JPH09500793A - 微生物ｄｎａのインサイチュー抽出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化することを含んで成る、ＤＮＡをさらなるin situの酵素的修飾を受けやすくする微生物DNAの抽出法。本方法は、ａ）低張ＥＤＴＡ溶液の存在中で微生物細胞を加熱し、ｂ）アクロモペプチダーゼを添加することにより細胞を溶解し、そしてｃ）該溶解細胞を加熱し、残存するプロテアーゼおよびヌクレアーゼ活性を不活性化する、ことを含んで成る。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物ＤＮＡのイン サイチュー抽出法 発明の分野 本発明は、細菌細胞のイン サイチュー(in situ)溶解法、それに続く細菌Ｄ ＮＡの酵素的修飾法に関する。この方法は酵素的修飾前に細菌溶解物からのＤＮ Ａの特別な単離、精製、または分離を必要としない。 発明の背景 今日の微生物の診断、研究および分析法の分野における急速な進歩には、各々 の特別な微生物株に独特な究極的な同定コードを提供するために、核酸レベルで の分析が必要である。 これらの核酸を効率的に得るために、多くの抽出法が開発されてきた。様々な 未知の微生物の分析を包含する診断システムのために、選択した方法はグラム陰 性およびグラム陽性細菌の両方を含む一連の種類の細菌に由来する核酸を同時に 抽出できなければならない。さらに有用なシステムでは、さらなる生化学的分析 および酵素的特性決定のために、抽出した核酸は十分に完全かつ適性な条件でな ければならない。 米国特許第4,900,677号明細書および欧州特許出願第87308431.3号明細書(Hewi tt)は、溶解酵素とカオトロピック試薬とを組み合わせた混合物を使用して、高 分子量の核酸を単離するための方法を開示している。本発明とは異なり、この方 法は抽出した核酸を酵素的に分析する前に、酵素阻害剤を除去するための透析お よび濃縮工程を行う必要がある。 国際特許出願公開第PCT/US89/0346号明細書(WO90/102179、ライフコード社：L ifecodes Corporation)は、血液細胞、精液、尿、組織、Hela細胞、毛髪および 大腸菌を含む、一連の生物試料からＤＮＡを単離す る広範な方法を開示している。この方法では、残存するタンパク質溶解活性を溶 解した細胞から除去するために、溶解した試料を自己消化、または残存するタン パク質溶解活性を不活化するのに十分な温度および時間加熱することにより、別 個の精製工程を省くことができると述べている。しかし本方法とは異なり、この 開示ではグラム陰性およびグラム陽性の細菌種の両方から核酸を抽出するのに利 用性がある方法とすることができない。さらに本発明とは対照的に、この開示は 直接的な酵素的操作(manipulation)をin situで行うために適する核酸の抽出に 効果を示していない。 発明の要約 本発明は、微生物細胞からの核酸の抽出および精製に有用な方法を提供する。 本発明はグラム陰性およびグラム陽性株を含む広範囲の微生物から完全な核酸を 抽出するのに有効である。この抽出法はin situで行われ、そしてさらに酵素的 にin situで操作できる核酸を生じる。 特に本発明は微生物細胞から核酸を抽出するためのin situ法を提供し、その 方法は（ａ）低張のEDTA溶液の存在下で、内因性の細胞性ヌクレアーゼ活性を不 活性化するのに十分な温度および時間で微生物細胞を加熱し、（ｂ）低張溶液中 にアクロモペプチダーゼを加えることにより微生物細胞を溶解し、そして該溶解 細胞を内部の細胞性分解因子を不活性化するために十分な時間インキューベーシ ョンし、そして（ｃ）残存するプロテアーゼおよびヌクレアーゼ活性を不活性化 するのに十分な温度で、該溶解細胞の混合物を加熱し、さらにin situで酵素的 操作に適する抽出微生物二本鎖核酸を生じる工程を含んで成る。 好適な態様では、微生物細胞を80℃で10分間、低張の20mM EDTA中で 加熱し、そして次に添加したアクロモペプチダーゼと20分間、37℃でインキュー ベーションすることにより溶解させる。残存するタンパク質溶解活性またはヌク レアーゼ活性を不活性化するために、この溶解した細胞を次に25分間、70℃でイ ンキューベーションする。 最も好適な態様では、次に抽出した微生物ＤＮＡを同じ細胞抽出容器中の制限 エンドヌクレアーゼで酵素的に処理し、そして制限消化の電気泳動的なクロマト グラフをゲルに取り、それにより生成した制限パターンを視覚化し、そして既知 のパターンを手段としてと比較し、未知の細菌株を同定する。 図面の簡単な説明 図１は、開示した方法を使用して抽出し、そして制限エンドヌクレアーゼEcoR Iで消化し、ＤＮＡプローブで標識したグラム陽性およびグラム陰性細菌ＤＮＡ のアガロースゲルの電気泳動的パターンであり、化学ルミネセンス標識により視 覚化した。 発明の詳細な説明 本明細書では、微生物、好ましくは細菌に由来する核酸、好ましくはＤＮＡのin situ単離法、そしてさらに場合によってはin situ酵素的操作法を記載する。 本方法は、 （ａ）細胞に付随する内因性ヌクレアーゼ活性を不活性化するために、微生物細 胞を熱的に処理し、 （ｂ）ＤＮＡ成分を遊離させるために微生物細胞を溶解し、そしてＤＮＡをイン キューベーションしてＤＮＡが後の酵素的作用を受けやすくし、そして （ｃ）残存するヌクレアーゼおよびプロテアーゼ活性を、熱的処理によ り不活性化して残存ヌクレアーゼおよびプルテアーゼを変性させる、 工程を含んで成る。 場合によっては、 （ｄ）さらにＤＮＡの酵素的操作を、同じ反応容器中で行うこともできる。 本発明では、工程（ａ）−（ｄ）がＤＮＡの中間的単離、分離または精製を行 うこと無くなされ、そしてグラム陽性およびグラム陰性細菌の両方に効果的であ る。さらに本発明の利点は、この反応が単一容器中で行えることである。本発明 のさらに別の利点は、この方法の全体が水性相中に供給される試薬で行えること である。したがって、本方法は容易に自動化できる。 本開示の目的のために、出願人は以下の用語が以下に説明する意味を有するこ とを意図とする。 in situとは、終始、記載される全方法（すなわち、微生物ＤＮＡの抽出、お よび場合によってはさらに酵素的消化）が単一の容器中で行えることを示すため に使用する。 “ＤＮＡ”という用語は、天然の二本鎖デオキシリボ核酸を言う。簡便のため に出願人は明細書を通して互換的にＤＮＡまたは核酸と言うが、微生物細胞中の 任意の起源由来のＲＮＡおよびＤＮＡのような、すべての種類の核酸を含む。 微生物細胞には、グラム陽性およびグラム陰性細菌のすべての種類を含む。 低張とは、完全な微生物細胞の内部で通常観察されるよりも低い溶解溶質の浸 透圧を有する任意の溶液を言う。 “細胞からの核酸のin situ抽出”という句に使用される“抽出”という用語 は、完全な天然の二本鎖状態でありながら、微生物の核酸がそれら天然の細胞内 パッケージから分離されるようになることを意味する。抽出により、さらなる操 作のために核酸が溶液中で得られるようになる。 “さらなるin situ酵素操作に適当である”と言う用語は、抽出ＤＮＡが、今 、同じ反応容器に加えられた酵素で消化されやすい状態であるという事実を言う 。出願人はこの説明的な句の中に、そのような抽出核酸が標識または当該技術分 野で周知の他の手段による特性化(characterization)のような、直接的な酵素的 改良以外の手法も受け入れやすく、かつ適するということを特別に意図し、そし て含んでいる。 本発明では、抽出され、そしてさらに制限エンドヌクレアーゼEcoRIにより消 化される細菌ＤＮＡを使用して、説明の目的のみに述べられた以下の工程の組合 わせが特に記載され、そして考察されている。 （ａ）内因性ヌクレアーゼの不活性化 この方法の第一工程は低張EDTA(約 20 mM)の存在と組み合わせた、完全な細菌細胞の加熱処理であり、細胞壁の破壊お よび内因性ヌクレアーゼの不活性化を起こす。最初の内因性ヌクレアーゼの不活 性化の失敗は、さらに細胞性物質を処理する間にしばしば自然な細菌ＤＮＡの分 解を生じる。特に出願人はグラム陰性細胞(特に、サルモネラ エスピーピー.:Sa lmonella spp.)が十分な加熱処理が無くてはさらに内因性ヌクレアーゼ活性を示 すことを観察した。最適な時間-温度処理は、基本の溶解緩衝液(1mM Tris、20mM EDTA,pH8.0)中で80±2℃にて10分間であると判明した。80℃で10分未満の加熱 処理で、数種の細胞系には十分な結果をもたらすが（特に、グラム陽性細胞系） 、そのような処理は実験を行った細胞系のほとんどの群では失敗で あると判断した。同様に、80±2℃未満の温度で10分間の処理は、実験したすべ ての細胞系について内因性ヌクレアーゼを不活性化しなかった。80℃を越える温 度での処理は、細菌ゲノム中に含まれる二本鎖ＤＮＡの迅速な変性を引き起こし 、そして引き続き制限消化を行うことができない。細胞の加熱処理を全く失敗す ると、実験したほとんどの細胞についてかなりのＤＮＡ分解を生じる。 内因性エンドヌクレアーゼの不活性化に欠かせないのは、EDTAの存在である。 EDTAは、細菌細胞壁の組織を安定化することが知られている二価のカチオンをキ レートする。さらに、細菌界中のほとんどすべての内因性エンドヌクレアーゼは 、その活性が二価カチオン依存性の金属酵素であると考えられている。不十分な EDTAは、細胞壁が溶解酵素に対して安定に維持され、そして内因性ヌクレアーゼ 活性を保護する。一般的に使用される試薬範囲についてEDTAの最適濃度は、1mM のTris、pH8.0の存在下で20mMであると判明した。この系では、5mM未満のEDTA濃 度ではほとんどすべての細胞系でＤＮＡの分解が観察された。30mM より高濃度 では、酵素ACP活性との合併が特記される。 （ｂ）細菌細胞の溶解 本方法の第２工程は、細胞と細菌溶解ペプチダーゼで あるアクロモペプチダーゼ(ACP)とのインキュベーションであり、これは細菌壁 中のペプチド結合を破壊し、細胞構造の統合性の損失を引き起こす。この工程は 低張条件下で行われるので、細胞壁の破壊は細菌細胞中に見られる高い内部浸透 圧勾配の破壊の結果、細菌細胞溶解を引き起こす。 タンパク質溶解性酵素であるアクロモペプチダーゼ(ACP)は、時々細菌溶解活 性を有すると知られている。以前の報告は、この酵素のグラム 陽性細胞に対する溶解活性に焦点をおいていた。本研究では、驚くことには、出 願人はこの酵素が適当な条件下で一般的な細菌溶解酵素と同じようによく機能す ると判断した。ＡＣＰの保存濃度は、脱イオン水中での250-4000単位/ml粗調製 物（ワコー化学社：Wako Chemical Inc.,リッチモンド、バージニア州）で変動 させた。保存濃度が500単位/ml未満のACP濃度は、45分以内（37℃）に細菌の全 体的な溶解を引き起こすには不十分であった。500単位/ml以上の保存ACP濃度で 、実験したすべての細胞系について25分内に細菌の溶解は完全になると判断した 。しかし1000単位/mlより高い保存ACP濃度では、制限エンドヌクレアーゼの導入 前に酵素を不活性化するためには、残存するACPのタンパク質溶解活性にはさら なる加熱処理が必要であった。500単位/mlの保存濃度では、次の処理工程で残存 するタンパク質溶解活性を回避するという過度な困難が無く迅速に細菌を溶解(t =25分間、37℃)したので、好適な様式はこの濃度を使用することである。 30分以下の目標時間が、37℃での溶解工程には最適であると判明した。この目 標を考えると、500単位/mlのACP濃度は37℃にて25分で完全な細菌溶解を起こす のに十分であると判明した。25分未満の溶解インキューベーション時間は、実験 したいくつかの細胞系について不完全な溶解を生じたので避けなければならない 。500単位/mlのACP濃度かつ37℃では、最高60分まで、方法に悪影響を及ぼさな いと記録された。 酵素に関する製品文献（ワコー化学社、リッチモンド、バージニア州）は、数 種のカチオンが酵素活性の既知の阻害剤であることを示している。これらの阻害 剤は以下の表に要約されている。さらに、本研究では25mMを越える全カチオン濃 度は、どのようなカチオンであっても避けるべき であることが判明した。この理由から、粗ACP調製物は常に脱イオン水で調製物 されなければならない。 ACPはペプチダーゼなので、自己消化を含む非特異的なタンパク質溶解活性を 示すだろう。したがってACPは酵素の自己消化を避けるために、4℃にて乾燥状態 で保存されるか、または脱イオン水中で凍結（-20℃）して保存されるべきであ る。これらのいずれかの条件下で最高１年間、測定できる酵素活性の損失は無い と観察された。 ACPの作用と相互作用する、いくつかのタンパク質も見いだされた。この態様 前に、使用した工程は細菌細胞の溶解に影響を与えるためにACPおよびリゾチー ムの混合物を使用した。生理的ｐＨではリゾチームのカチオン性がACP活性を阻 害することが見いだされた。 ワコー化学社（リッチモンド、バージニア州）からのデータ後の操作を受けやすいＤＮＡにするためのＤＮＡ処理。 溶解細胞からＤＮＡが いったん遊離したら、ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで処理する前に、結合タ ンパク質および他の細胞破片を除去するために処理しなければならない。ACPの 天然のペプチド溶解活性のために、ACPはこのように細胞を溶解し、ならびに後 の工程で妨害しうるタンパク質様物質を分解するための、両方の二重酵素として 使用される。ACPにタンパク質溶解作用を発揮させるためにさらに必要な試薬は 無い。この処理工程は細菌溶解と同時に起こる。細胞溶解物を37℃でインキュー ベーションすることによりACPの作用が促進される。 （ｃ）残存するヌクレアーゼおよびプロテアーゼ活性の不活性化 例えば制限 エンドヌクレアーゼで細菌ＤＮＡを酵素的に消化する前に、残存する内因性ヌク レアーゼおよびプロテアーゼ活性を完全に破壊しなけ ればならない。高温（70±1℃）での細胞溶解物の処理が、この目的を達成する ために使用される。そのような処理は残存するヌクレアーゼおよびプロテアーゼ の熱的変性を引き起こす。特に、溶解中に結合したタンパク質からＤＮＡを取り 出すために使用する便利なACPタンパク質溶解活性は、制限消化が進行する前に 除去されなければならない。EcoRIのような外因の消化性酵素は続いて極めて少 量で導入されるので、いかなる残存タンパク質溶解活性も外因の酵素活性を急速 に破壊し、そして未消化または部分消化されたＤＮＡを生じることになるだろう 。残存するプロテアーゼ活性は、加熱作用により破壊され、プロテアーゼを熱的 に変性させると判断した。この操作では温度が最も重要である。最適温度は70± 1℃であると定めた。71℃より高い温度は、二本鎖のゲノムＤＮＡを融解し、不 完全な制限消化物およびアガロースゲル電気泳動により観察される見かけ上のス メアーバンドを生じることが観察された。69℃未満の温度では、プロテアーゼ活 性の破壊が不十分であった。65℃未満では、60分未満のインキューベーション時 間でプロテアーゼ活性を破壊できなかった。目標の30分はプロテアーゼ不活性化 時間として設定したので、70±1℃で30分間という最適条件を決定した。 （ｄ）あるいは、今抽出したＤＮＡをさらにその場で酵素的に消化することも できる。１つの例は、溶解物を制限エンドヌクレアーゼEcoRIで消化してＤＮＡ 断片のスペクトルを生成することである。この態様では、過剰なマグネシウムイ オンが工程（ａ）で使用したEDTAのキレート阻害を克服するために添加されなけ ればならない。適当な緩衝液条件が必要であることに加えて、細菌RNAを分解す るためにRNAse Aがこの工程の反応混合物に加えられる。細菌RNAの分解に失敗す ると、後の電気泳 動法で偽物の信号を引き起こす可能性があり、そして極端な場合には制限エンド ヌクレアーゼ活性を阻害することもある。 本方法の最も好適な態様では、生成した制限消化物をさらにゲル電気泳動およ びＤＮＡプローブ法で分析して、細菌を同定し、あるいは特性を確認するために 使用できるバンドパターンを作成する［米国特許第4,717,653号明細書(Webster) ;米国特許第5,087,558号明細書(Webster);米国特許第4,885,697号明細書(Hubner )］。制限消化は、始めに添加緩衝液を加えることにより終了する。添加緩衝液 は消化反応を停止させるEDTAを含む。さらに添加緩衝液は、アガロース分離ゲル 上に乗せるための消化されたＤＮＡを調製するために、沈降剤（例えばFicoll、 シュクロース）を含む。アガロースゲル電気泳動は当該技術分野で周知の日常的 方法により行い、細菌ＤＮＡ断片の電気泳動的パターンを作成する。 抽出ＤＮＡの別の利用性 出願人の方法である上記工程には、最終工程としてＤＮＡの制限エンドヌクレ アーゼ消化が含まれるが、出願人は開示した方法が回収したＤＮＡに様々な別の 操作を行うためにも適すると考える。以下に記載する各々な操作(PCRは除く)は 、請求の範囲に記載された高温不活性化工程（ｃ）の後に挿入することができる 。そのような酵素的改良および手法は以下のものを含む：ＤＮＡ増幅反応の達成 。上記方法の工程（ｃ）の後に、様々な核酸増幅法を使用 でき、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR、米国特許第4,683,195号明細書）；リ ガーゼ連鎖反応(LCR、欧州特許出願公開第0 473 155明細書)；またはランダム増 幅多型DNA分析(RAPD、米国特許第5,126,239号明細書)を含む。所望のポリメラー ゼ（またはリガーゼ等）、適当なプ ライマー、デオキシヌクレオチド、および適当な反応緩衝液を、生成したＤＮＡ に加えて、ＤＮＡの増幅が通常の方法で行えるようにする。反応の一部として、 いくつかの増幅反応には高温（≧75℃）が必要なので、基本法中に高温工程（ｃ ）を分離する必要性を無くすことも可能である。ＤＮＡに行う他の酵素的操作 。様々な他のＤＮＡ操作酵素は、分子生物学的研究 に日常的に使用されている。例えば、リガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ホスファ ターゼ、エンド−またはエキソヌクレアーゼ、非特異的DNAses、あるいはＤＮＡ を標識または修飾することができる他の酵素を使用してもよい。さらに、転写酵 素（例えばＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）は、適当なヌクレオチドお よび緩衝液存在下で鋳型ＤＮＡを対応するＲＮＡコピーに転写するために使用す ることができる。ＤＮＡプローブを作成する目的のためのＤＮＡ基質の標識 。分子生物学的研究の 共通の目的は、核酸検出剤として使用するための標識されたＤＮＡプローブの生 成である。例えばニックトランスレーション法は、酵素作用を介してＤＮＡ基質 を標識するために日常的に使用されている。さらに、化学反応性結合基を含む標 識（例えば、ホトビオチン、フルオロセイン誘導体）は、標識のために、または 他のＤＮＡ修飾のためにその場でＤＮＡに付加することができる。クローニング実験 。分子生物学的実験または手法の中にはクローン性の組換えＤ ＮＡライブラリーを生成することを求める場合もある。これらのライブラリーは 通常、（１）制限エンドヌクレアーゼまたは他のヌクレアーゼでの基質ＤＮＡの 断片化；（２）断片化された基質ＤＮＡ中への所望の外因性ＤＮＡ挿入断片の付 加；（３）リガーゼによる挿入断片の基質断片へのライゲーション；そして（４ ）クローンから抽出された 特定の挿入物をもつＤＮＡを釣り上げることを介する生成した組換えＤＮＡのス クリーニング、により作成される。クローニング実験に含まれるほとんどの工程 で、ＤＮＡの酵素的操作を使用する。したがって、クローン性ライブラリーは本 明細書に記載される方法を使用して、in situで構成することができる。 実施例 一般試薬 基本溶解緩衝液 1mM Tris、20mM Na₂EDTA、pH8.0 アクロモペプチダーゼ 脱イオン水中500単位/ml （ワコー粗画分；0.5mg/ml） 消化緩衝液 160単位/ml RNAse A(シグマ:Sigma; 2mg/ml)、280mM Tris、560mM NaCl、 89mM MgCl₂、6mM ジチオスレイトール pH 7.5 EcoRI酵素 50単位/μl(ベーリンガー−マンハイム :Boehringer-Manheim) 添加緩衝液 10％ Ficoll(ファルマシア:Pharmacia )、2mM EDTA、追跡色素として微量の ブロモフェノールブルーおよびキシレ ンシアノールを加える 実施例１ この実施例はグラム陰性細菌種（例えば大腸菌）の溶解、ならびに続いて細胞 から得られたＤＮＡのin situ EcoRI消化を記載する（図１のレーン11、12およ び13を参照にされたい）。大腸菌の細菌コロニー(5x 10⁷から5×10⁸細胞)を、最初に一晩のペトリプレートから取り、そして基本溶解 緩衝液中に0.40（600nm、経路長＝1.0cm）の最適密度で懸濁した。細胞懸濁液の アリコート(30μl)を密閉性の反応容器に加え、そして80±1℃に10分間、水浴中 で加熱した。細胞試料を37℃に風冷した。アクロモペプチダーゼ(70μl)を反応 容器中の内容物に混合しながら加えた。細胞を溶解するために、反応容器は25分 間、37±2℃に保たれた。次に反応容器の温度を7分間にわたって70±1℃に上げ 、そして次に70±1℃をさらに25分間維持した。この高温工程の目的は、残存す るアクロモペプチダーゼのタンパク質溶解活性を不活性化するためであった。高 温工程の後、反応容器中の内容物を6分間にわたって37±2℃に冷却した。この時 点での反応混合物を中和溶解物と呼ぶ。 別の容器で、126μlのEcoRI溶液(製造元から供給された状態、50単位/μl)を5 76μlの消化緩衝液と徹底的に混合した。この溶液のアリコート（23μl）をピペ ットで上記の中和溶解物に混合しながら加えた。中和溶解物中に含まれる細菌Ｄ ＮＡの制限消化は、37℃で20分間行った。この時点で、細菌ＤＮＡは制限エンド ヌクレアーゼEcoRIにより一連の特徴的断片に消化された。この消化反応を停止 させ、そしてＤＮＡ断片に10μlの添加緩衝液を加えて電気泳動分析用に調製し た。次に0.8（重量／重量）％アガロースで試料の電気泳動を行い、そしてナイ ロン固定化膜に電気的にブロットした。次にブロットしたＤＮＡを米国特許第4, 717,653号および同5,087,558号明細書(Webster)(これは引用により全部、本明細 書に編入される)に記載されている、保存された配列であるリボゾームＤＮＡプ ローブに接触させた。次にプローブで釣り上げられたＤＮＡバンドを、米国特許 第07/739,123号明細書（これは引用により本明細書 に編入される）に記載されている化学ルミネセンスシステムを使用して視覚化し た。ゲル像は、当該技術分野で周知のデジダルＣＣＤカメラを使用して捕らえた （図１）。 あるいは、もしＤＮＡ断片が電気泳動的分析以外の目的のために使用されるな らば、消化反応はEDTAのみを加えることにより、または続いて保存工程で急速に -20℃に凍結させることにより停止させることができる。 実施例２ この実施例はグラム陽性細菌種（例えば、スタフィロコッカス エスピーピー .:Staphylococcus spp.およびリステリア エスピーピー.:Listeria ssp.）の溶 解、続いて細胞から得られたＤＮＡのin situ EcoRI消化を記載する。抽出、電 気泳動、プローブおよび視覚化法は、正確に実施例１に記載されたように行った が、細菌試料として望むグラム陽性種の取り込みが異なった（図１のレーン１− 10を参照にされたい）。このように、グラム陽性およびグラム陰性細菌種の両方 について、本方法の一般的利用性が実証された。 実施例１および２に関する図１の説明

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＵ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．微生物細胞から核酸を抽出するためのイン サイチュー(in situ)法であっ て、 （ａ）低張EDTA溶液の存在下で、内因性の細胞性ヌクレアーゼ活性を不活性化す るに十分な温度および時間で微生物細胞を加熱し、 （ｂ）低張溶液中のアクロモペプチダーゼを加えることにより微生物細胞を溶解 し、そして該溶解細胞を内因性の細胞性分解因子を不活性化するのに十分な時間 インキュベーションし、そして （ｃ）残存するプロテアーゼおよびヌクレアーゼ活性を不活化するのに十分な温 度まで該溶解細胞を加熱する、 工程を含んで成り、さらにin siru酵素的操作に適する抽出された微生物二本鎖 核酸を得る方法。 ２．上記微生物細胞がグラム陰性またはグラム陽性細菌細胞を含んで成る、請求 の範囲第１項に記載の方法。 ３．工程（ａ）で上記加熱が80±2℃の温度で約10分間行われる、請求の範囲第 １項に記載の方法。 ４．工程（ａ）でEDTAが約20mMの濃度で、約1mMのTris、約pH8.0の低張溶液中に 存在する、請求の範囲第３項に記載の方法。 ５．工程（ｂ）で上記溶解が、低張溶液中の約35単位のアクロモペプチダーゼ(5 00単位/mlの保存溶液から)を、約37℃の温度で約20分間加えることにより行われ る、請求の範囲第１項に記載の方法。 ６．工程（ｃ）で上記加熱が、70±1℃の温度で約30分間行われる、請求の範囲 第１項に記載の方法。 ７．工程（ｃ）の後に： （ｄ）該抽出核酸のin situ酵素的操作を行う、 工程をさらに含んで成る、請求の範囲第２項に記載の方法。 ８．上記in situ酵素的操作が、制限エンドヌクレアーゼの制限消化を行うこと を含んで成る、請求の範囲第７項に記載の方法。 ９．上記制限消化が制限エンドヌクレアーゼEcoRIを使用して行う、請求の範囲 第８項に記載の方法。 １０．上記in situ酵素的操作が、上記細菌ＤＮＡの１つ以上の配列セグメント の複製を含んで成る、請求の範囲第７項に記載の方法。 １１．上記複製が、ポリメラーゼ連鎖反応またはランダム多型ＤＮＡ分析を使用 して行われる、請求の範囲第１０項に記載の方法。 １２．工程（ｄ）の後に： （ｅ）上記酵素的操作の生成物を分析する、 工程をさらに含んで成る、請求の範囲第８または１０項に記載の方法。 １３．上記分析が大きさの分離に基づいて行われる、請求の範囲第１２項に記載 の方法。 １４．上記分離がゲル電気泳動を通して達成される、請求の範囲第１３項に記載 の方法。 １５．上記分析が、標識または色素を使用して上記の酵素的修飾ＤＮＡを視覚化 または検出することにより行われる、請求の範囲第１２項記載の方法。