JPH0984584A - 耐熱性リパーゼおよびその製造方法 - Google Patents
耐熱性リパーゼおよびその製造方法Info
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- JPH0984584A JPH0984584A JP7242842A JP24284295A JPH0984584A JP H0984584 A JPH0984584 A JP H0984584A JP 7242842 A JP7242842 A JP 7242842A JP 24284295 A JP24284295 A JP 24284295A JP H0984584 A JPH0984584 A JP H0984584A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lipase
- amino acid
- acid sequence
- helix
- thermostable
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- Pending
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 熱に対する耐熱性に優れた耐熱性リパーゼ、
ならびにその製造方法の提供。 【解決手段】 天然型Rhizopus niveus リパーゼのアミ
ノ酸配列において、その第３０６番目のプロリンから第
３１５番目のスレオニン間のαヘリックスを構成するア
ミノ酸とその他のリパーゼを構成するアミノ酸とのあい
だに共有結合、疎水結合、塩結合、ＳＳ結合、水素結合
を新たに導入するすることを特徴とする耐熱性リパー
ゼ。 【効果】 上記によれば、リパーゼの熱にたいする安定
性を向上させることができ、酵素使用量当りの生産性を
向上させることが出来る。また、融点の高い基質を用い
た工業的なエステル合成、エステル交換反応システムの
構築が可能となる。
ならびにその製造方法の提供。 【解決手段】 天然型Rhizopus niveus リパーゼのアミ
ノ酸配列において、その第３０６番目のプロリンから第
３１５番目のスレオニン間のαヘリックスを構成するア
ミノ酸とその他のリパーゼを構成するアミノ酸とのあい
だに共有結合、疎水結合、塩結合、ＳＳ結合、水素結合
を新たに導入するすることを特徴とする耐熱性リパー
ゼ。 【効果】 上記によれば、リパーゼの熱にたいする安定
性を向上させることができ、酵素使用量当りの生産性を
向上させることが出来る。また、融点の高い基質を用い
た工業的なエステル合成、エステル交換反応システムの
構築が可能となる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、熱に対する安定性
に優れた耐熱性リパーゼおよびその製造方法に関する。
安定性が改良された変異型リゾプス ニベウス（Rhizop
us niveus ）リパーゼ、該変異型リゾプスニベウス リ
パーゼの遺伝子、該遺伝子を含有し、酵母内で発現可能
な発現ベクター、該発現ベクターを含有している形質転
換体、及び該形質転換体を用いて変異型リゾプスニベウ
ス リパーゼを製造する方法に関する。
に優れた耐熱性リパーゼおよびその製造方法に関する。
安定性が改良された変異型リゾプス ニベウス（Rhizop
us niveus ）リパーゼ、該変異型リゾプスニベウス リ
パーゼの遺伝子、該遺伝子を含有し、酵母内で発現可能
な発現ベクター、該発現ベクターを含有している形質転
換体、及び該形質転換体を用いて変異型リゾプスニベウ
ス リパーゼを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】リパーゼはエステル交換活性、エステル
合成活性、エステル加水分解活性などの多岐にわたる触
媒作用から工業的に重要な酵素である。リパーゼの起源
としては主にカビ、酵母、バクテリアなどの微生物があ
り、それらの起源のものが用いられている。中でも、リ
ゾプス（Rhizopus）属に属する微生物が産生するリパー
ゼ（以下、リゾプス属のリパーゼという）は基質となる
トリグレセリドの１・３位に特異的に作用する、１・３
特異性を有し、油脂の改質やエステル合成等への産業上
の利用価値が高い。
合成活性、エステル加水分解活性などの多岐にわたる触
媒作用から工業的に重要な酵素である。リパーゼの起源
としては主にカビ、酵母、バクテリアなどの微生物があ
り、それらの起源のものが用いられている。中でも、リ
ゾプス（Rhizopus）属に属する微生物が産生するリパー
ゼ（以下、リゾプス属のリパーゼという）は基質となる
トリグレセリドの１・３位に特異的に作用する、１・３
特異性を有し、油脂の改質やエステル合成等への産業上
の利用価値が高い。
【０００３】リゾプス属のリパーゼの一次構造について
は、リゾプスニベウス（Rhizopus niveus ）（kugimiya
ら、Biosci. Biotech. Biochem. 、第56巻、716 〜719
、1992年）、リゾプスデレマー（Rhizopus delemar）
（Haas, M. J. ら、Gene、第109 巻、107 〜113 、1991
年）、及びリゾプスジャバニカス（Rhizopus javanicu
s）（Biol. Chem.Hoppe Seyler 、第374 巻、245 〜254
、1993年）由来のリパーゼが報告され、この３種のリ
パーゼは一次構造上、殆ど同じであることが明らかとな
っており、リゾプス属のリパーゼは非常によく似た構造
であると考えられる。
は、リゾプスニベウス（Rhizopus niveus ）（kugimiya
ら、Biosci. Biotech. Biochem. 、第56巻、716 〜719
、1992年）、リゾプスデレマー（Rhizopus delemar）
（Haas, M. J. ら、Gene、第109 巻、107 〜113 、1991
年）、及びリゾプスジャバニカス（Rhizopus javanicu
s）（Biol. Chem.Hoppe Seyler 、第374 巻、245 〜254
、1993年）由来のリパーゼが報告され、この３種のリ
パーゼは一次構造上、殆ど同じであることが明らかとな
っており、リゾプス属のリパーゼは非常によく似た構造
であると考えられる。
【０００４】また、リゾプスニベウス（Rhizopus niveu
s ）の産生するリパーゼは、その遺伝子がクローニング
され、その塩基配列ならびにそれにより推定されるアミ
ノ酸配列が決定されている（特開平3-290186号公報）。
この遺伝子の解析並びに、蛋白質からの１次構造解析に
より、このリパーゼは、配列番号１に記載した392 アミ
ノ酸のプレプロ構造を持ち、プロセッシングにより、５
１アミノ酸残基のＡ鎖と２９７アミノ酸のＢ鎖の２本の
ポリぺプチド鎖（リパーゼI ）に変化することが明らか
となっている（河野ら、農芸化学会誌、第66巻、104
頁、1992年）。更にこのプロセッシングを受けたリパー
ゼの一部は、培地中でＢ鎖中に存在するAla123とSer124
（以降配列番号は配列番号１に記載したアミノ酸配列番
号で記載する）の間が切断を受け、２６９アミノ酸から
構成される１本のポリペプチド鎖（リパーゼII）に移行
することが明らかとなっている（河野ら、農芸化学会
誌、第67巻、114 頁、1993年）。また、リゾプスニベウ
ス（Rhizopus niveus ）リパーゼ遺伝子を酵母、サッカ
ロミセスセレビジア（Sacchromyecs cerevisae）を宿主
とし、発現並びに分泌生産させることも可能となってい
る（特開平3-290186公報）。
s ）の産生するリパーゼは、その遺伝子がクローニング
され、その塩基配列ならびにそれにより推定されるアミ
ノ酸配列が決定されている（特開平3-290186号公報）。
この遺伝子の解析並びに、蛋白質からの１次構造解析に
より、このリパーゼは、配列番号１に記載した392 アミ
ノ酸のプレプロ構造を持ち、プロセッシングにより、５
１アミノ酸残基のＡ鎖と２９７アミノ酸のＢ鎖の２本の
ポリぺプチド鎖（リパーゼI ）に変化することが明らか
となっている（河野ら、農芸化学会誌、第66巻、104
頁、1992年）。更にこのプロセッシングを受けたリパー
ゼの一部は、培地中でＢ鎖中に存在するAla123とSer124
（以降配列番号は配列番号１に記載したアミノ酸配列番
号で記載する）の間が切断を受け、２６９アミノ酸から
構成される１本のポリペプチド鎖（リパーゼII）に移行
することが明らかとなっている（河野ら、農芸化学会
誌、第67巻、114 頁、1993年）。また、リゾプスニベウ
ス（Rhizopus niveus ）リパーゼ遺伝子を酵母、サッカ
ロミセスセレビジア（Sacchromyecs cerevisae）を宿主
とし、発現並びに分泌生産させることも可能となってい
る（特開平3-290186公報）。
【０００５】このリゾプスニベウス（Rhizopus niveus
）の産生するリパーゼIIは当研究室で結晶化され（河
野ら、J. Mol. Biol. 、第229 巻、785 〜786 、1993
年）、Ｘ線結晶解析により、図８に示すようにその三次
構造が決定されている。更に他の微生物起源のリパー
ゼ、リゾムコウルミエハイ（Derewenda,Z.S.ら、J. Mo
l. Biol. 、第227 巻、818 〜839 、1992年）、ジオト
リカムキャンディダム（Schrag,J.D. ら、J. Mol. Bio
l. 、第230 巻、575 〜591 、1993年）等についてその
３次構造が報告されている。特にリゾプスニベウスとリ
ゾムコウルミエハイのリパーゼの１次構造はその相同性
が５６％であり、３次構造についても非常によく似てい
る。しかし、リゾプス属のリパーゼは、リゾムコウルミ
エハイのリパーゼと比較して、熱や有機溶剤に対する安
定性はそれほど高くなく、反応を効率的に進行させた
り、また高融点の脂肪酸やトリグレセリドに作用させる
等より広範囲に工業的に使用するためには、より安定な
リパーゼが必要とされていた（西元ら、油化学、第41
巻、第9 号、274 〜282 、1992年）。
）の産生するリパーゼIIは当研究室で結晶化され（河
野ら、J. Mol. Biol. 、第229 巻、785 〜786 、1993
年）、Ｘ線結晶解析により、図８に示すようにその三次
構造が決定されている。更に他の微生物起源のリパー
ゼ、リゾムコウルミエハイ（Derewenda,Z.S.ら、J. Mo
l. Biol. 、第227 巻、818 〜839 、1992年）、ジオト
リカムキャンディダム（Schrag,J.D. ら、J. Mol. Bio
l. 、第230 巻、575 〜591 、1993年）等についてその
３次構造が報告されている。特にリゾプスニベウスとリ
ゾムコウルミエハイのリパーゼの１次構造はその相同性
が５６％であり、３次構造についても非常によく似てい
る。しかし、リゾプス属のリパーゼは、リゾムコウルミ
エハイのリパーゼと比較して、熱や有機溶剤に対する安
定性はそれほど高くなく、反応を効率的に進行させた
り、また高融点の脂肪酸やトリグレセリドに作用させる
等より広範囲に工業的に使用するためには、より安定な
リパーゼが必要とされていた（西元ら、油化学、第41
巻、第9 号、274 〜282 、1992年）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、熱に
対する安定性に優れた耐熱性リパーゼ、特にリゾプス属
のリパーゼについて耐熱性リパーゼ、並びにその製造方
法を提供することにある。
対する安定性に優れた耐熱性リパーゼ、特にリゾプス属
のリパーゼについて耐熱性リパーゼ、並びにその製造方
法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者はこの課題を解
決するために鋭意研究を行った結果、リゾプスニベウス
のリパーゼ遺伝子にランダムな突然変異を導入し、この
遺伝子を酵母内で発現が制御されるプロモーターの下流
に結合して酵母で培地中に発現分泌させることによっ
て、目的とする安定性が向上した変異リパーゼを作製す
ることができた。更にこの変異リパーゼの耐熱性に関与
しているアミノ酸置換部位を検討し、このリゾプスニベ
ウスリパーゼの高次構造から得られる情報を活用するこ
とによって、本発明を完成するに至った。
決するために鋭意研究を行った結果、リゾプスニベウス
のリパーゼ遺伝子にランダムな突然変異を導入し、この
遺伝子を酵母内で発現が制御されるプロモーターの下流
に結合して酵母で培地中に発現分泌させることによっ
て、目的とする安定性が向上した変異リパーゼを作製す
ることができた。更にこの変異リパーゼの耐熱性に関与
しているアミノ酸置換部位を検討し、このリゾプスニベ
ウスリパーゼの高次構造から得られる情報を活用するこ
とによって、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち、本発明は配列番号１に示される
アミノ酸配列を有するリパーゼにおいて、その第３０６
番目のプロリンから第３１５番目のスレオニン間のαヘ
リックスを構成するアミノ酸配列のうちのいずれかのア
ミノ酸がその他のアミノ酸に置換されていることを特徴
とする耐熱性リパーゼである。上記のその他のアミノ酸
に置換されている例としては第３１２番目のグルタミン
酸がバリンに置換されたものが上げられる。
アミノ酸配列を有するリパーゼにおいて、その第３０６
番目のプロリンから第３１５番目のスレオニン間のαヘ
リックスを構成するアミノ酸配列のうちのいずれかのア
ミノ酸がその他のアミノ酸に置換されていることを特徴
とする耐熱性リパーゼである。上記のその他のアミノ酸
に置換されている例としては第３１２番目のグルタミン
酸がバリンに置換されたものが上げられる。
【０００９】さらに、本発明は、配列番号１に示される
アミノ酸配列を有するリパーゼにおいて、その第３０６
番目のプロリンから第３１５番目のスレオニン間のαヘ
リックスを構成するアミノ酸配列のうちのいずれかのア
ミノ酸とその他のリパーゼを構成するアミノ酸配列のい
ずれかのアミノ酸とが相互に非共有結合および又は共有
結合を形成しうるようなアミノ酸であることを特徴とす
る耐熱性リパーゼである。
アミノ酸配列を有するリパーゼにおいて、その第３０６
番目のプロリンから第３１５番目のスレオニン間のαヘ
リックスを構成するアミノ酸配列のうちのいずれかのア
ミノ酸とその他のリパーゼを構成するアミノ酸配列のい
ずれかのアミノ酸とが相互に非共有結合および又は共有
結合を形成しうるようなアミノ酸であることを特徴とす
る耐熱性リパーゼである。
【００１０】さらに、本発明は、前記αヘリックスを構
成するアミノ酸配列のうちのいずれかのアミノ酸と第３
６０番目から第３６４番目のループ中のいずれかのアミ
ノ酸とが相互に非共有結合及び／又は共有結合を形成し
うるようなアミノ酸であることを特徴とする耐熱性リパ
ーゼである。上記αヘリックスを構成するアミノ酸配列
のうちのいずれかのアミノ酸としては第３１２番目のグ
ルタミン酸をバリンで置換された例が挙げられる。
成するアミノ酸配列のうちのいずれかのアミノ酸と第３
６０番目から第３６４番目のループ中のいずれかのアミ
ノ酸とが相互に非共有結合及び／又は共有結合を形成し
うるようなアミノ酸であることを特徴とする耐熱性リパ
ーゼである。上記αヘリックスを構成するアミノ酸配列
のうちのいずれかのアミノ酸としては第３１２番目のグ
ルタミン酸をバリンで置換された例が挙げられる。
【００１１】上記第３６０番目から第３６４番目のルー
プ中のいずれかのアミノ酸としては第３６２番目のアミ
ノ酸がイソロイシンの例が挙げられる。また、上記項非
共有結合としては疎水結合の例が挙げられる。さらに、
本発明は、前記の耐熱性リパーゼのアミノ酸配列をコー
ドする耐熱性リパーゼ遺伝子である。
プ中のいずれかのアミノ酸としては第３６２番目のアミ
ノ酸がイソロイシンの例が挙げられる。また、上記項非
共有結合としては疎水結合の例が挙げられる。さらに、
本発明は、前記の耐熱性リパーゼのアミノ酸配列をコー
ドする耐熱性リパーゼ遺伝子である。
【００１２】さらに、本発明は、前記の耐熱性リパーゼ
遺伝子を含有する発現ベクターである。。さらに、本発
明は、宿主細胞を前記発現ベクターにより形質転換した
形質転換体である。上記宿主細胞としては酵母サッカロ
ミセスセレビジア（Saccharomyces cerevisiae）が挙げ
られる。
遺伝子を含有する発現ベクターである。。さらに、本発
明は、宿主細胞を前記発現ベクターにより形質転換した
形質転換体である。上記宿主細胞としては酵母サッカロ
ミセスセレビジア（Saccharomyces cerevisiae）が挙げ
られる。
【００１３】さらに、本発明は、前記の形質転換体を培
地に培養し、培養物から耐熱性リパーゼを採取すること
を特徴とする耐熱性リパーゼの製造法である。以下、本
発明を詳細に説明する。遺伝子にランダムな変異を導入
する方法は当該技術分野において数多く報告されてい
る。リゾプス属のリパーゼ遺伝子にランダムな変異を導
入する場合、例えば、特開平3-290186公報に示されたプ
ラスミドpGPD24等のリゾプス属のリパーゼ遺伝子を含む
プラスミドを用いて、Myers らの方法(Myers,R.M.,L.s.
Lerman & T.Maniatis.,Science ,229 巻 242頁 1985
年) 、David らの方法(David W. Leung, Ellson Chen,
David V. Goeddel ,A journal of Methods in Cell and
Molecular Biology,1巻, 1 号, 11頁, 1989年) など一
般的なランダム変異技術を使うことができる。
地に培養し、培養物から耐熱性リパーゼを採取すること
を特徴とする耐熱性リパーゼの製造法である。以下、本
発明を詳細に説明する。遺伝子にランダムな変異を導入
する方法は当該技術分野において数多く報告されてい
る。リゾプス属のリパーゼ遺伝子にランダムな変異を導
入する場合、例えば、特開平3-290186公報に示されたプ
ラスミドpGPD24等のリゾプス属のリパーゼ遺伝子を含む
プラスミドを用いて、Myers らの方法(Myers,R.M.,L.s.
Lerman & T.Maniatis.,Science ,229 巻 242頁 1985
年) 、David らの方法(David W. Leung, Ellson Chen,
David V. Goeddel ,A journal of Methods in Cell and
Molecular Biology,1巻, 1 号, 11頁, 1989年) など一
般的なランダム変異技術を使うことができる。
【００１４】かくして得られた、ランダムに変異を導入
した変異ＤＮＡ断片は、ＹＥｐ３５１、ＹＥｐ３５２(J
ohn E. Hill ら, Yeast, 2, 163 〜167, 1986 年に記
載) 等の大腸菌と酵母のシャトルベクターにこの変異Ｄ
ＮＡをクローニングする。この時、この変異ＤＮＡがコ
ードしている変異リパーゼが適当な宿主細胞、好適には
サッカロミセスセレビジア(Sacchromyecs cerevisae)、
チゴサッカロミセスセレビジア(Zygoacchromyecs cerev
isae) 等の酵母で効率的に発現させるために、ホスホグ
リセロキナーゼ(PGK) グリセルアルデヒド-3- リン酸脱
水素酵素(GADPH)、アルコール脱水素酵素(ADH) 等の酵
母由来のプロモーターの下流に該変異ＤＮＡを連結す
る。この様にして構築された変異リパーゼ発現ライブラ
リーは、例えば電気パルス法などの一般的な方法に従っ
て、酵母に形質転換するとよい。
した変異ＤＮＡ断片は、ＹＥｐ３５１、ＹＥｐ３５２(J
ohn E. Hill ら, Yeast, 2, 163 〜167, 1986 年に記
載) 等の大腸菌と酵母のシャトルベクターにこの変異Ｄ
ＮＡをクローニングする。この時、この変異ＤＮＡがコ
ードしている変異リパーゼが適当な宿主細胞、好適には
サッカロミセスセレビジア(Sacchromyecs cerevisae)、
チゴサッカロミセスセレビジア(Zygoacchromyecs cerev
isae) 等の酵母で効率的に発現させるために、ホスホグ
リセロキナーゼ(PGK) グリセルアルデヒド-3- リン酸脱
水素酵素(GADPH)、アルコール脱水素酵素(ADH) 等の酵
母由来のプロモーターの下流に該変異ＤＮＡを連結す
る。この様にして構築された変異リパーゼ発現ライブラ
リーは、例えば電気パルス法などの一般的な方法に従っ
て、酵母に形質転換するとよい。
【００１５】該変異リパーゼ発現ライブラリーを導入し
た形質転換細胞、例えば形質転換酵母を、１プレート当
たり、２００〜３００コロニーになるようにＹＰＤプレ
ート等にプレーティングし、３０℃で２日間培養する。
これを同じくＹＰＤプレートにレプリカを行い、レプリ
カしたプレートを同３０℃で一日培養する。このＹＰＤ
プレートに１％のトリブチリンを含んだ寒天を重層し、
５５℃で一晩保温し、この条件でもハローを形成する菌
株を選択し、マスタープレートからこの菌株を選択す
る。尚、野生型リパーゼは５５℃では加熱失活の為、殆
どハローを形成しない。常法により、例えばＹＰＤ培地
のような培地で、３０℃で２〜５日間、振とう培養を行
い、菌体外に変異リパーゼを蓄積することが出来る。
た形質転換細胞、例えば形質転換酵母を、１プレート当
たり、２００〜３００コロニーになるようにＹＰＤプレ
ート等にプレーティングし、３０℃で２日間培養する。
これを同じくＹＰＤプレートにレプリカを行い、レプリ
カしたプレートを同３０℃で一日培養する。このＹＰＤ
プレートに１％のトリブチリンを含んだ寒天を重層し、
５５℃で一晩保温し、この条件でもハローを形成する菌
株を選択し、マスタープレートからこの菌株を選択す
る。尚、野生型リパーゼは５５℃では加熱失活の為、殆
どハローを形成しない。常法により、例えばＹＰＤ培地
のような培地で、３０℃で２〜５日間、振とう培養を行
い、菌体外に変異リパーゼを蓄積することが出来る。
【００１６】培養後、遠心分離などにより、培養物から
菌体を分離除去し、上清からＵＦ濃縮や硫安沈殿などの
常法によりリパーゼを回収、精製する。かくして製造さ
れたリパーゼは１・３位特異性を保持した形の熱に対す
る安定性の向上したリパーゼとして、エステル交換やエ
ステル合成反応に使用することが可能となる。
菌体を分離除去し、上清からＵＦ濃縮や硫安沈殿などの
常法によりリパーゼを回収、精製する。かくして製造さ
れたリパーゼは１・３位特異性を保持した形の熱に対す
る安定性の向上したリパーゼとして、エステル交換やエ
ステル合成反応に使用することが可能となる。
【００１７】
【発明の実施の形態】次に本発明を実施例により更に詳
細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定される
ものではない。なお、この実施例で使用する制限酵素 E
coRI、SalI、BamHI 、HincII、SacI、SacI、HindIII 、
NcoI、Bg1IIは東洋紡、宝酒造社製のもので市販されて
いるのもである。
細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定される
ものではない。なお、この実施例で使用する制限酵素 E
coRI、SalI、BamHI 、HincII、SacI、SacI、HindIII 、
NcoI、Bg1IIは東洋紡、宝酒造社製のもので市販されて
いるのもである。
【００１８】〔実施例１〕 (1) リゾプス属由来のリパーゼ遺伝子を含むプラスミド
pGPD24の作製 リゾプスニベウス（Rhizopus niveus ）のリパーゼ遺伝
子を含むプラスミドpGPD24は、特開平3-290186公報に従
い、以下のようにして構築した。まず、リゾプスニベウ
ス（Rhizopus niveus ）（IFO 4759) のリパーゼ遺伝子
に由来する4.3kb のPstI切断のＤＮＡ断片を有するプラ
スミドpGPIより、3.0kb ＤＮＡをアガロースゲル電気泳
動法により抽出して単離し、クレノウ断片を用い、その
両端を平滑化した。平滑末端化した3.0kb のEcoRI-BamH
IDNA断片をベクターpUC18 のHincII部位にサブクローニ
ングしてプラスミドpGPE3を得た。pGPE3をBamHI および
SacIの両制限酵素で切断し、エキソヌクレアーゼIII 及
びマングビーンヌクレアーゼを用いて、BamHI 部位側か
らリパーゼ遺伝子の５’側のプロモーター領域の欠失を
行ってプラスミドpGPD24を得た（図１参照）。
pGPD24の作製 リゾプスニベウス（Rhizopus niveus ）のリパーゼ遺伝
子を含むプラスミドpGPD24は、特開平3-290186公報に従
い、以下のようにして構築した。まず、リゾプスニベウ
ス（Rhizopus niveus ）（IFO 4759) のリパーゼ遺伝子
に由来する4.3kb のPstI切断のＤＮＡ断片を有するプラ
スミドpGPIより、3.0kb ＤＮＡをアガロースゲル電気泳
動法により抽出して単離し、クレノウ断片を用い、その
両端を平滑化した。平滑末端化した3.0kb のEcoRI-BamH
IDNA断片をベクターpUC18 のHincII部位にサブクローニ
ングしてプラスミドpGPE3を得た。pGPE3をBamHI および
SacIの両制限酵素で切断し、エキソヌクレアーゼIII 及
びマングビーンヌクレアーゼを用いて、BamHI 部位側か
らリパーゼ遺伝子の５’側のプロモーター領域の欠失を
行ってプラスミドpGPD24を得た（図１参照）。
【００１９】(2) 酵母 PGKプロモーターの下流に連結し
たリパーゼ遺伝子を含むプラスミドpUC118PLipS の作製 pGPD24プラスミドＤＮＡをEcoRI とSalIの両制限酵素で
切断した後、クレノウ断片を用いて、その両端を平滑化
した。そのＤＮＡ断片に、XbaIリンカー（5CTCTAGAG
3'）を付加した後、制限酵素XbaIで切断し、pUC118のXb
aI部位にサブクローニングして、プラスミドpUC118Lip
を得た。pUC118Lip をSphI及びSalIの両制限酵素で切断
し、エキソヌクレアーゼIII 、マングビーンヌクレアー
ゼによりSalI部位からリパーゼ遺伝子の3'側に非翻訳領
域の欠失処理を行った後、クレノウ断片により両末端を
平滑化した。両末端にSalIリンカー(5'GGTCGACC3')を付
加した後、セルフライゲーションによりプラスミドpUC1
18LipSを得た。pUC118LipSはリパーゼ遺伝子の3'側非翻
訳領域が約１kb欠失されたものである。得られたプラス
ミドpUC118LipSのリパーゼ遺伝子内のHindIII 部位を欠
失するために、合成オリゴヌクレオチド(3'CCACGTGTTCG
AGACGAAC5') を用いて部位特異的変異処理を行った。変
異処理に必要なpUC118LipSの１本鎖ＤＮＡや変異の為の
オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異処理は部位
特異的変異キットMutan-K 〔宝酒造（株）〕製を用い、
方法は総てそのマニュアルに従った。かくして得られた
プラスミドはpUC118LipSHDをBamHI 及びSalIの両制限酵
素で切断した後、酵母のPGK （フォスフォグリセロキナ
ーゼ）プロモーターを持つ発現プラスミドpMA91(J. Mel
lor ら、Gene、24、1 、1983年に記載) のBglII とSalI
部位に導入し、pMA91LipS を得た。このプラスミド(pMA
91LipS) ＤＮＡを制限酵素HindIII で切断後、クレノウ
断片によりＤＮＡ末端を平滑化した。更に、その平滑末
端にBamHI リンカー(5'CGGATCCG 3') を付加した後、Ba
mHI 及びSalIで切断し、YEp351、YEp352(John E. Hill
ら, Yeast, 2, 163 〜167, 1986 年に記載) のBamHI 、
SalI部位にサブクローニングを行い、酵母PGK プロモー
ターの下流に連結したリパーゼ遺伝子を含むプラスミYE
p351PLipSとYEp352PLipSを得た（図２、図３参照）。
たリパーゼ遺伝子を含むプラスミドpUC118PLipS の作製 pGPD24プラスミドＤＮＡをEcoRI とSalIの両制限酵素で
切断した後、クレノウ断片を用いて、その両端を平滑化
した。そのＤＮＡ断片に、XbaIリンカー（5CTCTAGAG
3'）を付加した後、制限酵素XbaIで切断し、pUC118のXb
aI部位にサブクローニングして、プラスミドpUC118Lip
を得た。pUC118Lip をSphI及びSalIの両制限酵素で切断
し、エキソヌクレアーゼIII 、マングビーンヌクレアー
ゼによりSalI部位からリパーゼ遺伝子の3'側に非翻訳領
域の欠失処理を行った後、クレノウ断片により両末端を
平滑化した。両末端にSalIリンカー(5'GGTCGACC3')を付
加した後、セルフライゲーションによりプラスミドpUC1
18LipSを得た。pUC118LipSはリパーゼ遺伝子の3'側非翻
訳領域が約１kb欠失されたものである。得られたプラス
ミドpUC118LipSのリパーゼ遺伝子内のHindIII 部位を欠
失するために、合成オリゴヌクレオチド(3'CCACGTGTTCG
AGACGAAC5') を用いて部位特異的変異処理を行った。変
異処理に必要なpUC118LipSの１本鎖ＤＮＡや変異の為の
オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異処理は部位
特異的変異キットMutan-K 〔宝酒造（株）〕製を用い、
方法は総てそのマニュアルに従った。かくして得られた
プラスミドはpUC118LipSHDをBamHI 及びSalIの両制限酵
素で切断した後、酵母のPGK （フォスフォグリセロキナ
ーゼ）プロモーターを持つ発現プラスミドpMA91(J. Mel
lor ら、Gene、24、1 、1983年に記載) のBglII とSalI
部位に導入し、pMA91LipS を得た。このプラスミド(pMA
91LipS) ＤＮＡを制限酵素HindIII で切断後、クレノウ
断片によりＤＮＡ末端を平滑化した。更に、その平滑末
端にBamHI リンカー(5'CGGATCCG 3') を付加した後、Ba
mHI 及びSalIで切断し、YEp351、YEp352(John E. Hill
ら, Yeast, 2, 163 〜167, 1986 年に記載) のBamHI 、
SalI部位にサブクローニングを行い、酵母PGK プロモー
ターの下流に連結したリパーゼ遺伝子を含むプラスミYE
p351PLipSとYEp352PLipSを得た（図２、図３参照）。
【００２０】(3) リパーゼ遺伝子にランダム変異の導入 リゾプスニベウス属のリパーゼをコードしているＤＮＡ
断片にランダムな変異を導入する場合は、David らの方
法(David W. Leung, Ellson Chen, David V. Goeddel ,
A journal of Methods in Cell and Molecular Biolog
y,1巻, 1 号, 11頁, 1989年) に従った。すなわち、酵
母PGK プロモーターの下流に連結したリパーゼ遺伝子を
含むプラスミドYEp351PLipS をSspIで切断し、プライマ
ーRPP101(5'AGCGATCTCCAAGCTGAACCT3') とRPP201(3'TGA
CCGGCAGCAAAATGTT5') を使用して以下の条件でリパーゼ
遺伝子にランダムな変異を導入しながらＰＣＲを行っ
た。
断片にランダムな変異を導入する場合は、David らの方
法(David W. Leung, Ellson Chen, David V. Goeddel ,
A journal of Methods in Cell and Molecular Biolog
y,1巻, 1 号, 11頁, 1989年) に従った。すなわち、酵
母PGK プロモーターの下流に連結したリパーゼ遺伝子を
含むプラスミドYEp351PLipS をSspIで切断し、プライマ
ーRPP101(5'AGCGATCTCCAAGCTGAACCT3') とRPP201(3'TGA
CCGGCAGCAAAATGTT5') を使用して以下の条件でリパーゼ
遺伝子にランダムな変異を導入しながらＰＣＲを行っ
た。
【００２１】（条件） 1ng SspIで切断したYEp351PLips 67mM Tris-HCl pH8.8 16.6mM (NH4)2SO4 6.1mM MgCl2 6.7 μM EDTA pH8.0 0.17mg/ml bovine serum albumin 10mM β-mercaptoethanol 0.5mM MnCl2 60μg/ml RPP101 60μg/ml RPP201 1mM dGTP 0.2mM dATP 1mM dTTP 1mM dCTP total 100 μl （反応条件） 1. 94 ℃、７分 2. 50 ℃、１分 3. 4IU Taq ポリメラーゼ添加 4. 70 ℃、４分 5. 94 ℃、１分 6. 50 ℃、１分 7. 70 ℃、４分 8.5 →6 →7 を24回行う。
【００２２】この様にして得られた、変異導入リパーゼ
遺伝子はHindIII とNcoIの両制限酵素で切断しアガロー
ス電気泳動で目的とする1.6kb のＤＮＡ断片を精製した
後、同じくHindIII とNcoIの両制限酵素で切断し、同様
に精製した1.6kb のリパーゼをコードしているＤＮＡ断
片を除いたYEp351PLipS のHindIII 、NcoI部位挿入し、
大腸菌JM109 株に形質転換を行い、約６万個の変異リパ
ーゼライブラリーを作製した（図４参照）。
遺伝子はHindIII とNcoIの両制限酵素で切断しアガロー
ス電気泳動で目的とする1.6kb のＤＮＡ断片を精製した
後、同じくHindIII とNcoIの両制限酵素で切断し、同様
に精製した1.6kb のリパーゼをコードしているＤＮＡ断
片を除いたYEp351PLipS のHindIII 、NcoI部位挿入し、
大腸菌JM109 株に形質転換を行い、約６万個の変異リパ
ーゼライブラリーを作製した（図４参照）。
【００２３】(4) 変異リパーゼ発現ライブラリーの作製 上記のようにして作成された約６万個の変異リパーゼラ
イブラリーに含まれている変異リパーゼ遺伝子を、酵母
サッカロマイセスセレビジアで発現、更に分泌生産させ
る為に、この変異リパーゼライブラリーから、プラスミ
ドＤＮＡを回収し、これをサッカロマイセスセレビジア
AH22株（ATCC38626 ）に電気パルス法で形質転換した。
これにより、変異リパーゼを分泌する形質転換体を約５
万コロニー得た。
イブラリーに含まれている変異リパーゼ遺伝子を、酵母
サッカロマイセスセレビジアで発現、更に分泌生産させ
る為に、この変異リパーゼライブラリーから、プラスミ
ドＤＮＡを回収し、これをサッカロマイセスセレビジア
AH22株（ATCC38626 ）に電気パルス法で形質転換した。
これにより、変異リパーゼを分泌する形質転換体を約５
万コロニー得た。
【００２４】(5) 安定性が向上した変異リパーゼのスク
リーニング。 (4) で得られた形質転換体を１プレート当たり200 〜30
0 コロニーになるようにＹＰＤプレート（1%酵母エキ
ス、2%ペプトン、2%グルコース）上にプレーティング
し、30℃で４８時間培養した。このプレートを同ＹＰＤ
プレートにレプリカを行い、レプリカされたプレートは
更に２４時間、30℃で培養した。次に、このプレートに
1%トリブチリン、1%ペプトン、20μg/mlのストレプトマ
イシンを含む2%アガーを重層し、55℃で一晩保温した。
この後、ハローを形成しているコロニーをマスタープレ
ートから選択し、Ｍ６０株を得た。更に、このＭ６０株
をＹＰＤ培地で７２時間培養し、培地中にＭ６０変異リ
パーゼを分泌生産させた。
リーニング。 (4) で得られた形質転換体を１プレート当たり200 〜30
0 コロニーになるようにＹＰＤプレート（1%酵母エキ
ス、2%ペプトン、2%グルコース）上にプレーティング
し、30℃で４８時間培養した。このプレートを同ＹＰＤ
プレートにレプリカを行い、レプリカされたプレートは
更に２４時間、30℃で培養した。次に、このプレートに
1%トリブチリン、1%ペプトン、20μg/mlのストレプトマ
イシンを含む2%アガーを重層し、55℃で一晩保温した。
この後、ハローを形成しているコロニーをマスタープレ
ートから選択し、Ｍ６０株を得た。更に、このＭ６０株
をＹＰＤ培地で７２時間培養し、培地中にＭ６０変異リ
パーゼを分泌生産させた。
【００２５】(6) Ｍ６０変異リパーゼの耐熱性評価 Ｍ６０変異リパーゼの耐熱性の評価はオリーブオイル-
ポリビニルアルコールエマルジョン系（仲ら、薬剤学、
第４５巻、３４１、１９８５）で評価した。すなわち、
5ml のエマルジョンに4ml 0.2Mリン酸緩衝液pH7.0 、更
に1ml のサンプルを加え４０℃、５０℃、６０℃、７０
℃で３０分インキュベートし、反応は10mlのアセトン／
エタノール混合液(1:1,v/v) を添加して停止させた。そ
の後、遊離脂肪酸量を定量し、１分間に１μmol の脂肪
酸を遊離する酵素量を１ＩＵとした。この様にして変異
を受けていないリゾプス属のリパーゼと比較した結果を
図２に示す。明らかにＭ６０変異リパーゼは耐熱性が１
０℃上昇していた（図５参照）。
ポリビニルアルコールエマルジョン系（仲ら、薬剤学、
第４５巻、３４１、１９８５）で評価した。すなわち、
5ml のエマルジョンに4ml 0.2Mリン酸緩衝液pH7.0 、更
に1ml のサンプルを加え４０℃、５０℃、６０℃、７０
℃で３０分インキュベートし、反応は10mlのアセトン／
エタノール混合液(1:1,v/v) を添加して停止させた。そ
の後、遊離脂肪酸量を定量し、１分間に１μmol の脂肪
酸を遊離する酵素量を１ＩＵとした。この様にして変異
を受けていないリゾプス属のリパーゼと比較した結果を
図２に示す。明らかにＭ６０変異リパーゼは耐熱性が１
０℃上昇していた（図５参照）。
【００２６】(7) Ｍ６０変異リパーゼの変異部位の同定 上記の(5) で得られた、Ｍ６０変異リパーゼの変異部位
の同定のために、Ｍ６０株を、5ml 最少培地（0.67%YN
B,20 μg/mlヒスチジン,2% グルコース）で２４時間培
養後、遠心して菌体を回収し、100 μl 0.5M NaCl 0.2M
Tris-HCl pH7.60.01M EDTA 1% SDS 中でガラスビーズ
により菌体を破砕した。得られた溶液に更に１×ＴＥ飽
和フェノール／クロロホルム（１：１）を加え、撹はん
後遠心分離を行い水層を回収し、エタノールでプラスミ
ドＤＮＡを沈殿回収した。このプラスミドＤＮＡを大腸
菌に形質転換し、この大腸菌からプラスミドＤＮＡを回
収することでＤＮＡ配列を決定できる量まで増幅した。
変異リパーゼ遺伝子の塩基配列の決定は常法に従い行っ
た。その結果を表１に示す。表１に示した様に、Ｍ６０
変異リパーゼはアミノ酸配列として第１１３番目のプロ
リンがヒスチジンに、第１３１番目のアラニンがスレオ
ニンに第３１２番目のグルタミン酸がバリンに置換され
ていた。
の同定のために、Ｍ６０株を、5ml 最少培地（0.67%YN
B,20 μg/mlヒスチジン,2% グルコース）で２４時間培
養後、遠心して菌体を回収し、100 μl 0.5M NaCl 0.2M
Tris-HCl pH7.60.01M EDTA 1% SDS 中でガラスビーズ
により菌体を破砕した。得られた溶液に更に１×ＴＥ飽
和フェノール／クロロホルム（１：１）を加え、撹はん
後遠心分離を行い水層を回収し、エタノールでプラスミ
ドＤＮＡを沈殿回収した。このプラスミドＤＮＡを大腸
菌に形質転換し、この大腸菌からプラスミドＤＮＡを回
収することでＤＮＡ配列を決定できる量まで増幅した。
変異リパーゼ遺伝子の塩基配列の決定は常法に従い行っ
た。その結果を表１に示す。表１に示した様に、Ｍ６０
変異リパーゼはアミノ酸配列として第１１３番目のプロ
リンがヒスチジンに、第１３１番目のアラニンがスレオ
ニンに第３１２番目のグルタミン酸がバリンに置換され
ていた。
【００２７】 表 １ Ｍ６０の変異部位 ─────────────────────────────────── 変異リパーゼ 塩基変異部位 塩基変異 アミノ酸変異部位 アミノ酸変異 ─────────────────────────────────── Ｍ６０ 338 Ｃ→Ａ 113 Pro→His 392 Ｇ→Ａ 131 Ala→Thr 453 Ｃ→Ｔ 935 Ａ→Ｔ 313 Glu→Val ───────────────────────────────────
【００２８】(8) 耐熱性に関与するアミノ酸置換の同定 Ｍ６０変異リパーゼはアミノ酸配列として第１１３番目
のプロリンがヒスチジンに、第１３１番目のアラニンが
スレオニンに第３１２番目のグルタミン酸がバリンに置
換されていた。次に、このアミノ酸置換のうちどのアミ
ノ酸置換が耐熱性に関与しているかを検討するために、
変異を受けていない野生型リパーゼとＭ６０変異リパー
ゼとの間にキメラリパーゼを作製して検討した。第１１
３番目のプロリンがヒスチジンに、そして第１３１番目
のアラニンがスレオニンへの置換は、リパーゼをコード
しているＤＮＡ断片の制限酵素地図上で、BamHI とBstE
IIの間に位置している。第３１２番目のグルタミン酸が
バリンへ置換の置換は、BstEIIとHindIII の間に位置し
ている。そこで、前２つのアミノ酸置換を含むBamHI 、
BstEII断片を未変異のリパーゼ遺伝子を含むYEp352PLip
S のBamHI,BstEIIの間に挿入しプラスミドYEp352LipSch
1 を作製した。更に、第３１２番目のグルタミン酸がバ
リンへの置換を含むBstEII,HindIII断片を同様にYEp351
PLipS のBstEII,HindIIIの間に挿入しプラスミドYEp352
LipSch2 を作製した。次に、この作製したプラスミドYE
p352LipSch1 、YEp352LipSch2 をそれぞれ酵母ND12B 株
に形質転換し、ＣＨ１株とＣＨ２株を作製した。尚、Ｃ
Ｈ１株はキメラリパーゼ１を、ＣＨ２株はキメラリパー
ゼ２を分泌生産する。この形質転換体をそれぞれＹＰＤ
培地で７２時間培養し、培地中にキメラリパーゼ１、キ
メラリパーゼ２を分泌生産させた（図６、図７参照）。
のプロリンがヒスチジンに、第１３１番目のアラニンが
スレオニンに第３１２番目のグルタミン酸がバリンに置
換されていた。次に、このアミノ酸置換のうちどのアミ
ノ酸置換が耐熱性に関与しているかを検討するために、
変異を受けていない野生型リパーゼとＭ６０変異リパー
ゼとの間にキメラリパーゼを作製して検討した。第１１
３番目のプロリンがヒスチジンに、そして第１３１番目
のアラニンがスレオニンへの置換は、リパーゼをコード
しているＤＮＡ断片の制限酵素地図上で、BamHI とBstE
IIの間に位置している。第３１２番目のグルタミン酸が
バリンへ置換の置換は、BstEIIとHindIII の間に位置し
ている。そこで、前２つのアミノ酸置換を含むBamHI 、
BstEII断片を未変異のリパーゼ遺伝子を含むYEp352PLip
S のBamHI,BstEIIの間に挿入しプラスミドYEp352LipSch
1 を作製した。更に、第３１２番目のグルタミン酸がバ
リンへの置換を含むBstEII,HindIII断片を同様にYEp351
PLipS のBstEII,HindIIIの間に挿入しプラスミドYEp352
LipSch2 を作製した。次に、この作製したプラスミドYE
p352LipSch1 、YEp352LipSch2 をそれぞれ酵母ND12B 株
に形質転換し、ＣＨ１株とＣＨ２株を作製した。尚、Ｃ
Ｈ１株はキメラリパーゼ１を、ＣＨ２株はキメラリパー
ゼ２を分泌生産する。この形質転換体をそれぞれＹＰＤ
培地で７２時間培養し、培地中にキメラリパーゼ１、キ
メラリパーゼ２を分泌生産させた（図６、図７参照）。
【００２９】(9) キメラリパーゼの耐熱性測定 上記で作製したキメラリパーゼのそれぞれの耐熱性をオ
リーブオイル- ポリビニルアルコールエマルジョン系
（(7) Ｍ６０変異リパーゼの耐熱性評価に記載した方
法）で評価した。その結果、キメラリパーゼ２がＭ６０
変異リパーゼと同じ耐熱性を示した。従って、Ｍ６０変
異リパーゼで耐熱性に関与しているアミノ酸置換は第３
１２番目のグルタミン酸がバリンへの置換であることが
明らかとなった（図８参照）。このＣＨ２株は、工業技
術院生命工学工業技術研究所にサッカロマイセスセレビ
ジアＣＨ２として寄託し、その寄託番号はFERM P-15158
である。
リーブオイル- ポリビニルアルコールエマルジョン系
（(7) Ｍ６０変異リパーゼの耐熱性評価に記載した方
法）で評価した。その結果、キメラリパーゼ２がＭ６０
変異リパーゼと同じ耐熱性を示した。従って、Ｍ６０変
異リパーゼで耐熱性に関与しているアミノ酸置換は第３
１２番目のグルタミン酸がバリンへの置換であることが
明らかとなった（図８参照）。このＣＨ２株は、工業技
術院生命工学工業技術研究所にサッカロマイセスセレビ
ジアＣＨ２として寄託し、その寄託番号はFERM P-15158
である。
【００３０】(10)Ｍ６０変異リパーゼの耐熱性獲得のメ
カニズム リゾプスニベウスリパーゼIIの高次構造とキメラリパー
ゼ２の変異部位を図８に示す。第３１２番目のグルタミ
ン酸がバリンへ置換することによって、このバリンが第
３６２番目のイソロイシンとの間に疎水結合を形成し、
リパーゼの耐熱化が起こったと考えられた。即ち、リパ
ーゼ分子内の第３０６番目のプロリンから第３１５番目
のスレオニン間のαヘリックスと、第３６０番目から第
３６４番目間のループとの結合が安定化し、これにより
リパーゼが耐熱化されていた。従って、リゾプスニベウ
スリパーゼの耐熱化はこのαヘリックスとこのループ間
の安定性が重要であるとの結論に至った。
カニズム リゾプスニベウスリパーゼIIの高次構造とキメラリパー
ゼ２の変異部位を図８に示す。第３１２番目のグルタミ
ン酸がバリンへ置換することによって、このバリンが第
３６２番目のイソロイシンとの間に疎水結合を形成し、
リパーゼの耐熱化が起こったと考えられた。即ち、リパ
ーゼ分子内の第３０６番目のプロリンから第３１５番目
のスレオニン間のαヘリックスと、第３６０番目から第
３６４番目間のループとの結合が安定化し、これにより
リパーゼが耐熱化されていた。従って、リゾプスニベウ
スリパーゼの耐熱化はこのαヘリックスとこのループ間
の安定性が重要であるとの結論に至った。
【００３１】
【発明の効果】本発明によれば、リパーゼの熱に対する
安定性を向上させることができ、酵素使用量にたいする
生産性を向上させることが出来る。また、融点の高い基
質を用いた工業的なエステル合成、エステル交換反応シ
ステムの構築が可能となる。
安定性を向上させることができ、酵素使用量にたいする
生産性を向上させることが出来る。また、融点の高い基
質を用いた工業的なエステル合成、エステル交換反応シ
ステムの構築が可能となる。
【００３２】
配列番号１ 配列の長さ：３９２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：リゾプス ニベウス ＩＦＯ４７５９ 配列 ATGGTTTCATTCATTTCCATTTCTCAAGGTGTTAGTCTTTGTCTTCTT MetValSerPheIleSerIleSerGlnGlyValSerLeuCysLeuLeu 1 5 10 15 GTCTCTTCCATGATGCTCGGTTCATCTGTTGTTCCTGTTTCTGGTAAA ValSerSerMetMetLeuGlySerSerValValProValSerGlyLys 20 25 30 TCTGGATCTTCCAACACCGCCGTCTCTGCATCTGACAATGCTGCCCTC SerGlySerSerAsnThrAlaValSerAlaSerAspAsnAlaAlaLeu 35 40 45 CCTCCTCTCATCTCCAGCCGTTGTGCTCCTCCTTCTAACAAGGGAAGT ProProLeuIleSerSerArgCysAlaProProSerAsnLysGlySer 50 55 60 AAAAGCGATCTCCAAGCTGAACCTTACAACATGCAAAAGAATACAGAA LysSerAspLeuGlnAlaGluProTyrAsnMetGlnLysAsnThrGlu 65 70 75 80 TGGTATGAGTCCCATGGTGGCAACCTGACATCCATCGGAAAGCGTGAT TrpTyrGluSerHisGlyGlyAsnLeuThrSerIleGlyLysArgAsp 85 90 95 GACAACTTGGTTGGTGGCATGACTTTGGACTTACCCAGCGATGCTCCT AspAsnLeuValGlyGlyMetThrLeuAspLeuProSerAspAlaPro 100 105 110 CCTATCAGCCTCTCTAGCTCTACCAACAGCGCCTCTGATGGTGGTAAG ProIleSerLeuSerSerSerThrAsnSerAlaSerAspGlyGlyLys 115 120 125 GTTGTTGCTGCTACTACTGCTCAGATCCAAGAGTTCACCAAGTATGCT ValValAlaAlaThrThrAlaGlnIleGlnGluPheThrLysTyrAla 130 135 140 GGTATCGCTGCCACTGCCTACTGTCGTTCTGTTGTCCCTGGTAACAAG GlyIleAlaAlaThrAlaTyrCysArgSerValValProGlyAsnLys 145 150 155 160 TGGGATTGTGTCCAATGTCAAAAGTGGGTTCCTGATGGCAAGATCATC TrpAspCysValGlnCysGlnLysTrpValProAspGlyLysIleIle 165 170 175 ACTACCTTTACCTCCTTGCTTTCCGATACAAATGGTTACGTCTTGAGA ThrThrPheThrSerLeuLeuSerAspThrAsnGlyTyrValLeuArg 180 185 190 AGTGATAAACAAAAGACCATTTATCTTGTTTTCCGTGGTACCAACTCC SerAspLysGlnLysThrIleTyrLeuValPheArgGlyThrAsnSer 195 200 205 TTCAGAAGTGCCATCACTGATATCGTCTTCAACTTTTCTGACTACAAG PheArgSerAlaIleThrAspIleValPheAsnPheSerAspTyrLys 210 215 220 CCTGTCAAGGGCGCCAAAGTTCATGCTGGTTTCCTTTCCTCTTATGAG ProValLysGlyAlaLysValHisAlaGlyPheLeuSerSerTyrGlu 225 230 235 240 CAAGTTGTCAATGACTATTTCCCTGTCGTCCAAGAACAATTGACCGCC GlnValValAsnAspTyrPheProValValGlnGluGlnLeuThrAla 245 250 255 CACCCTACTTATAAGGTCATCGTTACCGGTCACTCACTCGGTGGTGCA HisProThrTyrLysValIleValThrGlyHisSerLeuGlyGlyAla 260 265 270 CAAGCTTTGCTTGCCGGTATGGATCTCTACCAACGTGAACCAAGATTG GlnAlaLeuLeuAlaGlyMetAspLeuTyrGlnArgGluProArgLeu 275 280 285 TCTCCCAAGAATTTGAGCATCTTCACTGTCGGTGGTCCTCGTGTTGGT SerProLysAsnLeuSerIlePheThrValGlyGlyProArgValGly 290 295 300 AACCCCACCTTTGCTTACTATGTTGAATCCACCGGTATCCCTTTCCAA AsnProThrPheAlaTyrTyrValGluSerThrGlyIleProPheGln 305 310 315 320 CGTACCGTTCACAAGAGAGATATCGTTCCTCACGTTCCTCCTCAATCC ArgThrValHisLysArgAspIleValProHisValProProGlnSer 325 330 335 TTCGGATTCCTTCATCCCGGTGTTGAATCTTGGATCAAGTCTGGTACT PheGlyPheLeuHisProGlyValGluSerTrpIleLysSerGlyThr 340 345 350 TCCAACGTTCAAATCTGTACTTCTGAAATTGAAACCAAGGATTGCAGT SerAsnValGlnIleCysThrSerGluIleGluThrLysAspCysSer 355 360 365 AACTCTATCGTTCCTTTCACCTCTATCCTTGACCACTTGAGTTACTTT AsnSerIleValProPheThrSerIleLeuAspHisLeuSerTyrPhe 370 375 380 GATATCAACGAAGGAAGCTGTTTGTAA AspIleAsnGluGlySerCysLeu* 385
【図１】リゾプス属由来のリパーゼ遺伝子を含むプラス
ミドpGPD24の作製の工程を示す図。
ミドpGPD24の作製の工程を示す図。
【図２】酵母 PGKプロモーターの下流に連結したリパー
ゼ遺伝子を含むプラスミドpUC118PLipS の作製の工程を
示す図。
ゼ遺伝子を含むプラスミドpUC118PLipS の作製の工程を
示す図。
【図３】酵母 PGKプロモーターの下流に連結したリパー
ゼ遺伝子を含むプラスミドYEp351PLipS 、YEp352PLipS
の作製の工程を示す図。
ゼ遺伝子を含むプラスミドYEp351PLipS 、YEp352PLipS
の作製の工程を示す図。
【図４】変異リパーゼの発現プラスミドの作製の工程を
示す図。
示す図。
【図５】Ｍ６０の加水分解反応における至適温度を示す
図。
図。
【図６】キメラリパーゼ１の作製の工程を示す図。
【図７】キメラリパーゼ２の作製の工程を示す図。
【図８】キメラリパーゼの加水分解反応における至適温
度を示す図。
度を示す図。
【図９】高次構造上におけるキメラリパーゼ２のアミノ
酸置換部位を示す図。
酸置換部位を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:845） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:865）
Claims (12)
- 【請求項１】 配列番号１に示されるアミノ酸配列を有
するリパーゼにおいて、その第３０６番目のプロリンか
ら第３１５番目のスレオニン間のαヘリックスを構成す
るアミノ酸配列のうちのいずれかのアミノ酸がその他の
アミノ酸に置換されていることを特徴とする耐熱性リパ
ーゼ。 - 【請求項２】 配列番号１に示されるアミノ酸配列を有
するリパーゼにおいて、第３１２番目のグルタミン酸が
バリンに置換されたものであることを特徴とする請求項
１記載の耐熱性リパーゼ。 - 【請求項３】 配列番号１に示されるアミノ酸配列を有
するリパーゼにおいて、その第３０６番目のプロリンか
ら第３１５番目のスレオニン間のαヘリックスを構成す
るアミノ酸配列のうちのいずれかのアミノ酸とその他の
リパーゼを構成するアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸
とが相互に非共有結合および又は共有結合を形成しうる
ようなアミノ酸であることを特徴とする耐熱性リパー
ゼ。 - 【請求項４】 請求項３記載のαヘリックスを構成する
アミノ酸配列のうちのいずれかのアミノ酸と第３６０番
目から第３６４番目のループ中のいずれかのアミノ酸と
が相互に非共有結合及び／又は共有結合を形成しうるよ
うなアミノ酸であることを特徴とする耐熱性リパーゼ。 - 【請求項５】 αヘリックスを構成するアミノ酸配列の
うちの第３１２番目のグルタミン酸がバリンで置換され
たものであることを特徴とする請求項３ないし４記載の
耐熱性リパーゼ。 - 【請求項６】 上記ループ中の第３６２番目のアミノ酸
がイソロイシンである請求項３ないし４に記載の耐熱性
リパーゼ。 - 【請求項７】 非共有結合が疎水結合である請求項３な
いし４に記載の耐熱性リパーゼ。 - 【請求項８】 請求項１ないし７に記載のアミノ酸配列
をコードする耐熱性リパーゼ遺伝子。 - 【請求項９】 請求項８記載の耐熱性リパーゼ遺伝子を
含有する発現ベクター。 - 【請求項１０】 宿主細胞を請求項９記載の発現ベクタ
ーにより形質転換した形質転換体。 - 【請求項１１】 宿主細胞が酵母サッカロミセスセレビ
ジア（Saccharomyces cerevisiae）である請求項１０記
載の形質転換体。 - 【請求項１２】 請求項１１記載の形質転換体を培地に
培養し、培養物から耐熱性リパーゼを採取することを特
徴とする耐熱性リパーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7242842A JPH0984584A (ja) | 1995-09-21 | 1995-09-21 | 耐熱性リパーゼおよびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7242842A JPH0984584A (ja) | 1995-09-21 | 1995-09-21 | 耐熱性リパーゼおよびその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0984584A true JPH0984584A (ja) | 1997-03-31 |
Family
ID=17095110
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7242842A Pending JPH0984584A (ja) | 1995-09-21 | 1995-09-21 | 耐熱性リパーゼおよびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0984584A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110904074A (zh) * | 2019-05-31 | 2020-03-24 | 江南大学 | 一种脂肪酶突变体及其在去污方面的应用 |
| CN112175976A (zh) * | 2020-11-12 | 2021-01-05 | 武汉轻工大学 | 一种耐高温脂肪酶基因tllgold及其应用 |
-
1995
- 1995-09-21 JP JP7242842A patent/JPH0984584A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110904074A (zh) * | 2019-05-31 | 2020-03-24 | 江南大学 | 一种脂肪酶突变体及其在去污方面的应用 |
| CN112175976A (zh) * | 2020-11-12 | 2021-01-05 | 武汉轻工大学 | 一种耐高温脂肪酶基因tllgold及其应用 |
| CN112175976B (zh) * | 2020-11-12 | 2021-12-28 | 武汉轻工大学 | 一种耐高温脂肪酶基因tllgold及其应用 |
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