JPH09506091A

JPH09506091A - 脈管内皮損傷後の再発性狭窄を防止するための２７−ヒドロキシコレステロール若しくは関連化合物又はステロール−２７−ヒドロキシラーゼ刺激剤の投与

Info

Publication number: JPH09506091A
Application number: JP7515646A
Authority: JP
Inventors: ジャヴィット，ノーマン・ビー
Original assignee: ニュー・ヨーク・ユニヴァーシティー・メディカル・センター
Priority date: 1993-11-30
Filing date: 1994-11-29
Publication date: 1997-06-17
Also published as: CA2177822A1; AU682084B2; WO1995015165A1; EP0730457A1; US5587368A; AU1256895A

Abstract

(57)【要約】再発性狭窄防止及び／又は修復量の27−ヒドロキシコレステロール或いは25、26及び／又は27−アミノコレステロール、或いはステロール−27−ヒドロキシラーゼ刺激剤を投与する、再発性狭窄の防止又は修復方法。

Description

【発明の詳細な説明】脈管内皮損傷後の再発性狭窄を防止するための 27−ヒドロキシコレステロール若しくは関連化合物又はステロール−27−ヒドロキシラーゼ刺激剤の投与発明の背景１．技術分野本発明は、再発性狭窄の防止における27−ヒドロキシコレステロール、ステロール−27−ヒドロキシラーゼ及び関連化合物の使用方法に関するものである。２．背景情報種々の外科的バイパス法や血管造影法が器官、通常は心臓への血流を増加させるために定型的に使用される。これらの手術法や非手術法は、多かれすくなかれ、標的部位の血管内腔の内壁を損傷する。この内皮損傷からしばしば、段階的な成行きを経て再発性狭窄になる。例えば、動脈系にカテーテルを挿入して狭窄部位に気球、レーザー又は羽根を入れる気球、レーザー又はロタメータ血管形成術は血管内腔の狭小領域を拡張するのに十分成功している。しかし乍ら、内皮損傷が病変部位で生起し、患者の概ね20〜40％は再発狭窄症になる。動物では内皮損傷により損傷動脈の狭小化（狭窄）に至る過程が開始されることが示されており、そしてこのモデルは内皮損傷後に生起する結末を研究することに関係がありそしてそのために使用されている。再発性狭窄を説明するための現在の主要な理論は、内皮細胞が侵襲法によって一度損傷されるか又は除去されると、循環中の血小板が表皮剥落領域を覆いそして強力な増殖因子、例えば下部にある平滑筋細胞の増殖及び移動を刺激する血小板由来増殖因子を放出するということである。繊維芽細胞増殖因子のような他の増殖因子も関与している。これらの理由により、抗増殖因子はアテローム性動脈硬化症の防止について評価されてきている。再発性狭窄には多くの因子が潜在的に関与していると考えられる。更に、最初の病変の原因である血行力学的力は一般に血管形成術では弱めれず、そしてプラク破壊で増大されることがある。動脈内腔の血栓耐性性質は、複雑な幾何学的立体配置の顕著に血栓形成的表面の発生及び上記した血小板のような血液由来の要素と動脈内腔との間の直接的相互作用を可能にする浸透特性の変化により低下する。要するに、外科手術法や血管造影法は必然的に血管壁の損傷をもたらし、そしてその結果患者の20〜40％で再発狭窄症が生じる。 27−ヒドロキシコレステロール（コレスト−5−エン−3β,27−ジオール）は通常新生児期生活後の生物学的流体中に存在する。最近ＩＵＢは命名法の或る種の規則を変更し、そして現在27−ヒドロキシコレステロールと呼ばれている化合物は以前には26−ヒドロキシ−コレステロールと呼ばれていた。２個のメチル基がコレステールの炭素番号25に結合しているが、１個のメチル基しか酵素的に水酸化され得ず、そしてこのメチル基は以前には炭素番号26と命名されていたが現在は炭素番号27と命名されている。ジャビット（Javitt）の米国特許4,427,688は、身体組織内でのコレステロール合成及び／又はコレステロール蓄積を低下させるために26−ヒドロキシコレステロール（原文の通り、即ち27-ヒドロキシコレステロール）並びにその種々の誘導体及び類似体を投与することを記載している；それ故、アテローム性動脈硬化症を治療するために27−ヒドロキシコレステロール化合物を使用することを教示している。その後、米国特許4,939,134に開示されているように、ジャビット等は27−アミノコレステロール並びにその或る種のアミノ置換類似体及び誘導体が27−ヒドロキシコレステロールより強力なコレステロール合成及び蓄積インヒビターであることを発見した。ジャビットは1991年11月14日に019206／91（「ＪＰＡ」）として公告された日本出願107488／82を1982年に出願し、そしてこの出願は、アテローム性動脈硬化症の治療における27−ヒドロキシコレステロールの使用を更に支持する情報が追加されている米国特許4,427,688と開示が非常に一致している。このＪＰＡはカンダッチュ（Kandutsch）等、Science、201、498（1978年）が、酸素化されたコレステロールは、多分コレステロール生合成の速度制限酵素であるＨＭＧＣＯ− Ａレダクターゼを阻止することによって、インビトロで繊維芽細胞及びリンパ球の増殖に対して阻止効果を有している（これはコレステロールが細胞増殖に必須であるという考え方と一致している）と述べたことに言及している。ジャビットはこの理論を、培養ウエルにハムスター大動脈平滑筋細胞を低密度で接種しそして６日後に対照及び27−ヒドロキシコレステロール暴露細胞をコウルター(coult er)計数によって試験した。試験した濃度の27−ヒドロキシコレステロールは増殖を約50％阻止した。インビトロでの筋細胞増殖阻止自体は、潜在的な手がかりではあるが、インビボでの再発性狭窄を防止するために上記と同じ物質を使用することは教示もまた示唆もしていない。実際、或る者はオキシステロールによる脈管平滑筋細胞に与える阻止効果を毒性効果として解釈していた。ツォウ（Zhou ）等、Proc．Soc．Exp．Biol．Med.、202:75〜80；ナセム（Nassem）等、Bioche m．Internat.、14:71〜84。バラノウスキー（Baranowski）等、Atherosclerosis 、41:255〜260も参照。更に、強力なコレステロール低下医薬であるロバスタチンはＬＤＬ−コレステロール値を期待されたように顕著に低下させたが、ロバスタチンの高投与量は、無作為二重盲検プラセボ試験で、経皮経内腔的冠血管形成術の６ヶ月後の再発性狭窄を修復しなかったことが最近報告されている。かくして、今日現在で、医薬品のコレステロール低下生物学的活性は、多分アテローム性硬化症の治療における使用の可能性を示しているが、再発狭窄症と闘うための使用は予言もまた示唆もしていない。上記で考察したように、再発狭窄症はアテローム性硬化症とは異なる多面的現象であり、そしてそのメカニズムはせいぜい部分的にしか理解されていない。本明細書で参照した米国特許及び刊行物は全て参照として本明細書に組み入れる。発明の要旨以下では、本発明に関係のあるステロール核に対して現在受け入れられている命名法、27−ヒドロキシコレステロールを使用する。この化合物は、上記で考察した先行技術並びに他の先行技術で26−ヒドロキシコレステロールと命名された化合物と同一であると理解される。 27−ヒドロキシコレステロールは、血管内腔をカテーテル法で拡張したときに生じる血管内腔損傷後の再発性狭窄を効果的に修復することが現在見い出されている。それ故、本発明の１つの目的は、外科的バイパス法及び経皮血管造影法後に生じる再発狭窄症例を減少させる方法を提供することである。更に、25−、26 −及び／又は27−アミノコレステロールのような関連化合物は血管内腔に対して同様な効果を有していると期待される。ステロール−27−ヒドロキシラーゼの活性の継続によって産生される27−ヒドロキシコレステロールの或る種の代謝物も生物学的に活性であると期待される。特に、27−ヒドロキシコレステロールの代謝物、3β−ヒドロキシ−5−コレステノン酸は27−ヒドロキシコレステロールの代謝速度を低下させることによって、後者の活性を強化し得ると考えられる。本発明のもう１つの目的は、気球、レーザー又はロタメータ血管形成術後の再発狭窄症の生起を低下させる方法を提供することである。本発明の更なる特徴は、血管内腔を機械的に拡張した結果血管内腔を損傷した直後に27−ヒドロキシコレステロール又は関連化合物を投与すること及び再発狭窄症を防止するために維持投与量の上記化合物を患者に投与し続けることに関係している。本発明の更にもう１つの実施態様では、27−ヒドロキシコレステロール又は関連化合物は経口的にか又は静脈内に投与され、好ましくは２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンのようなβ−シクロデキストリンの水溶液に溶解して静脈内に投与される。本発明のもう１つの実施態様では、ステロール−27−ヒドロキシラーゼ刺激剤を投与することによって脈管組織内での27−ヒドロキシコレステロールの合成を高める。本発明のこの特徴は、大動脈内皮細胞でのステロール−27−ヒドロキシラーゼ活性の発見に基づいている。本発明の他の目的は、以下の発明の詳細な説明から当業者には明白であろう。発明の詳細な発明本発明の実施に使用される化合物は一般的に当該技術分野で知られており、そして次式：（式中、Ｒ₁はヒドロキシル又はケトであり；Ｒ₂は水素、ヒドロキシル又はケトであり；Ｒ₃はヒドロキシル、カルボキシル、水素又はアミノであり；Ｒ₄及びＲ₅ は水素又はアミノである；但し、Ｒ₃がヒドロキシルであるときＲ₄とＲ₅は共に水素であり、そしてＲ₃がヒドロキシルでないとき、Ｒ₃、Ｒ₄及びＲ₅のうち少なくとも１つはアミノ（−ＮＨ₂）でありそして他のものは水素又はアミノである）及びその製薬的に許容可能な誘導体及び塩で示すことができる。式（Ｉ）において、Ｒ₃は27位に置換されている。本発明の実施に使用される好ましい化合物群は、27位（Ｒ₃）がヒドロキシル又はアミノで置換されておりそしてＲ₄とＲ₅の各々が水素である式（Ｉ）の範囲内のものである。この時点で、再発性狭窄を修復及び／又は防止する本発明の方法で使用される最も好ましい化合物は27−ヒドロキシコレステロールである。本発明に使用できる他の化合物には25−アミノコレステロール、26−アミノコレステロール、27−アミノコレステロール、27−ノル−25−アミノ−コレステロール、25−アミノ−コレスタ−4,6−ジエン−3−オン、25−アミノ−コレスト− 4−エン−3−オン、22−アミノ−コレスト−5−エン−3,B−オール、20−アミノ −25,26,27−トリノルコレスト−5−エン−3,B−オール、25−アミノ−コレスタ −3,5−ジエン−7−オンが含まれる。患者に投与するために、本発明の化合物はそのものとしてか又はモノ及びジエステル化誘導体並びにモノ−及びジエーテルのような他の製薬的に許容可能な誘導体として提供することができる。最も通常では、エステルを形成するために脂肪酸、即ち天然生起のものと同一又は類似の脂肪酸が使用されるであろうが、製薬的に許容可能なエステルの製造で定型的に使用される他の無機及び有機エステル、例えばアセテート、スルフェート、カーボネート及びグルクロナイドを使用することができよう。エステル化及び／又はエーテル化は3−及び／又は27−位で生起するか、或いはＲ₂がヒドロキシルであるとき、６又は７の炭素位置で生起することができる。アリール及び／又はアルキルエーテル、例えばメチル、エチル若しくはシクロアルキル（即ち、シクロペンチルエーテル）が意図されている。更に、製薬的に許容可能である限り、酸の塩及び種々の置換化合物、例えば、ステロイドタイプの化合物の修正に通常使用されるフッ素のような元素を含有するものを使用することができる。液体及び固体処方物を使用して投与することができ、そして静脈内注射可能物のような注射可能物を使用して投与することもでき、その際には慣用の製薬担体が使用されるであろう。適当な製薬製剤には錠剤、カプセル、経口用液体及び非経口注射可能物が含まれる。錠剤及びカプセル製剤は、慣用のカプセル及び錠剤製造法でのラクトースのような慣用の希釈剤、賦形剤等を使用することができる。非経口注射剤は脂質可溶性物質と共に慣用的に使用される溶媒を使用することができるか、又はステロールの塩を製造することができ、そしてそのうちの少なくとも幾つかは水性溶媒に溶解されなければならない。本発明化合物の非経口投与用水溶液を形成することは困難であった。プロピレングリコール、エタノール、ジメチルスルホキシド又はジメチルホルムアミドのようなステロイド及び胆汁酸を可溶化するために通常使用される媒体はいずれも、水性媒体で希釈されたとき溶解性を維持することができない。デカプリオ(DeC aprio)、エン(Yen)及びジャビット、Journal of Lipid Research、第33巻、441 〜443頁、1992年、によって開示されているように、27−ヒドロキシコレステロール及び本明細書に含まれる関連化合物は、それにシクロデキストリンを含めることによって水性媒体中で安定化させることができると期待される。シクロデキストリンの環状構造は、限定された水溶解性を有する化合物が可溶性コンプレックスを形成する脂溶性内部を提供することが理論立てられている。この目的で使用できるβ−シクロデキストリンは当該技術分野で既知であり、そしてデカプリオ等、上述、によって記載された２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが含まれる。他の非毒性シクロデキストリンを使用することができよう。本発明の化合物は、１日当たり10mg／kgから100mg／kgまで、好ましくは約20m g／kgから40mg／kgまでの範囲の量を１から３回で投与される。本発明の１つの実施態様では、本発明の化合物は、血管内腔を拡張する直前、中及び／又は後に、上記投与量範囲のほぼ上限の投与量を使用し、その後上記投与量範囲のほぼ下限の維持投与量に減らして、ボーラスとして投与される。維持投与量は長期間に亘って、例えば１から５ヶ月間継続することが意図されている。以下の実施例は本発明の上記した特徴を説明するためのものであって限定するために提供するものではない。実施例１脈管損傷モデル体重2.6から5.1kgのニュージーランド白ウサギを筋肉内ケタミン35mg／kgで麻酔した。ケタミン（100mg／cc）とキシラジン（20mg/cc）の50：50混合物を、必要に応じて１ml増加量で追加的に注射した。ケフリン(Eli Lilly & Co.)、30／m g／kgを静脈内（ＩＶ）投与した。遠位後脚の内側面に縦軸切開を行って大伏在動脈を露出させた。動脈切開術を実施し、そして３−Ｆフォガーティ（Fogarty ）塞栓除去カテーテル（Edwards Laboratories、カリフォルニア州サンタアナ）を導入しそして横隔膜腹大動脈の位置に進めた。カテーテルは、気球を約20mmHg の圧力にふくらませて腹大動脈から引き出した。この方法を総計３回繰り返した。カテーテルを除去し、そして伏在動脈を結紮した。創傷を洗浄しそして4−0デクソン縫合糸で閉じた。標本分析腹大動脈は、左腹部に入れたカテーテル（14G Intracath）を介してグルタールアルデヒドを用いて生理学的圧力で潅流して固定した。エポキシに埋め込んだ大動脈標本の１ミクロン縦軸断面を切断し、染色し、そしてコンピューター画像化した。１標本当たり２個より多い切断面の血管内膜及び内側領域全体を、ルシダ（Lucida）コンピューター計算（Micro Brightfield，Inc.）を使用して測定した。血管内膜肥厚化度は血管内膜対内側領域（Ｉ／Ｍ）比を計算して決定した。群間の血管内膜対内側比の差異の統計的有意性はスチューデントのｔ検定を使用して計算した。実施Ｉ上記方法を使用して、５羽の対照気球損傷ウサギと、27−ヒドロキシコレステロール又はスラミンを投与する各５羽の気球損傷試験ウサギの２群を使用して試験を実施し、後者は血管内膜増殖を阻止することが示された。外科手術前日に、45％の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）水溶液1.0mlに溶解した27−ヒドロキシコレステロール10mgを、５羽の試験ウサギの１つの群に静脈内投与した。スラミンはもう一方の試験群に投与した。ｂＦＧＦを試験期間中ずっと投与した。外科手術日の気球血管形成術の少し前に、５羽の試験ウサギにもう１つのＨＰＢＣＤ 0.5ml中５mgの27−ヒドロキシコレステロールを投与し、そして同じ投与量を、45％のＨＰＢＣＤ0.5ml中５mgの27−ヒドロキシコレステロールを１日２回の形態で、気球血管形成術後１日目から14日目まで５羽の各試験ウサギに１日２回投与した。14日目に、上記標本分析を15羽のウサギで実施して、以下の結果が得られた。この実施は、27−ヒドロキシコレステロールの投与により血管内膜／内側比が改善されたことを示唆している。しかし乍ら、これらの結果はスラミンほど良好ではなく、そして計算したとき、対照群と27−ヒドロキシコレステロール群間の差異は統計的に有意でなかった。有用性が示唆されたので、27−ヒドロキシコレステロール投与量を増加して実施を更に行った。実施II 対照（媒体単独）及び27−ヒドロキシコレステロール試験ウサギは、各試験ウサギに45％のＨＰＢＣＤ 5.0mlに溶解した27−ヒドロキシコレステロール100mg を手術前日、手術日及び手術後１から14日目に皮下投与したことを除いて実施Ｉと同様にして使用した。 27−ヒドロキシコレステロールは対照群と比較したときほぼ1/2だけ血管内膜肥厚化度を低下させた。本願発明の第２の特徴では、ステロール−27−ヒドロキシラーゼ刺激剤を投与して、これまで脈管組織中での存在が知られていなかった脈管組織中に存在するステロール−27−ヒドロキシラーゼ活性を増加させる。このような方法においては、27−ヒドロキシコレステロールはステロール−27−ヒドロキシラーゼ活性による主要代謝物の１つであるという理由でその利用可能量が高まるだけでなく、 27−ヒドロキシコレステロールは再発性狭窄を修復及び／又は防止する際に身体が最も良く利用する場所の細胞で産生される。培養物中のウシ大動脈内皮（ＢＡＥ）細胞内のステロール−27−ヒドロキシラーゼ活性は、同一の培養条件を使用してＨepＧ2細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内の酵素活性と比較した。ＢＡＥ細胞内の総酵素活性（3.0nmol／72時間／細胞タンパク質mg）はＨepＧ2細胞内の総酵素活性（4.0nmol／72時間／タンパク質mg）に匹敵し、そしてこれら両者の値はＣＨＯ細胞内の総酵素活性（0.002nmol／72時間／タンパク質mg）より顕著に大きかった。この酵素は、特異性が証明されている抗体を使用してウェスターンブロット法によってＢＡＥ細胞で同定され、そしてその代謝物27−ヒドロキシコレステロールと3β−ヒドロキシ−5−コレステノン酸はマススペクトル分析によって同定された。内皮に酵素が存在することによって、脈管組織内で27−ヒドロキシコレステロールの生物学的効果をもたらすメカニズムが提供される。実施例２細胞培養屠殺場から得たウシ大動脈内皮（ＢＡＥ）細胞を100mm皿に低密度（２×10⁵個の細胞／cm²）でまき、そして10％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、50単位／mlのペニシリン及び50単位／mlのストレプトマイシンを補充したダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、37℃で５％ＣＯ₂雰囲気下で集密になるまで増殖させた。集密単層をハンクスの平衡塩類溶液で１回洗浄し、そして10％の脱脂ＦＢＳと、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンに溶解した20μＭコレステロールか又は等量の媒体単独のどちらかを含有するＤＭＥＭ４mlを各皿に加えた。ＨepＧ2細胞とチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を同一条件下で且つ同一期間培養した。24時間間隔で培地と細胞を採集した。各皿から得た培地は代謝物について分析した。細胞は免疫ブロット分析用にプールした。ウェスターンブロット法試料は、10％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に付し、そして電気泳動技術によってニトロセルロース膜に移した。27−ヒドロキシラーゼタンパク質の残基15から28に対する抗体をウサギで生じさせた。視覚化はアルカリホスファターゼ抱合ヤギ及び抗ウサギ抗体、続いてウェスターンブロットの熱量計検出用Ｒad-freeキット（Schleicher & Schuell、ニューハンプシャー州キーン）を使用して達成した。ＢＡＥ細胞から調製したミトコンドリア中の56kbの27−ヒドロキシラーゼタンパク質を検出するために数回試験したが、プロテアーゼインヒビターを使用したにも拘わらず、優勢な免疫反応性バンドは35kdで検出され、56kdの弱いバンドは時折り検出された。新たに採集した装填緩衝液中の全細胞の煮沸によりタンパク分解が阻止されたように思われる。ＧＬＣ−ＭＳ分析試料調製採集した培地１mlに、重水素処理した27−ヒドロキシコレステロール、３β− ヒドロキシ−5−コレステノン酸（重水素処理した27−ヒドロキシステロールの３−モノアセテートのジョーンズ(Jones)酸化によって調製した）及び¹³Ｃ−3β −ヒドロキシ−5−コレノン酸の内部標準（各500ng）を加え、そして室温で30分間平衡化させた。酸性化しそして酢酸エチル中に抽出した後、乾燥残渣をけん化した。試験によっては、抽出前にソルボリシスも実施した。乾燥抽出物は、真正標準品と一緒にシリカゲルゲルＧＴＬＣプレートに平行レーンとして適用した；展開（クロロホルム／アセトン、97：３）後、ホスホモリブデン酸を噴霧して標準品を視覚化し、そして27−ヒドロキシ−コレステロール並びにＣ₂₇及びＣ₂₄酸を溶出させるため適当なプレート領域を取り出した。次に、27−ヒドロキシコレステロールのジアセテートとＣ₂₇及びＣ₂₄酸のメチルアセテートを、メチル化用にジメトキシ−プロパン／ＨＣｌをそしてアセチル化用にピリジン／無水酢酸を使用して調製した。ジメトキシプロパン／ＨＣｌによるＣ₂₇酸の完全なメチル化はＣ₂₄酸より長くかかることが分かった。それ故、メチル化は室温で一夜（約18 時間）進行させた。この長期間のメチル化法による３−メトキシ誘導体形成は検出されなかった。同位体比率マススペクトル法ヒューレット・パッカードＧＬＳ−ＭＳ（モデル#5890−5970）及び融合シリカカラム（CP−sil 19 CB、内径0.25mm、長さ25ｍ; Chrompack、ニュージャジー州ラリタン）を使用して、適当なＴＬＣフラクションを、1.0℃／分で260℃から 270℃までプログラミングした温度及び５psiのカラムヘッド圧によって連続モードで注入した。 27−ヒドロキシコレステロールを定量するために、ｍ/ｚ 426［ジアセテートのモルイオン＝486−60（アセテート）］とｍ/ｚ 430の同時イオンモニターモードで検出器をプログラミングし、そして内在性27−ヒドロキシコレステロールの量をそれぞれの領域から計算した。Ｃ₂₇酸では、使用したイオン対はｍ/ｚ 412 ［メチルエステルアセテートのモルイオン＝476−60（アセテート）］とｍ/ｚ 4 16であり、そしてＣ₂₄酸ではｍ/ｚ 370［メチルエステルアセテートのモルイオン＝430−60（アセテート）］とｍ/ｚ 373であった。結果ＢＡＥ細胞と72時間接触させたステロール不含培地から単離した27−ヒドロキシコレステロール及び3β−ヒドロキシ−5−コレステノン酸のスペクトルと保持時間は共に、それぞれジアセテート及びメチルエステルジアセテート誘導体の真正標準品と同一である。これら化合物の同一性を完全なスペクトル分析によって確立した後、同位体比率プログラムを使用して、ステロール不含及びコレステロール補充培地中でのこれら化合物の合成速度を比較した。表１に示したように、20nmol／mlのコレステロールを含有する培地はステロール不含培地よりはるかに多量の代謝物を産生させた。72時間目に、代謝物は培地に添加されたコレステロールの約5.8％を示した［（1.029＋0.211）−（0.103＋0.079）×100÷20］。培地中の27−ヒドロキシコレステロールの量は24から72時間までで比較的一定であったが、3β−ヒドロキシ−5-コレステノン酸の量の累進的増加が生じた。非補充培地中で維持したＢＡＥ細胞では、Ｃ₂₇酸の割合が24時間での12％から72時間での 43％に上昇した。対照的に、合成されたＣ₂₇胆汁酸の絶対量はコレステロール補充培地の方がより多かったが、24時間目には総代謝物の3.8％しか示さずそして7 2時間目には17％に増加した。ＢＡＥ細胞中のステロール−27−ヒドロキシラーゼの活性を、コレステロール補充培地を使用してＨepＧ2及びＣＨＯ細胞中での活性と比較した。表２に示したように、72時間目にＢＡＥ細胞から集めた培地中の27−ヒドロキシコレステロールの量はＨepＧ2細胞から得たものより多かった。ＣＨＯ細胞から得た培地中に存在する量は検出限度（アッセイ当たり10ng）未満であった。ＣＨＯ細胞から得た培地は常に少量の3β−ヒドロキシ−5−コレステノン酸を含有しており、そしてこれはＨepＧ2又はＢＡＥ細胞から得た培地中で見られたものよりはるかに少なかった。ＨepＧ2細胞は27−ヒドロキシコレステロールから3β−ヒドロキシ−5−コレノン酸を合成するので、全ての細胞系から得た培地はソルボリシスの前後にこの誘導体について分析した。３β−ヒドロキシ−5−コレステノン酸の産生量は、ＨepＧ2又は他の細胞系から得た培地のソルボリシス後には増加しなかった。Ｈe pＧ2細胞から得た培地は、３β−ヒドロキシ−5−コレノン酸を含有していることが見い出され、そしてこの量はソルボリシス後に増加した。代謝産物は全て細胞のステロール−27−ヒドロキシラーゼ活性に由来するので、ＨepＧ2細胞とＢＡＥ細胞によって産生される総量は類似しており、そしてＣＨＯ細胞から得られるものよりはるかに多い。上記から、再発性狭窄に与える本願発明のプラスの効果は脈管内皮のステロール−27−ヒドロキシラーゼ活性を刺激することによってもたらすことができる。天然生起の性ホルモンのエストロゲンやテストステロンのようなステロイドホルモンを投与することによるような種々の刺激メカニズムが知られている。当業者は、ステロール−27−ヒドロキシラーゼ刺激剤効果をもたらすのに使用するために他の天然生起及び合成ステロイドホルモンを選択することができよう。ウサギの平滑筋細胞の増殖に与える27−ヒドロキシコレステロール及び3β− ヒドロキシ−5−コレステノン酸の効果を測定するために追加実験を実施した。この実験を以下に示す：ウサギ平滑筋細胞の増殖に与える 27−ヒドロキシコレステロール及び3β−ヒドロキシ−5−コレステノン酸の効果 96ウエルの微量滴定プレートを使用して、5000個の細胞を各ウエルにまき、そして0.1％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコの修正イーグル培地中で同調させた後、培地を取り出しそして５％の脱脂ＦＢＳを含有する培地及び、種々の濃度の27−ヒドロキシコレステロールか又は3β−ヒドロキシ−5−コレステノン酸のどちらかを含有する媒体で置き換えた。24時間目の細胞増殖は、各ウエルに存在する細胞数と相関関係にあることが知られているＭＴＳからのホルマザン（formazan）形成を使用して測定した。24時間目に、20μＭの27−ヒドロキシコレステロールを含有するウエルの光学密度は0.350±0.021であり、そして 3β−ヒドロキシ−5−コレステノン酸を含有するウエルでは0.357±0.22であった。対照ウエル（光学密度＝0.402±0.037）と比較すると、有意な減少（ｐ＜0. 01）が生じ、両化合物がウサギの平滑筋に対して抗増殖効果を有していることを示唆していた。更に、ラット大動脈及びヒト大腿動脈由来の細胞の増殖に与える27−ヒドロキシコレステロールの効果を試験するために、１つの実験も実施した。この実験を以下に示す：ラット大動脈及びヒト大腿動脈由来の平滑筋細胞の増殖に与える27−ヒドロキシコレステロールの効果（Institute of Pharmaceutical SciencesのDr．A．Corsini研究室、イタリア国ミラノ）平滑筋細胞は、ロス（Ross）（J．Cell．Biol.、50:172、1971年）に従って雄スプラーグ・ドゥリーラット（200〜250ｇ）の血管内膜−内側層から培養した。細胞は、10％のＦＢＳ、100Ｕ／mlのペニシリン、0.1mg/mlのストレプトマイシン、20nＭのトリシン緩衝液及び１％の非必須アミノ酸溶液を補充したＭＥＭ中、５％ＣＯ₂の湿潤化雰囲気下37℃で単層で増殖させた（Corsini等、Atheroscle rosis、101:117、1993年）。この培地を３日毎に取り替えた。細胞は継代数第４回から第10回の間で使用した。細胞の生存度はトリパンブルー排除によって評価した。平滑筋細胞は増殖挙動、形態学について、そしてα−アクチンに特異的なモノクローナル抗体を使用して、平滑筋細胞に典型的なイソ体を使用して同定した。ヒト脈管ミオサイトをヒト大腿動脈から取り、そして同じ培養条件下で増殖させた。ラット大動脈由来の平滑筋細胞は２×10⁵の密度で、そして大腿動脈由来のものは５×10⁴の密度でまいた。0.4％ＦＢＳを含有するＭＥＭ中で48時間同調させた後、培地を10％ＦＢＳと取り替えそして27−ヒドロキシコレステロールを加えた。細胞増殖は72時間目に、単層をトリプシン処理しそしてモデルＺＭコウルターカウンターで計数することによってか又は３時間インキュベートした後のトリチウム処理チミジン取込みのどちらかによって測定した。結果は以下の表形式で示す：上記２つの実験及びそれに関連するデータは、内皮損傷又は表皮剥落後の新生血管内膜過形成で生じる低下のメカニズム（即ち、再発性狭窄の防止）を提供する。かくして、これらの追加実験によって、27−ヒドロキシコレステロールと3 β−ヒドロキシ−5−コレステノン酸が共に平滑筋の増殖を阻止し、そして多分その結果血管内膜への細胞移動が阻止されるということが確立される。平滑筋細胞は移動と増殖の両方によって、再発性狭窄を引き起こす新生血管内膜塊の原因となる。本発明の変形は当業者に明白であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物の血管内腔に存在する狭窄を修復するか又は取り除くために実施される治療方法において、式（Ｉ）：（式中、Ｒ₁はヒドロキシル又はケトであり；Ｒ₂は水素、ヒドロキシル又はケトであり；Ｒ₃はヒドロキシル、カルボキシル、水素又はアミノであり；Ｒ₄及びＲ₅ は水素又はアミノである；但し、Ｒ₃がヒドロキシルであるときＲ₄とＲ₅は共に水素であり、そしてＲ₃がヒドロキシルでないとき、Ｒ₃、Ｒ₄及びＲ₅のうち少なくとも１つはアミノ（−ＮＨ₂）でありそして他のものは水素又はアミノである）の化合物並びにその製薬的に許容可能な誘導体及び塩の再発性狭窄防止量を哺乳動物に投与することによる、再発性狭窄を防止するための方法。２．哺乳動物の血管内腔に存在する狭窄を修復するか又は取り除くために実施される治療方法において、式（Ｉ）：（式中、Ｒ₁はヒドロキシル又はケトであり；Ｒ₂は水素、ヒドロキシル又はケトであり；Ｒ₃はヒドロキシル、カルボキシル、水素又はアミノであり；Ｒ₄及びＲ₅は水素又はアミノである；但し、Ｒ₃がヒドロキシルであるときＲ₄とＲ₅は共に水素であり、そしてＲ₃がヒドロキシルでないとき、Ｒ₃、Ｒ₄及びＲ₅のうち少なくとも１つはアミノ（−ＮＨ₂）でありそして他のものは水素又はアミノである）の化合物並びにその製薬的に許容可能な誘導体及び塩の再発性狭窄修復量を哺乳動物に投与することによる、再発性狭窄の程度を低下させるための方法。３．Ｒ₃がヒドロキシル又はアミノでありそしてＲ₄及びＲ₅の各々が水素である請求の範囲第１項記載の方法。４．Ｒ₃がヒドロキシル又はアミノでありそしてＲ₄及びＲ₅の各々が水素である請求の範囲第２項記載の方法。５．投与される式（Ｉ）の化合物が27−ヒドロキシコレステロールである請求の範囲第１項記載の方法。６．投与される式（Ｉ）の化合物が27−ヒドロキシコレステロールである請求の範囲第２項記載の方法。７．式（Ｉ）の化合物が、水性媒体中の式（Ｉ）の化合物を安定化するのに十分な量の製薬的に許容可能なシクロデキストリンを含有する水性媒体を含む製薬的に許容可能な担体中で投与される請求の範囲第１項記載の方法。８．式（Ｉ）の化合物が、水性媒体中の式（Ｉ）の化合物を安定化するのに十分な量の製薬的に許容可能なシクロデキストリンを含有する水性媒体を含む製薬的に許容可能な担体中で投与される請求の範囲第２項記載の方法。９．上記治療方法が外科手術法である請求の範囲第１項記載の方法。１０．上記治療方法が外科手術法である請求の範囲第２項記載の方法。１１．上記治療方法が気球、レーザー又はロタメータ血管形成術である請求の範囲第１項記載の方法。１２．上記治療方法が気球、レーザー又はロタメータ血管形成術である請求の範囲第２項記載の方法。１３．上記治療方法が気球血管形成術である請求の範囲第１項記載の方法。１４．上記治療方法が気球血管形成術である請求の範囲第２項記載の方法。１５．請求の範囲第１項記載の化合物が１日当たり約10から100mg／kgの量を１から３回で投与される請求の範囲第１項記載の方法。１６．請求の範囲第１項記載の化合物が１日当たり約10から100mg／kgの量を１から３回で投与される請求の範囲第２項記載の方法。１７．式（Ｉ）の化合物が該化合物それ自体として、或いはそのモノ−若しくはジ−エステル、又はモノ−若しくはジ−エーテルとして投与される請求の範囲第１項記載の方法。１８．式（Ｉ）の化合物が該化合物それ自体として、或いはそのモノ−若しくはジ−エステル、又はモノ−若しくはジ−エーテルとして投与される請求の範囲第２項記載の方法。１９．式（Ｉ）の化合物が、上記治療方法の前、中及び／又は後に投与される請求の範囲第１項記載の方法。２０．式（Ｉ）の化合物が、上記治療方法の前、中及び／又は後に投与される請求項２項記載の方法。２１．式（Ｉ）の化合物が上記治療方法の後に投与される請求の範囲第１項記載の方法。２２．式（Ｉ）の化合物が、上記治療方法の後に投与される請求の範囲第２項記載の方法。２３．哺乳動物の血管内腔に存在する狭窄を修復するか又は取り除くために実施される治療方法において、再発性狭窄の程度を低下させるのに十分な量のステロール−27−ヒドロキシラーゼ刺激剤を哺乳動物に投与することによる、再発性狭窄の程度を低下させるための方法。２４．哺乳動物の血管内腔に存在する狭窄を修復するか又は取り除くために実施される治療方法において、再発性狭窄を防止するのに十分な量のステロール− 27−ヒドロキシラーゼ刺激剤を哺乳動物に投与することによる、再発性狭窄を防止するための方法。