JPH1014594A - 液中細菌の検出方法 - Google Patents
液中細菌の検出方法Info
- Publication number
- JPH1014594A JPH1014594A JP17080296A JP17080296A JPH1014594A JP H1014594 A JPH1014594 A JP H1014594A JP 17080296 A JP17080296 A JP 17080296A JP 17080296 A JP17080296 A JP 17080296A JP H1014594 A JPH1014594 A JP H1014594A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bacteria
- bacterium
- oligotrophic
- staining
- fluorescence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 貧栄養状態にある細菌を薬品を用いずに蛍光
染色する。 【解決手段】 貧栄養状態にある細菌が生息している試
料液を加熱することで、菌体の外側を覆っている防護物
質を破るか薄くするようにし、菌体内のＤＮＡに蛍光色
素が結合しやすくする。そして、染色された貧栄養状態
の細菌を含む試料液に光を当てて細菌から発せられる蛍
光を測定することで、細菌の検出（定量）をほぼリアル
タイムに近い短時間で行う。
染色する。 【解決手段】 貧栄養状態にある細菌が生息している試
料液を加熱することで、菌体の外側を覆っている防護物
質を破るか薄くするようにし、菌体内のＤＮＡに蛍光色
素が結合しやすくする。そして、染色された貧栄養状態
の細菌を含む試料液に光を当てて細菌から発せられる蛍
光を測定することで、細菌の検出（定量）をほぼリアル
タイムに近い短時間で行う。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は液中の細菌を蛍光染
色して細菌の定量若しくは細菌の存在を検出する方法の
うち、特に貧栄養状態で生息している細菌の検出方法に
関する。
色して細菌の定量若しくは細菌の存在を検出する方法の
うち、特に貧栄養状態で生息している細菌の検出方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】液体中に含まれる細菌を高感度、迅速に
検知することは、食品、医薬品、半導体工業など、広範
囲の分野から要求されている問題である。現在行われて
いる液体中に含まれる細菌の検出方法として以下の〜
に挙げる方法がある。 検体を寒天培地に撒いてコロニーを形成させこれを計
数する方法。 特開平１−１４１５９２号公報に開示されるように、
菌体内物質のＡＴＰ（アデノシン三燐酸）にルシフェリ
ン、ルシフェラーゼ（ゲンジボタル由来の酵素）を作用
させその際の発光量から菌数を割り出す方法。 細菌を蛍光染色して、この蛍光を検出する方法。
検知することは、食品、医薬品、半導体工業など、広範
囲の分野から要求されている問題である。現在行われて
いる液体中に含まれる細菌の検出方法として以下の〜
に挙げる方法がある。 検体を寒天培地に撒いてコロニーを形成させこれを計
数する方法。 特開平１−１４１５９２号公報に開示されるように、
菌体内物質のＡＴＰ（アデノシン三燐酸）にルシフェリ
ン、ルシフェラーゼ（ゲンジボタル由来の酵素）を作用
させその際の発光量から菌数を割り出す方法。 細菌を蛍光染色して、この蛍光を検出する方法。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記の方法は、操作
が煩雑で熟練を要する上に、結果が判明するまでに時間
がかかるという重大な欠点を持っている。特に、水（水
道水、地下水等、及びそれから得られる滅菌処理水な
ど）の中に生息する菌は、低温の上に貧栄養状態にある
ため増殖速度が遅く、コロニー確認までに５日以上の日
数を要してしまう。通常の工業活動の中でこれほど日数
がかかってしまえば菌数の検査をすること自体の意義が
失われてしまう。
が煩雑で熟練を要する上に、結果が判明するまでに時間
がかかるという重大な欠点を持っている。特に、水（水
道水、地下水等、及びそれから得られる滅菌処理水な
ど）の中に生息する菌は、低温の上に貧栄養状態にある
ため増殖速度が遅く、コロニー確認までに５日以上の日
数を要してしまう。通常の工業活動の中でこれほど日数
がかかってしまえば菌数の検査をすること自体の意義が
失われてしまう。
【０００４】上記の方法は、１菌体からの発光量が極
微小であるため、ある程度の培養増殖が必要となり、ま
た、菌種や生息条件によって１菌体当たりのＡＴＰ量に
ばらつきがあるため、正確な菌数を求めることは困難で
ある。
微小であるため、ある程度の培養増殖が必要となり、ま
た、菌種や生息条件によって１菌体当たりのＡＴＰ量に
ばらつきがあるため、正確な菌数を求めることは困難で
ある。
【０００５】上記の方法は、細菌の培養操作を全く必
要としないため、迅速な菌測定を行いうる方法として有
望である。特に、菌体内のＤＮＡに結合する蛍光色素に
は、結合によって蛍光強度が非常に強くなるものがあ
り、小さな細菌の測定には有利である。ここで、細菌の
ＤＮＡを蛍光染色する場合、蛍光色素によっては、細胞
膜を故意に損傷して色素が細胞内に入りやすくする処理
を必要とする。通常この処理にはアルコール、アルデヒ
ド、界面活性剤などが使用される。富栄養状態またはそ
れに近い状態で生息している大部分の細菌では、それら
の薬剤による処理によって十分な染色が行われ、従って
それらの菌の検出も良好に行われる。しかしながら、貧
栄養状態で生息している細菌に関しては事情が異なる。
即ち、貧栄養状態で生息している細菌は自己防衛のため
に細胞の外側を防護物質で覆っているため、薬剤が菌体
表面に達しにくく、染色も不十分になってしまう。従来
の技術で貧栄養状態で生息している細菌を良好に染色し
ようとすると、処理薬品の濃度を上げ、更に長時間の処
理を行うか、またはより作用の強い薬品を使うしかな
く、操作上からも、また環境保護の観点からも好ましく
ない。
要としないため、迅速な菌測定を行いうる方法として有
望である。特に、菌体内のＤＮＡに結合する蛍光色素に
は、結合によって蛍光強度が非常に強くなるものがあ
り、小さな細菌の測定には有利である。ここで、細菌の
ＤＮＡを蛍光染色する場合、蛍光色素によっては、細胞
膜を故意に損傷して色素が細胞内に入りやすくする処理
を必要とする。通常この処理にはアルコール、アルデヒ
ド、界面活性剤などが使用される。富栄養状態またはそ
れに近い状態で生息している大部分の細菌では、それら
の薬剤による処理によって十分な染色が行われ、従って
それらの菌の検出も良好に行われる。しかしながら、貧
栄養状態で生息している細菌に関しては事情が異なる。
即ち、貧栄養状態で生息している細菌は自己防衛のため
に細胞の外側を防護物質で覆っているため、薬剤が菌体
表面に達しにくく、染色も不十分になってしまう。従来
の技術で貧栄養状態で生息している細菌を良好に染色し
ようとすると、処理薬品の濃度を上げ、更に長時間の処
理を行うか、またはより作用の強い薬品を使うしかな
く、操作上からも、また環境保護の観点からも好ましく
ない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決すべく本
発明に係る液中細菌の検出方法は、細菌が貧栄養状態で
生息している試料液に対して蛍光染色の前処理として薬
剤を用いずに加熱処理を行い、この加熱処理の後、細菌
のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）に蛍光色素を結合せしめ
て染色し、次いで試料液に光を当て、細菌から発せられ
る蛍光を測定するようにした。
発明に係る液中細菌の検出方法は、細菌が貧栄養状態で
生息している試料液に対して蛍光染色の前処理として薬
剤を用いずに加熱処理を行い、この加熱処理の後、細菌
のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）に蛍光色素を結合せしめ
て染色し、次いで試料液に光を当て、細菌から発せられ
る蛍光を測定するようにした。
【０００７】加熱手段としては、熱の伝導、輻射その他
どのような方法でもよい。通常は、細菌のみでなく媒体
の液体も加熱するので、その量や容器の形状によって加
熱時間は異なってくるが、細胞膜を損傷させることが目
的であるので、余り長時間加熱する必要はない。
どのような方法でもよい。通常は、細菌のみでなく媒体
の液体も加熱するので、その量や容器の形状によって加
熱時間は異なってくるが、細胞膜を損傷させることが目
的であるので、余り長時間加熱する必要はない。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下に、熱湯を使って加熱した場
合と電子レンジ（マイクロ波）で加熱した例を示す。試
料としては、市販の純水製造装置の１次処理水（活性
炭、逆浸透、イオン交換処理後）の中に生息する貧栄養
細菌を抽出して用いた。細菌からの蛍光の測定は以下の
手順で行った。 適当な温度、時間だけ試料液を加熱する。 冷却後、蛍光色素としてチアゾールオレンジを最終濃
度0.5μMとなるように添加し、８分間染色する。 細いフローセルに試料液を流し、これに直角にレーザ
ー光を当てて、細菌から発せられる蛍光をパルスとして
とらえ、これを波高分析器で観測する。
合と電子レンジ（マイクロ波）で加熱した例を示す。試
料としては、市販の純水製造装置の１次処理水（活性
炭、逆浸透、イオン交換処理後）の中に生息する貧栄養
細菌を抽出して用いた。細菌からの蛍光の測定は以下の
手順で行った。 適当な温度、時間だけ試料液を加熱する。 冷却後、蛍光色素としてチアゾールオレンジを最終濃
度0.5μMとなるように添加し、８分間染色する。 細いフローセルに試料液を流し、これに直角にレーザ
ー光を当てて、細菌から発せられる蛍光をパルスとして
とらえ、これを波高分析器で観測する。
【０００９】（実施例１）上記の貧栄養細菌が含まれる
試料液を８０℃の熱湯に５分間浸けて加熱処理を行っ
た。この処理後に細菌を染色処理し、更にレーザー光を
照射して細菌が発する蛍光を波高分析した結果を図１に
示す。図の横軸は個々の細菌が発した蛍光パルスの波高
値で、右に行くほど蛍光が強くなる。縦軸は蛍光パルス
の出現頻度である。この図において、左端の高い山は、
迷光及び電気的ノイズによる山である。中央付近の山は
細菌から発した蛍光である。染色の良否は、この２つの
山が明確に分離しているかどうかで判断できる。この実
施例では２つの山が十分離れており、良好な染色が行わ
れていることが分る。
試料液を８０℃の熱湯に５分間浸けて加熱処理を行っ
た。この処理後に細菌を染色処理し、更にレーザー光を
照射して細菌が発する蛍光を波高分析した結果を図１に
示す。図の横軸は個々の細菌が発した蛍光パルスの波高
値で、右に行くほど蛍光が強くなる。縦軸は蛍光パルス
の出現頻度である。この図において、左端の高い山は、
迷光及び電気的ノイズによる山である。中央付近の山は
細菌から発した蛍光である。染色の良否は、この２つの
山が明確に分離しているかどうかで判断できる。この実
施例では２つの山が十分離れており、良好な染色が行わ
れていることが分る。
【００１０】（実施例２）上記の貧栄養細菌が含まれる
試料液を、出力５００Ｗの電子レンジで２０秒間加熱処
理した結果を図２に示す。この実施例でも実施例１とほ
とんど同じ良好な結果が得られていることが分かる。し
かも電子レンジの場合には加熱処理の時間が極めて短く
て済むという利点がある。
試料液を、出力５００Ｗの電子レンジで２０秒間加熱処
理した結果を図２に示す。この実施例でも実施例１とほ
とんど同じ良好な結果が得られていることが分かる。し
かも電子レンジの場合には加熱処理の時間が極めて短く
て済むという利点がある。
【００１１】（比較例）上記の実施例と対比するために
薬品処理による染色の例を以下に示す。実施例１，２と
同じ貧栄養状態にある細菌をグルタルアルデヒド0.2％
で１０分間処理した場合の蛍光波高分析した結果を図３
に示す。この場合には、ノイズの山と細菌からの蛍光の
山が重なってしまい、染色が不完全であることが分か
る。因みに、同じ薬品、同じ処理法で富栄養状態にある
大腸菌を染色した結果を図４に示す。この場合には、細
菌からの蛍光とノイズとが十分分離できており、貧栄養
状態にない通常の菌ならば上記の薬品処理でも十分良好
な染色を行い得ることが分かる。換言すれば、通常の細
菌を良好に染色し得る薬品濃度でも貧栄養細菌は染色す
ることが困難で、この場合に本発明の加熱処理が絶好の
方法となる。
薬品処理による染色の例を以下に示す。実施例１，２と
同じ貧栄養状態にある細菌をグルタルアルデヒド0.2％
で１０分間処理した場合の蛍光波高分析した結果を図３
に示す。この場合には、ノイズの山と細菌からの蛍光の
山が重なってしまい、染色が不完全であることが分か
る。因みに、同じ薬品、同じ処理法で富栄養状態にある
大腸菌を染色した結果を図４に示す。この場合には、細
菌からの蛍光とノイズとが十分分離できており、貧栄養
状態にない通常の菌ならば上記の薬品処理でも十分良好
な染色を行い得ることが分かる。換言すれば、通常の細
菌を良好に染色し得る薬品濃度でも貧栄養細菌は染色す
ることが困難で、この場合に本発明の加熱処理が絶好の
方法となる。
【００１２】
【発明の効果】以上に説明したように本発明によれば、
細菌が生息している試料液を加熱することで、菌体の外
側を覆っている防護物質を破るか薄くするようにし、菌
体内のＤＮＡに蛍光色素が結合しやすくしたので、貧栄
養状態の細菌であっても良好に染色することができ、し
たがって、試料液に光を当てて細菌から発せられる蛍光
を測定することで、従来数日を要していた菌の検出がほ
ぼリアルタイムに近い短時間で可能となり、また正確に
細菌の定量等を行うことができる。また、本発明方法に
あっては染色の前処理に薬品を使用しないので、操作上
及び環境保護の点から好ましい。
細菌が生息している試料液を加熱することで、菌体の外
側を覆っている防護物質を破るか薄くするようにし、菌
体内のＤＮＡに蛍光色素が結合しやすくしたので、貧栄
養状態の細菌であっても良好に染色することができ、し
たがって、試料液に光を当てて細菌から発せられる蛍光
を測定することで、従来数日を要していた菌の検出がほ
ぼリアルタイムに近い短時間で可能となり、また正確に
細菌の定量等を行うことができる。また、本発明方法に
あっては染色の前処理に薬品を使用しないので、操作上
及び環境保護の点から好ましい。
【図１】蛍光染色した実施例１の貧栄養細菌が発する蛍
光を波高分析した結果を示す図。
光を波高分析した結果を示す図。
【図２】蛍光染色した実施例２の貧栄養細菌が発する蛍
光を波高分析した結果を示す図。
光を波高分析した結果を示す図。
【図３】薬品を用いて蛍光染色した比較例の貧栄養細菌
が発する蛍光を波高分析した結果を示す図。
が発する蛍光を波高分析した結果を示す図。
【図４】蛍光染色した比較例の富栄養細菌が発する蛍光
を波高分析した結果を示す図。
を波高分析した結果を示す図。
Claims (1)
- 【請求項１】 細菌が貧栄養状態で生息している試料液
を加熱処理した後、細菌のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）
に蛍光色素を結合せしめて染色し、次いで試料液に光を
当て、細菌から発せられる蛍光を測定することを特徴と
する液中細菌の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17080296A JPH1014594A (ja) | 1996-07-01 | 1996-07-01 | 液中細菌の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17080296A JPH1014594A (ja) | 1996-07-01 | 1996-07-01 | 液中細菌の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1014594A true JPH1014594A (ja) | 1998-01-20 |
Family
ID=15911623
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17080296A Pending JPH1014594A (ja) | 1996-07-01 | 1996-07-01 | 液中細菌の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1014594A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017051149A (ja) * | 2015-09-10 | 2017-03-16 | アズビル株式会社 | 液中生物粒子の検出装置、及び液中生物粒子の検出方法 |
-
1996
- 1996-07-01 JP JP17080296A patent/JPH1014594A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017051149A (ja) * | 2015-09-10 | 2017-03-16 | アズビル株式会社 | 液中生物粒子の検出装置、及び液中生物粒子の検出方法 |
| CN107063978A (zh) * | 2015-09-10 | 2017-08-18 | 阿自倍尔株式会社 | 液体中生物颗粒的检测装置及液体中生物颗粒的检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yuan et al. | Effect of laser irradiation on cell function and its implications in Raman spectroscopy | |
| JP3837006B2 (ja) | 細菌の染色方法及び検出方法 | |
| Madrid et al. | Microbial biomass estimation | |
| JP2012507288A (ja) | 水性媒体中の微生物含有量の測定方法及びシステム | |
| US4094745A (en) | Method of staining microscopic organisms | |
| JPH0131139B2 (ja) | ||
| RU2608653C2 (ru) | Способ обнаружения и количественного определения термостойких микроорганизмов в продуктах | |
| JP6138597B2 (ja) | 嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法 | |
| CA1089339A (en) | Method of staining micro-organisms | |
| CN111635552A (zh) | 腈菌唑分子印迹反蛋白石光子晶体水凝胶传感器的制备方法及应用 | |
| JP3113909B2 (ja) | 菌類の即時判別装置 | |
| JPH1014594A (ja) | 液中細菌の検出方法 | |
| JP6692075B2 (ja) | 微生物検出装置、微生物検出プログラム及び微生物検出方法 | |
| JPH09275998A (ja) | 菌類の即時判別方法及びその判別装置 | |
| CA2427106C (en) | Method and apparatus for prokaryotic and eukaryotic cell quantitation | |
| Lam et al. | Optical instrumentation for bioprocess monitoring | |
| Yu et al. | Characterization of activated sludge in wastewater treatment processes using front-face excitation–emission matrix (FF-EEM) fluorescence spectroscopy | |
| Hahn et al. | Assessment of DNA damage in filamentous fungi by single cell gel electrophoresis, comet assay | |
| JP4876251B2 (ja) | 生菌、死菌及び疑似生菌の存在割合判別方法 | |
| JP2005102645A (ja) | 微生物の殺菌処理効果測定方法 | |
| JP2592114B2 (ja) | 微生物細胞の生死判別法 | |
| Singh et al. | Diatomological mapping of water bodies of Delhi region for forensic consideration | |
| JP3763674B2 (ja) | 細菌の計測方法および計測装置 | |
| CN113670798B (zh) | 一种微生物的检测方法及其应用 | |
| JP2006174751A (ja) | 有芽胞細菌計量方法 |