JPH09329590A - 液体クロマトグラフ - Google Patents
液体クロマトグラフInfo
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- JPH09329590A JPH09329590A JP8151046A JP15104696A JPH09329590A JP H09329590 A JPH09329590 A JP H09329590A JP 8151046 A JP8151046 A JP 8151046A JP 15104696 A JP15104696 A JP 15104696A JP H09329590 A JPH09329590 A JP H09329590A
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- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 負加圧を増加させることなく、流速に依存し
ない高分離能を有するカラムの提供を目的とする。 【解決手段】 本発明は、互いに連続した０．５〜４μ
ｍサイズのスルーポアと、２〜５０ｎｍサイズのメソポ
アを有するシリカ骨格が絡み合った構造をもつ２重細孔
構造のシリカゲル表面にオクタデシルシリル化剤および
トリメリルシリ化剤、アミノプロピルトリメトキシシラ
ン等のシリル化剤で化学修飾した液体クロマトグラフ用
カラムである。
ない高分離能を有するカラムの提供を目的とする。 【解決手段】 本発明は、互いに連続した０．５〜４μ
ｍサイズのスルーポアと、２〜５０ｎｍサイズのメソポ
アを有するシリカ骨格が絡み合った構造をもつ２重細孔
構造のシリカゲル表面にオクタデシルシリル化剤および
トリメリルシリ化剤、アミノプロピルトリメトキシシラ
ン等のシリル化剤で化学修飾した液体クロマトグラフ用
カラムである。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、液体クロマトグラ
フ用のロッド形状のカラム及びそれを用いた液体クロマ
トグラフに関する。
フ用のロッド形状のカラム及びそれを用いた液体クロマ
トグラフに関する。
【０００２】
【従来の技術】液体クロマトグラフでは、通常多孔質球
状シリカゲル粒子を均一に充填したカラムが用いられ
る。液体クロマトグラフにおいては、溶質が粒子表面や
細孔表面の固定相と疎水性、イオン交換などの相互作用
を行い、溶質によって異なる相互作用の差により分離が
生じる。この相互作用が平衡に達するのに必要な距離
（理論段高）が小さいほど相互作用の回数が多くなり、
分離能が大きくなる。理論段高を小さくするには充填剤
の粒子径を小さくすることが必要である。また、分析時
間を短くするには、移動相速度を大きくしなければなら
ないが、溶質の輸送は、粒子間では移動相の対流によっ
て、粒子細孔内では拡散によって行われており、拡散に
よる移動速度は対流によるよりも遅いため、高流速にお
いて特に拡散係数が非常に小さいポリペプチドなどの高
分子の分析においてはブロードなピークを導くことにな
る。これを避けるには充填剤粒子を小さくし、拡散距離
を短くしなければならない。
状シリカゲル粒子を均一に充填したカラムが用いられ
る。液体クロマトグラフにおいては、溶質が粒子表面や
細孔表面の固定相と疎水性、イオン交換などの相互作用
を行い、溶質によって異なる相互作用の差により分離が
生じる。この相互作用が平衡に達するのに必要な距離
（理論段高）が小さいほど相互作用の回数が多くなり、
分離能が大きくなる。理論段高を小さくするには充填剤
の粒子径を小さくすることが必要である。また、分析時
間を短くするには、移動相速度を大きくしなければなら
ないが、溶質の輸送は、粒子間では移動相の対流によっ
て、粒子細孔内では拡散によって行われており、拡散に
よる移動速度は対流によるよりも遅いため、高流速にお
いて特に拡散係数が非常に小さいポリペプチドなどの高
分子の分析においてはブロードなピークを導くことにな
る。これを避けるには充填剤粒子を小さくし、拡散距離
を短くしなければならない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、充填剤
粒子の小径化にともない、粒子間空隙のサイズが小さく
なり、カラムに移動相を流すために高圧が必要となる。
現在では、粒子径５μｍの充填剤を用いた１〜２万段の
理論段数をもつカラムが最も一般的である。１．５μ
ｍ、２μｍなどの小さな粒子径をもつ粒子充填型カラム
も作成されているが、高負荷圧のため、カラム長さを短
くしたり、移動相流速を遅くしてもちいなければなら
ず、真の高性能化が達成されているとは言い難い。
粒子の小径化にともない、粒子間空隙のサイズが小さく
なり、カラムに移動相を流すために高圧が必要となる。
現在では、粒子径５μｍの充填剤を用いた１〜２万段の
理論段数をもつカラムが最も一般的である。１．５μ
ｍ、２μｍなどの小さな粒子径をもつ粒子充填型カラム
も作成されているが、高負荷圧のため、カラム長さを短
くしたり、移動相流速を遅くしてもちいなければなら
ず、真の高性能化が達成されているとは言い難い。
【０００４】そこで、本発明は、負加圧を増加させるこ
となく、流速に依存しない高分離能を有するカラムの提
供を目的とする。
となく、流速に依存しない高分離能を有するカラムの提
供を目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するため、互いに連続したμｍサイズの細孔（スルー
ポア）と、ｎｍサイズの細孔（メソポア）を有するシリ
カ骨格が絡み合った構造をもつ２重細孔構造のシリカゲ
ル表面にシリル化剤で化学修飾してなる液体クロマトグ
ラフ用カラムを提供する。
決するため、互いに連続したμｍサイズの細孔（スルー
ポア）と、ｎｍサイズの細孔（メソポア）を有するシリ
カ骨格が絡み合った構造をもつ２重細孔構造のシリカゲ
ル表面にシリル化剤で化学修飾してなる液体クロマトグ
ラフ用カラムを提供する。
【０００６】ここで、２重細孔構造のシリカゲル（シリ
カロッド）は、ケイ素アルコキシドを加水分解・重縮合
するゾル・ゲル法によって作成するのが好ましい。加水
分解・重縮合は、例えば有機高分子の酸性溶液中におい
て行う。有機高分子としては、例えばポリスチレンスル
ホン酸のナトリウムまたはカリウム塩、ポリアクリル
酸、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポリエチ
レンオキシド、ポリビニルピロリドン等を用いることが
できるが、これらに限定されない。また、有機高分子に
代えてホルミアルデヒドと多価アルコールとの混合物を
用いてもよく、多価アルコールとしては例えばグリセリ
ンを用いる。また、酸性溶液としては、例えば酢酸、塩
酸等を用いることができるが、酢酸が好ましく、酸性溶
液の濃度は、０．００１mol/l 〜１mol/l が好ましい。
カロッド）は、ケイ素アルコキシドを加水分解・重縮合
するゾル・ゲル法によって作成するのが好ましい。加水
分解・重縮合は、例えば有機高分子の酸性溶液中におい
て行う。有機高分子としては、例えばポリスチレンスル
ホン酸のナトリウムまたはカリウム塩、ポリアクリル
酸、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポリエチ
レンオキシド、ポリビニルピロリドン等を用いることが
できるが、これらに限定されない。また、有機高分子に
代えてホルミアルデヒドと多価アルコールとの混合物を
用いてもよく、多価アルコールとしては例えばグリセリ
ンを用いる。また、酸性溶液としては、例えば酢酸、塩
酸等を用いることができるが、酢酸が好ましく、酸性溶
液の濃度は、０．００１mol/l 〜１mol/l が好ましい。
【０００７】ケイ素アルコキシドとしては、テトラメト
キシシラン、テトラエトキシシラン、メチルトリメトキ
シシラン、エチルトリメトキシシラン、ビニルトリメト
キシシランを用いることができるが、これらに限定され
ない。
キシシラン、テトラエトキシシラン、メチルトリメトキ
シシラン、エチルトリメトキシシラン、ビニルトリメト
キシシランを用いることができるが、これらに限定され
ない。
【０００８】なお、ケイ素アルコキシドを加水分解・重
縮合して反応溶液のゲル化を行った後、アンモニア水溶
液に浸漬する工程（溶媒置換）を加えると細孔径を制御
しやすくなる。
縮合して反応溶液のゲル化を行った後、アンモニア水溶
液に浸漬する工程（溶媒置換）を加えると細孔径を制御
しやすくなる。
【０００９】作成した２重細孔構造のシリカゲルは、μ
ｍサイズの細孔（スルーポア）と、ｎｍサイズのメソポ
アを有するシリカ骨格が絡み合っている。ここで、スル
ーポアの細孔径は０．５〜４μｍが好ましい。０．５μ
ｍより小さいと、負加圧が大きくなりすぎ、４μｍより
大きいと性能が低下するためである。またメソポアの細
孔径は２〜５０ｎｍが好ましい。２ｎｍより小さいと、
細孔内での溶質の拡散が困難であり、５０ｎｍより大き
いと表面積が小さく分離が不十分になるためである。ス
ルーポアの細孔径は、反応系の組成及び温度、ｐＨ、有
機高分子の分子量等の各種条件によって変わり、これら
条件を調節することによって、所望の細孔径が得られ
る。例えば、出発物質の仕込み組成を変化させて生成し
た各シリカロッドの骨格径、スルーポアの細孔径、スル
ーポアの細孔容積を表１に示す。
ｍサイズの細孔（スルーポア）と、ｎｍサイズのメソポ
アを有するシリカ骨格が絡み合っている。ここで、スル
ーポアの細孔径は０．５〜４μｍが好ましい。０．５μ
ｍより小さいと、負加圧が大きくなりすぎ、４μｍより
大きいと性能が低下するためである。またメソポアの細
孔径は２〜５０ｎｍが好ましい。２ｎｍより小さいと、
細孔内での溶質の拡散が困難であり、５０ｎｍより大き
いと表面積が小さく分離が不十分になるためである。ス
ルーポアの細孔径は、反応系の組成及び温度、ｐＨ、有
機高分子の分子量等の各種条件によって変わり、これら
条件を調節することによって、所望の細孔径が得られ
る。例えば、出発物質の仕込み組成を変化させて生成し
た各シリカロッドの骨格径、スルーポアの細孔径、スル
ーポアの細孔容積を表１に示す。
【００１０】
【表１】 骨格径は走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真から平均値を
求め、スルーポアの細孔径、細孔容積は水銀圧入法によ
り測定した。
求め、スルーポアの細孔径、細孔容積は水銀圧入法によ
り測定した。
【００１１】また、メソポアサイズは溶媒置換条件によ
り調節される。例えば、各仕込み組成において得られた
シリカロッドの溶媒置換条件による骨格内構造への影響
を表２に示す。
り調節される。例えば、各仕込み組成において得られた
シリカロッドの溶媒置換条件による骨格内構造への影響
を表２に示す。
【００１２】
【表２】 ２重細孔構造のシリカゲルの表面はシリル化剤で化学修
飾して液体クロマトグラフ用カラムが作成される。シリ
ル化剤としては、例えばオクタデシルシリル化剤および
トリメリルシリ化剤、アミノプロピルトリメトキシシラ
ンが好ましく、オクタデシルシリル化剤としては、例え
ばオクタデシルジメチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノシラ
ン、トリメリルシリ化剤としては、例えば1,1,1,3,3,3-
ヘキサメチルジシラザンが好ましい。シリカゲル表面の
シリル化は、シリカゲルとオクタデシルシリル化剤との
反応後、残存しているシラノール量を最小にするため二
次シリルを行うのが好ましい。二次シリル化剤としては
前述の1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルジシラザンを用いるこ
とができる。シリル化剤の濃度としては、ベンゼン、ト
ルエン等の有機溶剤中に濃度１vol ％以上１００vol ％
まで、好ましくは１０〜５０vol ％が好ましく、シリル
化はシリル化剤の溶液中にシリカゲルを浸して行うか、
シリカゲルの細孔にシリル化剤を液体クロマトグラフな
どにより送液して行っても良い。
飾して液体クロマトグラフ用カラムが作成される。シリ
ル化剤としては、例えばオクタデシルシリル化剤および
トリメリルシリ化剤、アミノプロピルトリメトキシシラ
ンが好ましく、オクタデシルシリル化剤としては、例え
ばオクタデシルジメチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノシラ
ン、トリメリルシリ化剤としては、例えば1,1,1,3,3,3-
ヘキサメチルジシラザンが好ましい。シリカゲル表面の
シリル化は、シリカゲルとオクタデシルシリル化剤との
反応後、残存しているシラノール量を最小にするため二
次シリルを行うのが好ましい。二次シリル化剤としては
前述の1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルジシラザンを用いるこ
とができる。シリル化剤の濃度としては、ベンゼン、ト
ルエン等の有機溶剤中に濃度１vol ％以上１００vol ％
まで、好ましくは１０〜５０vol ％が好ましく、シリル
化はシリル化剤の溶液中にシリカゲルを浸して行うか、
シリカゲルの細孔にシリル化剤を液体クロマトグラフな
どにより送液して行っても良い。
【００１３】上述の液体クロマトグラフ用カラムは、移
動相を送液する送液ポンプと、カラムからの溶離液を検
出する検出器とを組み合わせることにより液体クロマト
グラフが構成される。この液体クロマトグラフにおいて
は、移動相線速度を従来より上げることができ、０．３
〜２０ｍｍ／ｓ、好ましくは１ｍｍ／ｓ以上とできる。
移動相線速度の制御は、移動相を送液する送液ポンプの
制御、カラム背圧の制御等により行える。
動相を送液する送液ポンプと、カラムからの溶離液を検
出する検出器とを組み合わせることにより液体クロマト
グラフが構成される。この液体クロマトグラフにおいて
は、移動相線速度を従来より上げることができ、０．３
〜２０ｍｍ／ｓ、好ましくは１ｍｍ／ｓ以上とできる。
移動相線速度の制御は、移動相を送液する送液ポンプの
制御、カラム背圧の制御等により行える。
【００１４】なお、本発明の液体クロマトグラフにおい
ては、あらゆる物質を分析できるが、特にポリペプチ
ド、タンパク、糖類、アミノ酸、ベンゼン誘導体の分析
に有効である。分析モードは順相、逆相、イオン交換、
ＧＰＣモードなどのあらゆるモードを利用できる。
ては、あらゆる物質を分析できるが、特にポリペプチ
ド、タンパク、糖類、アミノ酸、ベンゼン誘導体の分析
に有効である。分析モードは順相、逆相、イオン交換、
ＧＰＣモードなどのあらゆるモードを利用できる。
【００１５】
＜実験例１：液体クロマトグラフ用カラムの作成＞ （１）２重細孔構造のシリカゲルロッドの作成 分子量１０、０００のポリエチレンオキシド、ＰＥＯ
（Aldrich)を０．０１Ｎ酢酸水溶液（ナカライテスク、
試薬特級）１００ｍｌに溶解し、氷冷下でテトラメトキ
シシラン、ＴＭＯＳ（東京化成工業）を加えて３０分間
攪拌し、加水分解した。この溶液をヘリウムガスによっ
て２分間脱気し、内径１０ｍｍの筒状の型に流し込んだ
後、４０℃の恒温槽に入れてゲル化した。一晩エージン
グしたシリカゲルを型から出して、水に浸した。そして
０．０１Ｎアンモニア水溶液（ナカライテスク、試薬特
級）による溶媒置換処理を行い、５０℃で３日間乾燥し
た後、６００℃において２時間熱処理を行った。
（Aldrich)を０．０１Ｎ酢酸水溶液（ナカライテスク、
試薬特級）１００ｍｌに溶解し、氷冷下でテトラメトキ
シシラン、ＴＭＯＳ（東京化成工業）を加えて３０分間
攪拌し、加水分解した。この溶液をヘリウムガスによっ
て２分間脱気し、内径１０ｍｍの筒状の型に流し込んだ
後、４０℃の恒温槽に入れてゲル化した。一晩エージン
グしたシリカゲルを型から出して、水に浸した。そして
０．０１Ｎアンモニア水溶液（ナカライテスク、試薬特
級）による溶媒置換処理を行い、５０℃で３日間乾燥し
た後、６００℃において２時間熱処理を行った。
【００１６】以上の方法で調整したものを８３ｍｍ長に
成形加工した後、ジクロロメタン（ナカライテスク、試
薬特級）中１０分間超音波洗浄した。乾燥したシリカロ
ッドにフィルターとポリテトラフルオロエチレン（ＰＴ
ＦＥ）製エンドキャップをＰＴＦＥ製熱収縮性チューブ
で覆って取り付け、回りをエポキシ樹脂で固めてロッド
カラムとした。
成形加工した後、ジクロロメタン（ナカライテスク、試
薬特級）中１０分間超音波洗浄した。乾燥したシリカロ
ッドにフィルターとポリテトラフルオロエチレン（ＰＴ
ＦＥ）製エンドキャップをＰＴＦＥ製熱収縮性チューブ
で覆って取り付け、回りをエポキシ樹脂で固めてロッド
カラムとした。
【００１７】（２）オクタデシルジメチル−Ｎ，Ｎ−ジ
エチルアミノシラン（ＯＤＳ−ＤＥＳ）の合成 １Ｌ三角フラスコのオクタデシルジメチルクロロシラン
（ナカライテスク）５０ｇのｎ−ヘキサン（ナカライテ
スク、試薬特級）溶液６００ｍｌを入れ、ジエチルアミ
ン（ナカライテスク、試薬特級）６０ｍｌを加えて５０
℃で１時間攪拌した。その後、生成した塩を取り除くた
めに反応溶液をＰＴＦＥ製メンブランフィルターで濾過
し、溶媒を減圧留去した。
エチルアミノシラン（ＯＤＳ−ＤＥＳ）の合成 １Ｌ三角フラスコのオクタデシルジメチルクロロシラン
（ナカライテスク）５０ｇのｎ−ヘキサン（ナカライテ
スク、試薬特級）溶液６００ｍｌを入れ、ジエチルアミ
ン（ナカライテスク、試薬特級）６０ｍｌを加えて５０
℃で１時間攪拌した。その後、生成した塩を取り除くた
めに反応溶液をＰＴＦＥ製メンブランフィルターで濾過
し、溶媒を減圧留去した。
【００１８】（３）オクタデシルシリル化及び二次シリ
ル化 シリカゲルのシリル化は、液体クロマトグラフによる送
液を用いて次の方法で行った。最初にテトラヒドロフ
ランを流速１ｍｌ／ｍｉｎで３０分間送液、移動相を
トルエンに変えてさらに３０分間送液、１０ｍｌイン
ジェクトループにＯＤＳ−ＤＥＡの２０％(V/V) トルエ
ン溶液を注入し、６０℃、流速０．０３ｍｌ／ｍｉｎで
６時間送液することにより反応、反応後、トルエン、
テトラヒドラフランを流速１ｍｌ／ｍｉｎでそれぞれ３
０分間送液してカラム内を洗浄、充分な反応率を得る
ため、これらの操作を再度繰り返した。
ル化 シリカゲルのシリル化は、液体クロマトグラフによる送
液を用いて次の方法で行った。最初にテトラヒドロフ
ランを流速１ｍｌ／ｍｉｎで３０分間送液、移動相を
トルエンに変えてさらに３０分間送液、１０ｍｌイン
ジェクトループにＯＤＳ−ＤＥＡの２０％(V/V) トルエ
ン溶液を注入し、６０℃、流速０．０３ｍｌ／ｍｉｎで
６時間送液することにより反応、反応後、トルエン、
テトラヒドラフランを流速１ｍｌ／ｍｉｎでそれぞれ３
０分間送液してカラム内を洗浄、充分な反応率を得る
ため、これらの操作を再度繰り返した。
【００１９】シリカゲルとオクタデシルシリル化剤との
反応後、残存しているシラノール量を最小にするために
二次シリル化を行った。1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルジシ
ラザン、ＨＭＤＳ（ナカライテスク、ガスクロマトグラ
フィーシリル化用）、２０％(V/V) トルエン溶液を使用
し、オクタデシルシリル化と同様の作用を行った。
反応後、残存しているシラノール量を最小にするために
二次シリル化を行った。1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルジシ
ラザン、ＨＭＤＳ（ナカライテスク、ガスクロマトグラ
フィーシリル化用）、２０％(V/V) トルエン溶液を使用
し、オクタデシルシリル化と同様の作用を行った。
【００２０】（４）細孔径の測定 作成したカラムのスルーポアとメソポアの細孔径分布と
細孔容量をそれぞれ水銀圧入法と、窒素吸着法によって
測定した。スルーポアの細孔径分布を図１にメソポアの
細孔径分布を図２に示す。
細孔容量をそれぞれ水銀圧入法と、窒素吸着法によって
測定した。スルーポアの細孔径分布を図１にメソポアの
細孔径分布を図２に示す。
【００２１】＜実験例２；アルキルベンゼンの分離＞ 実験例１で作成した本発明のカラムを使って以下の分析
条件でアルキルベンゼンを分離した例を図３（ａ）に示
す。 移動相：８０％ メチルアルコール ポンプ：ＬＣ−１０ＡＤ型ポンプ（島津製作所製） カラム温度：３０℃ 検出器：島津ＳＰＤ−６ＡＶ型紫外線吸収検出器（２１
５ｎｍ） なお、比較のためカラムのみを従来の市販の粒子充填カ
ラム（ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ Ｃ18 ＵＧ）に代えて同
様に分析した例を図３（ｂ）に示す。
条件でアルキルベンゼンを分離した例を図３（ａ）に示
す。 移動相：８０％ メチルアルコール ポンプ：ＬＣ−１０ＡＤ型ポンプ（島津製作所製） カラム温度：３０℃ 検出器：島津ＳＰＤ−６ＡＶ型紫外線吸収検出器（２１
５ｎｍ） なお、比較のためカラムのみを従来の市販の粒子充填カ
ラム（ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ Ｃ18 ＵＧ）に代えて同
様に分析した例を図３（ｂ）に示す。
【００２２】図３より移動相の線速度（ｕ）が１．５ｍ
ｍ／ｓのとき、長さ８３ｍｍの本発明のカラムは、アル
キルベンゼンに対して約８８００段の理論段数Ｎ（理論
段高Ｈ；９．４μｍ）を与えた。これは、高流速におい
て理論段高が急激に増加する従来の粒子充填カラムに対
して、本発明の理論段高の変化はかなり小さく、本発明
では高速分離が可能であることを示している。
ｍ／ｓのとき、長さ８３ｍｍの本発明のカラムは、アル
キルベンゼンに対して約８８００段の理論段数Ｎ（理論
段高Ｈ；９．４μｍ）を与えた。これは、高流速におい
て理論段高が急激に増加する従来の粒子充填カラムに対
して、本発明の理論段高の変化はかなり小さく、本発明
では高速分離が可能であることを示している。
【００２３】なお、線速度ｕ、理論段数Ｎおよび理論段
高Ｈは次式に従って算出した。 線速度（ｍｍ／ｓ）；ｕ＝Ｌ／ｔ0 理論段数；Ｎ＝５．５４×（ｔR ／ω1/2 ）2 理論段高（μｍ）；Ｈ＝Ｌ／Ｎ ここで、Ｌはカラムの長さを、ω1/2 はピークの半値幅
を、ｔ0 はメタノールの保持時間をｔR はアルキルベン
ゼンの保持時間を表している。
高Ｈは次式に従って算出した。 線速度（ｍｍ／ｓ）；ｕ＝Ｌ／ｔ0 理論段数；Ｎ＝５．５４×（ｔR ／ω1/2 ）2 理論段高（μｍ）；Ｈ＝Ｌ／Ｎ ここで、Ｌはカラムの長さを、ω1/2 はピークの半値幅
を、ｔ0 はメタノールの保持時間をｔR はアルキルベン
ゼンの保持時間を表している。
【００２４】＜実験例３；インシュリンの分離＞以下の
分析条件でインシュリンを分析した例を図４（ａ）
（ｂ）に示す。図４（ａ）は実験例１で作成した本発明
のカラム、図４（ｂ）は従来の市販の粒子充填カラム
（ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ18 ＵＧ）を用いた例で
ある。 移動相：３０％ シアン化メチル ポンプ：ＬＣ−１０ＡＤ型ポンプ（島津製作所製） カラム温度：３０℃ 検出器：島津ＳＰＤ−６ＡＶ型紫外線吸収検出器（２１
５ｎｍ） この実験例においても本発明の理論段高の変化はかなり
小さく、本発明では高速分離が可能であることを示して
いる。
分析条件でインシュリンを分析した例を図４（ａ）
（ｂ）に示す。図４（ａ）は実験例１で作成した本発明
のカラム、図４（ｂ）は従来の市販の粒子充填カラム
（ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ18 ＵＧ）を用いた例で
ある。 移動相：３０％ シアン化メチル ポンプ：ＬＣ−１０ＡＤ型ポンプ（島津製作所製） カラム温度：３０℃ 検出器：島津ＳＰＤ−６ＡＶ型紫外線吸収検出器（２１
５ｎｍ） この実験例においても本発明の理論段高の変化はかなり
小さく、本発明では高速分離が可能であることを示して
いる。
【００２５】＜実験例４；ポリペプチドの分離＞実験例
１で作成した本発明のカラムのポリペプチドに対する分
離性能を、グラジエント溶出法を用いて、従来の市販の
粒子充填カラムと比較し検討した。溶質として、インシ
ュリン、チトクロムｃ、トランスフェリンおよび牛血清
アルブミンを用い、移動相にはトリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）を０．１％添加した。流速および移動相濃度の勾配
を大きくし、ポリペプチドに対する高性能、高速分離を
試みた結果を図５（（ａ）は本発明のカラム、（ｂ）は
従来の市販の粒子充填カラムを用いた例）に示す。図５
より従来のカラムでは低流速でも困難であったインシュ
リンとチトクロムｃの分離が、本発明では高流速におい
て可能となり、溶質の拡散距離が短い骨格で構成される
本発明カラムが、拡散係数の小さいポリペプチドに対し
て流速に依存しない高分離能を有し、分析時間の短縮を
可能にすることがわかる。
１で作成した本発明のカラムのポリペプチドに対する分
離性能を、グラジエント溶出法を用いて、従来の市販の
粒子充填カラムと比較し検討した。溶質として、インシ
ュリン、チトクロムｃ、トランスフェリンおよび牛血清
アルブミンを用い、移動相にはトリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）を０．１％添加した。流速および移動相濃度の勾配
を大きくし、ポリペプチドに対する高性能、高速分離を
試みた結果を図５（（ａ）は本発明のカラム、（ｂ）は
従来の市販の粒子充填カラムを用いた例）に示す。図５
より従来のカラムでは低流速でも困難であったインシュ
リンとチトクロムｃの分離が、本発明では高流速におい
て可能となり、溶質の拡散距離が短い骨格で構成される
本発明カラムが、拡散係数の小さいポリペプチドに対し
て流速に依存しない高分離能を有し、分析時間の短縮を
可能にすることがわかる。
【００２６】＜実験例５；ピリジルアミノグルコースオ
リゴマーの分離＞実験例１で作成したシリカゲルロッド
にアミノプロピルトリメトキシシランを修飾した本発明
のカラムを用いて糖類を以下の条件で分析した。アミノ
プロピルトリメトキシシランの修飾は、ロッドにアミノ
プロピルトリメトキシシラン／トルエン＝１ｇ／５ ml
溶液を８０℃で０．０２ｍｌ／min で流して修飾した。
また２次シリル化は実験例１と同様の方法で行った。
リゴマーの分離＞実験例１で作成したシリカゲルロッド
にアミノプロピルトリメトキシシランを修飾した本発明
のカラムを用いて糖類を以下の条件で分析した。アミノ
プロピルトリメトキシシランの修飾は、ロッドにアミノ
プロピルトリメトキシシラン／トルエン＝１ｇ／５ ml
溶液を８０℃で０．０２ｍｌ／min で流して修飾した。
また２次シリル化は実験例１と同様の方法で行った。
【００２７】図６（ａ）は、本発明のカラムを用いた結
果を、図６（ｂ）は従来の市販の粒子充填カラム（ＰＡ
ＬＰＡＫ Ｔｙｐｅ Ｎ）を用いた分析結果である（図
６中、Ｇ３、Ｇ６等はグルコースの数である）。
果を、図６（ｂ）は従来の市販の粒子充填カラム（ＰＡ
ＬＰＡＫ Ｔｙｐｅ Ｎ）を用いた分析結果である（図
６中、Ｇ３、Ｇ６等はグルコースの数である）。
【００２８】 移動相：Ａ；２００ｍＭ酢酸・トリエチルアミン（ｐＨ
３．３）／アセトニトリル）（３５／６５v/v) Ｂ；２００ｍＭ酢酸・トリエチルアミン（ｐＨ３．３）
／アセトニトリル）（５０／５０v/v) Ｂを５０分で０→１００％にグラジエント ポンプ：ＬＣ−１０ＡＤ型ポンプ（島津製作所製） カラム温度：３０℃ 検出器：蛍光検出器（励起波長３２０ｎｍ、蛍光検出波
長４００ｎｍ） 図６より本発明のカラムによれば、従来の１／６の時間
で分析できることが分かる。
３．３）／アセトニトリル）（３５／６５v/v) Ｂ；２００ｍＭ酢酸・トリエチルアミン（ｐＨ３．３）
／アセトニトリル）（５０／５０v/v) Ｂを５０分で０→１００％にグラジエント ポンプ：ＬＣ−１０ＡＤ型ポンプ（島津製作所製） カラム温度：３０℃ 検出器：蛍光検出器（励起波長３２０ｎｍ、蛍光検出波
長４００ｎｍ） 図６より本発明のカラムによれば、従来の１／６の時間
で分析できることが分かる。
【００２９】＜実験例６；ＧＰＣによるベンゼン誘導体
の分離＞実験例１で作成した本発明のカラムを用いて、
ＧＰＣモードでベンゼン誘導体を分析した結果を図７に
示す。 移動相：ＴＨＦ ポンプ：ＬＣ−１０ＡＤ型ポンプ（島津製作所製） カラム温度：３０℃ 検出器：島津ＳＰＤ−６ＡＶ型紫外線吸収検出器（２５
４ｎｍ） 図７より、本発明のカラムによればＧＰＣモードでも好
適な分析結果が得られることが示される。
の分離＞実験例１で作成した本発明のカラムを用いて、
ＧＰＣモードでベンゼン誘導体を分析した結果を図７に
示す。 移動相：ＴＨＦ ポンプ：ＬＣ−１０ＡＤ型ポンプ（島津製作所製） カラム温度：３０℃ 検出器：島津ＳＰＤ−６ＡＶ型紫外線吸収検出器（２５
４ｎｍ） 図７より、本発明のカラムによればＧＰＣモードでも好
適な分析結果が得られることが示される。
【００３０】
【発明の効果】本発明によれば、従来の粒子充填カラム
より流速に依存しない高性能、高速分離のカラムを提供
することができる。特にポリペプチドのような拡散係数
の非常に小さな溶質に対して、充填剤粒子よりも溶質の
拡散係数が短い骨格をもつ本発明のカラムは、グラジエ
ント溶出による分析時間の短縮を可能とした。
より流速に依存しない高性能、高速分離のカラムを提供
することができる。特にポリペプチドのような拡散係数
の非常に小さな溶質に対して、充填剤粒子よりも溶質の
拡散係数が短い骨格をもつ本発明のカラムは、グラジエ
ント溶出による分析時間の短縮を可能とした。
【図１】スルーポアの細孔径分布を示す図
【図２】メソポアの細孔径分布を示す図
【図３】（ａ）本発明のカラムでアルキルベンゼンを分
離した図 （ｂ）従来のカラムでアルキルベンゼンを分
離した図
離した図 （ｂ）従来のカラムでアルキルベンゼンを分
離した図
【図４】（ａ）本発明のカラムでインシュリンを分離し
た図 （ｂ）従来のカラムでインシュリンを分離した図
た図 （ｂ）従来のカラムでインシュリンを分離した図
【図５】（ａ）本発明のカラムでポリペプチドを分離し
た図 （ｂ）従来のカラムでポリペプチドを分離した図
た図 （ｂ）従来のカラムでポリペプチドを分離した図
【図６】（ａ）本発明のカラムでピリジルアミノグルコ
ースオリゴマを分離した図 （ｂ）従来のカラムでピリジルアミノグルコースオリゴ
マを分離した図
ースオリゴマを分離した図 （ｂ）従来のカラムでピリジルアミノグルコースオリゴ
マを分離した図
【図７】本発明のカラムを用いて、ＧＰＣモードでベン
ゼン誘導体を分析した図
ゼン誘導体を分析した図
Claims (8)
- 【請求項１】 互いに連続したμｍサイズの細孔（スル
ーポア）と、ｎｍサイズの細孔（メソポア）を有するシ
リカ骨格が絡み合った構造をもつ２重細孔構造のシリカ
ゲル表面にシリル化剤で化学修飾してなる液体クロマト
グラフ用カラム。 - 【請求項２】 スルーポアの細孔径が０．５〜４μｍ
で、メソポアの細孔径が２〜５０ｎｍである請求項１記
載の液体クロマトグラフ用カラム。 - 【請求項３】 シリル化剤がオクタデシルシリル化剤お
よびトリメリルシリ化剤、アミノプロピルトリメトキシ
シランである請求項１記載の液体クロマトグラフ用カラ
ム。 - 【請求項４】 オクタデシルシリル化剤がオクタデシル
ジメチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノシランであり、トリ
メリルシリ化剤が1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルジシラザン
である請求項３記載の液体クロマトグラフ用カラム。 - 【請求項５】 請求項１〜４記載の液体クロマトグラフ
用カラムと、該カラムに移動相を送液する送液ポンプ
と、該カラムからの溶離液を検出する検出器とからなる
液体クロマトグラフ。 - 【請求項６】 請求項５記載の液体クロマトグラフにお
いて、移動相線速度を０．３〜２０ｍｍ／ｓとする制御
部を設けたことを特徴とする液体クロマトグラフ。 - 【請求項７】 請求項５〜６記載の液体クロマトグラフ
において、ポリペプチド、タンパク、糖類、アミノ酸、
ベンゼン誘導体を分析することを特徴とする液体クロマ
トグラフの使用法。 - 【請求項８】 請求項７記載の液体クロマトグラフの使
用法において、分析モードがＧＰＣモードである液体ク
ロマトグラフの使用法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8151046A JPH09329590A (ja) | 1996-06-12 | 1996-06-12 | 液体クロマトグラフ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8151046A JPH09329590A (ja) | 1996-06-12 | 1996-06-12 | 液体クロマトグラフ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09329590A true JPH09329590A (ja) | 1997-12-22 |
Family
ID=15510122
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8151046A Pending JPH09329590A (ja) | 1996-06-12 | 1996-06-12 | 液体クロマトグラフ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09329590A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002505006A (ja) * | 1997-06-18 | 2002-02-12 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | 分取クロマトグラフィーによる分離のためのモノリシック吸着剤の使用 |
| JP2002350412A (ja) * | 2001-05-23 | 2002-12-04 | Nobuo Tanaka | 多次元高速液体クロマトグラフ |
| JP2003075420A (ja) * | 2001-09-07 | 2003-03-12 | Kazuki Nakanishi | 高速液体クロマトグラフ |
| WO2005015198A1 (ja) * | 2003-08-06 | 2005-02-17 | Nippon Telegraph And Telephone Corporation | 多孔質材料を用いた分子の検出方法ならびに該多孔質材料及び該多孔質材料の製造方法 |
| US7361278B2 (en) | 2002-07-18 | 2008-04-22 | Canon Kabushiki Kaisha | Process for producing mass transfer device and apparatus for production thereof |
-
1996
- 1996-06-12 JP JP8151046A patent/JPH09329590A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002505006A (ja) * | 1997-06-18 | 2002-02-12 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | 分取クロマトグラフィーによる分離のためのモノリシック吸着剤の使用 |
| JP2002350412A (ja) * | 2001-05-23 | 2002-12-04 | Nobuo Tanaka | 多次元高速液体クロマトグラフ |
| JP2003075420A (ja) * | 2001-09-07 | 2003-03-12 | Kazuki Nakanishi | 高速液体クロマトグラフ |
| US7361278B2 (en) | 2002-07-18 | 2008-04-22 | Canon Kabushiki Kaisha | Process for producing mass transfer device and apparatus for production thereof |
| WO2005015198A1 (ja) * | 2003-08-06 | 2005-02-17 | Nippon Telegraph And Telephone Corporation | 多孔質材料を用いた分子の検出方法ならびに該多孔質材料及び該多孔質材料の製造方法 |
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040203 |
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040402 |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050201 |