JP2010515047A - 有機または複合ポリマーモノリシック担体を含む高速クロマトグラフィーカラム及びその製造法 - Google Patents

有機または複合ポリマーモノリシック担体を含む高速クロマトグラフィーカラム及びその製造法 Download PDF

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Abstract

本発明は、低、中及び高分子量の有機化合物、並びにペプチド、タンパク質、オリゴ及びポリヌクレオチド、オリゴ及び多糖類などの生物有機化合物の分離及び／または精製に適している、連続バイモーダル多孔性を有するポリマーモノリシック担体を含む高速クロマトグラフィーカラムに関する。提案されたカラムは、連続的な多孔性で且つ硬質のポリマー構造をもつモノリシック固定相を含み、シリカベースのアモルファス材料で作られているか、またはそのような材料で内部をライニングした中空の管状支持体を含み、ここでそのような固定相は前記中空の管状支持体の内壁上に共有結合している。このカラムのクロマトグラフィー効率は50,000段/メートルを超える。本発明は、ガンマ線誘導重合プロセスでそのようなモノリシック型カラムを製造する方法にも関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、有機または複合−即ち無機成分との複合−ポリマーモノリシック担体を含む高速クロマトグラフィーカラム及びその製造法に関する。より具体的には、本発明は、新規な高速クロマトグラフィーカラムであって、固定相として、バイモーダル連続的多孔性(bimodal continuous porosity)を備え、即ち、より小さなサイズの拡散孔と、より大きなサイズの対流孔(convective pore)とを備え、任意の種類の有機及び生物有機化合物の分離及び／または精製に適し、ガンマ線照射により誘導される in-situ 重合プロセスにより得られ、モノリシック形態であり、キャピラリーまたはカラムの適切に前処理した内壁に直接固定されたモノリシックポリマー材料を含む、高速クロマトグラフィーカラムに関する。
治療特性をもつターゲット分子の発見及び開発に関連した近年の研究では、高効率、高分離度及び高感受性のスクリーニング手法が求められている。これらの手法の需要は、複雑な混合物のそれぞれの成分を単離し、同定し得る速度によって研究プロジェクト全体速度を限定する因子が表されるこれらの研究分野では、非常に重要である。この状況は、コンビナトリアル合成、ターゲット分子の生物工学的産生、プロテオミクス及び代謝学に由来する低分子量の分子ライブラリの分析などの生物医学研究ではますます頻繁になっている。現在使用されている種々の手法の中でも、高速(HPLC)及び超高速(UPLC)型の液体クロマトグラフィーは、その高い分離度及び利用柔軟性のため最も多面的な装置の一つであり、分取スケールアップにおいて大きな可能性を有する。液体クロマトグラフィーと質量分析法との組み合わせは(たとえばマイクロ及びナノ-LC-ESI-MSn-液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化質量分析法)、分離手法に強力な同定能力を加えている。
公知のように、殆どの慣用のクロマトグラフィー固定相は、カラムの内部に粒子材料を充填することにより製造されており、ここ十年、集中して研究される目的であるモノリシッククロマトグラフィーカラムは(Hjerten，S；Liao，J.L.；Zhang，R．、J.Chromatogr．1989年、473巻、273-275頁(非特許文献１)；Tennikova，T.B.；Reusch，J.、J.Chromatogr．A、2005年、1065巻、13-17頁(非特許文献２)；Benes，M.J.；Horak，D.；Svec，F.、J.Sep.Sci.2005年、28巻、1855-875頁(非特許文献3))、単一部分の非常に多孔性の材料によって得られる連続固体分離媒体から構成されている。これらは、主に高いクロマトグラフィー特性を生み出し得る連続多孔質構造をもつという事実のため、特に透過性に関して従来の充填カラムとは異なっている。多孔質粒子とは異なり、モノリシック材料は、固体の中いたるところに相互接続したチャネルの網状構造を形成している連続孔 (貫通孔：flow through pore)が存在することを特徴とする。
現在、クロマトグラフィー用途用モノリシック材料には主な二つのタイプ：シリカをベースとする無機材料と有機ポリマー材料とがある。シリカベースの無機モノリス(Tanaka、N.；Ebata、T.；Hashizume、K.；Hosoya、K.；Araki、M、J.Chromatogr．1989年、475巻、195-208頁(非特許文献４))は、一般に、カラム(通常、キャピラリーサイズ)内部のゾルのゾル-ゲル転換によって連続的架橋を作るゾル-ゲルプロセス、それに続く乾燥及びエージングプロセスにより製造する。この最終結果は、カラム内部に固体で連続的な多孔性構造を形成することである。
硬質ポリマー構造をもつ有機モノリスは、本質的に三種類の化学(chemistry)：ポリアクリルアミド(Palm，A.；Novotny，M.V.、Anal.Chem.1997年、69巻、4499頁(非特許文献５))；ポリスチレン(Gusev，I.；Huang，X.；Horvath，C.、J.Chromatogr、A1999年、855巻、273-290頁(非特許文献６))、及びポリアクリレート(Peters，E.C.；Petro，M.；Svec，F.；Frechet，J.M.J.、Anal.Chem.1997年、69巻、3646頁(非特許文献７))をベースとしている。ポリマー架橋は、適切な「ポロジェニック(porogenic)」溶媒の存在下、一及び多官能性(通常、二官能性)の重合可能なモノマーから出発する重合プロセスによってカラム内部に形成する。これらの溶媒は、重合プロセスの第一段階の間、反応媒体中でポリマー鎖の溶媒和に影響を与えることによって細孔の形成を制御する（Svec，F.LC-GC、2004年６月、18〜21頁(非特許文献８)）。
種々のタイプのクロマトグラフィー担体の性能を考慮すると、粒子固定相上のクロマトグラフィーカラムでは、溶質は多孔質粒子に浸透し、拡散によりその中を通過するが、対流性キャリヤ(convective carrier)は粒子間間隙に限定されている。液体-固体クロマトグラフィープロセスでは、移動相と固定相との間のタンパク質、核酸、多糖類及び合成ポリマーのような大きな分子の移動は通常非常にゆっくりであるが、低分子量の分子の移動は比較的早い。これは本質的に、大きな分子と小さな分子との間での拡散係数が大きく異なるためである。
この作用は、高速のクロマトグラフィーと同様に、物質移動速度が全体の速度を限定するとき、プロセス全体に悪影響を及ぼす。多孔質粒子中の物質移動をより効率的にする明らかに簡単な方法は、そのサイズと拡散経路を小さくすることである。実際、このように変動させると物質移動にはプラス効果を与えるが、粒子間間隙を低下させてしてしまうので、カラム内を移動相が流れるのに必要な圧力が上昇する。
固定相のモノリシック構成によって表される別のアプローチは、「貫流：flow-through」チャネルサイズと拡散細孔深度をそれぞれ最適化できる。このアプローチによって、物質移動とカラム透過性とを同時に最大化できる(Svec，F.；Huber，C.G.、Anal.Chem. A-ページ、2006年78(7)巻、2100-2107頁(非特許文献９))。
上記の結果、粒子材料の代替的な担体として、連続的多孔性構造を特徴とする不活性材料が使用され、クロマトグラフィー用途に関して研究されてきた。特に、有機型のクロマトグラフィー用途用のモノリシック材料分野を考慮すると、近年の研究から、マクロ多孔性モノリシック有機ポリマー成分からなる固定相によって高速分離を達成できる可能性が示されてきた。具体的には、文献では、バイモーダル多孔性、即ち約100Åのサイズの拡散性細孔(メソ細孔：mesopore)と、およそミクロンサイズの対流性細孔(マクロ孔：macropore)をもち、全多孔度が60％〜80％であることを特徴とするポリメタクリレートベースの有機モノリスが記載されている。この連続的多孔性構造によって、拡散層が減って溶質の対流移動が効率的になるため、高い移動相流と共に、低い圧力低下、高いクロマトグラフィー効率を達成することが可能になる。
液体クロマトグラフィー用途のモノリシック形態で得られるマクロ孔ポリマー材料のさらなる例は、ポロジェニック剤(porogenic agent)の存在下でビニルモノマーの適切な混合物のin situ 重合により得られ、バイモーダル分布の多孔度を有し、金属チューブに含まれた、HPLCに適したモノリシックカラムに関するもので、欧州特許第EP0609373号(特許文献１)(Cornell Research Foundation Inc.、J.M.J.Frechet及びF.Svec)に記載されている。
これらのモノリシック担体の製造は通常、熱ラジカル重合または光化学重合プロセスによって実施する。いずれの場合でもラジカル開始剤は、場合により架橋剤とポロジェニック溶媒と共に、重合可能なモノマーを含む反応混合物中に導入される。
特に、熱重合は通常、加熱すると開裂して、重合プロセスの開始剤として機能するラジカルフラグメントを生成するラジカル開始剤(たとえばアゾ-ビス-イソブチロニトリルまたはジベンゾイルペルオキシド)を反応媒体中に配合して実施する。別法は、水性環境中でのモノリスの製造に適したレドックスプロセスにより発生したラジカル開始剤(たとえばペルオキシジサルフェート及びTEMED(N,N,N,N-テトラメチルエチレンジアミン))をベースとするシステムからなる。
光化学重合は、ラジカル光開始剤の使用と、反応混合物にUVを照射することを想定する(Rohr、T.ら、Macromolecules，2003年，36巻，1677-1684頁(非特許文献１０))。
しかしながら、熱ラジカル重合や光開始剤を使用するラジカル重合によるクロマトグラフィー用のモノリシック担体の上記のような製造には欠点がある。第一の、その主要なものは、開始剤を使用するため、このようにして得られたポリマー生成物中に存在する残渣が、非最適特性の材料を生成しうるということである。たとえば、開始剤に由来する幾つかの末端基が、熱不安定性をもたらす可能性が有り、バイオクロマトグラフィーシステムでは、非特異的な吸着プロセスを生じることがある。
さらに、熱重合は高温で実施するため、低沸点溶媒の使用が除外され、溶媒の熱膨張またはその蒸発のために最終材料中での不規則性も起こることがある。
他方、最終容器(クロマトグラフィーカラム)のまさに内側で実施する光重合プロセスは、UV照射は全ての重合可能な材料に均一に到達することができないので、容器自体(シリカ、ガラス、スチール、PEEK(ポリエーテルエーテルケトン)、PEEKsil(PEEKで被覆した石英ガラス(fused silica)チューブ)、GLT-チュービング(ガラスでライニングしたチュービング：ガラス質状スチール(vitrified steel))などの材料で製造したキャピラリー、マイクロ内径カラム、標準分析カラム、分取カラム)の材料のサイズ及び性質を制限する。
これらの欠点により、モノリスの最終構造に不規則性と非均質性（non-homogenity）、クロマトグラフィー性能に損害が生じ、結果としてカラム特性の再現性が悪くなることがある。かくして、境界明瞭で(well-defined)容易に制御可能な細孔を備えた高効率のカラムを製造でき、且つこれを容易に実施することが可能なモノリシックカラムの代替的な製造法が望まれている。他の望ましい特性は、現在使用されている種々のタイプのカラム(キャピラリー、狭い孔(narrow bore)、標準及び分取カラムなど)及びその構成材料(石英ガラス、スチール、PEEKsil、GLT-チュービングなど)に関しては、高い再現性と使用柔軟性である。考慮すべきさらなる側面は、低温での製造及び、特に固体状態で重合を実施し得る可能性である。
重合プロセスを開始する別法としては、イオン化照射(ionizing radiation)、即ちUVや他の可視光の照射と異なり、電磁照射範囲のX線及びγ線などの、これらと接触したときに原子をイオン化するのに十分なエネルギーをもつ照射の使用が考えられる。照射の使用が考えられる先進ポリマー材料の製造のための放射線誘導重合プロセスの使用には、幾つかの有利な点がある。第一に有利な点は、室温以下でプロセスを実施し得る可能性である。これにより、低沸点の溶媒でさえも使用することが可能になり、溶媒の熱膨張のための最終材料中の不規則性の発生が避けられ、工業レベルでのスケールアップ観点から、潜在的に省エネルギーを意味するだろう。
さらに、ラジカル開始剤の添加に頼らずに重合を実施することができるので、化学純度の高い最終材料を得ることができるということを意味する。最終生成物中に潜在的に存在し得る残渣は、重合しなかったモノマー自体と、イオン化照射によって発生した少量の副生成物だけである。
文献中に記載された殆どの場合において、放射線誘導重合プロセスはγ線により開始される。公知のように、γ線はγ線を発生する同位体60Co、137Csまたは125Iなどの特定の放射性元素の核内で起こる遷移により発生する。放出された光子はモノエネルギー(monoenergy)のものであり、発生した同位体に特異的である。γ線に最も広く使用される放射性同位体はコバルト-60、半減期が5,272年の同位体である。Co-60は1.17と1.33MeVの等しい強度の二種類のγ光子を放出する。Co-60を含む照射装置の好ましい特性(Ganmmacellの名称のもとで公知のようなもの)は、長い半減期、放射線が高浸透力を有することと、製造容易性である。
マクロ孔ポリマーがγ線誘導重合によりモノリシック形態で得られる、液体クロマトグラフィーによる分離または精製などの用途で使用すべきマクロ孔重合性モノリスを製造する実験レベルでの研究については、Agnes Safrany及び共同研究者(Safrany，Aら、Polymer，2005年、46巻、2862-2871頁(非特許文献１１))に記載されている。この場合、メタクリレートポリマー(ジエチレングリコールジメタクリレート)のモノリシックを、Co-60ベースのγ照射源を使用し、種々のポロジェニック溶媒(メタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、酢酸エチル、ジオキサン、アセトニトリル及びテトラヒドロフラン)と種々の照射条件を、１〜50ｋGyを変動する全吸着用量(total absorbed dose)で、並びに種々の温度で実験することにより、in-situ重合のための４mm内径のテフロンチューブから構成されるモールドで製造した。得られた種々のモノリスは、いずれの場合でもテフロンチューブモールドから外した。あるいは、ステンレススチールパイプ(4mm内径)を使用して、次いで重合後に、モノリシックの特徴測定に直接適用した。記載された全ての場合において、その目的は、クロマトグラフィー分離用の連続細孔媒体として使用すべき適切な特徴のモノリシックプラグを製造することであり、ここで重合は、ラジカル開始剤を添加しないで実施していた。
欧州特許第EP0609373号、Cornell Research Foundation Inc.、J.M.J.Frechet及びF.Svec
Hjerten，S；Liao，J.L.；Zhang，R．、J.Chromatogr．1989年、473巻、273-275頁 Tennikova，T.B.；Reusch，J.、J.Chromatogr．A、2005年、1065巻、13-17頁 Benes，M.J.；Horak，D.；Svec，F.、J.Sep.Sci.2005年、28巻、1855-875頁 Tanaka、N.；Ebata、T.；Hashizume、K.；Hosoya、K.；Arai、M、J.Chromatogr．1989年、475巻、195-208頁 Palm，A.；Novotny，M.V.、Anal.Chem.1997年、69巻、4499頁 Gusev，I.；Huang，X.；Horvath，C.、J.Chromatogr、A1999年、855巻、273-290頁 Peters，E.C.；Petro，M.；Svec，F.；Frechet，J.M.J.、Anal.Chem.1997年、69巻、3646頁 Svec，F.LC-GC、2004年６月、18〜21頁 Svec，F.；Huber，C.G.、Anal.Chem. A-ページ、2006年78(7)巻、2100-2107頁 Rohr、T.ら、Macromolecules，2003年，36巻，1677-1684頁 Safrany，Aら、Polymer，2005年、46巻、2862-2871頁
先行技術をベースとして、本発明は、液体クロマトグラフィー用装置の固定相についての上記のような望ましい特徴をもち、ガンマ線誘導重合プロセスによる最終容器(カラム)のまさに内側でのモノマーの重合によって得ることができる、新規なポリマーベースのモノリシック高速クロマトグラフィーカラムを提供することを目的とする。カラムはその構成材料、ポロジェニック溶媒の性質及び、重合温度に関していかなる特定の制限ももつべきではない。
本発明に従って、その内壁を活性化して、形成されるポリマーを前記内壁に共有結合させ得る分子のフラグメントでその内壁を官能基化するためにその内壁が適切に前処理されているクロマトグラフィーカラムのまさに内側での、適切な溶媒の存在下での、モノマーと架橋剤との混合物のガンマ線誘導重合をベースとする製造法を用いて、高効率モノリシックカラムを得ることができることを見出した。このようにして、固定相を構築するモノリスの重合は、キャピラリーまたはカラムのまさに内側で起きて、次いでこれはクロマトグラフィー装置を構成し、そのモノリシック「プラグ(plug)」はそれの容器として機能するカラムと共に単一のボディを構成する。
従って、本発明は具体的には、シリカをベースとするアモルファス材料からなるか、またはそのような材料で内側をライニングした中空の管状支持体を含み、連続的な、ポリマー性で、多孔性で硬質の構造をもつモノリシック固定相を含む、高速液体クロマトグラフィー用のクロマトグラフィーカラムであって、そのような固定相が前記中空の管状支持体の内壁に共有結合していること、及び前記カラムのクロマトグラフィー効率が50,000段/メートルを超え、好ましくは60,000段/メートルを超えることを特徴とする、前記クロマトグラフィーカラムを提供する。さらに、別の特徴的な要素として、本発明に従ったクロマトグラフィーカラムを長期使用後でも保持時間の変動は５％未満である。
提案されたカラムの中空の管状支持体は、その内壁を前処理してその内壁にポリマーを共有結合させることを可能とするいかなるアモルファス状シリカベース材料から構成されていてもよく、特に、石英ガラス、ガラス化スチール若しくはGLT-チュービング、またはPEEKsil若しくはポリエーテルエーテルケトンで被覆した石英ガラスで作られていてもよく、ポリイミドの外部層があってもよい。本発明の中空の管状支持体は、石英ガラスで作られているのが好ましい。
前記中空の管状支持体の内径は、キャピラリーカラムで使用するのに適切であり得、即ち100〜500μｍを変動するか、または別のサイズであってもよい(ナノ内径：25〜100μｍ内径；ミクロ内径1.0〜2.1mm内径；標準内径4.0〜5.0mm内径)。通常、本発明に従った中空の管状支持体は、25μｍ〜５mmの内径を有し、具体的な解決策に従えば、100〜500μｍ(キャピラリー)及び２〜５mm(標準カラム)を変動する。
本発明に従ったクロマトグラフィーカラムの中空管状支持体の長さは通常、10〜100cmを変動する。
本発明により提案されたものによると、モノリシック固定相は、メタクリロイル官能基を含有するシランで前処理することによって中空の管状支持体の内壁に共有結合される(「壁へのグラフト化：grafting to the wall」プロセス)か、または別の手順に従って、モノリシック固定相は、前記内壁に結合したアゾ基を導入することによる活性化前処理によって中空の管状支持体の内壁に共有結合される(壁からのグラフト化)。「壁からのグラフト化」アプローチによって、管状支持体の内壁上にアゾフラグメントを導入することが可能になる。これらのフラグメントは、管状支持体内側の壁から重合プロセスを開始するラジカル種を発生させることができ、管状支持体の内部表面を「活性」官能基化する。
本発明のさらなる側面によると、本発明は、中空の管状支持体と、前記中空の管状支持体の内壁上に共有結合した連続的な多孔性で硬質のポリマー構造をもつモノリシック固定相とを含む高速液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法であって、
ａ）アモルファスシリカベースの材料で作られているか、若しくはそのような材料で内部ライニングされた中空の管状支持体を製造すると共に、エッチングによってその内壁を前処理し、続いてメタクリロイル官能基を含有するシランで処理するか、または前記内壁に共有結合したアゾ基を導入する；
ｂ）モノマーと架橋剤とポロジェニック剤との脱気混合物を前記管状支持体に添加する；
ｃ）ガンマ線で照射して前記混合物を重合させる；
ｄ）重合後にカラムを洗浄して、重合しなかったモノマーと溶媒とを除去する、
の各段階からなる、前記方法にも関する。
本発明に従って使用するモノマーは、ガンマ線誘導重合プロセスで反応することができる官能基と、クロマトグラフィープロセスの間に溶質と相互作用可能な一つ以上の官能基(逆相クロマトグラフィーでは耐水性相互作用のためアルキル基、順相クロマトグラフィーでは極性基、イオンクロマトグラフィーではイオン交換相互作用のためイオン化可能なまたはイオン化基)とを含む、低分子量の有機化合物である。一般に、モノマー化合物は、アルコール若しくはジオール、アミンまたはジアミンとのアクリル酸またはメタクリル酸の誘導体であってもよい。二官能性モノマー(ジオールまたはジアミンの誘導体)は架橋剤として作用する。あるいは、モノマー及び架橋剤は、スチレン及びジビニルベンゼンの誘導体によって表すことができる。
本発明の具体的な態様によると、モノマーと架橋剤との当該混合物は、以下の化合物の対の一つを含む：アクリレートモノマー及びジアクリレートモノマー、メタクリレートモノマー及びジメタクリレートモノマー、メタクリレートモノマー及びトリメタクリレートモノマー、メタクリレートモノマー及びテトラメタクリレートモノマー、アクリレートモノマー及びポリエチレングリコールジアクリレート、メタクリレートモノマー及びポリエチレングリコールジメタクリレート、スチレンモノマー及びジビニルベンゼン、アクリルアミドモノマー及びN,N’-メチレンビスアクリルアミド。
特に、モノマーと架橋剤との混合物は、以下の式：
Figure 2010515047
｛式中、Rは置換されていてもよい直鎖アルキル基、置換されていてもよい、フェニル、ビフェニル、ベンジル若しくはアリールC1-C10アルキル基、ペルフルオロアルキル基であるか、またはエポキシ、シアノ、カルボキシ、スルホン、ジアルキルアミン、トリアルキルアンモニウム基及び二若しくは多官能性モノマーから選択された官能基を含む分子基(molecular radical)である｝を有するメタクリレートモノマーを含むことができる。
他の具体的な解決法によると、モノマーと架橋剤との当該混合物は、以下の式：
Figure 2010515047
｛式中、Rは置換されていてもよい直鎖アルキル基、置換されていてもよい、フェニル、ビフェニル、ベンジル若しくはアリールC1-C10アルキル基、ペルフルオロアルキル基であるか、またはエポキシ、シアノ、カルボキシ、スルホン、ジアルキルアミン、トリアルキルアンモニウム基及びジビニルベンゼンから選択された官能基を含む分子基である｝を有するスチレンモノマーを含む。
メタクリロイル官能基を含有するシランを用いる本発明に従ったクロマトグラフィーカラムの管状支持体の内部表面の前処理は、好ましくは、2,2’-ジフェニル-1-ピクリル-ヒドラジルラジカル(DPPH)を含むトルエン中、3-(トリメトキシシリル)-プロピルメタクリレートの溶液で前記中空の管状支持体を充填し、好ましくは110℃で６時間加熱することによって実施する。
本発明に従った活性官能基化の前処理を実施する場合、管状支持体の内壁に共有結合したアゾ基の導入は、無水トルエン中の3-アミノプロピルトリエトキシシランの第一の溶液で前記中空の管状支持体を充填し、加熱し、洗浄し、乾燥し、続いて等しい割合で以下の組成：
A)無水トルエン中の1-メトキシ-2-メチル-1-(トリメチルシロキシ)プロパン；
B)無水THF中の4,4’-アゾビス-4-シアノバレリアン酸クロリド
を有する二つの溶液で充填し、洗浄し、乾燥することにより実施する。前記第一の溶液との処理の間、混合物は好ましくは90℃で３時間加熱し、本発明の具体的な方法では、溶液A)とB)は等しい割合であり、室温で50分間、前記管状支持体中に保持する。
本発明に従ったクロマトグラフィーカラムの固定相を構築する有機モノリシック材料を製造し、走査電子顕微鏡(SEM)、赤外分析分光法FT-IR(DRIFT、ATR、透過)、FT-ラマン、13C CP-MAS NMR、熱重量分析(TGA)、示差走査熱量測定(DSC)、水銀ポロシメータ及びBETにより特性決定した。
キャピラリーカラム(内径50〜500μｍ、長さ100cm以下)は、クロマトグラフィー試験(ナノ-マイクロ-HPLC、フローカーブ分析、ISEC、液体流に対する機械抵抗(40MPaまで）、透過性の測定)及び膨潤試験によって特性決定した。
以下の記載からより明らかになるように、本発明に従って製造したナノ−、キャピラリー及び標準分析カラムは、以下の利点を有する：
・再現性の高い条件で容易に製造できる；
・化学的、機械的及び熱的に安定であり、これにより、酸及び塩基修飾剤(HCOOH、CH3COOH、CF3COOH、Et3N)を含む有機及び水性溶媒並びに超臨界流体と共に、そして極端な温度(−80℃〜＋100℃)で使用するのに適する；
・少ない拡散層を有する連続多孔性構造による、高いクロマトグラフィー効率と高い透過性。これは、クロマトグラフィー材料を溶離液の非常に高い線速度条件での小さな分子量及び中程度の分子量の分子、並びに生物学的高分子の分析に適するものとすることができる；
・適用範囲が広い。
本発明の具体的な特徴、並びにその好都合な点及び関連する操作様式は、実施した実験結果及び従来技術との比較用データと共に、以下に記載する単に説明の目的のために提供された詳細な説明を参照することによりより明らかになろう。実験結果は付記図面でも説明されている。
図１は、ガンマ放射線により誘導した重合による、本発明に従ったモノリシック材料の製造方法を示す。 図２は、同一モノリシック材料を含む、本発明に従った石英ガラスキャピラリークロマトグラフィーカラムの製造方法を図式的に示す。 図３は、実施例で示した手順をベースとする、図１及び２で図示した手順に従って製造したモノリシック材料(a)の二種類の異なる拡大の走査電子顕微鏡(SEM)画像である。 図４は、実施例で示した手順をベースとする、図１及び２で図示した手順に従って製造したキャピラリーカラム(b)の二種類の異なる拡大の走査電子顕微鏡(SEM)画像である。 図５は、実施例に従って製造したモノリシックサンプルで実施したDEC(A)とTGA(B)分析を示す。 図６は、実施例に従って製造したキャピラリーカラムの、溶離液の線速度の関数としての操作圧力値の一次従属を示す；カラム250*0.25mm；溶離液：ACN/H2O 60/40；透過性：K0/m2＝5.58。 図７は、実施例に従って製造したカラムのバンデームタープロットを示す；カラム250*0.25mm；溶離液ACN/H2O 60/40；T=25℃；溶質：
Figure 2010515047
 図８は、実施例に従って製造したキャピラリーカラム上の、溶離液の種々の線速度を使用して得た芳香族溶質の混合物のクロマトグラフィー分離のクロマトグラムを示す；クロマトグラムA：流速3.0μl/分、線速度1.44mm/秒、溶質１〜５、(k’；N/m)：ウラシル(k’=0)、ベンズアルデヒド（0.43；31316）、ニトロベンゼン(0.76；30444)、エチルベンゼン(1.83；31084)、ブチルベンゼン(3.44；24812)；クロマトグラムB：流速2.0μl/分、線速度0.952mm/秒、溶質１〜５、(N/m)；ウラシル、ベンズアルデヒド(46504)；ニトロベンゼン(40980)；エチルベンゼン(42876)；ブチルベンゼン(33388)；クロマトグラムC：流速0.5μl/分、線速度0.235mm/秒、溶質１〜５、(N/m)；ウラシル、ベンズアルデヒド(63772)；ニトロベンゼン(62820)；エチルベンゼン(65235)；ブチルベンゼン(62692)；カラム250*0.25mm；溶離液ACN/H2O 60/40；T=25℃；圧縮空気インジェクタ、注入容積60nl；UV検出、214nm、AUFS：0.05。 図９は、連続する５回の反復試験のクロマトグラフィーパラメーターの再現性を示す；カラム：250*0.25mm；溶離液：A：ACN/H2O 95/5；B：ACN：A/B 42/58；流速３μ/分；圧縮空気インジェクタ、注入容積60nl、UV検出、214nm、AUFS：0.05。 図１０は、実施例に従って製造した二つの、内径だけが違う二つのモノリシックキャピラリーカラム(長さ：25cm；直径：0.250(A)及び0.320mm(B)）上で得られた、芳香族溶質の混合物のクロマトグラフィー分離の二つのクロマトグラムを示す；溶離液：ACN/H2O 60/40；T=25℃；圧縮空気インジェクタ；注入容積60nl；UV検出、214nm、AUFS：0.05；溶質１〜５：ウラシル、ベンズアルデヒド、ニトロベンゼン、エチルベンゼン、ブチルベンゼン；A：フロー2.0μl/分、ΔP=691psi；線速度0.952mm/秒；B：フロー3.15μl/分、ΔP=470psi、線速度1.001mm/秒。 図１１は、実施例に従って製造した三つの、内径だけが違うモノリシックキャピラリーカラム(長さ：50cm；直径：0.100(A)、0.250(B)及び0.320mm(C) )上で得られた、芳香族溶質の混合物のクロマトグラフィー分離の三つのクロマトグラムを示す；溶離液：ACN/H2O 60/40；T=25℃；圧縮空気インジェクタ；注入容積60nl；UV検出、214nm、AUFS：0.05；溶質１〜９：ウラシル、チオウレア、フェノール、ベンズアルデヒド、ニトロベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、プロピルベンゼン、ブチルベンゼン；A：フロー0.250μl/分、ΔP=900psi；線速度1.005mm/秒；B：フロー1.850μl/分、ΔP=880psi、線速度1.001mm/秒；C：フロー3.000μl/分、ΔP=755psi、線速度0.940mm/秒。 図１２は、実施例に従って製造したキャピラリーカラムによるペプチド混合物のクロマトグラフィー分離を示す；カラム250*0.32；溶離液：A：H2O＋0.05％TFA；溶離液B：ACN/H2O 80/20＋0.04％TFA、グラジェント 100％A(１分保持)から50％Aに15分で；フロー7.00μl/分；T=50℃；UV検出、214nm；溶質：アンギオテンシンI、II及びIIIの混合物。 図１３は、実施例に従って製造したキャピラリーカラムによるタンパク質の混合物のクロマトグラフィー分離を示す；カラム：250*0.32；溶離液：A：H2O＋0.05％TFA；溶離液B：ACN/H2O 80/20＋0.04％TFA、グラジェント ９５％A(１分保持)から８０％Aに0.01分で、１分保持、20％Aに15分で；フロー7.00μl/分；T=50℃；UV検出、214nm；溶質１〜４：リボヌクレアーゼ、チトクロームC、リゾチーム、ウシ血清アルブミン。
本発明の実施例に従って、キャピラリーカラム内側の重合プロセスは、以下に示すスキームに従って、ポロジェニック溶媒として1-プロパノール、1,4-ブタンジオールと水の存在下、モノマーとしてブチルメタクリレートとエチレングリコールメタクリレートを使用する。照射量は室温で20kGyであった。
得られたポリマー(A)は、以下の式のメタクリル酸架橋ポリマーであった。
Figure 2010515047
モノリシックカラムの製造
本発明に従ったモノリシック材料とクロマトグラフィーカラムの製造スキームは図１及び２である。後者にはキャピラリー壁(１)、内径diと、ポリアミド層から構成される前記壁の外部ライニング(２)を指す矢印がある。多孔質モノリス(３)は、その段階が図２に列記されている提案されたプロセスを適用した後にキャピラリー(１)の内側に形成される。
ａ）キャピラリーの前処理
a1)エッチング
手順a1.1)
記載された手順は、130μｍを超える壁厚の石英ガラスカラム上でのみ使用することができる。というのもこの処理により壁が脆弱になるからである。高い表面積の内壁をもつキャピラリーカラムを製造するためにこれを使用する。石英ガラスキャピラリーカラム(300×0.100mm)は、メタノール中、(NH4)HF2の飽和溶液でシリンジ充填され、25℃で１時間放置される。次いでこのキャピラリーがメタノール５ml、50/50メタノール/水、水、メタノールで洗浄され、窒素フロー(T=25℃、P：20psi、１時間)で洗浄される。
手順a1.2)
この「穏やかな」手順は、任意の壁厚の石英ガラスキャピラリーで使用可能な唯一のものである。キャピラリーは、温度範囲40〜90℃で、１N水酸化ナトリウム水溶液中で２時間処理され、次いで中性になるまで二回蒸留したH2Oで洗浄され、室温で0.1N塩酸水溶液で１時間処理され、最後に水とメタノール５mlずつで連続して洗浄される。
2A）シラン化
手順a2.1)（壁へのグラフト化）
(メタクリレートを介する活性化)シリンジを使用して、キャピラリーが、0.005％p/vの2,2’-ジフェニル-1-ピクリル-ヒドリルラジカル(DPPH)を含む50/50v/vの3-(トリメトキシシリル)プロピル-メタクリレート/トルエンの溶液で充填される。このキャピラリーを110℃で６時間加熱し、冷却後、トルエンとメタノール５mlずつで逐次的に洗浄し、最終的に窒素中で乾燥する。
手順a2.2)（壁からのグラフト化）
(アゾを介する活性化)シリンジを使用して、キャピラリーに、無水トルエン中3-アミノプロピル-トリエトキシ-シランの溶液(10％v/v)を充填し、90℃で３時間加熱し、冷却後、トルエン５mlで洗浄し、窒素中で乾燥する。
次いで二種類の溶液を製造する：
A：無水トルエン中1-メトキシ-2-メチル-1-(トリメチルシロキシ)プロペン(20％v/v)；
B：無水THF中4,4’-アゾ-ビス-4-シアノバレリアン酸クロリド(3.33％w/v)。
キャピラリーに、等しい割合の溶液AとBを混合して製造した溶液をシリンジで充填し、室温25℃で50分保持し、最終的にトルエンで洗浄し、窒素中で乾燥する。
ｂ）モノマー、架橋剤とポロジェニック溶媒を含む重合溶液の製造
モノマー：ブチルメタクリレート(0.586ml、ｄ＝0.895g/ml、全モノマーの60.1重量％に等しい)とエチレングリコールジメタクリレート(0.389ml、d=1.051g/ml、全モノマーの39.9重量％に等しい)をポロジェニック溶媒1-プロパノール(1.210ml、d=0.804g/ml、全ポロゲンの53.2重量％に等しい)、1,4-ブタンジオール(0.837ml、d=1.014g/ml、全ポロゲンの36.8重量％に等しい)及びH2O(0.227ml、d=1.000g/ml、全ポロゲンの10重量％に等しい)に溶解した。モノマー/ポロゲン重量比は31.2/68.8に等しい。
ｃ）重合溶液でキャピラリーを充填する
重合溶液は、室温で５分間、ヘリウムを散布することによって脱気する。わずかにアルゴン圧をかけて、次いでこれを不活性雰囲気中でキャピラリーに導入する。キャピラリーカラムの端部は最終的にシリコン化ゴム体でシールする。
ｄ）ガンマ放射線誘導重合
重合溶液を充填したキャピラリーをGammacell内側に置き、温度25℃、用量20、30または40kGyで、約２kGy/時間の適用率(administration rate)で照射する。
ｅ）多孔性モノリシックポリマーを含むキャピラリーの洗浄
キャピラリーは、マイクロ-HPLC用装置に接続し、一定圧力(10MPa)のもと、アセトン(約50カラムデッドボリューム)で洗浄する。
モノリスの化学-物理的特性決定と、モノリスを含むキャピラリーのクロマトグラフィーによる特性決定
モノリスの化学-物理的特性決定
モノリシックポリマー材料の化学-物理的特性決定は、閉鎖シリンダー状スチール容器50×4.0mmサイズ中で得られたモノリシックで実施した。キャピラリー内側の重合に関する先の実施例で記載した条件でガンマ照射後に得られたポリマー材料は、アセトン、メタノール、及びアセトン10mLずつで逐次的に洗浄し、次いで140℃で12時間、減圧(0.1mmHg)下で乾燥する。
走査電子顕微鏡
モノリスの約２mm2の部分を、両面テープを使用してサンプルホルダーに付け、金薄膜をスパッタリングして被覆した。同様の処理は、アセトン洗浄と窒素中の乾燥後に、モノリシックを含むキャピラリーの部分に実施した。SEM分析は、500倍、5000倍及び10000倍の拡大率で画像を記録することによりモノリシック材料上で実施した。SEM分析は、500倍、5000倍及び10000倍の拡大率で画像を記録することにより、モノリシック材料を含むキャピラリー上で実施した。
図３に示されているように、ポリマー材料は、低拡大率では一様に見え、高拡大率では、連続的な多孔性構造を示しており、材料の均質な細孔構造と寸法が観察される。細孔寸法は0.5から２〜３μｍを変動する。図４に示されているように、モノリシックを含むキャピラリーの分析により、後者はキャピラリー（４）自体の壁によく接着していることがわかる。キャピラリー（４）の内壁上には顕著な不連続性は全く観察されないので、キャピラリー自体の官能基化壁とポリマー材料との間の結合は安定であることが確認される。その長さに沿ったキャピラリーの様々な部分でも、モノリシックの構造にもキャピラリー壁への接着能力にも明らかな違いは全く見られない。
振動分光法
FT-IRスペクトルは、DRIFTモード(拡散反射率)、ATR(減衰全反射)及び透過率においてモノリシック材料について記録した。全ての場合において、スペクトルは、それぞれ1720-1730と1130-1140cm-1におけるエステルカルボニルの伸縮とC-O一重結合の伸縮とによるバンドによって決定づける。出発物質のメタクリレートのC=C二重結合の伸縮によるバンド(1640cm-1)は現れているが、強度は非常に弱いので、放射線誘導重合プロセスでオレフィン結合が殆ど完全に転換したことを示している。
ATRモードで記録したラマンスペクトルも、エステルフラグメントの特徴的なバンドと、残存オレフィン性二重結合による低い強度の幾つかの吸収をはっきりと示している。
固体状態核磁気共鳴分光法( 13 C CP MAS NMR)
モノマーと架橋剤の構造をベースとして予想された全てのシグナルが観察されている。エステルカルボニル(176ppm)、アルコール部分の炭素(63、30、18及び13ppm)及びポリマー骨格の炭素(44及び54ppm)によるはっきりしたサインがある。出発物質のモノマーのオレフィン性炭素によるシグナル(125と135ppmの間)はない。
熱重量分析(TGA)及び示差走査熱量測定(DSC)
図５に示されているように、温度範囲25〜600℃で実施したTGAは、220℃までは安定性を示している。温度400℃までは重量減少が観察され、400〜600℃の間では完全に熱分解及び揮発した。
モノリシック材料を含むキャピラリーカラムのクロマトグラフィーによる特性決定
直径250μｍ、長さ25cmのキャピラリーカラムをクロマトグラフィーの特性決定に使用した。アセトンとメタノールで洗浄した後、モノリシックカラムを室温で移動相で平衡させる。クロマトグラフィー効率は、標準的な溶質の混合物の種々のフロー分析で評価した。キャピラリー内側のモノリスの機械的安定性は、溶離液フローの関数として操作圧力値を記録することにより評価した(Ｐmax30〜40MPa)。
図６は、0.05〜3.05mm/秒の速度範囲では、溶離液の線速度と操作圧力との間には厳密に線形変化があることを示しており、これは圧力ストレス(pressure stress)に呼応したクロマトグラフィー床の圧縮現象が全くないことを示している。
クロマトグラフィー効率のデータ(図７)は、本発明に従って製造したキャピラリーカラムは、50,000〜60,000段/mのクロマトグラフィー効率を、効率曲線の最小領域での溶離液の線速度(0.500〜1.00mm/秒の間で線速度)と共に有することを示している。クロマトグラフィーのピークの非対称性も非常に低く、通常1.10よりも低い。
用途
応用例−以下の例は、本発明の有利な点を説明するために設けたものであり、本発明の範囲をいかなるものにも限定するものではない。
一連の実際の用途において、実施例により製造したキャピラリーカラムは、グラジェントでの溶離及びUV検出を使用して、芳香族溶質、ペプチド及びタンパク質の数種の混合物の分離で使用した。図８〜１３に示されているように、短時間で完全な分離が可能であり、クロマトグラフィーのピークもかなり対称性である。
現在、キャピラリー内側での放射線誘導重合プロセスによって、ナノ-及びミクロ-HPLC及びLC-MS用途用の高効率マイクロカラムを製造することが可能である。潜在的な適用分野は、低分子量の分子(医薬品、ペプチド、殺虫剤、農薬、食品添加物)及び生体分子(タンパク質、オリゴヌクレオチド、RNAフラグメント、DNA、多糖類)の分析である。
具体的な態様を参照して本発明を開示してきたが、当業者には、請求の範囲に定義された本発明の範囲を逸脱することなく変形及び変更が可能であることは理解されよう。

Claims (19)

  1. シリカをベースとするアモルファス材料で作られているか、またはそのような材料で内側をライニングした中空の管状支持体を含み、連続的な、ポリマー性で多孔性で硬質の構造をもつモノリシック固定相を含む高速液体クロマトグラフィー用のクロマトグラフィーカラムであって、そのような固定相が前記中空の管状支持体の内壁に共有結合していること、及び前記カラムのクロマトグラフィー効率が50,000段/メートルを超えることを特徴とする、前記クロマトグラフィーカラム。
  2. 前記カラムのクロマトグラフィー効率が60,000段/メートルを超える、請求項１に記載のクロマトグラフィーカラム。
  3. 前記中空の管状支持体が石英ガラス、ガラス化スチール若しくはGLT-チュービング、またはPEEKsil若しくはポリエーテルエーテルケトンでライニングした石英ガラスで作られている、請求項１または２に記載のクロマトグラフィーカラム。
  4. 前記中空の管状支持体が石英ガラスで作られている、請求項３に記載のクロマトグラフィーカラム。
  5. 前記中空の管状支持体の内径が25μｍ〜５mmである、請求項１〜４のいずれか1項に記載のクロマトグラフィーカラム。
  6. 前記中空の管状支持体の内径が100μｍ〜500μｍである、請求項５に記載のクロマトグラフィーカラム。
  7. 前記中空の管状支持体の内径が２mm〜５mmである、請求項５に記載のクロマトグラフィーカラム。
  8. 前記中空の管状支持体の長さが10〜100cmである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のクロマトグラフィーカラム。
  9. 前記モノリシック固定相が、メタクリロイル官能基を含有するシランで前処理することによって前記中空の管状支持体の内壁上に共有結合している、請求項１〜８のいずれか1項に記載のクロマトグラフィーカラム。
  10. 前記モノリシック固定相が、前記内壁上に結合したアゾ基を導入することによる活性化前処理によって前記中空の管状支持体の内壁上に共有結合している、請求項１〜８のいずれか1項に記載のクロマトグラフィーカラム。
  11. 中空の管状支持体と、前記中空の管状支持体の内壁上に共有結合した連続的な、多孔性で硬質のポリマー構造をもつモノリシック固定相とからなる高速液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法であって、
    ａ）シリカベースのアモルファス材料で作られているか、若しくはそのような材料で内部ライニングされた中空の管状支持体を製造すると共に、エッチングによってその内壁を前処理し、続いてメタクリロイル官能基を含有するシランで処理するか、または前記内壁に共有結合したアゾ基を導入する；
    ｂ）モノマーと架橋剤とポロゲニック剤との脱気混合物を前記管状支持体に添加する；
    ｃ）ガンマ線を照射して前記混合物を重合させる；
    ｄ）重合後にカラムを洗浄して、重合しなかったモノマーと溶媒とを除去する、
    の各段階からなる、前記方法。
  12. モノマーと架橋剤との前記脱気混合物は、以下の化合物の対の一つを含む、請求項１１に記載の方法：アクリレートトモノマー及びジアクリレートモノマー、メタクリレートトモノマー及びジメタクリレートモノマー、メタクリレートトモノマー及びトリメタクリレートモノマー、メタクリレートトモノマー及びテトラメタクリレートモノマー、アクリレートモノマー及びポリエチレングリコールジアクリレート、メタクリレートモノマー及びポリエチレングリコールジメタクリレート、スチレンモノマー及びジビニルベンゼン、アクリルアミドモノマー及びN,N’-メチレンビスアクリルアミド。
  13. モノマーと架橋剤との前記脱気混合物は、以下の式：
    Figure 2010515047
     ｛式中、Rは置換されていてもよい直鎖アルキル基、置換されていてもよい、フェニル、ビフェニル、ベンジル若しくはアリールC1-C10アルキル基、ペルフルオロアルキル基であるか、またはエポキシ、シアノ、カルボキシ、スルホン、ジアルキルアミン、トリアルキルアンモニウム基及び二若しくは多官能性モノマーから選択された官能基を含む分子基である｝を有するメタクリレートモノマーを含む、請求項１１に記載の方法。
  14. モノマーと架橋剤との前記脱気混合物は、以下の式：
    Figure 2010515047
     ｛式中、Rは置換されていてもよい直鎖アルキル基、置換されていてもよい、フェニル、ビフェニル、ベンジル若しくはアリールC1-C10アルキル基、ペルフルオロアルキル基であるか、またはエポキシ、シアノ、カルボキシ、スルホン、ジアルキルアミン、トリアルキルアンモニウム基及びジビニルベンゼンから選択された官能基を含む分子基である｝を有するスチレンモノマーを含む、請求項１１に記載の方法。
  15. メタクリロイル官能基を含有するシランによる前記処理は、2,2’-ジフェニル-1-ピクリル-ヒドラジルラジカル(DPPH)を含むトルエン中の3-(トリメトキシシリル)-プロピルメタクリレートの溶液で前記中空の管状支持体を充填することによって実施する、請求項１２〜１４のいずれか1項に記載の方法。
  16. 前記処理の間に、反応物を１１０℃で６時間加熱する、請求項１５に記載の方法。
  17. 請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法であって、前記内壁への共有結合したアゾ基の導入は、無水トルエン中の3-アミノプロピルトリエトキシシランの第一の溶液で前記中空の管状支持体を充填し、加熱し、洗浄し、乾燥し、続いて、等しい割合で以下の組成：
    A)無水トルエン中の1-メトキシ-2-メチル-1-(トリメチルシロキシ)プロペン；
    B)無水THF中の4,4’-アゾビス-4-シアノバレリアン酸クロリド
    を有する二つの溶液で充填し、洗浄し、乾燥することにより実施する、前記方法。
  18. 前記第一の溶液での前記処理の間に、反応物を９０℃で３時間加熱する、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記溶液A)とB)が等しい部であり、室温で５０分間、前記管状支持体中に保持される、請求項１６に記載の方法。
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