JPH0937772A - 植物の土壌病害防除剤および防除法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】シュードモナス・フルオレッセンスＣＨＡ０株
に比べ、黒根病に対する抑制効果が高く、特に汚染畑で
黒根病に対する防除効果が安定的に高い微生物を提供す
る。 【解決手段】黒根病の原因であるティーラビオプシス・
バシコーラに対する抗菌活性を有するシュードモナス・
フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）の酢酸
フェニル資化性菌株、および該菌株および／またはその
培養物を有効成分として含有する植物の土壌病害防除
剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、学名シュードモナ
ス・フルオレッセンスに属する１系統の細菌および該細
菌を用い、これを例えば植物根あるいは土壌に導入して
ティーラビオプシス・バシコーラが原因となるタバコ、
マメ科植物、ワタ等の黒根病を防除する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物病原菌の１種であるティーラビオプ
シス・バシコーラ（Thielaviopsis ba sicola）は、宿主
範囲が広く、マメ科、ナス科、ウリ科、キク科、ヒルガ
オ科など多種類の植物に寄生することが知られており、
特に、タバコ、ワタ、オクラ、マメ科植物では、黒根病
と呼ばれ被害が大きい。本病原菌（以下黒根病菌と略
す）は低温性の糸状菌であり、植物が圃場に移植される
春期にはまだ土壌温度が低いため、病原菌が活動しやす
く、根部から侵入し、収量減少・品質低下の原因とな
る。

【０００３】また、黒根病菌は、耐久器官である厚膜胞
子を形成するので、土壌中で長期間生存しやすく、防除
が困難である。

【０００４】本病を防除するためには、従来から土壌く
ん蒸剤、例えばクロルピクリンや臭化メチル、あるいは
土壌殺菌剤、例えばチオファネートメチルやベノミルな
どが主として用いられている。しかしながら、近年、こ
れらの薬剤の使用は、環境汚染の原因となることや、土
壌中の病原菌だけでなく有用な微生物までも死滅させる
ことから、より安全で効果の高い防除法が求められてき
た。

【０００５】また、本病に対する薬剤を用いない防除方
法として、土壌環境条件の改善、抵抗性品種の導入等が
あるが、それらは被害を減少させるものの効果的な防除
方法とはいえない。

【０００６】一方、自然の土壌中には、病原菌に対し拮
抗作用を示す微生物が多数存在することが明らかになっ
ており、安全で効果的な防除法を提供するために、これ
らの拮抗性の微生物を用いて本病を防除する試みが広く
行われている。

【０００７】その１例を示すと、シュードモナス・フル
オレッセンス（Pseudomonas fluore scens）ＣＨＡ０株
を用いる方法（J. Phytopathology（1989）vol 116:121
-134）があげられる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上記のシュードモナス
・フルオレッセンスＣＨＡ０株を用いた例では、黒根病
菌に対して培地上で抗菌活性を示し、温室内実験で発病
抑制効果が認められている。しかし、汚染畑では防除効
果が認められなかったり、不安定である例が多く、現時
点では、本病に対し実用性のある拮抗細菌は見いだされ
ていない。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、さらにこ
の分野の研究を進め、従来知られている拮抗細菌と比較
して、さらに効果が高い有効な細菌の存在を発見した。
例えばタバコ根部等の適当な材料から分離できるシュー
ドモナス・フルオレッセンスの１系統のものが酢酸フェ
ニル資化性であって、且つＣＨＡ０よりもはるかに黒根
病の発病抑制効果が高く、植物体に悪影響を及ぼさず、
汚染畑で本病を効果的に抑制することを発見した。すな
わち、本発明は、酢酸フェニルの資化性を有し、且つ黒
根病の抑制効果がＣＨＡ０よりも高いことを特徴とする
シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluo
rescens）の新菌株を提供するものである。

【００１０】本発明の代表的菌株、シュードモナス・フ
ルオレッセンス Ｈ３９８２（以下「Ｈ３９８２」とい
う）は次のようにして単離された。全国のタバコ畑から
タバコ根部を採取した。そして、タバコ根面あるいは根
圏から数多くの細菌株を分離した。具体的には、健全な
タバコ根部を掘り取り、ハサミで根部を切り離し、付着
している土壌を振り落とした。約1cmの長さに切断した
根を10mlの滅菌水中に入れ、ミキサーで撹拌したのち、
得られた懸濁液を１白金耳取り、Ｍ５２３培地（シュー
クローズ 10.0g，カゼイン酵素分解物 8.0g，イース
トエクストラクト 4.0g，リン酸二カリウム 2.0g，硫
酸マグネシウム・７水化物 0.3g，蒸留水1,000ml，寒
天 15.0g：Phytopathology（1970）vol 60：969〜97
6）あるいはキングＢ培地（プロテオースペプトンNo3
20g，リン酸二カリウム 1.5g，硫酸マグネシウム 1.5
g，グリセリン 10ml，蒸留水 1,000ml：J. Lab. Cli
n. Med.（1954） vol 44:301〜307）上に画線した。28
℃，3日間培養後、得られた単一のコロニーを−80℃の
フリーザーで保存した。このようにして、根面に良く定
着すると考えられる細菌株約2,000株を得た。

【００１１】そして、１）細菌自体が作物に対し病原性
あるいは悪影響を与えない、２）黒根病菌によって引き
起こされる病気の発生を圃場で効果的に抑制する、など
の性質を持ち、実用性の高い細菌株を温室あるいは圃場
で選抜した。具体的には、植物体への影響および効果の
評価法として、播種後約25日目の6葉期のタバコ苗（品
種：ＢＹ４）を供試し、タバコ黒根病の汚染土壌（約10
⁴／g乾土）を入れたビニールポット（30×30cm：36穴）
に移植した。そして、細菌株をキングＢ液体培地で28
℃，120rpm，２日間培養後、培養液をタバコの株元周辺
に落下して潅注することによって根部に導入した。その
後、20℃に設定した温室内でタバコの生育について定期
的に調べた。そして、１か月後に黒根病の発病度につい
て調査し、有用菌株を選抜した。

【００１２】次に、選抜した有用菌株は、上記と同様に
培養後、10,000×g，15分間遠心集菌し、滅菌水中に約1
0⁹／mlの濃度で懸濁したのち、播種後40日目の9〜10葉
期のタバコ苗（品種：ＢＹ４）の根部に潅注処理し、黒
根病の汚染畑（黒根病菌：約10²／g乾土）へ移植した。
２か月後にタバコの生育調査を行なったのちに、タバコ
根部を抜き取り、黒根病の発病度を調べた。

【００１３】こうして得られた有用菌株の代表例がＨ３
９８２菌株である。本菌株は、福島県西白河郡泉崎村の
タバコ（みちのく１号）の根部からＭ５２３培地によっ
て分離された。また、Ｈ３９８２菌株は、培地上ならび
に本畑において黒根病菌に対して抗菌活性を示した。

【００１４】Ｈ３９８２菌株の細菌学的性質を第１表に
示す。

【００１５】

【表１】 第 １ 表 Ｈ３９８２株の細菌学的性質 -------------------------------------------------------- 試験項目 -------------------------------------------------------- 形態 桿菌 グラム染色性 − 胞子 − 運動性 ＋ 酸素に対する態度 好気性 オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ ＯＦ Ｏ 蛍光色素の生成 ＋ 硝酸塩還元 − インドール生成 − グルコース発酵性 − アルギニンジヒドラーゼ ＋ 尿素分解 − エスクリン加水分解 − ゼラチン液化 ＋ ＰＮＰＧ − 資化性 グルコース ＋ Ｌ−アラビノース − Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−マンニトール ＋ Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン ＋ マルトース − グルコン酸カリウム ＋ ｎ−カプリン酸 ＋ アジピン酸 − ｄｌ−リンゴ酸 ＋ クエン酸ナトリウム ＋ 酢酸フェニル ＋ オキシダーゼ ＋ キシロースからの酸の産生 ＋ ソルビトールの資化性 − 黄色色素の生成 − -------------------------------------------------------- Ｈ３９８２菌株は、以上に示した細菌学的性質からBerg
ey's Manual of Systematic Bacteriology, volume 1
(1984)の記載に基づき検索したところ、シュードモナス
に属し、蛍光色素を生成することからシュードモナス・
フルオレッセンスに属する細菌株であると同定した。本
菌株は、酢酸フェニルの資化性が陽性であることを特徴
としており、一般のシュードモナス・フルオレッセンス
は酢酸フェニル資化性が陰性であることから容易に区別
できる新規菌株である。本菌株は、Pseudomonas fluore
scens H3982（受託番号FERM BP-5060）として平成７年
３月２８日に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
された。

【００１６】本発明の、酢酸フェニル資化性で黒根病に
対する抑制効果がＣＨＡ０株に比べて高いシュードモナ
ス・フルオレッセンスの菌株は、上記Ｈ３９８２菌株の
単離方法に準じて、土壌等の各種材料から探索すること
ができる。その際、本発明の開示に基づき、酢酸フェニ
ル資化性を指標に用いれば検索の効率が高まる。こうし
て単離される酢酸フェニルの資化性が陽性で、且つ黒根
病の原因であるティーラビオプシス・バシコーラに対す
る高い抗菌活性を有するシュードモナス・フルオレッセ
ンスの菌株（以下、単に酢酸フェニル資化性菌株という
ことがある）は全て本発明に含まれる。さらに、本発明
の菌株を改変し、例えば第１表に示す性質の一部が変更
された微生物も、シュードモナス・フルオレッセンスの
特性を有し、酢酸フェニルの資化能をもち、且つ黒根病
の原因であるティーラビオプシス・バシコーラに対する
拮抗活性を有する限り、本発明の範囲に含まれる。した
がって、以下の説明はＨ３９８２菌株を例にして行う
が、本発明は特定の菌株に限定されるわけではない。

【００１７】本発明の酢酸フェニル資化性菌株は、増殖
させる際には、必ずしも特別な培養基を準備する必要が
なく、Ｍ５２３培地、キングＢ培地、肉エキス培地など
一般細菌用の培地でよく増殖する。培養条件は、振盪培
養・通気培養などの好気的条件下で行なうが、温度は、
20〜30℃好ましくは22〜28℃、pH5〜8好ましくは6〜7、
培養期間は1〜4日好ましくは2〜3日が適当である。な
お、寒天入りの斜面あるいは平板培地で培養し、培地上
に生育した菌体を用いても良い。

【００１８】本発明における酢酸フェニル資化性菌株の
培養物とは、Ｈ３９８２等の培養懸濁液、生菌、培養ろ
液もしくは抗菌活性成分の抽出液あるいはまた乾燥菌体
をいう。本発明の黒根病防除法は、保護すべき植物の
葉、茎、根部、栽培地または土壌に酢酸フェニル資化性
菌株の培養物を導入することから成る。好ましくは、導
入は根部または土壌に行う。

【００１９】この明細書において「根部」とは、植物を
栽培した場合に土壌中あるいは水耕液中にあって水分や
栄養分の吸収を行なう部分である。また、根部への導入
は、培養物を散布あるいは潅注したり、培養物中へ根部
を浸漬することによって容易に行なうことができる。あ
るいは、培養液を土壌に混和したのちに植物を移植して
も目的を達成することができる。

【００２０】本発明によって酢酸フェニル資化性菌株の
培養物を植物の防除剤として用いる場合には、生菌とし
て10⁵〜10¹⁰／ml好ましくは、10⁸〜10¹⁰／mlの濃度で使
用する。また、培養ろ液を用いる場合は、原液〜100倍
好ましくは、原液〜10倍希釈を使用する。処理時期につ
いては、本畑移植の７日前から移植の１か月後までの間
にこれらを根部等に導入する。導入回数は、１〜３回が
適当である。導入の一方法として浸漬処理する場合に、
その浸漬時間は、30分ないし3時間好ましくは1時間前後
である。また、潅注あるいは潅水処理で根部に導入する
場合には、苗１株当り5〜20ml、移植後は50〜200mlが適
当である。あるいは、培養物を土壌中に撹拌散布するこ
とによっても、同じような効果が期待できる。

【００２１】本発明は、酢酸フェニル資化性菌株を根部
または土壌に導入するために適する植物病害防除剤も提
供する。本発明の植物病害防除剤は、酢酸フェニル資化
性菌株および／またはその培養物を、適当な担体と共に
含む。液剤の場合の担体としては、所望によりpH緩衝剤
を加えた水性溶媒が使用できる。植物病害防除剤は、使
用時に水等に希釈できる粉末剤、顆粒剤等にしてもよ
い。これらの剤型は、流通性や貯蔵安定性を高めるため
に都合がよい。剤中の菌の濃度は、適宜決定されてよ
い。また、タルクなどの助剤や、安定性を高めるために
スキムミルクなどの保護剤を適宜加えてもよい。

【００２２】本発明の植物病害防除方法は、タバコをは
じめとして黒根病菌の宿主植物には全てに応用すること
ができる。さらに黒根病以外にも、糸状菌の感染による
植物病害の防除に広く応用ができる。本明細書を通し
て、防除というときは、病気発生の予防および発生した
病変からの回復の両方を意味する。

【００２３】酢酸フェニル資化性菌株による黒根病の抑
制機構については、植物根によく定着し病原菌の侵入を
防ぐことのほか、本菌株が産生した抗菌物質によって黒
根病菌の感染・増殖が抑制されることが考えられてい
る。

【００２４】

【実施例】以下に実施例をあげて本発明の内容を説明す
る。

【００２５】試験１ Ｈ３９８２およびＣＨＡ０をキングＢ液体培地で22℃，
120rpm，3日間振盪培養したのち、遠心集菌（10,000×
g、15分間）し、滅菌水中に約10⁹／mlの濃度でそれぞれ
懸濁した。予めタバコ黒根病菌の汚染土壌（濃度：約10
⁴／g乾土）を詰めたビニールポット（30×30cm：36穴）
に6葉期のタバコ苗（品種：ＢＹ４）を移植したのち、
上記懸濁液を株当り、2mlずつそれぞれ株元に落下させ
潅注することによって根部に導入した。同時に対照無処
理区として滅菌蒸留水を同様に処理した。処理後は、20
℃の温室内に移し、１か月後にタバコの生育および発病
調査を行った。発病調査は、第２表に示すとおり、根部
の病徴を０から５までの６段階とし、下の式により、平
均罹病指数を求め、防除率を算出した。試験は２回反復
で行い、Tukeyの方法により統計処理を行った。結果を
第２表に示した。

【００２６】

【表２】 第 ２ 表 ------------------------------------------------------ 罹病指数 病 徴 ------------------------------------------------------ ０ 無 病 徴 １ わずかに病斑が認められる ２ 根全体のの1/4までが発病 ３ 根全体の1/4〜1/2が発病 ４ 根全体の1/2〜3/4が発病 ５ 根の3/4以上が発病 ------------------------------------------------------ 平均罹病指数＝（0×n₀+1×n₁+2×n₂+3×n₃+4×n₄5×n₅）／N ただし、Nは供試個体数、n₀〜n₅は罹病指数0〜5に属する個体数 防除率＝（１−処理区罹病指数／無処理区罹病指数）×100

【表３】 第 ３ 表 ---------------------------------------------------------------------- 試験区別 調査株数 葉数 地上部生重 地下部生重 罹病指数 防除率 ---------------------------------------------------------------------- H3982 24本 8.0枚 0.79g 0.14g 2.2 48.8% CHA0 24 7.8 0.66 0.08 3.6 16.3 無処理 24 7.8 0.73 0.05 4.3 − ---------------------------------------------------------------------- 最小有意差(5%) NS NS 0.04 0.5 − ---------------------------------------------------------------------- 注： NS：有意差なし 無処理区のタバコは、黒根病の発生により初期生育が悪
く、罹病指数が著しく高かった。ＣＨＡ０処理区では、
罹病指数が低下し有意差が認められた。一方、Ｈ３９８
２処理区では、罹病指数が最も低く、ＣＨＡ０よりも有
意に低かった。また、地下部生重も無処理区およびＣＨ
Ａ０に比べ有意に高かった。

【００２７】試験２ Ｈ３９８２およびＣＨＡ０をキングＢ液体培地で25℃，
120rpm，3日間振盪培養した。その後は、試験１と同様
に処理、発病調査を行った。結果を第４表に示した。

【００２８】

【表４】 第 ４ 表 -------------------------------------------------------------------- 試験区別 調査株数 地上部生重 地下部生重 罹病指数 防除率 -------------------------------------------------------------------- H3982 24本 1.18g 0.20g 1.4 66.7% CHA0 24 0.68 0.07 4.0 4.8 無処理 24 0.73 0.07 4.2 − -------------------------------------------------------------------- 最小有意差(5%) 0.22 0.06 0.5 -------------------------------------------------------------------- 無処理区のタバコは、試験１と同様に黒根病の発生によ
り罹病指数が著しく高く生育も悪かった。ＣＨＡ０処理
区では、罹病指数およびタバコの生育は無処理と同様で
有意差が認められなかった。一方、Ｈ３９８２処理区で
は、罹病指数が極めて低くなり、無処理およびＣＨＡ０
処理区に比べ、地下部の生体重が増加し、生育が良好で
あった。

【００２９】試験３ Ｈ３９８２をキングＢ液体培地で25℃，120rpm，3日間
振盪培養したのち、遠心集菌（10,000×g、15分間）
し、0.01Mのリン酸緩衝液中に10⁹／mlの濃度で懸濁し
た。この懸濁液を9〜10葉期のタバコ苗（品種：ＢＹ
４）に株当り、10mlずつ株元潅注することによってＨ３
９８２を根部に導入した。同時に対照無処理区として滅
菌蒸留水を同様に処理した。処理後は、黒根病の汚染畑
に移植した。移植月日は、３月３０日であった。６月１
０日に生育調査を行ない、６月１６日に第２表に従って
黒根病の発病調査を行った。試験は、２回反復で行な
い、ｔ-検定によって統計処理を行った。結果を第５表
に示した。

【００３０】

【表５】 第 ５ 表 -------------------------------------------------------------------- タバコの生育 試験区別 調査株数 ------------------------ 罹病指数 防除率 幹径 葉数 草丈 -------------------------------------------------------------------- H3982 20本 3.44cm 17.55枚 198.20cm 0.80 44.8％ 無処理 20 3.26 16.30 192.15 1.45 − -------------------------------------------------------------------- ｔ-検定 1% 1% NS 1% -------------------------------------------------------------------- 注： NS：有意差なし 無処理区では、生育初期から黒根病の被害をうけたた
め、葉数が少なく、生育も劣った。一方、Ｈ３９８２処
理区では、タバコの葉数および草丈が増加するととも
に、罹病指数が低くなり、防除効果が認められた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:39）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】黒根病の原因であるティーラビオプシス・
   バシコーラ（Thielaviopsis bacsic ola）に対する抗菌
   活性を有することを特徴とするシュードモナス・フルオ
   レッセンス（Pseudomonas fluorescens）に属する酢酸
   フェニル資化性を有する菌株。
2. 【請求項２】シュードモナス・フルオレッセンス Ｈ３
   ９８２菌株であることを特徴とする請求項１記載の菌
   株。
3. 【請求項３】請求項１〜２記載の菌株および／またはそ
   の培養物を有効成分として含有することを特徴とする植
   物の土壌病害防除剤。
4. 【請求項４】請求項３に記載の土壌病害が黒根病である
   ことを特徴とする植物の土壌病害防除剤。
5. 【請求項５】請求項３または４に記載の土壌病害防除剤
   を植物の葉、茎、根部、栽培地または土壌に導入するこ
   とを特徴とする植物の土壌病害防除方法。
6. 【請求項６】請求項５に記載の土壌病害が黒根病である
   ことを特徴とする植物の土壌病害防除方法。
7. 【請求項７】植物の土壌病害がティーラビオプシス・バ
   シコーラを含む糸状菌の感染によって起こる病害である
   ことを特徴とする請求項６の土壌病害防除方法。