＡＣＣＣＡＴＣＧＧＣＡＣＴＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＣＧＣ
ＡＣＣＣＣＴＧＡＣＡＴＣＡＡＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＡＣ６０ＧＣＣＡＧＴＣＧＣＧＧＧＡＴＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＧＣＣＧＣＴＴＣ
ＧＧＴＣＧＧ９９

【０１９５】

【配列番号：７０】配列の長さ：６０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列ＡＣＣＣＣＴＧＡＣＡＴＣＡＡＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＡＣＧＣＣＡＧＴ
ＣＧＣＧＧＧＡＴＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＧＣＣＧＣＴＴＣ６０

【０１９６】

【配列番号：７１】配列の長さ：６３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列 ACCCCTGACA TCAATCCTGC CTGGTACGCC AGTCGCGGGA TCAGGCCTGT GGGCCGCTTC 60 GGT 63

【０１９７】

【配列番号：７２】配列の長さ：６６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列 ACCCCTGACA TCAATCCTGC CTGGTACGCC AGTCGCGGGA TCAGGCCTGT GGGCCGCTTC 60 GGTCGG 66

【０１９８】

【配列番号：７３】配列の長さ：２１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列の特徴：第１０番目のXaaはAlaもしくはThr、第１
１番目のXaaはGlyもしくはSer、第２１番目のXaaはH、G
lyもしくはGlyArgを示す。配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Xaa Xaa Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg Phe Xaa 20

【０１９９】

【配列番号：７４】配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列の特徴：第３番目のXaaはAlaもしくはThr、第５番
目のXaaはGlnもしくはArg、第１０番目のXaaはIleもし
くはThrを示す。配列ＳｅｒＡｒｇＸａａＨｉｓＸａａＨｉｓＳｅｒＭｅｔＧｌｕ
ＸａａＡｒｇ１５
１０

【０２００】

【配列番号：７５】配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列ＣＡＲＣＡＹＴＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＡＡＣ
ＣＣＣ２６

【０２０１】

【配列番号：７６】配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TACCAGGCAG GATTGATACA GGGG 24

【０２０２】

【配列番号：７７】配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列ＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＧＧＡＧＣ
ＡＴ２５

【０２０３】

【配列番号：７８】配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列ＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＧＴＡＧＡＧ
ＧＡ２５

【０２０４】

【配列番号：７９】配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ACGTGGCTTC TGTGCTTGCT GC 22

【０２０５】

【配列番号：８０】配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列ＧＣＣＴＧＡＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＴＡＣ
ＣＡ２５

【０２０６】

【配列番号：８１】配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列ＴＴＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＧＡＡＧＣＧＧ
ＣＣＣ２６

【０２０７】

【配列番号：８２】配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GGCGGGGGCT GCAAGTCGTA CCCATCG 27

【０２０８】

【配列番号：８３】配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列ＣＧＧＣＡＣＴＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＣＧＣＡＣ
ＣＣＣＴ２７

【０２０９】

【配列番号：８４】配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列ＣＡＧＧＣＡＧＧＡＴＴＧＡＴＧＴＣＡＧＧＧＧＴ
ＧＣＧＧ２７

【０２１０】

【配列番号：８５】配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CATGGAGTGC CGATGGGTAC GACTTGC 27

【０２１１】

【配列番号：８６】配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列ＧＧＣＣＴＣＣＴＣＧＧＡＧＧＡＧＣＣＡＡＧＧＧ
ＡＴＧＡ２７

【０２１２】

【配列番号：８７】配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列ＧＧＧＡＡＡＧＧＡＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧ
ＡＧＡＧ２７

【０２１３】

【配列番号：８８】配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CCTGCTGGCC ATTCTCCTGT CTTAC 25

【０２１４】

【配列番号：８９】配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列ＧＧＧＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＡＡＧＧＴＴ
ＧＡ２５

【０２１５】

【配列番号：９０】配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列ＧＡＡＧＡＣＧＧＡＧＣＡＴＧＧＣＣＣＴＧＡＡＧ
ＡＣ２５

【０２１６】

【配列番号：９１】配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GGCAGCTGAG TTGGCCAAGT CCAGT 25

【０２１７】

【配列番号：９２】配列の長さ：１５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＳｅｒＡｒｇＡｌａＨｉｓＧｌｎＨｉｓＳｅｒＭｅｔＧｌｕ
ＩｌｅＡｒｇＴｈｒＰｒｏＡｓｐＣｙｓ１５
１０１５

【０２１８】

【配列番号：９３】配列の長さ：１５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＣｙｓＡｌａＴｒｐＴｙｒＡｌａＧｌｙＡｒｇＧｌｙＩｌｅ
ＡｒｇＰｒｏＶａｌＧｌｙＡｒｇＰｈｅ１５
１０１５

【０２１９】

【配列番号：９４】配列の長さ：１５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Cys Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly 1 5 10 15

【０２２０】

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト下垂体由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によ
って単離したｃＤＮＡクローンｐ１９Ｐ２に含まれるヒ
ト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ
断片の塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列
を示す。配列決定に用いたプライマーは−２１Ｍ１３で
ある。下線で示した部分は合成プライマーに相当する部
分である。

【図２】ヒト下垂体由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によ
って単離したｃＤＮＡクローンｐ１９Ｐ２に含まれるヒ
ト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ
断片の塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列
を示す。配列決定に用いたプライマーはＭ１３ＲＶ-Ｎ
（タカラ）である。下線で示した部分は合成プライマー
に相当する部分である。

【図３】図１に示したアミノ酸配列をもとに作成した、
ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコードされる蛋白質の部
分疎水性プロットを示す。

【図４】図２に示したアミノ酸配列をもとに作成した、
ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコードされる蛋白質の部
分疎水性プロットを示す。

【図５】図１および図２に示したｐ１９Ｐ２に含まれる
ヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮ
Ａ断片にコードされる蛋白質の部分アミノ酸配列を、公
知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質であるＳ１２８６
３と比較した図を示す。黒く塗った部分は一致している
部分を示す。ｐ１９Ｐ２の第１番目〜第９９番目のアミ
ノ酸配列は図１の第１番目〜第９９番目のアミノ酸配列
に対応し、第１５６番目〜第２３０番目のアミノ酸配列
は図２の第１番目〜第６８番目のアミノ酸配列に対応す
る。

【図６】ＭＩＮ６由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によっ
て単離したｃＤＮＡクローンｐＧ３−２およびｐＧ１−
１０にそれぞれ含まれるＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて導
き出したＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質ｃＤＮＡ断片の塩基配列およびそれにコードされるア
ミノ酸配列を示す。下線で示した部分は合成プライマー
に相当する部分である。

【図７】図６に示したＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質の部分アミノ酸配列（ｐＧ３−２／ｐＧ
１−１０）を、図１および図２に示したｐ１９Ｐ２にコ
ードされる蛋白質の部分アミノ酸配列と比較した図を示
す。黒塗りの部分は配列が一致している部分を示す。ｐ
１９Ｐ２の第１番目〜第９９番目のアミノ酸配列は図１
の第１番目〜第９９番目のアミノ酸配列に対応し、第１
５６番目〜第２２３番目のアミノ酸配列は図２の第１番
目〜第６８番目のアミノ酸配列に対応する。ｐＧ３−２
／ｐＧ１−１０の第１番目〜第２２３番目のアミノ酸配
列は図６の第１番目〜第２２３番目のアミノ酸配列に対
応する。

【図８】図６に示した部分アミノ酸配列をもとに作成し
た、ＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の
部分疎水性プロットを示す。

【図９】ｐ１９Ｐ２に挿入されているＤＮＡ断片をプロ
ーブとして用いて、ヒト下垂体由来ｃＤＮＡライブラリ
ーよりプラークハイブリダイゼーション法によって単離
したｃＤＮＡクローンｐｈＧＲ３に含まれるヒト下垂体
由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡの全塩基
配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。

【図１０】ヒト下垂体由来のｃＤＮＡクローンｐｈＧＲ
３がコードするレセプター遺伝子のヒト下垂体ｍＲＮＡ
に対するノーザンブロットの結果を示す。

【図１１】図９に示したアミノ酸配列をもとに作成し
た、ｐｈＧＲ３に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役
型レセプター蛋白質ｃＤＮＡにコードされる蛋白質の疎
水性プロットを示す。

【図１２】ＭＩＮ６由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によ
って単離したｃＤＮＡクローンｐ５Ｓ３８に含まれるＭ
ＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ
断片の塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列
を示す。下線で示した部分は合成プライマーに相当する
部分である。

【図１３】図１２に示したＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質の部分アミノ酸配列（ｐ５Ｓ３８）
を、図１および図２に示したｐ１９Ｐ２に含まれるｃＤ
ＮＡ断片にコードされるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質の部分アミノ酸配列、および図６に示したｐＧ３−２
ならびにｐＧ１−１０にそれぞれ含まれるｃＤＮＡ断片
の塩基配列から導きだした塩基配列にコードされるＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質の部分アミノ酸配列と比較
した図を示す。黒塗りの部分は配列が一致している部分
を示す。ｐ５Ｓ３８の第１番目〜第１４４番目のアミノ
酸配列は図１２の第１番目〜第１４４番目のアミノ酸配
列に対応する。ｐ１９Ｐ２の第１番目〜第９９番目のア
ミノ酸配列は図１の第１番目〜第９９番目のアミノ酸配
列に対応し、第１５６番目〜第２２３番目のアミノ酸配
列は図２の第１番目〜第６８番目のアミノ酸配列に対応
する。ｐＧ３−２／ｐＧ１−１０の第１番目〜第２２３
番目のアミノ酸配列は図６の第１番目〜第２２３番目の
アミノ酸配列に対応する。

【図１４】図１２に示した部分アミノ酸配列をもとに作
成した、ｐ５Ｓ３８に含まれるＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコードされる蛋白
質の部分疎水性プロットを示す。

【図１５】pAKKO-19P2を導入したCHO細胞でmRNAが発現
していることを確認するためにRT-PCRを行った。レーン
１から７は比較のためにpAKKO-19P2を段階的に希釈して
PCRを行ったもので、10μg/μlのプラスミドをそれぞれ
原液（レーン１）、1/2希釈（レーン２）、1/4希釈（レ
ーン３）、1/64希釈（レーン４）、1/256希釈（レーン
５）、1/1024希釈（レーン６）、１/4096希釈（レーン
７）した鋳型を使ってPCRを行ったものについて1.2％ア
ガロースゲル電気泳動により解析した結果である。レー
ン８から11はCHO-19P2細胞株から調製したcDNAをそれぞ
れ1/10希釈（レーン８）、1/100希釈（レーン９）、1/1
000希釈（レーン10）したものを鋳型としてPCRを行った
ものを電気泳動した。レーン11はcDNA の合成をreverse
transcriptaseなしで行ったものを鋳型としてPCRを行
ったものを電気泳動した。レーン12および13はそれぞれ
mock CHO細胞からreverse transcriptase添加および無
添加で調製したcDNAを鋳型としてPCRを行ったものを電
気泳動した。MはDNAのサイズマーカーであり両端のレー
ンはλ/Sty I digest（ニッポンジーン）を右から２番
目はφχ174/Hinc II digest（ニッポンジーン）をそれ
ぞれ1μgを電気泳動した。矢印は約400bpのPCRにより増
幅されたバンドの位置を示している。

【図１６】ラット全脳から抽出した粗リガンドペプチド
画分についてCHO-19P2細胞株からのアラキドン酸代謝物
の遊離を促進する活性を測定した。アラキドン酸代謝物
の遊離促進活性は0.05%BSAを含むHBSSを加えた時に遊離
された[³H]アラキドン酸代謝物の量を100％として、リ
ガンドペプチド粗画分を加えた時に放出されるアラキド
ン酸代謝物の量を％として表した。30% CH₃CN の画分に
CHO-19P2細胞株からアラキドン酸代謝物の遊離を促進す
る活性が認められた。

【図１７】ウシ視床下部から抽出した粗リガンドペプチ
ド画分についてCHO-19P2細胞株からのアラキドン酸代謝
物の遊離を促進する活性を測定した。アラキドン酸代謝
物の遊離を促進する活性は0.05%BSAを含むHBSSを加えた
時に遊離された[³H]アラキドン酸代謝物の量を100％と
して、リガンドペプチド粗画分を加えた時に放出される
アラキドン酸代謝物の量を％として表した。ラット全脳
から抽出した粗リガンドペプチド画分と同様に30% CH₃C
N の画分にCHO-19P2細胞株からアラキドン酸代謝物の遊
離を促進する活性が認められた。

【図１８】逆相カラム C18 218TP5415 で精製した画分
についてCHO-19P2細胞株に特異的なアラキドン酸代謝物
の遊離を促進する活性を測定した。RESOURCE Sの活性画
分を C18 218TP5415 で分離した。流速 1ml/min、20%-3
0% CH₃CN/0.1%TFA/H₂O の濃度勾配でクロマトグラフィ
ーを行い、溶出液を1ml ずつ分取し、凍結乾燥後、各フ
ラクションに含まれるCHO-19P2細胞株に特異的なアラキ
ドン酸代謝物遊離促進活性を測定した。その結果、活性
は、３つ(溶出順にそれぞれP-1、P-2、P-3と呼ぶ)に分
離した。

【図１９】逆相カラム diphenyl 219TP5415 で精製した
画分についてCHO-19P2細胞株に特異的なアラキドン酸代
謝物の遊離を促進する活性を測定した。C18 218TP5415
のP-3活性画分を diphenyl 219TP5415 で分離した。流
速 1ml/min、22%-25% CH₃CN/0.1%TFA/H₂O の濃度勾配で
クロマトグラフィーを行い、溶出液を1mlずつ分取し、
凍結乾燥後、各フラクションに含まれるCHO-19P2細胞株
に特異的なアラキドン酸代謝物遊離促進活性を測定し
た。その結果、活性は１つのピークに収束した。

【図２０】逆相カラム μRPC C2/C18 SC 2.1/10 で精製
した画分についてCHO-19P2細胞株に特異的なアラキドン
酸代謝物の遊離を促進する活性を測定した。diphenyl 2
19TP5415 で活性と一致したピークの画分を μRPC C2/C
18 SC 2.1/10 で分離した。流速 100μl/min、22%-23.5
% CH₃CN/0.1%TFA/H₂O の濃度勾配でクロマトグラフィー
を行い、溶出液を100μl ずつ分取し、凍結乾燥後、各
フラクションに含まれるCHO-19P2細胞株に特異的なアラ
キドン酸代謝物遊離促進活性を測定した。その結果、活
性は単一の物質(ペプチド)と思われる二つのピークに一
致した。

【図２１】逆相カラムμＲＰＣＣ２／Ｃ１８ＳＣ２.
１／１０で精製したＰ-２画分についてＣＨＯ-１９Ｐ２
細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進す
る活性を測定した。流速１００μl/min、２１.５％−２
３.０％ＣＨ₃ＣＮ／０.１％ＴＦＡ／蒸留水の濃度勾
配でクロマトグラフィーを行い、溶出液を１００μｌず
つ分取し、凍結乾燥後、各フラクションに含まれるＣＨ
Ｏ-１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の
遊離を促進する活性を測定した。その結果、活性は、単
一のペプチドと思われるペプチドのピークに一致した。

【図２２】ウシ視床下部由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法
によって単離したｃＤＮＡクローンに含まれるウシ視床
下部由来のＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキ
ドン酸代謝物の遊離を促進するリガンドポリペプチドｃ
ＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて導き出した該ウシ視床
下部由来リガンドポリペプチドｃＤＮＡ断片の塩基配列
およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。矢印で
示した部分は合成プライマーに相当する部分である。

【図２３】ウシ視床下部由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法
によって単離したｃＤＮＡクローンに含まれるウシ視床
下部由来のＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキ
ドン酸代謝物の遊離を促進するリガンドポリペプチドｃ
ＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて導き出した該ウシ視床
下部由来リガンドポリペプチドｃＤＮＡ断片の塩基配列
およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。矢印で
示した部分は合成プライマーに相当する部分である。

【図２４】ウシ視床下部由来のＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株
から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進するリガ
ンドポリペプチドのアミノ酸配列（ａ），（ｂ）および
配列番号：１、配列番号４４に示したリガンドポリペプ
チドの全コード領域をコードするｃＤＮＡ配列である。

【図２５】合成リガンドポリペプチド（１９Ｐ２−Ｌ３
１）についてＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株からの特異的なア
ラキドン酸代謝物遊離活性を濃度依存的に測定した。合
成ペプチドは、脱気処理した蒸留水に１０^-3Ｍの濃度で
溶解し、０．０５％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで１０^-12Ｍ
〜１０^-6Ｍの濃度に希釈した。アラキドン酸代謝物遊離
活性は、希釈液を細胞に添加した時に上清に遊離される
［³Ｈ］アラキドン酸代謝物の実測放射線量で表した。
その結果、１９Ｐ２−Ｌ３１によるＣＨＯ−１９Ｐ２細
胞株に特異的なアラキドン酸代謝物遊離活性が濃度依存
的に認められた。

【図２６】合成リガンドポリペプチド（１９Ｐ２−Ｌ３
１（Ｏ））についてＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株からの特異
的なアラキドン酸代謝物遊離活性を濃度依存的に測定し
た。合成リガンドポリペプチドは、脱気処理した蒸留水
に１０^-3Ｍの濃度で溶解し、０．０５％ＢＳＡを含むＨ
ＢＳＳで１０^-12Ｍ〜１０^-6Ｍの濃度に希釈した。アラ
キドン酸代謝物遊離活性は、希釈液を細胞に添加した時
に上清に遊離される［³Ｈ］アラキドン酸代謝物の実測
放射線量で表した。その結果、１９Ｐ２−Ｌ３１（Ｏ）
によるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株に特異的なアラキドン酸
代謝物遊離活性が濃度依存的に認められた。

【図２７】合成リガンドポリペプチド１９Ｐ２−Ｌ２０
についてＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株からの特異的なアラキ
ドン酸代謝物遊離活性を濃度依存的に測定した。合成ペ
プチドは、脱気処理した蒸留水に１０^-3Ｍの濃度で溶解
し、０．０５％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで１０^-12Ｍ〜１
０^-6Ｍの濃度に希釈した。アラキドン酸代謝物遊離活性
は、希釈液を細胞に添加した時に上清に遊離される［³
Ｈ］アラキドン酸代謝物の実測放射線量で表した。その
結果、１９Ｐ２−Ｌ２０によるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株
に特異的なアラキドン酸代謝物遊離活性が濃度依存的に
認められた。

【図２８】ウシゲノムライブラリーよりクローン化した
ファージのＤＮＡを制限酵素BamHI（Ｂ）およびSalI
（Ｓ）で切断し、１．２％アガロースゲル電気泳動を行
ったパターンを示す。ＤＮＡのサイズマーカー（Ｍ）に
はλファージＤＮＡのStyI消化物を用いた。Ｂのレーン
ではマーカーの１番目（19,329bp)と２番目(7,743bp)の
バンドの間に相当する位置にベクター由来の２本のバン
ドが検出され、その他に３番目(6,223bp)から５番目(3,
472bp)の間に挿入断片由来の３本のバンドが検出され
た。Ｓのレーンでは同じくベクター由来の２本のバンド
が検出されているが、挿入断片由来のバンドが重なって
いるために上側のバンドがＢのレーンに比べて太くなっ
ている。

【図２９】ウシゲノムＤＮＡから解読したコード領域付
近の塩基配列を示す。１〜３番目の塩基（ＡＴＧ）が翻
訳開始コドンに相当し、７６７〜７６９番目の塩基（Ｔ
ＡＡ）が翻訳終止コドンに相当する。

【図３０】ウシゲノムＤＮＡから解読したコード領域付
近の塩基配列(genome)をＰＣＲ法によってクローニング
したウシｃＤＮＡの塩基配列(cDNA)と比較した結果を示
す。配列の一致している部分は網掛けで示した。１０１
番目〜５７２番目の部分はｃＤＮＡの塩基配列には相当
する部分が無く、イントロンであることが判明した。

【図３１】ウシゲノムＤＮＡから解読したコード領域付
近の塩基配列からイントロン部分を除き、コードされる
アミノ酸配列に翻訳した結果を示す。

【図３２】ラット型リガンドポリペプチドの全長アミノ
酸配列および全コード領域をコードするｃＤＮＡ配列で
ある。

【図３３】ウシ型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列
およびウシ型ポリペプチド、ラット型ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を示す。矢印で示した部分は
合成プライマーに相当する部分である。

【図３４】ヒト型リガンドポリペプチドの全長アミノ酸
配列および全コード領域をコードするｃＤＮＡ配列であ
る。

【図３５】ウシ型リガンドポリペプチド、ラット型リガ
ンドポリペプチドおよびヒト型リガンドポリペプチドの
翻訳領域についてアミノ酸配列を比較したものである。

【図３６】生細胞におけるヨードラベル化リガンドポリ
ペプチドを用いたレセプター結合実験の結果を示す。

【図３７】ＣＨＯ−１９Ｐ２−９およびＣＨＯ−ＵＨＲ
１におけるリガンドポリペプチドによるアラキドン酸代
謝物遊離活性の測定結果を示す。

【図３８】ラット組織におけるＵＨＲ−１のＲＴ−ＰＣ
Ｒによる定量結果を示す。定量値は３回のＰＣＲの平均
値S.E.M.で表した。

【図３９】ラット組織におけるリガンドポリペプチドの
ＲＴ−ＰＣＲによる発現定量結果を示す。定量値は３回
のＰＣＲの平均値S.E.M.で表した。

【図４０】リガンドポリペプチドのグルコースによる血
漿インスリン濃度の増加をラジオイムノアッセイで測定
した結果を示す。

【図４１】リガンドポリペプチド１０nmolをマウスに投
与したときの行動量の測定結果を示す。図（ａ）は自発
運動量、図（ｂ）は立ち上がり行動量の測定結果を示
す。

【図４２】リガンドポリペプチド１nmolをマウスに投与
したときの行動量の測定結果を示す。図（ａ）は自発運
動量、図（ｂ）は立ち上がり行動量の測定結果を示す。

【図４３】リガンドポリペプチド０．１nmolをマウスに
投与したときの行動量の測定結果を示す。図（ａ）は自
発運動量、図（ｂ）は立ち上がり行動量の測定結果を示
す。

【図４４】リガンドポリペプチド０．０１nmolをマウス
に投与したときの行動量の測定結果を示す。図（ａ）は
自発運動量、図（ｂ）は立ち上がり行動量の測定結果を
示す。

【図４５】３mg/kgのレセルピンを皮下投与した１５時
間後のマウスにリガンドポリペプチドを脳室内投与した
ときの体温変化を測定した結果を示す。図中、一つの星
印は危険率：p<0.05、二つの星印はp<0.01を示す。

【図４６】延髄最後野（area postrema: AP）に角度２
０度でマイクロインジェクションカニューレを刺した場
合の模式図を示す。

【図４７】リガンドポリペプチドを延髄最後野に注入し
たときの脈波および平均血圧の典型例を示す。ラットの
延髄最後野にリガンドポリペプチドを１０nmol（流速１
μｌ／ｍｉｎ）注入し、無麻酔下で測定したものであ
る。

【図４８】ペントバルビタール麻酔下ラットの第三脳室
に５０nmolのリガンドポリペプチドを投与したときの血
漿中のＧＨ量を測定した結果を示す。

【図４９】第三脳室へのリガンドポリペプチドの投与に
よる血漿中成長ホルモン量の変化を示す。自由行動下の
ラットに５μｇ／ｋｇのGHRHを静脈下投与し、１０分後
に第三脳室へリガンドポリペプチドまたはＰＢＳを投与
した。ペプチドを投与した時間を０分とした。図中、一
つの星印は危険率：p<0.05、二つの星印はp<0.01を示
す。

【図５０】リガンドポリペプチド抗血清と吸光度の関係
を示す。

【図５１】抗リガンドポリペプチドポリクローナル抗体
によるアラキドン酸代謝物放出活性の測定結果を示す。

【図５２】発現ベクターｐＡＫＫＯ−ＵＨＲ−１上で構
築されたラットＵＨＲ−１の完全なコード領域の塩基配
列と、それにコードされるアミノ酸配列を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 31/70 ＡＤＰＡ６１Ｋ 31/70 ＡＤＰＡＤＵＡＤＵ 35/76 ＡＤＮ 35/76 ＡＤＮ 38/00 ＡＣＪ 48/00 ＡＡＢ 48/00 ＡＡＢＣ０７Ｈ 21/00 Ｃ０７Ｈ 21/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＪＧ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号特願平8−246573 (32)優先日平８(1996)９月18日 (33)優先権主張国日本（ＪＰ） (72)発明者細谷昌樹茨城県土浦市板谷１丁目711番地の83 (72)発明者藤井亮茨城県つくば市春日１丁目７番地９武田春日ハイツ303号 (72)発明者福住昌司茨城県つくば市並木３丁目17番地６ロイヤルシティ並木302号 (72)発明者北田千恵子大阪府堺市南向陽町１丁２番８号

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：７３で表されるアミノ酸配列と
同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドまたはそのアミド、エステルもしくはその
塩。
【請求項２】配列番号：３、配列番号：４、配列番号：
５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列
番号：９、配列番号：１０、配列番号：４７、配列番
号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番
号：５１、配列番号：５２、配列番号：６１、配列番
号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番
号：６５または配列番号：６６で表されるアミノ酸配列
を含有するポリペプチドである請求項１記載のポリペプ
チド。
【請求項３】配列番号：１、配列番号：４４、配列番
号：４５または配列番号：５９で表されるアミノ酸配列
を含有するポリペプチドである請求項１記載のポリペプ
チド。
【請求項４】請求項１記載のポリペプチドの部分ペプチ
ドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩。
【請求項５】請求項１記載のポリペプチドまたは請求項
４記載の部分ペプチドをコードする塩基配列を有するＤ
ＮＡを含有するＤＮＡ。
【請求項６】配列番号：２、配列番号：１１、配列番
号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番
号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番
号：１８、配列番号：４６、配列番号：５３、配列番
号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番
号：５７、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番
号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番
号：７０、配列番号：７１または配列番号：７２で表さ
れる塩基配列を有する請求項５記載のＤＮＡ。
【請求項７】請求項５記載のＤＮＡを含有する組換えベ
クター。
【請求項８】請求項５記載のＤＮＡまたは請求項７記載
の組換えベクターを保持する形質転換体。
【請求項９】請求項８記載の形質転換体を培養すること
を特徴とする請求項１記載のポリペプチドまたは請求項
４記載の部分ペプチドの製造法。
【請求項１０】請求項１記載のポリペプチドまたはその
アミド、エステルもしくはその塩を含有してなる医薬。
【請求項１１】請求項４記載の部分ペプチドまたはその
アミド、エステルもしくはその塩を含有してなる医薬。
【請求項１２】請求項５記載のＤＮＡを含有してなる医
薬。
【請求項１３】下垂体機能調節剤である請求項１０、請
求項１１または請求項１２記載の医薬。
【請求項１４】中枢神経機能調節剤である請求項１０、
請求項１１または請求項１２記載の医薬。
【請求項１５】膵臓機能調節剤である請求項１０、請求
項１１または請求項１２記載の医薬。
【請求項１６】請求項１記載のポリペプチドまたは請求
項４記載の部分ペプチドに対する抗体。
【請求項１７】（ｉ）配列番号：２１で表されるアミノ
酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含
有する受容体蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそ
の塩に、請求項１記載のポリペプチドまたは請求項４記
載の部分ペプチドを接触させた場合と（ii）配列番号：
２１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同
一のアミノ酸配列を含有する受容体蛋白質もしくはその
部分ペプチドまたはその塩に、請求項１記載のポリペプ
チドまたは請求項４記載の部分ペプチド、および試験化
合物を接触させた場合との比較を行うことを特徴とする
請求項１記載のポリペプチドまたは請求項４記載の部分
ペプチドと、配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と
同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する受
容体蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との
結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法。
【請求項１８】請求項１記載のポリペプチドまたは請求
項４記載の部分ペプチドと、配列番号：２１で表される
アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配
列を含有する受容体蛋白質もしくはその部分ペプチドま
たはその塩との結合性を変化させる化合物のスクリーニ
ング用キット。
【請求項１９】請求項１７記載のスクリーニング方法ま
たは請求項１８記載のスクリーニング用キットを用いて
得られる、請求項１記載のポリペプチドまたは請求項４
記載の部分ペプチドと、配列番号：２１で表されるアミ
ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を
含有する受容体蛋白質もしくはその部分ペプチドまたは
その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
【請求項２０】請求項１記載のポリペプチドまたは請求
項４記載の部分ペプチドをリガンドとして認識するＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質またはその塩。