JPH09318634A - グルコース濃度の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 全血状態の試料のグルコース濃度の測定方法
を提供する。 【解決手段】 グルコースセンサー法による全血試料の
グルコース濃度（ＧＬ）の測定を、(a)試料のＧＬは、
その試料についての平衡点法によるグルコース濃度測定
値（ＥＰ）および一次微分法によるグルコース濃度測定
値（ＤＩ）を用いて式(１):ＧＬ＝ＥＰ＋ａ×（ＥＰ−
ＤＩ）＋ｂ［式中、ａおよびｂは定数である。］で表
し、(ｂ)ＧＬが既知の種々の全血試料についてＥＰおよ
びＤＩを得、(ｃ)得られたＥＰおよびＤＩを式(１)に適
用することにより、定数ａおよびｂを予め求めておき、
(ｄ)グルコース濃度が未知の試料について、ＥＰおよび
ＤＩを得、(ｅ)得られたＥＰおよびＤＩならびに工程
(ｃ)において求めたａおよびｂを式(１)に適用してＧＬ
を求めることにより実施する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、グルコース濃度の
測定方法、特に、全血状態でグルコース濃度を測定する
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】医療分野、医学的研究分野等において、
血液（または血漿、場合により血清）中のグルコース濃
度の測定が必要とされ、そのために種々の方法が提案さ
れ、また、実施されている。

【０００３】そのような方法の中で、広く採用されてい
る方法の１つにバイオセンサーを用いる血液中のグルコ
ース濃度の測定方法がある。良く知られているように、
この測定方法は、一般的にグルコースセンサー法と呼ば
れ、グルコース分解酵素であるグルコースオキシダーゼ
（ＧＯＤ）を用いて試料中のグルコースを分解し、その
時に生成する分解生成物である過酸化水素量や消費され
る酸素量を電気化学的に測定し、測定結果から試料中の
グルコース濃度を求めることを測定原理とするものであ
る。

【０００４】このようなグルコースセンサー法は、試料
の複雑な前処理を必要とせずに高感度でグルコース濃度
を測定できるので、特に糖尿病の診断や治療に幅広く使
用され、具体的には、ＧＯＤを固定化した膜と過酸化水
素電極とを組み合わせた測定装置（グルコースセンサ
ー）がこの方法にしばしば用いられている。例えば、こ
の方法を用いるグルコース濃度測定装置として、株式会
社京都第一科学から商品名ＧＡ−１１４０装置が市販さ
れている。グルコースセンサー法によりグルコース濃度
を測定する場合、従来は、血液を遠心分離して血球部分
を分離した上澄み液（通常は血漿、場合により血清）を
採取し、これを適当な緩衝液により希釈し、グルコース
センサー法を用いてグルコースの分解速度を測定してい
た。

【０００５】このようなグルコースセンサー法を用いる
に際して、全血状態の血液を用いずに、遠心分離した血
液から上澄み液（血漿または血清）をサンプリングして
いたのは、血球は相当量の固形分（通常、約２５〜４５
％）を含むため、サンプリングした試料に血球が含まれ
ている場合、緩衝液による試料の希釈倍率が、見掛けの
倍率((緩衝液＋全試料）／全試料）と真の倍率((緩衝液
＋試料中の液体分）／試料中の液体分）とで異なり、血
球の含まれる割合が既知でなければ、求めたい真の倍率
が判らないからである。従って、全血状態でのグルコー
ス濃度の測定は困難であった。

【０００６】このような背景のもと、全血状態のままで
グルコース濃度を測定する方法として、平衡点法、一次
微分法および二次微分法のような高次微分法から選択さ
れる２種類の方法を用いて血球体積割合、即ち、血球お
よび液体成分から成る試料中における血球の体積割合を
求め、それに基づいて真の希釈倍率を求めて測定値（生
データ）を補正することによりグルコース濃度を求める
方法が特公平７−３７９９１号公報に記載されている。

【０００７】この公報に記載の平衡点法および一次微分
法は、次のような事項に基づくものである：全血は主に
血清（または血漿）および血球から成り、血球はその内
部に液体成分を含み、この液体成分は血清中のグルコー
ス濃度に等しい濃度でグルコースを含んでいる。通常、
上述のような特公平７−３７９９１号公報に記載の方法
では、全血試料をＧＯＤ−過酸化水素電極反応系で測定
する場合、試料は等張の緩衝液により８０〜１００倍程
度に希釈される。この場合、血球内の液体中のグルコー
スは１０秒程度で緩衝液中に移動（溶出）して平衡状態
となる。

【０００８】平衡点法では、このような平衡状態に到達
した後のグルコース濃度を測定することになるので、血
球内の液体および血清に含まれているグルコース濃度が
測定される。しかしながら、平衡点法を用いるとして
も、全血試料について測定する場合には、血球膜のよう
な固形分を含むので、上述のように真の希釈倍率が判ら
ない。また、見掛けの希釈倍率は真の希釈倍率より小さ
くなるので、平衡点法により測定されるグルコース濃度
は真のグルコース濃度よりも小さい測定値として得られ
る。

【０００９】一次微分法により全血試料のグルコース濃
度を測定する場合、過酸化水素電極の出力（電流値）の
時間的変化量（出力の速度の概念）は試料注入後２秒程
度で極大（最大）値に達する。一次微分法による測定も
平衡点法と変わるところはなく、真の希釈倍率は判らな
い。この場合においても、試料が希釈された時に、血球
内のグルコースは血球から緩衝液中に溶出しようとす
る。しかしながら、平衡点法と比較すると、極大値まで
の時間が相当短く、血球膜という抵抗も存在するので、
一次微分法により測定されるグルコース濃度は血清中の
グルコースのみに起因する濃度であると近似できる場合
が多い。特公平７−３７９９１号公報に記載の方法では
この近似を平衡点法と組み合わせて利用している。

【００１０】しかしながら、種々の検討を重ねていく
と、一次微分値の極大値を得る例えば２秒程度の時間内
であっても、血球内の液体中のグルコースが溶出しよう
とするのは確かであり、しかも、血球の割合が大きい場
合には各血球からの溶出量がわずかであっても溶出する
総量としては血球から緩衝液内へのグルコースの溶出を
無視し得ない場合があることが判った。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】従って、血球から緩衝
液への溶出がある場合であってもその影響を受けず、全
血状態のままで血液のグルコース濃度を測定する方法が
提供されれば、より向上した精度でグルコース濃度の測
定が可能となり、また、従来の測定方法では必要とされ
ていた遠心分離工程を省略することができる。即ち、全
血状態でのグルコース濃度の測定を可能にすることがで
きる。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明の第１の要旨にお
いて、グルコースセンサー法により、血球および液体成
分を含んで成る試料のグルコース濃度（ＧＬ）を測定す
る方法であって、（ａ）試料のグルコース濃度（ＧＬ）
を、その試料についての平衡点法によるグルコース濃度
測定値（ＥＰ）および一次微分法によるグルコース濃度
測定値（ＤＩ）を用いて ＧＬ＝ＥＰ＋ａ×（ＥＰ−ＤＩ）＋ｂ （１） ［式中、ａおよびｂは定数である。］で表すこと、
（ｂ）グルコース濃度（ＧＬ）が既知の種々の試料につ
いて平衡点法によるグルコース濃度測定値（ＥＰ）およ
び一次微分法によるグルコース濃度測定値（ＤＩ）を得
ること、（ｃ）得られた測定値（ＥＰおよびＤＩ）を式
（１）に適用することにより、定数ａおよびｂを予め求
めること、（ｄ）グルコース濃度が未知の試料につい
て、平衡点法によりグルコース濃度測定値（ＥＰ）を得
ると共に、一次微分法によりグルコース濃度測定値（Ｄ
Ｉ）を得ること、（ｅ）工程（ｃ）において求めた定数
ａおよびｂならびに工程（ｄ）において得られた測定値
（ＥＰおよびＤＩ）を式（１）に適用することにより、
グルコース濃度（ＧＬ）を求めることを特徴とする方法
を提供する。

【００１３】本発明の第２の要旨において、上述の第１
の要旨のグルコースセンサー法により血球および液体成
分を含んで成る試料のグルコース濃度（ＧＬ）を測定す
る方法を実施するための回路を含むグルコース濃度測定
システムを提供する。本発明の方法において、定数ａお
よびｂは、使用する測定装置、特に電極系によって決ま
る値である。

【００１４】本発明において、血球とは、赤血球、白血
球および血小板から選択される少なくとも一種を意味
し、実際的には主として赤血球から成るものを意味す
る。液体成分とは血球の外部に存在する液体、例えば血
漿、血清などを意味する。従って、血球および液体成分
を含んで成る試料とは、例えば通常の生体（生物、特に
ヒト）から採取した全血としての血液を意味するが、こ
れに限定されるものではなく、予め分離されている血液
の種々の液体成分および血球成分を混合したものであっ
てもよい。

【００１５】本発明において、試料のグルコース濃度
（ＧＬ）とは、その試料に含まれる液体成分中のグルコ
ース濃度のことである。また、本発明において、グルコ
ースセンサー法とは、酵素としてグルコース分解酵素、
例えばグルコースオキシダーゼ（通常は適当な支持体に
固定化されたもの）を用いて、液体部分に溶解している
グルコースを分解し、その時に生成する過酸化水素量お
よび／または消費される酸素量を過酸化水素電極および
／または酸素電極により電気化学的に測定し、その測定
結果から液体中のグルコース濃度を求めることを測定原
理とする、従来の技術の欄において説明したようないわ
ゆるバイオセンサーを用いるグルコース濃度を測定する
方法を意味する。通常のグルコース濃度の測定において
は、グルコース濃度を測定すべき試料を直接測定するの
ではなく、試料を適当な液体、特に緩衝液により希釈し
たものについてグルコース濃度を測定する。このような
グルコースセンサー法は当該分野においては周知のもの
であり、本発明ではグルコースオキシダーゼと過酸化水
素電極の組み合わせを用いるのが特に好ましい。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下、図１に示す本発明の方法に
よるグルコース濃度測定のフロー図に基づいて、グルコ
ースオキシダーゼと過酸化水素電極を用いる場合を例と
して本発明を説明するが、他の電極を用いる場合も本発
明を同様に適用できる。具体的には、図２に模式的に示
すような装置を用いてグルコース濃度を測定する。グル
コース濃度測定セル１はＧＯＤを固定化した過酸化水素
電極２を有し、セル内の液は、スターラ３および撹拌子
４により充分に撹拌されるようになっている。ポンプ５
により所定量の緩衝液がバルブ６を介してセル１内に供
給（緩衝液分注）され、グルコース濃度を測定すべき試
料はサンプラー９により所定量がセル１内に供給（検体
の採取及び吐出）され、測定（反応）が終了すると、ポ
ンプ７によりバルブ８を介して測定液は排出される。測
定は、サンプラー９から試料を供給した時間を０とし
て、過酸化水素電極２からの出力と経過時間との関係を
求めることにより行う。

【００１７】本発明において、平衡点法とは、上述のグ
ルコースセンサー法を用いるグルコース濃度測定法の１
つであって、グルコース濃度が既知の標準溶液について
測定開始後（即ち、試料をセル内に注入した後）の過酸
化水素電極の出力（電流値）が実質的に一定となるまで
測定を継続し、その一定出力とグルコース濃度との関係
を検量線として予め求めておき、その後、グルコース濃
度が未知の試料について過酸化水素電極の出力を測定
し、同様に出力が実質的に一定値となるまで測定を継続
し、その一定値から検量線に基づいてグルコース濃度を
求める方法を意味する。

【００１８】この平衡点法は、次のような事項に基づく
ものである：グルコースオキシダーゼによるグルコース
の分解反応速度は、緩衝液中のグルコース濃度に比例す
るが、酵素によるグルコースの分解量自体は微量である
のでグルコース濃度は殆ど変化しない。従って、定常状
態では過酸化水素の生成速度は一定となる。具体的に
は、あるグルコース濃度の試料について、測定を実施す
ると、図３に模式的に示すような（ある時間経過した後
は一定となる）電極の出力と試料注入後の時間との関係
が得られ、出力は通常１０秒程度でほぼ一定となる（図
３では、理解のため、ＥＰの符号を付している）。この
一定の出力値と緩衝液中のグルコース濃度との間には一
定の相関関係があり、平衡点法は、この関係を検量線と
して利用するものである。

【００１９】このような平衡点法では、測定開始後、出
力が一定値に到達するまでに十分な時間があり、測定す
べき液体試料中に血球が混入している場合、この時間
は、血球内の液体に含まれるグルコースが血球の細胞膜
という抵抗に抗して緩衝液本体中に拡散していくのに十
分なものであることが判っている。従って、平衡点法に
より測定されるグルコース濃度（ＥＰ）をもたらすグル
コースは、液体成分中に溶解しているグルコースおよび
血球内の液体中に溶解しているグルコースの双方であ
る。

【００２０】本発明において、一次微分法とは、上述の
グルコースセンサー法を用いるグルコース濃度測定法の
１つであって、グルコース濃度が既知の標準溶液につい
て測定開始後の過酸化水素電極の出力（電流値）と測定
時間との関係を測定し、それに基づいて出力の時間的変
化量（即ち、出力の時間による微分値、従って、出力の
速度）の最大値とグルコース濃度との関係を検量線とし
て予め求めておき、その後、グルコース濃度が未知の試
料について過酸化水素電極の出力の時間的変化を測定
し、同様に時間的変化量の最大値を測定し、その最大値
から検量線に基づいてグルコース濃度を求める方法を意
味する。

【００２１】例えば、図３においてＥＰの符号を付して
模式的に示すような電極の出力と時間との関係を時間に
ついて微分すれば出力の時間的変化量が求められ、具体
的には図３に示すような極大値を持つ曲線が得られる
（図３では、理解のためＤＩの符号を付している）。こ
の曲線の最大値と緩衝液中のグルコース濃度との間には
一定の相関関係があり、一次微分法はこの関係を検量線
として利用するものである。このような一次微分法で
は、測定開始後、出力の時間的変化量が最大値に到達す
るまでに要する時間はわずか数秒程度（例えば２秒程
度）であることが判っている。

【００２２】本発明は、グルコース濃度（ＧＬ）が既知
である種々の試料について、上記説明したような平衡点
法によるグルコース濃度測定値（ＥＰ）と一次微分法に
よるグルコース濃度測定値（ＤＩ）との関係について考
察した結果、これらの値の間に式（１）で示される関係
が統計的に成立することを見出したことに基づいてなさ
れたものである。

【００２３】

【発明の効果】本発明のグルコース濃度測定方法によれ
ば、血液中の血球量に関係なく、血液中のグルコース濃
度の測定が可能となる。従って、従来のように血液中の
グルコース濃度の測定に際して遠心分離操作をする必要
がないので、迅速に測定を行うことができる。また、グ
ルコース濃度の測定結果の精度が血球の存在の程度によ
って影響を受けないので、従来の方法による測定よりも
高い精度で測定を行うことができる。本発明の方法は、
血球が含まれた液体成分として全血状態の血液を使用す
る場合に特に有効であり、例えば糖尿病患者などの高グ
ルコース濃度の全血試料の測定に特に有用である。本発
明のグルコース濃度測定システムによれば、試料の注入
以降の一連の操作およびデータ処理が従来の方法よりも
短時間で自動的に行われてグルコース濃度の測定結果を
得ることができるので、本発明のグルコース濃度測定方
法を簡便かつ迅速に実施することができる。

【００２４】

【実施例】以下の実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれに限定されるものではない。ま
ず、真のグルコース濃度（ＧＬ）（即ち、血清グルコー
ス濃度）が８０ｍｇ／ｄｌであるヒトの血液について、
血球体積割合（体積％）が２０〜５０％の全血試料を準
備し、これらの試料についてグルコース濃度を平衡点法
および一次微分法により測定した。測定には、株式会社
京都第一科学から市販されているグルコース濃度測定装
置ＧＡ−１１６０（グルコースオキシダーゼ−過酸化水
素電極系）を一部改造してＤＩも測定できるようにした
装置を用いた。

【００２５】得られた測定値に基づいて、それぞれの血
球体積割合の試料について、真のグルコース濃度（Ｇ
Ｌ）と平衡点法によるグルコース濃度（ＥＰ）との差
（ＧＬ−ＥＰ）（ｍｇ／ｄｌ）ならびに真のグルコース
濃度（ＧＬ）と一次微分法によるグルコース濃度（Ｄ
Ｉ）との差（ＥＰ−ＤＩ）（ｍｇ／ｄｌ）の値を求め
た。同様にして、真のグルコース濃度が０〜８０ｍｇ／
ｄｌ、８０〜１００ｍｇ／ｄｌ、１００〜２００ｍｇ／
ｄｌおよび２００ｍｇ／ｄｌ以上の範囲にある全血試料
（各２０点ずつ）について、それぞれの血球体積割合
（体積％）が２０〜５０％であるものを準備して測定を
行い、それぞれの（ＧＬ−ＥＰ）値および（ＥＰ−Ｄ
Ｉ）値を求めた。これらの結果を、（ＥＰ−ＤＩ）の値
を横軸に、（ＧＬ−ＥＰ）の値を縦軸にとってプロット
すると、図４に示す結果が得られた。（図４において、
○は０〜８０ｍｇ／ｄｌのグルコース濃度の試料、■は
８０〜１００ｍｇ／ｄｌのグルコース濃度の試料、×は
１００〜２００ｍｇ／ｄｌのグルコース濃度の試料、△
は２００ｍｇ／ｄｌ以上のグルコース濃度の試料による
結果を示している。）

【００２６】このグラフから、式（１）を仮定すること
が妥当であることが判る。ここで、一次関数の定数ａお
よびｂ導出については、種々の回帰式を数学的にまたは
コンピュータ等により求める手法を用いることができ、
本実施例では最小二乗法を用いた。図４において得られ
たグラフに基づいて、式（１）の定数ａおよびｂを求め
ると、ａ＝１．３、ｂ＝４．６であった。従って、この
実施例において使用する測定装置について、 ＧＬ＝ＥＰ＋１．３×（ＥＰ−ＤＩ）＋４．６ （２） という式が得られる。

【００２７】次に、グルコース濃度が未知のヒトの全血
試料について、平衡点法および一次微分法によりそれぞ
れのグルコース濃度測定値（ＥＰおよびＤＩ）を求め、
これらの測定値を式（２）に適用してグルコース濃度の
測定を行った。以上のようにして行った本発明の方法に
よる測定の精度を確認するため、同じ全血試料について
遠心分離を行い、この時得られた血清をグルコース濃度
測定装置ＧＡ−１１６０（グルコースオキシダーゼ−過
酸化水素電極系）（株式会社京都第一科学より市販）に
より測定を行って、真のグルコース濃度とした。

【００２８】式（２）によって得られた測定値（Ｙ）を
縦軸に、血清のみについて測定した真のグルコース濃度
（Ｘ）を横軸にとって、図５に示すグラフが得られた。
図５から明らかなように、傾きがほぼ１の直線上に大部
分のデータが載っている（図５において、ｒは相関係数
であり、ｎは測定データ数である）。この結果から、本
発明の全血試料についてのグルコース濃度の測定方法に
は、十分な精度があることが判る。

【００２９】通常、ヒトの全血試料のグルコース濃度を
測定する場合、定数ａは０．５〜３．０の範囲の値であ
り、定数ｂは１０以下の正の値である。これらの定数ａ
およびｂの値は、ほぼ装置、特に電極系によって決まる
値であるので、例えば、特定の装置を使用して同様の検
体についてグルコース濃度を測定する場合には、グルコ
ース濃度が既知の複数の標準試料を用いて、平衡点法に
よるグルコース濃度（ＥＰ）および一次微分法によるグ
ルコース濃度（ＤＩ）を求め、その結果に基づいて、最
初にａおよびｂの値を求めれば、その後のグルコース濃
度が未知の実際の試料についての測定には得られたａお
よびｂの値をそのまま適用することができる。

【００３０】上記の測定には、グルコース濃度測定装置
ＧＡ−１１６０（グルコースオキシダーゼ−過酸化水素
電極系）（株式会社京都第一科学より市販）に一部改造
を加えてＤＩも測定できるようにした装置を用いたが、
このような既存のグルコース濃度測定装置に、本発明の
グルコース濃度測定方法を実施する回路を組み込むこと
により、全血試料のグルコース濃度の測定を行うことが
できる。本発明の測定方法は、上述の開示に基づいて容
易にソフト化でき、実際には電極からの出力の処理（即
ち、平衡点法および一次微分法の測定値の算出）と組み
合わせてコンピュータで全血試料のグルコース濃度を計
算させることができる。例えば、図６にブロック図で示
すような本発明のグルコース濃度測定方法をソフト化し
た回路を含むグルコース濃度測定システムによれば、本
発明の第１の要旨に係る方法を含めて、測定部において
測定し、電極からの出力を制御・演算部に送ってグルコ
ース濃度を計算（データ処理）し、その結果を所望によ
り、例えば紙などにプリントアウトしたり、ソフトウェ
ア的データとして出力したりする図１のフロー図に示す
ような一連の操作が自動的に行われ、短時間のうちに試
料のグルコース濃度の測定値を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の測定方法の模式的フロー図である。

【図２】 グルコース濃度測定装置を模式的に示す図で
ある。

【図３】 過酸化水素電極の出力の時間的変化および過
酸化水素電極の出力の時間的変化の時間微分を示す模式
的グラフであって、平衡点法および一次微分法によるグ
ルコース濃度の測定原理を示す。

【図４】 実際のデータについて、（ＧＬ−ＥＰ）の値
と（ＥＰ−ＤＩ）の値との関係を示すグラフである。

【図５】 本発明の方法によるグルコース濃度の測定値
と真の血清グルコース濃度との比較を示すグラフであ
る。

【図６】 本発明のグルコース濃度測定システムの模式
的ブロック図である。

【符号の説明】

１…グルコース濃度測定セル、２…ＧＯＤ固定化過酸化
水素電極、３…スターラ、４…撹拌子、５…ポンプ、６
…バルブ、７…ポンプ、８…バルブ、９…サンプラー。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 グルコースセンサー法により、血球およ
   び液体成分を含んで成る試料のグルコース濃度（ＧＬ）
   を測定する方法であって、 （ａ）試料のグルコース濃度（ＧＬ）を、その試料につ
   いての平衡点法によるグルコース濃度測定値（ＥＰ）お
   よび一次微分法によるグルコース濃度測定値（ＤＩ）を
   用いて ＧＬ＝ＥＰ＋ａ×（ＥＰ−ＤＩ）＋ｂ （１） ［式中、ａおよびｂは定数である。］で表すこと、 （ｂ）グルコース濃度（ＧＬ）が既知の種々の試料につ
   いて平衡点法によるグルコース濃度測定値（ＥＰ）およ
   び一次微分法によるグルコース濃度測定値（ＤＩ）を得
   ること、 （ｃ）得られた測定値（ＥＰおよびＤＩ）を式（１）に
   適用することにより、定数ａおよびｂを予め求めるこ
   と、 （ｄ）グルコース濃度が未知の試料について、平衡点法
   によりグルコース濃度測定値（ＥＰ）を得ると共に、一
   次微分法によりグルコース濃度測定値（ＤＩ）を得るこ
   と、 （ｅ）工程（ｃ）において求めた定数ａおよびｂならび
   に工程（ｄ）において得られた測定値（ＥＰおよびＤ
   Ｉ）を式（１）に適用することにより、グルコース濃度
   （ＧＬ）を求めることを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 血球および液体成分を含んで成る試料と
   して、全血試料を使用することを特徴とする請求項１記
   載の方法。
3. 【請求項３】 請求項１または２記載の方法を実施する
   ための回路を含むグルコース濃度測定システム。
4. 【請求項４】 定数ａおよびｂの値について、０．５≦
   ａ≦３．０であり、０＜ｂ≦１０であることを特徴とす
   る請求項３記載のグルコース濃度測定システム。