JPH09508369A - レトロウイルスインテグラーゼの阻害法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 レトロウイルスインテグラーゼを阻害する方法がこのような治療を必要とする対象において明らかにされている。本方法は、ビス［5−アミジノ−2−ベンゾイミダゾリル］メタン、1,2−ビス［5−アミジノ−2−ベンゾイミダゾリル］エタン、1,2−ビス［5−アミジノ−2−ベンゾイミダゾリル］エテンのようなビス−ベンゾイミダゾール化合物または薬剤学的に許容可能なその塩のレトロウイルスインテグラーゼ阻害効果を発揮する有効量を上記対象に投与することを含む。レトロウイルス感染症を抑制する方法も明らかにされている。

Description

【発明の詳細な説明】 レトロウイルスインテグラーゼの阻害法 発明の範囲 本発明は、二価の陽イオンのビス−ベンゾイミダゾール（bis-benzimidazole ）類を用いてレトロウイルスインテグラーゼを阻害する方法に関する。 発明の背景 典型的なレトロウイルスのゲノムは、ウイルスの複製サイクルを仲介する三つ の主な酵素をコード化する。逆転写酵素は、ウイルスＲＮＡゲノムを二本鎖ＤＮ Ａに転換する。インテグラーゼは、このＤＮＡコピーを宿主細胞ゲノムに非特異 的に挿入し、プロテアーゼはウイルスの構造および非構造タンパクをその成熟型 に切断する。 レトロウイルスのライフサイクルの必須段階は、二本鎖ＤＮＡコピーの宿主ゲ ノムへの組み込みである。H．Sakai et al.，J.Virol．67，1169-74(1993)を参 照。このプロセスは、高度の保存配列認識と切断段階を必要とする。このため、 このプロセスを中断できる治療薬は、有効な特異的な抗ウイルス薬となるはずで ある。ウイルスポリメラーゼＣ末端のタンパク質、インテグラーゼ（IN）は、こ のプロセスに必要な唯一のウイルスタンパク質である。R．LaFeminaet al.，J． Virol．66，7414-7419(1992)を参照。 A．Fesen et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90，2399-2403（1993）は、 可能性のあるヒト免疫不全ウイルス１型（HIV-1）インテグラーゼ阻害剤として 、生体外（in vitro）インテグラーゼ分析を用いて種々の化学物質の研究を検討 している。この論文は、ドキソルビシン、ミトキサントローゼ（mitoxantrose） 、エリプチシン（ellipticine）、クエルセチンのような幾つかのトポイソメラ ーゼ阻 害剤を有力な阻害剤として報告している。幾つかのトポイソメラーゼ阻害剤は優 れた抗インテグラーゼ剤であったが、抗ウイルス効果との相関関係は観察されな かった。これは、多くのトポイソメラーゼ阻害剤が、その阻害のメカニズムに依 存して、重度の細胞傷害効果を有するという事実に少なくとも一部は起因するも のと考えられる。 R．LaFemina et al.，J．Virology 56，7414-7419(1992)は、HIV-1感染を起こ すためのインテグラーゼ酵素の絶対必要量を決定することによって、特異的HIV- 1抗ウイルス治療薬を得る目的としてのインテグラーゼ酵素の有用性を評価する 研究を報告している。この論文は、組み換えインテグラーゼに特異的アミノ酸置 換を誘発した結果を報告しており、突然変異タンパク質の特異的および非特異的 切断と組み込みを適切に仲介する能力を評価している。 発明の要約 本発明の第一の態様は、レトロウイルスインテグラーゼを阻害する方法（例え ば、生体外またはこのような治療が必要な対象において）である。本方法は、レ トロウイルスインテグラーゼを阻害する有効量の式（Ｉ） ［式中、Ｒ₁およびＲ₂は、Ｈまたは低級アルキル基からなる一群からそれぞれ独 立して選択されるか、またはＲ₁およびＲ₂はあわせて−(CH₂)_m−（ｍは２〜４） を表す。 Ｒ₃は、Ｈまたは低級アルキル基である。 Ｘは、炭素数１〜２の飽和または二重結合を一つ含む不飽和アルキルである（ 例えば、−(CH₂)_n−（ｎは１〜２）であり、非置換または１〜２回低級アルキ ルで置換されており、飽和または不飽和（一つの二重結合を含む）である）。］ で示される化合物または薬剤学的に許容可能なその塩を、対象に投与するか、あ るいはレトロウイルスインテグラーゼに接触させることを含む。 本発明の好ましい実施例において、Ｒ₁およびＲ₃はそれぞれＨであり、Ｒ₂は Ｈまたは低級アルキルである。Ｘは、−CH₂−CH₂-、−CH＝CH-、およびこれらが 低級アルキルにより１〜２回置換されたもののいずれかよりなる一群から選択さ れる。また薬剤学的に許容可能なそれらの塩である。現在、好ましい化合物は、 ビス［5−アミジノ−2−ベンゾイミダゾリル］メタン、1,2−ビス［5−アミジノ −2−ベンゾイミダゾリル］エタン、1,2−ビス［5−アミジノ−2−ベンゾイミダ ゾリル］エテン、1,2−ビス［5−イソプロピルアミジノ−2−ベンゾイミダゾリ ル］エテン、または薬剤学的に許容可能なそれらの塩である。 本発明の第二の態様は、レトロウイルス感染を抑制する方法である（例えば、 生体外またはこのような治療を必要とする対象において）。本方法は、レトロウ イルス感染症を抑制する有効量の上記式（Ｉ）で示される化合物または薬剤学的 に許容可能なその塩を投与する、またはそれらに接触させることを含む。現在、 好ましい化合物は、ビス［5−アミジノ−2−ベンゾイミダゾリル］メタン、1,2 −ビス［5−アミジノ−2−ベンゾイミダゾリル］エタン、1,2−ビス［5−アミジ ノ−2−ベンゾイミダゾリル］エテン、1,2−ビス［5−イソプロピルアミジノ−2 −ベンゾイミダゾリル］エテン、または薬剤学的に許容可能なそれらの塩である 。 医薬製剤を提供するために、薬剤学的に許容可能な担体（キャリヤー）中に式 （Ｉ）の化合物またはそれらの薬剤学的に許容可能な塩を、治療効果を発揮する 有効量含めることができる。治療効果を発揮する有効量とは、上述の方法を実行 するために有効な量である。 本発明の更なる態様は、レトロウイルスインテグラーゼを阻害するのための、 またはレトロウイルス感染を抑制するための薬物の調製に上記の式（Ｉ）の化合 物またはそれらの薬剤学的に許容可能な塩の使用を含む。 本発明の上記およびその他の目的および態様については、以下に詳細に示す。 図面の簡単な説明 図１は、種々の濃度の1,2−ビス［5−イソプロピルアミジノ−2−ベンゾイミ ダゾリル］エテン（化合物Ｂ）（30μM、100μM、300μM）により処理されたCEM 細胞、ヒトＴリンパ腫細胞系（human T-lymphona cell line）(A.H．Kaplan et al.，J．Virol．67，4050-5(1993))の平板効率を示す。ｘ軸は暴露日数を表し、 ｙ軸はミリリットル（ml）あたりの生存能力のある細胞数を表す。 図２は、種々の濃度の1,2−ビス［5−イソプロピルアミジノ−2−ベンゾイミ ダゾリル］エテン（化合物Ｂ）(30μM、100μM、300μM)の存在下に、マジック 細胞(J．Kimpton et al.，J．Virol．66,2232-2239(1992))の成長率を示す。ｘ 軸は暴露日数を表し、ｙ軸は細胞数を表す。 発明の詳細な説明 ここに使用される“低級アルキル”という言葉は、メチル、エチル、プロピル 、ブチル、イソプロピル、sec-ブチル、tert-ブチル等の炭素数１〜４の直鎖ま たは分岐アルキルを示す。好ましくは、メチルとエチルである。 本発明の方法により治療される対象は動物で、典型的には、哺乳動物（例えば 、ヒト、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、サル、類人猿(ape)等）およ びトリ（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ 等）を含む脊椎動物である。 本発明は、一般に、レトロウイルス、すなわちレトロウイルス科全体に応用さ れる。この科は、ＲＮＡゲノムとＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵 素）酵素活性を有するウイルスの全てを包含する。この科は、三つの亜科、(1) 全ての腫瘍ウイルスメンバーおよび多くの密接な関係を有する非腫瘍ウイルスを 含むオンコウイルス亜科、(2)ビスナウイルスのような“スロー”ウイルスであ るレンチウイルス亜科、および(3)臨床症状を伴わない持続性感染症を引き起こ す“泡状(foamy)”ウイルスであるスプーマウイルス亜科、に区分される。興味 の対象となるレトロウイルスには、免疫不全ウイルス１型（HIV-1）のようなヒ トのレトロウイルス；ニワトリのトリ肉腫および白血病ウイルス（avian sarcom a and leukosis viruses）（ASLVs）、特定のキジ種およびウズラ種の内因性ウ イルス、シチメンチョウの細網内皮症ウイルスとアヒルおよびニワトリの関連ウ イルス、およびシチメンチョウのリンパ増殖（lymphoproliferate）疾患ウイル スのようなトリのレトロウイルス；ネコの白血病ウイルス（FeLV）およびネコの 肉腫ウイルス（FeSV）と内因性レトロウイルス（RD114およびCCC分離菌）を含む ネコのＣ型レトロウイルス；ミンクの白血病ウイルス（MiLV）を含むミンクのＣ 型レトロウイルス；ブタのＣ型レトロウイルス；ウマの感染性貧血ウイルス（EI AV）を含むウマのＣ型レトロウイルス；風土病であるウシの白血病またはリンパ 肉腫を含むウシのＣ型レトロウイルス；ヒツジのＣ型レトロウイルス；キツネザ ルなど（prosimian）のＣ型レトロウイルス、サルの肉腫およびテナガザルの白 血病Ｃ型レトロウイルス、ヒヒのＣ型レトロウイルス、マカークザルのＣ型レト ロウイルス、ヨザルのＣ型レトロウイルス、コロブスザルのＣ型レトロウイルス 、メーソン−ファイザー（Mason-Pfizer）ザルのＤ型レトロウイルス、ラングー ルザルのＤ型レトロウイルスおよびリスザルのＤ型レトロウイルスを含む霊長類 のレトロウイルスが含まれる。Molecular Biology of Tumor Viruses，R．Weiss ，N．Teich，H．Varmus，and J．Coffin編、Cold Spring Harbor Laboratory，N ew York（第2版、1984）、26〜207頁に記載のN．TeichによるTaxonomy of Retro viruses を参照。 上記のように、本発明は下記に詳細に示すように、好ましくはエーロゾル、経 口および非経口投与のための薬剤学的に許容可能な担体中の上記の式（Ｉ）の化 合物、または薬剤学的に許容可能なそれらの塩から成る医薬製剤を提供するもの である。また、本発明は、凍結乾燥されており、静脈注射または筋肉注射による ような投与のために薬剤学的に許容可能な調製品を形成するために再構成できる 化合物またはそれらの塩を提供するものである。 その使用が本発明の範囲内に含まれる全ての特定の化合物の治療効果を発揮す る有効量は、化合物によって、また患者によってともかく異なり、患者の状態と 投与経路によって左右される。一般論として、約0.1〜約20mg／kgの投薬量は治 療効果を有し、経口及び／またはエーロゾル投与の場合には、更に高い投与量が 使用される可能性がある。高投与量では毒性の問題があるため、静脈内投与量を より低いレベル、例えば、約10mg／kgまでに制限することができ、塩が使用され る場合も含めて、重量は全て活性基剤に基づいて計算する。典型的には、約0.56 mg／kg〜約５mg／kgまでの投与量が使用される。ある種の条件においては、より 高い、あるいはより低い投与量が適切な場合もある。投与期間は１日１回２週間 〜３週間であってもよく、例えば慢性疾患の治療には数カ月または数年間継続し てもよい。低投与量をより低い頻度で使用して、感染症の再発を予防または減少 させることができる。１日当たりの投与量は、一つの個別投薬ユニットの形態で 一回投与、または幾つかのより小さな投薬ユニットの形態で一回投与により、ま たは小分けにして一定間隔で複数回投与により投与可能である。 式（Ｉ）の化合物は、それ自体、または薬剤学的に許容可能な塩の形態で投与 できる。医薬品に使用される場合、式（Ｉ）の化合物の塩は、薬理学的にも、薬 剤学的にも許容可能でなくてはならないが、薬剤学的に許容できない塩も、遊離 活性化合物または薬剤学的に許容可能なそれらの塩の調製に好都合に使用でき、 本発明の範囲から除外されない。このような薬理学的に、および薬剤学的に許容 可能な塩には、以下の酸から調製される塩が含まれるが、これらに限定されない 。すなわち、塩酸、乳酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、燐酸、マレイン酸、酢酸、 サリチル酸、p−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、 ギ酸、 マロン酸、コハク酸、ナフタリン−2−スルホン酸およびベンゼンスルホン酸で ある。また、薬剤学的に許容可能な塩は、カルボン酸のナトリウム塩、カリウム 塩またはカルシウム塩のようなアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩として も調製できる。従って、本発明は、レトロウイルスインテグラーゼ阻害剤ととも に、それらの一つ以上の薬剤学的に許容可能な担体を含み、選択的に他の治療成 分を含む動物と人間の医療用の医薬製剤も提供する。一以上の担体は、製剤中の 他の成分と併用でき、その投与対象に過度に有害でないという意味で薬剤学的に 許容可能でなくてはならない。 製剤は、経口、経直腸、局所、経鼻、点眼、非経口（皮下、筋肉内、静脈内を 含む）投与に適した製剤を含む。エーロゾル、経口、非経口投与に適した製剤が 好ましい。 製剤は、ユニット投薬形態で好都合に提供できる。また薬学技術において公知 の方法のいずれによっても調製できる。全ての方法は、活性化合物と一つ以上の 副成分を構成する担体とを、会合（association）させる段階を含む。一般に、 製剤は活性化合物を液体担体、微細な固体担体または両者と均一かつ密に会合し 、次に必要に応じて生成物を所望の製剤に形成する。 経口投与に適した本発明の製剤は、予め測定された量のインテグラーゼ阻害剤 を粉末または顆粒としてそれぞれ含むカプセル、カシェ剤、錠剤または舐剤のよ うな個別ユニットとして、または、シロップ、エリキシル剤、エマルジョンまた は１回分の液薬のような水溶液または非水性溶液中の懸濁液として提供し得る。 錠剤は、選択的に一つ以上の副成分と共に、圧縮または成形によって調製され る。圧縮錠剤は、適当な機械で圧縮することによって調製され、活性化合物は、 選択的に結合剤、崩壊剤（disintegrant）、潤滑剤、不活性の希釈剤、表面活性 剤または分散剤と混合される粉末または顆粒のように自由に流動する形態である 。粉末活性化合物と適切な担体の混合物を含む成形錠剤は、適切な機械で成形す る ことによって調製できる。 シロップは、活性化合物をスクロースのような糖の濃縮水溶液に加えることに よって調製できる。糖には、一以上の副成分も添加できる。このような副成分は 、香料、適当な保存薬、糖の結晶化を遅延させる薬剤、例えばグリセロールまた はソルビトール等の多価アルコールのような他の成分の溶解度を高める薬剤を含 むことができる。 非経口投与に適した製剤は、好都合には、活性化合物の滅菌水溶液を含み、好 ましくは被投与対象の血液と等張で、発熱物質を含まない。 経鼻スプレー製剤は、保存薬と等張剤とを有する活性化合物との精製水溶液を 含む。このような製剤は、好ましくは、鼻粘膜融和性のｐＨと等浸透圧に調節さ れる。 経直腸投与用製剤は、ココアバターまたは水素化脂肪または水素化脂肪酸のよ うな適切な担体と共に座薬として提供される。 点眼剤は、ｐＨと浸透圧が好ましくは眼の値と一致するように調節されている 以外は、経鼻スプレーと同様の方法により調製される。 局所剤は、鉱油、石油、多価アルコールまたは局所医薬製剤に使用されるその 他の基剤のような一種類以上の媒質に溶解または懸濁された活性化合物を含む。 下記の如く、他の副成分の添加が好ましい場合がある。 上記成分に加え、本発明の製剤は、希釈剤、緩衝液、香料、結合剤、崩壊剤、 表面活性剤、増粘剤、潤滑剤、保存剤（酸化防止剤を含む）等からなる一群から 選択される一種類以上の副成分を更に含むことができる。 本方法の好ましい実施例に従って、式（Ｉ）の化合物または薬剤学的に許容可 能なその塩は、固体として経口または吸入により投与でき、または溶液、懸濁液 またはエマルジョンとして、筋肉内または静脈内投与できる。あるいは、化合物 または塩は、リポソームの懸濁液として静脈内または筋肉内投与も可能である。 吸入投与の場合、化合物または塩は、粒子径が約0.5〜約５ミクロン、好ましく は約１〜約２ミクロンの多数の固体粒子または小滴の形態で投与されるべきであ る。 本発明は、静脈内または筋肉内注入に適した医薬組成も提供する。医薬組成は 、薬剤学的に許容可能な担体に含まれる式（Ｉ）の化合物または薬剤学的に許容 可能なその塩を含む。溶液が好ましい場合には、水溶性化合物または塩に関して は水が最適であり、グリセロール、プロピレン、グリコール、ポリエチレングリ コール、またはそれらの混合物のような有機媒体が適切な場合もある。後者の場 合には、有機媒体は大量の水を含んでもよい。次に、いずれの場合にも、溶液を 適切な方法で滅菌し、好ましくは0.22ミクロンのフィルターを通して濾過滅菌す る。滅菌に続き、溶液を発熱物質を除去した（depyrogenated）ガラスバイアル のような適切な容器に充填する。当然、充填は無菌的方法により実施されなくて はならない。次に、滅菌栓でバイアルを密封し、所望によりバイアルの内容物を 凍結乾燥してもよい。 式（Ｉ）の化合物またはそれらの塩に加え、医薬組成は、ｐＨ調整剤のような 他の添加物を含めてよい。特に、有用なｐＨ調整剤には、乳酸ナトリウム、酢酸 ナトリウム、グルコン酸ナトリウム等の酸または塩基または緩衝液が含まれる。 更に、組成は、殺菌性保存剤を含んでよい。有用な殺菌性保存剤には、メチルパ ラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコールが含まれる。典型的には、製剤 が複数回投薬用に設計されたバイアルに入れられた場合に、殺菌性保存剤が使用 される。当然、既述のように、本発明の医薬組成は、公知技術を用いて凍結乾燥 してよい。 本発明の更に別の態様において、式（Ｉ）の化合物またはその塩を含む注射可 能な、安定な、滅菌組成は、密封容器に入ったユニット投薬の形態で提供される 。化合物または塩は、凍結乾燥品の形態で提供され、適切な薬剤学的に許容可能 な担体を用いて、再構成し、対象への注射に適したその液体組成を形成すること が 可能である。ユニット投薬形態は、典型的には約10mg〜約10ｇの化合物または塩 を含む。化合物または塩が実質的に水に不溶性の場合、化合物または塩を水性担 体に乳化するために、生理学的に許容可能な十分量の乳化剤が十分量使用される 。このような有用な乳化剤の一つは、ホスファチジルコリンである。 水性ベースエマルジョンのような他の医薬組成が、水に不溶性の式（Ｉ）の化 合物またはその塩から調整できる。このような場合、組成は式（Ｉ）の化合物ま たはその塩の所望の量を乳化するために、十分量の薬剤学的に許容可能な乳化剤 を含む。特に有用な乳化剤には、ホスファチジルコリンとレシチンが含まれる。 更に、本発明は式（Ｉ）の化合物またはその塩のリポソーム製剤を提供する。 リポソーム懸濁液を形成する方法は、公知技術である。式（Ｉ）の化合物または その塩が水溶性の塩である場合には、従来のリポソーム技術を用いて、同物質を 脂質小胞に取り込むことができる。このような場合、化合物または塩が水溶性で あるため、化合物または塩は、リポソームの親水性中心部または核内に実質的に 取り込まれる。使用される脂質層は、従来の組成のいずれもが可能で、コレステ ロールを含んでいても、含んでいなくてもよい。関心の対象となる化合物または 塩が水に不溶性の場合にも、従来のリポソーム形成技術を使用して、塩はリポソ ームの構造を形成する嫌水性の脂質二重層の中に実質的に取り込まれる。どちら の場合も、生成されるリポソームは、標準超音波処理または均質化技術を使用し て、サイズ縮小が可能である。 当然、式（Ｉ）の化合物またはそれらの塩を含むリポソーム製剤は、凍結乾燥 され凍結乾燥物を形成する。これは、リポソーム懸濁液を再生するために、水の ような薬剤学的に許容可能な担体を用いて再構成できる。 吸入により、エアーゾルとして投与されるのに適した医薬製剤も提供される。 これらの製剤は、所望の式（Ｉ）の化合物またはその塩の溶液または懸濁液、ま たは化合物または塩の多数の固体粒子を含む。所望の製剤は、小さなチャンバに 入れられ、噴霧される。噴霧は、圧縮空気または超音波エネルギーにより達成さ れ、化合物の塩から成る多数の液体小滴または固体粒子が形成できる。液体小滴 または固体粒子は、約0.5〜約５ミクロンの範囲の粒径を有するべきである。固 体粒子は、式（Ｉ）の固体化合物またはその塩を、超微粉化のような公知技術の 適切な方法で、処理することによって得られる。最も好ましくは、固体粒子また は小滴の大きさは、約１〜約２ミクロンである。この観点から、この目的を達成 するために、市販の噴霧器（ネブライザー）を利用できる。好ましくは、エーロ ゾル投与に適した医薬製剤は液状で、製剤は、水を含む担体中に水溶性の式（Ｉ ）の化合物またはその塩を含む。噴霧する場合、製剤の表面張力を十分減少させ 、所望の範囲の大きさの小滴を形成できる界面活性剤を含めることができる。 既述の如く、本発明は、水溶性の化合物と塩と、水に不溶性の化合物と塩の両 者を提供する。本発明の明細書に使用されているように、“水溶性”という言葉 は、水に約50mg／mLまたはそれ以上溶解する組成を定義している。また、本明細 書に使用されているように、“水に不溶性”という言葉は、水に約20mg／mL以上 溶けない組成を定義している。特定の応用例では、水溶性の化合物または塩が望 ましいが、他の応用例では水に不溶性の化合物または塩が同様に望ましい場合が ある。 上記の式（Ｉ）の化合物の実施例には、以下が含まれるが、これらに限定され ない。 (A) 1,2−ビス［5−アミジノ−2−ベンゾイミダゾリル］エテン 1,2-bis[5-amidino-2-benzimidazolyl]ethene； (B) 1,2−ビス［5−イソプロピルアミジノ−2−ベンゾイミダゾリル］エテン ； (C) ビス［5−(2−イミダゾリル)−2−ベンゾイミダゾリル］メタン (D) ビス［5−アミジノ−2−ベンゾイミダゾリル］メタン (E) (5−アミジノ−2−ベンゾイミダゾリル)−(5'−(2−イミダゾリニル)−2' −ベンゾイミダゾリル)メタン (5-amidino-2-benzimidazolyl)-(5'−(2-imidaz olinyl)-2'-benzimidazolyl)methane； (AA) 1,2−ビス［5−アミジノ−2−ベンゾイミダゾリル］エタン； (BB) 1,2−ビス［5−(2−イミダゾリル)−2−ベンゾイミダゾリル］エタン (CC) 1,2−ビス［5−(2−イミダゾリル)−2−ベンゾイミダゾリル］エテン (DD) 1−(5−アミジノ−２−ベンゾイミダゾリル)−(5'−(2−イミダゾリニル )−2'−ベンゾイミダゾリル）エタン； (EE) 1−(5−アミジノ−２−ベンゾイミダゾリル)−(5'−(2−イミダゾリニル )−2'−ベンゾイミダゾリル)エテン； (FF) ビス［5−イソプロピルアミジノ−2−ベンゾイミダゾリル］メタン； (GG) 1,2−ビス［5−イソプロピルアミジノ−2−ベンゾイミダゾリル］エタン 。 上記と類似の式（Ｉ）の化合物の追加例は、2−イミダゾリル基を2−ピリミジ ル基（2-pyrimidyl）に置換することによって生成することができる。 本発明の実施に使用される化合物は公知であるか、または当業者にとって公知 の方法により、特に下記に明らかにされている開示に照らして調製できる（例え ば、米国特許第4,933,347号を参照。この開示内容の全てを引用することにより 本明細書の一部をなすものとする。）。 既述の如く、本発明において使用される化合物は、薬剤学的に許容可能な塩と して提供できる。このような塩には、グローコナイト（glauconite）、乳酸塩、 酢酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、燐酸塩、ホウ酸塩、硝酸塩、硫酸塩、塩酸塩が 含まれる。 本発明の塩は、一般に、二当量の同じアミジン塩基化合物と所望の酸を、溶液 中で反応させることによって調製される。反応終了後、塩が溶けない溶媒を適量 加えることによって、溶液から塩を晶析させる。 本発明を、以下の本発明を限定しない実施例によって詳細に説明する。ここで 、 “g”はグラム、“mg”はミリグラム、“μg”はマイクログラム、“mmol”はミ リモル、“h”は時間、“ml”はミリリットル、“M”はモル濃度、“mM”はミリ モル濃度、“UV”は紫外線、“HCl”は塩酸、“NaCl”は塩化ナトリウム、“EDT A”はエチレンジアミン四酢酸、“MP”は融点、“℃”はセ氏温度を意味する。 実施例１ 化合物の調製 下記の阻害試験に使用される化合物の構造を表１に示す。全て、過去に発表さ れた方法により合成された。R．Tidwell et al.，Antimicrob．Agents and Chem other．38，000-000(1993)；T.Fairley，J．Med．Chem．36，1746-1753(1993)を 参照。 実施例２ インテグラーゼタンパク質の調製と分析 インテグラーゼタンパク質の精製。インテグラーゼは、HIV-1 DNAのHXB2クロ ーン（L．Ratner et al.，AIDS Res．Hum．Retroviruses 3，57-69(1987)）から のインテグラーゼコード化ドメイン、pT7f11-INを使用して、インテグラーゼ配 列を含む誘発プラスミドからE．Coli中でlacI調節T7ポリメラーゼの調節下に過 剰生産された。IPTGを0.5mMまで添加することによって、O.D.が0.6の１リットル の培養物が誘発された。３時間後、遠心分離により細胞を収集し、ペレットを− 70℃で保存した。 Sherman and Fyfe（P．Sherman et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA87，511 9-23(1990)）の方法の改変法により、インテグラーゼタンパク質を精製した。細 胞を、氷上の緩衝液（50mMトリス塩酸、pH7.5、5mMジチオトレイトール、1mMEDT A、1mg／mlリゾチーム）中で6ml／g細菌ペレットにて30分間解凍溶解し、続いて 37℃で５分間インキュベート溶解した。溶解物を12,000×gで１時間遠心分離し た。ペレットを50mMトリス塩酸、pH7.5、1mMジチオトレイトール、1mM EDTA、1M NaClに再懸濁した（最初の細菌で4ml／g）。ホモゲネートを4℃で30分間撹拌し 、12,000×gで30分間再度遠心分離した。 30分間にわたり撹拌しながら、粉末をゆっくり加え、上清を0.8M硫酸アンモニ ウム溶液にした。次に抽出物を遠心分離し、沈殿物を除去し、フェニルセファロ ース（phenyl sepharose）カラムにかけた。高濃度塩緩衝液（50mMトリス塩酸、 1mM EDTA、5mM DTT、2M NaCl）50mlで洗浄後、10％（重量／容量）グリセロール を含む高濃度塩から塩濃度０の緩衝液の勾配により、タンパク質を溶出し、更に G75セファデックス（Sephadex）カラムを通して精製し、バックグラウンドのヌ クレアーゼを除去した。１リットルの培養物から、1000回以上の薬物阻害分析を 実施するのに十分なインテグラーゼ活性が得られる。 インテグラーゼ活性の分析。酵素精製段階を、エンドヌクレアーゼ／ニッキン グ分析、およびノースカロライナ大学チャペルヒルのW．OsheroffとR．Swanstro mにより生成されたインテグラーゼに対する単クローン性抗体を利用するウェス タンブロット法により監視した。超らせんpBluescriptKS＋II（0.3μg）を、カ ラムフラクションと37℃で30分間、20mMトリス塩酸、pH8.0、5mM 2−メルカプト エタノール、2mM MnCl₂を含む緩衝液中でインキュベートした。SDSを1％まで添 加することにより反応を止め、0.8％アガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウ ムブロミドで染色し、UV照明下に写真撮影することによりＤＮＡ基質の切断を評 価した。 特定部位の切断は、上記のSherman et al.，に記述されているように評価され たが、分析用緩衝液はChow et al.，Science 255，723-6（1992）によって報告 されたものと同じものを使用した。HIV-1のU5またはU3末端にどちらかに対応す る一つの20-merオリゴヌクレオチドを³²Ｐにより末端標識し、その補体とアニー リングし、精製し、上記のエンドヌクレアーゼ分析と同じ条件で使用した。反応 生成物をホルムアミドで変性し、20％変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動に かけ、オートラジオグラフィーで視覚化した。切断と結合活性の両方を一つのゲ ルから評価できる。結合活性を単独で評価するために、放射能標識した18-merオ リゴヌクレオチドを使用することによって人工的に作製された−2切断を有する “予め切断された”基質も、幾つかの実験に使用した。 実施例３ ウイルスおよび細胞培養 使用した細胞系は、CEM細胞、ヒトＴ細胞リンパ腫細胞系、A．Kaplan et al. ，J．Virol．67，4050-5(1993)、およびマジック細胞、J．Kimptonet al.，J．V irol．66，2232-2239(1992)であった。CEM細胞は、5％FCSを補足したRPM1-1640 培地で成長させた。マジック細胞は、HELA誘導体であり、5％FCS、G418（20mg／ ml）、およびハイグロマイシン（10mg／ml）を補足したDMEM／Hで成長させた。H IV分離菌は、HXB2株で、国立衛生研究所（NIH）のRobert Gallo研究室のLee Rat nerから最初入手した。 実施例４ 毒性分析 ウイルスの感染性を測定するために使用した細胞系で、三種類の毒性試験を実 施した。 最初の毒性試験は、Weislow et al.，J．Natl．Cancer Inst．81，577-586（1 989）により報告されたXTT分析を利用した。これは、逆転写酵素阻害剤の可能性 を有する物質により、細胞毒性の測定に最初使用された標準分析法である。簡単 に述べると、細胞を細胞／mlまで成長させ、薬物希釈液を培地に添加した。２日 間のインキュベーション後、XTT試薬を加え、インキュベーションを37℃で４時 間継続する。インキュベーション後、細胞無しの培地＋XTT試薬、試薬無しの細 胞＋培地を対照として、プレートを450マイナス650nm（650の値は自動的にマイ ナスされるバックグラウンド値である）で測定する。細胞＋培地＋XTT試薬の対 照も各プレート毎に測定した。XTT試薬が無色（還元されていない）から橙色（ 還元される）に変わるため、フェノールレッドを含まない培地を使用し、バック グラウンドの色を最小限に止めた。XTT試薬は、分析当日、以下のように新しく 調製した：0.01Mのフェナジンメトスルフェート中に1mg／mlのXTT。フェナジン メトスルフェート溶液を前もって調製し、遮光瓶に4℃で保存した。100μlの培 地あたり24μlのXTT試薬をマイクロタイターウェルに加えた。Molecular Device s Co．のVmaxプレートリーダーで、O.D.を測定し、データ整理した。結果は、未 処理の対照に対するパーセントとして表される。毒性が最小の化合物は、化合物 Ａ、Ｂ、Ｆで毒性が表れる値は500μM以上であった。 次に、平板効率試験により、数日間薬物とインキュベーション後に、細胞の成 長能を測定した。種々の濃度の試験化合物を加え、あるいは加えずに、マジック 細胞を初期細胞濃度0.8×10⁴から6日間成長させた。プラスチック上で各培養物 の希釈物を平板培養することにより、細胞の平板効率を評価した。プレートを染 色後、コロニー数を数え、2〜4日間コロニー形成単位を測定した。各試料を２検 体ずつ平板培養し、コロニー数の平均値を求めた。結果を図１に示す。 第三の細胞毒性試験は、対照培養に対し試験化合物の存在下に、成長速度を評 価した。試験化合物を種々の濃度に希釈し、あるいは希釈しないで、マジック細 胞を15日間にわたり成長させた。１日おきに部分標本を取り出し、細胞数を血球 計数器で計数した。結果を図２に示す（下記の表２も参照）。 実施例５ インテグラーゼ阻害作用の分析 インテグラーゼ阻害剤としての試験。E．Coliの中で過剰生産されたインテグ ラーゼを、上記のSherman et alの方法に従って精製し、薬物阻害作用の分析に 使用した。これらの試験に使用されたインテグラーゼ製剤は、極めて純度が高く 、ヌクレアーゼ活性による汚染は認められなかった。上記実施例１に報告されて いる阻害剤化合物の希釈液を、酵素を加える前に基質と混合した。分析は、実施 例２に報告されている方法と同じで、実施例２に記述されている基質を使用した 。分析は全て２回ずつ実施した。乾燥させたゲルのバンドの放射能活性を、リン 光体画像化装置により定量し、切断、ヌクレアーゼ生成物と結合生成物の両者に 対する薬物の効果を評価した。一連の薬物濃度に関する対照反応の阻害率（％） を決定後、インテグラーゼの阻害作用のIC₅₀値を、インテグラーゼ反応の切断と 結合部分の両者に関して計算した。これらの結果を下記の表２に示す。化合物Ａ 、Ｂ、Ｃ、Ｄは、インテグラーゼ活性に対して類似効果を示した。しかし、化合 物Ａは、比較的低濃度で（10μM）で開始し、基質の凝集反応を引き起こし、そ の評価を複雑にした。 本発明の理論または説明に制約されることは望まないが、現在これらの化合物 は、ＡＴに偏った二重鎖ＤＮＡの小溝に結合するものと考えられており（T．Fai rley et al.，J．Med．Chem．36，1746-1753(1993)）、ウイルスの長末端反復（ “LTR”）においてインテグラーゼがその認識配列に結合するのを妨げることに よって、インテグラーゼを阻害する可能性が非常に高い。この提案されたメカニ ズムは、切断と組み込みが共に化合物により同等に影響されるという観察により 支持される。ＤＮＡ配列の特異性及び／またはインテグラーゼタンパク質との直 接的相互作用も、化合物のメカニズムに関与している可能性があるものと現在考 えられている。インテグラーゼはマルチマーとして作用するので、K.S．Jones e t al.，J．Biol．Chem．267，16037-40(1992)、化合物のＤＮＡ結合がマルチマ ーの平衡状態にともかく影響する可能性もある。 しかし、結果は、ＤＮＡ結合強度だけが決定因子ではないことを示す。ＤＮＡ 配列特異性及び／またはインテグラーゼタンパク質との直接的相互作用も関与し ている可能性があると現在考えられている。ヌクレオソームは、HIV-1の5'LTRに 正確に配置されていることが明らかにされているので、A．Fesen et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 90，2399-2403(1993)、このような位相性が、二価の陽 イオンの（dicationic）溝に結合する薬物がインテグラーゼ作用を阻害する別の 方法である可能性がある。 実施例６ HIV-1阻害作用分析 上記のKipmton et al．によるマジック細胞分析を記述されているように使用 した。この分析法は、tatの発現によりHIV-1に感染した個々の細胞を同定する。 tatは、組み込み後lac2レポーター遺伝子に結合されたHIV-1 LTRの内因性コピー をトランス活性化し、β−ガラクトシダーゼの発現を誘発し、その時点でx-gal が細胞培地に添加される。HIV-1が組み込まれた細胞は全て青色に変わる。従っ て、この分析法は、組み込みの阻害を含めて、初期段階からtat発現までのHIV阻 害剤の効果を評価する便利な方法を提供する。 マジック細胞を、感染１日前に12ウェルプレートに入れる。標準分析法は、約 200感染単位のHIV-1感染を分析する。これは約20対1のシグナル対バックグラウ ンド比と、dim効果の定量に十分な感染イベント数を提供する。ウイルス感染４ 時間前に細胞を薬物で前処理する。１時間ウイルスの吸着が起こる。細胞を通常 の培地で洗浄し、続いて阻害剤を含む培地を細胞に戻す。２日後、組み込み後細 胞を、β−ガラクトシダーゼ生産の指示薬、x-galで固定する。β−ガラクトシ ダーゼ発現細胞の数を光学顕微鏡により計数する。 マジック細胞中に種々の濃度のビス−ベンゾイミダゾール薬物を含む場合と含 まない場合の感染単位の比較結果をIC₅₀値として表し、上記表２にまとめる。な お、その基質凝集特性により正確な測定が不可能であった化合物Ａを除き、抗HI V作用が最も優れた化合物（Ｂ〜Ｄ）は、最も優れたインテグラーゼ阻害剤でも あることに留意する。 更に、化合物Ｂについては、標準再感染分析により測定される抗ウイルス活性 の評価も実施した。この分析における化合物ＢのIC₅₀は、10〜30μMであった。 これは、マジックセル分析が、優れた抗ウイルス活性を有するインテグラーゼ阻 害剤のスクリーニングに適していることを確証するものである。 化合物による細胞効果を評価するもう１つの試験は、種々の濃度の試験薬物で インキュベーション後、細胞の平板効率を測定するものであった。これは、薬物 による実際の細胞死滅効果を評価する試験である。この試験では、IC₅₀値ははる かに高くなるものと予想される。結果は、最も優れた抗HIV作用を示す化合物Bが 、抗ウイルス作用が認められた濃度で、マジック細胞の平板効率に全く効果を示 さなかったことを示す。 最も鋭敏な試験は、試験化合物の存在下に、細胞の成長速度を測定した。使用 した抗ウイルス分析は、ウイルスのライフサイクルの初期時間を評価するもので あったが、この試験は15日間実施され、この間１日おきに培地中の細胞数を計数 した。２週間までの期間、ウイルス組み込み現象を50％阻害した化合物Ｂの濃度 が、細胞系の成長速度に影響を与えなかったことに注意することが重要である。 しかし、濃度が高くなると、細胞の成長速度に影響を与えた。 前記実施例は、本発明を説明するものであり、それらを制限することを意図し ていない。本発明は、以下の請求項により定義され、請求項と同等のものはこれ に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 スワンストロム，ロナルド・アイ アメリカ合衆国、27514 ノース・キャロ ライナ、チャペル・ヒル、ノッティ・パイ ン・ドライヴ 7021 (72)発明者 ティドウェル，リチャード・アール アメリカ合衆国、27514 ノース・キャロ ライナ、チャペル・ヒル、ジ・オークス 1806

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．次式（Ｉ） ［式中、Ｒ₁およびＲ₂は、Ｈまたは低級アルキルからなる一群からそれぞれ独立 に選択されるか、またはＲ₁およびＲ₂はあわせて−(CH₂)_m−（ｍは２〜４）を表 す。 Ｒ₃は、Ｈまたは低級アルキルである。 Ｘは、炭素数１〜２の飽和または不飽和（二重結合一つを含む）アルキルであ る］ で示される化合物または薬剤学的に許容可能なその塩のレトロウイルス阻害効果 を発揮する有効量を対象に投与することを含み、このような治療が必要な対象に おいてレトロウイルスインテグラーゼを阻害する方法。 ２．上記Ｒ₁、Ｒ₂、およびＲ₃がＨである請求項１に記載の方法。 ３．上記Ｒ₁およびＲ₂があわせて−CH₂−CH₂−で表され、Ｒ₃がＨである請求 項１に記載の方法。 ４．上記Ｘが、−(CH₂)_n−（ｎは１〜２）であり、非置換または低級アルキル により１〜２回置換されており、これが飽和または不飽和（二重結合を一つ含む ）である請求項１に記載の方法。 ５．上記Ｘが、−CH₂−CH₂−、−CH＝CH-、これらを低級アルキルにより１〜 ２回置換したもののいずれかからなる一群から選択される請求項１に記載の方法 。 ６．上記化合物が、 (A) 1,2−ビス［5−アミジノ−2−ベンゾイミダゾリル］エテン、 (B) 1,2−ビス［5−イソプロピルアミジノ−2−ベンゾイミダゾリル］エテン 、 (C) ビス［5−（2−イミダゾリル）−2−ベンゾイミダゾリル］メタン、 (D) ビス［5−アミジノ−2−ベンゾイミダゾリル］メタン、 および薬剤学的に許容可能なそれらの塩からなる一群から選択される請求項１に 記載の方法。 ７．上式（Ｉ）の化合物が、ビス［5−アミジノ−2−ベンゾイミダゾリル］メ タンまたは薬剤学的に許容可能なその塩である請求項１に記載の方法。 ８．上式（Ｉ）の化合物が、1,2−ビス［5−アミジノ−2−ベンゾイミダゾリ ル］エタンまたは薬剤学的に許容可能なその塩である請求項１に記載の方法。 ９．上式（Ｉ）の化合物が、1,2−ビス［5−アミジノ−2−ベンゾイミダゾリ ル］エテンまたは薬剤学的に許容可能なその塩である請求項１に記載の方法。 １０．上記対象が哺乳動物である請求項１に記載の方法。 １１．上記対象がトリ類である請求項１に記載の方法。 １２．次式（Ｉ） ［式中、Ｒ₁およびＲ₂は、Ｈまたは低級アルキルからなる一群からそれぞれ独立 して選択されるか、またはＲ₁およびＲ₂はあわせて−(CH₂)_m−（ｍは２〜４）で 表される。 Ｒ₃は、Ｈまたは低級アルキルである。 Ｘは、炭素数１〜２の飽和または不飽和（二重結合一つを含む）アルキルであ る。］ で示される化合物または薬剤学的に許容可能なその塩のレトロウイルス感染症抑 制作用を発揮する有効量を対象に投与することを含み、このような治療が必要な 対象においてレトロウイルス感染症を抑制する方法。 １３．上記Ｒ₁、Ｒ₂、およびＲ₃がＨである請求項１２に記載の方法。 １４．上記Ｒ₁およびＲ₂があわせて−CH₂−CH₂−で表され、Ｒ₃がＨである請 求項１２項に記載の方法。 １５．上記Ｘが、−(CH₂)_n−（ｎは１〜２）であり、非置換または低級アルキ ルにより１〜２回置換されており、これが飽和または不飽和（二重結合一つを含 む）である請求項１２に記載の方法。 １６．上記Ｘが−CH₂−CH₂−、−CH=CH-、これらが低級アルキルにより１〜２ 回置換されたもののいずれかからなる一群から選択される請求項１２に記載の方 法。 １７．上記化合物が、 (A) 1,2−ビス［5−アミジノ−2−ベンゾイミダゾリル］エテン、 (B) 1,2−ビス［5−イソプロピルアミジノ−2−ベンゾイミダゾリル］エテン 、 (C) ビス［5−（2−イミダゾリル）−2−ベンゾイミダゾリル］メタン、 (D) ビス［5−アミジノ−2−ベンゾイミダゾリル］メタン、 および薬剤学的に許容可能なそれらの塩からなる一群から選択される請求項１２ に記載の方法。 １８．上式（Ｉ）の化合物が、ビス［5−アミジノ−2−ベンゾイミダゾリル］ メタンまたは薬剤学的に許容可能なその塩である請求項１２に記載の方法。 １９．上式（Ｉ）の化合物が、1,2−ビス［5−アミジノ−2−ベンゾイミダゾ リル］エタンまたは薬剤学的に許容可能なその塩である請求項１２に記載の方法 。 ２０．上式（Ｉ）の化合物が、1,2−ビス［5−アミジノ−2−ベンゾイミダゾ リル］エテンまたは薬剤学的に許容可能なその塩である請求項１２に記載の方法 。 ２１．上記対象が哺乳動物である請求項１２に記載の方法。 ２２．上記対象がトリ類である請求項１２に記載の方法。