JPH09502988A - 寄生虫に対する感染防御抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 オステルタギア キルクムキンクタ（Ｏｓｔｅｒｔａｇ ｉａ ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）、トリコストロンギルス コルブリホルミス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙ ｌｕｓ ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）、およびファスキオラ ヘパティカ（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉ ｃａ）、ならびに関連感染体からなる群から選択される感染体に対する仮想的感染防御抗原もしくはその断片であって、それらの抗原は、２６〜３６および９１〜１０５キロダルトンの領域のおおよその分子量を有する抗原、３２〜３５キロダルトンのおおよその分子量を有する抗原、ならびに２８キロダルトン、３２キロダルトン、３７キロダルトン、４２〜１００キロダルトン、５４〜５５キロダルトン、および＞２００キロダルトンの領域のおおよその分子量をそれぞれ有する抗原から選択される。

Description

【発明の詳細な説明】 寄生虫に対する感染防御抗原 本発明は、抗体プローブ、ならびに寄生虫および細菌からの数多くの感染防御 抗体および診断用抗原の検出および精製におけるそのようなプローブの使用に関 する。具体的には本発明は、寄生虫、オステルタギア キルクムキンクタ（Ｏｓ ｔｅｒｔａｇｉａ ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）、トリコストロンギルス コル ブリフォルミス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍ ｉｓ ）、およびファスキオラ ヘパティカ（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃ ａ ）中の抗原の同定および精製、先の抗原を組み入れたワクチンの調製法、なら びに診断用アッセイにおけるそのような抗原の使用に関する。 先行技術では、家畜類を初めとする動物の寄生虫、細菌、および他の感染体に 対するワクチンの開発にかなりの努力が注がれてきた。しかしながら、真核生物 および原核生物の生物体の外来性産物の大容量での産生の関連技術は途方もなく 進展してきているにもかかわらず、過去５年間ではこの目標に対しては殆ど進展 が果たせられていない。動物における重要な病原体性感染の感染防御抗原の同定 は、例えばワクチンの産生に至るまでに重要な障害をかかえたままになっている 。 オーストラリア特許第６４０３６４号は引用により本明細書に取り込まれるが 、この特許では疾患病原体に関連する抗原を調製するための方法が開示されてお り、そしてこの方法は攻撃に対して最も感受性が高いと考えられるある発達段階 の疾患病原体から採取された疾患病原体の試 料；ならびに、ある疾患病原体に対する少なくとも一つの抗体を含む抗体プロー ブを提供し；その病原体試料をその抗体プローブで探索し；そして検出される抗 原を単離することを含む。 この方法は当該技術分野における有意な進展を提供するものの、調査事項は少 数の寄生虫性および細菌性感染に限定されていた。この方法が他の感染、および 別の感染防御抗原の同定に首尾よく適用できたとしたら、これは当該技術分野に おける有意な進展であったかもしれない。 オステルタギア キルクムキンクタ（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ ｃｉｒｃｕｍｃ ｉｎｃｔａ ）はヒツジの腸内線虫寄生虫であり、これはヒツジの第四胃（４番目 の胃）に局在する。Ｏ．キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ） は最近ではテラドルサギア キルクムキンクタ（Ｔｅｌａｄｏｒｓａｇｉａ ｃ ｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ ）として再分類されているものの、後者の名称は未だに 一般的には用いられていない。第四胃中の成虫寄生虫からの卵は感染したヒツジ の排泄物中から牧草へと受け渡される。 孵化後には第三段階（Ｌ３）にまで発達した幼虫が牧草に出現する。Ｌ３幼虫 は放牧されているヒツジに摂取され、そして第四胃内で更に発達を遂げる。Ｌ４ 段階は第四胃陰窩で発達するが；発達はヒツジの免疫状態および季節に依存して 緩和な速度をとるか、もしくは拘束される可能性がある。幼虫は冬の間中粘膜陰 窩内で発達休止状態で過ごし、その後、春に成熟した卵産生性成虫へと発達する 可能性がある。寄生虫数が突然同調増加すると有意な罹患率を生じることが可能 である。後期幼虫段階および成虫の粘膜での摂取に起因する組織損傷は、血清漏 洩および第四胃内層の肥厚、ならびにそれに後続する第四胃機能の妨害、および 究極的にはその動物の成長不全をもたらす。類似の病状が関連寄生虫、Ｏ．オス テルタギイ（Ｏ． ｏｓｔｅｒｔａｇｉｉ）により乳牛にもたらされている。 オーストラリアおよび海外諸国における綿羊・乳牛産業においてかなりの経済 的損失を生じるという点でのオステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）種の重要 性にもかかわらず、従来の技術ではこの寄生虫に対しての有効なワクチンが未だ に開発されていない。 ファスキオラ ヘパティカ（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）（肝蛭） は吸虫類（Ｔｒｅｍａｔｏｄｅ）一族に属する寄生虫であり、これは種々の野生 および家畜動物種に感染可能であり、かつ綿羊・乳牛産業にとって特に経済的に 重要なものである。研究されている種の中でも、ラットは再感染に対して強力か つ免疫学的な基盤を有する免疫性を発揮することが可能な唯一の宿主である（Ｈ ａｒｏｕｎ，Ｅ Ｔ Ｍ ａｎｄ Ｇ Ｖ Ｈｉｌｌｙｅｒ、Ｖｅｔ Ｐａｒａ ｓｉｔｏｌ ２０ ６３−９３、１９８６、に総説が記載されている）。従って ラットの免疫系によって強く認識される抗原はワクチン接種手法にとって特に重 要なものであり、かつ本出願中に開示されている。オーストラリア特許第６４０ ３６４号はファスキオラ ヘパティカ（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ） 感染に対する感染防御抗原を開示しており、この抗原は約１２０〜１２５キロダ ルトンのおおよその分子量を有する。この抗原は乳牛とヒツジとの間で特異的に 認識され、かつ本出願に記載される抗原とは完全に異なっている。 トリコストロンギルス エスピーピー（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ．）での感染は、ヒツジでは小腸の最初の３〜４メータ ー内で生じ、そして羊毛産生および体成長の減少、貧繁殖、ならびに収益の減少 をもたらす。重篤感染は死をもたらす可能性がある。これは経済的に重大な疾患 でもあるが、この寄生虫に対する有用なワクチンは従来の技術では未だに開発さ れていない。 従って、従来の技術に関連する難題および欠点の内の一つもしくは複数を克服 するか、もしくは少なくとも軽減することが本発明の目的である。 従って最初の態様では、本発明はオステルタギア キルクムキンクタ（Ｏｓｔ ｅｒｔａｇｉａ ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）もしくは関連感染体に対する仮想 的な感染防御抗原もしくはその断片を提供するが、ただしそれらは２６〜３６お よび９５〜１０５キロダルトンの範囲内のおおよその分子量を有する抗原から選 択され、本明細書中これ以降に記載される。これらの抗原は他の種および系統の 寄生虫にも存在する可能性がある。 ２６〜３６ｋＤのＯ．キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ） の抗原領域はその３２〜３６ｋＤの位置にダブレット抗原を含む可能性がある。 このダブレット抗原はレクチン様β−ガラクトシド結合性蛋白質である可能性が ある。この３２〜３６ｋＤのダブレット抗原は一つもしくは複数のペプチド配列 の内の一つを含む可能性がある。 ２６〜３６ｋＤのＯ．キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎ ｃｔａ ）抗原領域の株バンドは、トロポミオシンおよびグルタチオニンＳ−トラ ンスフェラーゼと相同の蛋白質を含む。 Ｏ．キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）の配列で、（Ａ） トロポミオシンと相同のものは： （Ｂ）グルタチオニンＳ−トランスフェラーゼと相同のものは： である。 本発明の別の好ましい態様は、トリコストロンギルス コルブリフォルミス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）もしくは関 連感染体に対する仮想的感染防御抗原もしくはその断片を提供することであるが 、ただしそれらは３２〜３５キロダルトンのおおよその分子量を有し、本明細書 中これ以降に記載される。この感染防御抗原はダブレットであってもよい。 Ｔ． コルブリフォルミス（Ｔ． ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）抗原はＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥ上では先に引用されるＯ．キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍ ｃｉｎｃｔａ ）ダブレット抗原と同一位置に存在し、そしてそのためこれらは本 質的には類似する分子ではあるが、相同な上清抗体プローブにより最も強く認識 される種特異的エピトープを含む可能性がある。 本発明の更に別の態様では、ファスキオラ ヘパティカ（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ）もしくは関連感染体に対する仮想的感染防御抗原もしくはそ の断片が提供され、それらは、２８キロダルトン、３ ２キロダルトン、３７キロダルトン、４２〜１００キロダルトン、５４〜５５キ ロダルトン、および＞２００キロダルトンの領域のおおよその分子量を有する抗 原から選択され、本明細書中これ以前に記載されている。他のファスキオラ（Ｆ ａｓｃｉｏｌａ ）種（例えばファスキオラ ギガンティカ（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ ））、および他の吸虫類寄生虫（例えばスキストソマ エス ピーピー（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｓｐｐ．））においては類似抗原が存在す る可能性がある。 ＞２００キロダルトンのＦ． ヘパティカ（Ｆ． ｈｅｐａｔｉｃａ）抗原は ダブレット抗原である可能性がある。Ｆ． ヘパティカ（Ｆ． ｈｅｐａｔｉｃ ａ ）抗原は攻撃誘発させた免疫ラットの腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）からの上清に より特異的に認識される。 ３２ｋＤ抗原はＮ−末端ペプチド配列 KPNYKRQFEPFSDELIHYINLE を含む可能性がある。 ５４〜５５ｋＤ抗原はＮ−末端ペプチド配列 LEDNGRTHWAVLVA を含む可能性がある。 組換え蛋白質抗原を寄生虫から抽出された天然の抗原の代わりに用いることが できるということが理解されるであろう。 感染防御用エピトープを含む抗原（一つもしくは複数）の断片、および感染防 御用エピトープを含む合成ペプチドを、ワクチンおよび診断用検査の両方におけ る天然もしくは組換え体の全分子（一つもしくは複数）と置換することができる 。 この抗原（一つもしくは複数）は他の種の寄生虫に存在する可能性があり、そ してそのため表示される病原体により生じるもの以外の他の疾患のワクチン接種 および診断に用いられるであろう。 これらの抗原に対して作製された抗体はポリクローナルもしくはモノクローナ ルのいずれにも拘わらず、診断用検査に、もしくは免疫予防剤として用いること ができる。 本発明に従う感染防御抗原は、先に引用されるオーストラリア特許第６４０３ ６４号に開示される方法を利用して産生することができる。従って更に別の態様 では、本発明は既述のファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）、オステルタギア（Ｏ ｓｔｅｒｔａｇｉａ ）、およびトリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎ ｇｙｌｕｓ ）種、ならびに関連種から選択される疾患病原体に関連する抗原を調 製するための方法を提供し、その方法は、 ファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）、オステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ ）、およびトリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）種、な らびに関連種から選択される疾患病原体の試料；ならびに、 ある方法 ［この方法は、免疫動物を、ファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）、オステル タギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、およびトリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏ ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ）種、ならびに関連種から選択される病原体もしくは病原 体抽出物で攻撃誘発させた後の短時間の内に採取されたその免疫動物からの生物 学的試料を提供し； その生物学的試料から細胞を単離し； 細胞を適切な培養培地中でインビトロで培養し；そして 前記細胞から産生される抗体を回収することを含む］ により産生される個別の疾患病原体に対する少なくとも一つの抗体を含 む対応抗体プローブを提供し、 その対応抗体プローブでその病原体試料を探索して少なくとも一つの抗原を検 出し;そして 検出された抗原を単離すること、 を含む。 この疾患病原体試料は、寄生虫、寄生虫抽出物、もしくはその寄生性部分であ ることが好ましい。オステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）病原体はオステル タギア キルクムキンクタ（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ ）もしくはオステルタギア オステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ ｏｓｔｅ ｒｔａｇｉａ ）である可能性がある。トリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔ ｒｏｎｇｙｌｕｓ ）病原体は、トリコストロンギルス コルブリフォルミス（Ｔ ｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）もしくはトリ コストロンギルス アクセイ（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ａｘｅｉ） である可能性がある。ファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）種はファスキオラ ヘ パティカ（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）もしくはファスキオラ ギガ ンティカ（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ）である可能性がある。 好ましい態様では疾患病原体の試料を、攻撃に対して最も感受性が高いと思わ れる、ある発達段階に採取することができる。 疾患病原体の試料が採取される時期が重要であると仮定され、その理由は、寄 生虫は被検体に侵入した後のほんの短期間のみに攻撃が効を奏する状態となり、 その後には寄生虫は構造を変化させる可能性があり、そして最早免疫攻撃を受け 付けなくなり、そして最早感染防御抗原を発 現しなくなる可能性があることである。 例えば、疾患病原体、Ｆ． ヘパティカ（Ｆ． ｈｅｐａｔｉｃａ）、Ｏ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）、およびＴ． コルブリ フォルミス（Ｔ． ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）の場合には、幼虫段階から試 料を採取することが適する可能性がある。 生物学的試料を採取することができる動物はいずれかの適切な種類のものであ る可能性がある。生物学的試料が採取される動物は免疫動物である可能性がある 。生物学的試料は、その免疫動物を病原性感染体で攻撃誘発させた後の短時間の 内に採取することができる。この動物は、ヒツジもしくは乳牛のような動物であ る可能性がある。 生物学的動物試料はいずれかの適切な種類のものであることができる。生物学 的試料は、動物組織、器官、血液、リンパ、もしくはリンパ節からのものである 可能性がある。生物学的試料は感染化動物のいずれかの切片標本から採取するこ とができる。しかしながら、試料を、感染部位、あるいは所定の疾患の際に形成 される可能性のある病変の領域、あるいはその感染部位に近接するかもしくはそ こからの排水が行われる領域、あるいは例えばリンパ節中に存在するような病変 から採取することが好ましい。試料は肝リンパ節、第四胃リンパ節、もしくは腸 間膜リンパ節から採取される可能性がある、血清／血漿試料は生物学的試料とし ては好ましくはない。血清／血漿試料中に見いだされる過半数の抗体は感染防御 もしくは病原体の特異的診断には不適切であり、かつその病原体とは無関係であ ることが見いだされている。 それとは対照的に、本発明で用いられるプローブは病原体特異的抗体がかなり 豊富に含まれ、かつこれを感染防御免疫性にとって特に重要で ある病原体段階に限定して選択することが可能である。 生物学的試料から単離される細胞はＢ細胞を含む可能性がある。この細胞は、 分泌および／または抗体産生性期間を含むことが知られる時期にも同じように単 離される可能性がある。別法では、この細胞は所定の疾患の後期段階に産生され る可能性のあるメモリー細胞を含む可能性がある。 従って例えば適切な寄生虫段階に関しては、その細胞をインビボでの刺激化後 の短時間、好ましくはその後のおおよそ２〜１３日の内に採取することが好まし く、そのことにより抗体形成性細胞のインビボでの誘導化がもたらされ、そして その細胞はインビトロでのインキュベーションの後にその培養培地中に特異的抗 体を産生するであろう。非活性化リンパ球の事前のインビボ刺激化なしでは、抗 体は培養培地中に全く分泌されないか、もしくはほんの少量のみの分泌である可 能性がある。 つい先ほど活性化されたばかりのＢ細胞による培養培地中の抗体のインビトロ 分泌は、その培養物へのヘルパー因子の添加により亢進させることができる。こ のヘルパー因子は、単独もしくは組合わせて用いられるサイトカインである可能 性があり、これらにはインターロイキン１、２、３、４、５、６、７、および８ 、コロニー刺激化因子、インターフェロン、およびいずれかの他の因子が含まれ 、これらはＢ細胞による特異的抗体分泌における亢進性効果を有することが見い だされる可能性がある。 抗体プローブを産生する方法には、単離された細胞を活性化させて増殖、なら びに抗体の分泌および／または放出を行わせる別の段階が含まれる可能性がある 。細胞活性化剤は寄生虫由来のものである可能性があ るし、あるいはマイトジェン類、および白血球により産生されるヘルパー因子類 、あるいはそれらの合成的等価物、あるいはそれらの組み合わせ物から選択する ことが可能である。 マイトジェンは、ポークウィド（アメリカヤマゴボウ）（フィトラッカ アメ リカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ））に由来する産物でポー クウィドマイトジェン（ＰＷＭ）としても知られるもの、ホルボールミリスチン 酸（ＰＭＡ）、ポリビニル−ピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアデニル酸−ポリウリ ジル酸（ｐｏｌｙ（Ａ−Ｕ））、精製ツベルクリン（ＰＰＤ）、ポリイノシン酸 −ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ（Ｉ−Ｃ））、リポ多糖（ＬＰＳ）、ブドウ球菌生 物体もしくはその産物、バクト（Ｂａｃｔｏ）−ストレプトリシン Ｏ−試薬（ ＳＬＯ）、ブドウ球菌ファージ溶菌物（ＳＰＬ）、エプスタイン−バールウイル ス（ＥＢＶ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）菌の水溶性マイトジェン（ＮＷ ＥＭ）、フィトヘマグルチン（ＰＨＡ）、コンカナバリン（Ｃｏｎｃａｎａｖａ ｌｉｎ）Ａ（Ｃｏｎ Ａ）、および硫酸デキストラン、ならびにそれらの混合物 から選択することができる。細胞増殖剤は、Ｂ細胞増殖および／または抗体分泌 を間接的もしくは直接的にもたらすいずれかの作用物質であることができ、その 例は、固相抗−免疫グロブリンである。ヘルパー因子は、インターロイキン１、 ２、３、４、５、６、７、および８、コロニー刺激化因子、インターフェロンを 初めとするサイトカイン類、ならびに単独もしくは他の因子および作用物質と組 み合わせて添加する際に特異的Ｂ細胞増殖および／または抗体分泌についての亢 進性効果を有することが示される可能性のある他のヘルパー因子である可能性が ある。これはヘルパー因子を初めとするマイトジェンおよ び細胞活性化因子の完璧なリストを意味することでは決してあり得ない。 細胞のインビトロ培養は、細胞の亜集団を分離するための事前段階を伴ってか 、もしくは伴わずに実施される可能性がある。抗体の回収はその培養培地からの 上清の回収により実施される可能性がある。この上清はそのインビトロ培養中に それらの細胞により分泌されたか、あるいはＢ細胞から人工的に放出された（例 えばＢ細胞の溶菌により）抗体を含む。驚くべきことに、抗体含有性上清を直接 使用して病原体の抗原を検出することができる。 好ましい態様では、疾患病原体の試料を標準的緩衝溶液と混合し、そして例え ばＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのような標準的支持体上にのせて、その中に 含まれる蛋白質を分離することができる。分離された蛋白質は、その後にニトロ セルロース、ナイロン、もしくは他のシートに移すことができる。 既述の要領で産生される対応抗体を、その培養培地から回収された上清の形態 で単純に利用することができる。別法では、その抗体を分離および精製すること ができる。 培養培地に含まれる抗体を抗原の精製用に用いることができる。親和性精製、 好ましくは免疫親和性精製を用いることができる。 既述の要領で位置が決定された抗原を、いずれかの適切なアッセイ技術を利用 して検出することができる。 従って抗体探索段階は、このようにして産生された産物を検出用アッセイに供 することを更に含む可能性がある。 検出用アッセイはウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット技術を含むことがで きる。検出用アッセイは、免疫沈降アッセイ、放射免疫アッセ イ、酵素抗体免疫アッセイ、もしくは免疫蛍光アッセイであることができる。 従って抗原をある方法により精製することができ、その方法には、 未精製の抗原混合物； ファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）、オステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇ ｉａ ）、およびトリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、 ならびに関連種から選択される疾患病原体に対する抗体（適切な支持体に固定化 されている）； を提供すること； その未精製抗原混合物を固定化抗体を利用する親和性クロマトグラフィーに供 すること；ならびに そのように形成された精製化抗原を単離すること、 を含む。 抗体は既述の培養上清プローブから通常の方法により取得可能である。例えば 、血清もしくは血漿から免疫グロブリンを精製するのに通常に用いられる方法（ 例えば硫酸アルミニウムでの沈殿、カプリル酸での分画化、イオン交換クロマト グラフィー）、あるいは固定化させたプロテインＧもしくはプロテインＡへの結 合および溶出による方法を利用することができる。 このように取得された抗体を、その後には適切な支持体（例えば、ＣＮＢｒ− 活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ａ ｆｆｉ−ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社））、もしくは蛋白質を結合することが可能な 他の親和性クロマトグラフィー支持体に結合させることが可能である。 固定化された抗体をその後には、親和性クロマトグラフィーによる複雑な寄生 虫抽出物からの特異抗原の分画化および精製に適用させることができる。抗原を 固定化抗体に結合させた後には未結合の巨大分子種を固体支持体から洗いさるこ とができるが、それには例えば、１．５ＭのＮａＣｌを含む緩衝液が用いられる 。それに続いてその抗原をその親和性カラムから溶出させることができ、それに は例えば、低いもしくは高いｐＨ緩衝液、あるいはカオトロピックイオン（例え ば、０．５〜３．０Ｍのチオシアン酸ナトリウム）を含む緩衝液が用いられる。 単離もしくは位置の決定が行われた抗原を、モノクローナル抗体の調製の際に 用いることができる 従って本発明は更に、既述の、ある疾患病原体の抗原に対するモノクローナル 抗体を産生させるための方法を提供し、この方法は、 前記感染防御抗原もしくはその断片に対する抗体を産生可能であり、かつ既 述の疾患病原体に対する感染防御抗原で免疫化される動物から取得されるＢ細胞 ；および 骨髄腫細胞； を提供し； そのＢ細胞をその骨髄腫細胞と融合させ； そうすることにより形成されるハイブリドーマ細胞を継代し；そして 前記ハイブリドーマにより産生される抗体を回収すること、 を含む。 このモノクローナル抗体は先に論議される疾患の受動的治療の基盤を形成する 可能性がある。 抗原がファスキオラ ヘパティカ（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉ ｃａ ）抗原であることが好ましい。 このように形成されたモノクローナル抗体は、本明細書中これ以降に記載され るＦＹ ４−７−１２、ＦＹ ３−３−１、ＦＹ ３−３−２、ＦＹ ３−５、 ＦＹ ４−７−６、およびＦＹ １−６からなる群より選択される可能性がある 。 抗原（一つもしくは複数）分子を同定するのには、生物学的もしくは化学的技 術（例えば、クローニング技術）を用いてこの抗原の非限定量を産生することが できるか、もしくは別法では、同定された抗原の様々な断片に対応する合成ペプ チドをワクチンを産生するための手段として用いることができる。 従って、本発明の好ましい態様では、ファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）、オ ステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、およびトリコストロンギルス（Ｔｒｉ ｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ）、ならびに関連種から選択される疾患病原体に対 する合成抗原性ペプチドを調製するための方法が提供され、その方法は、 ファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）、オステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉ ａ ）、およびトリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、な らびに関連種から選択される疾患病原体の試料から取得されるｃＤＮＡライブラ リーもしくはゲノムライブラリー；ならびに 対応する抗体プローブ ［この抗体プローブは、ファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）、オステルタギ ア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、およびトリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔ ｒｏｎｇｙｌｕｓ ）種、ならびに関連種から選択される病原体もしくは病原体抽 出物で免疫動物を攻撃誘発させた後の短時間の 内に採取された免疫動物からの生物学的試料を提供することを含む方法により産 生される個別の疾患病原体に対する少なくとも一つの抗体、あるいはその動物か ら取得される対応するモノクローナル抗体、あるいは精製された抗原の注入後に 作製されるポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を含む］ を提供し； そのｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリーから合成ポリペプチド を産生し； その抗体プローブでその合成ポリペプチドを探索し；そして そのことにより検出される合成抗原性ポリペプチドを単離すること、 を含む。 ｃＤＮＡもしくはゲノムのライブラリーを使用することができる。ｃＤＮＡも しくはゲノムのライブラリーを、転写および後続のそのクローンのＤＮＡの発現 が可能であるであろう適切な発現ベクター内に組み込ませることができ、それら は原核生物宿主（例えば、細菌）もしくは真核生物宿主（例えば、哺乳類細胞） のいずれかの中で行われる。ライブラリーをスクリーニングするためのプローブ を、好ましくは （ｉ）既述の要領で同定および精製された抗原のアミノ酸配列に基づく合成オ リゴヌクレオチドプローブ； （ｉｉ）その合成オリゴヌクレオチドプローブから作製されるＰＣＲ産物： （ｉｉｉ）同定された抗原のアミノ酸配列データから取得される合成ペプチド に基づく抗体； （ｉｖ）既述の要領で産生される培養培地から取得される抗体； （ｖ）既述の要領で同定および精製される抗原に対して産生されるモノクロー ナルもしくはポリクローナル抗体；ならびに （ｖｉ）例えばＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ２４１、ペ ージ５４４〜５４６により記載される、抗原に対する特異性を有する組換えもし くは合成モノクローナル抗体もしくはポリペプチド、から選択することができる 。 ｃＤＮＡライブラリーは、オステルタギア キルクムキンクタ（Ｏｓｔｅｒｔ ａｇｉａ ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）の試料から取得し；それに対応する抗体 プローブは３２〜３６ｋＤのダブレット抗原に対して作製されたモノクローナル 抗体であることが好ましい。 更に別の態様では、既述の要領で調製される合成抗原性ポリペプチドが提供さ れる。 その合成抗原性ポリペプチドはクローン３−２および５−２ｂから選択される 可能性があり、それらはアミノ酸配列 を有しており、これについては本明細書中これ以降に記載される。 従って本発明の別の態様では、ファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）、オステル タギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、およびトリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏ ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ）種、ならびに関連種から選択される疾患病原体に対する 仮想的感染防御抗原が提供され、それらは、 ファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）、オステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉ ａ ）、およびトリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）種、 ならびに関連種から選択される疾患病原体の試料；ならびに 既述の方法により産生される、オステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）お よびトリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）種、ならびに 関連種から選択される疾患病原体に対する少なくとも一つの抗体を含む抗体プロ ーブ； を提供し； 対応する抗体プローブでその疾患病原体試料を探索し；そして 検出される仮想的抗原を単離すること、 を含む方法により産生される。 この仮想的抗原は、これ以降に論議されるワクチンおよび／または診断用抗原 として機能する可能性がある。 本発明の他の態様では、ファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）、オステルタギア （Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、およびトリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒ ｏｎｇｙｌｕｓ ）種、ならびに関連種から選択される疾患病原体に対する感染防 御抗原もしくはその断片に対するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体が 提供される。 他の態様では、ファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）種および関連種に対する感 染防御抗原（これは本明細書中、これ以前に記載される）もしくはその断片に対 するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体が提供される。 他の態様では本発明は、ファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）、オステ ルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、およびトリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈ ｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ）種、ならびに関連種から選択される疾患病原体により 動物において引き起こされる感染を予防するための方法が提供され、その方法は 、既述の少なくとも一つの感染防御抗原の有効量を動物に投与することを含む。 感染防御抗原は、本明細書に記載されるファスキオラ ヘパティカ（Ｆａｓｃ ｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）もしくはトリコストロンギルスコルブリホルミス （Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）から取得 される抗原であることが好ましい。 本発明の更に別の態様では、ファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）、オステルタ ギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、およびトリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓ ｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ）種、ならびに関連種により動物において引き起こされる感 染の治療のための方法が提供され、その方法は、既述の感染防御抗原に対するモ ノクローナルもしくはポリクローナル抗体の治療学的有効量を動物に投与するこ とを含む。 本発明は更に、既述のファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）、オステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ ）、およびトリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏ ｎｇｙｌｕｓ ）種、ならびに関連種から選択される疾患病原体に対する少なくと も一つの抗原の予防学的有効量を含むワクチンすなわち獣医学用組成物を提供す る。このワクチン組成物は多数の疾患病原体に対する複数の感染防御抗原を含む ことが好ましい。 本発明は更に、既述の感染防御抗原に対する少なくとも一つのモノクローナル もしくはポリクローナル抗体の治療学的有効量を含むワクチンすなわち獣医学用 組成物を提供する。このワクチン組成物は複数のモノ クローナルもしくはポリクローナル抗体を含むことが好ましい。 好ましい形態では、複数の防御用物質を単回の治療を介して動物に提供するこ とができる。 本発明に従うワクチンすなわち獣医学用組成物は経口的に投与することができ るか、あるいは非経口的（例えば、筋肉内的、皮下的、皮内的、もしくは静脈内 的注射）に投与することができる。 必要とされる量は活性成分の抗原性によって変化するであろうし、そして現存 するワクチンを代表する免疫応答を誘導するのに十分な量のみが必要とされるで あろう。 反応性の実験により、必要とされる量が容易に確認されるであろう。ワクチン すなわち獣医学用組成物の典型的初期用量は、おおよそ０．００１〜１ｍｇの活 性成分／ｋｇ体重である可能性がある。この用量率は増加する可能性があるか、 あるいは複式用量を必要に応じて使用して所望されるレベルの防御を提供するこ とができる。 本発明に従うワクチンすなわち獣医学用組成物は更に、その組成物の獣医学的 に許容される担体、希釈剤、もしくは賦形剤を含むことができる。活性成分は担 体中に懸濁もしくは溶解させることができることが好ましい。担体は、動物にと って非毒性でありかつ活性成分に適合性であるいずれかの固体もしくは溶媒であ る可能性がある。適切な担体には、液体担体（例えば、通常の食塩水、および生 理学的濃度かもしくはそれに近い濃度の他の非毒性の塩）、ならびに固形担体（ 例えば、タルクもしくはスクロース）がある。例えばフロインド（Ｆｒｅｕｎｄ ）のアジュバント（完全もしくは不完全のもの）のようなアジュバント類、ある いは例えばサイトカイン類のような免疫調節性物質を添加して、所望され る場合には抗原の免疫原性を亢進させることができる。気管支管を介する投与の ために使用する際には、そのワクチンはエアロゾルの形態で存在することが適す る。 本発明に従うワクチンすなわち獣医学用組成物はＴａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎ ａｔｕｒｅ ３５６：１５２、１９９２に記載される要領で、生きたベクター（ 例えば、ワクシニアウイルス、サルモネラ）内に取り込ませるか、あるいはＤＮ ＡもしくはＲＮＡとして投与することができる。 本発明の更に別の態様では、既述の要領で同定および精製された疾患病原体に 対する診断用抗原もしくはその断片を含む診断用アッセイキットが提供される。 この診断用キットを利用して、Ｏ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍ ｃｉｎｃｔａ ）、Ｆ． ヘパティカ（Ｆ． ｈｅｐａｔｉｃａ）、Ｔ． コルブ リホルミス（Ｔ． ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）もしくは関連寄生虫から選択 される疾患病原体により引き起こされる動物の感染症を検出することができる。 この診断用アッセイキットは診断用アッセイと組み合わせて利用される可能性 がある。この診断用アッセイはウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット技術を含 む可能性がある。診断用アッセイは診断用免疫アッセイである可能性がある。こ の免疫アッセイは、免疫沈降アッセイ、放射免疫アッセイ、酵素抗体免疫アッセ イ、免疫蛍光アッセイ、もしくは化学ルミネセントアッセイである可能性がある 。 本発明はここで、以下に示される実施例を参照にすると一層記載が完全になる であろう。しかしながら以下の記述は単に説明であるに過ぎず、 かついずれの状況においても既述の本発明の一般性についての制約としてとらえ られるべきではないことが理解されるべきである。図面について： 図１ａ ：オステルタギア キルクムキンクタ（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａｃｉｒｃｕ ｍｃｉｎｃｔａ ） 実験的な免疫スッフォルク（Ｓｕｆｆｏｌｋ）仔ヒツジからのリンパ（１／１ ０００希釈物）で探索されるオステルタギア キルクムキンクタ（Ｏｓｔｅｒｔ ａｇｉａ ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）のＬ３幼虫抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ １２．５％ゲル）およびウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット分析。見かけ上 の分子量２６〜３６および９５〜１０５ｋＤの２群の免疫反応性種が検出された 。更に同一領域を、攻撃誘発させたヒツジからの第四胃のリンパ節の培養上清を 用いて同定した。図１ｂ〜１ｅ ：プラーク免疫アッセイによる抗−ダブレットｍＡｂもしくはヒツ ジ血清とのクローンの反応 各クローンのプレートから取り出したＩＰＴＧフィルターを数枚の細片に切り 分け、そして抗体と反応させた。検出は、アルカリ性ホスファターゼと複合体形 成させてある抗マウスＩｇＭ＋ＩｇＧもしくは抗−ヒツジＩｇＧで実施した。フ ィルターを、図１ｂでは抗−ダブレットｍＡｂと、図１ｃでは陰性対照であるＩ ｇＭ ｍＡｂと、図１ｄでは精製されたダブレット抗原に対して作製されたヒツ ジ血清と、図１ｅでは陰性対照のヒツジ血清と反応させた。示されるクローンは 、７−１、７−２、５−２ｂ（２つの単離物）、３−２、８−２（２つの異なる 希釈物）、もしくは陰性対照プラークである。図１ｆ ：クローンから親和性精製された抗体を用いて探索するＯ．キル クムキンクタ（Ｏ．ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）Ｌ３抽出物のウエスタン（Ｗｅ ｓｔｅｒｎ）ブロット Ｌ３幼虫からの水性抽出物の試料を１２．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル上での電気泳動にかけ、これをその後に電気ブロットにかけた。このウエス タン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロットを、プラーク免疫アッセイから溶出された親和 性精製化抗体、ｍＡｂ、ヒツジ血清、あるいは反復感染させてある免疫ヒツジか らの第四胃リンパと反応させ、そして反応物をアルカリ性ホスファターゼ抗マウ スＩｇＭ＋ＩｇＧもしくは抗−ヒツジＩｇＧで検出した。レーン１：陰性対照ｍ Ａｂ；２：抗−ダブレットｍＡｂ（溶出されてきた親和性精製化抗体）；３：ク ローン７−１；４：クローン７−２；５および６：クローン５−２ｂ（２つの単 離物）；７：クローン３−２；８：クローン８−２；９：陰性対照プラーク；１ ０：ヒツジ抗−ダブレット血清；１１：陰性対照血清；１２：免疫ヒツジからの リンパ；Ｍ：予めラベル化してある分子量マーカー（ＢｉｏＲａｄ社）。ダブレ ット抗原の位置に矢印を施してある。図１ｇ ：クローン３−２および５−２ｂのヌクレオチド配列および予想アミノ酸 配列 アミノ酸を３文字コードで示す。図１ｈ ：Ｏ．ボルブルス（Ｏ．ｖｏｌｖｕｌｕｓ）およびＣ．エレガンス（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）からのＧＢＰ（複数）とのＯ．キルクムキンクタ（Ｏ．ｃｉｒ ｃｕｍｃｉｎｃｔａ）クローン ３−２および５−２ｂの予想アミノ酸配列の整 列図 ＧＢＰ（複数）についてのアミノ酸配列をＡＮＧＩＳを用いるデータベースか ら抽出した（Ｏ．ボルブルス（Ｏ．ｖｏｌｖｕｌｕｓ）はＧｅ ｎＰｅｐデータベース（アクセス番号第Ｕ０４０４６＿１号から；Ｃ． エレガ ンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）はＰＩＲデータベース（アクセス番号第Ｓ２７７９ ８号）から）。アミノ酸については一文字コードが示される。図１ｉ ：ダブレット抗原がレクチン様ＧＢＰであることの証明 Ｏ．キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）Ｌ３幼虫を緩衝液 で抽出し、そして試料をアシアロフェッツイン−アフィゲル（Ａｆｆｉｇｅｌ） １５カラムに適用させた。洗浄後、結合した蛋白質を１００ｍＭのラクトースで 抽出した。レーン：Ｍ：分子量マーカー；１：Ｌ３抽出物；２：カラムからの最 終素通り分画；３〜７：ラクトース溶出分画。ダブレット抗原の位置に矢印を施 してある（１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシーブルー染色化）。図１ｊおよび１ｋ ：大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）中の組換え抗原の発現 図１ｊおよび１ｋ。ＣＴＡＢ−可溶化封入体を１３％ゲル上で電気泳動にかけ 、それをその後に電気ブロットにかけた。このウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブ ロットの半分を抗−ダブレットｍＡｂと反応させ、そしてアルカリ性ホスファタ ーゼと複合体形成させてある抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（図１ｊ）で検出し、そし て他の半分をヒツジ抗血清と反応させてダブレット抗体を精製し、そしてアルカ リ性ホスファターゼと複合体形成させてある抗−ヒツジＩｇＧで検出した（図１ ｋ）。レーン１：クローン７−１；２：クローン７−２；３：クローン３−２； ４：クローン８−２；５：クローン５−２ｂ；６：ｐＭＯＳＥＬＯＸ対照。図２ａ〜２ｃ ： −オステルタギア キルクムキンクタ（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ） ３回の個別の試験におけるＬ３幼虫での感染後のワクチン接種化ヒツジ（●― ●）および対照ヒツジ（○―○）の排泄物当たりの平均卵数（ｅｐｇ）。図２ｄ ：Ｈ． コントルトゥス（Ｈ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）での異種感染後の 第３回目のオステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）ワクチン接種試験に用いた 対照ヒツジおよびワクチン接種化ヒツジの平均排泄物卵数。図３ ：トリコストロンギルス コルブリホルミス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙ ｌｕｓ ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ） Ｔ． コルブリホルミス（Ｔ． ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）感染化ヒツジ のＭＬＮ上清で探索した３種のＬ３線虫幼虫抗原のウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ ）ブロット。 レーン１． Ｂｉｏ−Ｒａｄから供与された分子量マーカー。 レーン２． Ｏ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）Ｌ ３抗原。 レーン３． Ｈ． コントルトゥス（Ｈ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）Ｌ３抗原。 レーン４． Ｔ． コルブリホルミス（Ｔ． ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ） Ｌ３抗原。 括弧内＝トリコストロンギルス コルブリホルミス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎ ｇｙｌｕｓ ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）の抗原 図４：ファスキオラ ヘパティカ（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ） 予め感染および処置を施してあったラットの２００Ｍｃでの経口攻撃 誘発後７日目の肝リンパ節（１）、腸間膜リンパ節（２）、および脾臓（３）か らの上清で探索したＮＥＪ吸虫抗原のウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット。 レーン４： Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のプレステインド（Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ）分 子量マーカー。 矢印＝ＭＬＮ上清によってのみ認識される＞２００ｋＤ抗原の位置。図５ ：ファスキオラ ヘパティカ（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ） ２度免疫化させ、かつ治療を施し、４００匹のＭｃで攻撃誘発させたラットの 肝リンパ節（５）、腸間膜リンパ節（６）、および脾臓（７）からの上清で探索 したＮＥＪ抗原のウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット。 レーン４： Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のプレステインド（Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ）分 子量マーカー。 矢印＝ＭＬＮ上清によってのみ認識される抗原の位置。 図６ａ〜６ｄ： −ファスキオラ ヘパティカ（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔ ｉｃａ） ヒツジＭＨＣクラスＩＩ（陰性対照）に対するｍＡｂ ３８．２７での（図６ ａ）ＮＥＪ吸虫の間接的免疫パーオキシダーゼ染色（×４０）。類似のネガティ ブ染色を複数のｍｃＡｂ ＦＹ３−５およびＦＹ１−６、（図６ｂ）ｍｃＡｂ ＦＹ３−３−２（×４０）；（図６ｃ）ｍｃＡｂ ＦＹ３−３−２（×１００） 、および（図６ｄ）ｍｃＡｂ ＦＹ３−３−１（×１００）を用いて観察した。 （図６ｄ）のより限定的なまばらな染色と比較される（図６ｂ）および（図６ｃ ）における強い網状タ イプの染色に注目せよ。矢印はＮＥＪ吸虫の吸盤口を指す。 実施例１ オステルタギア キルクムキンクタ （ＯＳＴＥＲＴＡＧＩＡ ＣＩＲＣＵＭＣＩＮＣＴＡ）寄生虫および実験動物 Ｏ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）の第三段階幼虫 （Ｌ３）をその寄生虫で実験的に感染させてあるドナーヒツジの排泄物培養物か ら回収した。免疫動物はＯ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃ ｔａ ）の幼虫でヒツジを反復感染させることにより取得し、そしてその後に排泄 物の卵産出をモニターした。攻撃誘発させた用量が排泄物中に卵を殆ど産生させ ないか、あるいは全く産生させない場合には、その動物ｇａ免疫されたものとし た。一旦免疫されたらそのヒツジをイベルメクチン（ＩＶＥＲＭＥＣＴＩＮ）に 浸し、そして少なくとも４週間の期間放置し、その後に６０，０００匹のＬ３幼 虫で攻撃誘発させ、そしてその後に攻撃誘発後５〜８日目に屠殺した。培養上清の調製 第四胃リンパ節（ＡＬＮ）を取り出し、そして細胞懸濁液を先に引用されるオ ーストラリア特許第６４０３６４号に記載される要領で調製した。１０〜１５ｍ ｌの大量培養物を培養用フラスコ（Ｍｉｌｅｓ社）中で、ＤＭＥ＋１０％のウシ 胎仔血清中１．０×１０⁷細胞／ｍｌの濃度に設定した。予備実験により、この 培養上清中の大半の抗体はインビボで刺激されたリンパ節内に存在する抗体産生 性細胞により産生されること、およびこの抗体産生はポークウィドマイトジェン （ＰＷＭ）での刺激化によっては更に増大することがないことが証明された。従 ってＰＷＭ は別の培養物には添加せず、そして培養上清を、３７℃下、５％ＣＯ₂雰囲気中 での細胞の５日間インキュベーション後に回収し、その後に使用するまで−２０ ℃に保存した。第四胃リンパ節のカニューレ挿入およびリンパの回収 ヒツジ（スッフォルク（Ｓｕｆｆｏｌｋ）種の仔ヒツジ）を既述の要領で免疫 化させ、６０，０００匹のＬ３幼虫で攻撃誘発させ、そして通常の第四胃リンパ 管内カニューレ挿入を攻撃誘発後４日目に実施した。リンパをカニューレ挿入後 数日間回収し、そして細胞非含有性リンパを使用前に−２０℃に保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット用の抗原の調製 Ｏ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）の第三段階幼虫 を、おおよそ０．５％のＮａＨＯＣｌ中、ＣＯ₂で充満させた雰囲気中、３７℃ 下で２０分間脱鞘させて第二段階の鞘を除去した。その後にこの幼虫をリン酸緩 衝化食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中で１０分間、３，０００ｇで反復洗浄および 遠心分離させた。６度目の洗浄後にこれらを、２００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよ び０．２μｇ／ｍｌのストレプトマイシンの存在下の５００ｍｌのＤＥＭ培地（ ｐＨ６．８）に移し、そして３９℃下、２０％ＣＯ₂を補充して空気中で３日間 培養した。その後にこの培養培地を３，０００ｇで１５分間、２０℃で遠心分離 し、そしてインビトロで変体させたＬ４幼虫をペレット化させ、これを−７０℃ に保存した。 抗原は、脱鞘させたＬ３、インビトロで変体させたＬ４、インビボでのＬ４、 および成虫段階から、３度の凍結−解凍、次いでポリトロンホ モジナイザー（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ ＧｍｂＨ社、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ） を用いての均一化、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ Ｎ ａＣｌ中での一晩の抽出、および５０，０００×ｇでの３０分間の遠心により抽 出した。可溶化させた抗原を含む上清を−７０℃に保存した。 抽出された抗原を非還元性条件下で１２．５％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳ−ポリアク リルアミドゲル上で泳動させ、そしてＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ、Ｍｉｌ ｌｉｐｏｒｅ社）もしくはニトロセルロース上でのウエスタンブロットを行った 。ワクチン接種試験用の抗原の調製 Ｏ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）の第三段階幼虫 をＣＯ₂を含ませた雰囲気下で２〜３時間、３７℃で脱鞘させて第二段階の鞘を 除去した。脱鞘させたＬ３を３度凍結−解凍し、次いで磨りガラスホモジナイザ ーを用いて均一化させ、その後に２％（ｗ／ｖ）の臭化ヘキサデシルトリメチル −アンモニウム（ＣＴＡＢ、Ｓｉｇｍａ社）を含む１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中で一晩抽出を行った。粒子状物質を３０分間、３ ００ｇの遠心分離により除去した。この上清を更に１５，０００×ｇでの３０分 間の遠心分離にかけ、そして可溶性抽出物を−２０℃に保存した。 抽出した抗原を非還元性条件下（沸騰させずに）で、１０％のＣＴＡＢ−アク リルアミドゲル上で泳動させた。ゲルの適切な領域をそのゲルのいずれかの端で ２枚の細片のウエスタンブロットを行うことにより同定し、そしてそれらの細片 を陽性リンパと反応させた。免疫反応性領域に相当するゲル領域を切り出し、す りつぶし、そして２％ ＣＴＡＢ溶 液中で一晩インキュベートして受動的に抗原を溶出させた。ＣＴＡＢを２Ｍ尿素 ｐＨ１０中、ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）樹脂と共に５分間インキュベーショ ンすることにより除去し、その後にＰＢＳに対して一晩透析して尿素を除去した 。この抗原をセントリプレップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ 社）内で濃縮し、その蛋白質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて 決定し、そしてこの抗原を用いてヒツジを免疫化した。この抗原調製物は、ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させた際に２６〜３６ｋＤの免疫反応性領域を含むこ とが示された。抗原の同定 ウエスタンブロットを行った抗原調製物を、感染させたヒツジからのＡＬＮか らのインビトロ培養上清およびカニューレ挿入を施した第四胃リンパ節からのリ ンパを用いて探索した。その培養上清およびリンパの両方共が分子量２６〜３６ および９５〜１０５ｋＤの２領域を強く示した（図１を参照せよ）。 レクチン複合体と共に行ったブロット化抗原のインキュベーションにより、そ れらの抗原は幾つかのレクチンに結合可能であることが明らかにされた。このこ とは、それらの抗原の内の幾つかがグリコシル化されていることを示す。ウエスタンブロットにより同定される２６〜３６ｋＤ抗原の蛋白質配列決定 この領域内に含まれる抗原のＮ−末端アミノ酸配列は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ るその蛋白質の分離、それに続くＣＡＰＳ緩衝液を用いるＰｒｏＢｌｏｔｔ配列 決定用膜への電気泳動的移動の後に決定した。移動さ せた蛋白質はクーマシーブルーでの染色により膜上での位置を決定し、そしてそ れらを切り出した。配列は、ブロットカートリッジがはめ込んであるＡｐｐｌｉ ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の４７６Ａ蛋白質配列決定機内で決定した。更に 別の中間部配列データは、ＣＴＡＢ精製した抗原を臭化シアンで消化させ、それ らの断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰｒｏＢｌｏｔ上へのブロッティン グを行い、そして先の要領で配列決定を行うことにより作製した。この蛋白質配 列決定の結果を以下に総括してある。２６〜３６ｋＤ領域の上部の２本のバンド からはいずれの配列も取得できず、そして恐らくＮ−末端が遮蔽されている可能 性があった。上部の３２〜３６ｋＤ領域のこれら２本のバンドは更に「ダブレッ ト」として引用され、それはこの領域に対して作製されたモノクローナル抗体は 両バンドを認識するためであり（図１ｆを参照せよ）、このことはそれらのバン ドが類似分子であることを意味する。 ２６〜３６ｋＤ領域の下部バンドから取得された配列を、Ａｕｓｔｒａｌｉａ ｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉ ｃｅで利用可能な配列データベースライブラリーに対して、プログラムＦＡＳＴ Ａを使用してスクリーニングした。この結果を以下に示す。このデータバンク内 の配列に対する高度の相同性により２つの分子が同定された。これらの相同性配 列はトロポミオシンおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼであった。 Ｏ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）の配列で、 （Ａ）トロポミオシンに相同であるものは、 であり、 （Ｂ）グルタチオンＳ−トランスフェラーゼに相同であるものは、 である。 これらのダブレットバンドを含む領域からの配列を取得するために、均一化さ せた第三段階のオステルタギア キルクムキンクタ（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ ｃ ｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ ）の幼虫の水性抽出物を調製し、そしてこの抽出物中の 蛋白質を還元性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ダブレットバンド をクーマシーブルーで染色したゲルから切り出し、そしてその後にそれらの蛋白 質を切り出したゲルから電気溶出によって抽出した。単離された蛋白質をトリプ シン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）で消化し、そしてそのようにして作製されたペプチドを 高速逆相液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分離した。精製されたペプ チドは、エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解によりＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｍｓ社の４７６Ａ蛋白質配列決定機内で配列決定した。以下のペプチド配列が決 定され、それらは であった。ダブレット抗原をコードするｃＤＮＡのクローニング ライブラリーの調製 ＲＮＡは、液体窒素中で予め瞬間凍結させてあった新しく回収したＬ ３幼虫から抽出した（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ＆ Ｓａｃｃｈｉ、１９８７、 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６２、１５６〜１５９）。メッセンジャーＲＮ Ａ（ｍＲＮＡ）をｍＡＰ紙上でのオリゴｄＴ親和性クロマトグラフィー（Ａｍｅ ｒｓｈａｍ Ａｕｓｔｒａｌｉａ社）により単離した。二本鎖の相補的ＤＮＡ（ ｓＤＮＡ）は、オリゴｄＴもしくはランダムプライマーのいずれかで２μｇのｍ ＲＮＡをｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｌｕｓキット（Ａｍ ｅｒｓｈａｍ Ａｕｓｔｒａｌｉａ社）を用いてプライミングすることにより調 製した。オリゴｄＴおよびランダムープライマーでのプライミングにより取得さ れたｃＤＮＡを合わせ、そしてＥｃｏ ＲＩアダプターを添加し（ｃＤＮＡ高速 アダプター連結用モジュール、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ａｕｓｔｒａｌｉａ社）、そ してＥｃｏ ＲＩに連結させたアダプター接続化ｃＤＮＡを切断し、バクテリオ ファージ発現ベクターλＭＯＳＥＬＯＸアーム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ａｕｓｔｒ ａｌｉａ社）を脱リン酸化させ、そしてλ−ＤＮＡインビトロパッケージング用 モジュール（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ａｕｓｔｒａｌｉａ社）を用いてパッケージン グを行った。１．４×１０⁶プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍＬの初期ライブラ リーが取得され、この内の＞９０％が組換え体であった。このライブラリーを、 使用前に大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＥＲ １６４７細胞内で増幅させた。ライブラリーのスクリーニング 増幅させたｃＤＮＡライブラリーの内の５×１０⁵ｐｆｕを大腸菌（Ｅ． ｃ ｏｌｉ ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ細胞上で５×１０⁴ｐｆｕ／プレートで プレート培養した。針で刺した程のサイズのプラークが出現した際に（３７℃で ４〜６時間後）このプレートに、予め１０ ｍＭのイソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）で飽和させてあったニ トロセルロースフィルターを重層し、そして更に６時間、３７℃でインキュベー トした。その後にプレートを一晩４℃に保存した。フィルターをこのプレートか ら取り出し、そしてＴＮＴ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）内で洗浄し、ＢＬＯＴＴＯ（ ＴＮＴ中の５％ ｗ／ｖ の低脂肪乳粉末）中での遮断を行い、そして室温で２ 時間、予めダブレット抗原に対して作製してあったＩｇＭマウスモノクローナル 抗体（ｍＡｂ）と共にインキュベートした（未希釈の培養上清）。ＴＮＴ内での 洗浄後にはフィルターを、ＢＬＯＴＴＯ中で１：５，０００希釈でアルカリ性ホ スファターゼと複合体形成させてあるウサギ抗−マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｊａｃ ｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）と共に室温で１時間インキュベー トした。更にＴＮＴ中で洗浄した後、フィルターを０．１６５ｍｇ／ｍＬの５− ブロモ−３−クロロ−４−インドリルリン酸エステル（ＢＣＩＰ）および０．３ ３ｍｇ／ｍＬのニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）で、アルカリ性ホスファ ターゼ緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ 、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）中で発色させた。１５の仮想的陽性プラーク（この内の 幾つかは非常に微弱であった）を取り出し、そして既述の要領でそのモノクロー ナル抗体での再スクリーニングを行い、この後には５つのプラークが陽性として 残った。これらのプラークを三度目のスクリーニングにかけ、そしてＥＲ１６４ ７細胞上でのプレート培養により増幅化保存物を調製した。クローンの分析 ダブレット抗原についてのクローンの特異性を決定するためにプラーク免疫ア ッセイを実施した。プラーク精製されたクローンをＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ Ｅ大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞上でプレート培養し、そして既述の要領でＩＰ ＴＧフィルターを用いる誘導化を施した。その後にこれらのフィルターを、抗− ダブレットｍＡｂ、無関係のＩｇＭマウスｍＡｂ、および精製されたダブレット 抗原に対してヒツジ内で作製された抗血清、あるいは陰性対照のヒツジ血清と反 応させた（両ヒツジ血清共ＢＬＯＴＴＯ中の１：５０希釈で用い、そして二次抗 体は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社からの１：５，０００ でのアルカリ性ホスファターゼと複合体形成させてあるウサギ抗−ヒツジＩｇＧ であった）。陽性反応を既述の要領で検出した。全クローンが抗−ダブレットｍ Ａｂに関して陽性であり、そして無関係のｍＡｂおよび陰性対照のヒツジ血清に 関して陰性であった。３−２および５−２ｂと表示される２つのクローンがヒツ ジ内で作製された抗−ダブレット血清に関して強い陽性を示した（図１ｂ〜１ｅ ）。 クローンもしくはλＭＯＳＥＬＯＸ対照プラークを８０ｍＭのプレート当たり ２，０００プラークでプレート培養して融合溶菌を達成した。針で刺したような プラークが出現したら直ちにＩＰＴＧフィルターを添加し、そしてインキュベー ションを一晩継続した。フィルターをＴＮＴで根気よく洗浄し、ＢＬＯＴＴＯ中 で１時間の遮断を行い、そして室温で４時間、抗−ダブレットヒツジ抗血清（Ｂ ＬＯＴＴＯ中１：５０）と共にインキュベートした。（使用前には、野生型λＭ ＯＳＥＬＯＸプラークのプレートからのフィルターでのインキュベーションによ りこの血清から抗−大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）抗体を枯渇させた）。その後にフ ィ ルターをＴＮＴ内で５度、ホウ酸洗浄用緩衝液（０．１Ｍのホウ酸、０．５Ｍの ＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、ｐＨ８）中で１度、次いでＰＢＳ（ １４０ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、０．００ １５ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄）中で１度洗浄した。結合し、親和性精製された抗体は各 クローンに特異的であり、これらを０．１Ｍのグリシン、０．１５ＭのＮａＣｌ 、ｐＨ２．６内で、各フィルターについて５ｍＬで１分間溶出し、そして３００ μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含む試験管内に添加することによ り即座に中和させた。これらの抗体をＴＮＴに対して１〜２時間、４℃で透析し 、低脂肪乳粉末を５％ ｗ／ｖ になるまで添加し、そして−２０℃で保存した 。Ｌ３幼虫の水性抽出物を１２．５％の変性性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル 上で電気泳動し、そして蛋白質を電気ブロッティングによりＩｍｍｏｂｉｌｏｎ 膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に移した。この膜をＴＮＴ中で洗浄し、ＢＬＯＴＴ Ｏ中で遮断させ、そして細片に切り分けた。この細片をクローンから親和性精製 された抗体と、抗−ダブレットｍＡｂもしくは陰性対照ｍＡｂと、あるいはヒツ ジ抗−ダブレット抗血清もしくは陰性対照ヒツジ血清と共に４℃で一晩インキュ ベートした。検出は、アルカリ性ホスファアターゼと複合体形成させてある抗− 種抗体を用いて、およびそれに次いでＢＣＩＰおよびＮＢＴでの発色を用いて実 施した。ヒツジ抗−ダブレット抗血清に関して陽性を示す２つのクローン、３− ２および５−２ｂについて親和性精製された抗体は、ウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒ ｎ）ブロット上ではＯ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｕｔ ａ ）の幼虫からのダブレットバンドを特異的に認識した（図１ｆ）。 これらのクローンを、ベクターの製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ａｕｓｔｒａ ｌｉａ社）により推奨される要領でカルベニシリンの存在下で大腸菌（Ｅ． ｃ ｏｌｉ ）ＢＭ２５．８細胞上でプレート培養することによりプラスミド形態（ｐ ＭＯＳＥＬＯＸ中）内に挿入して保護した。プラスミドＤＮＡの調製は、「Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 第二版」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．＆ Ｍａｎｉａ ｔｉｓ，Ｔ．、１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載の要領でアルカリ性溶菌およびＣｓＣｌ濃度勾 配分離法により実施した。プラスミドＤＮＡの試料をＥｃｏ ＲＩで消化し、そ して５０μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含むＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭのＴｒｉｓ −酢酸エステル、ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ）中１％のアガロースゲル上で分離 した。クローン３−２は約１０００、４００、および２００塩基対の３つのＥｃ ｏ ＲＩ断片を含む一方で、クローン５−２ｂは１０００および４００塩基対の ２断片を含んでいた。ＤＮＡ配列決定 ＤＮＡ配列決定は、セクアナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）キットを用いて、製 造業者の説明書（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ ｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）に従ってジデオキシ方法により実施した。配列決定用の 反応はα−³⁵Ｓ−ｄＡＴＰの存在下で実施し、そしてゲルをオートラジオグラフ ィーにかけた。最初にその挿入断片をフランクするベクターに基づくプライマー を用いた（Ｔ７の遺伝子１０およびＳＰ６プライマー）。それらの挿入断片の全 長の配列を決定するための更に別のプライマーを、取得された配列に基づいて設 計した。ク ローン３−２および５−２ｂは相同のＤＮＡ配列を含むが、例外は、クローン３ −２がかなり長い３’非翻訳領域を有することで、その領域にはｍＲＮＡのポリ （Ａ）テイルが含まれる。ＤＮＡ配列および予想アミノ酸配列を図１ｇに示す。 この予想アミノ酸配列を用いて複合型蛋白質データベースを検索するが、それに はＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．、Ｇｉｓｈ，Ｗ．、Ｍｉ ｌｌｅｒ，Ｗ．、Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ． ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、１９９ ０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５、４０３−４１０）を、インターフェース としてＡＮＧＩＳを用いるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ上で用いた。この配列は、カエ ノルハブディティス エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅａｎ ｓ ）およびオンコケルカ ボルブルス（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕ ｓ ）からの３２ｋＤのレクチン様β−ガラクトシド結合性蛋白質（ＧＢＰ）とか なり相同性が高いことが見いだされた。Ｏ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒ ｃｕｍｃｉｎｃｔａ ）配列はＣ． エレガンス（Ｃ． ｅｌｅａｎｓ）配列と ６９％の相同性を、かつＯ． ボルブルス（Ｏ． ｖｏｌｖｕｌｕｓ）配列と７ ８％の相同性を有していた。アミノ酸配列の整列図を図１ｈに示す。これらの相 同配列との相似性によると両クローンは開始用ＡＴＧを含む。ダブレットがレクチン様β−ガラクトシド結合性蛋白質であることの証明 ダブレット抗原とＣ． エレガンス（Ｃ． ｅｌｅａｎｓ）の３２ｋ ＧＢ Ｐが共通に有する特性には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのサイズ、グリコシル化の欠 損、および遮蔽されるＮ−末端がある（Ｈｉｒａｂａ ｙａｓｈｉ，Ｊ．、Ｓａｔｏｈ，Ｍ，、およびＫａｓａｉ，Ｋ．、１９９２、Ｊ ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６７、１５４８５−１５４９０、を参照せよ）。Ｃ ． エレガンス（Ｃ． ｅｌｅａｎｓ）のＧＢＰの特色は、アシアロフェッツ インカラムに結合させることにより親和性精製可能であるということである（Ｈ ｉｒａｂａｙａｓｈｉ，Ｊ．、Ｓａｔｏｈ，Ｍ，、Ｏｈｙａｍａ，Ｙ．、＆ Ｋ ａｓａｉ，Ｋ．、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｔｏｋｙｏ １１１、５５３ −５５５）。 Ｏ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）のＬ３幼虫を水 性緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈ Ｃｌ、ｐＨ８．０）中で抽出し、そしてその抽出物をアシアロフェッツイン−ア フィゲル（Ａｆｉｇｅｌ）１５カラムに適用させた。結合した蛋白質を１００ｍ Ｍのラクトースを含む先の緩衝液で溶出させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は 、そのダブレットがアシアロフェッツインカラムに結合することを明らかにした （図１ｉ）。このことは、そのダブレットが真の意味でレクチン様β−ガラクト シド結合性蛋白質であることを証明している。このダブレットの両バンド共がそ の糖カラムに結合するため、それらは両方ともレクチン様ＧＢＰである。このＧ ＢＰがなぜＯ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）におい ては２本のバンドとしての見かけを示すかは、Ｃ． エレガンス（Ｃ． ｅｌ ｅａｎｓ ）においてはなぜそれが単一バンドのみであるかということと同様に未 知のことがらである。恐らくＯ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉ ｎｃｔａ ）の蛋白質はいくらかの度合いの翻訳前開裂を受けるのであろう。 線虫におけるこれらＧＢＰの機能は知られてはいないが、Ｃ． エレ ガンス（Ｃ． ｅｌｅａｎｓ）についてはそれらが形態形成（例えば、外被形 成）の調節に関与すると仮定されている。組換え抗原の発現 クローンもしくはｐＭＯＳＥＬＯＸ対照からのプラスミドＤＮＡを大腸菌（Ｅ ． ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ細胞内に、Ｄ．Ｈａｎａｈａｎ（ 「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」内、 第１巻、１９８５（ｅｄ． Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ）、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏ ｘｆｏｒｄ、ｐ１１５）の簡便な形質転換方法を用いて形質転換させた。ＢＭ２ ５．８からのプラスミドをこの株に移すことが必須であり、それはこの組換え抗 原はＴ７プロモーターの調節下で発現され、かつＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ 細胞がｌａｃプロモーターの調節下にＴ７ポリメラーゼをコードする遺伝子を保 持するためである。コロニーを拾いあげ、そして３７℃で一晩増殖させた。１０ ｍＬの培養物にその一晩培養物からの１：１００希釈物を接種し、そして５時間 増殖させた。組換え蛋白質合成は、０．１ｍＭになるまでのＩＰＴＧの添加によ り誘導させ、そしてインキュベーションを一晩継続させた。大腸菌（Ｅ． ｃｏ ｌｉ ）細胞ペレットを、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ中に 再懸濁させ、そして超音波処理により破壊した。封入体を含む不溶性物質をペレ ット化させ、そして超音波処理により１％のＣＴＡＢ中に再懸濁させた。試料を ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロットにより分析した （図１ｊおよび１ｋ）。クローン３−２および５−２ｂは融合蛋白質を産生し、 これらは抗−ダブレットｍＡｂもしくはダブレット抗原に対するヒツジ抗血清で 探索するウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロットでは 陽性を示した。それとは対照的に、クローン７−１、７−２、および８−２によ り産生される融合蛋白質はダブレットｍＡｂに関しては陽性であったが、ヒツジ 抗血清に関しては陽性ではなく、このことにより初期に記載されたプラーク免疫 アッセイの結果が立証された（図１ｂ〜１ｅ）。ｐＭＯＳＥＬＯＸ対照蛋白質は いずれの抗体とも反応しなかった。全組換え融合蛋白質およびｐＭＯＳＥＬＯＸ 対照蛋白質はＣＴＡＢ−可溶化細胞ペレット内に独占的に局在しており、このこ とはそれらが封入体内で発現されることを示している。ワクチン接種試験 ３回のワクチン接種試験を、２６〜３６ｋＤの免疫反応性領域を含む天然のＯ ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）抗原のＣＴＡＢ抽出 物を用いて実施した。 ワクチン接種を施したヒツジを、各免疫化について２〜３週間の間隔を開けて クイル（ｑｕｉｌ）Ａ中の５０〜１００μｇの蛋白質で３回免疫した。対照用ヒ ツジにはクイル（ｑｕｉｌ）Ａのみを投与した。全免疫化は皮内的投与で実施し た。全ヒツジを最終免疫化後２〜３週間目に２０，０００匹のＬ３幼虫で攻撃誘 発させ、そして排泄物中の卵数をモニターした。３回の個別のワクチン接種試験 の結果を図２ａ〜２ｃに示し、そしてこれは、対照と比較する場合のワクチン接 種群の排泄物中卵数の明白な減少を示す。 初回試験は５頭のワクチン接種ヒツジおよび３頭の対照ヒツジからなっていた 。第二試験は１０頭のワクチン接種ヒツジおよび８頭の対照ヒツジを有していた 。第三回目の試験は７頭のワクチン接種ヒツジおよび７頭の対照ヒツジからなっ ていた。種交差反応性 Ｏ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）の２６〜３６ｋ Ｄ抗原でのワクチン接種を施したヒツジからの血清で探索した際に、２６〜３６ ｋＤ領域はやはりＯ． オステルタギイ（Ｏ． ｏｓｔｅｒｔａｇｉｉ）抗原調 製物内にも同定された（非公開）。このことは、類似抗原がやはりこの線虫種お よび恐らく他の線虫種内に存在することを示す。 第三回目のオステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）ワクチン接種試験の最後 にヒツジの末梢血リンパ球増殖アッセイを、未精製の可溶性Ｈ． コントルトゥ ス（Ｈ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）Ｌ３抽出物を用いて実施した。Ｈ． コントル トゥス（Ｈ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）抗原でのかなり有意な（Ｐ＜０．０２）刺 激化が、対照ヒツジ（平均６１２２ｃｍｐ）と比較するとワクチン接種化ヒツジ （平均２４００３ｃｐｍ）に観察され、このことは２６〜３６ｋＤの抗原領域内 での２寄生虫種間の交差反応性を意味する。交差防御を評定するために、第三試 験の全ヒツジをイベルメクチンに浸して残存するオステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔ ａｇｉａ ）蠕虫を除去し、そして１００００匹のＨ． コントルトゥス（Ｈ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ ）幼虫で感染させた。図２ｄに示されるように、排泄物の卵 数は対照群と比較するとワクチン接種群では一貫して低目になっており、このこ とは交差防御が生じていることを示唆する。対照群の排泄物卵数がかなり変動す るため、統計的有意性は日毎の卵数では達成されてはいないが、それら２群の間 の変動には有意な差異が存在していた（Ｆ−検査）。これら２つの結果は、ハエ モンクス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）種とオステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ ）種との間の有 意な異種刺激化および防御が存在すること、ならびに類似の防御用分子が存在し そうであることを示す。９５〜１０５ｋＤ抗原の特性決定 オーストラリア特許第６４０，３６４号に記載されるハエモンクスコントルト ゥス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）の６０〜９０ｋＤの表面抗 原に対して調製された特異的抗血清も、同一の９５〜１０５ｋＤ領域内に存在す るＯ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）Ｌ３幼虫抽出物 と反応した。このことは、この抗原はＨ． コントルトゥス（Ｈ． ｃｏｎｔｏ ｒｔｕｓ ）について記載されたものに類似する抗原であることを示唆するのであ ろう。 実施例２ トリコストロンギルス コルブリフォルミス （ＴＲＩＣＯＳＴＲＯＮＧＹＬＵＳ ＣＯＬＵＢＲＩＦＯＲＭＩＳ）実験の設計 ヒツジをＴ． コルブリフォルミス（Ｔ． ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）で の数度の感染により免疫化し、そして少なくとも４カ月間は未感染のままにさせ た。これらを５０，０００匹のＴ． コルブリフォルミス（Ｔ． ｃｏｌｕｂｒ ｉｆｏｒｍｉｓ ）Ｌ３幼虫で攻撃誘発させ、１０日後に屠殺し、そして第一腸間 膜リンパ節（ＭＬＮ）を取り出した。リンパ節細胞をＯ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）について記載される要領で処理および培養し 、そしてその上清を用いて寄生虫抗原のウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット を探索した。Ｏ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）、Ｈ ．コントルトゥス（Ｈ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）、およびＴ． コルブリ フォルミス（Ｔ． ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）からのＬ３幼虫抗原抽出物は 、以前にＯ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）について 記載される要領で調製した。 抽出された抗原を、１２．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上還元的条件下 で泳動させ、そしてＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社） 上へのウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロットを行った。このウエスタン（Ｗｅ ｓｔｅｒｎ）ブロットをＭＬＮ−上清で探索し、そしてパーオキシダーゼと複合 体形成させてある抗−ヒツジＩｇ（ＤＡＫＯ社）で発色させた。結果および論議 ３２〜３５ｋＤの分子量の間にＴ． コルブリフォルミス（Ｔ． ｃｏｌｕｂ ｒｉｆｏｒｍｉｓ ）抗原抽出物に関して強力な反応が観察され、そしてこれはダ ブレットでできているという見かけを示す（図３）。Ｏ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）およびＨ．コントルトゥス（Ｈ． ｃｏｎｔ ｏｒｔｕｓ ）抗原に関しては反応が全く観察されないか、あるいは微弱であった 。しかしながらＴ． コルブリフォルミス（Ｔ． ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ ）ダブレット抗原は既述のＯ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎ ｃｔａ ）抗原と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上では同一の位置に存在し、そしてそのため 両者は本質的には類似する分子ではあるが、相同の上清抗体プローブにより最も 強力に認識される種特異的エピトープを伴っている可能性が存在する。 実施例３ ファスキオラ ヘパティカ （ＦＡＳＣＩＯＬＡ ＨＥＰＡＴＩＣＡ） 我々は、オーストラリア特許第６４０３６４号に記載される要領で取得された抗 体プローブを用いるウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロットの技術を用いてＦ． ヘパティカ（Ｆ． ｈｅｐａｔｉｃａ）の仮想的感染防御抗原を同定した。類 似抗原が他のファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）種（例えば、ファスキオラ ギ ガンティカ（Ｆ． ｇｉｇａｎｔｉｃａ）ならびに他の吸虫類寄生虫（例えば、 スキストソーマ エスピーピー（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｓｐｐ．）中に存在 する可能性もある。寄生虫および抗原抽出物 Ｆ． ヘパティカ（Ｆ． ｈｅｐａｔｉｃａ）の被嚢幼虫（Ｍｃ）をＣｉｂａ −Ｇｅｉｇｙ社（Ｎ．Ｓ．Ｗ．、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から取得した。新しく脱 嚢した若虫（ＮＥＪ）を、以前に記載される（オーストラリア特許第６４０３６ ４号）インビトロ脱嚢化により取得した。若虫肝蛭は、経口感染後１７日目にマ ウス肝臓から回収した。様々な吸虫段階は既述の要領で（オーストラリア特許第 ６４０３６４号）、プロテアーゼ阻害剤を含むＰＢＳ中で超音波処理にかけ、Ｓ ＤＳ非還元性試料用緩衝液中で沸騰させ、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での 泳動にかけ、そしてウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット作製用のＰＶＤＦ膜 （Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＭＡ）上に移した。培養上清の調製 脾臓、肝リンパ節（ＨＬＮ）、および腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）細胞のインビ トロ培養物を、本質的には既述（オーストラリア特許第６４０３６４号）の要領 で、培養培地（１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのグルタミン、１００ｕ／ｍｌの ペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプト マイシン、および２．５×１０^-5の２−メルカプトエタノールを含むＤＥＭ）中 のｍｌ当たり３×１０⁶細胞に設定した。上清を４〜５日のインキュベーション 後に回収し、そして使用するまで−２０℃に保存した。実験の設計 ８〜９週令のＰＶＣラットを１００匹のＦ． ヘパティカ（Ｆ． ｈｅｐａｔ ｉｃａ ）のＭｃで感染させ、次いで１０日後には７５μｇ／グラムでの殺吸虫剤 Ｆａｓｉｎｅｘ １２０（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ社）で処理した。このラットを ２００匹のＭｃで６週間後に経口攻撃誘発させ、そして攻撃誘発後７〜１０日後 に屠殺してＨＬＮ、ＭＬＮ、および脾臓細胞を回収した。結果 「急激な」感染が全く生じない場合（すなわち、殺吸虫剤による初期感染の完 全治癒すなわち除去）、後発の攻撃誘発感染後には様々なリンパ性器官の間に局 所的抗体応答の顕著な差異が存在した。脾臓もしくはＨＬＮ上清を用いてＮＥＪ 抗原のウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロットを探索した際には全く反応が観察 されなかった一方で、顕著な抗原ダブレットがＭＬＮ細胞からの上清により認識 された。この抗原は１１０ｋＤの分子量マーカーの上方に位置し（図４）、かつ 後の実験では（非公開）２００ｋＤの分子量マーカーの上方に遊走することが判 明しており、そして更に＞２００ｋＤ抗原として引用される。 「急激な」感染の兆候が検出される場合には（すなわち、肝肉芽腫もしくは胆 管内の成虫吸虫）、変化した複雑なパターンのＮＥＪ抗原認識がＨＬＮ上清に関 して観察されるが、＞２００ｋＤ抗原はまたもや、後発の攻撃誘発感染後のＭＬ Ｎ細胞上清により特異的に認識されるに過ぎ ない（非公開）。 全ラットは経口攻撃誘発感染に対して免疫化されており、それは肉眼的に観察 できる肝臓病変の痕跡が存在しないこと、およびすりつぶした全肝臓調製物から の若虫吸虫が全く存在しないことにより判定された。 先と同一のＭＬＮ上清を１７日目の肝蛭抗原を用いてウエスタン（Ｗｅｓｔｅ ｒｎ）ブロット上で反応させた際には、そのような＞２００ｋＤダブレット反応 の所見は得ることができず（非公開）、このことはこの抗原がＮＥＪ段階に特異 的であることを示唆する。結論 非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での＞２００ｋＤ分子量のダブレット抗原（ これはＮＥＪ段階に存在する）が発見され、これは免疫ラットの経口攻撃誘発後 の初期後発応答の間にＭＬＮ細胞の培養上清により特異的に認識される。経口攻 撃誘発感染に対してラット内に発揮される免疫性は消化管のレベルで生じること が示されているため（Ｖｅｔ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． １９８６、２０、６３〜 ９３）、この抗原はワクチン候補物でありそうである。＞２００ｋＤ抗原はＮＥ Ｊ吸虫に特異的な段階に存在するように思われ、それはその抗原が肝組織から回 収された吸虫中に類似の条件下では検出されないためであり、そしてそのためこ の抗原はＮＪＥ段階に対してのみに有効である可能性がある。 実施例４ ファスキオラ ヘパティカ （ＦＡＳＣＩＯＬＡ ＨＥＰＡＴＩＣＡ） 寄生虫および抗原の抽出、ならびに培養上清の調製は、実施例２に報告される 様式で実施した。実験の設計 ８〜９週令のＰＶＣラットを５０匹のＦ． ヘパティカ（Ｆ． ｈｅｐａｔｉ ｃａ ）のＭｃで経口的に感染させ、そして１４日後に１５０μｇのトリクラベン ダゾール（Ｔｒｉｃｌａｂｅｎｄａｚｏｌｅ）／グラムで処置した。これらのラ ットには１５０匹のＭｃの後発経口感染を施し、そして４日後に先と同様の処置 を施した。初回感染の１〜２週間後にラットを４００匹のＭｃで経口攻撃誘発さ せ、そしてＨＬＮ、ＭＬＮ、および脾臓細胞の回収のために７日目に屠殺した。モノクローナル抗体（ｍｃＡｂ）産生 ラットは既述の要領で免疫化および攻撃誘発させ、そしてその攻撃誘発感染後 ５日目に屠殺した。ＭＬＮ細胞上清を調製し、そしてＭＲＣ細胞性免疫部門、Ｏ ｘｆｏｒｄ、英国、により供与されたＹ３ラット骨髄腫株と融合させた。融合物 上清を、ＭＥＪおよび１７日目の肝段階抗原に対してウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒ ｎ）ブロット上でスクリーニングした。陽性融合物を、フィーダーとしてラット 胸腺を用いて少なくとも２度再クローニングした。ｍｃＡｂ（複数）での表面染色 インビトロで脱嚢化させたＮＥＪを、０．０５％のアジ化ナトリウムを含むｍ ｃＡｂ上清と共に氷上で３０分間インキュベートした。これらを冷却ＰＢＳ−ア ジド中で３回洗浄し、そしてＰＢＳ中で１／２０に希釈したパーオキシダーゼ複 合体形成化ウサギ抗−ラット免疫グロブリン（ＤＡＫＯ−Ｄｅｎｍａｒｋ社）と 共に以前と同様にインキュベートした。ＰＢＳ中での３度の洗浄後、ジアミノ（ Ｄｉａｍｉｎｏ）ベンジジン基質を用いる発色を数分間進行させ、そして希釈に より停止させた。 ＰＢＳ中で更に２度洗浄した後、ＮＥＪを１％のホルムアルデヒドおよび２％の グルコースを含むＰＢＳ中に固定化し、そして染色状況を光学顕微鏡下で評定し た。結果 実施例３の結論に記載される＞２００ｋＤ抗原は、２度免疫化したラットのＭ ＬＮ上清中にも存在していた。それに加えてこの過免疫ＭＬＮ上清は、約３２ｋ Ｄの抗原および４２ｋＤと１００ｋＤとの間のおおよその分子量を有する拡散性 抗原（一つもしくは複数）も認識した（図５）。更に２つの余計な抗原がＮＥＪ 抗原のブロット上のみに検出され、そしてこれは１７日目の肝臓段階の抗原につ いては検出されなかった。モノクローナル抗体（ｍｃＡｂ） 幾つかのモノクローナル抗体を、２度免疫化させかつ攻撃誘発させたＭＬＮ細 胞の融合物から取得した。これらのｍｃＡｂの内の３つ（Ｆ．ｈ．１〜３）はＭ ＬＮ上清を用いて検出される３つの抗原を認識するように思われた。あるｍｃＡ ｂを感染化ラットの肝リンパ節から作製し（ＦＹ１−６）、そしてこれはある抗 原を認識したが、その抗原はＮＥＪおよび肝段階吸虫の両方についても感染血清 で強く認識された。作製された全ｍｃＡｂおよびそれらの個々の分子量抗原を表 １にまとめてある。 後の実験（非公開）により、ｍｃＡｂ ＦＹ４−７−１２、ＦＹ３−３−１、 およびＦＹ３−３−２はナイーブマウスの感染後２日目に回収された腹膜吸虫段 階抗原とは依然として反応するが、４日目のものとは反応しないことが確認され ている。 生存可能なＮＥＪと反応させる場合には、２つのｍｃＡｂ（ＦＹ３−３−１およ びＦＹ３−３−２）をＮＥＪ吸虫の表面と反応させるが、各々は独特な染色パタ ーンを示した（図６）。生化学的特性決定 それらのｍｃＡｂにより認識される分子の還元感受性を、ＮＪＥ蛋白質抽出物 への２−メルカプトエタノール（５％ ｖ／ｖ の最終濃度）の添加により調査 した。還元後にはＦ．ｈ．２抗原の有意な上方移動が存在し、このことはこの抗 原が数々のジスルフィド結合を含むことを示唆する。ｍｃＡｂ ＦＹ３−３−２ により認識される最上部のバンドは還元後にゲルの低目の位置へと遊走した一方 で、Ｆ．ｈ．６抗原につい ての移動度の変化は存在しなかった。 それらのｍｃＡｂが炭化水素エピトープを認識するか否かを決定するために、 ＮＥＪ抗原抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをＰＶＤＦ膜上にブロットし、そして Ｗｏｏｄｗａｒｄ，ＭＰ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ 、７８：１４３、１９８５）により記載される要領で過ヨウ素酸塩で処理した。 過ヨウ素酸塩処理後には、ｍｃＡｂ ＦＹ３−３−２およびＦＹ１−６の反応性 は各々消失するか、もしくは劇的に減少し、このことは、これらのｍｃＡｂが炭 化水素エピトープと反応することを示す。各ブロットの過ヨウ素酸塩処理はｍｃ Ａｂ ＦＹ３−３−１およびＦＹ４−７の反応性は変化させなかった。ｍｃＡｂ ＦＹ３−３−２による炭化水素エピトープの認識はウエスタンブロット上での 拡散性認識パターンを説明しており、それはその炭化水素エピトープが糖蛋白質 の範疇に存在する可能性があるためである。アミノ酸配列データ ＮＥＪ抗原調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動させ、ＰｒｏＢｌｏｔ膜（Ａｐ ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）上にブロットし、そしてクーマシー（Ｃ ｏｏｍａｓｓｉｅ）で染色した。抗原番号Ｆ．ｈ．２およびＦ．ｈ．６の位置に 相当するバンドを切り出し、そしてＡＢＩ型４７６Ａ蛋白質配列決定機内で直接 配列決定を行った。取得されたＮ−末端配列は、 であった。 Ｆ．ｈ．２についての配列は、スキストソーマ マンソニ（Ｓｃｈｉｓ ｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）のカテプシンＢ（Ｓｍ３１）のｍＲＮＡと１４ のａａ（アミノ酸）が重複する点で６４．３％の相同性を示した（Ｍｏｌ．Ｂｉ ｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． ３３：１１３−１２２（１９８９））。 Ｆ．ｈ．６については明白は相同性は見いだされなかった。結論 本発明は攻撃誘発させた免疫ラットのＭＬＮ上清により認識されるこれらの抗 原を含み、そして全抗原ならびにそれらの個別の抗体が表１に記載される。経口 攻撃誘発感染に対してラット中に発揮される免疫性は消化管および腹膜のレベル で初期の吸虫段階に対して生じることが示されているため（Ｖｅｔ．Ｐａｒａｓ ｉｔｏｌ． １９８６、２０：６３〜９３、に総説が記載される）、これらの抗 原はワクチン候補物となる。これらの抗原の内の４つはＮＥＪおよび２日令の吸 虫に対する段階特異的なものであると思われ、それはそれらの抗原が感染の後期 段階に回収された吸虫では類似条件下（ウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット ）で検出されなかったためであり、そしてそのためこれらは防御に関与するよう に思われる。段階特異的抗原は肝蛭においてはこれまでに同定されておらず、か つ本発明において新規の抗体産生性細胞プローブを用いることによってのみ検出 されるに過ぎない。 結局のところ、他の様々な改変物および／または変造物は、本明細書に概要が 記載される本発明の精神から逸脱することなく作成される可能性があるというこ とが理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｎ 5/10 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 15/02 9162−4Ｂ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｎ Ｌ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ウオーカー，ジヨン オーストラリア・ビクトリア3103バルウイ ン・クラフアムストリート26 (72)発明者 アシユマン，キース オーストラリア・ビクトリア3337メルト ン・アラワタパレイド10 (72)発明者 ニユートン，スーザン・エリザベス オーストラリア・ビクトリア3041ストラス モア・レバノンストリート３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 本明細書中これ以前に記載される、２６〜３６および９５〜１０５キロ ダルトンの領域のおおよその分子量を有する抗原から選択される、オステルタギ ア キルクムキンクタ（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）も しくは関連感染体に対する仮想的感染防御抗原もしくはその断片。 ２． ２６〜３６ｋＤ抗原がその３２〜３６ｋＤの位置にダブレット抗原を含 む、請求の範囲１に記載の仮想的感染防御抗原。 ３． ダブレット抗原がレクチン用ベータ−ガラクトシド結合性蛋白質であり 、かつペプチド配列 の内の一つもしくは複数を含む可能性のある、請求の範囲２に記載の仮想的感染 防御抗原。 ４． ２６〜３６ｋＤ領域内の抗原がトロポミオシンのＯ． キルクムキンク タ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）相同物であり、以下のＮ−末端配列：MK AEEVRQALKおよび中間部配列：VEADLERAEERAEAAGENKVVVLを含む、請求の範囲１に 記載の仮想的感染防御抗原。 ５． ２６〜３６ｋＤ領域内の抗原がグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの Ｏ． キルクムキンクタ（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）相同物であり、Ｎ −末端配列：VQYKLYYFDGRXAAEVを含む、請求の範囲１に記載の仮想的感染防御抗 原。 ６． 本明細書中これ以前に記載される、３２〜３５キロダルトンの おおよその分子量を有するトリコストロンギルス コルブリホルミス（Ｔｒｉｃ ｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）もしくは関連感染体 に対する仮想的感染防御抗原もしくはその断片。 ７． 抗原がダブレット抗原である、請求の範囲６に記載の仮想的感染防御抗 原。 ８． 本明細書中これ以前に記載される、２８キロダルトン、３２キロダルト ン、３７キロダルトン、４２〜１００キロダルトン、５４〜５５キロダルトン、 および＞２００キロダルトンの領域のおおよその分子量を有する抗原から選択さ れる、ファスキオラ ヘパティカ（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）もし くは関連感染体に対する仮想的感染防御抗原もしくはその断片。 ９． ＞２００キロダルトン抗原がダブレット抗原である、請求の範囲８に記 載の仮想的感染防御抗原。 １０． ３２ｋＤ抗原がＮ−末端ペプチド配列KPNYKRQFEPFSDELIHYINLEを含む、 請求の範囲８に記載の仮想的感染防御抗原。 １１． ５４〜５５ｋＤ抗原がＮ−末端ペプチド配列LEDNGRTHWAVLVAを含む、請 求の範囲８に記載の仮想的感染防御抗原。 １２． ファスキオラ ヘパティカ（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）抗 原が攻撃誘発させた免疫ラットの腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）からの上清により特 異的に認識される、請求の範囲８に記載の仮想的感染防御抗原。 １３． 請求の範囲１〜１２の内のいずれか一つに記載される、ファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ ）、オステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、およびトリコ ストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ） 種、ならびに関連種から選択される疾患病原体に関連する抗原を調製するための 方法であって、 ファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）、オステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉ ａ ）、およびトリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）種、 ならびに関連種から選択される疾患病原体の試料；ならびに ある方法（その方法は、 免疫動物をファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）、オステルタギア（Ｏｓ ｔｅｒｔａｇｉａ ）、およびトリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇ ｙｌｕｓ ）種、ならびに関連種から選択される病原体もしくは病原体抽出物で攻 撃誘発させた後の短時間の内に採取されたその免疫動物からの生物学的試料を提 供し； その生物学的試料から細胞を単離し； 細胞を適切な培養培地中でインビトロで培養し；そして 前記細胞から産生される抗体を回収すること、 を含む）により産生される個別の疾患病原体に対する少なくとも一つの抗体を含 む対応する抗体プローブ を提供し； その対応する抗体プローブで病原体試料を探索して少なくとも一つの抗原を 検出し；そして 検出された抗原を単離すること、 を含む、方法。 １４． 疾患病原体の試料が攻撃に対して最も強い感受性を示す発達段階に採取 される、請求の範囲１３に記載の方法。 １５． 試料が幼虫段階から採取される、請求の範囲１４に記載の方法。 １６． 対応する抗体プローブが培養培地から回収された上清の形態をとる、請 求の範囲１３に記載の方法。 １７． 上清が攻撃誘発された免疫ラットの腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）からのも のである、請求の範囲１６に記載の方法。 １８． 請求の範囲１〜１２の内のいずれか一つに記載されるファスキオラ（Ｆ ａｓｃｉｏｌａ ）、オステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、およびトリコス トロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）種から選択される疾患病原 体の抗原に対するモノクローナル抗体を産生するための方法であって、 前記感染防御抗原もしくはその断片に対する抗体を産生可能であり、かつ既 述の疾患病原体に対する感染防御抗原で免疫化された動物から取得されるＢ細胞 ；および 骨髄腫細胞； を提供し； そのＢ細胞をその骨髄腫細胞と融合させ； そのことにより形成されるハイブリドーマを継代し；そして 前記ハイブリドーマにより産生される抗体を回収すること、 を含む、方法。 １９． 抗原がファスキオラ ヘパティカ（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃ ａ ）抗原である、請求の範囲１８に記載の方法。 ２０． 請求の範囲１８もしくは１９に記載の方法により産生される感染防御抗 原に対するモノクローナル抗体。 ２１． 本明細書中これ以前に記載される、ＦＹ４−７−１２、ＦＹ３ −３−１、ＦＹ３−３−２、ＦＹ３−５、ＦＹ４−７−６、およびＦＹ１−６か らなる群より選択される、ファスキオラ ヘパティカ（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅ ｐａｔｉｃａ ）抗原に対するモノクローナル抗体。 ２２． 請求の範囲１〜１２の内のいずれか一つに記載のファスキオラ（Ｆａｓ ｃｉｏｌａ ）、オステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、およびトリコストロ ンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）種、ならびに関連種から選択さ れる疾患病原体に対する合成抗原性ペプチドを調製するための方法であって、 ファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）、オステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉ ａ ）、およびトリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）種、 ならびに関連種から選択される疾患病原体の試料から取得されるｃＤＮＡライブ ラリーもしくはゲノムライブラリー；ならびに 対応する抗体プローブ（これは、 免疫動物を、ファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）、オステルタギア（Ｏ ｓｔｅｒｔａｇｉａ ）、およびトリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎ ｇｙｌｕｓ ）種、ならびに関連種から選択される病原体もしくは病原体抽出物で 攻撃誘発させた後の短期間の内に採取されたその免疫動物からの生物学的試料を 提供することを含む方法により産生される個別の疾患病原体に対する少なくとも 一つの抗体、あるいはその免疫動物から取得される対応するモノクローナル抗体 、あるいは精製された抗原の注射後に作成されるポリクローナルもしくはモノク ローナル抗体を含む） を提供し、 ｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリーから合成ペプチドを作成 し； それらの合成ペプチドをその抗体プローブで探索し；そして それにより検出された合成抗原性ペプチドを単離すること、 を含む、方法。 ２３． ｃＤＮＡライブラリーがオステルタギア キルクムキンクタ（Ｏｓｔｅ ｒｔａｇｉａ ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）の試料から取得され；かつ対応する 抗体プローブが３２〜３６ｋＤダブレット抗原に対して作成されたモノクローナ ル抗体である、請求の範囲２２に記載の方法。 ２４． 請求の範囲２２もしくは２３に記載の方法により産生される合成抗原性 ペプチド。 ２５． 本明細書中これ以降に記載される、アミノ酸配列 を有する、合成抗原性ペプチド、クローン３−２および５−２ｂ。 ２６． 請求の範囲１〜１２の内のいずれか一つに記載の診断用抗原もしくはそ の断片を含む診断用キット。 ２７． 請求の範囲１〜１２の内のいずれか一つに記載の少なくとも一つの感染 防御抗原の予防学的有効量を動物に投与することを含む、動物における疾患を予 防するための方法。 ２８． 請求の範囲２０〜２１に記載の感染防御抗原に対するモノクロ ーナル抗体の治療学的有効量を動物に投与することを含む、動物における疾患の 治療のための方法。 ２９． 請求の範囲１〜１２の内のいずれか一つに記載の、ファスキオラ（Ｆａ ｓｃｉｏｌａ ）、オステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、およびトリコスト ロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）から選択される少なくとも一 つの疾患病原体に対する少なくとも一つの感染防御抗原の予防学的有効量を含む ワクチンすなわち獣医学的組成物。 ３０． 多数の疾患病原体に対する複数の感染防御抗原を含む、請求の範囲２９ に記載のワクチンすなわち獣医学的組成物。 ３１． 請求の範囲２０もしくは２１に記載の少なくとも一つのモノクローナル 抗体の治療学的有効量を含むワクチンすなわち獣医学的組成物。 ３２． 複数のモノクローナル抗体を含む、請求の範囲３１に記載のワクチンす なわち獣医学的組成物。 ３３． 実質的には本明細書中これ以前に実施例の内のいずれか一つに関連して 記載される、仮想的感染防御抗原もしくはモノクローナル抗体。